WO1998000524A1 - Procede de production d'adenovirus recombinants - Google Patents

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WO1998000524A1
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Definitions

  • the present invention relates to a new process for the production of recombinant adenoviruses. It also relates to purified viral preparations produced by this process.
  • Adenoviruses have certain properties which are particularly advantageous for use as a vector for gene transfer in gene therapy. In particular, they have a fairly broad host spectrum, are capable of infecting quiescent cells, do not integrate into the genome of the infected cell, and have not been associated to date with significant pathologies in man. Adenoviruses have thus been used to transfer genes of interest into the muscle (Ragot et al., Nature 361 (1993) 647), the liver (Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372), the nervous system (Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224), etc.
  • Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses approximately 36 (kilobases) kb in size. Their genome includes in particular a repeated inverted sequence (ITR) at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and late genes.
  • ITR inverted sequence
  • Psi encapsidation sequence
  • the main early genes are contained in the E1, E2, E3 and E4 regions. Among these, the genes contained in the El region in particular are necessary for viral propagation.
  • the main late genes are contained in regions L1 to L5.
  • the genome of the Ad5 adenovirus has been fully sequenced and is accessible on the database (see in particular Genebank M73260). Likewise, parts or even all of other adenoviral genomes (Ad2, Ad7, Adl2, etc.) have also been sequenced.
  • adenovirus For their use in gene therapy, different vectors derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different therapeutic genes. In each of these constructions, the adenovirus was modified so as to render it incapable of replication in the infected cell. Thus, the constructions described in the prior art are deleted adenoviruses from the E1 region, essential for viral replication, at the level of which heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Furthermore, to improve the properties of the vector, it has been proposed to create other deletions or modifications in the genome of the adenovirus.
  • thermosensitive point mutation was introduced into the mutant ts125, making it possible to inactivate the 72kDa DNA binding protein (DBP) (Van der Vliet et al., 1975).
  • DBP 72kDa DNA binding protein
  • Other vectors include a deletion of another region essential for viral replication and / or spread, the E4 region.
  • the E4 region is in fact involved in the regulation of the expression of late genes, in the stability of late nuclear RNA, in the extinction of the expression of proteins of the host cell and in the efficiency of replication of l 'Viral DNA.
  • Adenoviral vectors in which the E1 and E4 regions are deleted therefore have very reduced transcription background noise and expression of viral genes.
  • the recombinant adenoviruses described in the literature are produced from different adenovirus serotypes. There are in fact different serotypes of adenoviruses, the structure and properties of which vary somewhat, but which have a comparable genetic organization. More particularly, the recombinant adenoviruses can be of human or animal origin. As regards adenoviruses of human origin, mention may preferably be made of those classified in group C, in particular adenoviruses of type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) or 12 (Adl2).
  • adenoviruses of animal origin mention may preferably be made of adenoviruses of canine origin, and in particular all the strains of adenoviruses CAV2 [manhattan or A26 / 61 strain (ATCC VR-800) for example].
  • Other adenoviruses of animal origin are cited in particular in application WO94 / 26914 incorporated herein by reference.
  • the recombinant adenovirus is a human adenovirus of group C. More preferably, it is an adenovirus Ad2 or Ad5.
  • Recombinant adenoviruses are produced in an packaging line, that is to say a cell line capable of complementing in trans one or more of the deficient functions in the recombinant adenoviral genome.
  • a packaging line that is to say a cell line capable of complementing in trans one or more of the deficient functions in the recombinant adenoviral genome.
  • One of these lines is for example the line 293 in which a part of the adenovirus genome has been integrated.
  • line 293 is a human embryonic kidney cell line containing the left end (approximately 11-12%) of the genome of the adenovirus serotype 5 (Ad5), comprising the left ITR, the packaging region , the El region, including Ela and Elb, the region coding for the pIX protein and part of the region coding for the pIVa2 protein.
  • This line is capable of transcomplementing recombinant adenoviruses defective for the E1 region, that is to say devoid of all or part of the E1 region, and to produce viral stocks having high titers.
  • This line is also capable of producing, at permissive temperature (32 ° C.), stocks of virus further comprising the thermosensitive E2 mutation.
  • Recombinant adenoviruses are usually produced by introducing viral DNA into the packaging line, followed by lysis of the cells after approximately 2 or 3 days (the kinetics of the adenoviral cycle being 2 ⁇ to 36 hours). After the cell lysis, the recombinant viral particles are isolated by centrifugation in a cesium chloride gradient.
  • the viral DNA introduced may be the complete recombinant viral genome, optionally constructed in a bacterium (WO96 / 25506) or in a yeast (WO95 / 03400), transfected in the cells. It can also be a recombinant virus used to infect the packaging line. DNA viral can also be introduced in the form of fragments each carrying a part of the recombinant viral genome and a homology zone making it possible, after introduction into the packaging cell, to reconstitute the recombinant viral genome by homologous recombination between the different fragments.
  • a conventional process for the production of adenovirus thus comprises the following steps:
  • the cells for example the 293 cells
  • the incubation then lasts from 40 to 72 hours.
  • the virus is then released from the nucleus by lysis of the cells, generally by several successive thawing cycles.
  • the cell lysate obtained is then centrifuged at low speed (2000 to 4000 rpm) and the supernatant (clarified cell lysate) is then purified by centrifugation in the presence of cesium chloride in two stages:
  • the virus band is in the majority. However, two less dense, thin bands are observed, which observation by electron microscopy has shown that they were empty or broken viral particles for the densest band, and viral subunits (pentons, hexons) for the strip least den.se.
  • the virus is harvested by needle puncture in the centrifuge tube and the cesium is removed by dialysis or desalting.
  • the resolution obtained is average, the authors indicating that virus particles are present in several chromatographic peaks; the yield is low (yield of viral particles: 67%; yield of infectious particles: 49%); and the viral preparation obtained following this chromatographic step is impure.
  • pretreatment of the virus with different enzymes / proteins is necessary.
  • This same article also describes a study of the use of gel permeation chromatography, demonstrating very poor resolution and very low yields (15-20%).
  • the present invention describes a new process for the production of recombinant adenoviruses.
  • the process according to the invention results from modifications of the previous processes at the level of the production phase and / or at the level of the purification phase.
  • the method according to the invention now makes it possible to obtain very quickly and industrially, stocks of viruses in very high quantity and quality.
  • One of the first aspects of the invention relates more particularly to a process for the preparation of recombinant adenoviruses in which the viruses are harvested from the culture supernatant.
  • Another aspect of the invention relates to a process for the preparation of adenovirus comprising an ultrafiltration step.
  • the invention also relates to a method for purifying recombinant adenoviruses comprising a step of anion exchange chromatography.
  • the present invention also describes an improved purification process using gas chromatography. gel permeation, optionally coupled to anion exchange chromatography.
  • the method according to the invention makes it possible to obtain viruses of high quality, in terms of purity, stability, morphology and infectivity, with very high yields and under production conditions fully compatible with industrial requirements and with the regulations concerning the production of therapeutic molecules.
