JP3792487B2 - レシチン化スーパーオキシドジスムターゼ含有医薬組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レシチン化スーパーオキシドジスムターゼ（以下、単にＰＣ−ＳＯＤともいう）及びシュークロースを含有する医薬組成物、およびこれからなる疾患の処置剤に関する。また本発明は、シュークロースを有効成分とするＰＣ−ＳＯＤの活性低下等を抑制するための剤及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明に最も近い先行技術について説明する。
（ａ）特開平９−１１７２７９号公報には、本発明において用いることができるＰＣ−ＳＯＤおよびこれを有効成分として含む医薬について記載されている。
（ｂ）特開平３−１７０４３８号公報には、レシチン化生物活性蛋白を含む経口及び局所投与用生物活性蛋白組成物が記載されている。また生物活性蛋白の例示としてスーパーオキシドジスムターゼ（以下、単にＳＯＤともいう）が記載されており、また添加物として砂糖が例示されている。
【０００３】
しかしながらこれらの先行技術には、ＰＣ−ＳＯＤ及びシュークロースを含有する医薬組成物の特定の組み合わせについては記載されていない。またＰＣ−ＳＯＤの長期間保存による活性の低下、凍結乾燥した場合の性状、カラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現の問題については解決されていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下が少なく（すなわち安定性が高く）、凍結乾燥した場合の性状が良好で、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現が抑制されたＰＣ−ＳＯＤを含有する医薬組成物を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、ＰＣ−ＳＯＤを有効成分とする医薬組成物について鋭意検討を行った結果、シュークロースが、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し（安定性を保持させ）、凍結乾燥した場合の性状を良好に保ち、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制する作用を有することを見い出し、これにより上記課題を解決しうる医薬組成物が提供できることを見い出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、下記一般式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤ及びシュークロースを含有することを特徴とする医薬組成物（以下、本発明医薬組成物という）を提供する。
ＳＯＤ’（Ｑ−Ｂ）m （Ｉ）
（式中、ＳＯＤ’はスーパーオキシドジスムターゼの残基を表し、Ｑは化学的架橋を表し、Ｂはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンのその水酸基の水素原子を除いた残基を表し、ｍはスーパーオキシドジスムターゼ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数であって、１以上の正数を表す）
また本発明は、本発明医薬組成物からなる、疾患の処置剤（以下、本発明処置剤ともいう）を提供する。
【０００７】
本発明医薬組成物は、好ましくは下記の性質を有する。
(a)性状：この医薬組成物を凍結乾燥したものに注射用水（注射用蒸留水）を添加すると溶解し、不溶性異物は認められない。
(b)安定性：この医薬組成物を凍結乾燥した直後における単位重量あたりのスーパーオキシドジスムターゼ活性を１００とした場合、凍結乾燥した組成物を８℃で１２ヶ月、２５℃で１２ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存した時点における該活性の相対値が、いずれも９７％以上である。
【０００８】
(c)ゲル濾過クロマトグラフィーにおける類縁物質ピーク：凍結乾燥した組成物を再溶解し、ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、溶出液の２２０ｎｍの吸光度を測定した場合、当該吸光度の検出チャートにおけるレシチン化スーパーオキシドジスムターゼのピークの形状と、凍結乾燥前のレシチン化スーパーオキシドジスムターゼの当該ピークの形状との間に、実質的な差が認められない。
【０００９】
(d)逆相クロマトグラフィーにおける類縁物質ピーク：凍結乾燥した組成物を８℃で１２ヶ月、２５℃で１２ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存した時点で再溶解し、逆相クロマトグラフィーにかけ、溶出液の２２０ｎｍ及び２７０ｎｍの吸光度を測定した場合、検出される類縁物質の量が、いずれも凍結乾燥した直後におけるものと実質的に変化しない。
【００１０】
本明細書で「溶解」とは、溶質（医薬組成物を凍結乾燥したもの）と溶媒（注射用水）が混合して、肉眼で観察して澄明な溶液が生じることをいう。「溶解」するか否かは、室温（１℃〜３０℃）下において、溶質に溶媒（注射用水）を添加して緩やかに振とうし、１０秒以内に溶解するか否かで判断することが好ましい。
【００１１】
さらに本発明医薬組成物は、その凍結乾燥物を、８℃で３６ヶ月、２５℃で３６ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存したいずれの時点においても上記(a)〜(d)に記載の全性質を維持しているものであることが好ましい。
【００１２】
また本発明は、シュークロースを有効成分とする剤であって、上記一般式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤと共存させることにより該ＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し、または、該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制するための剤（以下、本発明抑制剤ともいう）を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、上記一般式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤにシュークロースを共存させることにより該ＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し、または、該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制する方法（以下、本発明抑制方法ともいう）を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
【００１５】
＜１＞本発明医薬組成物
(1)本発明医薬組成物に用いるＰＣ−ＳＯＤ
本明細書における「レシチン」とは、フォスファチジルコリンを意味する通常のレシチンをいい、「リゾレシチン」とは、レシチンのグリセロールの２位に結合した脂肪酸１分子がとれて、２位の炭素原子に水酸基が結合した化合物をいう。
【００１６】
本発明医薬組成物に含有されるＰＣ−ＳＯＤは、通常、リゾレシチンの２位の水酸基に化学的架橋剤を結合させたレシチン誘導体を、ＳＯＤに１個以上結合させて得ることができる。このＰＣ−ＳＯＤは次式（Ｉ）で示される。
ＳＯＤ’（Ｑ−Ｂ）m （Ｉ）
上記一般式（Ｉ）中、ＳＯＤ’はスーパーオキシドジスムターゼの残基を表す。
【００１７】
前記式（Ｉ）中のＳＯＤ’は、生体内の活性酸素Ｏ2 -の分解というその本来の機能を発揮し得る限りにおいて、その起源等は特に限定されるものではなく、各種の動植物又は微生物に由来するＳＯＤの残基を広く用いることが可能である。しかしながら、医薬品用途のＳＯＤとしては、生体内での抗原性を可能な限り減じることが好ましいことを考慮すれば、本発明医薬組成物を投与する動物種に応じて、適宜適切なＳＯＤを選択することが好ましい。例えば、最も本発明医薬組成物が必要とされると考えられるヒトを対象とする場合には、ＳＯＤとしてヒト体内における抗原性を可能な限り減ずるべく、ヒト由来のＳＯＤを用いることが好ましい。そしてその中でも、ヒト由来のＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（活性中心に銅と亜鉛を含むヒト由来のＳＯＤ；以下、ヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤと略記することもある）が、細胞内における発現量が多く、また遺伝子工学的手法による生産技術が確立しており、大量に調製することが可能であるため、特に好ましい。
【００１８】
このヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤには、ヒト組織から製造される天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ；遺伝子工学的手法により製造されるヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ；天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤと実質上同一のアミノ酸配列を有する組換えヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ、これらのヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤのアミノ酸配列中の一部のアミノ酸を化学的に修飾もしくは改変したＳＯＤ等があり、いずれのヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤであってもよい。
【００１９】
参考のため、この天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤのタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。なお、実際のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤは、このアミノ酸配列を有するタンパク質が二量体（ダイマー）となっている。
【００２０】
このタンパク質におけるアミノ酸配列に示すごとく、天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの１１１位のアミノ酸はシステインであるが、蛋白工学的手法、例えば部位特異的変異法により、この１１１位をセリンに変換したヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（特開昭62-130684号公報）や、化学的にこの１１１位のシステインを修飾したヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（特開平6-199895号公報）も報告されており、これらのヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤを素材として、本発明におけるＰＣ−ＳＯＤを得ることができる。そして、これらのヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤのうちでも、電荷的及び分子量的に均一であり、かつＳＯＤ活性が安定している、１１１位のシステインを化学的に修飾した、例えばこのシステインをＳ−（２−ヒドロキシエチルチオシステイン）とした、ヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤを素材として、本発明におけるＰＣ−ＳＯＤを得るのが好ましい。
【００２１】
