WO2000028326A1

WO2000028326A1 - Nouveaux complexes contenant de l'avidine reticulee, procede analytique dans lequel on utilise de l'avidine reticulee, reactifs et kits d'analyse

Info

Publication number: WO2000028326A1
Application number: PCT/JP1999/006172
Authority: WO
Inventors: Kazuyuki Sugiyama; Nobuhiro Hoshino; Hiroki Tatsumi; Satoshi Fukuda
Original assignee: Iatron Laboratories, Inc.; Kikkoman Corporation
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 1999-11-05
Publication date: 2000-05-18
Also published as: ATE327508T1; US6787325B1; EP1052510B2; DE69931467T8; EP1052510A1; ES2264271T3; DE69931467T2; EP1052510A4; JP4004230B2; DE69931467D1; EP1052510B1; DE69931467T3

Description

明細書架橋ァビジン含有新規複合体、架橋アビジンを用いる分析方法、

並びに分析用試薬及びキッ卜技術分野

本発明は、架橋アビジンを含む新規複合体、前記新規複合体の製造方法、架橋アビジンを用いる分析方法、並びに分析用試薬及び分析用キッ卜に関する。なお、本明細書における「分析」には、分析対象化合物の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象化合物の存在量を決定する「定量」との両方が含まれる。背景技術

抗原抗体反応を利用した高感度測定法の一つに酵素免疫測定法があり、代表的なものとして、ヘテロジニアスェンザィムィムノアツセィ、例えば、固相化抗体と標識化抗体とを用いたサンドイッチ法、又は固相化抗体と標識化抗原とを用いた競合法等がある。

これらの方法で用いられる酵素標識化抗原又は酵素標識ィヒ抗体は、種々の方法で調製されてきた。例えば、初期には、抗原又は抗体と酵素との混合液に、二価性の反応性を有するグルタルアルデヒドを加え、抗原又は抗体と酵素とのポリマ —をランダムに調製する方法が開発された。その後、ペル才キシダ一ゼの表面ァミノ基が少ないこと、そして、化学反応試薬に対しての耐性が強いことを利用した改良も試みられた。すなわち、まず、ペルォキシダ一ゼにグルタルアルデヒドを反応させた後に、過剰のアルデヒド基を除去し、得られたアルデヒド導入ペル才キシダ一ゼと、抗体とを混合することにより、必要な酵素標識化抗体のみを合成する方法が開発された。また、ペル才キシダ一ゼが糖鎖を持つことを利用して、過ヨウ素酸で糖鎖を酸化してアルデヒドを生じさせ、抗体のァミノ基と結合させることにより、高収率に酵素標識化抗体を得る方法も開発された。

一方、種々の架橋剤も開発され、抗体と酵素とを結合する反応に用いられるようになつた。その中でも、スクシンイミドとマレイミド基とを両端に持つようなヘテロバイフアンクショナルな架橋剤が開発され、酵素のァミノ基と抗体のヒンジ領域の S H基とを特異的に結合し、収率良く酵素標識ィヒ抗体を得ることもできるようになった。

抗原又は抗体と酵素とを架橋剤で結合する前記方法以外にも、アビジン一ピオチン反応を利用した抗原又は抗体と酵素との結合方法も開発されてきた。この方法では、二つの試薬を組み合わせて使用する方法が一般的である。すなわち、一方では、ビ才チン化試薬を用いることにより、抗原又は抗体にビ才チンを導入した抗原又は抗体（ピオチン導入抗原又はピオチン導入抗体）を調製しておく。他方では、（1 ) 化学結合法により、酵素とアビジンとの複合体（酵素標識化アビジン）を調製しておくか、あるいは、（2 ) ビ才チン導入酵素とアビジンとを適当な比率で混合することにより、ピオチンを介した酵素とアビジンとの複合体（酵素標識化アビジン）を調製しておく。

ここで、前記化学結合法（〗）は、酵素とアビジンとを、グルタルアルデヒド又はへテロバイフアンクショナルな架橋剤で結合するもので、酵素と抗体との組合せに代えて、酵素とアビジンとを組み合わせること以外は、前記の酵素標識化抗体調製法をそのまま利用することができる。

一方、前記方法（2 ) で使用する前記ピオチン導入酵素は、酵素として、例えば、ルシフヱラーゼを使用する場合に、遺伝子操作法により得ることができる。例えば、ルシフェラ一ゼの遺伝子とビ才チンァクセプタ一の遺伝子とを連結させた遺伝子を宿主細胞内で発現させると、ルシフヱラ一ゼ一ピオチンァクセプタ一融合タンパク質が宿主細胞内で合成され、続いて、この融合タンパク質に、宿主細胞の働きによりビ才チンが結合され、ピオチン導入酵素（ピオチンが導入されたルシフェラ一ゼ一ピオチンァクセプター融合タンパク質）を得ることができる。このようにして得られたビォチン導入抗原又はビォチン導入抗体と、酵素標識化アビジンとを用いる方法では、例えば、一般に、分析対象化合物（抗原）を含む被検試料と、抗体固定化担体とを反応させた後、洗浄操作を行い、次に、前記ビォチン導入抗体を反応させ、再び洗浄を行った後、酵素標識化アビジンを反応させ、抗体固定化担体と分析対象化合物との複合体に結合した酵素標識化ァビジン由来の酵素量を測定することにより、抗原量を知ることができる。このようなアビジンービ才チン反応を利用した免疫測定法は、予め酵素標識化ァビジンを調製しておけば、種々の抗体をビ才チン化するだけで標識物として使用することができるという点や、化学的な処理で活性に大きなダメ一ジを受ける酵素でも、遺伝子操作でピオチン導入酵素として発現させることにより、活性を維持したまま酵素標識化ァビジンとして用いることができるというメリットがあるが、操作ステップが多くなることや、測定毎のデ一タに再現性が乏しいという欠点を持っている。