  • the method of the invention uses methods for treating culture supernatants tested on a large scale for recombinant proteins, such as microfiltration or deep filtration, and tangential ultrafiltration. Furthermore, due to the stability of the virus at 37 ° C., this process allows better organization at the industrial stage since, unlike the intracellular method, the harvest time does not need to be precise at half day close. In addition, it guarantees a maximum harvest of the virus, which is particularly important in the case of defective viruses in several regions. On the other hand, the process of the invention allows easier and more precise monitoring of the production kinetics, directly on homogeneous samples of supernatant, without pretreatment, which allows better reproducibility of the productions.
  • the method according to the invention also makes it possible to dispense with the step of lysis of the cells.
  • Cell lysis has several drawbacks. Thus, it can be difficult to envisage breaking cells by freezing-thawing cycles on an industrial level.
  • alternative lysis methods (Dounce, X-press, sonication, mechanical shearing, etc.) have drawbacks: they are potentially aerosol generators difficult to confine for L2 or L3 viruses (level of virus confinement, dependent their pathogenicity or their mode of dissemination), these viruses also tend to be infectious by air; they generate shear forces and / or release of heat which are difficult to control and which decrease the activity of the preparations.
  • the solution of using detergents to lyse the cells would need to be validated and would also require validation of the detergent removal.
  • cell lysis leads to the presence in the medium of numerous cellular debris, which makes the purification.
  • the method of the invention potentially allows better maturation of the virus leading to a more homogeneous population.
  • premature lysis of cells potentially releases empty particles which, although not replicative, are a priori infectious and capable of p. participate in the toxic effect of the virus and increase the specific activity ratio of the preparations obtained.
  • the specific infectivity ratio of a preparation is defined as the ratio of the total number of viral particles, measured by biochemical methods (DO260nm, HPLC, PCR, immunoenzymatic methods, etc.) over the number of viral particles generating an effect biological (formation of lysis plaques on cells in culture in solid medium, transduction of cells).
  • this ratio is determined by making the ratio of the concentration of the particles measured by DO at 260 nm to the concentration of units forming the range of the preparation. This ratio must be less than 100.
  • the results obtained show that the process of the invention makes it possible to obtain a virus of a purity at least equal to its counterpart purified by centrifugation in cesium chloride gradient, in a single step and without prior treatment, starting from a concentrated viral supernatant.
  • a first object of the invention therefore relates to a process for the production of recombinant adenoviruses characterized in that the viral DNA is introduced into a culture of packaging cells and the viruses produced are harvested after release into the culture supernatant.
  • the viruses are harvested following a premature cell lysis carried out mechanically or chemically
  • the cells are not lysed by the intervention of an external factor.
  • the culture is continued for a longer period of time, and the viruses are harvested directly from the supernatant, after spontaneous release by the packaging cells.
  • the virus according to the invention is thus recovered in the cell supernatant, whereas in the previous methods, it is an intracellular virus, more particularly intranuclear.
  • the method according to the invention makes it possible to generate viral particles in high quantity and of better quality.
  • this process makes it possible to avoid the lysis steps which are heavy at the industrial level and generate numerous impurities.
  • the principle of the process is therefore based on the collection of the viruses released in the supernatant. This process may involve a longer culture time than previous techniques based on cell lysis. As indicated above, the harvest time does not have to be precise to the nearest half day. It is essentially determined by the kinetics of release of the viruses into the culture supernatant.
  • the kinetics of virus release can be followed in different ways.
  • analysis methods such as RP-HPLC, IE-HPLC, semi-quantitative PCR (example 4.3), staining of dead cells with trypan blue, measuring the release.
  • LDH-type intracellular enzymes measurement of particles in the supernatant by Coulter-type devices or by light diffraction, immunological (ELISA, RIA, etc.) or nephelometric methods, titration by aggregation in the presence of antibodies , etc.
  • the harvest is carried out when at least 50% of the viruses have been released into the supernatant.
  • the time when 50% of the viruses have been released can be easily determined by carrying out kinetics according to the methods described above. Even more preferably, the harvest is carried out when at least 70% of the viruses have been released into the supernatant. It is particularly preferred to carry out the harvest when at least 90% of the viruses have been released into the supernatant, that is to say when the kinetics reach a plateau.
  • the kinetics of virus release are essentially based on the replication cycle of the adenovirus, and can be influenced by certain factors. In particular, it can vary according to the type of virus used, and in particular according to the type of deletion carried out in the recombinant viral genome.
  • the deletion of the E3 region appears to delay the release of the virus.
  • the virus can be harvested 24-48 hours after infection.
  • a longer culture time seems necessary.
  • the applicant has carried out experiments on the kinetics of release of an adenovirus deficient for the E1 and E3 regions in the cell supernatant, and has shown that the release begins 4 to 5 days approximately post-infection, and lasts until on day 14 approximately. Release generally reaches a plateau between day 8 and day 14, and the titer remains stable for at least 20 days post-infection.
  • the cells are cultured for a period of between 2 and 14 days.
  • the release of the virus can be induced by expression in the packaging cell of a protein, for example viral, involved in the release of the virus.
  • the release can be modulated by expression of the Death protein encoded by the E3 region of the adenovirus (protein E3-11.6K), optionally expressed under the control of an inducible promoter. Therefore, it is possible to reduce the time of release of the viruses and to collect in the culture supernatant, more than 50% of the viruses 24-48 hours post-infection.
  • the culture supernatant is advantageously filtered beforehand.
  • the adenovirus having a size of approximately 0.1 ⁇ m (120 nm) the filtration is carried out by means of membranes having a porosity sufficiently large to allow the virus to pass, but sufficiently fine to retain the contaminants.
  • the filtration is carried out by means of membranes having a porosity greater than 0.2 ⁇ m.
  • the filtration is carried out by successive filtrations on membranes of decreasing porosity. Particularly good results have been obtained by carrying out filtration on depth filters with decreasing porosity lO ⁇ m, l.O ⁇ m then 0.8-0.2 ⁇ m.
  • the filtration is carried out by tangential microfiltration on flat membranes or hollow fibers. More particularly, Millipore flat membranes or hollow fibers having a porosity of between 0.2 and 0.6 ⁇ m can be used. The results presented in the examples show that this filtration step has a yield of 100% (no loss of virus was observed by retention on the filter having the lowest porosity).
  • the applicant has now developed a method for harvesting and purifying the virus from the supernatant.
  • the supernatant thus filtered (or clarified) is subjected to ultrafiltration.
  • This ultrafiltration makes it possible (i) to concentrate the supernatant, the volumes involved being significant, (ii) to carry out a first purification of the virus and (iii) to adjust the buffer of the preparation to the subsequent stages of preparation.
  • the supernatant is subjected to a tangential ultrafiltration.