なお本明細書においては、このようにヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤにおいて部位特異的変異法等により一部アミノ酸を変換したものや、ヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの一部のアミノ酸を化学的に修飾して得られるものも含めて、単にヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤという。
【００２２】
また、前記式（Ｉ）中のＢで示される「グリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンの、その水酸基の水素原子を除いた残基」は、次式(II)で表される。
【００２３】
-O-CH(CH2OR)[CH2OP(O)(O-)(OCH2CH2N+(CH3)3)] （II）
（式中、Ｒは脂肪酸残基（アシル基）である）
Ｒは、炭素数１０〜２８の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が好ましく、より好ましくはミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、イコサノイル基、ドコサノイル基、その他炭素数が１４〜２２の飽和脂肪酸残基であり、特に好ましくは炭素数１６の飽和脂肪酸残基であるパルミトイル基である。
【００２４】
また前記式（Ｉ）中のＱは化学的架橋を表す。化学的架橋は、ＳＯＤとレシチンとを架橋して化学的に結合（共有結合）させ得るものであれば特に限定されない。化学的架橋としては、残基−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−Ｃ（Ｏ）−が例示され、かつ好ましい。この残基は、 式ＨＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−Ｃ（Ｏ）−ＯＨで表される直鎖状ジカルボン酸の両端の水酸基を除いた残基、もしくは、このジカルボン酸の無水物、このジカルボン酸のエステル、このジカルボン酸のハロゲン化物、又はその他のこのジカルボン酸の反応性誘導体等の両端における水酸基に対応する部分を除いた残基であるものが好ましい。前記式（Ｉ）中のＱが上記直鎖状ジカルボン酸の残基である場合、Ｑの一端とＢとは、エステル結合で連結している。また、この場合、このＱの他端は、ＳＯＤのアミノ基とアミド結合などにより直接結合していると考えられる。この場合、ＳＯＤ’は、ＳＯＤの結合に関与するアミノ基から水素原子を１つ除いた残基を示す。なお前記の化学的架橋において、基−（ＣＨ2）n−におけるｎは２以上の整数であり、好ましくは２〜１０の整数であり、特に好ましくは３である。
【００２５】
また前記式（Ｉ）中のｍは、ＳＯＤ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数を表している。ｍは１以上の正数であり、１〜１２の正数が好ましく、４が特に好ましい。
【００２６】
ＰＣ−ＳＯＤの製造において、レシチン誘導体のＳＯＤへの結合は、公知の方法、例えば特開平６−５４６８１号公報に記載された方法に従って行うことが可能である。このＰＣ−ＳＯＤの製造過程は、実施例中に記載する。
【００２７】
本発明医薬組成物に用いるＰＣ−ＳＯＤは、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものであることが好ましい。
【００２８】
例えばＰＣ−ＳＯＤは、2,500 U/mg(ＰＣ−ＳＯＤ)以上の比活性を有する精製されたものを用いるのが好ましく、3,000 U/mg(ＰＣ−ＳＯＤ)以上の比活性を有する精製されたものがより好ましい。なお、本明細書において１U(ユニット)とは、pH7.8、30℃の条件下でＮＢＴ(ニトロブルーテトラゾリウム)を用いてJ.Biol.Chem. Vol.244, No.22, 6049-6055(1969)に準じた方法により測定し、ＮＢＴの還元速度を５０％阻害するＰＣ−ＳＯＤの酵素量を表す。
【００２９】
(2)本発明医薬組成物に用いるシュークロース
本発明医薬組成物に用いるシュークロースは、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものであり、活性炭で処理されたシュークロースが好ましい。活性炭による処理は、シュークロースを水溶液とし、これと活性炭とを接触させることにより行うことができる。このような活性炭処理により、たとえばシュークロース中のエンドトキシン濃度を低減させることができ、類縁物質ピークの出現をさらに抑制でき、かつ安定性をさらに向上させうる。
【００３０】
本発明医薬組成物に用いるシュークロース中のエンドトキシン濃度は、0.25 EU/mg以下が好ましく、検出限界(0.006 EU/ml)以下がより好ましい。
【００３１】
なおシュークロース中のエンドトキシン濃度は、公知のエンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。リムルス試験法に用いるリムルス試薬としては、エンドトキシン特異的リムルス試薬を用いることが好ましい。リムルス試薬としては、例えば次に挙げる市販のリムルス試薬を用いることができる；トキシカラーシステムＬＳ−６，ＬＳ−２０，ＬＳ−５０Ｍ、エンドスペシーＥＳ−６，エンドスペシーＥＳ−２００（生化学工業株式会社）。
【００３２】
(3)本発明医薬組成物
本発明の医薬組成物は、ＰＣ−ＳＯＤとシュークロースを含む。該組成物は(1)で説明したＰＣ−ＳＯＤと、(2)で説明したシュークロースを配合することにより得るのが好ましい。これにより、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下が少なく（安定性が高く）、凍結乾燥した場合の性状が良好で、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の時に類縁物質ピークの出現が抑制された本発明医薬組成物を得ることができる。
【００３３】
本発明医薬組成物中のＰＣ−ＳＯＤとシュークロースの配合比率は、投与量、本発明医薬組成物の形態等に応じて当業者が適宜決定でき、特に限定されないが、「ＰＣ−ＳＯＤ／シュークロース」の重量比として0.1/100〜80/100程度が好ましく、0.4/100〜60/100程度がより好ましい。
【００３４】
また本発明医薬組成物は、その脂肪酸含量が、０．１３〜０．１５μｍｏｌ／ｍｇ蛋白であることが好ましい。脂肪酸含量は、例えば（株）ワイエムシイ社製「長鎖、短鎖脂肪酸分析キット」を用いて測定することができる。
【００３５】
なお本発明医薬組成物には、ＰＣ−ＳＯＤの酵素活性に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等、通常医薬に用いられる成分を添加することができる。このような成分としては、生理学上許容され、医薬として使用できる程度の純度であり、かつ医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものを使用できる。
【００３６】
本発明医薬組成物の製造は、ＰＣ−ＳＯＤ及びシュークロースを用い、製剤学的に公知の方法を用いて行なうことができる。なお本発明医薬組成物は、溶液状、凍結状、または凍結乾燥状の形態が好ましい。なお溶液状の形態としては、以下の(1)および(2)の態様も包含される。
(1)凍結状態とした場合の本発明医薬組成物における、凍結前および融解後における溶液状態。
(2)凍結乾燥状態とした場合の本発明医薬組成物における、凍結乾燥前および溶媒添加による再溶解後の溶液状態。
【００３７】
これらの中で、本発明医薬組成物の形態は凍結乾燥状の形態とするのが好ましい。すなわち本発明医薬組成物は凍結乾燥医薬組成物であることが好ましい。
【００３８】
凍結乾燥は、公知の凍結乾燥手法に従って、当業者が適宜条件等を設定して行うことができる。例えば市販の凍結乾燥機を用い、以下のステップ(1)〜(5)の順に実行されるよう設定して行うことができる。なお（ ）内は、各段階に要する時間を示した。
【００３９】
(1)冷却する。例えば、室温から−４０℃〜−５０℃まで冷却する（0.3〜1.5時間程度）。
【００４０】
(2)真空状態を維持しながら冷却状態を維持する。例えば、−４０℃〜−５０℃を維持する（１２時間以上）。
【００４１】
(3)真空状態を維持しながら冷却状態から室温まで戻す。例えば、−４０℃〜−５０℃から室温まで戻す（３〜15時間程度）。
【００４２】
(4)真空状態を維持しながら室温を維持する（例えば３〜20時間程度）。
【００４３】
(5)復圧する。
【００４４】
ステップ(1)〜(5)からなる凍結乾燥医薬組成物の製造においては、上記のステップ(2)に要する時間を工夫するのが好ましく、該時間が、１２時間以上であることが好ましい。
【００４５】
凍結乾燥医薬組成物としては、その性質が下記(a)〜(d)の全ての条件を満たすものが特に好ましい。
【００４６】
(a)性状：凍結乾燥医薬組成物を肉眼で観察した場合、凍結乾燥組成物のケーキの形状が錠剤状であり、かつ凍結乾燥組成物に注射用水を添加した場合、速やかに溶解し、かつ不溶性異物を認めない（凍結乾燥医薬組成物の性状が良好に保持されている）。通常、注射用水に１０秒以内に溶解する。
【００４７】
(b)安定性：凍結乾燥直後の単位重量あたりの酵素活性を１００(％)とした場合、凍結乾燥組成物を８℃で１２ヶ月、２５℃で１２ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存した時の酵素活性の相対値(％)が９７％以上、好ましくは９９％以上である。この安定性は、後述する実施例１中の「(1-2-2)安定性試験」に記載された方法で測定できる。
【００４８】
(c)ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピーク：２２０ｎｍの吸光度を測定した場合、当該吸光度の検出チャートにおけるＰＣ−ＳＯＤ(凍結乾燥医薬組成物)のピークの形状と、凍結乾燥前のＰＣ−ＳＯＤの当該ピークの形状との間に、実質的な差が認められない。該クロマトグラフィーは、後述する実施例１中の「(1-2-3-1)ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験」に記載された方法で測定するのが好ましい。
【００４９】
(d)逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピーク：凍結乾燥組成物を８℃で１２ヶ月、２５℃で１２ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存した時における、２２０ｎｍ及び２７０ｎｍの吸光度の測定により検出される類縁物質の量が、凍結乾燥直後と実質的に変化しない。該クロマトグラフィーは、後述する実施例１中の「(1-2-3-2)逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験」に記載された方法で測定するのが好ましい。
【００５０】
さらに本発明医薬組成物は、その凍結乾燥物を、８℃で３６ヶ月、２５℃で３６ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存したいずれの時点においても上記(a)〜(d)に記載の全性質を維持しているものであることが好ましい。
【００５１】
本発明にいう類縁物質は、主としてレシチンが種々の部分で切断されて生成した種々の物質からなり、遊離脂肪酸等が含まれる。これらの類縁物質はＰＣ−ＳＯＤに結合していたレシチンが切断されて生成するものと考えられ、ＰＣ−ＳＯＤに結合していたレシチンが多量に切断されると、ＰＣ−ＳＯＤとしての機能が減じられ、またそのような類縁物質が多量に含まれるとその医薬品としての品質、規格等の管理上好ましくない。
【００５２】
本発明医薬組成物、さらには該組成物を種々の形態にしたものは、そのまま医薬品として投与するための最終剤形として用いうるが、他の剤形の医薬品、例えば、液剤、凍結乾燥剤等の原料として使用することもできる。
【００５３】