反応ステップを減らすために、ピオチン導入抗体、アビジン、及びビ才チン導入酵素の三者を予め混合して、酵素標識化抗体（ビ才チン導入抗体一アビジン一ピオチン導入酵素複合体）として用いる試みもなされたが、反応性が著しく低下したり、安定性が非常に悪くなつたりして、そのままでは試薬として使用することはできなかった。

また、前記アビジン一ビ才チン反応は、前記の免疫学的分析方法以外にも、 D N Aプロ一ブを用いる D N A又は R N A分析方法、あるいは、受容体一リガンド分析方法にも適用されており、これらの分析方法にアビジン一ピオチン反応を適用した場合にも、免疫学的分析方法と同様の問題があつた。

従って、本発明の課題は、前記の従来技術の欠点を解消し、アビジン一ビ才チン反応の長所を有しながら、操作ステップが少なく、迅速且つ簡易であって、しかも、正確な分析方法を提供することにある。発明の開示

本発明は、同種又は異種のピオチン導入物少なくとも 2個と、前記ピオチン導入物の間に挟まれた架橋アビジン 1個とを含む、ピオチン一アビジン一ピオチン型複合体に関する。

本発明の前記ビ才チン一アビジン一ピオチン型複合体においては、前記ビォチン導入物の少なくとも 1個が、ビ才チン導入結合成分であり、前記ビ才チン導入物の少なくとも 1個が、ピオチン導入標識物質であることが好ましい。

また、本発明は、（ 1 ) アビジンを架橋剤で処理することにより、架橋ァビジンを調製する工程、 ( 2 ) 同種又は異種のビ才チン導入対象物をビ才チン化することにより、同種又は異種のピオチン導入物を調製する工程、及び

( 3 ) 前記架橋アビジンと、同種又は異種の前記ピオチン導入物とを結合させることにより、前記ビ才チン一アビジン一ビ才チン型複合体を形成させる工程を含むことを特徴とする、前記ビォチン一アビジン一ピオチン型複合体の製造方法に関する。

また、本発明は、同種又は異種のピオチン導入物と、架橋アビジンとを使用することを特徴とする、分析方法に関する。

また、本発明は、（1 ) ビ才チン導入結合成分、（2 ) 架橋アビジン、及び（ 3 ) ピオチン導入標識物質を使用することを特徴とする、分析方法に関する。また、本発明は、（ 1 ) 分析対象物を含む可能性のある被検試料、前記分析対象物と特異的に結合可能なピオチン導入結合成分、架橋アビジン、及びピオチン導入標識物質を任意の順序で接触させることにより、前記分析対象物とビ才チン導入結合成分と架橋アビジンとビォチン導入標識物質との複合体を形成させるェ程、及び

( 2 ) 前記複合体における前記標識物質に由来する信号を分析する工程

を含むことを特徴とする、前記分析対象物の分析方法に関する。

また、本発明は、架橋アビジンを含むことを特徴とする、分析用試薬に関する。また、本発明は、架橋アビジン及びビォチン化剤を含むことを特徴とする、分析用キッ卜に関する。

更に、本発明は、（ 1 ) ビ才チン導入結合成分、（2 ) 架橋アビジン、及び（ 3 ) ピオチン導入標識物質を含むことを特徴とする、分析用キットに関する。本明細書における「分析」とは、「結合分析」、すなわち、 2種類の化合物が相互に特異的に結合する性質を利用して、 2種類の前記化合物の内のいずれか一方を分析対象化合物とし、それと特異的に結合可能な「結合成分」を用いて前記分析対象化合物を分析することを意味する。特異的な結合を示す前記の 2種類の化合物の組み合わせとしては、例えば、抗原と抗体との組み合わせ、 D N Aとそれに相補的な D Ν Α若しくは R N Aとの組み合わせ、 R N Aとそれに相補的な D N A若しくは R N Aとの組み合わせ、受容体とそのリガンド（例えば、ホルモン、サイ卜力イン、神経伝達物質、又はレクチン）との組み合わせ、酵素とそのリガンド（例えば、酵素の基質アナログ、補酵素、調節因子、又は阻害剤）との組み合わせ、酵素アナログとその酵素アナログの元となる酵素の基質との組み合わせ、又はレクチンと糖との組み合わせを挙げることができる。なお、「酵素アナログ」とは、元の酵素に対する基質との特異的な親和性は高いものの、触媒活性を示さないものをいう。図面の簡単な説明

図 1 は、架橋ストレブトアビジンを用いる E L I S A法により、 A F Pを測定した結果を示すグラフである。

図 2は、架橋されていないス卜レプ卜アビジンを用いる E L I S A法により、 A F Pを測定した結果を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

本発明のビ才チン一アビジン一ビ才チン型複合体は、同種又は異種のピオチン導入物 2個以上と、前記ピオチン導入物の間に挟まれた架橋アビジン 1個とを含む。前記ピオチン導入物の各々と前記架橋アビジンとの各結合は、ビ才チン一ァビジン反応による結合である。

本発明では、「アビジン」として、ピオチンに特異的に強く結合することのできる任意のアビジン、例えば、卵白アビジン、ストレプトアビジン、又は遺伝子操作で得られたアビジン（すなわち、リコンビナントアビジン）等を用いることができる。

