WO1999011659A1

WO1999011659A1 - Derives tetrapeptides cycliques et leur utilisation medicinale

Info

Publication number: WO1999011659A1
Application number: PCT/JP1998/003893
Authority: WO
Inventors: Norikazu Nishino; Minoru Yoshida; Sueharu Horinouchi; Yasuhiko Komatsu; Tsutomu Mimoto
Original assignee: Japan Energy Corporation
Priority date: 1997-09-02
Filing date: 1998-09-01
Publication date: 1999-03-11
Also published as: EP1010705A4; CA2302451A1; US6399568B1; NZ503061A; EP1010705A1; AU732299B2; KR20010023449A; NO20001045L; NO20001045D0; AU8888598A; JP3494624B2

Description

明細書新規な環状テトラベプチド誘導体とその医薬用途技術分野

本発明は、新規な環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩と該化合物のヒストンデァセチラ一ゼ阻害剤並びに MHC class— I分子発現促進剤としての応用、並びに、前記するヒストンデァセチラ一ゼ阻害作用あるいは MHC class— I分子発現促進作用を利した、抗癌剤等の医薬用途を有する当該環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬 «物に関する。 . 背景技術

自己の組織細胞は、本来外部から侵襲した異物、病原体等と区別し、免疫細胞による誤つた傷害を防ぐため、抗原提示分子として MHC c 1 ass— I分子をその細胞表面に発現している。免疫系は、 MHC class- 1 分子を識別することで、自己の糸!^細胞であるとして、その攻撃対象から除いている。他方、本来自己細胞ではある力癌化した細胞、あるいは癌ィ匕ウィルスに感染した細胞では、正常な自己細胞と異なり、癌化に伴う蛋白質、あるいは癌ィ匕ウィルス由来蛋白質が生産され、これら非自己蛋白質に由来する抗原が MHC class— I分子により提示される。免疫細胞、特には、細胞傷害性 T細胞この非自己蛋白質に由来する抗原を認識することで、癌細胞、あるいは癌ィ匕ウィルス感染細胞を排除することができる。し力しな力ら、ある種の癌細胞あるいは癌化ウィルス感胞においては、この MHC class— I分子の発現力 ^低下しており、前記の免疫系による排除機構を回避し、癌化糸皿の伸長 '拡大、癌化ウィルス感染の長期持続化、拡大が引き起こされること力報告されている。これら癌細胞ある、は癌化ゥィルス感染細胞の造腫瘍性抑制を目的とした研究において、低下した MHC c 1 ass— I分子の発現を回復させることで治療効果が達成されることを示唆する結果が報告されておリ、例えば、

12型で形質転換した癌細胞や自然発症メラノ一マにおいて、低下している MHC class- 1分子の発現を MHC class- 1遺伝子の導入により高めてやることで、これら癌細胞の造腫瘍性カ肖失することを田中ら力 ¾告している (Tanaka,

K.， Isse lbacher, K. J. , Khoury, G. , and Jay, G. Science 228， 26-30, 1985;

Tanaka, K.， Gorel ik, E. , Watanabe, M. , Hozumi , N. , and Jay, G. Mol . Cel l.

Bio l . 8， 1857 - 1861， 1988等を参照) 。ところで、 MHC class- 1 分子の発現その自己組織細胞の細胞増殖後、分ィ匕過程の一環として起こるものであり、この過程での内因性蛋白質の翻訳を促進することで、 MHC class— I 分子の発現も促進されること力期待される。内因性蛋白質の翻訳を調整している機構は幾つかあるが、遺伝子に重要な役割を果たしていると考えられるものの一つに、核遺伝子クロマチン中にその構造蛋白質として含まれるヒストン蛋白のァセチルイ匕がある。具体的には、クロマチンは、 4種類のコアヒストン 8量体に遺伝子 DNA力巻き付き、言請ヌクレオソ一ム構造と称される基本単位をなし、更にこれカ缟次構造を形成しているが、そのコアヒストンの N末端付近 (^基性ァミノ酸に富んだテール状をとリ、前記ヌクレオソ —ム上の DNAをさらに被う構造をとる。このテール域付近のリジン残基 ( 可逆的なァセチル化の代謝回転を被っており、ヌクレオソ一ム自体の構造制御、あるいは、遺伝子 DNAに作用する他の蛋白質（転写因子群、サイレンサー蛋白質群、 RNAポリメラ一ゼなど）との結合制御を介する転写制御に密接に係わっているとされている。ヒストンのァセチル化に依存する遺伝子発現制御の査証として、ヒストンの高ァセチル化その領域に存在する遺伝子からの発現誘導を促進し、一方脱ァセチル化は、ヘテロクロマチンと称される転写不活性な領域を形成することが報告されている。即ち、クロマチンの構造蛋白質であるヒストンとそのァセチル化染色体遺伝子の全域に及ぶものであるにも係わらず、その機能は特定の遺伝子の発現に大きな影響を及ぼし、いわ ( 亥内情報伝達にかかわる厳密な制御に関与すること力示唆されている。ヒストンのァセチルイ匕を行う酵素は、ヒストンァセチルトランスフェラ一ゼであり、逆に脱ァセチルイ匕を行う酵素は、ヒストンデァセチラーゼであり、この両酵素はヒストンァセチルイヒレベルの動的な代謝回転を調整している。ヒストンデァセチラ一ゼの作用が冗進すると、細胞の適正な分化や形態正常化が阻害される力このヒストンデァセチラ一ゼの酵素活性を阻害すると、ヒストンからの脱ァセチル化が抑制される結果、ヒストン高ァセチル化が引き起こされ、分ィ匕ゃ形態正常化に必要な遺伝子！ ^力誘導される。この現象は、ヒストンデァセチラーゼに対する酵素阻害物質である、図 1に示すトリコスタチン A (トリコスタチン A) や図 2に示すトラポキシン（trapoxin) 類縁体を用いた研究によりある程度確認されている。加えて、これら阻害物質を更に高い濃度で細胞に作用させると、細胞周期の阻害が引き起こされ、結果として増殖阻害が起こる。なお、トリコスタチン Aは、低濃度で非拮抗的な酵素阻害作用を示し、また、可逆的な阻害剤であるが、トラポキシン類縁体は、競争的な阻害作用を示すが、不可逆的な阻害剤である。また、ヒト細胞由来のヒストンデァセチラーゼの酵素活性サブュニットは、トラポキシンと類する環状テトラペプチドィ匕合物の K-trapを用いたァフィ二ティ一カラムで精製されたとの報告がなされており、トラポキシン等に見られる環状テトラベプチド構造が当該酵素活性サブュニットと選択的な分子間結合を形成することの有力な査証が与えらている。上述するとおリ、ヒストンデァセチラ一ゼに対する酵素阻害物質は、細胞分ィ匕又は形状正常化を起こす薬剤となるので、分化過程の一環としておこる MHC class 一 I分子発現に対しても促進作用を示す可能性があるものの、これまでのところ、それを確認させる報告はされていない。従って、自己糸! ^細胞での MHC class— I 分子発現に対する促進作用を示すヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害物質の探索 · 提案が待望されている。また、上の述べた通り、ヒストンデァセチラ一ゼ¾素阻害物質は高濃度において、細胞周期の阻害を引き起こし、結果として増殖阻害が起こる作用を示すので、 MHC class— I分子発現促進に伴う、造腫瘍性の抑制、並びに、免疫系による癌細胞の排除、加えて、細胞増殖の阻害作用も寄与した複合的な抗癌作用を示す、新規な丽 C class— I分子発現促進に由来する抗癌剤の提案も待たれている。本発明は、上記の課題を解決するものであり、本発明の目的は、自己組織細胞での MHC class— I分子発現に対する促進作用を示すヒストンデァセチラ一ゼ¾素阻害物質の提供、ならびに、該ヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害物質を有効成分とする医薬 «物の提供にある。発明の開示

本発明者ら前記の課題を解決すべく、鋭意研究を進め、

ラ一ゼ酵素阻害活性を有するトリコスタチン Aやその,化合物トリコスタチン Cを動物細胞に作用させた際、 MHC class— I分子発現を促進することを見出し、更に、前記のトリコスタチン類以外に、ヒストンデァセチラーゼ酵素阻害活性を有する酪酸やトラポキシン Aもやはり MHC class— I分子発現促進活性を示すことを見出した。これらの知見に基づき、環状テトラペプチド誘導体種々を創製するとともに、これら環状テトラベプチド誘導体がヒストンデァセチラ一ゼの酵素活性を可逆的に阻害し、且つ MHC class— I分子発現促進活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明一般式 ( I )

一般式 ( I，)

一般式（ I ")

")

又

(式中、

Ru、 R_l2、い R₂₂ それぞれ水素、炭素数 l〜 6の直鎖アルキル基、炭素数 3〜

6の分岐のアルキル基、炭素数 1〜 5の直鎖 ω—アミノアルキル基、炭素数 3〜の分岐のァミノアルキル基、前記の直鎖又は分岐ァミノアルキル基上のァミノ基上に炭素数 3以下のァシル基又 (お、ロゲノ置換アシフレ基が置換してなる Ν—ァシル一アミノアルキル基、ベンジル基、 4—メトキシベンジル基、 3—ィンドリルメチル基、（N—メトキシ— 3—インドリル）メチル基、炭素数 3以下のァシル基を環状窒素上に置換基として有する（N—ァシル一 3—インドリル）メチル基、環数 4以下のァリ一ル基が置換したメチル基から選択される一価の基を表し、 R₃は、鎖上に分岐鎖を有してもよい鎖長炭素数 3又は 4の直鎖アルキレン基、鎖上に分岐鎖を有してもょレ、鎖長炭素数 3又は 4の直鎖ァルケ二レン基、鎖上に分岐鎖を有してもよい鎖長炭素数 4の直鎖アルカジエ二レン基、並びに、前記の直鎖アルキレン基、直鎖ァルケ二レン基及びアルカジエ二レン基上に付加される分岐鎖カ铺合環構造を形成したもの、または、これら鎖式炭ィ b 素基を構成する炭素原子のうち、遊離原子価が存在する炭素原子以外の炭素原子の一つが素、ィォゥ又は窒素の何れかのへテロ原子に置き換わつてなる二価の基から選択される二価の基を表し、

R₄ 当該鎖上に分岐鎖を有してもよい鎖長炭素数 4〜6の二価の鎖式炭化水素基、およびこれら鎖式炭化水素基を構成する炭素原子のうち、遊離原子価が存在する炭素原子以外の炭素原子の一つ以上が素、ィォゥ又は窒素の何れかのへテ口原子に置き換わってなる二価の基を表し、

R₄ (i, 鎖長が 4〜 6の二価の鎖式炭化水素基、更に、当該鎖上に分岐鎖を有してもよく、また^ これら鎖式炭化水素基を構成する炭素原子のうち、遊離原子価力存在する炭素原子以外の炭素原子の一つ以上が酸素、ィォゥ又は窒素の何れかのへテロ原子に置き換わってなる二価の基を表し、

一般式（1") あるいは（Γ) 中の ( メチル基またはノヽロゲノ置換メチル基を表す）の何れかで示される環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩であり、更には、前記の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩の何れかを有効成分とするヒストンデァセチラ一ゼ阻害剤、 MHC c lass— I 分子発現促進剤、並びに、前記の環状テトラペプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩の何れかを有効成分として含有する抗癌剤などの医薬用途糸滅物である。図面の簡単な説明

図 1は、トリコスタチン A、トラポキシンの分子構造並びにヒストン脱ァセチル化阻害の作用を示す図。

図 2は、トラポキシン類縁体の分子構造を示す図。

図 3は、実施例 1〜 3及び参考例 1の化合物の MHC cl ass— I分子発現促進作用とその添加濃度依存性を示す図。

図 4は、実施例 4、 5の化合物及びトリコスタチン Aの MHC class— I分子発現促進作用とその添加濃度依存性を示す図。

図 5は、ニコチン酸とその誘導体の MHC class— I分子発現促進作用とその添カロ濃度依存性を示す図。

図 6は、実施例 1の化合物並びにトリコスタチン Aの添加による B16ZBL6細胞内におけるヒストン脱ァセチルイヒを阻害する効果を示す図。

図 7は、実施例 2 1の化合物； HDA- 31のマウス尾静脈内投与後の血中濃度推移を示す図。発明を実施するための最良の形態

本発明の環状テトラペプチド誘導体、その製造方法に関して、以下により詳しく説明する。加えて、該環状テトラペプチド誘導体の示す薬理活性につき概説する。本発明の環状テトラペプチド誘導体は、上述する通り、一般式（ I ) 〜（ ') の化学式で示される 4種の互いに相関した構造の何れかにより示される。先ず、この 4種の分子構造が、以下に述べる通り、構造上、互いに密な相関関係を有し、その意味において、高い構造上の類似性を有する化合物群であることを説明する。本発明の一般式 ( I ) で示される環状テトラペプチド誘導体は、一旦それを構成する 4アミノ酸を連結して、対応する鎖状テトラペプチド誘導体を調製し、次いで、この鎖状テトラペプチド誘導体を環ィ匕して得られるものである。即ち、次の一般式 (I I) ：

(式中、 R„、 R_l2は、それぞれ一般式（I) の R„、 R₁₂と同じ基を表す）で示される α—アミノ酸、一般式 (III) ：

(式中、 R₂₁、 R₂₂は、それぞれ一般式（I) の R_2l、 ¾と同じ基を表す）で示される一アミノ酸、一般式（IV) ：

(式中、 R₃は、一般式（I) のと同じ基を表す）で示される環状の α—ァミノ酸、一般式（V) ：

(式中、 R₄ 一般式（I) の R₄と同じ基を表す）で示される α—アミノ酸、これら一般式- (Π) 〜（V) で示される 4種の α—アミノ酸をペプチド結合により環状テトラペプチド骨格を形成したのち、前記一般式 (V) の側鎖カルボキシル基をヒドロキサム酸に誘導したものである。本発明の一般式（Γ) で示される環状テトラペプチド誘導体前記の一般式 (I) で示される環状テトラペプチド誘導体に対して、ペプチド鎖の形成を逆方向に行ったものに相当する。即ち、一般式 (I) で示される環状テトラペプチド誘導体は、同じ一般式（II) 〜（V) で示される 4種のアミノ酸を Ν末から C末に向かい（Π)→ (III) → (IV) → (V) の順で連結したアミノ酸配列を有する力 \ 一般式（Γ) で示される環状テトラペプチド誘導体は、一般式（Π) 〜 (V) で示される 4種の α—アミノ酸を Ν末から C末に向かい（V) → (IV) → (III)→ (II) の順で連結したアミノ酸配列を有する。本発明の一般式（ 1") で示される環状テトラペプチド誘導体は、一般式（I ) で示される環状テトラペプチド誘導体に対して、一般式 (V)で示される側鎖に力ルポキシル基を有する α—アミノ酸に換え、次の一般式（V) ：

(式中、 R₄は、一般式（1") の R₄と同じ基を表す）で示される側鎖にアミノ基を有する α—アミノ酸を用い、一般式（II) 〜（IV) と一般式（V) で示される 4 種の一アミノ酸を同じ並びに、即ち、 Ν末から C末に向かい（II) → (III) →

