WO1998044146A1 - Procede de production de proteines etrangeres - Google Patents

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WO1998044146A1
WO1998044146A1 PCT/JP1998/001552 JP9801552W WO9844146A1 WO 1998044146 A1 WO1998044146 A1 WO 1998044146A1 JP 9801552 W JP9801552 W JP 9801552W WO 9844146 A1 WO9844146 A1 WO 9844146A1
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WO
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medium
heterologous protein
producing
culture
surfactant
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PCT/JP1998/001552
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English (en)
French (fr)
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Toyoo Ohda
Tomoshi Ohya
Shinobu Kuwae
Masao Ohyama
Kaoru Kobayashi
Yahiro Uemura
Original Assignee
Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to an improved method for producing a heterologous protein by culturing a host transformed by genetic manipulation.
  • HSA human serum albumin
  • various proteins useful as pharmaceuticals such as human serum albumin (hereinafter referred to as HSA), which is a major protein component of plasma, are produced by fractionation from body fluids.
  • HSA human serum albumin
  • the production of such proteins by microorganisms and cells has become possible, and research and development of mass production of heterologous proteins by genetic recombination technology has been actively conducted.
  • the yield is still low and mass production is difficult.
  • rHSA recombinant HSA
  • rHSA recombinant HSA
  • rHSA recombinant HSA
  • a surfactant having a high concentration of a polyalkylene glycol group Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 3-500969
  • an object of the present invention is to further increase the amount of heterologous protein produced by improving culture conditions.
  • the present inventors have conducted studies to solve the above problems, and as a result, by culturing a heterologous protein-producing host prepared by genetic manipulation in a medium containing a fatty acid or a salt thereof and a surfactant. They have found that the amount of heterologous protein produced can be increased, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a heterologous protein-producing host prepared by genetic engineering And culturing in a medium containing a surfactant, and collecting the heterologous protein from the culture.
  • the heterologous protein in the present invention is a protein which is not originally produced by a host cell, and is a foreign protein which can be produced by transformation.
  • the heterologous protein-producing host prepared by genetic engineering used in the present invention is not particularly limited as long as it is prepared through genetic engineering and can produce a heterologous protein. Even those that are developed can be used as appropriate. Specific examples include bacteria (for example, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, etc.) that have been rendered heterologous protein-producing through genetic manipulation, animal cells, and the like. In particular, in the present invention, it is preferable to use yeast, specifically, Saccharomyces or Pichia as a host. Also, auxotrophic strains and antibiotic-sensitive strains of these hosts can be used.
  • the G18 sensitive strain Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (a, his4, leu2, can1 ;, Pichia pastoris) GTS115
  • the strain (his 4, NRRL deposit number Y-185585) is used.
  • the heterologous protein produced by the heterologous protein producing host is not particularly limited, and preferably includes HSA and the like.
  • an HSA-producing host for example, a method using an ordinary HSA gene (Japanese Patent Laid-Open Nos. 58-56684 and 58-95051) Nos. 58-1505517) and a method using a novel HSA gene (Japanese Patent Application Laid-Open Nos. Sho 62-29985 and Hei 1-94846).
  • a method using a synthetic signal sequence Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 1-244091
  • a method using a serum albumin signal sequence Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Hei 2-16795 A method of incorporating a recombinant plasmid onto a chromosome (JP-A-3-72889); a method of fusing host cells (JP-A-3-53587); method for in a mutation, mutant AOX 2 method using a promoter one (Hei 6 9 0 7 6 8 No., each publication of JP-4 one 2 9 9 9 8 4 No.), the HS Alpha by Bacillus subtilis Expression (JP No. 621-153133), Expression of HSA by yeast (Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 60-41,487, 63-395,763 and 63-3,744) No. 93), expression of HSA by Pichia yeast (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-140290), and the like.
  • the method of causing mutation in a medium containing methanol is specifically performed as follows. That is, first, a transcription unit in which HS A is expressed in a suitable host, preferably Pichia yeast, specifically, in the AOXi gene region of Pichia pastoris GT S115 strain under the control of A OXi promoter by a conventional method.