アビジンは、同一のサブュニッ卜 4個からなるタンパク質である。各サブュニッ卜にはビ才チン結合部位が 1箇所ずつ存在するため、 1分子のアビジンには 4 分子のピオチンが結合することができる。各サブュニッ卜は共有結合で結合していないため、アビジンに高い熱が加わると、各サブュニッ卜に開裂してしまうことが知られている。

本発明において使用する架橋アビジンは、アビジンの少なくともサブュニット間が架橋（すなわち、分子内架橋）されているものを意味する。前記架橋アビジンには、アビジン 1分子のみからなる架橋アビジンモノマ一、及び複数のァビジン分子が、更に分子間架橋により共有結合で結合されている架橋ァビジンポリマ一の両方が含まれる。

前記の架橋ァビジンは、アビジンを架橋剤で処理することにより得ることができる。前記架橋剤としては、例えば、アミノ基同士を結合する架橋剤としてのグルタルアルデヒド、ジスクシンイミド、ジメチルビメルイミデート、若しくはジメチルスべルイミデート、又はアミノ基とカルボキシ基とを縮合反応させる架橋剤としての種々のカルポジイミド [例えば、 1ーェチルー 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド等] を使用することができる。

本発明において使用するピオチン導入物は、任意のビ才チン導入対象物をビ才チン化したものである。前記ビ才チン導入対象物としては、ビ才チン化可能であり、しかも、ピオチン化した後のピオチン導入物が、ビ才チン一アビジン反応を介して架橋アビジンと結合可能である限り、特に限定されるものではなく、溶液中の任意の物質（例えば、通常の免疫学的分析方法において抗体又は抗原を標識するのに使用することのできる標識物質、あるいは、ビ才チンを導入可能な結合成分）であることができる。

前記標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質若しくは蛍光物質結合タンパク質、発光物質若しくは発光物質結合タンパク質、又は放射性同位元素を挙げることができる。

前記酵素としては、例えば、ルシフヱラ一ゼ、アルカリホスファターゼ、ペル才キシダ一ゼ、 ?— D—ガラクトシダ一ゼ、グルコキナーゼ、へキソキナーゼ、又はグルコース一 6—リン酸デヒドロゲナ一ゼ（G 6 P D H ) を挙げることができる。

前記蛍光物質としては、例えば、フルォレツセイン、ローダミン、ダンシルク口ライド、フル才ロニトロベンゾフラザン、ュ一口ピウムキレート、又はサマリゥムキレートを挙げることができ、前記蛍光物質結合タンパク質としては、前記蛍光物質をタンパク質に結合し、蛍光物質を集積したものを挙げることができる前記発光物質としては、例えば、ァクリジゥムエステル、ァダマンチル一ジォキサン、又はイソルミノールを挙げることができ、前記発光物質結合タンパク質としては、前記発光物質をタンパク質に結合し、発光物質を集積したものを挙げることができる。

前記放射性同位元素としては、例えば、 ^{3 2} P、 ^{3 5} S、 ^{1 2 5} I 、又は³ Hを挙げることができる。

本発明において使用することのできるピオチン導入酵素は、例えば、ルシフエラーゼ、アルカリホスファターゼ、ペル才キシダ一ゼ、又は/?— D—ガラクトシダ一ゼ等の酵素をビ才チン化したものである。

このようなピオチン導入酵素は、例えば、化学的修飾法又は遺伝子操作法を用いることにより調製することができる。

前記化学的修飾法は、酵素アミノ酸残基に対して化学的にピオチンを結合させる方法である。

一方、前記遺伝子操作法は、酵素とピオチンァクセプターとの融合タンパク質を宿主細胞中で発現させることにより、ビ才チン導入酵素を得るものである。ィ匕学的修飾に対して非常に不安定である酵素（例えば、ルシフェラ一ゼ等）の場合には、遺伝子操作法を用いることが好ましい。前記ピオチンァクセプタ一とは、宿主細胞中でピオチンを付加される一定のァミノ酸配列を含むタンパク質の総称であり、目的に応じてァクセプタータンパク質に翻訳される配列を含む遺伝子を用いることができる。

酵素（例えば、ルシフヱラーゼ）の遺伝子とピオチンァクセプタ一の遺伝子とを連結させた遺伝子を宿主細胞内で発現させると、酵素一ビ才チンァクセプタ一融合タンパク質が宿主細胞内で合成され、続いて、この融合タンパク質に、宿主細胞の働きによりビ才チンが結合され、ビ才チン導入酵素（ピオチンが導入された酵素一ピオチンァクセプター融合タンパク質）を得ることができる。

本発明において使用することのできるビ才チン導入標識物質の内、ピオチン導入酵素以外のものについては、公知の方法を用いて調製することができる。本発明において使用することのできるピオチン導入結合成分における前記結合成分は、ビ才チンを導入することができ、しかも、分析対象物と特異的に結合可能な結合成分である限り、特に限定されるものではなく、例えば、（ a ) タンパク質である抗体（モノクローナル抗体及びポリクロ一ナル抗体の両方を含む）、抗体フラグメン卜 [例えば、 F a b 、 F a b ' 、 F ( a b ' ) ₂、又は F v ] 、タンパク質抗原、受容体、タンパク質ホルモン、サイ卜力イン、レクチン、酵素、又は酵素アナログ、（b ) 核酸である D N A又は R N A、あるいは、（c ) タンパク質又は核酸以外の化合物である非タンパク質抗原、非タンパク質ホルモン、酵素に対するリガンド（例えば、酵素の基質アナログ、補酵素、転写因子、若しくは阻害剤）、酵素アナログの元となる酵素の基質、又は糖を挙げることができる。