(IV) → (V) の順でペプチド結合により環状テトラペプチド骨格を形成したのち、前記一般式 Π の側鎖アミノ基をァシル基で修飾したものである。また、本発明の一般式 ( I "') で示される環状テトラペプチド誘導体 ( 前記の一般式 ( 1") で示される環状テトラペプチド誘導体に対して、ペプチド鎖の形成を逆方向に行ったものに相当する。即ち、一般式 (Γ') で示される環状テトラペプチド誘導体は、一般式 (II) 〜 (V) で示される 4種の α—アミノ酸を Ν末から C末に向かい（II) -> (III) → (IV) → (V) の順で連結したアミノ酸配列を有するが、 · 一般式 ( Γ) で示される環状テトラペプチド誘導体は、同じ一般式 (II)〜（V)で示される 4種の α—アミノ酸を Ν末から C末に向かい（ →(IV) → (III) → (II) の順で連結したアミノ酸配列を有する。本発明の一般式 ( I ) で示される環状ペプチドにおいて、それを構成する α— アミノ酸の立体配置は、 L-体、 D—体の何れをも取り得るが、構造的な安定性の、から、少なくとも一つのアミノ残基は、他のアミノ酸残基と異なる立体配置をとること力好ましい。具体的に ( これら 4種の α—アミノ酸の立体配置を、少なくとも 1つを D—体にとり、残りを L—体とすると良い。例えば、 4種の α 一アミノ酸のうち、 D-体を一つ選択する際には、一般式 (V) の α—アミノ酸に隣接する一般式（Π) 又は一般式（IV) の α—アミノ酸の何れかを D—体とすればよく、 D—体を二つ選択する際には、一般式 (V) の α—アミノ酸に隣接する一般式（II) 及び一般式（IV) のひ—アミノ酸をともに D—体とすればよい。なお、一般式（Π) 並びに一般式（I I I) の α—アミノ酸をともにグリシン、即ち、 R„、 R₁₂並びに R₂₁、 ¾をともに水素を選択する際には、残る二つのアミノ酸をともに同じ立体配置に選択してもよい。この特異な選択においては、連続する二つのグリシンの存在により、この部位は柔軟性が高いゆえ、環状ペプチド全体として構造的安定性を保つこと力 ^ '可能となる。より好ましくは、前記 4種のアミノ酸のうち、環状アミノ酸である一般式（IV) で示されるものを、 D—体に選択し、残る 3種を L—体に邀尺する、あるいは、一般式（IV) で示されるものを、 L—体に選択し、残る 3種を D—体に選択するとよい。乃至前記 4種のアミノ酸のうち、環状アミノ酸である一般式 (IV) の α—アミノ酸並びに一般式（Π) の一アミノ酸を、ともに D—体に選択し、残る 2種を L一体に選択するとより好ましい。特に、一般式（I I) の α—ァミノ酸残基の側鎖が嵩高い際には、環状アミノ酸である一般式 (IV) の α—アミノ酸並びに一般式 (I I) の α—アミノ酸を、ともに D—体に選択し、残る 2種を L一体に選択すると一層好ましい。即ち、この環状ペプチドにおいて、本来の基質である Ν—ァセチルイ匕リジンの側鎖に替わり、ヒストンデァセチラーゼの酵素活性点に対して近接する部位は、一般式 (V)のアミノ酸の側鎖カルボキシル基から誘導されるヒドロキサム酸であるので、この一般式 (V) のアミノ酸天然のリジンと同じく、 L—体を選択するの力一層好ましい。従って、環状アミノ酸である一般式 (IV) で示されるものを、 D—体に選択し、残る 3種を L—体に選択する、あるいは、環状アミノ酸である一般式 (IV) の α—アミノ酸並びに一般式 (I I) のな一アミノ酸を、ともに D—体に選択し、残る 2種を L—体に選択することが一層好ましい態様となる。より好ましくは、前記 4種のアミノ酸のうち、環状アミノ酸である一般式（IV) で示されるものを、 D—体に選択し、残る 3種を L—体に選択する、あるいは、一般式（IV) で示されるものを、 L一体に選択し、残る 3種を D—体に選択するとよい。なお、この環状ペプチドにおいて、本来の基質である Ν—ァセチルイヒリジンの側鎖に替わり、ヒストンデァセチラーゼの酵素活性点に対して近接する部位は、一般式（V)のアミノ酸の側鎖カルボキシル基から誘導されるヒドロキサム酸であるので、この一般式（V) のアミノ酸は、天然のリジンと同じく、 L一体を選択するのがー層好ましい。従って、環状アミノ酸である一般式（IV) で示されるものを、 D—体に選択し、残る 3種を L—体に選択することが一層好ましい態様となる。次いで、一般式（V)のアミノ酸側鎖から誘導された側鎖ヒドロキサム酸構造；一 R₄— CO—丽— 0Hに関して述べると、上述するとおリ、この部位は、本来の基質である N—ァセチル化リジンの側鎖；一（CH₂) ₄— NH— CO— CH₃に替わる部位であリ、二価の基 R₄の鎖長少なくとも 4以上がよく、上限の 6以下とするのがよい。即ち、 R₄の鎖長が 4未満とすると、ヒストンデァセチラ一ゼの酵素活に対して適切に近接することができず、他方、 7以上になると、不要に長くなつてしまい、何れの場合にも、ヒストンデァセチラ一ゼの酵素活性阻害能力著しく損なわれる。この二価の基 R₄ (d N—ァセチル化リジンの側鎖と同じく分岐鎖のないものでもよく、既知阻害物質トリコスタチン Aにおける対応する鎖状部分と同様に、鎖上に分岐鎖力存在してもよい。なお、分岐鎖は、その鎖長 4を超えるなぃ範囲から選択するとよく、好ましく^ 炭素数 3以下、特に炭素数 1のメチル基（CH₃—）又はメチリデン基（CH₂= ) がより好ましい。 R₄の主鎖は、のアルキレン基、或いは、不飽和のアルケニレン基、アルカジエ二レン基の何れでもよく、分岐鎖のメチリデン基（CH₂= ) を有する場合には、前記の主鎖より不飽和炭素-炭素結合力曾えることになる。但し、主鎖中に不飽和炭素—炭素結合を有する場合、主鎖の方向に関して、トランス型となるものがよい。なお、具体的に一般式 (V) のアミノ酸の一例をあげると、 R₄に炭素数 4のテトラメチレン基を選択するものは 2—ァミノヘプタン二酸（α—アミノピメリン酸； Η- Api- 0Η) であり、に炭素数 5のペンタメチレン基を選択するものは 2— ァミノオクタン二酸（α—アミノスべリン酸； H- Asu-OH) であり、 R₄に炭素数 6 のへキサメチレン基を選択するものは 2—アミノノナンニ酸（α:—アミノアゼラィン酸； H-Aaz-OH) である。環状テトラペプチドの残る部分前記の一般式（V)のアミノ酸に由来する側鎖ヒドロキサム酸構造；— 一 CO— NH— 0Hをヒストンデァセチラ一ゼの酵素活性点に向け、保持する役割を持ち、この働きは、既知の不可逆的な阻害剤であるトラポキシン ¾体の環状ペプチド部の機能と実質的に同じものである。即ち、この環状テトラぺプチドの残る部分によりて、ヒストンデァセチラ一ゼの酵素活性点近傍に分子間結合し、前記の一般式 (V)のアミノ酸に由来する側鎖ヒドロキサム酸構造を酵素活性点上に固定する役割を持つ。従って、残る 3種の一アミノ酸は、その側鎖を利用してヒストンデァセチラ —ゼ蛋白質表面に結合できる限り、如何なるものでもよいが、一般式 (IV) の環状アミノ酸は、前記の一般式（V)のアミノ酸に由来する側鎖ヒドロキサム酸構造の向く方向を固定する際、主に機能する。一般式 (IV) の環状アミノ酸の環構造図 2に示すトラポキシン Bにおける天然の D—プロリンと同じ 5員環、あるい図 2に示すトラポキシン Aにおける天然の D—ピぺリジン一 2—カルボン酸と同じ 6員環の何れかが好ましい。従って、この環を構成する二価の基 ( プ口リンにおけるトリメチレン基、ピぺリジン一 2—力ルボン酸におけるテトラメチレン基、あるいは、これら鎖長 3又は 4の直鎖炭化水素基に対応し、炭素一炭素二重結合を有する不飽和な直鎖炭ィは素基が好ましい。なお、前記の鎖長 3又はの直鎖炭化水素基鎖上に分岐鎖カ加されるものでもよく、分岐鎖に代えて、環構造カ铺合した構造を形成するもの、あるいは、これら二価の炭化水素基において、アミノ窒素原子並びにカルボン酸の α位の炭素原子と結合を形成している、当該二価の基における遊離原子価の存在する炭素原子以外の炭素原子を、酸素、ィォゥ、又は窒素の何れかのへテロ原子で置き換えたものでもよい。前記する分岐鎖に代えて、環構造が縮合した構造を形成するものは、一般式 (IV) の環状ァミノ酸において、 R₃自体環の一部として存在する。例えば、 1，2，3, 4—テトラハイドロイソキノリンー 3—カルボン酸ピペリジン一 2—カルボン酸にベンゼン環力縮合した構造を形成したものに相当し、この例のように、環状アミノ酸の環構造が二つの環カ宿合した構造となっているものを意味する。なかでも、 R₃には、トリメチレン基、テトラメチレン基、あるいは、これら鎖長 3又は 4の直鎖炭化水素基に対応し、炭素一炭素二重結合を有する不飽和な直鎖炭化水素基等がより好ましい。なお、一般式（IV) の環状アミノ酸に換えて、当該環状アミノ酸の環構造を形成する炭素鎖が分断された類似の構造を持った N—アルキルィ匕一アミノ酸、例えば、 N—メチルグリシン（サルコシン）等を用いる変形も本発明に包含される。なお、この一般式（IV) の環状アミノ酸に換えて、類似の構造を持った N—アルキルィ匕 α—アミノ酸を利用する際に当該 Ν—アルキル化 α—アミノ酸 D 体の環状アミノ酸の立体配置と等価な立体配置を採るもの力好ましい。従って、 Ν —アルキル化に利用されるアルキル基としては、メチル基またはェチル基が好ましく、特にメチル基がより好ましい。残る二つの一アミノ酸は、天然に見出される α—アミノ酸と同じ程度の嵩を有する側鎖を持つものが一般には、好ましい。即ち、図 2に示すトラポキシン類縁体におけるチロシンの Ρ—ヒドロキシベンジル基、フエ二ルァラニンのベンジル基、あるいはトリプトファンの 3—ィンドリルメチル基の嵩を上限とするものである。また、これらトラポキシン,体中の対応部分と同じく、塩基性ァミノ酸あるいは酸性アミノ酸以外のアミノ酸、即ち、 «性アミノ酸ならびに親水性アミノ酸のうち中性アミノ酸が好ましい。更には、天然の ¾ΤΚ性アミノ酸ならびに親水性ァミノ酸のうち中性ァミノ酸と構造的な類似性を有する非天然のァミノ酸でもよい。従って、 R_u、 R₁₂並びに R₂い ¾における好ましい選 iRI5としては、 7素、炭素数 1〜 6の直鎖アルキル基、炭素数 3〜 6の分岐のアルキル基、ベンジル基、 4—メトキシベンジル基、 3—インドリルメチル基、（N—メ卜キシー 3—インドリル）メチル基、（N—フオルミルー 3—インドリル）メチル基、更には、ベンジル基と類似する、環数 4以下のァリ一ル基カ置換したメチル基等を挙げることができる。前記する環数 4以下のァリール基カ換したメチル基とは、縮合環構造を構成する環数が 4以下のァリール基、例えば、 1-ナフチル基、卜フエナントリル基などにより置換されたメチル基を意味し、ベンジル基に更にベンゼン環が縮合したものに相当する。加えて、い R₁₂並びに R₂い R₂₂で表される α—アミノ酸側鎖においては、図 1 に示すトリコスタチン Αに見られる Ν， Ν—ジメチルァミノフエニル基の如く、それに含まれるァミノ基窒素原子上に二置換がなされているものを用いることもでき、あるいは、ベンジル基中のフエニル基に換えてピリミジル基の如く、複素芳香環基中に窒素原子を含むものに置き換えたものを用いることができる。更に側鎖のカルボキシル基をエステル、アミドに変換したものも用いることができる。また、図 2に示すクラミドシンにおいて見出される、 2—メチルァラニン（2— ァミノ— 2—メチルプロパン酸； Η - Aib-OH) の如く、通常の天然の α—アミノ酸の位上に更に嵩の小さな側鎖力存在してもよい。なお、 2—メチルァラニンなどのように、ともに立体的な干渉を及ぼさない嵩の小さな側鎖である場合を除き、 R_u、 R₁₂の何れカぉ _Κ素原子を選択するとよい。同じ理由から、ぃの何れかは 7 素原子を選択するとよい。特に上記の一般式 (I I) 並びに一般式（I I I) で表される α—アミノ酸として、天然の ¾τ性アミノ酸並びにチロシンなど、蛋白質との結合において、 »性相互作用に利するものを選択するとより一層好ましい。なお、チロシンあるいはトリプトファンなど、ヒドロキシル基ゃィミノ基が存在する場合、ヒドロキシノレ基を 0—アルキノレイ匕する、イミノ基を Ν—アルコキシ化する、あるい Ν—ァシル化する等の修飾を施し、当該原子団を保護するとよい。従って、一般式 ( I ) で示される環状テトラペプチド誘導体において、一層好ましいものの一例を挙げると、次の一般式 (VI ) ：

(式中、 R„は一般式（ I ) の R_nと同義の基を表し、 R_2Iは一般式 ( I ) の R₂₁と同義の基を表し、は一般式 ( I ) の R₃と同義の基を表し、 R₄は一般式（ I ) の R₄と同義の基を表す。）で示すことができ、、 R_2lには、天然の疎水性アミノ酸並びにチロシンなど、蛋白質との結合において、 ¾ j性相互作用に利するものを選択するとよリー層好ましい。具体的には、一般式 (VI) において、フエニルァラニンのベンジル基、チロシンの p—ヒドロキシベンジル基又はその 0—メチル化した P—メトキシベンジル基、ァラニンのメチル基、イソロイシンの 1-メチルプロピル基、バリンのィソプロピル基、ロイシンのィソブチル基、グリシンの水素、あるいは、ェチル基、プロピル基などを R_u、 R₂₁に選択すると一層好ましいものとなる。また、 R_uに選択する基が、前記するベンジル墓 p—メトキシベンジル基など芳香環を含む基である際には、 R₂₁に選択する基鎖状炭化水素基を選択すると好ましい。この組み合わせ当該環状ペプチドの合成を行う際にも利する。本発明の一般式（ Γ) の環状テトラペプチド誘導体は、一般式 ( I ) の環状テトラペプチド誘導体における環を形成するアミノ酸配列を反転させたものであり、一般式（ I ) の環状テトラペプチド誘導体において、好ましい一般式（I I)〜（V) のアミノ酸の選択は、一般式 ( Γ) の環状テトラペプチド誘導体においても、同様に好ましいものである。また、一般式（I I)〜（V) のアミノ酸の立体配置に関しても、一般式（IV)の環状 α—アミノ酸並びに一般式（I I)の α—アミノ酸を D— 体に選択し、残りの 2種の α—アミノ酸を L—体とする、あるいは、その鏡像体となるように選択するとよリ好ましい。また、本発明の一般式 ( 1 ") の環状テトラペプチド誘導体は、一般式（I ) の環状テトラぺプチド誘導体における一般式 (V)に示す α—アミノ酸の側鎖カルボキシル基から誘導されたヒドロキサム酸構造を、基質ァセチル化ヒストンにおけるァセチルイ匕リシン残基の側鎖の Ν—ァセチルァミノ ¾冓造に類する構造に置き換えたものに相当する。従って、一般式（I I )〜（IV)のアミノ酸の選択は、一般式 ( I ) の環状テトラペプチド誘導体において、好ましい一般式 (Π)〜（IV) のァミノ酸の選択は、一般式（1 ") の環状テトラペプチド誘導体においても、同様に好ましいものである。また、一般式（V) のアミノ酸に関しても、その側鎖を構成する二価の基 R₄に関しては、一般式 ( I ) の環状テトラペプチド誘導体において、一般式（V) のアミノ酸に由来する二価の基 R₄として好ましいものは、同様に好ましいものとなる。特に、一般式 (V)のアミノ酸と異なる点は、一般式 (V) のアミノ酸においては、ァセチルイ匕リシン残基の側鎖に対応する、二価の基 R₄の鎖長を 4に選択すると一層好ましいことである。また、一般式 (I I) 〜（IV)、及び (V のアミノ酸の立体配置は、上述した一般式（I ) の環状テトラペプチド誘導体において好ましい選択は、同じく好ましい。結果として、一般式 ( I ) の環状テトラペプチド誘導体において好ましい一例である上記"^式 (VI) のヒドロキサム酸構造を N—ァシル化ァミノ »冓造に置き換えた一連の化合物一般式 ( 1 ") の環状テトラペプチド誘導体においても、好ましい一例となる。また、本発明の一般式（1 ") の環状テトラペプチド誘導体^ ~¾式（I ) の環状テトラぺプチド誘導体における一般式 (V)に示す α—アミノ酸の側鎖カルボキシル基から誘導されたヒドロキサム酸構造を、基質ァセチル化ヒストンにおけるァセチル化リシン残基の側鎖の Ν—ァセチルァミノ冓造に類する構造に置き換えたものに相当する。従って、一般式（I I)〜（IV)のアミノ酸の選択^ 一般式 ( I ) の環状テトラペプチド誘導体において、好ましい一般式 (Π)〜（IV) のァミノ酸の選択一般式 ( 1 ") の環状テトラペプチド誘導体においても、同様に好ましいものである。また、一般式 (V) のアミノ酸に関しても、その側鎖を構成する二価の基 R₄に関しては、一般式 ( I ) の環状テトラペプチド誘導体において、一般式 (V) のアミノ酸に由来する二価の基 R₄として好ましいものは、同様に好ましいものとなる。結果として、一般式（I ) の環状テトラペプチド誘導体において好ましい一例である上記一般式 (VI) のヒドロキサム酸構造を N—ァシルイ匕アミノ纖造に置き換えた一連の化合物は、一般式（1 ") の環状テトラぺプチド誘導体においても、好ましい一例となる。本発明の一般式 ( I "') の環状テトラペプチド誘導体は、一般式（Γ) の環状テトラべプチド誘導体における一般式 (V)に示す α—ァミノ酸の側鎖カルボキシル基から誘導されたヒドロキサム酸構造を、基質ァセチル化ヒストンにおけるァセチル化リシン残基の側鎖の Ν—ァセチルァミノ基構造に類する構造に置き換えたものに相当する。あるいは、一 f¾S式 ( 1 ") の環状テトラペプチド誘導体における環を形成するアミノ酸配列を反転させたものにも相当する。従って、一般式（I I) 〜（IV)のアミノ酸の選択は、一般式 ( I )の環状テトラペプチド誘導体において、好ましい一般式（I I)〜（IV) のアミノ酸の選択一般式 ( I "') の環状テトラペプチド誘導体においても、同様に好ましいものである。また、一般式（V) のアミノ酸に関しても、その側鎖を構成する二価の基 R₄に関しては、一般式（I ) の環状テトラペプチド誘導体において、一般式 (V) のアミノ酸に由来する二価の基 R₄として好ましいものは、同様に好ましいものとなる。特に、式 (V) のアミノ酸と異なる点は、一般式（V のアミノ酸においては、ァセチル化リシン残基の側鎖に対応する、二価の基 R₄の鎖長を 4に選択すると一層好ましいことである。また、一般式（I I) 〜（IV)、及び ( )のアミノ酸の立体配置は、上述した一般式（1 ') の環状テトラペプチド誘導体において好ましい選択は、同じく好ましい。本発明の一般式 ( I "') の環状テトラペプチド誘導体は、一般式（1 ') の環状テトラペプチド誘導体における一般式 (V)に示す α—アミノ酸の側鎖カルボキシル基から誘導されたヒドロキサム酸構造を、基質ァセチルイ匕ヒストンにおけるァセチルイヒリシン残基の側鎖の Ν—ァセチルアミノ造に類する構造に置き換えたものに相当する。あるいは、一般式 ( I ") の環状テトラペプチド誘導体における環を形成するアミノ酸配列を反転させたものにも相当する。従って、一般式（Π) 〜（IV)のアミノ酸の選択一般式（I )の環状テトラペプチド誘導体において、好ましい一般式 (Π)〜（IV) のアミノ酸の選択は、一般式 ( I "') の環状テトラペプチド誘導体においても、同様に好ましいものである。また、一般式（V) のアミノ酸に関しても、その側鎖を構成する二価の基 R₄に関して一般式（I ) の環状テトラペプチド誘導体において、一般式 (V) のアミノ酸に由来する二価の基 R₄として好ましいものは、同様に好ましいものとなる。本発明の環状テトラべプチド誘導体は、その環を形成するァミノ酸配列が同じ又はその逆順序である、一般式（I ) 〜（IV) の 4種の何れかである力ァミノ酸配列が同じである場合、一般に、一般式（ I ) の化合物一般式（ 1 ') の化合物より好ましく、一般式 U ") の化合物は、一般式（Γ") の化合物より好ましい。一般式（ I ) の化合物と一般式（1 ") の化合物の比較においては、一般式 (V) のアミノ酸残基の側鎖を構成する R₄と一般式（V) のアミノ酸残基の側鎖を構成する R₄が同じ場合、一般に、一般式（I ) の化合物がより好ましい。本発明の一般式 ( I ) の環状テトラペプチド誘導体は、上述するとおリ、一般式 ( 11 )〜 (V)に示す 4種の α—ァミノ酸を出発原料として、ぺプチド鎖の形成 ·環化の工程により 3iすることができる。その工程の一例に関して、以下に概説する。