本発明医薬組成物は、ＰＣ−ＳＯＤを有効成分とする注射用製剤として使用するのが好ましい。例えば、本発明医薬組成物を溶液状態の注射用製剤として提供する場合、前記の方法で製造される溶液状態の本発明医薬組成物を、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存し、注射剤として投与に供することができる。
【００５４】
本発明医薬組成物を凍結状態の注射用製剤として提供する場合、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に、凍結状態の本発明医薬組成物を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に融解させて注射剤として投与に供することができる。
【００５５】
また、本発明医薬組成物を凍結乾燥状態の注射用製剤として提供する場合、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に前記の方法で製造される凍結乾燥状態の本発明医薬組成物を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に注射用蒸留水で溶解し、注射剤として投与に供することができる。凍結乾燥状態の本発明医薬組成物は、溶解用の溶媒とセットで提供してもよい。
【００５６】
注射用製剤としては、凍結乾燥状態のものが好ましい。すなわち、本発明医薬組成物は注射用凍結乾燥組成物の形態であることが特に好ましい。
＜２＞本発明処置剤
本発明処置剤は、本発明医薬組成物からなる疾患の処置剤である。また本発明処置剤は、各種疾患の治療剤、予防剤、悪化防止剤、改善剤等の概念をも包含する。本発明処置剤の構成成分として用いるＰＣ−ＳＯＤ、シュークロース、これらの配合量、含有させてもよい他の成分、剤型等は、上記の本発明医薬組成物と全く同じ態様が採用できる。
【００５７】
本発明処置剤を適用できる疾患は、ＰＣ−ＳＯＤの作用によって処置（治療、予防、維持(悪化防止)、軽減(症状の改善)等）が可能な疾患である限りにおいて特に限定されない。
【００５８】
ＰＣ−ＳＯＤの作用によって処置が可能な疾患としては、過剰な活性酸素に起因する疾患が挙げられるが、より具体的には運動ニューロン疾患（例えば筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄性進行性筋萎縮症、家族性痙性麻痺、シャルコー・マリー足、進行性球麻痺、若年性一側上肢筋萎縮症（平山病）等）、虚血再灌流障害、急性腎不全（腎前性急性腎不全、腎性急性腎不全、腎後性急性腎不全等）、ループス腎炎（正常糸球体におけるループス腎炎、メサンギウム増殖性変化を伴うループス腎炎、巣状分節状糸球体腎炎、びまん性増殖性糸球体腎炎、びまん性膜性糸球体腎炎、末期硬化性糸球体腎炎等）、脳血管障害（脳出血、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳血栓、脳塞栓、一過性脳虚血発作、高血圧性脳症等）に伴う機能障害（発語障害、麻痺による運動機能障害、視覚障害、聴覚障害、嗅覚障害、味覚障害等の感覚障害、痴呆等）、間質性肺炎、線維症（肺線維症等）、潰瘍性胃腸障害（潰瘍性大腸炎、クローン病等）、関節炎、熱傷等が挙げられ、これらのなかでも運動ニューロン疾患（特にＡＬＳ）や潰瘍性胃腸障害（特に潰瘍性大腸炎やクローン病）が好ましい適用疾患である。また線維症（特に肺線維症）、間質性肺炎も好ましい適用疾患である。
【００５９】
本発明処置剤は、含有するＰＣ−ＳＯＤの働きで、これらの疾患並びにこれら疾患に伴う症状に対して改善作用を有する。なお、ここに挙げた疾患名は例示であり、かかる例示疾患に本発明処置剤の適用範囲は限定されない。
【００６０】
本発明においては、対象となる疾患の性質や進行段階に応じて、後述する剤形を本発明処置剤の剤形として適宜選択することが好ましい。
【００６１】
本発明処置剤は、注射（筋肉内、皮下、皮内、静脈内等）、経口、吸入等の投与方法によって、経口あるいは非経口的に投与することができ、投与方法に応じ適宜製剤化することができる。剤形としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、坐剤等が挙げられるが、注射剤が好ましく、静脈内投与用の注射剤とすることがより好ましい。
【００６２】
本発明処置剤中の有効成分（ＰＣ−ＳＯＤ）の量および当該処置剤の投与量は、製剤調製の方法、剤形、疾患の種類、当該処置剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状（疾患の程度）、患者の体重等によって個別的であり特に限定されないが、例えば、臨床量として成人１人１日当り 0.5〜100mg（1500〜300000Ｕ）を例示することができる。また、上記製剤の投与間隔は１日１回程度でも可能であり、３〜４回に分けて投与することも可能である。
【００６３】
また本発明処置剤は、前記の疾患を発症しうる脊椎動物、特に哺乳動物に投与する処置剤とすることができるが、ヒトの処置剤とすることが好ましい。
【００６４】
＜３＞本発明抑制剤及び本発明抑制方法
上記の通り、ＰＣ−ＳＯＤにシュークロースを共存させることにより該ＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し、または、該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制することができる。
従って本発明抑制剤は、シュークロースを有効成分とする剤であって、前記一般式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤと共存させることにより該ＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し、または、該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制するための剤である。好ましくは、前記ＰＣ−ＳＯＤの活性低下の抑制、および該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現の抑制の両方の目的のために使用される剤である。
【００６５】
なお本発明抑制剤は、凍結乾燥医薬組成物の調製の際にＰＣ−ＳＯＤと共存させると、上記の抑制効果に加えてさらに凍結乾燥医薬組成物の性状を良好に保持させるという効果を発揮する。従って本発明抑制剤は、特に、前記ＰＣ−ＳＯＤを含有する凍結乾燥医薬組成物を調製する際に前記ＰＣ−ＳＯＤと共存させて用いることが好ましい。
【００６６】
また本発明抑制方法は、上記一般式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤにシュークロースを共存させることにより該ＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し、または、該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制する方法である。好ましくは、本発明抑制方法は、前記ＰＣ−ＳＯＤの活性低下の抑制、および該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現の抑制の両方の目的のために使用される。
【００６７】
本発明抑制剤の有効成分として用いるシュークロース、また本発明抑制方法に用いられるシュークロース、及びそのＰＣ−ＳＯＤへの添加量等は、前記＜１＞に記載したものと同様である。
【００６８】
またＰＣ−ＳＯＤの活性低下抑制、カラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現抑制、また凍結乾燥医薬組成物の調製に用いた場合における凍結乾燥医薬組成物の性状の良好な保持は、後述の実施例に記載された方法で確認することができる。
【００６９】
【実施例】
以下に、本発明を製造例及び実施例により具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００７０】
〔製造例〕
＜１＞ヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの調製
該ＳＯＤは、特開平6-199895号公報に記載された方法で調製したものを用いた。このヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの111 位のアミノ酸はＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システインとなっている。
【００７１】
＜２＞ＰＣ−ＳＯＤの調製
ＰＣ−ＳＯＤは、特開平6-54681号公報に記載された方法によって、２−（４−ヒドロキシカルボニルブチロイル）リゾレシチンの活性エステル体を調製し、これと上記＜１＞のＳＯＤとを反応させることによって調製した。精製・濃縮後、蛋白質濃度をローリー法(Lowry, O.h.ら、J. Biol. Chem., 193 巻, 265 頁 (1951年))、ＳＯＤの残存アミノ基をＴＮＢＳ法（トリニトロベンゼンスルホン酸塩、Goodwin, J. F.ら、Clin. Chem., 16 巻, 24頁 (1970年))で分析することにより、ＳＯＤ１分子あたりのレシチン誘導体の結合数を求めたところ、平均４．０個であった。このＰＣ−ＳＯＤの水溶液は青緑色〜緑色を呈し、ｐＨは７〜８であった。また、分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により調べたところ、ＰＣ−ＳＯＤサブユニットのモノマー（ＰＣ−ＳＯＤはサブユニットのホモダイマーである）あたり約１８０００であった。
【００７２】
〔実施例１〕
本実施例において「ＰＥＧ４０００」とは、ポリエチレングリコール（平均分子量４０００）をいう。
【００７３】
(1)以下、本実施例で用いた方法をまとめて説明する。
(1-1)凍結乾燥
凍結乾燥機（モデルNo.RL402BS；共和真空製）を用いて溶液組成物を凍結乾燥した。なお凍結乾燥のプログラムは、下記表１のステップ(1)〜(5)の順に実行されるよう設定した。
【００７４】
【表１】
【００７５】
(1-2)各種試験方法
(1-2-1)性状試験
凍結乾燥された組成物について、以下の方法で組成物の性状を調べた。
【００７６】
肉眼で観察して、凍結乾燥組成物のケーキの形状が錠剤状であり、かつ凍結乾燥組成物に注射用水を添加した際、１０秒以内に溶解し、かつ不溶性異物を認めなかったものを「○」、凍結乾燥組成物のケーキの形状が錠剤状でなかったもの、又は凍結乾燥組成物に注射用水を添加した際、１０秒以内に溶解しなかったかもしくは不溶性異物を認めたものを「×」として評価した。
【００７７】
(1-2-2)安定性試験
凍結乾燥された組成物について、以下の方法で組成物中のＰＣ−ＳＯＤの酵素活性を測定した。
【００７８】
凍結乾燥組成物に注射用水を添加して再溶解した溶液を用い、pH7.8、30℃の条件下でＮＢＴ(ニトロブルーテトラゾリウム)を用いてJ.Biol.Chem. Vol.244, No.22, 6049-6055(1969)に準じた方法により測定し、ＮＢＴの還元速度を５０％阻害する酵素量を１Uとして求めた。凍結乾燥直後の酵素活性を１００(％)とした時の保存後の酵素活性の相対値(％)を求めた。
(1-2-3)カラムクロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験
(1-2-3-1)ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験（以下、「ＧＰＣ」と略記することもある）
凍結乾燥組成物に注射用水を添加して再溶解した溶液を試料とし、以下のカラム及び移動相を用いた高速液体クロマトグラフィーに付した。
【００７９】
カラム：YMC-Pack Diol-200（(株)ワイエムシイ製）
移動相：45％アセトニトリル／0.01M リン酸緩衝液
溶出液の２２０ｎｍの吸光度を連続的に検出し、その検出チャートを得た。検出チャートにおけるＰＣ−ＳＯＤのピークの形状が、凍結乾燥前のＰＣ−ＳＯＤのピークの形状と実質的な差が認められなかった場合を「○」、凍結乾燥前のＰＣ−ＳＯＤのピークには認められないピークが認められた場合を「×」として評価した。