本発明において使用することのできるピオチン導入結合成分の内、結合成分がタンパク質であるもの（例えば、抗体、抗体フラグメント、タンパク質抗原、受容体、タンパク質ホルモン、サイトカイン、レクチン、酵素、又は酵素アナログ ) については、ビォチン導入酵素に関して説明した前記の調製方法、すなわち、化学的修飾法又は遺伝子操作法を用いて、結合成分にピオチンを導入することにより調製することができる。

また、本発明において使用することのできるビ才チン導入結合成分の内、結合成分が核酸であるもの（例えば、 0 八又は1^ 八）については、公知の方法を用いて、結合成分にピオチンを導入することにより調製することができる。前記公知方法としては、例えば、 4種類のヌクレオチドの内、 1種類をピオチン化ヌクレオチド（例えば、ビ才チン化 d U T P又はビ才チン化 U T P ) に置き換えて実施するニックトランスレーション法又はプライマー伸長法、あるいは、 4種類のヌクレオチドの内、 1種類をァミノ化ヌクレオチド（例えば、ァミノ一 7— d U T P ) に置き換えて D N A合成を行ない、得られた修飾 D N Aと適当なビ才チン誘導体とを反応させる方法を挙げることができる。

前記二ックトランスレーション法又はプライマ一伸長法に用いるピオチン化 d U T P又はビォチン化 U T Pとして、例えば、 d U T P又は U T Pのピリミジン環の 5位の炭素原子にリンカ一を介してビ才チンを結合させたものが市販されており、それを使用することができる。

更に、本発明において使用することのできるピオチン導入結合成分の内、結合成分がタンパク質又は核酸以外の化合物であるものについては、公知の方法を用いて、結合成分にピオチンを導入することにより調製することができる。本発明のビォチン一アビジン一ビ才チン型複合体においては、同種又は異種のビ才チン導入物少なくとも 2個と、前記ビ才チン導入物の間に挟まれた架橋アビジン 1個とを含む限り、前記ピオチン導入物の組み合わせは特に限定されるものではなく、例えば、ピオチン導入結合成分とビ才チン導入標識物質との組み合わせ、ピオチン導入結合成分と、それと同種又は異種のビ才チン導入結合成分との組み合わせ、あるいは、ビ才チン導入標識物質と、それと同種又は異種のビォチン導入標識物質との組み合わせを挙げることができ、ピオチン導入結合成分とビ才チン導入標識物質との組み合わせを用いることが好ましい。

更に、本発明において使用するビ才チン導入結合成分としては、 1分子中に含まれるビ才チン数が 1 であるビ才チン導入結合成分（すなわち、結合成分 1分子に対してピオチン 1分子を導入したピオチン導入結合成分）が好ましく、本発明の好適態様においては、ビ才チン導入結合成分として、ビ才チン導入抗体フラグメント F a b ' を用いることができる。前記ビ才チン導入抗体フラグメン卜 F a b ' は、分析対象化合物に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体及びポリクロ一ナル抗体の両方を含む）から得られる抗体フラグメント F a b ' に、ピオチン 1分子を共有結合により導入したものである。

前記抗体フラグメン卜 F a b ' は、抗体をペプシンで消化することにより得られる抗体フラグメント F ( a b ' ) ₂を、更に還元剤（例えば、 —メルカプトェタノ一ル又はメルカプ卜ェチルァミン）で還元することにより調製することができる。すなわち、抗体分子のヒンジ領域には、 2本の H鎖を連結する S— S結合 1個が存在しており、この S— S結合の C末端側下流で、ペプシンによる分解を受けるので、抗体フラグメント F ( a b ' ) ₂のじ末端側領域には、前記 S— S結合が残っている。続いて、還元剤により前記 S— S結合を還元すると、抗体フラグメント F ( a b ' ) ₂ 1分子から、 C末端側領域に S H基 1つを有する抗体フラグメント F a b ' 2分子が生じる。

このようにして得られた S H基 1つを有する抗体フラグメント F a b，と、マレイミド基を有するピオチン誘導体とを反応させると、抗体フラグメント F a b ' 1分子当たり、ピオチン 1分子が導入されたピオチン導入抗体フラグメント F a b ' を得ることができる。本発明において使用することのできるビ才チン導入抗原は、抗原に、ビ才チン

1分子を共有結合により導入したものであることが好ましい。このようなビ才チン導入抗原は、ビ才チン導入酵素に関して説明した前記の調製方法、すなわち、化学的修飾法又は遺伝子操作法を用いて調製することができる。

本発明のビ才チン一アビジン一ビ才チン型複合体は、これに限定されるものではないが、例えば、本発明の製造方法により、調製することができる。本発明の製造方法においては、予め、それぞれ別々に調製した架橋アビジンと同種又は異種のビォチン導入物とを、一度に同時に、あるいは、順次、結合させることにより、本発明のビォチン一アビジン一ビォチン型複合体を形成させる。