(製造方法) - 本発明の環状テトラペプチド誘導体は、一旦一般式（I I )〜(V)に示す 4種の α— アミノ酸がぺプチド結合した鎖状のテトラべプチド中間体を調製し、しかる後に環状テトラペプチドとし、最終的に一般式 (V) に示す α—アミノ酸の側鎖カルボキシル基をヒドロキサム酸構造に誘導することで製造することができる。以下のこの 3t工程を概説する。なお、鎖状のテトラペプチド中間体は、目的とする環状テトラベプチド誘導体の何れのぺプチド結合で開裂した構造を用いることができる力、以下の説明で一般式 (IV) で表される環状 α—アミノ酸を C末に、一般式 (V)で表される α—アミノ酸を Ν末とする鎖状のテトラペプチド中間体を経る合成経路を例にとり説明する。

(工程 1 ) 鎖状のジ、トリ、及びテトラペプチドの合成

まず、汎用のペプチド合成法に従い、一般式（Π Ι)及び一般式 (IV)のアミノ酸を結合し、更に一般式 ( Π)のアミノ酸を結合し、最後に、側鎖カルボキシル基をべンジルエステル化して保護した一般式 (V) のアミノ酸、例え L- Aaz(0Bzl)、 L-Asu(0Bzl)、 L-Api (OBzl) 等を結合して、下記一般式 (VI I) ：

(式中、 R_n, R₁₂、 R₂₁、 R₂、 R₃並びに R₄ それぞれ一般式（I ) の R„、 R₁₂、 R₂い R₂₂、 R₃並びにと同じ基を表す）で示される鎖状テトラペプチドを形成する。なお、この過程において、原料アミノ酸のァミノ保護基には Boc-基または Z- 基、またカルボキシル基保護のためには tert-ブチルエステルを用い、 DCC/HOBt 法により縮合した。また、 Z-基は酢酸中 Pd-C触媒によって接触還元的に除去し、酢酸を留去した後、フリーアミンとして重曹水を用いて酢酸ェチル中に抽出した。抽出液から回収した生成物の油状物を真空乾燥後の次の縮合に用レ、た。

一般式 (VI I)で示される全保護鎖状テトラペプチドはシリカゲルカラムを用いるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。

(工程 2 ) 高々度希釈法による環状ペプチドの合成

トリフルォロ酢酸を用いて、一般式 (VI I)で示される全保護鎖状テトラべプチドの Boc-基及び tert-ブチルエステルの除去（脱保護）を行った。下記の一般式 (VI I I) ：

(式中、 R_l R₁₂、 R₂い R₂、 R₃並びに R₄ ( それぞれ一般式（I ) の R_u、 R₁₂、 R₂い R₂₂、 R₃並びにと同じ基を表す。 ) で示される生成物反応液からトリフルォ口酢酸を留去後、エーテル及び石油エーテルで固化し、真空乾燥した。一般式（VI I で示されるペプチド使用予定量の 1 0量を DMFに溶解し 0. ImM の濃度になるように設定した。 DMF溶液に氷冷下、第三級ァミン、例えば、ジィソプロピルェチルァミン及び HATU (0— (7— Azabenzotriazoi— 1— yl)— 1， 1， 3， 3-tetramethyluronium hexaf luorophosphate) をカロえ、室温で 30分間撹拌した。引き続き、前記の DMF溶液に、一般式 (VI I I) で示されるペプチド使用予定量の 1/10量とジイソプロピルェチルァミン及び HATUを追カ卩し、室温で 30分間撹拌した。前記の操作を計 10 回繰り返し環化反応を行った。反応終了後、下記一般式

(IX) ：

(式中、 R„、 R₁₂、 R₂い、 R₃並びに R₄ ( それぞれ一般式 ( I ) の R„、 R₁₂、 R₂い、 R₃並びにと同じ基を表す。 ) で示される反応生成物（環状ペプチド）を酢酸ェチル中に抽出し、シリカゲルカラムを用いるフラッシュクロマトグラフィ一によって精製した。

(工程 3 ) 側鎖ヒドロキサム酸構造の導入

一般式 (IX) で示される環状ペプチドの側鎖べンジルエステルは、メタノール中 Pd-C触媒によって接触還元的に除去し、メタノールを留去した後、真空乾燥し、カルボン酸として油状物を得た。

前記の脱保護によリ得られた側鎖カルボン酸の環状ペプチド化合物及び HOBt を DMFに溶解し、氷冷下ヒドロキシルァミン塩酸塩、トリェチルァミン、次いで B0P試薬を添加し 1時間撹拌した。反応終了後、 DMFを留去し、水でデカンテーシヨンを行った後、凍結乾燥により、最終生成物の白色粉末を得た。この白色粉末を少量のメタノールに溶解し、 HPLCでセミ分取用カラムを用いて精製し、凍結乾燥により一般式 ( I ) で示される目的物を得た。本発明の一般式（Γ) で示される環状テトラペプチド誘導体上述する工程 1に準じて、鎖状のテトラペプチドの合成を行い、次いで、工程 2の条件を利用して環状テトラペプチドとする。原料の一般式 (V) で示される α—アミノ酸に由来する側鎖べンジルエステル等の形状で保護されているカルボキシル基を工程 3に準じて、側鎖ヒドロキサム酸構造に変換することで調製することができる。一方、本発明の一般式 (1")で示される環状テトラペプチド誘導体一般式 (V) で示される α—アミノ酸に換え、一般式 )で示される一アミノ酸を用いて、上述の工程 1に準じて、鎖状のテトラペプチドの合成を行い、次いで、工程 2の条件を利用して環状テトラペプチドとする。この際、該一般式 (V)で示される α —アミノ酸の側鎖アミノ基は、ベンジルォキシカルボニル基 (Ζ基）等の汎用される保護基を用いて保護し、一連のペプチド結合の形成と環化反応を行う。次いで、得られた環状テトラペプチド中、当該一般式 (V で示される α—アミノ酸の側鎖アミノ基上の保護基を脱保護し、一旦塩酸塩とする。しかる後、目的のァシル基をこの側鎖アミノ基上に置換-導入する。例え目的のァシル基の導入は、対応する酸無水物を用い、汎用の Ν—ァシル化反応によリ行うことができる。本発明の一般式（Γ")で示される環状テトラペプチド誘導体も、一般式 (V)で示される α—アミノ酸に換え、一般式 (V)で示される α—アミノ酸を用いて、上述した一般式 ( ) で示される環状テトラペプチド誘導体の合成におけると同様に、環状テトラペプチド構造を形成する。しかる後に、この環状テトラペプチド構造中、当該一般式 (V)で示される α—アミノ酸の側鎖アミノ基上の保護基を脱保護し、一旦塩酸塩とする。し力る後、目的のァシル基をこの側鎖アミノ基上に置換' 導入する。この Ν—ァシル化反応は、一般式（Γ')で示される環状テトラペプチド誘導体における条件に準じて行うことができる。上記の合成法に加え、一般式（ I ) 又は一般式 ( ) で示される化合物に関しては、下に述べる実施例 1 4、実施例 1 8、実施例 2 3において、具体例により示す固相合成法を利用した方法により合成を行うことができる。また、一般式又は一般式（ 1 "') で示される化合物についても、下に述べる実施例 1 4、実施例 1 8において、具体例により示す固相合成法を利用した方法に準じて、ぺプチド鎖の延長とその璟ィ匕反応を行うことができる。本発明の環状テトラペプチド誘導体の薬学的に許容される塩とは、例え塩基性を示す窒素原子を含む誘導体では、塩酸塩などの薬学的に許容される無機酸との塩、酢酸塩などの薬学的に許容される有機酸との塩を意味する。本発明の MHC class— I分子発現促進剤〖^ 上で説明した側鎖末端にヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）を持つ環状テトラベプチド誘導体、あるいは、側 $1*端に N—ァシル化ァミノ £|冓造を持つ環状テトラべプチド誘導体を有効成分とするものであり、下記する試験例に示すとおり、優れた発現促進活性を有する。その MHC class— I分子発現促進作用は、ヒストンデァセチラーゼ酵素阻害活性に付随するものであるが、ヒドロキサム酸構造を持つトリコスタチン Aと同じく、この阻害は可逆的なものである考えられる。また、高い濃度投与で顕著となるヒストンデァセチラ一ゼ素阻害自体に起因する細胞増殖阻害、細胞周期の阻害作用のみならず、促進された MHC class— I分子発現に起因する、細胞傷害性 T細胞の関与する癌細胞や癌化ウィルス感染細胞の排除作用の相補的な効果で、高い治療効果を発揮する利点を持つ。加えて、不可逆的な阻害剤であるトラポキシン,体と比較するとき、正常糸！^細胞に対する副作用等、生体に対する好ましからざる影響の残留カ少なく、治療効果と対比するとき、相対的な副作用が大幅に低減された薬剤としての応用が期待される。本発明の医薬組成物は、前記の MHC class— I分子発現促進作用を利用して治療効果を達成するものである力 \ 有効成分となる環状テトラベプチド誘導体の用量は、その治療目的、症状の程度、投与対象者の性別、年齢、体重等に応じて適宜決定されるものである。投与対象者が成人男子である場合、 1日当たりの用量を 0 . 1〜5 O m gZ k gの範囲、好ましくは、 0 . 5〜 1 O m gZ k gの範囲内に選ぶのが一般的であり、数回に分けて投与すると好ましい。この医薬糸滅物は、有効成分となる環状テトラべプチド誘導体にこの種のぺプチド様化合物製剤に汎用される添加剤を加えて、投与経路に適する剤形とすることができる。細胞透過性に富むものであるので、多種の投与経路が利用することが可能であるが、ぺプチドホルモンなどの投与に多様される投与形態、投与経路を取るのが好ましい。本発明の環状テトラペプチド誘導体とその製造方法、並びに、該環状テトラペプチド誘導体の有する優れた生理活性、即ち、 MHC class— I 分子発現促進作用及びヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害活性に優れることを具体例によリ説明する。例 1 ) HDA-5； eye 1 o (-Asu(NHOH)-Phe-Phe-D-Pro-)

下記式（X) ：

で示される環状テトラペプチド HDA-5； cyclo(-Asu(NHOH)- Phe-Phe- D- Pro-)の合成方法を工程を追って述べる。

cyclo (-Asu(NHOH)- Phe-Phe- D- Pro- )の合成工程卜 1 Z-Phe-D-Pro-OtBu

Z-Phe-0H(874 rag, 2.92 mmol), H-Pro-0tBu(500mg, 2.92画 1), HOBt - Η₂0 ( 490 mg, 3.20 mmol)の DMF( 15ml)溶液に、氷冷下にて DCC(660 mg， 3.20 mmol)を加え、そのまま 1時間、さらに室温で終覚拌した。反応液を濾過、濃縮後、酢酸ェチルに再溶解し、 10%クェン酸、 4% NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、濃縮、残渣をフラッシュシリ力ゲルクロマトグラフィー (CHC1₃) で精製し、標記ジペプチド化合物 1.40_g(quant)を油状物質として得た。

Rf = 0.72 (CHCl₃/MeOH = 9/1) 工程 1-2 Z-Phe-Phe-D-Pro-OtBu

工程 1-1で得られたジぺプチド化合物 Z- Phe- D- Pro- OtBu (700 mg, 1.45 mmol) を酢酸 (5 ml)に溶解し、 5% Pd/C (70mg)存在下、水素雰囲気下で終夜（約 14時間）撹拌した。反応混合物を濾過、激宿後、油状残渣を酢酸ェチルに溶解し、- 4% NaHC0₃で洗浄した。無水炭酸ナトリウム上で乾燥後、濃縮して H- Phe- D- Pro- 0tBu(425mg, 92%)を得た。これを、 DMF(5ml)に再溶解し、 Z- Phe- 0H(434 mg， 1.45 mmol), H0Bt.H₂0 ( 245 mg, 1.60 mmol), さらに氷冷下にて DCC(330 mg， 1.60 mmol) を加え、そのまま終夜撹拌した。反応液を濾過、濃縮後、酢酸ェチルに再溶解し、 10%クェン酸、 4%NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。 MgS0₄上で乾燥後、濃縮、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー (CHC1₃)で精製し、標記トリぺプチド化合物 720 mg(90%)を泡状物質として得た。

Rf = 0.52 (CHCl₃/Me0H = 9/1) 工程 1-3 Boc-Asu (OBz 1 ) -Phe-Phe-D-Pro-0tBu

工程 1-2で得られたトリぺプチド化合物 Z- Phe- Phe- D- Pro-0tBu (422 mg, 0.704 腿 ol)を酢酸 (5 ml)に溶解し、 5%Pd/C (40 mg)存在下、水素雰囲気下で終夜（約 14時間）撹拌した。反応混合物を濾過、濃縮後、油状残渣を酢酸ェチルに溶解し、 4% NaHC0₃で洗浄した。無水炭酸ナトリウム上で乾燥後、纖して H- Phe-Phe-D - Pro-0tBu(302mg, 92%)を得た。

これを、 DMF(5ml)に再溶解し、 Boc-Asu(0Bzl)-0H(320 mg, 0.844 mmol), H0Bt.H₂0(142 mg, 0.844隱 ol)、さらに氷冷下にて DCC(192 mg, 0.928 mmol)をカロえ、そのまま終夜撹拌した。反応液を濾過、濃縮後、酢酸ェチルに再溶解し、 10% クェン酸、 4%NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。 MgS0₄上で乾燥後、灘宿、残渣をフラッシュシリ力ゲルクロマトダラフィ一 (CHC1₃)で精製し、標記鎖状テトラベプチド化合物 426 mg(80%)を泡状物質として得た。

Rf = 0.59 (CHCl₃/MeOH - 9/1)

HPLC: Rt = 23.5 min (column ： Wako Pak C4, 4.6x150醒， 37 - 100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min) 工程 1-4 H-Asu (OBz 1 ) -Phe-Phe-D-Pro-OH. TFA

工程 1-3で得られた化合物 Boc- Asu(OBzl)- Phe- Phe- D- Pro- OtBu (426 mg, 0.52 mmol)に TFA(2ml)を加え、氷冷下 2時間撹拌した。反応液を '獻宿し、残渣にエーテル/石油エーテル (1/5)を加えさせ、標記化合物 (366mg, 90%)を白色粉末として得た。

Rf = 0.47 (CHCl₃/MeOH/AcOH= 90/10/2)

HPLC: Rt = 10.32 min (条件は工程 1-3と同じ）

FAB-MS: m/z -= 671 (M+1) 工程卜 5 eye 10 (-Asu (OBz 1 ) -Phe-Phe-D-Pro-)

工程 1-4で得られた化合物 H- Asu(OBzl)- Phe-Phe-D- Pro- 0H.TFA (31 mg, 0.040 mmol)の DMF(400ml)溶液に、 HATU(23mg, 0.060 mmol), 10%DIEA/DMF(280^ 1, 0.16 醒 ol)を加え室温で 30分間撹拌した。さらに、化合物 H- AsuOffizD-Phe-Phe-D- Pro- 0H.TFA (31 mg, 0.040 mmol)、 HATU (23 mg, 0.060 nunol), 10% DIEA/DMF(280 β\, 0.16腿 ol)を 30分毎に 9回加えた。反応液を濃縮後、残渣を酢酸ェチルに再溶解し、 10%クェン酸、 4% NaHC0₃および!^口食塩水で順次洗浄、無冰 MgS0₄上で乾燥、した。得られた残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（2.5%メタノール ZCHC1₃) にて精製し、標記環状テトラペプチド化合物（220 mg， 84%) を油状物質として得た。

HPLC: Rt = 14.20 min (条件 (i 程 1-3と同じ）工程 1-6 cyclo(-Asu(0H)-Phe-Phe-D-Pro-)

工程 1-5で得られた化合物 eye 10 (-Asu (OBz 1 ) -Phe-Phe-D-Pro-) (94 mg, 0.144 mmol)を MeOH(3 ml)に溶解し、 5% Pd/C(10 mg)存在下、水素雰囲気下で 4時間撹拌した。反応混合物を濾過、濃縮して、標記化合物 (74 mg， 91%)を油状物質として得た。

HPLC: Rt = 17.03 min (column ： Wako Pak C18， 4.6x150匪， 10一 100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min) 工程 1-7 eye 1 o (-Asu(NHOH) -Phe-Phe-D-Pro-)