【００８０】
(1-2-3-2)逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験（以下、「ＣＮ」と略記することもある）
上記(1-2-3-1)と同様に試料を調製し、以下のカラム及び移動相を用いた高速液体クロマトグラフィーに付した。
【００８１】
カラム：シアノプロピル化シリカゲル（(株)ワイエムシイ製）
移動相：アセトニトリル／0.1％トリフルオロ酢酸（アセトニトリルの２０％〜９０％の濃度勾配により溶出）
【００８２】
溶出液の２２０ｎｍ及び２７０ｎｍの吸光度を連続的に検出した。ＰＣ−ＳＯＤのピーク（主要なピーク）の前に出現するピーク群（類縁物質のピーク群）の合計面積（ＳＩ）と、ＰＣ−ＳＯＤのピークとＳＩとの合計面積（ＳＴ）を測定し、各々のサンプルについて類縁物質の量（ＳＩ／ＳＴ；％）を算出した。
【００８３】
なお、後述の表７と表８については、比較を容易にするために、処方１における凍結乾燥直後の類縁物質の量を１としたときの相対値で示した。
【００８４】
(2)ＰＣ−ＳＯＤ含有医薬組成物についての試験
(2-1)組成物中の成分の種類による影響１
前記製造例で製造したＰＣ−ＳＯＤ(0.4mg/バイアル)及び下記の表２に示した各種成分(表中のカッコ内の数値は１バイアルあたりの重量を示す)を注射用水に溶解して溶液組成物を製造し、これを凍結乾燥した。
【００８５】
この凍結乾燥物を、前記の各種試験に付した。結果を表２に示す。
評価項目中１つでも×があったものは「×」と判定し、評価項目中全く×がなかったものを「◎」と判定した。
【００８６】
【表２】
【００８７】
表２の結果から、ＰＣ−ＳＯＤはシュークロースと共に配合することによって、極めて凍結乾燥医薬組成物の性状が良好となり、またカラムクロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分析の際の類縁物質ピークの出現が抑制されることが明らかになった。
【００８８】
(2-2)成分の種類による影響２
前記製造例で製造したＰＣ−ＳＯＤ及び下記の表３に示した各種成分を注射用水に溶解して溶液組成物を製造し、0.5 mLずつバイアルに分注し、前記の方法で凍結乾燥した。
【００８９】
なお表中の重量は、１バイアル中に含有される重量を示し、「−」は配合していないことを示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
上記処方１〜４の凍結乾燥医薬組成物を、以下の(a)〜(d)の時点において、性状試験、安定性試験、ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験および逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験に付した。
【００９２】
(a)凍結乾燥直後（保存せず）
(b)凍結乾燥後、４０℃で３ヶ月間保存した時点
(c)凍結乾燥後、２５℃で３ヶ月間保存した時点
(d)凍結乾燥後、８℃で３ヶ月間保存した時点（処方１については６ヶ月間保存した時点）
各試験の結果を表４〜表７に示す。
(1)性状試験
【００９３】
【表４】
【００９４】
いずれの処方も、良好な性状を示した。
【００９５】
(2)安定性試験
【００９６】
【表５】
【００９７】
ソルビトールとポリエチレングリコールとを含有する処方（処方４）は、他の処方に比してＰＣ−ＳＯＤ活性の低下が大きかった。
【００９８】
(3)ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験
【００９９】
【表６】
表６中、Ｎ．Ｔ．は試験していないことを示す。
【０１００】
いずれの処方も、ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピークは検出されなかった。
【０１０１】
(4)逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験（２２０ｎｍ）
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
ソルビトールとマンニトールとを含有する処方（処方３）及びソルビトールとポリエチレングリコールとを含有する処方（処方４）では、逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの面積が、シュークロースを含有する処方（処方１）の約１．４〜３．４倍であった。
【０１０４】
また上記処方において、ＰＣ−ＳＯＤの含量を0.4mg、あるいは10mgとしたものについても同様に実験をした結果、同様の結果が得られた。
【０１０５】
以上の結果から、ＰＣ−ＳＯＤ及びシュークロースを含有する凍結乾燥組成物は、他の処方に比して、(1)性状が良好であり、かつ(2)長期間の保存による酵素活性の低下が非常に少なく（極めて安定である）、かつ(3)ゲル濾過クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークが極めて少ないという極めて有利な効果を有することが見いだされた。
【０１０６】
〔実施例２〕
ＰＣ−ＳＯＤ及びシュークロースを含有する凍結乾燥組成物が、より長期間の保存に耐えうるか否かを調べるために、以下の試験を行った。
【０１０７】
上記の処方１によりＰＣ−ＳＯＤを含有する凍結乾燥組成物を製造し、以下の(e)〜(h)の時点において、実施例１と全く同様の方法で各種試験を行った。本試験においては各処方においてそれぞれ３ロットを試験に供した。
【０１０８】
(e)凍結乾燥直後（保存せず）
(f)凍結乾燥後、４０℃で６ヶ月間保存した時点
(g)凍結乾燥後、２５℃で１２ヶ月間(g-1)、２４ヶ月間(g-2)、３６ヶ月間(g-3)保存した時点
(h)凍結乾燥後、８℃で１２ヶ月間(h-1)、２４ヶ月間(h-2)、３６ヶ月間(h-3)保存した時点
試験の結果をまとめて表８に示す。
【０１０９】
【表８】
【０１１０】
またこの処方において、ＰＣ−ＳＯＤの含量を０．４ｍｇ、あるいは１０ｍｇとしたものについても同様に実験した結果をそれぞれ表９及び表１０に示す。
【０１１１】
【表９】
【０１１２】
【表１０】
【０１１３】
［実施例３］
前記製造例で製造したＰＣ−ＳＯＤ ３０ｍｇ及びシュークロース５０ｍｇを注射用水に溶解して溶液組成物を製造し、１．５ｍＬずつバイアルに分注し、前記の方法で凍結乾燥した。
【０１１４】
上記組成物の凍結乾燥直後、８℃で９ヶ月保存した時点において、比活性の測定方法を除き、実施例１と全く同様の方法で各種試験を行った。比活性は、凍結乾燥組成物に注射用水を添加して再溶解した溶液を用い、ｐＨ７．８、 ２５℃の条件下でシトクロムＣを用いて J. Biol. Chem., Vol. 244, No.22, 6049-6055 (1969) に準じた方法により測定し、シトクロムＣの還元速度を５０％阻害する酵素量を１Ｕとして求めた。凍結乾燥直後の酵素活性を１００（％）とした時の保存後の酵素活性の相対値（％）を求めた。試験の結果を表１１に示す。
【０１１５】
【表１１】
【０１１６】
以上の結果から、シュークロースは、従来知られている医薬担体（結合剤）としての効果の他に、ＰＣ−ＳＯＤに添加することによって長期間保存後でも凍結乾燥医薬組成物の性状を良好に保持し、ＰＣ−ＳＯＤ活性の低下を抑制し（安定に保持し）、かつゲル濾過クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークを抑制する等の効果を発揮することが示された。
【０１１７】
【発明の効果】
本発明医薬組成物は、組成物中のシュークロースの作用により、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下が少なく（安定性が高く）、凍結乾燥した場合の性状が良好で、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現が抑制されているので、医薬品、例えば本発明処置剤の成分として有用である。
【０１１８】
本発明処置剤は、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下が少なく（安定性が高く）、凍結乾燥した場合の性状が良好で、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現が少ない医薬品として、例えば過剰な活性酸素に起因する疾患の処置剤として有用である。
【０１１９】
また本発明抑制剤は、ＰＣ−ＳＯＤの長期間保存による活性低下を抑制し（安定性を保持させ）、凍結乾燥した場合の性状を良好に保ち、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制する作用を有するので、本発明医薬組成物や本発明処置剤を調製する際に有用である。
【０１２０】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レシチン化スーパーオキシドジスムターゼ（以下、単にＰＣ−ＳＯＤともいう）及びシュークロースを含有する医薬組成物、およびこれからなる疾患の処置剤に関する。また本発明は、シュークロースを有効成分とするＰＣ−ＳＯＤの活性低下等を抑制するための剤及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明に最も近い先行技術について説明する。
（ａ）特開平９−１１７２７９号公報には、本発明において用いることができるＰＣ−ＳＯＤおよびこれを有効成分として含む医薬について記載されている。
（ｂ）特開平３−１７０４３８号公報には、レシチン化生物活性蛋白を含む経口及び局所投与用生物活性蛋白組成物が記載されている。また生物活性蛋白の例示としてスーパーオキシドジスムターゼ（以下、単にＳＯＤともいう）が記載されており、また添加物として砂糖が例示されている。
【０００３】
しかしながらこれらの先行技術には、ＰＣ−ＳＯＤ及びシュークロースを含有する医薬組成物の特定の組み合わせについては記載されていない。またＰＣ−ＳＯＤの長期間保存による活性の低下、凍結乾燥した場合の性状、カラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現の問題については解決されていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下が少なく（すなわち安定性が高く）、凍結乾燥した場合の性状が良好で、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現が抑制されたＰＣ−ＳＯＤを含有する医薬組成物を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、ＰＣ−ＳＯＤを有効成分とする医薬組成物について鋭意検討を行った結果、シュークロースが、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し（安定性を保持させ）、凍結乾燥した場合の性状を良好に保ち、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制する作用を有することを見い出し、これにより上記課題を解決しうる医薬組成物が提供できることを見い出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、下記一般式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤ及びシュークロースを含有することを特徴とする医薬組成物（以下、本発明医薬組成物という）を提供する。
ＳＯＤ’（Ｑ−Ｂ）m （Ｉ）
（式中、ＳＯＤ’はスーパーオキシドジスムターゼの残基を表し、Ｑは化学的架橋を表し、Ｂはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンのその水酸基の水素原子を除いた残基を表し、ｍはスーパーオキシドジスムターゼ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数であって、１以上の正数を表す）