本発明のピオチン一アビジン一ピオチン型複合体は、例えば、本発明の分析方法に用いることができる。本発明においては、分析対象化合物に応じて、適宜、適当なピオチン導入物（特にはピオチン導入結合成分）を選択することができる。例えば、分析対象化合物が抗原である場合には、その抗原に特異的に反応する抗体又は抗体フラグメント [例えば、 F a b、 F a b ' 、 F ( a b ' ) ₂、又は F v ] にビォチンを導入したビ才チン導入抗体又はビ才チン導入抗体フラグメン卜を；分析対象化合物が抗体である場合には、その抗体が認識する抗原にビ才チンを導入したビ才チン導入抗原を；分析対象化合物が D N A又は R N Aである場合には、それに相補的な D N A又は R N Aにピオチンを導入したピオチン導入 D N A又はビ才チン導入 R N Aを；分析対象化合物が受容体である場合には、その受容体に対するリガンドにピオチンを導入したピオチン導入リガンドを；分析対象化合物が受容体のリガンドである場合には、そのリガンドに対する受容体にピオチンを導入したビ才チン導入受容体を；分析対象化合物が酵素である場合には、その酵素に対するリガンドにピオチンを導入したビ才チン導入リガンドを；そして、分析対象ィヒ合物が酵素のリガンドである場合には、その酵素にビォチンを導入したビォチン導入酵素を、それぞれ使用することができる。

以下、ビ才チン導入結合成分として、ビ才チン導入抗体フラグメント F a を使用し、ビォチン導入標識物質として、ピオチン導入酵素を使用する場合の態様に主に基づいて、本発明（本発明の分析方法、本発明の分析用試薬、及び本発明の分析用キット）を更に説明する。例えば、これまで説明した方法により得られた（1 ) ピオチン導入抗体フラグメント F a b' と、（2) 架橋アビジンと、（3) ビ才チン導入酵素とを、適当な比率で混合することにより、酵素活性及び抗体活性を共に維持した状態で酵素標識化抗体を得ることができる。これらの酵素標識化抗体を、本発明の分析方法で使用することができる。

また、（1 ) ビ才チン導入抗体フラグメント F a と、（2) 架橋アビジンと、（3) ピオチン導入酵素とは、それぞれ別々に使用することもできる。例えば、抗体固定化担体と分析対象化合物（抗原）とを反応させた後に、

(a) 前記の 3種類の試薬をこの順に添加し、三段階で反応させることもできるし、

(b) ビ才チン導入抗体フラグメント F a b' と架橋アビジンとを予め混合しておいたものを反応させた後に、ビ才チン導入酵素を反応させ、二段階で反応させることもできるし、あるいは、

(c) ビ才チン導入抗体フラグメント F a b' を反応させた後に、架橋アビジンとピオチン導入酵素とを予め混合しておいたものを反応させ、二段階で反応させることもできる。

これらの 3種類の試薬を、予め全て混合して使用するか、あるいは、別々に使用するかは、それぞれの測定系に応じて適宜決定することができる。

本発明の分析方法では、（1 ) ビ才チン導入抗体フラグメント F a b' 、 (2 ) 架橋アビジン、及び（3) ビ才チン導入酵素を使用すること以外は、従来公知の免疫学的分析方法、例えば、サンドイッチ法又は競合法にそのまま適用することができる。

例えば、サンドイッチ法を利用し、（1 ) ピオチン導入抗体フラグメント F a b' と、（2) 架橋アビジンと、（3) ピオチン導入酵素とを、適当な比率で混合して得られた酵素標識化抗体を用いる本発明の分析方法では、具体的には、ビォチン導入抗体フラグメント F a b ' とは異なるェピトープで分析対象化合物と反応する抗体又は抗体フラグメン卜を適当な不溶性担体に固定化する（第 1抗体 ) 。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なプロッキング剤 [例えば、ゥシ血清アルブミン（B S A) やゼラチン等] で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、被検試料を加えて一定時間（例えば、 5分〜 3時間）及び一定温度（例えば、 4で〜 4 0で、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（1次反応）。続いて、 3種類の試薬の混合物である前記酵素標識ィヒ抗体を加えて一定時間（例えば、 5分〜 3時間）及び一定温度（例えば、 4 °C ~ 4 0 °C、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（2次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する酵素標識化抗体の量を定量する。その値から、被検試料中の分析対象化合物の量を算出することができる。

本発明の分析方法においては、 3種類の試薬の混合物である酵素標識化抗体を添加して一段階で反応させる代わりに、先に説明したように、 3種類の試薬を別々に加えて二段階又は三段階で反応させることもできる。

本発明の分析方法に使用する架橋ァビジンは、分子内架橋により各サブュニッ卜が共有結合により連結されているので、（1 ) ピオチン導入抗体フラグメント F a b ' と（2 ) 架橋アビジンと（3 ) ピオチン導入酵素とを適当な比率で混合し、酵素標識化抗体を調製しても、その酵素活性及び抗体活性を安定に維持することができる。それに対して、架橋されていないアビジンを使用する従来公知の酵素標識化抗体（すなわち、ビォチン導入抗体一アビジン一ビ才チン導入酵素複合体）では、酵素標識化抗体としての反応性が著しく低下する。この理由は、ァビジン 1分子にビ才チン 2分子（ビ才チン導入抗体及びビ才チン導入酵素）が結合すると、高い熱を加えた場合と同様に、アビジンに強い力が加わり、サブュニッ卜へと開裂してしまうためと考えられる。

更に、本発明の分析方法では、 1分子中に含まれるピオチン数が 1 であるピオチン導入抗体フラグメント F a b ' 及びビ才チン導入酵素を使用すると、酵素標識化抗体の酵素活性及び抗体活性を更に安定に維持することができる。もしも、抗体フラグメン卜 F a b ' 、抗原、又は酵素中に複数のピオチン分子が存在すると仮定すると、アビジンを介して連鎖的に結合反応が進行し、酵素標識化抗体が巨大分子化し、沈殿形成など好ましくない反応を起こすことが予想されるからで