工程 1-6で得られた化合物 cyclo(-Asu(0H)-Phe-Phe-D-Pro-) (74 mg, 0.132 醒 ol)、 HOBt · H₂0 ( 30 mg, 0.198腿 ol)の DMF(3 mi)溶液に、塩酸ヒドロキシルァミン（19 mg, 0.264腿 ol) の DMF溶液に ΤΕΑ(40 μΛ， 0.264腿 ol) を加え中和処理した後濾過した濾液、 B0P(90 rag, 0.178醒 ol)を氷冷下にて加え、 3時間撹拌した。反応液を II宿後、これを、 MeOHに溶解し逆相 HPLCにて分 ¾ϋ製（col醒： YMC-Pack ODS A323, 10x250 ram, 25% CH₃CN I 0.1% TFA) 、凍結乾燥して標記ィ匕合物を得た。

HPLC: Rt = 16.43 min (条件 ii 程 1-6と同じ）

FAB-MS: m/z = 577 (M+)

(実施例 2 ) HDA- 17 ; eye 10 (- Aaz (NH0H) -Phe-Phe-D- Pro- )

下記式 (XI) ：

で示される環状テトラベプチド HDA- 17； cyclo(- Aaz(NHOH)- Phe-Phe-D- Pro-)の合成工程を簡単に述べる。実施例 1に記載する工程 1-2に引き続き、工程卜 3に準じて、 Boc- Asu(0Bzl )-0Hに換え Boc- Aaz(OBzl )- 0Hを用いて、鎖状テトラぺプチド Boc-Aaz(OBzl )-Phe-Phe-D-Pro-OtBuを調製した。それ以降、工程 1-4〜工程 1-7 の手法を適用して、脱保護、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）への変換を行い、標記環状テトラべプチドを得た。

FAB-MS: m/z = 591 (M+)

(実施例 3 ) HDA-18； cyclo(-Api ( HOH)-Phe-Phe-D-Pro-)

下記式（XI I ) ：

で示される環状テトラぺプチド HDA-18； cyclo (- Api (NHOH)-Phe-Phe-D- Pro- )の合成工程を簡単に述べる。実施例 1に記載する工程 1-2に引き続き、工程 1-3に準じて、 Boc- Asu(OBzl)- 0Hに換え Boc- Api (OBzl)- 0Hを用いて、鎖状テトラべプチド Boc-Api (OBzl )-Phe- Phe- D-Pro- OtBuを調製した。それ以降、工程 1-4〜工程 1-7 の手法を適用して、脱保護、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）への変換を行い、標記環状テトラペプチドを得た。

FAB-MS : m/z = 563 (M⁺) (実施例 4 ) HDA-12； cycio(- Asu(NHOH)- D- Phe- Leu- Pip- ) 下記式 (XI I I ) ：

で示される環状テトラぺプチド HDA- 12； cyclo(- Asu(NHOH)- D- Phe-Leu-Pip-)の合成工程を簡単に述べる。実施例 1の工程 1-1に準じて、 Z-Leu-OHと H- DL-Pip-OtBu から Z- Leu-DL- Pip - OtBuを調製した。実施例 1の工程 1-2に準じて、 Z- Leu-DL- Pip-OtBuと- Z- D-Phe- OHから Z-D-Phe-Leu-DL- Pip-OtBuを調製した。次いで、実施例 1の工程 1-3に準じて、 Z-D- Phe- Leu-DL- Pip-OtBuと Boc-Asu(OBzI )- OHから、鎖上テトラペプチド Boc-Asu(OBzl )- D-Phe-Leu- DL- Pip- OtBuを得た。以降、工程 1-4〜工程 1-7の手法を適用して、脱保護、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）への変換を行い、標記環状テトラペプチドを得た。

FAB-MS: m/z = 559 (M+)

(実施例 5 ) HDA-15； eye 1 o (-Asu (NHOH) -A i b-Phe-D-Pro-)

下記式（XIV) ：

で示される環状テトラべプチド HDA-15； cyclo(-Asu(NHOH)-Aib-Phe-D- Pro- )の合成工程を簡単に述べる。実施例 1の工程 1-1に引き続き、工程 1-2に準じて、 Z- Phe-OHに換えて Z-Aib-OHを用いて、 Z-Aib-Phe-D- Pro- OtBuを調製した。次いで、工程 1-3に準じて、 Z-Aib-Phe-D-Pro-OtBuと Boc-Asu(0Bzl )-0Hから、 $崖状テトラぺプチド Boc-Asu(OBz l )- Aib- Phe-D- Pro-OtBuを得た。以降、工程 1-4〜工程 1-7 の手法を適用して、脱保護、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）への変換を行い、標記環状テトラペプチドを得た。

FAB-MS : m/z = 517 (M⁺)

(参考例 1 ) HDA-19； eye 1 o (-Asu (NHOH) -Phe-Phe-D-Pro-) ₂

上記実施例 1のテトラペプチド（HM- 5)と同じアミノ酸配列が繰リ返された構造である、環状ォクタべプチド HDA-19； eye 1 o (-Asu (NHOH) -Phe-Phe-D-Pro-) ₂ 実施例 1の工程 1-3で得られる Boc- Asu (OBzl )-Phe-Phe-D-Pro- OtBuから、以降同様な手順に従い、環状ォクタべプチドに調製した。

(実施例 6 ) HDA-13； eye lo (- L- Asu(NHOH)- D- Pro- L- Al a- D- Ala- )の合成下記式（X V) ：

で示される環状テトラペプチド HDA-13； eye lo (-L-Asu(NHOH) -D-Pro-L-Al a-D- Ala_)の合成工程を簡単に述べる。

工程 6-1 Boc-L-Asu (OBz 1 ) -D-Pro-OtBu

Boc-L-Asu(0Bzl)-0H (1.14 g， 3.0腿 ol)、 H-D-Pro-0tBu (510 mg, 3.0 mmol) および HOBt H₂0 ( 505 mg, 3.3 mmoUを DMF (7 ml)に溶解し、氷冷下 DCC (681 mg,

3.3画 oi)を加え、終夜室温で撹拌した。反応液を濾過、 m,酢酸ェチルに再溶解し、 10% クェン酸、 4% NaHC0₃および脑食塩水で順次洗浄した。無冰 MgS0₄ 上で乾燥後、濃縮、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（CHC1₃)で精製し、標記化合物 1.51 g (94%)を油状物質として得た。

Rf = 0.61 (CHC1₃ I MeOH = 9 / 1) 工程 6-2 Boc-L-A 1 a-D-A 1 a-0H

H-D-Ala- OH (668 mg, 7.5 mmol)の水溶液 (5 id)に氷冷下 TEA (1.26 ml, 9.0 mmol)をカロえ、これに Boc-L-A la-0su (1.43 g， 5.0画 1)の DMF溶液 (10 ml)を混合し、終夜室温で撹拌した。反応液を濃縮し後、残渣を NaHC0₃水溶液に溶解し、 7M¾を酢酸ェチルで洗浄した。クェン酸にて 7_Κί目を酸性にして、酢酸ェチルで抽出し、有機相を飽和食塩水で洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、濃縮、残渣にジェチルエーテル I石油エーテル (1 I 5)を加え固化し、標記化合物 890 mg (68%) を白色粉末状物質として得た。 Rf = 0.40 (CHC1₃ I MeOH / 酢酸 = 90 / 10 / 2) 工程 6-3 Boc-L-A 1 a-D-A 1 a-L-Asu (OBz 1 ) -D-P ro-OtBu

Boc-L-Asu(0Bzl)-D-Pro-0tBu (1.4 g, 2.63腿 ol)に氷冷下 TFA (3 ml)を加え、そのまま 20分間放置した。反応液を濃縮し、残渣にジェチルエーテル I 石油ェ —テル (1 I 5)を加えデカンテーシヨンを行い、 H-L-Asu(0B l)-D-Pro-0tBu TFA (2.0 g， quant)を得た。

これを DMF (10 ml)に溶解し、 Boc-L-A 1 a-D-A la-0H (810 mg, 3.16画 1)、 HOBt Η,Ο (582 mg, 3.8 mmol)、さらに氷冷下 DCC (783 mg, 3.8 mmol)を加え、そのまま終夜撹拌した。反応液を濾過、 i後、酢酸ェチルに再溶解し、 10%クェン酸、 4% NaHC0₃および勝口食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（l% Me0H I CHC1₃)で精製し、標記化合物 1.23 g (69%)を油状物質として得た。

Rf = 0.33 (CHCI3 I MeOH = 9 / 1) 工程 6- 4 cyclo (-L-Asu (NH0H) -D-Pro-L-A 1 a-D-A 1 a-)

これ以降は、実施例 1 (HDA- 5)の工程 1-4〜I- 7の手法を適用して、脱保護、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）への変換を行い、標記環状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt = 8.22min (column: Wako PakC18, 4.6x150 mm, 0-100¾ 1 i near gradient CH₃CN I 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z = 426 (M + H)⁺

(実施例 7) HDA- 16； cyclo (-L-Asu ( H0H) -L-Trp(CHO) -L-Leu-D-P i p-) 下記式（XVI) ：

で示される標記環状テトラペプチド HDA-16； eye lo (-L-Asu(NHOH)-L-Trp(CHO)- L-Leu- D- Pip-)の合成のは実施例 4 (HDA-12)に記載の方法に準じて行った。

HPLC: Rt = 17.34 min (column: Wako Pak C18， 4.6 x 150腿， 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z = 647 (M + Na)⁺

(実施例 8) HDA-33； cyclo ( -L-Asu (NH0H) -L-Trp-L-Leu-D-P i -)

下記式（XVII) ：

で示される標記環状テトラペプチド HDA-33； cyclo ( -L-Asu (NHOH) -L-Trp-L-Leu- D- Pip- )の合成は実施例 4 (HDA- 12)に記載の方法に準じて行った。

HPLC: Rt = 17.08 min (column: Wako Pak C18， 4.6x150 mm, 0-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z = 597 (M + H)⁺

(実施例 9) HDA-32； cyclo (-L-Asu (NHOH) -L-Lys(Boc)-L-Phe-D-Pro-)

下記式 (XVIII) ：

で示される環状テトラペプチド HDA-32； eye lo (-L-Asu(NHOH)-L-Lys(Boc)-L- Phe-D-Pro-)の合成工程を簡単に述べる。工程 9-1 Boc-L-Asu(OBz 1 ) -L-Lys (Z) -L-Phe-D-Pro-OtBu

実施例 1 (H -5)工程 1- 1、 1-2に準じて行い Boc-L-Lys(Z)- L- Phe- D-Pro-OtBu を得た。このトリペプチド（1.96 g, 2.88匪 ol)に氷冷下 TFA (3 ml)を加え、そのまま 20分間放置した。反応液を ¾Ιϋ、酢酸ェチルに溶解し、 4% NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 N C0₃上で乾燥後、濃縮し、 H- L- Lys(Z) - L - Phe-D-Pro-OtBu (1.32 g, 79%)を得た。

これを DMF (10 ml)に溶解し、 Boc-L-Asu(0Bzl)-0H (1.07 g, 2.81画 1)、 HOBt H₂0 ( 502 mg, 3.28 ramol), さらに氷冷下 DCC (677 rag, 3.28腿 ol)を加え、そのまま終夜撹拌した。反応液を濾過、 mm,酢酸ェチルに再溶解し、 ιο%クェン酸、 4% NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、 . 残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（1% MeOH I CHC1₃)で精製し、標記化合物 1.55 g (72%)を泡状物質として得た。

Rf = 0.80 (CHC1₃ I MeOH = 9 / 1) 工程 9-2 cyclo (-L-Asu-L-Lys(Boc)-L-Phe-D-Pro-)

工程 9-1で得られた化合物 Boc - L-Asu(OBzl)-L-Lys(Z)-L-Phe-D- Pro-OtBuを実施例 1 (HDA-5)の工程卜 4〜卜 6の手法を適用して、 Boc基の除去、環化反応を行つた。この保護環状テトラペプチド（98 mg, O.I28mmol)を酢酸（3 mi)に溶解し、 5%?(1-(： (3011¾)を用ぃて、水素雰囲気下で 4時間撹拌した。反応液を濾過、し、 cyc!o (- L-Asu- L-Lys- L- Phe-D- Pro- )を得た。

これをジォキサン（2 ml)と水（2 ml)の混合溶媒に溶解し、 NaHC0₃で pH8に調整した。これに氷冷下 Boc₂0 (42mg)のジォキサン溶液を加え、終夜撹拌した。反応液を纖後、酢酸ェチルに再溶解し、 10% クェン酸、および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、し、標記化合物 61 mg (74%)を得た。工程 9- 3 cyclo (-L-Asu (NHOH) -L-Lys (Boc) -L-Phe-D-Pro-)

これ以降は、実施例 1 (HDA-5)の工程 1-7の手法を適用して、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）への変換を行い、標記璟状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt = 17.15 min (column: Wako Pak C18, 4.6 X 150腿， 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml I min)

FAB-MS: m/z = 659 (M + H)⁺

(実施例 10) HDA-6； cyclo (-L-Lys (Ac)-L-Phe-L-Phe-D-Pro-)

下記式 (XIX) ：

で示される環状テトラペプチド H - 6； cyclo (-L-Lys (Ac) -L-Phe-L-Phe-D-Pro-) の合成工程を簡単に述べる。工程 10-1 cyclo (-L-Lys-L-Phe-L-Phe-D-Pro-) -HC1

実施例 1 (HDA-5)に記載する工程 1-1〜1-6の手法を適用し、 cyclo (- L- Lys(Z) -L-Phe-L-Ph¾-D-Pro- )を得た。これを酢酸中接触還元後、酢酸塩を塩酸塩に置換し、標記化合物を得た。

FAB-MS: m/z = 556 (M+H)⁺ 工程 10-2 cyclo (-L-Lys (Ac) -L-Phe-L-Phe-D-Pro-)

工程 10-1で得られた eye （- L-Lys- L-Phe-L-Phe- D- Pro-)'HCl (44 mg, 80 mmol) の DMF溶液（2ral)に氷冷下、 TEA (33 ml, 0.24醒 o 1 )および無水酢酸 (12ml, 0.12 mmol)を加え、 2時間撹拌した。反応液に酢酸を加えて中和し、した。粗ぺプチドを逆相 HPLCにて分取精製（col議： YMC-Pack 0DS A- 323， 10 x 250腿， 30% CH₃Ci I 0.1¾ TFA)、凍!^燥して標記化合物 57 mg (quant)を得た。

HPLC: Rt = 16.68 min (column: Wako Pak C18, 4.6x150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml I min)

FAB-MS: m/z = 562 (M+H)^f (実施例 1 1 ) HDA-26； cyclo (-L-Lys (BrAc) -L-Phe-L-Phe-D-Pro-)

下記式（Π) ：

で示される環状テトラペプチド HDA-26； cyclo (-L-Lys (BrAc) -L-Phe-L-Phe-D- Pro-)の合成工程を簡単に述べる。実施例 1 0 (HDA-6) の工程 10- 1を適用して得られる cyclo (-L-Lys-L-Phe- L-Phe-D-Pro-) HCl (50 rag, 90 mmol)とブロモ酢酸（19 rag, 0. 135 腿 ol )を DMF (1 ml)に溶解し、氷冷下 TEA (19 ml, 0. 135 垂 ol )および DCC (28 mg, O. I35mol )を加え、終夜撹拌した。反応液を濾過、 m . 酢酸ェチルに再溶解し、 10% クェン酸、 4% NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、謹、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、標記化合物 36 mg (62%)を油状物質として得た。

HPLC: Rt = 17. 62 min (column: Wako Pak C18， 4. 6 x 150 mm, 10-100% l inear gradient CH₃CN I 0. 1% TFA over 30 min, f low rate 1. 0 ml / min)

FAB-MS: ra/z = 640 (M+H)⁺, 642 (M + 3)⁺

(実施例 1 2 ) HDA- 3 4； cyclo (-L-G 1 u (G 1 y-NH0H) ) -D-Tyr (Me) -L- 1 1 e-D-Pro-) 下記式（XXI) ：

で示される環状テトラペプチド HDA- 3 4 ； eye lo (-L-Glu(Gly-NHOH))-D- Tyr (Me)-L- 11 e-D-P ro-)の合成工程を簡単に述べる。工程 12- 1 Boc-L-Glu-OAll

Boc-L-Glu-OH (2.47 g, 10.0 mmol)の THF (20 ml)溶液に氷冷下にて DCC (2.27 g， ll.Ommol)を加え、そのまま 2時間撹拌した。反応液を濾 J し、その濾液にァリルアルコール（1.02 ml， 20.0 mmol)およびジシクロへキシルァミン（2.39 ml， 12.0腿 ol)を加え、終夜撹拌した。反応液を濃縮後、エーテル-石油ェ一テルで洗浄し、標記化合物 3.90 g (83%)を白色粉末状物質として得た。

Rf = 0.74 (CHCl I MeOH / 酢酸 = 90 / 10 / 0.2) 工程 12 - 2 Boc-L-Glu(Gly-0Bzl)-0All

工程 12-1で得られた Boc- L-Glu- 0A11 DCHA(1.62 g， 3.45 mmol)を酢酸ェチル (200 mi)に溶解し、 10% クェン酸および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄ 上で乾燥後、濃縮し Boc- L- G 1 u-0A 1〖を得た。

Boc-L-Glu-OAll (630 mg, 2.19 mmol), H-Gly-0Bzl TosOH (739 mg, 2.19 mmol) および HOBt H₂0 (34 mg， 0.22 mmol)を DMF (10 ml)に溶解し、氷冷下 TEA (0· 31 ml， 2.19 mmol)および DCC (543 mg, 2.63 mmol)を加え、終夜室温で撹拌した。反応液を濾過、後、酢酸ェチルに再溶解し、 10%クェン酸、 4%NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、濃縮し、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（1% MeOH I CHC1₃)で精製し、標記化合物 343 mg (46%)を油状物質として得た。