また本発明は、本発明医薬組成物からなる、疾患の処置剤（以下、本発明処置剤ともいう）を提供する。
【０００７】
本発明医薬組成物は、好ましくは下記の性質を有する。
(a)性状：この医薬組成物を凍結乾燥したものに注射用水（注射用蒸留水）を添加すると溶解し、不溶性異物は認められない。
(b)安定性：この医薬組成物を凍結乾燥した直後における単位重量あたりのスーパーオキシドジスムターゼ活性を１００とした場合、凍結乾燥した組成物を８℃で１２ヶ月、２５℃で１２ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存した時点における該活性の相対値が、いずれも９７％以上である。
【０００８】
(c)ゲル濾過クロマトグラフィーにおける類縁物質ピーク：凍結乾燥した組成物を再溶解し、ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、溶出液の２２０ｎｍの吸光度を測定した場合、当該吸光度の検出チャートにおけるレシチン化スーパーオキシドジスムターゼのピークの形状と、凍結乾燥前のレシチン化スーパーオキシドジスムターゼの当該ピークの形状との間に、実質的な差が認められない。
【０００９】
(d)逆相クロマトグラフィーにおける類縁物質ピーク：凍結乾燥した組成物を８℃で１２ヶ月、２５℃で１２ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存した時点で再溶解し、逆相クロマトグラフィーにかけ、溶出液の２２０ｎｍ及び２７０ｎｍの吸光度を測定した場合、検出される類縁物質の量が、いずれも凍結乾燥した直後におけるものと実質的に変化しない。
【００１０】
本明細書で「溶解」とは、溶質（医薬組成物を凍結乾燥したもの）と溶媒（注射用水）が混合して、肉眼で観察して澄明な溶液が生じることをいう。「溶解」するか否かは、室温（１℃〜３０℃）下において、溶質に溶媒（注射用水）を添加して緩やかに振とうし、１０秒以内に溶解するか否かで判断することが好ましい。
【００１１】
さらに本発明医薬組成物は、その凍結乾燥物を、８℃で３６ヶ月、２５℃で３６ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存したいずれの時点においても上記(a)〜(d)に記載の全性質を維持しているものであることが好ましい。
【００１２】
また本発明は、シュークロースを有効成分とする剤であって、上記一般式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤと共存させることにより該ＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し、または、該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制するための剤（以下、本発明抑制剤ともいう）を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、上記一般式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤにシュークロースを共存させることにより該ＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し、または、該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制する方法（以下、本発明抑制方法ともいう）を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
【００１５】
＜１＞本発明医薬組成物
(1)本発明医薬組成物に用いるＰＣ−ＳＯＤ
本明細書における「レシチン」とは、フォスファチジルコリンを意味する通常のレシチンをいい、「リゾレシチン」とは、レシチンのグリセロールの２位に結合した脂肪酸１分子がとれて、２位の炭素原子に水酸基が結合した化合物をいう。
【００１６】
本発明医薬組成物に含有されるＰＣ−ＳＯＤは、通常、リゾレシチンの２位の水酸基に化学的架橋剤を結合させたレシチン誘導体を、ＳＯＤに１個以上結合させて得ることができる。このＰＣ−ＳＯＤは次式（Ｉ）で示される。
ＳＯＤ’（Ｑ−Ｂ）m （Ｉ）
上記一般式（Ｉ）中、ＳＯＤ’はスーパーオキシドジスムターゼの残基を表す。
【００１７】
前記式（Ｉ）中のＳＯＤ’は、生体内の活性酸素Ｏ2 -の分解というその本来の機能を発揮し得る限りにおいて、その起源等は特に限定されるものではなく、各種の動植物又は微生物に由来するＳＯＤの残基を広く用いることが可能である。しかしながら、医薬品用途のＳＯＤとしては、生体内での抗原性を可能な限り減じることが好ましいことを考慮すれば、本発明医薬組成物を投与する動物種に応じて、適宜適切なＳＯＤを選択することが好ましい。例えば、最も本発明医薬組成物が必要とされると考えられるヒトを対象とする場合には、ＳＯＤとしてヒト体内における抗原性を可能な限り減ずるべく、ヒト由来のＳＯＤを用いることが好ましい。そしてその中でも、ヒト由来のＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（活性中心に銅と亜鉛を含むヒト由来のＳＯＤ；以下、ヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤと略記することもある）が、細胞内における発現量が多く、また遺伝子工学的手法による生産技術が確立しており、大量に調製することが可能であるため、特に好ましい。
【００１８】
このヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤには、ヒト組織から製造される天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ；遺伝子工学的手法により製造されるヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ；天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤと実質上同一のアミノ酸配列を有する組換えヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ、これらのヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤのアミノ酸配列中の一部のアミノ酸を化学的に修飾もしくは改変したＳＯＤ等があり、いずれのヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤであってもよい。
【００１９】
参考のため、この天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤのタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。なお、実際のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤは、このアミノ酸配列を有するタンパク質が二量体（ダイマー）となっている。
【００２０】
このタンパク質におけるアミノ酸配列に示すごとく、天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの１１１位のアミノ酸はシステインであるが、蛋白工学的手法、例えば部位特異的変異法により、この１１１位をセリンに変換したヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（特開昭62-130684号公報）や、化学的にこの１１１位のシステインを修飾したヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（特開平6-199895号公報）も報告されており、これらのヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤを素材として、本発明におけるＰＣ−ＳＯＤを得ることができる。そして、これらのヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤのうちでも、電荷的及び分子量的に均一であり、かつＳＯＤ活性が安定している、１１１位のシステインを化学的に修飾した、例えばこのシステインをＳ−（２−ヒドロキシエチルチオシステイン）とした、ヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤを素材として、本発明におけるＰＣ−ＳＯＤを得るのが好ましい。
【００２１】
なお本明細書においては、このようにヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤにおいて部位特異的変異法等により一部アミノ酸を変換したものや、ヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの一部のアミノ酸を化学的に修飾して得られるものも含めて、単にヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤという。
【００２２】
また、前記式（Ｉ）中のＢで示される「グリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンの、その水酸基の水素原子を除いた残基」は、次式(II)で表される。
【００２３】
-O-CH(CH2OR)[CH2OP(O)(O-)(OCH2CH2N+(CH3)3)] （II）
（式中、Ｒは脂肪酸残基（アシル基）である）
Ｒは、炭素数１０〜２８の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が好ましく、より好ましくはミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、イコサノイル基、ドコサノイル基、その他炭素数が１４〜２２の飽和脂肪酸残基であり、特に好ましくは炭素数１６の飽和脂肪酸残基であるパルミトイル基である。
【００２４】
また前記式（Ｉ）中のＱは化学的架橋を表す。化学的架橋は、ＳＯＤとレシチンとを架橋して化学的に結合（共有結合）させ得るものであれば特に限定されない。化学的架橋としては、残基−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−Ｃ（Ｏ）−が例示され、かつ好ましい。この残基は、 式ＨＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−Ｃ（Ｏ）−ＯＨで表される直鎖状ジカルボン酸の両端の水酸基を除いた残基、もしくは、このジカルボン酸の無水物、このジカルボン酸のエステル、このジカルボン酸のハロゲン化物、又はその他のこのジカルボン酸の反応性誘導体等の両端における水酸基に対応する部分を除いた残基であるものが好ましい。前記式（Ｉ）中のＱが上記直鎖状ジカルボン酸の残基である場合、Ｑの一端とＢとは、エステル結合で連結している。また、この場合、このＱの他端は、ＳＯＤのアミノ基とアミド結合などにより直接結合していると考えられる。この場合、ＳＯＤ’は、ＳＯＤの結合に関与するアミノ基から水素原子を１つ除いた残基を示す。なお前記の化学的架橋において、基−（ＣＨ2）n−におけるｎは２以上の整数であり、好ましくは２〜１０の整数であり、特に好ましくは３である。
【００２５】
また前記式（Ｉ）中のｍは、ＳＯＤ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数を表している。ｍは１以上の正数であり、１〜１２の正数が好ましく、４が特に好ましい。
【００２６】
ＰＣ−ＳＯＤの製造において、レシチン誘導体のＳＯＤへの結合は、公知の方法、例えば特開平６−５４６８１号公報に記載された方法に従って行うことが可能である。このＰＣ−ＳＯＤの製造過程は、実施例中に記載する。
【００２７】