<¾>る。

本発明の分析用試薬は、架橋アビジンを含む。本発明の分析用試薬は、他の試薬、例えば、ピオチン導入抗体フラグメン卜 F a b ' 及びピオチン導入酵素と組み合わせて、本発明の分析方法に用いることができる。

本発明の分析用キッ卜は、架橋アビジン及びピオチン化剤を含む。前記ビォチン化剤としては、従来公知のピオチン化剤を使用することができ、例えば、 N— ビォチノィル一 N ' - ( 6—マレイミドへキサノィル）一ヒドラジド、又はビ才チニル一ε—アミノカプロン酸 N—ヒドロキシスクシンイミドエステル等を挙げることができる。前記分析用キットとは別に用意した抗体フラグメント F a b ' 及び酵素を、前記ピオチン化剤によりピオチン化して得られるピオチン導入抗体フラグメント F a b ' 及びピオチン導入酵素と、前記分析用キットに含まれる架橋ァビジンとを組み合わせて、本発明の分析方法に用し、ることができる。

本発明の分析用キットは、架橋アビジン及びビ才チン化剤に加え、ピオチン導入標識物質（例えば、ピオチン導入酵素）を更に含むことができる。本発明の分析用キッ卜は、架橋アビジン、ビ才チン導入標識物質、及びビ才チン化剤をそれぞれ別々の試薬として含むこともできるし、あるいは、架橋アビジンとピオチン導入標識物質とを予め混合した混合物、及び単独のピオチン化剤として含むこともできる。

また、本発明の分析用キッ卜は、前記ビ才チン化剤に代えて、ピオチン導入抗体フラグメント F a b ' 及びビ才チン導入標識物質（例えば、ビ才チン導入酵素 ) を含む構成とすることもできる。すなわち、本発明の別の分析用キットは、（ 1 ) ピオチン導入抗体フラグメント F a b ' 、 ( 2 ) 架橋アビジン、及び（3 ) ビ才チン導入標識物質を含む。本発明の分析用キットは、（1 ) ピオチン導入抗体フラグメント F a b ' 、（2 ) 架橋アビジン、及び（3 ) ビ才チン導入標識物質をそれぞれ別々の試薬として含むこともできるし、あるいは、 2以上の試薬を予め混合した混合物として含むこともできる。後者の例示としては、例えば、ビォチン導入抗体フラグメン卜 F a b ' と架橋アビジンとビォチン導入標識物質との混合物を含む分析用キット、ビ才チン導入抗体フラグメント F a b ' と架橋ァビジンとの混合物、及び単独のビ才チン導入標識物質を含む分析用キッ卜、あるいは、単独のピオチン導入抗体フラグメント F a b ' 、及び架橋アビジンとビ才チン導入標識物質との混合物を含む分析用キッ卜を挙げることができる。本発明の分析用キットは、それ単独で、あるいは、所望により他の試薬と組み合わせて、本発明の分析方法に使用することができる。

以上、ビ才チン導入結合成分として、ビ才チン導入抗体フラグメント F a b ' を使用し、ビォチン導入標識物質として、ビ才チン導入酵素を使用する態様に基づいて本発明を主に説明したが、前記ピオチン導入抗体フラグメン卜 F a b ' の代わりに、ビ才チン導入抗原を用いても本発明を実施することができる。以下、ビ才チン導入標識物質として、ピオチン導入酵素を用いる態様について説明する。例えば、（ 1 ) ビ才チン導入抗原と、（2 ) 架橋アビジンと、（3 ) ピオチン導入酵素とを、適当な比率で混合して得られた酵素標識化抗原を用いる本発明の分析方法では、例えば、競合法により抗原を免疫学的に分析することができる。具体的には、分析対象化合物と反応する抗体又は抗体フラグメン卜を適当な不溶性担体に固定化する（第 1抗体）。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤 [例えば、ゥシ血清アルブミン（B S A ) やゼラチン等] で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、 3種類の試薬の混合物である前記酵素標識化抗原と、被検試料とを加えて一定時間（例えば、 5分〜 3時間）及び一定温度（例えば、 4で〜 4 0 °C、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水 ) で洗浄してから、不溶性担体上に存在する酵素標識化抗原の量を定量する。その値から、被検試料中の分析対象ィ匕合物の量を算出することができる。

本発明の分析方法においては、 3種類の試薬の混合物である酵素標識化抗原を添加して一段階で反応させる代わりに、先に説明したように、 3種類の試薬を別々に加えて二段階又は三段階で反応させることもできる。

更には、ピオチン導入抗体フラグメント F a b ' 又はビ才チン導入抗原に代えて、その他のビ才チン導入結合成分、例えば、ピオチン導入抗体、ピオチン導入抗体フラグメント、ピオチン導入 D N A、ビ才チン導入 R N A、ピオチン導入受容体、ビ才チン導入酵素、ビ才チン導入リガンド（受容体に対するリガンド及び酵素に対するリガンドを含む) 、ビ才チン導入酵素アナログ、酵素アナログの元となる酵素の基質にピオチンを導入したもの、ピオチン導入レクチン、又はピオチン導入糖を用いても、同様に本発明を実施することができる。また、ピオチン導入酵素に代えて、その他のピオチン導入標識物質、例えば、ピオチン導入蛍光物質若しくはビォチン導入蛍光物質結合タンパク質、ピオチン導入発光物質若しくはピオチン導入発光物質結合タンパク質、又はピオチン導入放射性同位元素を用いても、同様に本発明を実施することができる。実施例

