WO1998033514A1 - Composition lyophilisee de mp52 humaine de proteines morphogenetiques osseuses - Google Patents

Description

明 細 書

骨誘導因子ヒ ト MP52凍結乾燥組成物

技術分野

本発明は、 骨誘導因子ヒト MP52凍結乾燥組成物およびその製法に関する。 さらに詳しくは、 本発明は骨誘導因子ヒト MP52とマンニトールとの混合物 からなる骨誘導因子ヒト MP52凍結乾燥組成物およびその製法に関する。 背景技術

骨誘導因子ヒ ト MP52は TGF—；8スーパ一ファミ リーに属する骨形成関連 因子として 1994年にその cDNAが初めて単離された（Biochem. Biophy. Res. Comm. , Vol. 204, No. 2, 1994) 。 続いて遺伝子組換え技術により骨誘導活 性を失うことなく骨誘導因子ヒ ト MP52が得られた （W096Z33215) 。 骨誘 導因子ヒ ト MP52は凍結乾燥して保存されるが、 保存中にその体積が減少 (萎縮）し、 再溶解時に粉末が凝集するという問題がある。

このような問題を解決するために、 同じ TGF— /3スーパーファミ リ一に 属する蛋白質であり、 骨誘導因子ヒ ト MP52に最も近い性質を有するといわ れる BMP— 2においては、 添加物としてアミノ酸、 糖類または多価アルコ —ルが用いられている （特表平 6—508777) 。 そこで本発明者らは、 これ らの添加剤の骨誘導因子ヒト MP52への適用を試みたが上記問題を解決する ことはできなかった。 即ち、 ァラニン、 ノくリン、 リジン等の中性または塩 基性ァミノ酸 0. 5〜2. 5%を骨誘導因子ヒト MP52に添加して凍結乾燥しても、 再溶解時に凝集が認められた。 蔗糖、 デキス トラン等の糖類 0. 5〜1 %を 同様に添加し凍結乾燥すると、 凍結乾燥品に淡黄緑色の着色および萎縮が 認められ、 また、 多価アルコールであるソルビトール 0. 5〜1 %を同様に 添加し凍結乾燥すると、 凍結乾燥中に骨誘導因子ヒト MP52が溶解し、 凍結 乾燥品とすることができなかった。

発明の開示

本発明者らは、 上記問題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、 骨誘導 因子ヒト MP52にマンニトールを添加して凍結乾燥すると、 凍結乾燥品の保 存中における着色や萎縮が認められず、 再溶解時における凝集がないこと を見出し、 本発明を完成するに至った。

本発明は、 骨誘導因子ヒ ト MP52とマンニトールとの混合物からなる骨誘 導因子ヒ ト MP52凍結乾燥組成物よりなる。 本発明の骨誘導因子ヒト MP52と しては、 W096Z33215で開示されている遺伝子工学的方法により製造され た骨誘導因子ヒ ト MP52 (以下 rhMP52ということもある） が好適に使用され る。 マンニトールとしては日本薬局方に D—マンニトールとして規定され ているものが好適に使用される。 骨誘導因子ヒ ト MP52とマンニトールとの 混合比は 1 ： 5〜50 (重量比） が好ましい。

本発明の組成物は、 骨誘導因子ヒ ト MP52とマンニトールとの混合物溶液 を常法にしたがって凍結乾燥することにより容易に製造される。 詳しくは、 骨誘導因子ヒト MP52精製物の塩酸溶液に所定量のマンニトールを加えて混 合し、 得られた混合物溶液を濾過した後、 無菌バイアルに充填し、 凍結乾 燥することにより本発明の組成物が得られる。

本発明の組成物は、 これを用時注射用蒸留水又は弱酸 （pH 3付近） 、 例 えば塩酸溶液やクェン酸緩衝液等で溶解し治療上有効な量が患者に投与さ れる。

本発明の組成物のマンニトールの好ましい配合量は安定性試験により決 定した。 安定性試験は日本薬局方第 13局に従って作成した標準操作手順書 の方法に従って行われ、 試験開始時および 3ヶ月後の外観の性状、 溶状、 電気泳動、 水分含量及び 6ヶ月保存後の異所性骨形成能を測定することに より行われた。

その結果、 試験開始時および 3ヶ月後外観において性状および溶状に変 化はみられなかった。 また、 電気泳動の結果および水分含量の結果から、 マンニトールを前記の重量比で含有する製剤はいずれも試験開始時と 3ケ 月後の比較において安定であった。 凍結乾燥品の水分含量は一般的に 2 %以下が好ましいとされている。 以 上のことから骨誘導因子ヒト MP52、 l mg当たりマンニトールを 5〜50mg、 望ましくは 10mg含有する骨誘導因子ヒ ト MP52組成物が医薬品原体として好 ましいと判断された。