  • Tangential ultrafiltration consists in concentrating and fractionating a solution between two compartments, retentate and filtrate, separated by membranes of determined cutoff thresholds, by carrying out a flow in the retentate compartment of the device and by applying transmenbranary pressure between this compartment and the filtrate compartment.
  • the flow is generally carried out by means of a pump in the retentate compartment of the device and the transbranar pressure is controlled by means of a valve on the liquid stream of the retentate circuit or of a variable flow pump on the liquid stream of the circuit filtrate.
  • the speed of the flow and the transmembrane pressure are chosen so as to generate few shear forces (number of reynolds less than 5000 sec "1 , preferably less than 3000 sec " 1 , pressure less than 1.0 bar) while avoiding clogging of the membranes.
  • Different systems can be used to carry out ultrafiltration, such as, for example, spiral membranes (Millipore, Amicon), flat membranes or hollow fibers (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor).
  • the adenovirus having a mass of approximately 1000 kDa, membranes having a cutoff threshold of less than 1000 kDa, preferably between 100 kDa and 1000 kDa, are advantageously used in the context of the invention.
  • membranes having a cutoff threshold of 1000 kDa or higher in fact leads to a significant loss of virus at this stage.
  • membranes with a cutoff threshold of between 200 and 600 kDa are used, even more preferably between 300 and 500 kDa.
  • the experiments presented in the examples show that the use of a membrane having a cutoff threshold of 300 kDa allows the retention of more than 90% of viral particles while eliminating environmental contaminants (DNA, environmental proteins, cellular proteins, etc.).
  • the use of a cutoff threshold of 500 kDa offers the same advantages.
  • This ultrafiltration step thus constitutes an additional purification compared to the conventional scheme insofar as the contaminants of mass below the cut-off threshold (300 or 500 kDa) are eliminated at least in part.
  • the improvement in the quality of the viral preparation is clear when the aspect of separation is compared after the first ultracentrifugation step according to the two methods.
  • the tube of the viral preparation has a cloudy appearance with a coagulum (lipids, proteins) sometimes coming to touch the band of virus, while in the method of the invention, the preparation after release and ultrafiltration presents an already well resolved band of environmental contaminants which persist in the upper phase.
  • the improvement in quality is also demonstrated when the profiles on ion exchange chromatography of a virus obtained by cell lysis are compared with the virus obtained by ultrafiltration as described in the present invention. Furthermore, it is possible to further improve the quality by continuing the ultrafiltration by a diafiltration of the concentrate. This diafiltration is carried out on the same principle as tangential ultrafiltration, and makes it possible to more completely remove contaminants of size greater than the cut-off threshold of the membrane, while achieving equilibration of the concentrate in the purification buffer.
  • the method according to the invention is therefore characterized in that the viruses are harvested by ultrafiltration.
  • the resulting concentrate can be used directly for purifying the virus.
  • This purification can be carried out by prior conventional techniques, such as centrifugation in a cesium chloride gradient or other ultracentrifugation medium making it possible to separate the particles according to their size, density or coefficient of sedimentation.
  • the results presented in Example 4 indeed show that the virus thus obtained exhibits remarkable characteristics.
  • the viruses are therefore harvested and purified by anion exchange chromatography.
  • cellulose For anion exchange chromatography, different types of support can be used, such as cellulose, agarose (Sepharose gels), dextran (Sephadex gels), acrylamide (Sephacryl gels, Trisacryl gels), silica (TSK-gel SW gels), poly [styrene-divinylbenzene] (Source gels or Poros gels), the copolymer ethylene glycol-methacrylate (Toyopearl HW and TSK-gel PW gels), or mixtures (agarose-dextran: Superdex gel).
  • supports in the form of beads, having the following characteristics: - as spherical as possible,
  • the support is chosen from agarose, dextran, acrylamide, silica, poly [styrene-divinylbenzene], the ethylene glycol-methacrylate copolymer, alone or as a mixture.
  • the support used must be functionalized, by grafting a group capable of interacting with an anionic molecule.
  • the group consists of an ain which can be ternary or quaternary.
  • a ternary amine such as DEAE for example, a weak anion exchanger is obtained.
  • a quaternary amine By using a quaternary amine, a strong anion exchanger is obtained.
  • a strong anion exchanger In the context of the present invention, it is particularly advantageous to use a strong anion exchanger.
  • a chromatography support as used above is used, functionalized by quaternary amines.
  • examples that may be mentioned are Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ and Poros QE resins, Fractogel TMAE type resins, and Toyopearl Super Q resins.
  • Preferred examples of resins usable in the context of the invention are the
  • Source in particular Source Q, such as Q (Pharmacia), MonoBeads, such as Q (Pharmacia), resins of the Poros HQ and Poros QE type.
  • the MonoBeads support (ball diameter 10 ⁇ 0.5 ⁇ m) has been commercially available for more than 10 years and the Source type resins (15 ⁇ m) or Poros (10 ⁇ m or 20 ⁇ m) for approximately 5 years.
  • These last two supports have the advantage of having a very wide distribution of internal pores (they range from 20 nm to 1 ⁇ m), thus allowing the passage of very large objects through the beads.
  • they offer very little resistance to the circulation of liquid through the gel (therefore very little pressure) and are very rigid. The transport of solutes to the functional groups with which they will interact is therefore very rapid.
  • the Applicant has shown that these parameters are particularly important in the case of the adenovirus, the diffusion of which is slow due to its size.
  • results presented in the examples show that the adenovirus can be purified from the concentrate in a single step of anion exchange chromatography, that the purification yield is excellent (140% in terms of tdu, compared to the 49% value reported by Huyghes et al.) and that the resolution is excellent.
  • the results presented show that the adenovirus obtained has a high infectivity, and therefore has the characteristics required for therapeutic use.
  • Particularly advantageous results have been obtained with a strong anion exchanger, that is to say functionalized with quaternary amines, and in particular with Source Q resin.
  • Source Q15 resin is particularly preferred.
  • another subject of the invention relates to a process for the purification of recombinant adenoviruses from a biological medium, characterized in that it comprises a purification step by strong anion exchange chromatography.
  • the biological medium can be a supernatant of packaging cells producing said virus, a lysate of packaging cells producing said virus, or a prepurified solution of said virus.
  • the chromatography is carried out on a support functionalized with a quaternary amine.
  • the support is chosen from agarose, dextran, acrylamide, silica, poly [styrene-divinylbenzene], ethylene glycol-methacrylate copolymer, alone or as a mixture.
  • a particularly advantageous embodiment is characterized in that the chromatography is carried out on a Source Q resin, preferably Q15.
  • the method described above is advantageously carried out using a supernatant of producer cells, and comprises a prior step of ultrafiltration.
  • This step is advantageously carried out under the conditions defined above, and in particular, it is a tangential ultrafiltration on a membrane having a cutoff threshold of between 300 and 500 kDa.
  • the viruses are harvested and purified by gel permeation chromatography.
  • the gel permeation can be carried out directly on the supernatant, on the concentrate, or on the virus resulting from anion exchange chromatography.