本発明医薬組成物に用いるＰＣ−ＳＯＤは、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものであることが好ましい。
【００２８】
例えばＰＣ−ＳＯＤは、2,500 U/mg(ＰＣ−ＳＯＤ)以上の比活性を有する精製されたものを用いるのが好ましく、3,000 U/mg(ＰＣ−ＳＯＤ)以上の比活性を有する精製されたものがより好ましい。なお、本明細書において１U(ユニット)とは、pH7.8、30℃の条件下でＮＢＴ(ニトロブルーテトラゾリウム)を用いてJ.Biol.Chem. Vol.244, No.22, 6049-6055(1969)に準じた方法により測定し、ＮＢＴの還元速度を５０％阻害するＰＣ−ＳＯＤの酵素量を表す。
【００２９】
(2)本発明医薬組成物に用いるシュークロース
本発明医薬組成物に用いるシュークロースは、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものであり、活性炭で処理されたシュークロースが好ましい。活性炭による処理は、シュークロースを水溶液とし、これと活性炭とを接触させることにより行うことができる。このような活性炭処理により、たとえばシュークロース中のエンドトキシン濃度を低減させることができ、類縁物質ピークの出現をさらに抑制でき、かつ安定性をさらに向上させうる。
【００３０】
本発明医薬組成物に用いるシュークロース中のエンドトキシン濃度は、0.25 EU/mg以下が好ましく、検出限界(0.006 EU/ml)以下がより好ましい。
【００３１】
なおシュークロース中のエンドトキシン濃度は、公知のエンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。リムルス試験法に用いるリムルス試薬としては、エンドトキシン特異的リムルス試薬を用いることが好ましい。リムルス試薬としては、例えば次に挙げる市販のリムルス試薬を用いることができる；トキシカラーシステムＬＳ−６，ＬＳ−２０，ＬＳ−５０Ｍ、エンドスペシーＥＳ−６，エンドスペシーＥＳ−２００（生化学工業株式会社）。
【００３２】
(3)本発明医薬組成物
本発明の医薬組成物は、ＰＣ−ＳＯＤとシュークロースを含む。該組成物は(1)で説明したＰＣ−ＳＯＤと、(2)で説明したシュークロースを配合することにより得るのが好ましい。これにより、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下が少なく（安定性が高く）、凍結乾燥した場合の性状が良好で、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の時に類縁物質ピークの出現が抑制された本発明医薬組成物を得ることができる。
【００３３】
本発明医薬組成物中のＰＣ−ＳＯＤとシュークロースの配合比率は、投与量、本発明医薬組成物の形態等に応じて当業者が適宜決定でき、特に限定されないが、「ＰＣ−ＳＯＤ／シュークロース」の重量比として0.1/100〜80/100程度が好ましく、0.4/100〜60/100程度がより好ましい。
【００３４】
また本発明医薬組成物は、その脂肪酸含量が、０．１３〜０．１５μｍｏｌ／ｍｇ蛋白であることが好ましい。脂肪酸含量は、例えば（株）ワイエムシイ社製「長鎖、短鎖脂肪酸分析キット」を用いて測定することができる。
【００３５】
なお本発明医薬組成物には、ＰＣ−ＳＯＤの酵素活性に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等、通常医薬に用いられる成分を添加することができる。このような成分としては、生理学上許容され、医薬として使用できる程度の純度であり、かつ医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものを使用できる。
【００３６】
本発明医薬組成物の製造は、ＰＣ−ＳＯＤ及びシュークロースを用い、製剤学的に公知の方法を用いて行なうことができる。なお本発明医薬組成物は、溶液状、凍結状、または凍結乾燥状の形態が好ましい。なお溶液状の形態としては、以下の(1)および(2)の態様も包含される。
(1)凍結状態とした場合の本発明医薬組成物における、凍結前および融解後における溶液状態。
(2)凍結乾燥状態とした場合の本発明医薬組成物における、凍結乾燥前および溶媒添加による再溶解後の溶液状態。
【００３７】
これらの中で、本発明医薬組成物の形態は凍結乾燥状の形態とするのが好ましい。すなわち本発明医薬組成物は凍結乾燥医薬組成物であることが好ましい。
【００３８】
凍結乾燥は、公知の凍結乾燥手法に従って、当業者が適宜条件等を設定して行うことができる。例えば市販の凍結乾燥機を用い、以下のステップ(1)〜(5)の順に実行されるよう設定して行うことができる。なお（ ）内は、各段階に要する時間を示した。
【００３９】
(1)冷却する。例えば、室温から−４０℃〜−５０℃まで冷却する（0.3〜1.5時間程度）。
【００４０】
(2)真空状態を維持しながら冷却状態を維持する。例えば、−４０℃〜−５０℃を維持する（１２時間以上）。
【００４１】
(3)真空状態を維持しながら冷却状態から室温まで戻す。例えば、−４０℃〜−５０℃から室温まで戻す（３〜15時間程度）。
【００４２】
(4)真空状態を維持しながら室温を維持する（例えば３〜20時間程度）。
【００４３】
(5)復圧する。
【００４４】
ステップ(1)〜(5)からなる凍結乾燥医薬組成物の製造においては、上記のステップ(2)に要する時間を工夫するのが好ましく、該時間が、１２時間以上であることが好ましい。
【００４５】
凍結乾燥医薬組成物としては、その性質が下記(a)〜(d)の全ての条件を満たすものが特に好ましい。
【００４６】
(a)性状：凍結乾燥医薬組成物を肉眼で観察した場合、凍結乾燥組成物のケーキの形状が錠剤状であり、かつ凍結乾燥組成物に注射用水を添加した場合、速やかに溶解し、かつ不溶性異物を認めない（凍結乾燥医薬組成物の性状が良好に保持されている）。通常、注射用水に１０秒以内に溶解する。
【００４７】
(b)安定性：凍結乾燥直後の単位重量あたりの酵素活性を１００(％)とした場合、凍結乾燥組成物を８℃で１２ヶ月、２５℃で１２ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存した時の酵素活性の相対値(％)が９７％以上、好ましくは９９％以上である。この安定性は、後述する実施例１中の「(1-2-2)安定性試験」に記載された方法で測定できる。
【００４８】
(c)ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピーク：２２０ｎｍの吸光度を測定した場合、当該吸光度の検出チャートにおけるＰＣ−ＳＯＤ(凍結乾燥医薬組成物)のピークの形状と、凍結乾燥前のＰＣ−ＳＯＤの当該ピークの形状との間に、実質的な差が認められない。該クロマトグラフィーは、後述する実施例１中の「(1-2-3-1)ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験」に記載された方法で測定するのが好ましい。
【００４９】
(d)逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピーク：凍結乾燥組成物を８℃で１２ヶ月、２５℃で１２ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存した時における、２２０ｎｍ及び２７０ｎｍの吸光度の測定により検出される類縁物質の量が、凍結乾燥直後と実質的に変化しない。該クロマトグラフィーは、後述する実施例１中の「(1-2-3-2)逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験」に記載された方法で測定するのが好ましい。
【００５０】
さらに本発明医薬組成物は、その凍結乾燥物を、８℃で３６ヶ月、２５℃で３６ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存したいずれの時点においても上記(a)〜(d)に記載の全性質を維持しているものであることが好ましい。
【００５１】
本発明にいう類縁物質は、主としてレシチンが種々の部分で切断されて生成した種々の物質からなり、遊離脂肪酸等が含まれる。これらの類縁物質はＰＣ−ＳＯＤに結合していたレシチンが切断されて生成するものと考えられ、ＰＣ−ＳＯＤに結合していたレシチンが多量に切断されると、ＰＣ−ＳＯＤとしての機能が減じられ、またそのような類縁物質が多量に含まれるとその医薬品としての品質、規格等の管理上好ましくない。
【００５２】
本発明医薬組成物、さらには該組成物を種々の形態にしたものは、そのまま医薬品として投与するための最終剤形として用いうるが、他の剤形の医薬品、例えば、液剤、凍結乾燥剤等の原料として使用することもできる。
【００５３】
本発明医薬組成物は、ＰＣ−ＳＯＤを有効成分とする注射用製剤として使用するのが好ましい。例えば、本発明医薬組成物を溶液状態の注射用製剤として提供する場合、前記の方法で製造される溶液状態の本発明医薬組成物を、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存し、注射剤として投与に供することができる。
【００５４】
本発明医薬組成物を凍結状態の注射用製剤として提供する場合、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に、凍結状態の本発明医薬組成物を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に融解させて注射剤として投与に供することができる。
【００５５】
また、本発明医薬組成物を凍結乾燥状態の注射用製剤として提供する場合、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に前記の方法で製造される凍結乾燥状態の本発明医薬組成物を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に注射用蒸留水で溶解し、注射剤として投与に供することができる。凍結乾燥状態の本発明医薬組成物は、溶解用の溶媒とセットで提供してもよい。
【００５６】
注射用製剤としては、凍結乾燥状態のものが好ましい。すなわち、本発明医薬組成物は注射用凍結乾燥組成物の形態であることが特に好ましい。
＜２＞本発明処置剤
本発明処置剤は、本発明医薬組成物からなる疾患の処置剤である。また本発明処置剤は、各種疾患の治療剤、予防剤、悪化防止剤、改善剤等の概念をも包含する。本発明処置剤の構成成分として用いるＰＣ−ＳＯＤ、シュークロース、これらの配合量、含有させてもよい他の成分、剤型等は、上記の本発明医薬組成物と全く同じ態様が採用できる。
【００５７】
本発明処置剤を適用できる疾患は、ＰＣ−ＳＯＤの作用によって処置（治療、予防、維持(悪化防止)、軽減(症状の改善)等）が可能な疾患である限りにおいて特に限定されない。
【００５８】
ＰＣ−ＳＯＤの作用によって処置が可能な疾患としては、過剰な活性酸素に起因する疾患が挙げられるが、より具体的には運動ニューロン疾患（例えば筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄性進行性筋萎縮症、家族性痙性麻痺、シャルコー・マリー足、進行性球麻痺、若年性一側上肢筋萎縮症（平山病）等）、虚血再灌流障害、急性腎不全（腎前性急性腎不全、腎性急性腎不全、腎後性急性腎不全等）、ループス腎炎（正常糸球体におけるループス腎炎、メサンギウム増殖性変化を伴うループス腎炎、巣状分節状糸球体腎炎、びまん性増殖性糸球体腎炎、びまん性膜性糸球体腎炎、末期硬化性糸球体腎炎等）、脳血管障害（脳出血、高血圧性脳内出血、脳梗塞、脳血栓、脳塞栓、一過性脳虚血発作、高血圧性脳症等）に伴う機能障害（発語障害、麻痺による運動機能障害、視覚障害、聴覚障害、嗅覚障害、味覚障害等の感覚障害、痴呆等）、間質性肺炎、線維症（肺線維症等）、潰瘍性胃腸障害（潰瘍性大腸炎、クローン病等）、関節炎、熱傷等が挙げられ、これらのなかでも運動ニューロン疾患（特にＡＬＳ）や潰瘍性胃腸障害（特に潰瘍性大腸炎やクローン病）が好ましい適用疾患である。また線維症（特に肺線維症）、間質性肺炎も好ましい適用疾患である。