HPLC: Rt = 23.75 min (column: Wako Pak C18, 4.6 X 150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min) 工程 12- 3 Boc-L-Ile-D-Pro-OBzl

Boc-L-Ile-0H 1/2 H₂0 (1.13 g, 4.7 mmol), H-D-Pro-0Bzl HCl (1.14 g, 4.7 mmol) および H0Bt 0 (72mg， 0.47 mmol)を DMF (10 ml)に溶解し、氷冷下 TEA (0.66 ml， 4.7匪 ol)および DCC (1.16 g, 5.64匪 ol)を加え、終夜室温で撹拌した。反応液を濾過、濃縮後、酢酸ェチルに再溶解し、 10%クェン酸、 4%NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、、し、フラッシュシリカゲルク口マトグラフィ一（1% MeOH I CHC1₃)で精製し、標記化合物 1.76 g (89%)を油状物質として得た。

Rf = 0.32 (CHC1₃ I MeOH = 49 / 1) 工程 12-4 Boc-D-Tyr(Me)-L-I le-D-Pro-0Bzl

工程 12-3で得られた化合物 Boc-L-Ile-D-Pro-OBzl (967 mg, 2.31 議 ol)をジォキサン（12 ml)に溶解し、 4N HCI Iジォキサン（12 ml)を加え、室温で 1.5時間静置した。反応液を »し、残渣にジェチルエーテル I石油エーテル（1 I 3) を加えデカンテーシヨンを行い、 H-L-Ile-D-Pro-OBzl HCl (745 mg, 91%)を得た。これを DMF (10 ml)に溶解し、 Boc-D-Tyr(Me)-0H (620 mg, 2.10画 1)、 HOBt H₂0 (322 mg, 2.10 mmol), さらに氷冷下 TEA (0.63 ml, 4.53 mraoi)および BOP (1.05 g， 2.36腿 ol)を加え、そのまま 2時間撹拌した。反応液を' 後、酢酸ェチルに再溶解し、 10%クェン酸、 4 NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄ 上で乾燥後、濃縮、粗ペプチドをフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ MeOH I CHC1₃)で精製'し、標記化合物 881 mg (72%)を油状物質として得た。

HPLC: Rt = 21.87 min (column: Wako Pak C18， 4.6x150醒， 37-100% linear gradient CH₃CN I 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min) 工程 12-5 Boc-D-Tyr(Me)-L-I le-D-Pro-OH

工程 12-4で得られた化合物 Boc- D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro- OBzi (881 mg, 1.44 raraol)を MeOH (5 ml)に溶解し、 5% Pd-C (70 mg)を用いて、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液を濾過、し、標記化合物を得た。

Rf = 0.69 (CHC1₃ I MeOH / 酢酸 = 90 / 10 / 2) 工程 12-6 Boc-D-Ty r (Me) -L- 11 e-D-Pro-L-G 1 u (G 1 y-OBz 1 ) -OA 11

工程 12-2で得られた化合物 Boc-L-Glu(Gly-0Bzl)-0All (200 mg, 0.46 mmol) をジォキサン（3 ml)に溶解し、 4N HC1 / ジォキサン（3 ml)を加え、室温で 1.5 時間静置した。反応液を ίΐϋし、残渣にジェチルエーテル /石油エーテル（ 3) を加えデカンテ一シヨンを行い、 H-L-Glu(Gly-0Bzl)-0All HC1 (171 mg, quant) を得た。

これを DMF (5011)に溶解し、80(-0-了 1"(¾¾)- 116-0-?1"0-011 (233 mg, 0.46 mraol), HOBt H₂0 ( 70 rag, 0.46 mmol), さらに氷冷下 TEA (0.17 ml, 1.20 mraol)および BOP (305 mg, 0:69 mmol)を加え、そのまま終夜撹拌した。反応液を宿後、酢酸ェチルに再溶解し、 10%クェン酸、 4% NaHC0₃および飽和食:^ で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、濃縮し、粗ペプチドをフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー、1 MeOH I CHC1₃)で精製し標記化合物 300 mg (79%)を油状物質として得た。

HPLC: Rt = 20.99 min (column: Wako Pak C18, 4.6x150 mm, 37-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml I min)

FAB-MS: m/z = 822 (M + H)⁺ 工程 12- 7 cyclo (-L-G 1 u ( G 1 y-NH0H) -D-Tyr (Me ) -L- 11 e-D-Pro-)

工程 12-6で得られた Boc- D-Tyr(Me)-L- lie- D- Pro- L-Glu(Gly- OBzl)- OAU (300 mg, 0.37 mmol)を CHC13 /酢酸 / N-メチルモルフォリン（37 / 2 / 1) (11 ml) に溶解し、 Ar ガスで反応容器内を置換した。これに Pd(0)(PPh₃)₄ (1.27 g, 1.1 mmol)を加え Ar雰囲気下終夜撹拌した。反応液を濃縮後、酢酸ェチルに再溶解し、 10%クェン酸および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、 ΐϋし、 Boc-D-Tyr (Me) -L- 11 e-D-Pro-L-G 1 u(G ly-OBz 1 ) -OHを得た。

これ以降は実施例 1(HDA- 5)の工程 1-4〜卜 7の手法を適用して、脱保護、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）への変換を行い、標記環状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt = 15.55 min (column: Wako Pak C18, 4.6x150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN I 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z = 589 (M + H)+

(実施例 1 3) HDA-3 5 ； cyclo ( -L-G 1 u (b-A 1 a-NH0H) ) -D-Ty r (Me ) -L- 11 e-D- Pro-) - 下記式（XXII) ：

で示される標記環状テトラペプチド HDA- 3 5 ； cyclo (-L-Glu(b-Ala-NH0H))-D- Tyr(Me)- L-Ile- D- Pro- )の合成は、実施例 1 2の工程 12- 2に記載の方法に準じて、 Boc-L-Glu(b-Ala-0Bzl)-0All を調製し、次いで、工程 12- 3〜 12-7の手順に準じて、当該環状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt = 15.28 min (column: Wako Pak C18， 4.6x150 匪， 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 nun, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: ra/z = 603 (M + H)+

(参考例 2) HDA- 7； cyclo (- L- Lys(Ac)-L-Phe- L- Phe- D- Pro- )₂の合成実施例 10の HDA- 6と同じアミノ酸配列が繰り返された構造である、環状ォクタぺプチド HDA- 7は、実施例 10 (HDA-6) の工程 10-1中、実施例 1の工程 1-3 に相当する中間工程で得られる Boc-L- Lys(Z)-L-Phe-L - Phe- D- Pro- OtBuから、以降同様な手順に従い、標記環状ォクタべプチドを得た。

HPLC: Rt = 16.10 min (column: MS GEL C18, 4.6x150 mm, 10-100¾ 1 inear gradient CH₃CN I 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z = 1124 (M+H)+

(参考例 3) HDA- 14； cyclo (- L- Asu( HOH)- D-Tyr(Me)- L- Ile-L-Pro-)₂の合成後述する実施例 18の HDA-30と同じアミノ酸配列が繰り返された構造である、環状ォクタペプチド HDA- 14 は、実施例 1 (HDA-5)の手法を適用して、 Boc-L- Asu(NHOH) -D"-Tyr (Me) -L- 11 e-L-Pro-OtBuを調製し、標記環状ォクタペプチドを得た。

HPLC: Rt = 20.59 min (column: Wako Pak C18， 4.6x150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z = 1170 (M+Na)⁺

(実施例 1 ) HDA- 38 ； cyclo (-L-Asu(NHOH)- D- Phe- L- Phe- L- Pro -）下記式（XXI II ) ：

で示される環状テトラペプチド HDA-38 ； eye lo ( -L-Asu (NHOH) -D-Phe-L-Phe-L- Pro-)の合成工程を簡単に述べる。工程 14-1 cyclo (-L-Asu (OB 1 ) -D-Phe-L-Phe-L-Pro-)

Boc-L-Asu(0Bzl)-0H (380 mg, 1.0 mmol)とォキシ厶樹脂（OxR, 1.0 g)を DCM (15 ml)中で DCC (206 mg, 1.0隨 ol)を用いて縮合した。導入率 0.47 mmol I g resin。この樹脂 1 g を用いて Boc-ストラテジーによる固相合成の常法で、順次、 Boc- L- Pro-0H、 Boc-L-Phe-0H、および Boc-D-Phe-OH を縮合し、 Boc- D- Phe- L- Phe-L- Pro- L-Asu(0Bzl)-0xRを得た。次いで、脱 Boc後、 DMF (15 ml)の懸濁液に 2等量ずつの酢酸 (57 ml, 1.0 mmol), DIEA (0.15 ml, 1.0腿 ol)を加えて 20時間反応容器を » [した。反応液を濾過、 '雄後、残渣に水を加え固化し、標記環状テトラペプチド化合物 110 mg (38%)を白色粉末状物質として得た。

HPLC: Rt = 15.72 min (column: Wako Pak C4， 4.6x150 mm, 37-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min) 工程 14-2 cyclo (- L- Asu (NHOH)- D-Phe-L- Phe- L- Pro- )

以下、実施例 1 (HDA-5) の製造方法中、工程卜 6および 7 と同様に、 Pd - C を用い DMF中で接触還元後、ヒドロキシルァミンと縮合した。反応液を濃縮後、

DMS0に溶解し逆相 HPLCにて分取精製 (column: YMC-Pack ODS A-323, 10 x 250 mm,

36% CH₃CN I 0.1% TFA)、凍結乾燥して標記ィ匕合物 9 mg (10%)を得た。

HPLC: Rt = 16.94 min (column: MS GEL C18, 4.6 X 150 mm, 10-100¾ linear gradient

CH₃CN I 0.1¾ TFA over 30 min)

FAB-MS: m/z = 578 (M+H)^f

(実施例 1 5) HDA- 37 ； cyclo (-L-Asu(NHOH)-D-Pro-L-Phe-D-Phe-) 下記式（XXIV) ：

で示される環状テトラペプチド HM- 37 ； cyclo (-L-Asu (NHOH) -D-Pro-L-Phe-D- Phe- )の合成 Boc-L- Phe- OxRを出発原料として、実施例 1 4に記載の方法に準じて、当該環状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt= 17.65 rain (column: MS GEL C18, 4.6x150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN I 0. \% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z = 578 (M + H)⁺

(実施例 1 6 ) HDA-39; cyc/o (- L- Asu(NHOH)- L- Phe- D-Phe-L- Pro-) 下記式（xxv)

で示される環状テトラペプチド HDA- 39 ； cyclo (-L-Asu (NHOH) -L-Phe-D-P e-L- Pro-)の合成 ί Boc-L-Asu(OBzl)- OxRを出発原料として、実施例 14に記載の方法に準じて、当該環状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt =— 16.16 min (column: Wako Pak C18， 4.6x150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml I min)

FAB-MS: m/z = 578 (M + H)⁺

(実施例 17 ) HDA-40； cyclo ( -L-Asu (NHOH) -L-Phe-L-Phe-Sar-)

下記式（XXVI) ：

で示される環状テトラぺプチド HDA-40； cyclo (-L-Asu (NHOH) -L-Phe-L-Phe-Sar-) の合成は、 Boc-L-Asu(0Bzl)-0xR を出発原料として、実施例 1 4に記載の方法に準じて、当該環状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt = 15.86 min (column: Wako Pak C18, 4.6x150 mm, 10-100% linear gradient C CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z = 552 (M + H)⁺ 例 1 8) HDA-30； cyclo (-L-Asu(NH0H)-D-Tyr(Me)-L-I le-L-Pro-) 下記式（XXVII) ：

で示される環状テトラペプチド HDA-30； eye lo (-L-Asu (NHOH) -D-Tyr (Me) -L- 11 e- L - Pro- )の合成工程を簡単に述べる。工程 18-1 Boc-L-11 e-L-P ro-L-Asu (OBz 1 ) -D-Tyr (Me) -OH

Boc-L-Tyr(Me)-OH (591 mg, 2.0 mmol)とォキシム樹脂 (OxR, 2.0 g)をトルェン（301111)中で0(：じ (412 rag, 2.0 mmol)を用いて縮合した。導入率 0.36 mmol / g resin。この樹脂 1 gを用いて Boc-ストラテジーによる固相合成の常法で、順次、 Boc-L-Asu(0Bzl)-0H, Boc- L- Pro- 0H、および Boc- L- Ile-OH を縮合し、 Boc- L- Ile- L-Pro- L-Asu(OBzl)- D- Tyr(Me)- OxRを得た。次いで、 DMF (15 ml)の懸濁液に 1 -ヒドロキシピペリジン（182 mg, 1.80 ol)を加えて 24時間反応容器を振盪した。反応液を濾過、後、酢酸（7 ml)に溶解し、 a₂S₂0₄ (312 mg, 1.80 mmol) を加え、 1 時間撹拌した。反応液を濃縮後、酢酸ェチルに再溶解し、 10% クェン酸、および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、激宿し、標記鎖状テトラペプチド化合物 368 mg (quant)を油状物質として得た。

HPLC: Rt = 17.45 min (column: Wako Pak C4 4.6 X 150 ram, 37-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min) 工程 18- 2 H-L- 11 e-L-Pro-L-Asu (OBz 1 ) -D-Tyr (Me ) -OH TFA 工程 18-1で得られた化合物 Boc- L- lie- L- Pro- L- Asu(OBzl)- D- Tyr(Me)- 0H (368 mg, 0.48 mmol)に氷冷下 TFA (3 ml)を加え、そのまま 30分間放置した。反応液を濃縮し、残渣にジェチルエーテル / 石油エーテルを加え固化し、標記化合物 338 rag (90%)を白色粉末状物質として得た。工程 18- 3 cyclo (-L-Asu(NHOH)-D-Tyr(Me)-L-I le-L-Pro-)

これ以降は実施例 1 (HDA- 5)の工程ト 5〜ト 7の手法を適用して、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）への変換を行い、標記環状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt = 17.18 min (column: Wako Pak C18， 4.6x150 mm, 10-100% linear gradient C CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z = 574 (M + H)+

(実施例 1 9) HDA-28； cyclo (- L-Asu(NHOH)- D- Phe-L- Leu-L-Pro- ) 下記式 (XXVIII) ：

で示される環状テトラペプチド HDA-28； cyclo (-L-Asu (NH0H) -D-Phe-L-Leu-L- Pro-)の合成は、 Boc-D- Phe- OxRを出発原料として、実施例 1 8に記載の方法に準じて、当該環状テトラペプチドを得た。 HPLC: Rt = 17.50 min (column: Wako Pak C18, 4.6 x 150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: ra/z = 544 (M + H)⁺

(実施例 20) HDA-27； eye Jo (-L-Asu(NHOH)-D-Phe-L-Phe-D-Pro-) 下記式 (XXIX) ：

で示される環状テトラペプチド HDA-27； eye Jo ( -L-Asu (NHOH) -D-Phe-L-Phe-D- Pro-)の合成は、 Boc- D- Phe- OxRを出発原料として、実施例 1 8に記載の方法に準じ、当該環状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt = 19.35 min (column: Wako Pak C18， 4.6 X 150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN I 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: rn/z = 578 (M + H)⁺

(実施例 2 1 ) HDA-31； cyclo (-L-Asu(NHOH) -D-Tyr (Me) -L- 11 e-D-Pro-) 下記式（XXX) ：

で示される環状テトラペプチド HDA-31； eye lo (-L-Asu( HOH)-D-Tyr(Me)-L-I le- D-Pro- )の合成 Boc-D- Tyr(Me)-OxRを出発原料として、実施例 1 8に記載の方法に準じ、当該環状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt = 18.63 min (column: Wako Pak C18， 4.6x150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z- = 574 (M + H)⁺

(¾5S例 22) HDA-29； cyclo (-L-Asu (NH0H) -D-Phe-L-Leu-D-Pro-) 下記式（XXXI) ：

で示される環状テトラペプチド HDA- 29； cyclo (-L-Asu(NHOH)-D-Phe-L-Leu-D- Pro- )の合成は、 Boc-D- Phe- OxRを出発原料として、実施例 1 8に記載の方法に準じ、当該環状テトラペプチドを得た。

HPLC: Rt = 17.88 min (column: Wako Pak C18, 4.6x150 匪， 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml / min)

FAB-MS: m/z = 544 (M + H)+

(実施例 23) HDA-30； cyclo (-L-Asu (NH0H) -D-Ty r (Me ) -L- 11 e-L-Pro-) 下記式（XXVII) ：

で示される環状テトラペプチド HM-30； eye lo (-L-Asu(NHOH)-D-Tyr(Me)-L-I le- L-Pro-)の別法による合成工程を簡単に述べる。

工程 23-1 Boc-L-Asu(OBzl)-OTme

Boc-L-Asu(0Bzl)-0H (2.38 g, 6.27画 1)，トリメチルシリルエタノール (1.79 ml, 12.53腿 ol)の DCM (12 ml)溶液に氷冷下にて 4 -ジメチルァミノピリジン（76 mg, 0.63 iMol)および DCC (1.55 g, 7.52 mmol)を加え、そのまま終夜撹拌した。反応液を濾過、濃縮後、酢酸ェチルに再溶解し、 10%クェン酸、 4%NaHC0₃および飽和食塩水で順次洗浄した。無水 MgS0₄上で乾燥後、濃縮、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸ェチル I へキサン = 1 I 4)で精製し、標記化合物 3.18 g (quant)を油状物質として得た。