  • the supports mentioned for the anion exchange chromatography can be used in this step, but without functionalization.
  • the preferred supports are agarose (Sepharose gels), dextran (Sephadex gels), acrylamide (Sephacryl gels, Trisacryl gels), silica (TSK-gel gels
  • a preferred method according to the invention therefore comprises an ultrafiltration followed by anion exchange chromatography.
  • Another preferred method includes ultrafiltration followed by anion exchange chromatography, followed by gel permeation chromatography.
  • Another variant of the invention relates to a method for purifying adenovirus from a biological medium comprising a first stage of ultracentrifugation, a second stage of dilution or dialysis, and a third stage of anion exchange chromatography .
  • the first step is carried out by rapid ultracentrifugation on a cesium chloride gradient.
  • rapid means ultracentrifugation ranging from about 0.5 to 4 hours.
  • the virus is diluted or dialyzed against buffer, to facilitate its injection on the chromatography gel, and the elimination of the ultracentrifugation medium.
  • the third step is carried out using anion exchange chromatography as described above, preferably strong anions.
  • a 1st rapid ultracentrifugation is carried out with cesium chloride (as in Example 3). Then, after a simple dilution of the sample (for example by 10 volumes of buffer) or after a simple dialysis in buffer, the sample is chromatographed in ion exchange (as in example 5.1.).
  • the advantage of this variant of the process of the invention comes from the fact that it implements 2 completely different modes of separation of the virus (density and surface charge), which can possibly bring the virus to a level of quality combining the performances of the 2 methods.
  • the chromatography step allows simultaneously to eliminate the medium used for ultracentrifugation (cesium chloride for example, or any other equivalent medium mentioned above).
  • Another subject of the invention relates to the use of iodixanol, 5.5 ′ - [(2-hydroxy-1-3-propanediyl) -bis (acetylamino)] bis [N, N'-bis (2,3dihydroxypropyl-2, 4,6-triodo- 1, 3-benzenecarboxamide] for the purification of adenovirus.
  • the packaging cells can be prepared from different pharmaceutically usable cells, that is to say cultivable under industrially acceptable conditions and having no recognized pathogenic character. They can be established cell lines or primary cultures and in particular human retinoblasts, human lung carcinoma cells, or kidney embryonic cells. Advantageously, these are cells of human origin, which can be infected with an adenovirus. In this regard, mention may be made of KB, Hela, 293, Vero, gmDBP6, HER, A549, HER, etc. cells.
  • the cells of the KB line are derived from a human epidermal carcinoma. They are accessible to ATCC (ref. CCL17) as well as the conditions allowing their cultivation.
  • the Hela human cell line comes from a carcinoma of the human epithelium. It is also accessible to ATCC (ref. CCL2) as well as the conditions allowing its cultivation.
  • the cells of line 293 are human embryonic kidney cells (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). This line contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome of the human adenovirus Ad5 (12%).
  • the gm DBP6 cell line (Brough et al., Virology 190 (1992) 624) consists of Hela cells carrying the E2 adenovirus gene under the control of the LTR of MMTV.
  • MDCK canine origin
  • cells from the MDCK canine line are preferred. Culture conditions MDCK cells have been described in particular by Macatney et al., Science 44 (1988) 9.
  • Different packaging cell lines have been described in the literature and are mentioned in the examples. They are advantageously cells trans-complementing the El function of the adenovirus. Even more preferably, these are cells that complement the E1 and E4 or E1 and E2a functions of the adenovirus. These cells are preferably derived from human embryonic kidney or retinal cells, or from human lung carcinomas.
  • the invention thus provides a method of producing particularly advantageous recombinant adenoviruses.
  • This method is suitable for the production of recombinant viruses defective for one or more regions, and in particular, viruses defective for the El region, or for the El and E4 regions. Furthermore, it is applicable to the production of adenoviruses of different serotypes, as indicated above.
  • the method of the invention is used for the production of recombinant adenoviruses in which the E1 region is inactivated by deletion of a PvuII-BglII fragment going from nucleotide 454 to nucleotide 3328, on the sequence of l adenovirus Ad5.
  • This sequence is accessible in the literature and also on the database (see in particular Genebank n ° M73260).
  • the E1 region is inactivated by deletion of a HinfII-Sau3A fragment going from nucleotide 382 to nucleotide 3446.
  • the method allows the production of vectors comprising a deletion of the entire region E4.
  • E4 a Maell-Mscl fragment corresponding to nucleotides 35835-32720.
  • a functional part of E4 is deleted. This part includes at least the ORF3 and ORF6 phases.
  • these coding phases can be deleted from the genome in the form of PvuII-AluI and BglII-PvuII fragments respectively, corresponding to nucleotides 34801-34329 and 34115-33126 respectively.
  • the deletions of the E4 region of the Ad2 dl808 virus or of the Ad5 dll004, Ad5 dll007, Ad5 dllOll or Ad5 dll014 viruses can also be used in the context of the invention.
  • the cells of the invention are particularly advantageous for the production of viruses comprising an inactive E1 region and a deletion in the E4 region of the type of that present in the genome of Ad5 d11014, that is to say of E4 virus "retaining the ORF4 reading phase.
  • the deletion in the El region advantageously covers all or part of the El A and E1B regions. This deletion must be sufficient to render the virus incapable of autonomous replication in a cell.
  • the part of the El region deleted in the adenoviruses according to the invention advantageously covers the nucleotides 454-3328 or 382-3446.
  • the adenoviruses produced may have other alterations in their genome.
  • other regions can be deleted to increase the capacity of the virus and reduce its side effects linked to the expression of viral genes.
  • all or part of the E3 or IVa2 region in particular can be deleted.
  • the E3 region it may however be particularly advantageous to keep the part coding for the protein gpl9K.
  • This protein in fact makes it possible to prevent the adenoviral vector from being the subject of an immune reaction which (i) limits its action and (ii) could have undesirable side effects.
  • the E3 region is deleted and the sequence coding for the protein gpl9k is reintroduced under the control of a heterologous promoter.
  • adenoviruses constitute very efficient gene transfer vectors for gene and cell therapy applications.
  • a heterologous nucleic acid sequence whose transfer and / or expression in a cell, an organ or an organism is sought can be inserted into their genome.
  • This sequence may contain one or more therapeutic genes, such as a gene whose transcription and possibly translation into the target cell generate products having a therapeutic effect.
  • therapeutic products mention may more particularly be made of enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, etc.
  • FR 9203120 growth factors, neurotransmitters or their synthetic precursors or enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; apolipoproteins: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc. (WO94 / 25073), dystrophin or a minidystrophin (WO93 / 06223), tumor suppressor genes: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc.
  • trophic factors BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc
  • apolipoproteins ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc.
  • WO93 / 06223 tumor suppressor genes: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc.
  • WO94 / 24297 genes coding for factors involved in coagulation: Factors VII, VIII, IX, etc., suicide genes: thymidine kinase, cytosine deaminase, etc; or all or part of a natural or artificial immunoglobulin (Fab, ScFv, etc., WO94 / 29446), etc.