【００５９】
本発明処置剤は、含有するＰＣ−ＳＯＤの働きで、これらの疾患並びにこれら疾患に伴う症状に対して改善作用を有する。なお、ここに挙げた疾患名は例示であり、かかる例示疾患に本発明処置剤の適用範囲は限定されない。
【００６０】
本発明においては、対象となる疾患の性質や進行段階に応じて、後述する剤形を本発明処置剤の剤形として適宜選択することが好ましい。
【００６１】
本発明処置剤は、注射（筋肉内、皮下、皮内、静脈内等）、経口、吸入等の投与方法によって、経口あるいは非経口的に投与することができ、投与方法に応じ適宜製剤化することができる。剤形としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、坐剤等が挙げられるが、注射剤が好ましく、静脈内投与用の注射剤とすることがより好ましい。
【００６２】
本発明処置剤中の有効成分（ＰＣ−ＳＯＤ）の量および当該処置剤の投与量は、製剤調製の方法、剤形、疾患の種類、当該処置剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状（疾患の程度）、患者の体重等によって個別的であり特に限定されないが、例えば、臨床量として成人１人１日当り 0.5〜100mg（1500〜300000Ｕ）を例示することができる。また、上記製剤の投与間隔は１日１回程度でも可能であり、３〜４回に分けて投与することも可能である。
【００６３】
また本発明処置剤は、前記の疾患を発症しうる脊椎動物、特に哺乳動物に投与する処置剤とすることができるが、ヒトの処置剤とすることが好ましい。
【００６４】
＜３＞本発明抑制剤及び本発明抑制方法
上記の通り、ＰＣ−ＳＯＤにシュークロースを共存させることにより該ＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し、または、該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制することができる。
従って本発明抑制剤は、シュークロースを有効成分とする剤であって、前記一般式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤと共存させることにより該ＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し、または、該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制するための剤である。好ましくは、前記ＰＣ−ＳＯＤの活性低下の抑制、および該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現の抑制の両方の目的のために使用される剤である。
【００６５】
なお本発明抑制剤は、凍結乾燥医薬組成物の調製の際にＰＣ−ＳＯＤと共存させると、上記の抑制効果に加えてさらに凍結乾燥医薬組成物の性状を良好に保持させるという効果を発揮する。従って本発明抑制剤は、特に、前記ＰＣ−ＳＯＤを含有する凍結乾燥医薬組成物を調製する際に前記ＰＣ−ＳＯＤと共存させて用いることが好ましい。
【００６６】
また本発明抑制方法は、上記一般式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤにシュークロースを共存させることにより該ＰＣ−ＳＯＤの活性低下を抑制し、または、該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制する方法である。好ましくは、本発明抑制方法は、前記ＰＣ−ＳＯＤの活性低下の抑制、および該ＰＣ−ＳＯＤのカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現の抑制の両方の目的のために使用される。
【００６７】
本発明抑制剤の有効成分として用いるシュークロース、また本発明抑制方法に用いられるシュークロース、及びそのＰＣ−ＳＯＤへの添加量等は、前記＜１＞に記載したものと同様である。
【００６８】
またＰＣ−ＳＯＤの活性低下抑制、カラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現抑制、また凍結乾燥医薬組成物の調製に用いた場合における凍結乾燥医薬組成物の性状の良好な保持は、後述の実施例に記載された方法で確認することができる。
【００６９】
【実施例】
以下に、本発明を製造例及び実施例により具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００７０】
〔製造例〕
＜１＞ヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの調製
該ＳＯＤは、特開平6-199895号公報に記載された方法で調製したものを用いた。このヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの111 位のアミノ酸はＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システインとなっている。
【００７１】
＜２＞ＰＣ−ＳＯＤの調製
ＰＣ−ＳＯＤは、特開平6-54681号公報に記載された方法によって、２−（４−ヒドロキシカルボニルブチロイル）リゾレシチンの活性エステル体を調製し、これと上記＜１＞のＳＯＤとを反応させることによって調製した。精製・濃縮後、蛋白質濃度をローリー法(Lowry, O.h.ら、J. Biol. Chem., 193 巻, 265 頁 (1951年))、ＳＯＤの残存アミノ基をＴＮＢＳ法（トリニトロベンゼンスルホン酸塩、Goodwin, J. F.ら、Clin. Chem., 16 巻, 24頁 (1970年))で分析することにより、ＳＯＤ１分子あたりのレシチン誘導体の結合数を求めたところ、平均４．０個であった。このＰＣ−ＳＯＤの水溶液は青緑色〜緑色を呈し、ｐＨは７〜８であった。また、分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により調べたところ、ＰＣ−ＳＯＤサブユニットのモノマー（ＰＣ−ＳＯＤはサブユニットのホモダイマーである）あたり約１８０００であった。
【００７２】
〔実施例１〕
本実施例において「ＰＥＧ４０００」とは、ポリエチレングリコール（平均分子量４０００）をいう。
【００７３】
(1)以下、本実施例で用いた方法をまとめて説明する。
(1-1)凍結乾燥
凍結乾燥機（モデルNo.RL402BS；共和真空製）を用いて溶液組成物を凍結乾燥した。なお凍結乾燥のプログラムは、下記表１のステップ(1)〜(5)の順に実行されるよう設定した。
【００７４】
【表１】
(1-2)各種試験方法
(1-2-1)性状試験
凍結乾燥された組成物について、以下の方法で組成物の性状を調べた。
【００７６】
肉眼で観察して、凍結乾燥組成物のケーキの形状が錠剤状であり、かつ凍結乾燥組成物に注射用水を添加した際、１０秒以内に溶解し、かつ不溶性異物を認めなかったものを「○」、凍結乾燥組成物のケーキの形状が錠剤状でなかったもの、又は凍結乾燥組成物に注射用水を添加した際、１０秒以内に溶解しなかったかもしくは不溶性異物を認めたものを「×」として評価した。
【００７７】
(1-2-2)安定性試験
凍結乾燥された組成物について、以下の方法で組成物中のＰＣ−ＳＯＤの酵素活性を測定した。
【００７８】
凍結乾燥組成物に注射用水を添加して再溶解した溶液を用い、pH7.8、30℃の条件下でＮＢＴ(ニトロブルーテトラゾリウム)を用いてJ.Biol.Chem. Vol.244, No.22, 6049-6055(1969)に準じた方法により測定し、ＮＢＴの還元速度を５０％阻害する酵素量を１Uとして求めた。凍結乾燥直後の酵素活性を１００(％)とした時の保存後の酵素活性の相対値(％)を求めた。
(1-2-3)カラムクロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験
(1-2-3-1)ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験（以下、「ＧＰＣ」と略記することもある）
凍結乾燥組成物に注射用水を添加して再溶解した溶液を試料とし、以下のカラム及び移動相を用いた高速液体クロマトグラフィーに付した。
【００７９】
カラム：YMC-Pack Diol-200（(株)ワイエムシイ製）
移動相：45％アセトニトリル／0.01M リン酸緩衝液
溶出液の２２０ｎｍの吸光度を連続的に検出し、その検出チャートを得た。検出チャートにおけるＰＣ−ＳＯＤのピークの形状が、凍結乾燥前のＰＣ−ＳＯＤのピークの形状と実質的な差が認められなかった場合を「○」、凍結乾燥前のＰＣ−ＳＯＤのピークには認められないピークが認められた場合を「×」として評価した。
【００８０】
(1-2-3-2)逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験（以下、「ＣＮ」と略記することもある）
上記(1-2-3-1)と同様に試料を調製し、以下のカラム及び移動相を用いた高速液体クロマトグラフィーに付した。
【００８１】
カラム：シアノプロピル化シリカゲル（(株)ワイエムシイ製）
移動相：アセトニトリル／0.1％トリフルオロ酢酸（アセトニトリルの２０％〜９０％の濃度勾配により溶出）
【００８２】
溶出液の２２０ｎｍ及び２７０ｎｍの吸光度を連続的に検出した。ＰＣ−ＳＯＤのピーク（主要なピーク）の前に出現するピーク群（類縁物質のピーク群）の合計面積（ＳＩ）と、ＰＣ−ＳＯＤのピークとＳＩとの合計面積（ＳＴ）を測定し、各々のサンプルについて類縁物質の量（ＳＩ／ＳＴ；％）を算出した。
【００８３】
なお、後述の表７と表８については、比較を容易にするために、処方１における凍結乾燥直後の類縁物質の量を１としたときの相対値で示した。
【００８４】
(2)ＰＣ−ＳＯＤ含有医薬組成物についての試験
(2-1)組成物中の成分の種類による影響１
前記製造例で製造したＰＣ−ＳＯＤ(0.4mg/バイアル)及び下記の表２に示した各種成分(表中のカッコ内の数値は１バイアルあたりの重量を示す)を注射用水に溶解して溶液組成物を製造し、これを凍結乾燥した。
【００８５】
この凍結乾燥物を、前記の各種試験に付した。結果を表２に示す。
評価項目中１つでも×があったものは「×」と判定し、評価項目中全く×がなかったものを「◎」と判定した。
【００８６】
【表２】
表２の結果から、ＰＣ−ＳＯＤはシュークロースと共に配合することによって、極めて凍結乾燥医薬組成物の性状が良好となり、またカラムクロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分析の際の類縁物質ピークの出現が抑制されることが明らかになった。
【００８８】
(2-2)成分の種類による影響２
前記製造例で製造したＰＣ−ＳＯＤ及び下記の表３に示した各種成分を注射用水に溶解して溶液組成物を製造し、0.5 mLずつバイアルに分注し、前記の方法で凍結乾燥した。
【００８９】
なお表中の重量は、１バイアル中に含有される重量を示し、「−」は配合していないことを示す。
【００９０】
【表３】
上記処方１〜４の凍結乾燥医薬組成物を、以下の(a)〜(d)の時点において、性状試験、安定性試験、ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験および逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験に付した。
【００９２】
(a)凍結乾燥直後（保存せず）
(b)凍結乾燥後、４０℃で３ヶ月間保存した時点
(c)凍結乾燥後、２５℃で３ヶ月間保存した時点
(d)凍結乾燥後、８℃で３ヶ月間保存した時点（処方１については６ヶ月間保存した時点）
各試験の結果を表４〜表７に示す。
(1)性状試験
【００９３】
【表４】
いずれの処方も、良好な性状を示した。
【００９５】
(2)安定性試験
【００９６】
【表５】
ソルビトールとポリエチレングリコールとを含有する処方（処方４）は、他の処方に比してＰＣ−ＳＯＤ活性の低下が大きかった。
【００９８】