Rf = 0.50 (酢酸ェチル I へキサン = 1 / 4) 工程 23- 2 Boc-L-Asu-OTme

工程 23 - 1で得られた化合物 Boc- L- Asu(OBzl)- OTme (1.55 g, 3.13腿 oi)を THF (6 ml)に溶解し、 5% Pd-C (200 mg)存在下、水素雰囲気下で 3時間撹拌した。反応混合物を濾過、濃縮し、標記化合物 1.41 g (quant)を油状物質として得た。 Rf = 0.38 (CHC1₃ I MeOH / 酢酸 = 19 / 1 / 0.2) 工程 23-3 cyclo (- L- Asu(NHOH)- D- Tyr(Me)- L- 1 le- L-Pro-) 工程 23-2で得られた化合物 Boc-L- Asu-OTme (1.30 g, 3.32 mmol)とォキシム樹脂（3.32 g)を DCM (50 ml)中で DCC (685 mg, 3.32 匪 ol)を用いて縮合し Boc-L-Asu(0xR)-0Traeを得た。導入率 0.38 mmol I g resin。この樹脂 350 mg (0.13 腿 ol)を用いて Boc-ストラテジーによる固相合成の常法で、順次、 Boc-L- Pro-0H、 Boc-L- Ile-0H、および Boc-D- Tyr(Me)- OH を縮合し、 Boc- D-Tyr(Me)- L- 1 le- L- Pro- L- Asu(OxR)- OTmeを得た。

次いでこのペプチド担持樹脂 400 mgを、 DMF (6 m に懸濁し、 1Mテトラプチルァンモニゥムフルォリドの THF溶液 (0.76 ml )をシリンジで加えて、室温で 30 分間 »して、 Trae基を除去、更に DCM中で Boc基を除去した。再度 DMF (6 ml) に懸濁し、 E0P (176mg， 0.39腿 oi)、 HOBt H₂0 (82 mg, 0.52腿 ol)および DIEA (93 ml, 0.52醒₀1)を加ぇて、樹脂上で 2時間環化反応を行った。 DMFで洗浄後、 cyclo (- D-Tyr(Me)-L- Ile-L-Pro-L- Asu(OxR)-)を DMF (6 ml)に懸濁し、ヒドロキシルァミン塩酸塩（46mg， 0.65 mmol), DIEA (0.12 ml, 0.65 mmol)および酸（40 ml， 0.65 mmol)を加えて終夜振盪し、 ¾^テトラペプチドヒドロキサム酸を脱離させた。反応液を濾過、濃縮後、 DMF に溶解し逆相 HPLC にて分取精製（column: YMC-Pack 0DS A-323, 10 X 250 mm, 32% C CN I 0.1% TFA)、凍結乾燥して標記化合物 37 mg (50%)を得た。

HPLC: Rt = 17.18 min (column: Wako Pak C18， 4.6 X 150腿， 10-100% linear gradient CH₃CN / 0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml I min)

FAB-MS: m/z = 574 (M+H)^f

(実施例 24) HDA-49； eye 1 o (-L-Asu (NH0H) -D-Tyr (Me) -L- 11 e-L-P i p-) 下記式（XXXII) ：

(ΧΧΧΠ)

で示される標記環状テトラベプチド Η -49の合成法を簡単に述べる。

Boc-D-Tyr(Me)-OxRを出発原料とし、固相合成法の常法で Boc-L-I le-L-Pip-L- Asu(OBzl)-D-Tyr(Me)-OxR を調製した。ただし、 Boc-L- I le-OHの縮合には HATU を用いたダブルカップリングを行った。これ以降の工程は、 HDA-30 ; cyclo(-L- Asu(NHOH)- D- Tyr(Me)- L- I le-L- Pro-)の実施例 1 8に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行い、を得た。

HPLC: Rt = "17. 94 min (column: WakoPak C18, 4. 6 x 150 mm, 10-100% l inear gradient CH₃CN/0. 1% TFA over 30 min, flow rate 1. 0 ml /min)

FAB-MS: m/z = 588 (M +H)+

(¾¾例2 5 ) HDA-50； eye 1 o (-L-Asu (NH0H) -D-Ty r (Me) -L- 1 1 e-D-P i p- ) 下記式（ m) ：

で示される標記環状テトラベプチド HDA- 50の合成法を簡単に述べる。

Boc-D-Tyr(Me)-OxRを出発原料とし、固相合成法の常法で Boc- L-I le-D-Pip-L- Asu(OBzl)-D-Tyr(Me)-OxR を調製した。ただし、 Boc-L-Ile- 0H の縮合には HATU を用いたダブルカップリングを行った。これ以降の工程は、 HDA-30; cyclo(-L- Asu(NHOH)- D- Tyr(Me)- L- lie- L- Pro- )の実施例 1 8に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行い、標記環状テトラベプチド H -50を得た。

HPLC: Rt = 20.15min (column: WakoPak C18, 4.6 x 150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN/0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml/min)

FAB-MS: m/z = 588 (M +H)⁺

(実施例 26 ) HDA-51； eye 1 o (-L-Asu ( H0H) -D-Tyr (Me) -L- 11 e-L-T i c-)

(lie ： 1, 2, ό, 4-tetrahydoroisoquinol ine-3-carboxl ic acid)

下記式（XXXIV) ：

で示される標記環状テトラべプチド HDA-51の合成法を簡単に述べる。

Boc-D-Tyr(Me)-OxRを出発原料とし、固相合成法の常法で Boc-L-I le-L- Tic-L - Asu(OBzl)- D- Tyr(Me)- OxR を調製した。ただし、 Boc- L-I le- OH の縮合には HATU を用いたダブルカップリングを行った。これ以降の工程は、 HDA-30; cyclo(-L- Asu(NHOH)- D- Tyr(Me)- L-I le- L- Pro- )の実施例 1 8に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行い、標記環状テトラベプチド HDA-51を得た。 ·

HPLC: Rt = 18. 48 min (column: WakoPak C18, 4. 6 x 150 匪， 10-100% l inear gradient CH₃CN/0. 1% TFA over 30 min, flow rate 1. 0 ml /min)

FAB-MS : m/z = 636 (M +H)⁺

(実施例 2 7 ) HDA-52； eye 1 o (-L-Asu (NH0H) -D-Ty r (Me ) -L- 1 le-D-Tic-) 下記式（XXXV) ：

で示される標記環状テトラベプチド HDA- 52の合成法を簡単に述べる。

Boc-D-Tyr(Me)-OxRを出発原料とし、固相合成法の常法で Boc-L- 1 le-D-Tic-L- Asu(OBzl)-D-Tyr(Me)-OxR を調製した。ただし、 Boc-L- l ie - 0H の縮合には HATU を用いたダブルカップリングを行った。これ以降の工程は、 HDA- 30; cyclo(-L- Asu(NHOH)-D-Tyr(Me)- L- l ie- L- Pro-)の実施例 1 8に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行い、標記環状テトラベプチド HDA-52を得た。 ·

HPLC: Rt = 20. 78 min (co lumn: WakoPak C18， 4. 6 x 150 mm, 10-100% l inear gradient CH₃CN/0. 1% TFA over 30 min, flow rate 1. 0 ml/rain)

FAB-MS: m/z = 636 (M +H)⁺

(実施例 2 8 ) HDA-53； eye 1 o (-L-Asu(NHOH) -D-Phe-L-Leu-L-P i -)

下記式（XXXVI) ：

で示される標記環状テトラベプチド HDA-53の合成法を簡単に述べる。

Boc-D-Phe-OxR を出発原料とし、固相合成法の常法で Boc- L- Leu- L- Pip - L- Asu(OBzl )- D-Phe-OxRを調製した。ただし、 Boc- L-Leu- OHの縮合には HATUを用いたダブルカップリングを行った。これ以降の工程は、 HDA- 30 ; cyclo(-L- Asu(NHOH)- D- Tyr(Me)- L- l ie- L- Pro-)の実施例 1 8に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行い、標記環状テトラベプチド H - 53を得た。 -

HPLC: Rt = 18.26 min (column: WakoPak C18， 4. 6 x 150 mm, 10-100% l inear gradient CH₃CN/0. 1% TFA over 30 min, f low rate 1. 0 ml/min)

FAB-MS: m/z = 558 (M +H)⁺

(実施例 2 9 ) HDA-42； cyclo(-L-Api (NH0H) -D-Tyr (Me) -L- 11 e-D-Pro-) 下記式（XXXVI I ) ：

で示される標記環状テトラベプチド HDA- 42の合成法を簡単に述べる。

Boc-L-Api (0Bzl )-0xR を出発原料とし、 HDA- 38; cyclo (-L-Asu(NHOH)-D-Phe- L-Phe-L- Pro- )の実施例 1 4に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行レ、、標記環状テトラベプチド HDA- 42を得た。

HPLC: Rt = 17. 67 min (column: WakoPak C18， 4. 6 x 150腿， 10-100% l inear gradient CH₃CN/0. 1% TFA over 30 min, flow rate 1. 0 ml/min)

FAB-MS: m/z = 560 (M +H)+

(実施例 3 0 ) HDA- 43； eye 1 o (-L-Aaz (NH0H) -D-Tyr (Me) -L- 1 le-D- Pro -）下記式（XXXVI I I ) ：

で示される標記環状テトラベプチド HDA- 43の合成法を簡単に述べる。

Boc-L-Aaz(0Bzl )-0xR を出発原料とし、 HDA-38; eye 1 o (-L-Asu(NHOH) -D-Phe- L-Phe- L- Pro- )の実施例 1 4に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行い、標記環状テトラべプチド HDA- 43を得た。

HPLC: Rt = 18. 92 min (column: WakoPak C18， 4. 6 x 150 ram, 10-100% l inear gradient CH₃CN/0. 1% TFA over 30 min, flow rate 1. 0 ml/min)

FAB-MS : m/z = 588 (M +H)+

(実施例 3 1 ) HDA-44； eye 1 o (-L-Asu(NHOH) -D-Tyr (Me) -L-Al a-D-Pro-) 下記式 (XXXIX) ：

で示される標記環状テトラベプチド HDA- 44の合成法を簡単に述べる。

Boc-L-Asu(0Bzl)-0xR を出発原料とし、 HDA-38 ; eye 1 o (-L-Asu (NHOH) -D-Phe- L - Phe- L- Pro-)の実施例 1 4に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行レヽ、標記環状テトラベプチド HDA- 44を得た。

HPLC : Rt = 12. 89 min (column: WakoPak C18, 4. 6 x 150腿， 10-100% l inear gradient CH₃CN/0. 1% TFA over 30 min, flow rate 1. 0 ml/rain)

FAB-MS: m/z = 532 (M +H)+

(実施例 3 2 ) HDA-45； eye 1 o (-L-Asu(NHOH) -D-Phe-L-A 1 a-D-Pro-)

下記式（XXXX) ：

で示される標記環状テ卜ラベプチド HDA- 45の合成法を簡単に述べる。

Boc-L-Asu(0Bz l )-0xR を出発原料とし、 HDA- 38; cyclo(-L-Asu(NHOH)-D-Phe- L - Phe- L-Pro- )の実施例 1 4に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行い、標記環状テトラべプチド HDA- 45を得た。

HPLC: Rt = 12. 91 min (co lumn: WakoPak C18， 4. 6 150 mm, 10-100% l inear gradient CH₃CN/0. 1% TFA over 30 min, flow rate 1. 0 ml/min)

FAB-MS: m/z = 544 (M +H)+

(実施例 3 3 ) HDA- 46； eye 1 o (-L-Asu(NHOH) -D-Phe-L- 1 le-D-Pro-) 下記式（ΧΧΠΙ) ：

で示される標記環状テトラベプチド HDA-46の合成法を簡単に述べる。

Boc-L-Asu(0Bzl)-0xR を出発原料とし、 HDA-38; eye 1 o (-L-Asu ( H0H) -D-Phe- L-Phe-L-Pro-)の実施例 1 4に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行い、標記環状テトラべプチド HDA-46を得た。

HPLC : Rt = 18.46 min (co lumn: WakoPak C18, 4. 6 x 150 醒， 10-100% l inear gradient CH₃CN/0. 1% TFA over 30 min, f low rate 1. 0 ml /min)

FAB-MS : m/z = 502 (M +H)* (実施例 34) HDA- 47 ; cydo(- L- Asu(NHOH)- D- Naf- L- Ile-D- Pro- )の合成（D - Naf： D-l-napht yl alanine)

下記式（ΧΠΧΙΙ) ：

で示される標記環状テトラベプチド Η -47の合成法を簡単に述べる。

Boc-L- Asu(OBzl)- OxR を出発原料とし、 HDA- 38; eye 1 o (-L-Asu (NHOH) -D-Phe- L-Phe-L-Pro- )の実施例 14に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行い、標記環状テトラべプチド HDA-47を得た。

HPLC: Rt = 20.52 min (column: WakoPak C18， 4.6 x 150 mm, 10-100% linear gradient CH₃CN/0.1% TFA over 30 min, flow rate 1.0 ml /min)

FAB-MS: m/z = 594 (M +H)⁺

(実施例 35 ) HDA- 48； eye 1 o (-L-Asu (NHOH) -D-Pya-L- 1 le-D-Pro-)の合成（D- Pya: D-l-pyrenyl alanine)

下記式（XXXXIII) ：

(xxxxm)

で示される標記環状テトラベプチド HM-48の合成法を簡単に述べる。

Boc-L- Asu(OBzl )- OxR を出発原料とし、 HDA-38; eye 1 o (-L-Asu (NHOH) -D-Phe- L-Phe- L- Pro-)の実施例 1 4に準じ、環化反応、側鎖カルボン酸のヒドロキサム酸構造への変換を行い、標記環状テトラベプチドに HDA- 48を得た。

HPLC: Rt = 23. 56 min (column: WakoPak C18， 4. 6 x 150 mm, 10-100% l inear gradient CH₃CN/0. 1% TFA over 30 min, flow rate 1. 0 ml/min)

FAB-MS: m/z = 667. 81 (M +H)⁺

(試験例 1 ) MHC class- 1分子観促進活性

本発明の環状テトラペプチド誘導体の有する MHC class— I 分子発現促進作用を以下の試験により検証した。即ち、本試験において、癌細胞を用いて、本発明の環状テトラぺプチド誘導体を作用させることで、 MHC class- 1 分子発現が促進されることを検証した。試離

用いた癌細胞は、米国国立癌研究所より分譲を受けたマウスメラノーマ細胞である B16ZBL6細胞を使用した。該細胞の培養は、 10% FBSを添加した MEM培地を用い、 37で、 5%二酸化炭素存在下、水蒸気飽和したインキュベータ一を用いて行つた。被験化合物は、予めジメチルスルホキシド（DMS0)に溶解し、濃度 100 mM又は 10 m の原溶液に調製した。また、ヒストンデァセチラ一ゼ藤素阻害活性を有することカ'判明しているトリコスタチン A市販品（和光純薬より購入）を、同じく DMS0に溶解し、濃度 5 mg/ml (16. 54 mM) の原溶液に調製した。トリコスタチン Aは、ヒストンデァセチラ一ゼ¾素阻害活性に起因する MHC class— I分子発現促進作用の陽性対照化合物とした。なお、被験化合物原溶液の溶媒として用いる MS0は、本試験において不可避的に培地中へ混入することになる力試験に用いられる混入量の範囲では、試^果に影響を及ぼさないことは別途確認した。前記の B16/BL6細胞を 5000個 Zwel 1の細胞密度で 9 6穴マイクロプレートに播種し、各 wel l当たり上記の培地 200 ^ 1中で、 2 4時間培養した後、雄化合物の原溶液所定量を培地に希釈した液 10 を添加し、引き続き 7 2時間培養した。その後、各 wel lを PBS (リン隱衝液）で一回洗浄し、浮遊する細胞及び培地を除いた後、 0. 1%ダルタルアルデヒド溶液で 3分間処理し、細胞の固定を行つた。固定した細胞表面に発現している MHC class— I分子の量以下の方法で測定した。一次抗体として、マウスの MHC c 1 ass— I分子に対する抗体である抗 H- 2K^bD^bD^d 抗体（市販品；明治乳業）を用い、二次抗体として、ピオチン化抗マウス IgG+M (市販品；ケミコン社）を用い、次いで、標識酵素として、ストレプトアビジン - —ガラクトシダーゼコンジュゲート（市販品； BRL社）を反応させた。上記の方法で標識された酵素 /3 —ガラクトシダーゼ量を、基質として、 4- me thy 1 umbel 1 iferyl- 3 -D-galactoside (市販品：販売元ナカライテック^) を用い、酵素反応の生成物に起因する蛍光強度（励起： 365nm、蛍光： 450nm) をマイクロプレートリーダーで測定した。なお、被験化合物の添加量を零とした別の wel l に対して、前記の一次抗体を添加せずに、それ以降は同じ操作を施し、この別の we l lにおいて測定される蛍光強度をバックグランドの水準とした。実際に測定される値（バックグラウンドを含んだ見掛けの値）から、前記のバックグランドの水準を差し引いた値を、発現している MHC class— I分子量を反映する真の測定値とした。なお、碰化合物の添加量を零とした群を参照群とし、この群において発現している MHC class— I分子量の測定値を基準値とした。各被験化合物の添加濃度における、発現している MHC class— I分子量前記の基準値を 1とする相対値で表す。各纖ィ匕合物に関して、添加濃度を種々に選び、 MHC class- 1 分子発現促進作用の添加濃度依存性を調べた。本発明の環状テトラベプチド誘導体ならびに陽 '(4*f照のトリコスタチン Aに対する評価結果の一例を図 3と図 4に示す。図 3には、参考として、上記参考例 1 の化合物に対する評価結果も併せて示す。加えて、参考化合物として、ニコチン酸 (nicotinic acid) 、ニコチン酸アミド（nicotinamide) 、ニコチン酸ヒドロキサム酸（nicotinic acid hydroxamate) の三種の化合物についても、同様の評価を行い、その結果を図 5に示す。図 3並びに図 4に示すとおり、実施例 1の化合物（HDA-5 ) ； cyclo(- Asu(NHOH)-Phe-Phe-D-Pro-) , 実施例 2 の化合物（ HDA-17 ) ； cyclo (- Aaz(NHOH)-Phe- Phe-D-Pro- )、実施例 3の化合物（HDA-18) ； cyclo(-Api (NHOH)- Phe-Phe- D- Pro- )、実施例 4の化合物（HDA- 12) ； cyclo(-Asu(NHOH)-D-Phe-Leu- Pip -)、実施例 5の化合物（HDA-15) ； cyclo(-Asu(NHOH)- Aib- Phe-D-Pro-)は何れも MHC class— I 分子発現促進作用を示すことか認された。同じく、陽照のトリコスタチン Aにおいても、図 4に示すとおり MHC class— I分子発現促進作用力追認された。特に、実施例 4の化合物は、トリコスタチン Aと同じ程度に低い添加濃度より、 MHC class— I分子発現促進作用を示すこと力確認された。一方、参考例 1の化合物； cy_Clo(-Asu(NHOH)-Phe-Phe-D- Pro- )₂では、高い添加濃度において MHC class— I 分子発現促進作用力^!かに観測されるのみであった。即ち、参考例 1の化合物は、実施例 1の化合物と同じ構成単位を持つ環状ォクタべプチド誘導体であるが、環状テトラベプチド誘導体である実施例 1の化合物とは比較にならない程 MHC class— I分子発現促進作用は低いものとなっている。換言するならば、末端にヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）を有する側鎖が重要であることは勿論であるが、それに加えて、環状テトラべプチド構造部分が MHC class— I分子発現促進作用に重大なる寄与を持つこと力結論される。なお、上述した MHC class— I 分子発現促進作用の添加濃度依存性の評価結果を基に、無添加を基準として、 MHC class— I 分子発？が 2倍となる添加濃度 C _{x 2}を求めた。その結果の一例を、表 1に示す。表 1