  • a transformant is obtained by introducing a plasmid having the formula (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-140290). This transformant has a low ability to grow in a medium containing methanol. Therefore Hei 4 - according to the process described in 2 9 9 9 8 4 discloses, the transformant to cause a mutation is cultured in a medium containing methanol, to recover only viable strains.
  • the methanol concentration is, for example, about 0.001% to 5%.
  • the medium may be a synthetic medium or a natural medium.
  • the culture conditions are, for example, about 15 ° C. to 40 ° C. and about 1 hour to 1000 hours.
  • the medium used for culturing the transformed host is not particularly limited as long as it contains a fatty acid or a salt thereof, and a surfactant. Usually, a medium known in this field is used. used. By culturing the transformed host in a medium containing a fatty acid or a salt thereof and a surfactant, the amount of heterologous protein produced can be increased. Furthermore, the effect of suppressing the degradation of heterologous proteins by enzymes secreted by the host itself can be expected.
  • Fatty acids preferably include those having 10 to 26 carbon atoms.
  • fatty acid examples include saturated or unsaturated fatty acids such as myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, oleic acid, t-vaccenic acid, linoleic acid, linolenic acid, linoleic acid, and arachidonic acid.
  • the salts of these fatty acids include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and calcium salt, alkaline earth metal salts and organic amine salts.
  • the medium contains oleic acid or a salt thereof.
  • Examples of the content of the fatty acid in the medium include about 0.01 to 1 OW / V! K. Preferably, it is about 0.2 to 5 W / V%.
  • the surfactant used in the present invention preferably includes a nonionic surfactant having a high molecular weight of 100 to 100,000.
  • nonionic surfactant examples include a polyalkylene glycol (for example, a polypropylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 1000, preferably 2000 to 600), and a polyoxyalkylene.
  • Copolymer for example, a polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer having an average molecular weight of 100,000 to 100,000, preferably 100,000 to 30,000
  • hydrogenated castor oil polyoxyalkylene derivative for example, Hydrogenated castor oil polyoxyethylene-(20)-ether, identical (40)-ether, same-
  • castor oil polyoxyalkylene derivative for example, castor oil polyoxyethylene- (20) -ether, same- (40) -ether, same (100)- Ether, etc.
  • sorbitan fatty acid esters examples thereof include alkylphenol polyoxyethylene ether, polyoxetylene sorbite fatty acid ester, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, and polyglycerin fatty acid ester.
  • the medium contains a polyalkylene glycol, a polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (trade name: Pull Mouth Nick), or a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (trade name: Twien).
  • the content of the surfactant in the medium is preferably 0.5 gZL or less.
  • the medium may be a synthetic medium or a natural medium. Preferably, it is a synthetic medium.
  • the medium may be a solid medium or a liquid medium, but is preferably a liquid medium.
  • synthetic media generally include various sugars as a carbon source, urea, ammonium salts, nitrates, etc. as nitrogen sources, various vitamins, nucleotides, etc. as micronutrients, and inorganic salts such as Mg, Ca, Fc, Na, etc. K, Mn, Co, Cu and the like are exemplified.
  • YNB liquid medium [0.7% yeast tonogenic base (Difco), 2% glucose] and the like.
  • the natural medium examples include a YPD liquid medium [1% yeast extract (manufactured by Diico), 2% bactobutone (manufactured by Difco), 2% glucose].
  • a methanol-containing medium can be used. In this case, the methanol concentration is preferably about 0.01 to 5%.
  • the medium used in the present invention can be easily prepared by adding the fatty acid or a salt thereof and a surfactant to a conventionally known medium.
  • Other culturing conditions include conditions according to general ordinary methods.
  • the culture temperature is 15. C to 40 ° C, usually 20 ° C to 37.
  • the temperature is preferably 20 ° C to 30 ° C, and when it is a bacterium, the temperature is preferably 30 ° C to 37 ° C.
  • the culturing time is usually about 1 hour to 100 hours.