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

実施例 1

( 1 ) ビ才チン導入抗体フラグメント F a b' の調製

ヒ卜一フエトプロテイン（A F P) をゥサギに対し免疫して得られた抗血清から、 A F P固定化セファロ一ス 4 Bを用いたァフィ二ティ一カラムクロマ卜グラフィ一で特異抗体 I g G分画を得た。

この特異抗体 I g G分画 [ 0. 1 m o I / I酢酸緩衝液（ p H 4. 5) ] に 2 %重量のペプシンを加え、 3 7 °Cの孵卵器で一夜消化を行い、ゲルクロマ卜グラフィ一で分子量 1 0万の抗体フラグメント F (a b' ) ₂分画を得た。

5 0 mm 0 I / I酢酸緩衝液（ p H 5. 0 ) に対して透析した F ( a b ' ) ₂ 分画 5 m g ( 1 m l ) に、 0. 2 5010 1 ノ 1 — 2—メルカプトェチルアミン [ 5 0 mm o I / I酢酸緩衝液（p H 5. 0) ] 5 Q μ \ を加え、 3 7°Cで 9 0分間還元した。得られた反応液を、 1 mm o I / I エチレンジァミン四酢酸（E D T A) を含む 5 0 mm 0 I / I リン酸緩衝液（p H 7. 0) で平衡化したセファデックス G— 2 5カラム（1 . 5 X 1 3 c m) に通し、ボイドボリュームに溶出される抗体フラグメント F a b，分画をプールした。

この抗体フラグメント F a 分画に、ジメチルホルムアミド 0. 1 m lに溶解した N—ピオチノィル一N，一（6—マレイミドへキサノィル）一ヒドラジド 0. 4 m gを加え、室温で一夜静置反応させた後、生理食塩水で平衡化したセフアデックス G— 2 5カラム（1 . 5 X 1 3 c m) に通し、ボイドボリュームに溶出されるビ才チン導入抗体フラグメン卜 F a b' をプ一ルした。

(2) 架橋ストレプトアビジンの調製 I b

0. 1 m o I / I リン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) 1 m l に溶解した精製ストレプ卜アビジン 1 m gに、 1 %グルタルアルデヒド溶液 [0. I m o l Z l リン酸緩衝液（p H 7. 0) ] 2 0 I を加え、混合した後、 4°Cで 1 6時間静置反応した。反応混液に、 0. 1 m o I Z I リン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) で調製した 4 m g/m I水素化ホウ素ナトリウム液 2 0 μ I を加え、室温で 4時間静置反応することにより、アルデヒドを還元した。反応混液を 0. 3 m ο I I食塩水で平衡ィ匕したセフアデックス G— 2 5カラム（1 . 5 X 1 5 c m) に通し、ボイドボリユームに溶出される架橋ストレプ卜アビジンをプールした。

(3) 抗 A F Pモノクロ一ナル抗体のコーティング

5 0 mm o I / I炭酸緩衝液（p H 9. 5) で S gZm l に調整した抗 A F Pモノクローナル抗体（オリエンタル酵母社） 1 0 0 u I を、白色 9 6穴プレー卜の各ゥエルに分注し、 3 7°Cで 2時間振盪コーティングを行った後、洗浄液 [ 0. 1 %卜ウイーン 2 0を含む Z O mm o l Z l トリス塩酸緩衝液（ p H 7. 5 ) ] で洗浄し、以下の工程に用いた。

(4) 酵素標識化抗体の調製

前記実施例 1 ( 1 ) で得られたビ才チン導入抗体フラグメント F a b' (最終濃度 =0. 1 / g/m I ) と、前記実施例 1 (2) で得られた架橋ストレブトァビジン（最終濃度 = 1 · 2 g/m I ) と、ビ才チン導入ルシフヱラ一ゼ一ビ才チンァクセプター融合タンパク質（キッコ一マン社）（最終濃度 =0. 0 7 g /m I ) とを、 5%グリセロール、 1 %ゥシ血清アルブミン（B S A) 、及び 1 mm o I / I -E D TAを含む 5 0 mm o l / l — H E P E S緩衝液（p H 7. 5) 中で混合し、室温で 2時間静置反応してから酵素標識化抗体として、以下の反応に用いた。

(5) E L I S A法による A F Pの測定

反応緩衝液（ 0. 1 5 m 0 I Z I食塩を含む前記洗浄液）で所定濃度（ 1 p g /m I , 1 0 ρ gZmし及び 1 0 0 ρ gZm门に希釈した標準 A F P溶液 1 0 0 I を抗体コ一トウ Iルに分注し、 3 7°Cで 1時間振盪反応を行った。洗浄液で 4回洗浄した後、実施例 1 (4 ) で調製した酵素標識化抗体 1 0 0 I を分注し、 3 7でで 1時間振盪反応を行った。洗浄液で 4回洗浄した後、発光検出器にセッ卜し、 0. 1 m g/m Iルシフエリン、 4 0 mm o I / I— A T P、及び 1 50 mm o I / I硫酸マグネシゥムを含む 50mmo I / I -H E P E S緩衝液（pH 7. 5) 1 00 I を基質として加え、 1 0秒間の積算発光量を測定した。

結果を図 1に示す。図 1から明らかなように、非常に低濃度の A F Pに対しても発光量のレスポンスが得られた。

このようにストレプ卜アビジンを架橋剤処理することにより、ビ才チン導入抗体フラグメント F a b' とビ才チン導入酵素との間を、安定に結合することができることが示された。