ちなみに、図 5に示す、ニコチン酸とその誘導体の結果を検討するなら ( ヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）を有するもので ( MHC class— I分子発現促進作用が見られており、末端にヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）を有する側鎖は、本発明の環状テトラペプチド誘導体における MHC class— I分子発現 {£1作用の根幹であることの極めて有力な傍証を与えている。なお、実施例 1〜 3の化合物間の対比によリ、該末端にヒドロキサム酸構造（ヒドロキシァミノカルボニル構造）を有する側鎖のメチレン鎖長は、 5が最適と判断され、トラポキシン体の対応する結果であった。このメチレン鎖長の差違による MHC class— I分子発現促進作用の違いは、恐らく、本発明の環状テトラべプチド誘導体がヒストンデァセチラ一ゼに作用する際、該酵素上の環状テトラべプチド部が結合する部位と酵素活' 間の隔たりに対応して、最適なメチレン鎖長が存在していると推定される。加えて、基質の N—ァセチル化されたリジンの側鎖との対比より、酵素活性点におけるカルボニル基酸素原子の配向が、このメチレン鎖長の違い、より具体的に ( 奇数個か偶数個かの違いに伴い反転することも、関与すると推察される。従って、比較的に柔軟性に富む飽和の炭化水素鎖より、トリコスタチン類の如く、不飽和の炭化水素鎖であるものでは、このカルボニル基酸素原子の配向が好ましい向きに保持されるため、環状テトラべプチド部の寄与の違いを補っているとも考えられる。更には、環状テトラペプチド部の寄与が若干劣るものであっても、トリコスタチン類に類した不飽和の炭化水素鎖を有するものでは、総合的には優れた MHC class— I分子発現促進作用を発揮すると推断される。また、図 5に示すニコチン酸ヒドロキサム酸の添加濃度依存性と同じく、本発明の環状テトラペプチド誘導体の示す MHC class— I分子発現促進活性は、高い濃度域において、見かけ上活性の濃度依存的上昇に抑制傾向が見られる。この現象ヒストンデァセチラーゼに対する阻害活性に由来する細胞増殖の抑制力起こリはじめ、結果的に MHC class— I分子発現量総口の上昇が抑制されている結果と解釈される。即ち、ヒストンデァセチラ一ゼに対する阻害活性に由来する細胞増殖の抑制作用が高濃度域において、顕著に見出されている。

加えて、本発明の環状テトラペプチド化合物に関して、その他の実施例において調製される化合物についても、 MHC class-I 分子発現促進活性を評価した。複数回のアツセィを実施し、二倍発現促進濃度についてまとめたものを表 2に示す。この表 2に ( 既に表 1に示す、 HDA-5, 17， 18， 12， 15， 19，及びトリコスタチン Aの値も再掲されている。

表 2 compounds cone, for - fold expression (nM) mean on IN trichostatin A 2.81 Q 14 trichostatinC 6.88 υ.υυ 1 trapoxin A 3.59 υ.υυ 1

cvcloi'-LvsCAcVPhe-Phe-D-Pro-'i i'rT AP -Ac'i 0 1

cyclo(-Asu(NHOH)-D-Phe- Leu-Pro-) (CHAP28) 80.2 Λ cyclo(-Asu( HOH)-D-Phe-Leu-D-Pro-) (CHAP29) 5.41 Λ cyclo(-Asu(NHOH)-D-Phe-Leu-D-Pip-) (CHAP 12) 2.75 1 ΔΛ J cyclo(-Asu( HOH)-D-Phe-Leu-Pip-) (CHAP53) 19.8 4.1 J cyclo(-Asu(NHOH)-Lys(Boc)-Phe-D-Pro-) (CHAP32) 773 244 2 cyclo(-Asu( HOH)-Trp-Leu-D-Pip-) (CHAP33) weak 2 cycio(-Asu( HOH)-D-Pro-AIa-D-AIa-) (CHAP13) 406 86 3 cyclo(-Asu( HOH)-Aib- Phe-D-Pro-) (CHAP15) 33.2 8.7 3 cyclo(-Asu( HOH)-Trp(CHO)-Leu-D-Pip-) (CHAP16) toxic 2

Ac-Asu(NHOH)-NH-Bzl 2410 771 3

Ph-(CH2)5- CONHOH 1 1400 0 1 nicotinic acid hydroxamate 28000 0 2 benzohydroxamic acid 35800 2480 2 benzoic acid >200000 1 nicotinamide > 1000000 1 nicotinic acid > 1000000 1 この表 2の結果を参照すると、本発明の環状テトラべプチドを構成する 4種のアミノ酸残基について、その立体配置に関する上述する好適な選択は、立体配置のみ力異なる立体異性体間の比較により、検証される。一例を挙げると、環状テトラペプチドを特徴付ける側鎖にヒドロキサム酸構造を有する Asu(NHOH)が L-体である HDA-5の立体配置を、 Asu(NHOH)を基準として最初に Lと記し LLLDと記載すると、 HDA-5と構成アミノ酸の種類は同じである力、その立体配置の組み合わせが違う異性体である HDA- 27， 38， 39はそれぞれ、 LDLD, LDLL, LLDL と記載される。この 4種の立体異性体 HDA-5, 27， 38， 39それぞれの二倍促進濃度は 98. 2， 3. 01， 558，及び 65800 nMであり、 MHC c lass - 1分子発現促進活性強度の序列としては、 LDLD > LLLD > LDLL > LLDL となっている。即ち、環状テトラペプチドを構成するァミノ酸残基のうち、 Asu(NHOH)に L-体を選択する際、 Asu(NHOH)に隣接する環状アミノ酸残基に、 D-体を選択するの力好ましく、加えて、 Asu(NHOH) に隣接する他方のアミノ酸残基も、 D-体を選択する更に好ましい結果となっている。同じく、 HDA-30 (LDLL)と HDA-31 (LDLD)の比較、 HDA-28 (LDLL)と HDA - 29 (LDLD) の比較、 HDA-53 (LDLL)と HDA - 12 (LDLD)の比較、 HDA-40 (LDLL)と HDA- 50 (LDLD) の比較、及び HDA- 51 (LDLL) と HDA-52 (LDLD) の比較においても、側鎖にヒドロキサム酸構造を有するアミノ酸残基に隣接する環状アミノ酸残基に、 D-体を選択するのが好ましく、加えて、隣接する他方のアミノ酸残基も、 D-体を選択する^ 更に好ましい結果となっている。なお、試験例 4に示す、ヒストンデァセチラーゼ（h i stone deacetylase) 阻害活性の評価結果においても、 HDA-27 (LDLD) > HDA-5 (LLLD) , HDA-31 (LDLD) > HDA-30 (LLLD) ， HDA- 29 (LDLD) > HDA-28 (LLLD) という阻害活性の序列が同様に検証されている。但し、ヒストンデァセチラ一ゼ阻害活性における差異は、 MHC class-I分子発現促進活性における差異ほど顕著ではない。

MHC c lass-I 分子発現促進作用を発揮するためには、環状テトラペプチドは細胞外より、細胞内に移行する過程も係わる。あるいは、ァセチル化ヒストン中に含まれる特定のリジンにおけるァセチル化の保持がよリ重要であることも想定される。即ち、細胞内への輸送過程など、ヒストンデァセチラ一ゼ阻害活性以外の要因の影響が、前記の差異を引き起こすものと推察される。

しかしながら、これらの比較より、特に、細胞自体に作用させる際には、ヒストンデァセチラーゼ阻害活性を示す天然の環状テトラベプチドに見出される立体配置の組み合わせである、 LLLDや LDLLよりも、 LDLD型の方がよリ優れていると判断される。

(試験例 2 ) ヒストン脱ァセチル化に対する阻害効果

本発明の環状テトラベプチド誘導体の有する MHC class— I分子発現促進作用が、ヒストン脱ァセチル化に対する阻害効果に付随することを検証するため、上記の B16/BL6細胞内におけるヒストン脱ァセチルイ匕を阻害する効果の確認を行った。試纖

7 5 ml容の培養用フラスコに、 B16ZBL6細胞 1. 5 X 10⁵個を播き、予め 4日間培養した。次いで、 ¾^化合物の所定量を添加して、引き続き 6時間培養した。その後、 0. 25%トリプシン酵素液を用いて、細胞を剥がし、 PBSで一回洗浄後、一 8 0 °Cで一時保存した。

この細胞試料から常法に従い、ヒストンをクロマチンより分離し、他の蛋白質とともに採取した。得られた蛋白質試料を 1 x g/laneの量にて、 AUTge l電気泳動に掛けた。該ゲルに銀染色を施し、泳動により分離されたバンドを検出した。

—例として、上記実施例 1の化合物を ΙΟ^ Μ添加した結果と、トリコスタチン Αを I M添加した結果、 INF— γを lOOUZml添加した結果とを比較したものを図 6に示す。なお、参照群として、ィ匕合物の添加量を零としたものの結果も併せて示す。図 6において、最下端の部分にヒストン H4のバンドが見られる力 \ トリコスタチン Aと実施例 1の化合物を添加した結果では、この領域に明確に合計 5本のバンド力分離されている。無添加の参照例と対比させると、前記の 5本のバンド中の 3本は参照例では見いだせず、これらは、脱ァセチル化の程度が異なる N-ァセチル化されたヒストンであること力判る。即ち、デァセチラ一ゼ酵素阻害活性を有するトリコスタチン Aと同様に、実施例 1の化合物を添加することで、ヒストンの脱ァセチル化が阻害を受け、高ァセチル化のヒストン力残留していること力判明した。本発明の環状テトラペプチド誘導体の添加は、ヒストン脱ァセチルイ匕に対する阻害効果を持ち、 MHC class- I 分子発現促進作用は、その効果に付随するものであること力 ¾1認された。

(試験例 3 ) 細胞増殖に対する抑制効果

本発明の環状テトラぺプチド誘導体の有する癌化細胞における細胞増殖を抑制する作用を検証するため、上記の B16/BL6細胞の細胞増殖に及ぼす作用を調べた。なお、細胞増殖率の評価市販の測定キット、具体的に Promega社製の商品名 Cel ITiter 96 Aqueous Non-Radioactive Prol iferation Assay Kitを禾 [j用した。該測定キットは、動物生細胞により、試薬の tetrazol ium化合物（3-(4，5- dimetylthiazol - 2 - y 1 ) -5-(3-carboxymethoxypheny 1 ) -2- (4-su 1 fopheny 1 ) -2H- tetrazol ium, inner salt ； MT S ) が還元されて生成する生成物量を、その生成物の発色を分光学的に検出して求めるもので、前記の生成物量は生細胞量に比例するので、生細胞量の評価に利用される。

試験例 1と同じ手順で B16ZBL6細胞を 9 6穴マイクロプレートに播種し、 2 4 時間培養した後、各穴当たリ ΐ«ィ匕合物の原溶液所定量を培地に希釈した液 10 6 1を添加する。その後、更に 4 8時間培養を続けた後、上記の Cel lTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Prol iferation Assay Kitの試薬液 20 1 を加える。 3 7 °Cで 1時間ィンキュベーシヨンを続けた後、発色量を 490nmにおける吸光度として、マイクロプレートリーダーを用いて測定する。なお、ネ雄ィヒ合物の添加量を零とした群を参照群として、参照群における細胞増殖量を基準（100%) として、被験化合物を添加した群の細胞増殖量〖お目対値で表す。各被験ィ匕合物について、種々の添加濃度における細胞増殖量を測定し、細胞増殖量の添加濃度依存性を調べ、その結果から無添加の参照群における細胞増殖量の 5 0 %に細胞増殖量力柳制される添加濃度を求めた。前記 B16ZBL6細胞の細胞増殖に対する 5 0 %抑制濃度の評価結果の一例を表 3に示す。なお、表 3には、癌細胞に対して細胞増殖抑制作用を示すことが報告されている陽 ¾¾·象として、トリコスタチン Aの評価結果も併せて示す。表 3

本発明の環状べプチド誘導体は、表 3に示すとおリ、表 1に例示する MHC class — I 分子発現促進が達成される濃度より高い濃度域において、それぞれ細胞増殖抑制作用を示すことが分かる。なお、実施例 4の化合物は、トリコスタチン Aよリ低い濃度より細胞増殖抑制作用を示しており、その影響のため、上述した MHC class— I分子発現促進作用の評価結果において見かけの促進量の頭打ち傾向が見られている。

加えて、本発明の環状べプチド誘導体の有する癌化細胞における細胞増殖を抑制する作用は、上記の試験例で用いた B16/BL6細胞株のみでなく、その他の癌化細胞における細胞増殖をも抑制することを検証した。試験方法は、上述の手順に従ってものであるが、但し、薬物添加後のインキュベーション時間は 72時間で行つた。具体例として、癌細胞として、マウス悪性黒色腫細胞である B16/BL6細胞株及び B16細胞株，白血病細胞である L1210細胞株，大腸癌細胞である Colon26細胞株，及び肝癌細胞である MH134細胞株を用いた評価結果を示す。これら各種の癌細胞に対して、各被験化合物の示す細胞増殖抑制作用について、 50%増殖抑制濃度を表 4に示す。また、トリコスタチン Aについての結果も併せて、表 4に示す。表 4

L1210 fn ) B16/BL6 fnM) B16 (nM) Colon 26 fnM) MH134 fnM) compounds mean SD mean SD mean SD mean SD mean SD

HDA-17 7380 1160 1260 210 23500 5000 29300 23900 19900 8410

HDA-18 >100000 59300 17300 >100000 >100000 >100000

HDA-13 2770 ^: 950 866 203 15400 4700 11000 1600 7920 2300

HDA-5 500 96 257 35 3370 ； 1030 2160 280 1660 763

HDA-28 1330 ： ^: 1371 470 54 3820 1660 7370 1090 ： 4830 2050

HDA-30 408 255 112 3 861 ； 282 1570 270 : 1510 106

HDA-15 193 ： 122 no 1 1230 ： 630 908 144 ' 946 262

HDA-27 ： 53.0 ^: 21.7 " 18.0 2.5 309 95 277 62 236 59

HAD-31 18.8 ： 5.4 5.43 0.39 ： 22.3 33.0 12.0 ― 50.7 8.9 HDA-29 43.8 19.9 15.8 5.6 109 198 51 " 176 ' 87

HDA-12 28.3 13.6 9.44 3.Π 1 262 174 149 39 112 48

TSA 12.4 2.4 19.1 10.5 621 50 139 42 * 41.7 ― 23.6 ここに比較する範囲においても、細胞増殖に対する抑制効果と MHC class- 1分子発現促進作用に関して、各化合物の活性の序列は一致力見出される。なお、細胞増殖に対する抑制効果において、その感受性は癌細胞種によって大きく異なる化合物があり、必ずしも定量的にも、 MHC class-I 分子発現促進作用と一致するものではないこと力分かった。この例で比較されている本発明の環状テトラべプチドにおいて、 HDA-31はどの癌細胞に対しても、 ICso値は数 nMから数 ΙΟ ηΜであり、他を有意に上回る増殖抑制活性を発揮している。

(試験例 4 ) ヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害活性

上述した試験例 2における細胞系におけるヒストン脱ァセチル化に対する阻害効果が、実際に本発明の環状テトラベプチド化合物によるヒストンデァセチラ一ゼの酵素活性を阻害によることの査証を得る目的で、本発明の環状テトラベプチド化合物が、 in vi troの系において、ヒストンデァセチラ一ゼの酵素活性を阻害することを以下の評価によリ検証した。評価方法