  • the cultivation is carried out by a batch (batch) culturing method or a semi-batch (fed batch) culturing method or a continuous culturing method under standing or shaking, stirring, and aeration.
  • a fed-batch culture method using a single batch is used.
  • a method of obtaining a high concentration of cells and a product by supplying a high concentration of glucose in a small amount by a feed batch culture and avoiding a high concentration of substrate inhibition on the producing cells Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-8333
  • pre-culture is performed prior to the culture.
  • a YNB liquid medium or a YPD liquid medium is used.
  • the culture time is, for example, 10 hours to 100 hours, the temperature is about 30 ° C. for yeast, and about 37 for bacteria.
  • the heterologous protein is collected from the culture by known separation and purification means.
  • the culture refers to a culture medium obtained by culturing a heterologous protein-producing host, and any medium that can contain a heterologous protein of the host or the like.Specifically, a culture supernatant, its filtrate, Bacteria, cells, and the like.
  • Mutant AOX2 promoter [Natural AOX2 promoter (YEAST, 5, 167-177 (1988) or Mol. Cell Biol.. 9, 1316-1323 (1989)), nucleotide 255 upstream of the start codon was transformed from T to C] to construct a plasmid pMM042 for HSA expression, introduced into Pichia pastoris GTS115 strain, and transformed into UHG42-3. A strain was obtained (Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei.
  • YPD medium 2% bactopton, 1% bisect extract, 2% glucose
  • Table 1 shows the composition of the batch medium used in the main culture
  • Table 2 shows the composition of the feed medium
  • Table 3 shows the composition of the solution of * 2 in Tables 1 and 2.
  • the content of oleic acid in the batch medium and the feed medium used in this example was set to 0.1.
  • Table 1 Batch medium composition Component Amount (1 ZL)
  • 1 ml of the cell suspension (for example, about 10 OD S4Q ) was inoculated into 50 ml of YPD medium and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours.