  • the therapeutic gene can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs. Such sequences can for example be transcribed, in the target cell, into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the therapeutic gene can also be a gene encoding for an antigenic peptide capable of generating an immune response in humans, for the production of vaccines.
  • antigenic peptides capable of generating an immune response in humans, for the production of vaccines.
  • These may in particular be antigenic peptides specific for the epstein barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, or even specific for tumors (EP 259 212).
  • the heterologous nucleic acid sequence also comprises a promoter region for functional transcription in the infected cell, as well as a region located 3 ′ of the gene of interest, and which specifies a transcriptional end signal and a site for polyadenylation. All of these elements constitute the expression cassette.
  • the promoter region it may be a promoter region naturally responsible for the expression of the gene considered when it is capable of functioning in the infected cell. It can also be from regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes or any promoter or derivative sequence, stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not and in an inducible way or not.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect, or from the genome of a virus, and in particular, the promoters of the E1A, MLP genes of adenovirus, the CMV promoter, LTR-RSV, etc.
  • eukaryotic promoters include ubiquitous promoters (HPRT, vimentin, ⁇ -actin, tubulin, etc.), promoters of intermediate filaments (desmin, neurofilaments, keratin, GFAP, etc.) promoters of therapeutic genes (MDR type , CFTR, factor VIII, etc.) tissue-specific promoters (pyruvate kinase, villin, promoter of the intestinal fatty acid binding protein, promoter of actin to smooth muscle cells, specific promoters for the liver; Apo AI , Apo AU, Human albumin, etc.) or promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, etc.).
  • HPRT ubiquitous promoters
  • promoters of intermediate filaments desmin, neurofilaments, keratin, GFAP, etc.
  • promoters of therapeutic genes MDR type , CFTR, factor VIII, etc.
  • tissue-specific promoters pyruvate kinase, vi
  • these expression sequences can be modified by adding activation, regulation sequences or allowing tissue-specific or majority expression.
  • the inserted nucleic acid does not contain expression sequences, it can be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence.
  • heterologous nucleic acid sequence may also comprise, in particular upstream of the therapeutic gene, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • the therapeutic gene expression cassette can be inserted at different sites in the genome of the recombinant adenovirus, according to the techniques described in the prior art. It can first of all be inserted at the level of the El deletion. It can also be inserted at the E3 region, in addition to or in substitution for sequences. It can also be located at the level of the deleted E4 region.
  • the present invention also relates to the purified viral preparations obtained according to the process of the invention, as well as any pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant adenoviruses prepared according to this process.
  • the pharmaceutical compositions of the invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation.
  • pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation may in particular be saline solutions (monosodium phosphate, disodium phosphate, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition, as appropriate, of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • Other excipients can be used such as for example a hydrogel. This hydrogel can be prepared from any biocompatible and non-cytotoxic polymer (homo or hetero). Such polymers have for example been described in application WO93 / 08845.
  • the doses of virus used for the injection can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses between 10 ⁇ and 10 *** ⁇ pfu, and preferably 10 ° to 10 *** ⁇ pfu.
  • pfu plaque forming unit
  • plaque forming unit corresponds to the infectious power of an adenovirus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 15 days, the number of plaques of infected cells.
  • the techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the viruses thus produced can be used for the treatment or prevention of many pathologies, including genetic diseases (dystrophy, cystic fibrosis, etc.), neurodegenerative diseases (Alzheimer, Parkinson, ALS, etc.), cancers , pathologies linked to coagulation disorders or dyslipoproteinemias, pathologies linked to viral infections (hepatitis, AIDS, etc.), etc.
  • Figure 1 Study of the stability of the purified adenovirus according to Example 4.
  • Figure 2 Analysis in HPLC (reverse phase) of the purified adenovirus according to Example 4. Comparison with the adenovirus of Example 3.
  • Figure 3 Release kinetics of the Ad- ⁇ Gal adenovirus in the supernatant of 293 cells, measured by semi-quantitative PCR and Plate Assay.
  • Figure 4 Elution profile on Source Q15 of an ultrafilter adenovirus supernatant (Example 5.1).
  • FIG. 5 Analysis in HPLC Resource Q of the peak of virus harvested by chromatography on resin Source Q15 of a supernatant of adenovirus ultrafilter (example 5.1).
  • Figure 6 (A) Elution profile on Source Q15 resin of an adenovirus supernatant Ad-APOAl ultrafilter (Example 5.3); and (B) HPLC analysis (Resource Q) of the peak of harvested virus.
  • Figure 7 (A) Elution profile on Source Q15 of an adenovirus supernatant Ad-TK ultrafilter (Example 5.3). HPLC analysis (Resource Q) of the different fractions (beginning and end of peak) of harvested viruses: (B) F2 fraction, middle of the peak; (C) Fraction F3, peak bound; (D) Fraction F4, end of the peak.
  • FIG 8 Elution profile on Mono Q resin of a concentrated supernatant of culture of adenovirus producing cells (example 5.4).
  • BG25F1 Supernatant virus concentrates and purifies on cesium.
  • BG25C Supernatant infects, concentrates.
  • Figure 9 Elution profile on POROS HQ gel of a concentrated supernatant from the culture of adenovirus producing cells (Example 5 4) BG25F1 Supernatant virus concentrated and purified on cesium BG25C Infectant supernatant, concentrated
  • Figure 1 Analysis by electron microscopy of a purified adenovirus stock according to the invention
  • the plasmids of the pBR322, pUC type and the phages of the Ml 3 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories)
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose gels or acrylamide, extracts with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol then incubated in the presence of phage T4 DNA ligase (Biolabs) according to the supplier's recommendations
  • the filling of the prominent 5 'ends can be carried out by the Klenow fragment of E coli DNA Polymerase I (Biolabs) according to supplier's specifications Destruction of the prominent 3 'ends is carried out in the presence of phage DNA Polymerase T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease SI.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 12 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
  • Enzymatic amplification of DNA fragments by the technique called PCR can be performed using a "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer's specifications. Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham.
  • Example 1 Cell lines for packaging
  • the packaging cells used in the context of the invention can come from any cell line infectable with an adenovirus, compatible with use for therapeutic purposes. It is more preferably a cell chosen from the following lines:
  • Line 293 is a line of human kidney embryonic cells containing the left end (approximately 11-12%) of the genome of the adenovirus serotype 5 (Ad5), comprising the left ITR, the packaging region, the El region, including Ela, Elb, the region coding for the pIX protein and part of the region coding for the pIVa2 protein (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59 ).