比較例 1

比較例として、実施例 1 (2) で調製した架橋ストレプトアビジンの代わりに、架橋処理を行なっていないストレブトアビジンを使用すること以外は、前記実施例 1 (4) 及び実施例 1 (5) の手順を繰り返した。結果を図 2に示す。図 2から明らかなように、 A F P量に対する発光のレスポンスがほとんど見られず、架橋されていないス卜レプトアビジンでは、ビ才チン導入抗体フラグメン卜 F a b ' とビ才チン導入酵素との間をうまく結合することができないことが確認された _c 産業上の利用可能性

本発明によれば、アビジンービォチン反応の長所を生かしながら、迅速且つ簡易に、しかも、正確に分析対象化合物の分析を実施することができる。以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲

1 . 同種又は異種のピオチン導入物少なくとも 2個と、前記ピオチン導入物の間に挟まれた架橋アビジン 1個とを含む、ビ才チン一アビジン一ビ才チン型複合体。

2. 少なくとも 1個のピオチン導入物が、ビォチン導入結合成分であり、少なくとも 1個のピオチン導入物が、ビ才チン導入標識物質である、請求項 1に記載のピオチン一アビジン一ビォチン型複合体。

3. ( 1 ) アビジンを架橋剤で処理することにより、架橋アビジンを調製するェ程、

(2) 同種又は異種のビ才チン導入対象物をビ才チン化することにより、同種又は異種のビ才チン導入物を調製する工程、及び

(3) 前記架橋アビジンと、同種又は異種の前記ピオチン導入物とを結合させることにより、請求項 1 に記載のピオチン一アビジン一ビ才チン型複合体を形成させる工程

を含むことを特徴とする、請求項 1 に記載のビ才チン一アビジン一ピオチン型複合体の製造方法。

4. 同種又は異種のピオチン導入物と、架橋アビジンとを使用することを特徴とする、分析方法。

5. (〗）ビ才チン導入結合成分、（2) 架橋アビジン、及び（3) ピオチン導入標識物質を使用することを特徴とする、分析方法。

6. ( 1 ) 分析対象物を含む可能性のある被検試料、前記分析対象物と特異的に結合可能なビ才チン導入結合成分、架橋アビジン、及びピオチン導入標識物質を任意の順序で接触させることにより、前記分析対象物とピオチン導入結合成分と架橋ァビジンとビ才チン導入標識物質との複合体を形成させる工程、及び

( 2 ) 前記複合体における前記標識物質に由来する信号を分析する工程を含むことを特徴とする、前記分析対象物の分析方法。

7. 結合成分が、抗体、抗体フラグメント、抗原、 D N A、 R NA、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、酵素アナログ、酵素アナログの元となる酵素の基質、レクチン、又は糖である、請求項 5又は 6に記載の分析方法。

8. 抗体フラグメントが F a b ' である、請求項 7に記載の分析方法。

9. ビ才チン導入標識物質が、ビォチン導入酵素、ピオチン導入蛍光物質若しくはピオチン導入蛍光物質結合タンパク質、ビ才チン導入発光物質若しくはビォチン導入発光物質結合タンパク質、又はビ才チン導入放射性同位元素である、請求項 5 ~ 8のいずれか一項に記載の分析方法。

1 0. 前記ピオチン導入酵素が、ピオチンが導入された酵素一ピオチンァクセプター融合タンパク質である、請求項 9に記載の分析方法。

1 1 . 前記ピオチン導入酵素が、ビ才チン導入ルシフェラ一ゼである、請求項 9 に記載の分析方法。

1 2. 架橋アビジンが、架橋卵白アビジン、架橋ストレブ卜アビジン、又は架橋リコンビナン卜アビジンである、請求項 4〜 1のいずれか一項に記載の分析方法。

1 3. 架橋アビジンを含むことを特徴とする、分析用試薬。

1 4. 架橋アビジン及びビ才チン化剤を含むことを特徴とする、分析用キッ卜。

1 5. ピオチン導入標識物質を更に含む、請求項 1 4に記載の分析用キッ卜。

1 6. 架橋アビジンとピオチン導入標識物質との混合物、及びピオチン化剤を含むことを特徴とする、分析用キッ卜。

1 7. ( 1 ) ピオチン導入結合成分、（2) 架橋アビジン、及び（3) ピオチン導入標識物質を含むことを特徴とする、分析用キット。

1 8. 結合成分が、抗体、抗体フラグメント、抗原、 D N A、 R NA、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、酵素アナログ、酵素ァナログの元となる酵素の基質、レクチン、又は糖である、請求項 1 7に記載の分析用キッ卜。

1 9. 抗体フラグメン卜が F a b' である、請求項 1 8に記載の分析用キッ卜。

2 0. ( 1 ) ビ才チン導入抗体フラグメン卜 F a b' 、 (2) 架橋アビジン、及び（3) ピオチン導入標識物質を含むことを特徴とする、分析用キット。

2 1 . ( 1 ) ピオチン導入抗体フラグメント F a b' と（2) 架橋アビジンと（ 3) ビォチン導入標識物質とを、それらの混合物の形で含む、請求項 2 0に記載の分析用キッ卜。

2 2. ( 1 ) ピオチン導入抗体フラグメント F a b' と（2) 架橋アビジンとを、それらの混合物の形で含む、請求項 2 0に記載の分析用キット。

2 3. (2) 架橋アビジンと（ 3) ピオチン導入標識物質とを、それらの混合物の形で含む、請求項 2 0に記載の分析用キッ卜。