  • the culture solution was sampled, and the amount of HS A production was measured by the method described in the following Reference Example. As a result, assuming 100% when no oleic acid was added, it was 114%.
  • the amount of heterologous protein produced by the heterologous protein-producing host can be increased, and the degradation of the heterologous protein by the enzyme secreted by the host itself can be suppressed.
  • the present invention can be carried out by a simple method by culturing a heterologous protein-producing host in a medium to which a fatty acid or a salt thereof and a surfactant are added. This application is based on Japanese Patent Application No. 85064/1997 filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

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Description

明細書
異種蛋白質の製造方法
技術分野
本発明は、 遺伝子操作により形質転換された宿主を培養することによる異種蛋 白質の製造方法の改良に関する。
背景技術
例えば、 血漿の主要な蛋白構成成分であるヒ 卜血清アルブミン （以下、 H S A という） 等、 医薬として有用な多種多様の蛋白質は、 体液からの分画によって製 造されているが、 この方法においては、 原材料の確保が難しく、 また、 製造され た製剤は、 ウィルス等による汚染の危険が大きい。 近年、 組換え D N A技術の出 現によつて、 このような蛋白質の、 微生物や細胞による生産が可能となり、 遺伝 子組換え技術による異種蛋白質の大量生産の研究開発が活発に行われている。 し かしながら、 その収量はいまだ低く、 大量生産することは困難である。
異種蛋白質の産生を増強させる方法として、 培地中に脂肪酸またはその塩を添 加して組換え H S A (以下、 r H S Aという） の産生を増強する方法 （特開平 4 - 2 9 3 4 9 5号公報） 、 高濃度のポリアルキレングリコール基を有する界面活 性剤を添加して r H S Aの産生を増強させる方法 （特表平 3 - 5 0 0 9 6 9号公 報） 等が知られている。
本発明はかかる技術的背景の下に、 特に培養条件の改良によって異種蛋白質の 生産量をより増大させることを課題とする。
発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、 遺伝子操作により調 製された異種蛋白質産生性宿主を、 脂肪酸またはその塩、 および界面活性剤を含 有する培地で培養することにより、 異種蛋白質の産生量を増大できることを見出 し、 本発明を完成するに到った。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 遺伝子操作により調製された異種蛋白質産生性宿主を脂肪酸またはその塩、 および界面活性剤を含有する培地で培養し、 培養物から異種蛋白質を採取するこ とを特徴とする異種蛋白質の製造方法。
(2) 脂肪酸の炭素数が 1 0〜2 6である上記 （1) に記載の異種蛋白質の製造 方法。
(3 ) 培地が脂肪酸またはその塩を 0. 0 1〜 1 0W/V!¾の濃度で含有する上記 （ 1 ) に記載の異種蛋白質の製造方法。
( 4) 界面活性剤が分子量 1 0 0〜 1 0万の非イオン性界面活性剤である上記 （ 1 ) に記載の異種蛋白質の製造方法。
(5) 培地が界面活性剤を 0. 5 gZL以下の濃度で含有する上記 （ 1 ) に記載 の異種蛋白質の製造方法。
発明の詳細な説明
本発明における異種蛋白質とは、 宿主細胞が本来産生しない蛋白質であって、 形質転換によつて産生可能となつた外来の蛋白質を L、う。