方谢標識ァセチルイ匕ヒストンを基質として用いた酵素アツセィ系により、ヒス

'ーゼ酵素阻害活性の評価を行った。基本的な条件は、吉田ら（J. Biol . Chem. 265, 17174-17179, 1990) の方法に従った。

マウスヒストンデァセチラ一ゼ FM3A細胞から部分精製したものを使用した。細胞を HDA buffer (15 mM リン酸カリゥム、 5% グリセロール、 0. 2 mM EDTA、 H 7. 5) に懸濁し、ホモジナイズした後、遠心で核を集め（35000 xg， lO min) 、 1 M ( H₄)₂S0₄を含む同 buffer中で再びホモジナイズした。超音波破碎し、遠心した上清の師 ₄)₂S0₄濃度を 3. 5 Mまで上昇させデァセチラ一ゼ酵素蛋白質を«させた。この ¾物を HDA bufferに再溶解し、 HDA bufferに対して透析後、 DEAE-ce l lulose カラムにアプライし、 NaCl の勾配で溶出した。活性画分をヒストンデァセチラ —ゼ ¾素液として用いた。

基質として、 [¾]acetyl histoneを用いた。 FM3A細胞の培養液中に 5 mMの n - 酪酸ナトリウム存在下、 [¾]acetateを添加し 30分インキュベートすることによリヒストンを； &½fラベルした。常法によりヒストンを調製し、基質液として使用した。アツセィは、歷化合物を所定濃度添加し、一方、無添加条件を参照群として、基質液と酵素液を 37°Cで 10分インキュベートすることにより行った（反応容積 100 ^ 1 ) 。酵素反応を 10 1 の濃塩酸を加えて止め、切り出された [¾]acetate を酢酸ェチルで抽出して放射活性を測定した。阻害活性は、参照群における酵素活性を 50%阻害する濃度で表した（50%阻害濃度）。評価結果の一例を示す表 5にある通り、本発明の環状テトラべプチド化合物は、何れもヒストンデァセチラーゼ阻害活性を示すことが分かった。側鎖ヒドロキサム酸構造を有する化合物であり、ヒストンデァセチラーゼに対する酵素阻害は、可逆的であることも確認された。表 5

ヒス卜ンデァセチラー B日害物晳の効罢

試験例 1の細胞系における MHC class- 1分子発現促進作用の評価結果と同じく、本発明の環状テトラべプチドを特徴付ける側鎖のヒドロキサム酸構造にぉ、て、璟構造が同じ際には、 HDA-5 の如く、その側鎖のメチレン鎖長が 5において、最適の阻害活性力得られ、鎖長炭素数 6の HDA- 17、鎖長炭素数 4の HDA-18はともに相当に高い阻害活性を示すものの、鎖長炭素数 5のものより、活性は劣るものである。この一致からも、本発明の環状テトラペプチドの MHC c lass- 1分子発現促進作用ヒストンデァセチラーゼ阻害活性に起因することが結論される。

(試験例 5 )

ヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害活性（合成べプチド基質を用いた評価）前記の試験例 4においては、細胞から採取したヒストンを基質として、本発明の環状テトラべプチド化合物が示すヒストンデァセチラーゼ酵素阻害活性を評価したが、その結果を補完する目的で、合成ペプチド基質を利用して、

セチラーゼ素阻害活性の再評価を行つた。試験方法

ヒストンデァセチラーゼの調製は基本的には吉田ら U. Bio l . Chem. 265, 17174-17179, 1990) の方法に従って行った。酵素は B16/BL6細胞から部分精製したものを使用した。細胞を HDA buffer (15 mM リン酸カリウム、 % グリセ口一ル、 0. 2 mM EDTA, 10¾ 2-mercaptoethanol , pH 7. 5) に懸濁し、ホモジナイズした後、遠心で核を集め（2500Xg， 10 min) 、 1 M ( H₄)₂S0₄を含む同 buffer中で再びホモジナイズした。超音波破砕し遠心して、採取した上清中の (NH₄)₂S0₄濃度を 3. 5 Mまで上昇させ、ヒストンデァセチラ一ゼを ¾させた。この灘物を HDA bufferに再溶解し、ゲル濾過で HDA bufferに溶媒交換し、粗ヒストンデァセチラーゼ¾素液として用いた。

基質として、合成基質ぺプチド； [¾]acetylated hi stone H4 peptideを用いた。この [¾] acetyl ated hi stone H4 peptide は、ヒストン H4 の N末ペプチド； SGRGKGGKGLGKGGAKEHR VC (C末にはシスティンをつけてある）を合成し、 3H-無水酢酸で; ΚΙίァセチル化し、基質として用いた。

アツセィはィ匕合物の存在下、合成基質液と酵素液を 37°Cで三時間インキュベ一トすることによリ行った（反応容積 100^ 1 ) 。反応を 25 1の 1M HC1， 0. 2 M 酢酸を添加で止め、酵素反応で切リ出された [³H]acetateを酢酸ェチルで抽出して活性を測定した。なお、参照群として、匕合物を反応系添加せず、同じ操作を行った。阻害活性は、参照群におけるヒストンデァセチラーセ素活性を 50%阻害する濃度で表した（50%阻害濃度）。評価結果の一例を表 6に示す。天然のァセチル化ヒストンを基質とした結果と、合成基質を用いた結果間で若干の不一致が見られる。し力しな力ら、この表 6に示す、環状テトラベプチドは何れもヒストンデァセチラーゼ酵素阻害活性に優れること ί 何れの結果においても検証される。

この結果と、細胞レベルで見いだされる MHC cl ass- 1分子発現促進活性、細胞増殖抑制作用とを対比させると、酵素阻害活性がより高い環状テトラべプチドにおける、 MHC class-I 分子発現促進活性、細胞増殖抑制作用 ( それぞれ高いものの、その活性の強弱に関する序列は必ずしも酵素阻害活性の強弱の序列と一致していないことが見いだされた。細胞内におけるヒストンデァセチラーゼ酵素阻害活性が関与する MHC class- 1分子発現促進活性、細胞増殖抑制作用においては、酵素阻害活性に加えて、当該化合物の細胞膜透過性の違い等も、本質的な影響を持っため、その影響により、 MHC class- 1 分子発現促進活性、細胞増殖抑制作用は必ずしも極めて高い水準に至つてない化合物もあると推断される。表 6 ィ [^物 I ίηΜ

リコ：チ、 / A 2 55

丽-

HDA-30 3.31

醒 -31 3.32

匪 - 49 4.81

腿- 50 3.96

腿- 51 49.8

腿- 52 4.35

HDA-17 24.7

腿- 18 150

腿- 27 3.44

腿- 38 5.32

HDA-39 226

腿- 37 9.16

腿- 42 53.8

HDA-43 33.9

(試験例 6) 制癌活性の評価

本発明の環状テトラペプチド化合物は、上記の試験例 3の結果に示す通り、 in vitro での癌化細胞に対する細胞増殖抑制効果を示すことから、当然に生体内においても、制癌活性を有すると推断される。一方、個々の癌細胞に対する細胞増殖抑制効果の強弱が見られておリ、その個々の癌細胞における感受性には差異があると想定される。本発明の環状テトラペプチド化合物は、実際の生体内において、制癌活性を示すことを検証するとともに、個々の癌細胞における感受性の違いの有無を確認するため、腹水癌の系並びに固形癌の系において、代表的な癌細胞を用いて制癌活性の評価を行った。

( 1 ) マウスにおける in vivoでの制癌活性（腹水癌の系）

試験方法

»癌の系に関して、担癌マウスを用いて、本発明の環状テトラペプチド化合物の in vivoでの制癌活性を評価した。用いた癌細胞は L1210, B16, Colon26，及び MH134である。それぞれの癌細胞を常法により培養し、 PBSに懸濁して、マウス一匹当たり、 L12I0は 10⁵個、また、 B16, Colon26, 及び MH134は 10^s個をそれぞれ腹腔内に移植した（ 100 1 /mouse) 。用いたマウスの種類は、 L1210, B16， Colon26, MH134についてそれぞれ CDF1, BDF1, CDF1, C3H/HeNである（7週齢の雄性マウス）。癌細胞移植の翌日から薬物投与を開始した。 L1210 については、 0. 5%カルボキシメチルセルロース Na懸濁液として、また、他の癌細胞については PBS溶液（実際は NaOHで中和後の懸濁液として投与）として連日投与した（100 /mouse) 。投与日数は、 L1210は 4日、 B16及び MH134は 9日、 Colon26は 8 日である。上記の投与期間が経過後、 ¾ ^マウスを飼育し、癌細胞移植より死亡に至った日数を基に、 median survival days (平均生存日数）を算定した。薬物を含まない同量の液を投与した参照群（コントロール）の median survival days (C) と薬物投与を行った処置群の median survival days (T) の比を、パーセンテージ表示した値（T/C%) を求めた、一例として、 HDA- 31における結果を表 7に示す。表 7 Median Survival days (T/C%)

cell lines—0.015 mg/mouse 0.05 mg/mouse 0.15 mg/mouse 1.5 mg/mouse

L1210 113 125 37.5

B16 117 119 139

Colon26 90.9 86.4 63.6

MH134 95.8 85.4 9L7 表 7に示す結果より、癌細胞 L1210及び B16に対して、 HDA-31は明らかな延命効果を示した。一方、 Colon26及び MH134において延命効果は確認されなかつた。本発明の環状テトラペプチド化合物癌の系においては、癌の種類によリ有効性は異なるものの、な抗癌剤となりうる可能性力示唆された。

( 2 ) マウスにおける in vivoでの制癌活性（固形癌の系）

試験方法

Colon26、 Meth A, 及び B16の 3種類のマウス癌を用いて、固形癌の系で本発明の環状テトラべプチド化合物の in vivoでの制癌活性を評価した。癌細胞は定法で培養後、 PBSに懸濁して 10^s個をマウスの腹側部に皮内移植した。用いたマウスの種類は、 - Col on26、 Meth A, 及び B16に対して、それぞれ CDF1、 Balb/c、及び BDF1である（7週齢の雄性マウス）。癌移植日を day-0とし、 Colon-26については day - 4， 7， 10の三回、 Meth A及び B16については day- 7， 10， 13， 16の 4 回、 TO化合物所定量を含む一定量の液を尾静脈内投与した（10, 3，及び l mg/kg; 2 ml/kg) 。本例では、投与液は PBS懸濁液を用いた（NaOHで中和済み）。その後、 Colon- 26については day- 14に、 Meth A及び B16については day - 21に腫瘍径

(短径及び長径）を測定した。腫瘍重量は、 1/2*長径 *短径 ²の式を用いて、算定した値を基に推定した。抗腫瘍効果は、腫瘍重量推定値を指標とし、薬物を添加しない同量の液を投与した群を参照群とし、参照群における腫瘍重量推定値との差を抑制量として、抑制率を求めた。一例として、 HDA-31に対する評価結果を表 8に示す。表 8

cell lines condition tumor weight (mg) % inhibition

Colon 26 control 980 ± 77

1 mg/kg 756 ± 25 22.9

3 mg/kg 677 ± 155 31.0

10 mg/kg 726 ± 123 25.9

Meth A control 3120 ± 480

1 mg/kg 2100 ± 570 32.5

3 mg/kg 1230 ± 500 60.7

10 mg/kg 1470 ± 500 52.8

B16 control 699 ± 229

1 mg/kg 258 ± 184 63.1

3 mg/kg 280 ± 152 59.9

10 mg/kg 120 ± 112 82.9

表 8に示す結果より、これらの固开總細胞において、 H - 31を初めとする本発明の環状テトラペプチド化合物は有効性を示すこと力認される。特に、 HDA-31 に関して B16メラノ一マに対して、極めて高い抑制率 8 0 %が得られていた。以上の結果より、本発明の環状テトラペプチド化合物は、癌細胞の細胞増殖抑制作用を利用して、 IIz癌の系ならびに固开¾£の系双方において、制癌活性を示すと判断された。また、上記の例において薬剤を尾静脈内投与した際に制癌活性か認されており、投与後相当の時間にわたって、血中濃度を有効濃度範囲に維持され、制癌効果が発揮されたと推断できる。

(試験例 7 )

本発明の環状テトラペプチドは、投与後相当の時間にわたって、血中濃度を有効濃度範囲に維持されると推断できるものの、実際に制癌剤としての応用に適合する前記の血中濃度推移カ'達成されることを検証した。ここにおいては、一例として、上記の試験例で使用した薬剤、 HDA-31に対する評価結果を示す。 HDA-31のラット血中濃度推移

試験方法

ケタラール/セラクタール混合麻酔下 SDラットに HDA-31を尾静脈内投与した (10 mg/kg; 2 ml/kg) 。薬物は PBSに分散させ NaOHで中和した懸濁液を用いた。投与後一定時間おきに頸動脈より採血し（抗凝固剤としてへパリン使用）、遠心により血漿を調製した。血漿中の HDA-31 を MTBE (methyl-t-butyl-ether) で抽出し、逆相 HPLCで分離を行い、 HDA- 31 に相当するピーク面積を質量分析計にて定量した。結果を図 7に示す。なお、図示する結果は、 3匹の平均値である。 HDA- 31の癌細胞増殖抑制に関する ICso値は数 nMから数 10 nMであり、 100 ng/mlはモル濃度で 174 nMに相当するので、静脈内投与後数時間に亙って、前記の有効濃度を超える血中濃度が維持されていることが分かる。

'また、今回の投与は子の懸濁液として投与したため、子状になっていた薬物は十分血中に乗らずに速やかに代謝された可能性もある。このことをも考慮すると、完全に溶解する媒体を用いればより高い血中濃度が同じ投与量でされる可能性力想定される。また、 HDA-31 よりも癌細胞増殖抑制、あるい MHC class— I分子発現促進に関して、上述した細胞レベルの試 ¾ 果に示す通り、例えば HDA-50, HDA-52などはよリ高、活性を示す。 HDA - 31 よりも高、活性を示す本発明の環状テトラべプチド化合物、例えば HDA-50, HDA-52などに関しても、ここに示した HDA-31と類似の動態を取ると仮定したならこれらの化合物ではもつと低用量で薬効血中濃度を達成出来ることになる。

産業上の利用可能性

本発明の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩は、その優れたヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害活性に付随して、 MHC class— I分子発現促進に優れた活性を有する。また、ヒストンデァセチラ一ゼ酵素阻害に由来する細胞増殖阻害、細胞周期の阻害作用も有しており、癌組織の拡大を抑制するので、前記の MHC class— I分子発現促進作用を利用して、免疫系による癌細胞の排除を格段に促進することができ、抗癌剤として極めて有用である。その際、本発明の環状テトラぺプチド誘導体のヒストンデァセチラーゼ酵素阻害は可逆的なものであるので、不可逆的な阻害剤と比較して、正常な組織に対しては、細胞増殖阻害、細胞周期の阻害作用などの好ましからざる副作用が格段に少ない利点を持つ。

Claims

請求の範囲

1 . 下記の一式（ I )、（ Γ)、（ I ") 又は（ I '") のいずれかで示される環ベプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩。

(n

(式中、

R_u、 R₁₂、 R₂₁、 ¾ それぞれ水素、炭素数 1〜6の直鎖アルキル基炭素数 3〜 6の分岐のアルキル基、炭素数 1〜 5の直鎖 ω—アミノアルキル基、炭素数 3〜 5の分岐のァミノアルキル基、前記の直鎖又は分岐ァミノアルキル基上のァミノ基上に炭素数 3以下のァシル基又 ίお、ロゲノ置換ァシル基カ置換してなる Ν—ァシルーァミノアルキル基、ベンジル基、 4ーメトキシベンジル基、 3—インドリルメチル基、（Ν—メトキシー 3—インドリル）メチル基、炭素数 3以下のァシル基を環状窒素上に置換基として有する（Ν—ァシルー 3—インドリル）メチル基、環数 4以下のァリール基が置換したメチル基から選択される一価の基を表し、 ( 鎖上に分岐鎖を有してもよい鎖長炭素数 3又は 4の直鎖アルキレン基、鎖上に分岐鎖を有してもよい鎖長炭素数 3又は 4の直鎖ァルケ二レン基、鎖上に分岐鎖を有してもよい鎖長炭素数 4の直鎖アルカジエ二レン基、並びに、前記の直鎖アルキレン基、直鎖ァルケ二レン基及びアルカジエ二レン基上に付加される分岐鎖カ縮合環構造を形成したもの、またこれら鎖式炭ィは素基を構成する炭素原子のうち、遊離原子価が存在する炭素原子以外の炭素原子の一つか素、ィォゥ又は窒素の何れかのへテロ原子に置き換わつてなる二価の基から選択される二価の基を表し、

R₄は、当該鎖上に分岐鎖を有してもよい鎖長炭素数 4〜6の二価の鎖式炭化水素基、およびこれら鎖式炭化水素基を構成する炭素原子のうち、遊離原子価が存在する炭素原子以外の炭素原子の一つ以上が酸素、ィォゥ又は窒素の何れかのへテ口原子に置き換わってなる二価の基を表し、

一般式 ( 1") あるいは ( Γ") 中のは、メチル基またはノヽロゲノ置換メチル基を表す。 )

2. 前記一般式（I ) で示されることを特徴とする請求項 1記載の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される

3 . 前記一般式 ( ) で示されることを特徴とする請求項 1記載の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩。

4. 前記一般式 ( 1 ") で示されることをとする請求項 1記載の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩。

5. 前記一般式 ( I '") で示されることを特徴とする請求項 1記載の環状テトラベプチド誘導体又はその薬学的に許容される

6 . 前記請求項 1〜 5の何れかに記載の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩の何れかを有効成分として含有するヒストンデァセチラーゼ阻害剤。

7 . 前記請求項 1〜 5の何れかに記載の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩の何れかを有効成分として含有する MHC class- 1分子発現促進剤。

8. 前記請求項 1〜 5の何れかに記載の環状テトラべプチド誘導体又はその薬学的に許容される塩の何れかを有効成分として含有する医薬糸!^物。

9. 抗癌剤として使用される請求項 8記載の医薬物。