(3)ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験
【００９９】
【表６】
【０１００】
いずれの処方も、ゲル濾過クロマトグラフィーによる類縁物質ピークは検出されなかった。
【０１０１】
(4)逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの検出試験（２２０ｎｍ）
【０１０２】
【表７】
ソルビトールとマンニトールとを含有する処方（処方３）及びソルビトールとポリエチレングリコールとを含有する処方（処方４）では、逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークの面積が、シュークロースを含有する処方（処方１）の約１．４〜３．４倍であった。
【０１０４】
また上記処方において、ＰＣ−ＳＯＤの含量を0.4mg、あるいは10mgとしたものについても同様に実験をした結果、同様の結果が得られた。
【０１０５】
以上の結果から、ＰＣ−ＳＯＤ及びシュークロースを含有する凍結乾燥組成物は、他の処方に比して、(1)性状が良好であり、かつ(2)長期間の保存による酵素活性の低下が非常に少なく（極めて安定である）、かつ(3)ゲル濾過クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによる類縁物質ピークが極めて少ないという極めて有利な効果を有することが見いだされた。
【０１０６】
〔実施例２〕
ＰＣ−ＳＯＤ及びシュークロースを含有する凍結乾燥組成物が、より長期間の保存に耐えうるか否かを調べるために、以下の試験を行った。
【０１０７】
上記の処方１によりＰＣ−ＳＯＤを含有する凍結乾燥組成物を製造し、以下の(e)〜(h)の時点において、実施例１と全く同様の方法で各種試験を行った。本試験においては各処方においてそれぞれ３ロットを試験に供した。
【０１０８】
(e)凍結乾燥直後（保存せず）
(f)凍結乾燥後、４０℃で６ヶ月間保存した時点
(g)凍結乾燥後、２５℃で１２ヶ月間(g-1)、２４ヶ月間(g-2)、３６ヶ月間(g-3)保存した時点
(h)凍結乾燥後、８℃で１２ヶ月間(h-1)、２４ヶ月間(h-2)、３６ヶ月間(h-3)保存した時点
試験の結果をまとめて表８に示す。
【０１０９】
【表８】
またこの処方において、ＰＣ−ＳＯＤの含量を０．４ｍｇ、あるいは１０ｍｇとしたものについても同様に実験した結果をそれぞれ表９及び表１０に示す。
【０１１１】
【表９】
【表１０】
［実施例３］
前記製造例で製造したＰＣ−ＳＯＤ ３０ｍｇ及びシュークロース５０ｍｇを注射用水に溶解して溶液組成物を製造し、１．５ｍＬずつバイアルに分注し、前記の方法で凍結乾燥した。
【０１１４】
上記組成物の凍結乾燥直後、８℃で９ヶ月保存した時点において、比活性の測定方法を除き、実施例１と全く同様の方法で各種試験を行った。比活性は、凍結乾燥組成物に注射用水を添加して再溶解した溶液を用い、ｐＨ７．８、 ２５℃の条件下でシトクロムＣを用いて J. Biol. Chem., Vol. 244, No.22, 6049-6055 (1969) に準じた方法により測定し、シトクロムＣの還元速度を５０％阻害する酵素量を１Ｕとして求めた。凍結乾燥直後の酵素活性を１００（％）とした時の保存後の酵素活性の相対値（％）を求めた。試験の結果を表１１に示す。
【０１１５】
【表１１】
以上の結果から、シュークロースは、従来知られている医薬担体（結合剤）としての効果の他に、ＰＣ−ＳＯＤに添加することによって長期間保存後でも凍結乾燥医薬組成物の性状を良好に保持し、ＰＣ−ＳＯＤ活性の低下を抑制し（安定に保持し）、かつゲル濾過クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークを抑制する等の効果を発揮することが示された。
【０１１７】
【発明の効果】
本発明医薬組成物は、組成物中のシュークロースの作用により、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下が少なく（安定性が高く）、凍結乾燥した場合の性状が良好で、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現が抑制されているので、医薬品、例えば本発明処置剤の成分として有用である。
【０１１８】
本発明処置剤は、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下が少なく（安定性が高く）、凍結乾燥した場合の性状が良好で、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現が少ない医薬品として、例えば過剰な活性酸素に起因する疾患の処置剤として有用である。
【０１１９】
また本発明抑制剤は、ＰＣ−ＳＯＤの長期間保存による活性低下を抑制し（安定性を保持させ）、凍結乾燥した場合の性状を良好に保ち、かつカラムクロマトグラフィーによる分析の際の類縁物質ピークの出現を抑制する作用を有するので、本発明医薬組成物や本発明処置剤を調製する際に有用である。
【０１２０】
【配列表】
Claims (15)
- 下記一般式（Ｉ）で表されるレシチン化スーパーオキシドジスムターゼ及びシュークロースを含有することを特徴とする医薬組成物。
ＳＯＤ’(Ｑ−Ｂ)ｍ （Ｉ）
（式中、ＳＯＤ’はスーパーオキシドジスムターゼの残基を表し、Ｑは−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ) ｎ −Ｃ（Ｏ）−，ｎは２−１０の整数を表し、Ｂはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンのその水酸基の水素原子を除いた残基を表し、ｍはスーパーオキシドジスムターゼ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数であって、１以上の正数を表す） - 下記の性質を有することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
(a)性状：この医薬組成物を凍結乾燥したものに注射用水を添加すると溶解し、不溶性異物は認められない。
(b)安定性：この医薬組成物を凍結乾燥した直後における単位重量あたりのスーパーオキシドジスムターゼ活性を１００とした場合、凍結乾燥した組成物を８℃で１２ヶ月、２５℃で１２ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存した時点における該活性の相対値が、いずれも９７％以上である。
(c)ゲル濾過クロマトグラフィーにおけるレシチン化スーパーオキシドジスムターゼ中のレシチンが種々の部分で切断されて生成した物質である類縁物質ピーク：凍結乾燥した組成物を再溶解し、ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、溶出液の２２０ｎｍの吸光度を測定した場合、当該吸光度の検出チャートにおけるレシチン化スーパーオキシドジスムターゼのピークの形状と、凍結乾燥前のレシチン化スーパーオキシドジスムターゼの当該ピークの形状との間に差が認められない。
(d)逆相クロマトグラフィーにおけるレシチン化スーパーオキシドジスムターゼ中のレシチンが種々の部分で切断されて生成した物質である類縁物質ピーク：凍結乾燥した組成物を８℃で１２ヶ月、２５℃で１２ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存した時点で再溶解し、逆相クロマトグラフィーにかけ、溶出液の２２０ｎｍ及び２７０ｎｍの吸光度を測定した場合、検出されるレシチン化スーパーオキシドジスムターゼ中のレシチンが種々の部分で切断されて生成した物質である類縁物質の量が、いずれも凍結乾燥した直後におけるものと変化しない。 - 凍結乾燥した組成物を、８℃で３６ヶ月、２５℃で３６ヶ月、又は４０℃で６ヶ月間保存したいずれの時点においても請求項２に記載の全性質を維持していることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物中の脂肪酸含量が、０．１３〜０．１５μｍｏｌ／ｍｇ蛋白である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- ＳＯＤ’が、ヒトのスーパーオキシドジスムターゼの残基である、請求項１〜４いずれか１項に記載の医薬組成物。
- ＳＯＤ’が、ヒトのスーパーオキシドジスムターゼのアミノ酸配列１１１位のアミノ酸がＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システインとなったスーパーオキシドジスムターゼ修飾体の残基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- スーパーオキシドジスムターゼが、活性中心に銅と亜鉛を含むスーパーオキシドジスムターゼである、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
- ｍが１〜１２の正数である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- シュークロースが、活性炭処理されたシュークロースである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 凍結乾燥医薬組成物の形態である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- レシチン化スーパーオキシドジスムターゼとシュークロースの重量比が０．４／１００〜６０／１００である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物からなる疾患の処置剤。
- 疾患が、運動ニューロン疾患又は潰瘍性胃腸障害である、請求項１２に記載の処置剤。
- シュークロースを有効成分とする剤であって、下記一般式（Ｉ）で表されるレシチン化スーパーオキシドジスムターゼと共存させることにより該スーパーオキシドジスムターゼの活性低下を抑制し、かつ、該スーパーオキシドジスムターゼのカラムクロマトグラフィーによる分析の際のレシチン化スーパーオキシドジスムターゼ中のレシチンが種々の部分で切断されて生成した物質である類縁物質ピークの出現を抑制するための剤。
ＳＯＤ’（Ｑ−Ｂ）m （Ｉ）
（式中、ＳＯＤ’はスーパーオキシドジスムターゼの残基を表し、Ｑは−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ) ｎ −Ｃ（Ｏ）−，ｎは２−１０の整数を表し、Ｂはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンのその水酸基の水素原子を除いた残基を表し、ｍはスーパーオキシドジスムターゼ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数であって、１以上の正数を表す） - 下記一般式（Ｉ）で表されるレシチン化スーパーオキシドジスムターゼにシュークロースを共存させることにより該スーパーオキシドジスムターゼの活性低下を抑制し、かつ、該スーパーオキシドジスムターゼのカラムクロマトグラフィーによる分析の際のレシチン化スーパーオキシドジスムターゼ中のレシチンが種々の部分で切断されて生成した物質である類縁物質ピークの出現を抑制する方法。
ＳＯＤ’（Ｑ−Ｂ）m （Ｉ）
（式中、ＳＯＤ’はスーパーオキシドジスムターゼの残基を表し、Ｑは−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ) ｎ −Ｃ（Ｏ）−，ｎは２−１０の整数を表し、Ｂはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンのその水酸基の水素原子を除いた残基を表し、ｍはスーパーオキシドジスムターゼ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数であって、１以上の正数を表す）
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