本発明において用いられる遺伝子操作により調製された異種蛋白質産生性宿主 は、 遺伝子操作を経て調製され、 かつ異種蛋白質を産生し得るものであれば特に 限定されず、 既に公知文献記載のものの他、 今後開発されるものであっても適宜 利用することができる。 具体的には、 遺伝子操作を経て異種蛋白質産生性とされ た菌 （例えば、 大腸菌、 酵母、 枯草菌等） 、 動物細胞等が挙げられる。 特に、 本 発明においては、 宿主として、 酵母、 具体的にはサッカロマイセス属、 ピキア属 を使用することが好ましい。 また、 これらの宿主の栄養要求性株や抗生物質感受 性株をも使用できる。 好適には、 G 1 8感受性株であるサッカロマイセス ·セ レビシェ (Saccharomyces cerevisiae) AH 2 2株 (a, his 4， leu 2, can 1； 、 ピキア ·パス卜リス （Pichia pastoris)GT S 1 1 5株（his 4， NRRL寄託番 号 Y— 1 5 8 5 1 ) 等が用いられる。
異種蛋白質産生性宿主によつて産生される異種蛋白質は特に限定されず、 好適 には H S A等が挙げられる。
これらの異種蛋白質産生性宿主の調製方法は公知ならびにそれに準じた手法を 採用することによって実施される。
例えば HS A産生性宿主 （または HS A産生株） の調製方法としては、 例えば 通常の H S A遺伝子を用いる方法 （特開昭 5 8— 5 6 6 8 4号、 同 5 8— 9 0 5 1 5号、 同 5 8— 1 5 0 5 1 7号の各公報） 、 新規な H S A遺伝子を用いる方法 (特開昭 6 2 - 2 9 9 8 5号、 特開平 1— 9 8 4 8 6号の各公報） 、 合成シグナ ル配列を用いる方法 （特開平 1一 2 4 0 1 9 1号公報） 、 血清アルブミ ンシグナ ル配列を用いる方法 （特開平 2 - 1 6 7 0 9 5号公報） 、 組換えプラスミ ドを染 色体上に組込む方法 （特開平 3 - 7 2 8 8 9号公報） 、 宿主同士を融合させる方 法 （特開平 3— 5 3 8 7 7号公報） 、 メタノール含有培地中で変異を起こさせる 方法、 変異型 AOX2 プロモータ一を用いる方法 （特開平 6— 9 0 7 6 8号、 特 開平 4一 2 9 9 9 8 4号の各公報） 、 枯草菌による HS Αの発現 （特開昭 6 2一 2 5 1 3 3号公報） 、 酵母による HS Aの発現 （特開昭 6 0— 4 1 4 8 7号、 同 6 3— 3 9 5 7 6号、 同 6 3— 7 4 4 9 3号の各公報） 、 ピキア酵母による H S Aの発現 （特開平 2 - 1 0 4 2 9 0号公報） 等が挙げられる。
このうち、 メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法は、 具体的には以下 のように行う。 すなわち、 まず適当な宿主、 好ましくはピキア属酵母、 具体的に はピキア ·パストリス GT S 1 1 5株の AOXi 遺伝子領域に、 常法により A OXi プロモータ一支配下に HS Aが発現する転写ュニッ 卜を有するプラスミ ド を導入して形質転換体を得る （特開平 2— 1 0 4 2 9 0号公報を参照） 。 この形 質転換体はメタノール含有培地中での增殖能は弱い。 そこで特開平4 — 2 9 9 9 8 4号公報に記載の方法に従い、 この形質転換体をメタノール含有培地中で培養 して変異を起こさせ、 生育可能な菌株のみを回収する。 この際、 メタノール濃度 としては、 0. 0 0 0 1 %〜 5 %程度が例示される。 培地は合成培地、 天然培地 のいずれでもよい。 培養条件としては 1 5°C〜4 0°C、 1時間〜 1 0 0 0時間程 度が例示される。
形質転換宿主の培養に用いられる培地は、 脂肪酸またはその塩、 および界面活 性剤を含有していれば他の成分は特に限定されず、 通常この分野で既知の培地が 使用される。 脂肪酸またはその塩、 および界面活性剤を含有する培地で形質転換 宿主を培養することにより、 異種蛋白質の産生量を増大させることができる。 さ らに宿主自身が分泌する酵素によつて異種蛋白質が分解されることを抑制する効 果が期待できる。
脂肪酸としては、 好ましくは炭素数が 1 0〜2 6であるものが挙げられる。
前記脂肪酸としては、 例えばミ リスチン酸、 パルミチン酸、 パルミ トレイ ン酸、 ォレイン酸、 t—バクセン酸、 リノ一ル酸、 リノレン酸、 リノ レイン酸、 ァラキ ドン酸等の飽和または不飽和脂肪酸が挙げられる。 これらの脂肪酸の塩としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩、 カルシウム塩等のアルカリ金属塩、 アルカリ 土類金属塩または有機アミ ン塩が挙げられる。 特に、 培地がォレイ ン酸またはそ の塩を含有していれば好ましい。
脂肪酸の培地中の含有量としては、 0. 0 1〜 1 OW/V!K程度が例示される。 好 ましくは 0. 2〜5W/V%程度である。
本発明で用いられる界面活性剤としては好ましくは分子量 1 0 0から 1 0万の 高分子量を有する非ィォン性界面活性剤が挙げられる。