  • Ad5 adenovirus serotype 5
  • This line is capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the E1 region, that is to say devoid of all or part of the E1 region, and to produce viral stocks having high titers -
  • the cells of the A549 line are capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the E1 region, that is to say devoid of all or part of the E1 region, and to produce viral stocks having high titers -
  • the cells of the A549 line are capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the E1 region, that is to say devoid of all or part of the E1 region, and to produce viral stocks having high titers -
  • the cells of the A549 line are capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the E1 region, that is to say devoid of all or part of the E1 region, and to produce viral stocks having high titers
  • Cells complementing the E1 region of the adenovirus were constructed from A549 cells (Imler et al., Gene Ther. (1996) 75). These cells contain a fragment of the El region, devoid of the left ITR, placed under the control of an inducible promoter.
  • HER Human retinal embryonic cells
  • adenovirus Bactet al., Oncogene 2 (1988) 477
  • Adenovirus packaging cells prepared from these cells have been described for example in application WO94 / 28152 or in the article by Fallaux et al. (Hum.Gene Ther. (1996) 215).
  • Mention may more particularly be made of the line 911 comprising the E1 region of the genome of the adenovirus Ad5, from nucleotide 79 to nucleotide 5789 integrated into the genome of HER cells. This cell line allows the production of viruses defective for the E1 region.
  • IGRP2 cells are cells obtained from 293 cells, by integration of a functional unit of the E4 region under the control of an inducible promoter. These cells allow the production of viruses defective for the E1 and E4 regions (Yeh et al., J. Virol (1996) 70).
  • VK cells (VK2-20 and VK10-9) are cells obtained from 293 cells, by integration of the entire E4 region under the control of an inducible promoter, and of the region coding for the protein pIX. These cells allow the production of viruses defective for the E1 and E4 regions (Krougliak et al., Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1575).
  • the 293E4 cells are cells obtained from 293 cells, by integration of the entire E4 region. These cells allow the production of viruses defective for the El and E4 regions (WO95 / 02697; Cancer Gene Ther. (1995) 322).
  • viruses produced in the context of the following examples are an adenovirus containing the LacZ marker gene from E. coli (Ad- ⁇ Gal), an adenovirus containing the gene coding for the herpes virus type I thymidine kinase (Ad-TK ), an adenovirus containing the gene encoding the human p53 tumor suppressor protein and a virus encoding the apolipoprotein A1 (Ad-apoAI). These viruses are derived from the Ad5 serotype and have the following structure:
  • a deletion in the E1 region covering for example, nucleotides 382 (Hinfl site) to 3446 (Sau3a site).
  • any other construct can be produced according to the method of the invention, and in particular viruses carrying other heterologous genes and / or other deletions (E1 / E4 or E1 / E2 for example).
  • This example reproduces the prior technique of virus production, consisting in lysing the packaging cells to recover the viruses produced.
  • the incubation lasts from 40 to 72 hours, the harvest timing being judged by the observation under the microscope of the cells which round, become more refractive and adhere more and more weakly to the culture support.
  • the kinetics of the viral cycle last from 24 to 36 hours.
  • the concentration factor is depending on the size of the culture of the order of 10 to 100 times.
  • the virus is then released from the nucleus by 3 to 6 successive thawing cycles (dry ice ethanol at -70 ° C, water bath at 37 ° C)
  • the cell lysate obtained is then centrifuged at low speed (2000 at 4000 rpm) and the supernatant (clarified cell lysate) is then purified by ultracentrifugation in cesium chloride gradient in two stages:
  • the rotors can be 'swinging' rotors (Sw28, S 41 Beckman) or fixed angle (Ti 45, Ti 70, Ti 70.1 Beckman) depending on the volumes to be treated;
  • a second ultracentrifugation in a longer gradient (from 10 to 40 hours depending on the rotor used), for example 18 hours at 35,000 rpm in sw 41 rotor which constitutes the true and unique purification of the virus.
  • the virus is found in a linear gradient at equilibrium at a density of 1.34.
  • the virus band is in the majority. Sometimes, however, two less dense, thin bands are observed, which observation by electron microscopy has shown that they were empty or broken viruses and for the less dense band of viral subunits (pentons, hexons). After this stage, the virus is harvested in the tube by needle puncture and the cesium is eliminated by dialysis or desalting on G25.
  • EXAMPLE 4 Production of Viruses in the Supernatant This example describes an experiment in virus production by recovery after spontaneous release. The virus is then harvested by ultrafiltration, then purified by cesium chloride.
  • the cells are not harvested 40 to 72 hours post-infection, but the incubation is prolonged between 8 to 12 days so as to obtain a total lysis of the cells without the need to proceed freezing and thawing cycles.
  • the virus is found in the supernatant.
  • the supernatant is then clarified by filtration through filters with decreasing porosity depth (10 ⁇ m / 1.0 ⁇ m / 0.8-0.2 ⁇ m).
  • the virus has a size of 0.1 ⁇ m and at this stage we did not observe any loss of virus by retention on the filter with the lowest porosity (0.22 ⁇ m)
  • the supernatant once clarified is then concentrated by tangential ultrafiltration on a Millipore spiral membrane having a cutoff threshold of 300 kDa.
  • the concentration factor is dictated by the dead volume of the system which is 100 ml. Volumes of supernatant from 4 to 20 liters were concentrated with this system, making it possible to obtain volumes of concentrate from 100 ml to 200 ml without difficulty, which corresponds to a concentration factor of 20 to 100 times.
  • the concentrate is then filtered through 0.22 ⁇ m and then purified by centrifugation on cesium chloride as described in Example 3, followed by a dialysis step.
  • the intracellular virus tube presents a cloudy appearance with a coagulum (lipids, proteins) sometimes coming to touch the band of virus
  • the viral preparation obtained after the first stage of centrifugation on cesium chloride by the procedure of The invention presents a band of virus already well isolated from the environmental contaminants which persist in the upper phase.
  • the analysis in high performance liquid chromatography on a Resource Q column also shows this gain in purity of the starting material obtained by ultrafiltration of infected supernatant with a reduction in nucleic acid contaminants (DO 260/280 ratio greater than or equal to 1.8) and protein (DO 260/280 ratio less than 1).
  • the stability of the virus was determined by titration by the plate assay method of an infectious culture supernatant from which aliquots were taken at different incubation times at 37 ° C. post-infection. The results are presented below:
  • Ad-TK virus Ad-TK virus
  • This parameter corresponding to the ratio of the number of viral particles measured by HPLC to the number of pfu, accounts for the infectious power of the viral preparations. According to FDA recommendations, it should be less than 100.
  • This parameter was measured as follows: Two series of culture flasks containing 293 cells were infected in parallel at the same time with the same viral prestock under the same conditions. This experiment was carried out for a recombinant Ad-bgal adenovirus, then repeated for an Ad-TK adenovirus. For each adenovirus, a series of vials is harvested 48 hours post-infection and is considered to be a production of purified intracellular virus on a cesium gradient after freezing and thawing.
  • the other series is incubated 10 days post-infection and the virus is harvested from the supernatant.