さらに、 マンニトールを 10、 25、 50mg添加した骨誘導因子ヒ ト MP52凍結 乾燥組成物を 6ヶ月保存した後の異所性骨形成能について測定した。 その 結果、 保存温度及びマンニトール添加量に拘わらずいずれも骨形成が認め られた。 これらの試験結果から骨誘導因子ヒト MP52にマンニトールを配合 して凍結乾燥した場合、 骨誘導因子ヒ ト MP52には何らの悪影響を与えず、 長期間にわたり安定であることが確認された。

発明を実施するための最良の形態

次に、 実施例を示して本発明の効果を具体的に説明する。

実施例 1 rhMP52組成物の調製

W096Z33215で開示されている製造方法により得られた rhMP52精製物 10 mM塩酸溶液 l mgZmlに日本薬局方の D—マンニトール 10、 25及び 50ragを加 えて混合し、 混合物を濾過 （0. 22 ;/ πιメンブランフィルタ一使用） 後、 濾 液を無菌的に 1 mlずつバイアルに充填した。 それらを凍結乾燥して医薬品 原体形態の本発明の組成物を調製した。

実施例 2 rhMP52組成物の安定性試験

実施例 1で得られた rhMP52凍結乾燥組成物をバイアル瓶 （気密、 透明） 容器に詰め、 2〜8 °C、 25°C及び 40°C下にそれぞれ保存した。 安定性の判 定は、 下記判定基準に基づいて 3ヶ月間それぞれ保存後に評価した。 判定 基準は下記のとおりである。

性 状：

(外観）：試験時と同じく、 白色のケーキであり、 着色のみられないも のを 「変化なし」 と判定した。

(溶状）：注射用蒸留水 l mlにとかした溶液が、 無色澄明であり、 凝集 が認められないものを 「変化なし」 と判定した。

電気泳動：赤色フィルムを用いた透過によるフィルムスキャナーで画像 を取り込み、 各バンドのィンテグレーシヨン ·ォプチカル · デンシティ (Integration Optical Density： IOD) %を求め、 面積百分率により主バンドの純度を算出した。

水分含量：微量水分計を用いてその水分含量を測定した。

結果は性状として、 本発明の組成物は外観および溶状は変化なしであつ たが、 rhMP52単独の凍結乾燥品では凝集が見られた。 電気泳動における安 定性（％)の結果はいずれも良好であった。

水分含有率（％)の結果を表 1に示す。 表 1は水分含有率にはいずれも大 きな変化がないことを示している。 本発明組成物は rhMP52単独品に比較し て製造時および保存後の水分含有率が低く、 萎縮がおこりにくいことを示 している。

3 ケ 月 後

試験開始時 2〜8。C 25°C 40°C rhMP52単独 9.7 9.2 7.6 7.8

マンニトール 10mg 1.6 1.6 1.4 1.2

" 25mg 0.9 0.7 0.6 0.5

〃 50mg 0.6 0.5 0.4 0.4 実施例 3 rhMP52の異所性骨形成能

実施例 1で得られた rhMP52組成物 1バイアル （lmgZバイアル） を 4°C および 25°Cでそれぞれ 6ヶ月保存後、 これらに注射用蒸留水 lmlを加えて 投与液を調製し、 これらを ICRマウス （日本クレア（株）より購入） に 20//g ノ20 1筋注し、 2週間後に骨形成の有無を钦 X線撮影で観察した （n = 2) 。 その結果を表 2に示す。

2

4 °C 25°C

r h M P 52単独 骨形成有り 骨形成有り

マンニトール 10mg 骨形成有り 骨形成有り

" 25mg 骨形成有り 骨形成有り

" 50mg 骨形成有り 骨形成有り 産業上の利用可能性

骨誘導因子ヒ ト MP52は凍結乾燥品が保存時に着色あるいは萎縮し、 また 再溶解時に凝集するという問題がある。 しかるに本発明の凍結乾燥組成物 においては、 上記の問題点はみられない。 本発明の凍結乾燥組成物中の骨 誘導因子ヒ ト MP52は、 長期保存しても安定であり、 純度、 水分含有率、 異 所性骨形成能においてほとんど変化はみられない。 従って、 本発明は医薬 製造分野において利用可能である。

Claims

請 求 の 範 囲

. 骨誘導因子ヒト MP52とマンニトールとの混合物からなる骨誘導因子ヒ ト MP52凍結乾燥組成物。

. 前記骨誘導因子ヒト MP52とマンニトールの混合比が 1 ： 5〜50 (重量 比） である請求項 1に記載の凍結乾燥組成物。

. 前記骨誘導因子ヒト MP52が遺伝子工学的方法により産生されたもので ある請求項 1または 2に記載の凍結乾燥組成物。

. 骨誘導因子ヒト MP52精製物溶液にマンニトールを加え、 得られた混合 物溶液を凍結乾燥することからなる骨誘導因子ヒ ト MP52凍結乾燥組成物 の製造方法。

. 前記骨誘導因子ヒ ト MP52とマンニトールの混合比が 1 ： 5〜50 (重量 比） である請求項 4に記載の凍結乾燥組成物の製造方法。

. 前記骨誘導因子ヒ ト MP52が遺伝子工学的方法により産生されたもので ある請求項 4または 5に記載の凍結乾燥組成物の製造方法。