前記非イオン性界面活性剤としては、 ポリアルキレングリコール （例えば、 平 均分子量 1 0 0 0~ 1 0 0 0 0、 好ましくは 2 0 0 0〜6 0 0 0のポリプロピレ ングリコール） 、 ポリオキシアルキレン共重合体 （例えば、 平均分子量 1 0 0〜 1 0万、 好ましくは 1 0 0 0〜 3万のポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレ ン共重合体） 、 硬化ヒマシ油ポリオキシアルキレン誘導体 〔例えば、 硬化ヒマシ 油ポリオキシエチレン— （2 0) —エーテル、 同一 （4 0) —エーテル、 同—
( 1 0 0) 一エーテル等〕 、 ヒマシ油ポリオキシアルキレン誘導体 〔例えば、 ヒ マシ油ポリオキシエチレン— （2 0) —エーテル、 同— （ 4 0) —エーテル、 同 一 （ 1 0 0) —エーテル等〕 、 ポリオキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル
(例えばポリオキシエチレンソルビタンモノォレエ一卜、 ポリオキシエチレンソ ルビタンモノステアレート、 ポリオキシエチレンソルビ夕ンモノパノレミテ一ト、 ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ一卜等） 、 ソルビタン脂肪酸エステル、 アルキルフヱノールポリオキシエチレンエーテル、 ポリォキシェチレンソルビッ ト脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、 ポリグリセリン脂肪酸ェ ステル等が例示できる。 特に、 培地がポリアルキレングリコール、 ポリオキシェ チレン一ポリオキシプロピレン共重合体 （商品名プル口ニック等） 、 またはポリ ォキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル （商品名卜ウイーン等） を含有してい れば好ましい。
界面活性剤の培地中の含有量としては、 0. 5 gZL以下が好ましい。
培地は合成培地、 天然培地のいずれでもよい。 好ましくは合成培地である。 ま た、 固体培地であっても液体培地であってもよいが、 好ましくは液体培地である。 例えば、 合成培地としては、 一般に炭素源として各種糖類、 窒素源として尿素、 アンモニゥム塩、 硝酸塩等、 微量栄養素として各種ビタミ ン、 ヌクレオチド等の 他、 無機塩として Mg、 C a、 F c、 Na、 K、 Mn、 C o、 C u等が例示され る。 YNB液体培地 〔0. 7 %イース トナイ トロジェンのべ一ス （Difco 社製） 、 2 %グルコース〕 等が挙げられる。 また天然培地としては、 YPD液体培地 〔 1 %ィース トエキス トラク ト （Diico社製） 、 2%バク トぺブト ン （Difco 社製） 、 2 %グルコース〕 が例示される。 メタノール資化性宿主を用いる場合は、 メタノ —ル含有培地を用いることができる。 この場合メタノール濃度は好ましくは 0. 0 1〜 5 %程度である。
本発明で用いられる培地は、 従来公知の培地に当該脂肪酸またはその塩、 およ び界面活性剤を添加することによつて簡便に調製することができる。
他の培養条件としては、 一般的な常法に準じた条件が挙げられる。
培養温度としては 1 5。C〜4 0°C、 通常 2 0°C〜3 7 が例示される。 宿主が 酵母の場合は 2 0°C〜3 0 °Cであることが好ましく、 細菌の場合は 3 0°C〜3 7 °Cであることが好ましい。 培養時間は通常 1時間〜 1 0 0 0時間程度が例示され る。
培養は静置または振盪、 攪拌、 通気下に回分 （バッチ） 培養法や半回分 （フエ ッ ドバッチ） 培養法あるいは連続培養法により実施され、 好ましくは、 ファーメ ン夕一を用いたフェツ ドバッチ培養法が用いられる。 例えば、 フヱッ ドバッチ培 養により、 高濃度のグルコースを適度に少量ずつ供給し、 産生菌体に対する高濃 度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法 （特開平 3— 8 3 5 9 5号 公報） 等が挙げられる。
なお、 当該培養に先立って前培養を行うことが好ましい。 前培養の培地として は、 例えば Y N B液体培地や Y P D液体培地が使用される。 また、 前培養の培養 条件としては、 好ましい態様として、 培養時間は 1 0時間〜 1 0 0時間、 温度は 酵母では 3 0 °C程度、 細菌では 3 7 程度が例示される。
かく して培養終了後、 異種蛋白質は培養物から公知の分離、 精製手段により採 取される。 ここで培養物とは、 異種蛋白質産生性宿主を培養することにより得ら れる培養培地、 当該宿主等の異種蛋白質等を含みうるもの全てを意味し、 具体的 には培養上清、 その濾液、 菌体、 細胞等が挙げられる。