  • the purified preparations obtained are titrated by assay plate and the quantification of the number of total viral particles is determined by measuring the concentration of PVII protein by reverse phase HPLC on a C4 Vydac 4.6 ⁇ 50 mm column after denaturation of the samples in 6.4M guanidine. .
  • Protocol 20 ⁇ l of sample are placed on a carbon grid and then treated for observation in negative staining with 1.5% uranyl acetate. For observation, a Jeol 1010 electron microscope from 50 kV to 100 kV is used.
  • Figure 2 shows the overlay of 3 chromatograms obtained from two virus samples collected intracellularly and a virus sample purified by the supernatant method.
  • the chromatograms show a perfect identity between the samples, with no difference in the relative intensities of each peak. The nature of each peak was determined by sequencing and demonstrates that the proteins present are all of viral origin (see table below).
  • the cytotoxicity analysis is carried out by infecting HCT116 cells in 24-well plates for increasing MOIs and by determining the percentage of living cells compared to an uninfected control, 2 and 5 days post-infection, using the technique of staining with violet crystal. The results are shown in the table below:
  • the transduction efficiency of a preparation is determined by infecting W162 cells, non-permissive to replication, cultured in 24-well plates, with increasing concentrations of viral particles. For the same quantity of viral particles deposited, there are, 48 hours post-infection, the cells expressing the betagalactosidase activity after incubation with X-gal as substrate. Each blue cell is counted as a transduction unit (TDU), the result is multiplied by the dilution of the sample in order to obtain the concentration in unit of transductions of the sample. The transduction efficiency is then expressed by making the ratio of the concentration of viral particles to the concentration of TDU. The results obtained show that the purified viruses exhibit good transduction efficiency in vitro.
  • TDU transduction unit
  • the adenoviruses were injected stereotaxically into the striatum of OF1 immunocompetent mice. For this, volumes of l ⁇ l to 10 'pfu of virus were injected at the following stereotaxic landmarks (for the 0mm incisor bar): Anteroposterior: +0.5; Medio-lateral: 2; Depth: -3.5.
  • the brains were analyzed 7 days after the injection. The results obtained show that the transduction efficiency is high: thousands of transduced cells, very intense expression in the nucleus and frequent and intense diffusion in the cytoplasm.
  • This example describes a study of the kinetics of release of adenoviruses in the culture supernatant of packaging cells.
  • the amount of adenovirus released into the supernatant was determined on a supernatant of 293 cells infected with Ad- ⁇ Gal, at different post-infection times. The results obtained are shown in Figure 3. They show that cell release begins from the 5th or 6th day post infection.
  • virus determination technique can be used for the same purpose, on any other packaging line, and for any type of adenovirus.
  • EXAMPLE 5 Purification of the Virus by Ultrafiltration and Ion Exchange This example illustrates how the adenovirus contained in the concentrate can be purified directly and in a single chromatographic step of ion exchange, with very high yields.
  • the starting material therefore consists of the concentrate
  • This retentate has a total protein content of between 5 and 50 mg / ml, and more preferably between 10 and 30 mg / ml, in PBS buffer (10 mM phosphate , pH 7.2 containing 150 mM NaCl).
  • the ultrafiltration supernatant obtained from a virus preparation is injected into a column containing Source Q 15 (Pharmacia) equilibrated in 50 mM Tris / HCl buffer pH 8.0 containing 250 mM NaCl, 1.0 mM MgC12, and 10% glycerol (buffer A). After rinsing with 10 column volumes of buffer A, the adsorbed species are eluted with a linear gradient of NaCl (250 mM to 1 M) on 25 column volumes at a linear flow rate of 60 to 300 cm / h, more preferably 12 cm / h. The typical elution profile obtained at 260 nm is presented in FIG. 4. The fraction containing the viral particles is collected.
  • the fraction collected has a purity of 98% in viral particles (UV detection at 260 nm), when it is analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) on a column of Resouce Q (1 ml) in a following chromatographic system: 10 ⁇ l of the fraction purified by chromatography as described in Example 5.1 are injected onto a Resource Q15 column (1 ml of gel; Pharmacia) balanced in 50 mM Tris / HCl buffer pH 8.0 (buffer B) . After rinsing with 5 ml of buffer B, the adsorbed species are eluted with a linear gradient of 30 ml of NaCl (0 to 1 M) in buffer B at a flow rate of 1 ml / min.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the electrophoresis analysis of the purified adenoviral fraction by chromatography is carried out on polyacrylamide gel (4-20%) under denaturing conditions (SDS). The protein bands are then revealed with silver nitrate.
  • adenoviral preparation obtained by chromatography has a level of purity at least equal to that of the preparation conventionally maintained by ultracentrifugation since it does not have an additional protein band which would indicate contamination of the preparation with non-adenoviral proteins.
  • the adenoviral preparation obtained by chromatography has an absorbance ratio A 2 60 nm At 280 nm equal to 1.30 ⁇ 0.05. This value, which is identical to that obtained for the best preparations obtained by ultracentrifugation, indicates that the preparation is devoid of contaminating proteins or contaminating nucleic acids.
  • Example 4.2 The analysis by electron microscopy carried out under the conditions described in Example 4.2 on an Ad- ⁇ gal virus purified by chromatography shows a clean preparation, without contaminants, without aggregates and without empty viral particles (FIG. 11).
  • the ultracentrifugation in cesium chloride gradient of this preparation reveals a single band of density 1.30, which confirms the absence of contamination of the chromatographic preparations by possible empty particles or fragments of capsids.
  • the chromatographic peak of the virus is followed by a shoulder (or secondary peak) in its rear part, which is not collected with the main peak.
  • the cesium chloride gradient ultracentrifugation of this fraction reveals a density band 1.27, and analysis of the composition of this fraction shows that it does not contain nucleic acids.
  • adenoviruses comprising a therapeutic gene such as the genes coding for the ApoAl proteins or thimidine kinase.
  • This example illustrates how adenoviruses comprising in their genomes heterologous nucleic acid sequences encoding proteins can be purified directly and in a single chromatographic ion exchange step. It also shows that the chromatographic behavior of the adenovirus is independent of the heterologous nucleic acid sequences that it carries, which makes it possible to implement the same purification process for different adenoviruses carrying diverse heterologous nucleic acid sequences.
  • an adenovirus comprising in its genome a heterologous nucleic acid sequence coding for the ApoAl protein (Example 2, WO94 / 25073) is purified by chromatography, in the system described in Example 5.1, 18 ml (72 mg of proteins; 1.08 x 10 3 particles) of concentrated supernatant from a cell culture harvested 10 days post-infection (FIG. 6A).
  • the peak of viral particles collected after chromatography contained 9.98 x 10 12 particles, which indicates a particle yield of 92% and a purification factor of 51.
  • an adenovirus comprising in its genome a heterologous nucleic acid sequence coding for the herpes simplex protein thimidine kinase type 1 (Example 2, WO95 / 14102) is purified by chromatography in the system described in Example 5.1. 36 ml (180 mg protein; 4.69 x 10 13 particles) of concentrated cell culture supernatant (Figure 7A). The peak of viral particles collected after chromatography (20 ml; 5.6 mg of protein) contained 4.28 x 10 n particles, which indicates a particle yield of 91% and a purification factor of 32.