以下に実施例によって本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれにより何ら限 定されるものではない。
実施例 1
( 1 ) 使用菌株の調製
変異型 A O X 2プロモータ一 [天然 A O X 2プロモーター （YEAST, 5， 167-17 7 (1988)または Mol. Cell Biol. . 9， 1316-1323 (1989)) 中、 開始コドン上流 2 5 5番目の塩基が Tから Cに変異したもの] を用いて H S A発現用プラスミ ド p MM 0 4 2を構築し、 ピキア ·パストリス （Pichia pastoris) G T S 1 1 5株に 導入し、 形質転換体 U H G 4 2 - 3株を得た （特開平 4 - 2 9 9 8 4号公報） 。
( 2 ) 培地組成
前培養には、 Y P D培地 （ 2 %バク トぺプトン、 1 %ィ一ス トエキス トラク ト、 2 %グルコース） を使用した。 本培養に使用したバッチ培地の組成を表 1に、 フ ィ一ド培地の組成を表 2に示す。 さらに、 表 1および表 2中の * 2の溶液の組成 を表 3に示す。 表 1および表 2に示すように、 本実施例において使用するバッチ 培地およびフィ一ド培地中のォレイン酸の含有量は 0 . とした。 表 1 ：バッチ培地組成 成分 量 （ 1 ZL)
Figure imgf000009_0001
(3) フアーメ ンターを用いた培養方法
①前培養
菌体懸濁液 lml (例えば ODS4Q 1 0程度のもの） を YPD培地 5 0 mlに植 菌し、 3 0°C、 2 4時間振盪培養した。
② 本培養
前培養液 1 4 mlをバッチ培地 7 0 Omlに植菌し、 ミニジャーフアーメンターを 用いて通気攪拌培養した。 培養温度は 2 5 UC、 pHは 5. 8とした。 ポリオキシ アルキレン系界面活性剤であるアデ力ノール L G— 1 0 9 (旭電化工業製） を培 地中に 0. 4 gZLとなるように添加した。
バッチ培養において酵母が十分高密度に増殖し、 培地中のグリセロールが消費 された後、 フィード培地の添加を開始し、 3 6 0時間培養を行って、 HSAを産 生させた。
培養終了後、 培養液をサンプリングし、 下記の参考例に記載した方法にて HS A産生量を測定した。 その結果、 ォレイ ン酸無添加時を 1 0 0 %とすれば、 1 1 4 %であった。
実施例 2
フィ一ド培地中のォレイン酸濃度を 1 W/V%としたこと以外は実施例 1と同様に して培養を行った。 115八産生量は 1 2 5 %であった。
実施例 3
フィード培地中のォレイン酸濃度を 5 W/V¾としたこと以外は実施例 1と同様に して培養を行った。 118 産生量は 1 2 7 %であった。
実施例 4
フィ 一ド培地中の界面活性剤をポリォキシエチレン—ポリォキシプロピレン共 重合体であるプルロニック L— 6 1 (平均分子量 2 0 0 0、 エチレンォキサイ ド ： プロピレンォキサイ ド = 1 0 ： 9 0、 旭電化工業製） としたこと以外は実施例 1と同様にして培養を行った。
参考例 HS A濃度の定量
回収した培養液の一部を遠心分離し、 その上清を清澄濾過後に、 HP L Cによ るゲル濾過分析を行うことにより定量した。 本発明によれば、 異種蛋白質産生性宿主が産生する異種蛋白質の産生量を増大 させることができると共に、 異種蛋白質が、 宿主自身が分泌する酵素によって分 解されることを抑制することができるため、 異種蛋白質の採取量を増大させるこ とができる。 本発明は、 脂肪酸またはその塩、 および界面活性剤を添加した培地 で異種蛋白質産生性宿主を培養すればよく、 簡易な方法によって実施することが できる。 本出願は日本で出願された平成 9年特許願第 8 5 0 6 4号を基礎としておりそ れらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
1. 遺伝子操作により調製された異種蛋白質産生性宿主を脂肪酸またはその塩、 および界面活性剤を含有する培地で培養し、 培養物から異種蛋白質を採取するこ とを特徴とする異種蛋白質の製造方法。
2. 脂肪酸の炭素数が 1 0~2 6である請求の範囲 1記載の異種蛋白質の製造方 法。
3. 培地が脂肪酸またはその塩を 0. 0 1〜 1 0W/V¾の濃度で含有する請求の範 囲 1記載の異種蛋白質の製造方法。
4. 界面活性剤が分子量] 0 0〜 1 0万の非イオン性界面活性剤である請求の範 囲 1記載の異種蛋白質の製造方法。
5. 培地が界面活性剤を 0. 5 gZL以下の濃度で含有する請求の範囲 1記載の 異種蛋白質の製造方法。
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