  • This example illustrates how an adenovirus comprising in its genome a heterologous nucleic acid sequence can be purified directly in a single chromatographic step of ion exchange from a lysate of packaging cells producing said virus.
  • an adenovirus comprising in its genome a heterologous nucleic acid sequence coding for the ⁇ -gal protein is purified by chromatography in the system described in example 5.1 (column
  • FineLine Pilot 35, Pharmacia 100 ml of Source 15Q resin), 450 ml (i.e. 2.5 x 10 * 4 particles) of concentrated lysate from a cell culture harvested 3 days post-infection by chemical lysis (1% Tween-20).
  • the peak of viral particles collected after chromatography 110 ml contained 2.15 x 10 4 particles, which indicates a particle yield of 86%. After this purification step, the fraction collected had a purity greater than 98% in viral particles during the chromatographic analysis under the conditions described in 5.2.
  • Example 5.2 The electrophoresis analysis of the purified adenoviral fraction by chromatography carried out under the conditions described in Example 5.2 showed that this preparation had a level of purity at least equal to that of a preparation obtained conventionally by ultracentrifugation, and that it is devoid of contaminating proteins or contaminating nucleic acids. 5.5. Purification of the virus by ultrafiltration and ion exchange chromatography on different columns.
  • This example illustrates how the adenovirus contained in the concentrate can be purified directly and in a single chromatographic ion exchange step using a gel different from the Source 15 Q support, while operating on the same separation principle, anion exchange by interaction with quaternary amino groups in the matrix.
  • Source Q30 gel can therefore be suitable for the purification of recombinant adenoviruses, even if its properties remain inferior to those of Source Q15 (purity on the order of 99%, efficiency on the order of 8000 and ability to 2.5 to 5 10 12 pv per ml).
  • a ⁇ -Gal adenovirus is purified by chromatography on a column of MonoQ HR 5/5 according to the protocol described in Example 5.1.
  • the chromatographic image corresponding to the ultrafiltration retentate and to the purified viral preparation thus obtained is illustrated in FIG. 8.
  • a ⁇ -Gal adenovirus is purified by chromatography on a Poros HQ / M column following the protocol described in Example 5.1.
  • the corresponding chromatographic image to the ultrafiltration retentate and to the purified viral preparation thus obtained is illustrated in FIG. 9.
  • This example illustrates how the adenovirus contained in the concentrate (ultrafiltration retentate) can be purified directly by gel permeation chromatography, with very high yields.
  • the resolution of the two gel permeation chromatographic systems described above can be advantageously improved by chromatographing the ultrafiltration supernatant (200 ⁇ l) on a system of 2 columns HR 10/30 (Pharmacia) coupled in series (Sephacryl S column -1000HR or S-2000 followed by a column of Superdex 200 HR) equilibrated in buffer C.
  • the species are eluted with buffer C at a flow rate of 0.5 ml / min and detected in UV at 260 nm.
  • the peak of viral particles is very clearly better separated from the lower molecular weight species than in the system comprising a Sephacryl S-1000 HR or Sephacryl S-2000 column alone.
  • Example 7 Purification of the virus by Ultrafiltration. Ion exchange and gel permeation
  • the fraction of viral particles resulting from anion exchange chromatography can advantageously be chromatographed in one of the gel permeation chromatographic systems described above, for example in order to further improve the level purity of the viral particles, but also mainly for the purpose of conditioning the viral particles in a compatible or adapted medium for subsequent uses of the viral preparation (injection, etc.).

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour la production d'adénovirus recombinants selon lequel l'ADN viral est introduit dans une culture de cellules d'encapsidation et les virus produits sont récoltés après libération dans le surnageant. Elle concerne également les virus produits et leur utilisation.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION D' ADENOVIRUS RECOMBINANTS
La présente invention concerne un nouveau procédé pour la production d'adénovirus recombinants. Elle concerne également les préparations virales purifiées produites selon ce procédé.
Les adenovirus présentent certaines propriétés particulièrement avantageuses pour une utilisation comme vecteur de transfert de gènes en thérapie génique. Notamment, ils ont un spectre d'hôte assez large, sont capables d'infecter des cellules quiescentes, ne s'intègrent pas au génome de la cellule infectée, et n'ont pas été associés à ce jour à des pathologies importantes chez l'homme. Les adenovirus ont ainsi été utilisés pour transférer des gènes d'intérêt dans le muscle (Ragot et al., Nature 361 (1993) 647), le foie (Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372), le système nerveux (Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224), etc.
Les adenovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 (kilobases) kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El , E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions Ll à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Adl2, etc) ont également été séquencées.
Pour leur utilisation en thérapie génique, différents vecteurs dérivés des adenovirus ont été préparés, incorporant différents gènes thérapeutiques. Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adenovirus délétés de la région El, essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195 ; Gosh-Choudhury et al., Gène 50 (1986) 161). Par ailleurs, pour améliorer les propriétés du vecteur, il a été proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant tsl25, permettant d'inactiver la protéine de 72kDa de liaison à l'ADN (DBP) (Van der Vliet et al., 1975). D'autres vecteurs comprennent une deletion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale, la région E4. La région E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adénoviraux dans lesquels les régions El et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits. De tels vecteurs ont ete décrits pas exemple dans les demandes WO94/28152, WO95/02697, PCT/FR96/00088). En outre, des vecteurs portant une modification au niveau du gène IVa2 ont également été décrits (WO96/10088).
Les adenovirus recombinants décrits dans la littérature sont produits a partir de différents sérotypes d'adénovirus. Il existe en effet différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Plus particulièrement, les adenovirus recombinants peuvent être d'origine humaine ou animale. Concernant les adenovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C, en particulier les adenovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) ou 12 (Adl2). Parmi les différents adenovirus d'origine animale, on peut citer préférentiellement les adenovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adenovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. D'autres adenovirus d'origine animale sont cités notamment dans la demande WO94/26914 incorporée à la présente par référence.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, l'adénovirus recombinant est un adenovirus humain du groupe C. De manière plus préférentielle, il s'agit d'un adenovirus Ad2 ou Ad5. Les adenovirus recombinants sont produits dans une lignée d'encapsidation, c'est-à-dire une lignée de cellules capables de complémenter en trans une ou plusieurs des fonctions déficientes dans le génome adénoviral recombinant. L'une de ces lignées est par exemple la lignée 293 dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée. Plus précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires humaines de rein contenant l'extrémité gauche (environ 11-12 %) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation, la région El, incluant Ela et Elb, la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine pIVa2. Cette lignée est capable de trans- complémenter des adenovirus recombinants défectifs pour la région El, c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la région El, et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés. Cette lignée est également capable de produire, à température permissive (32°C), des stocks de virus comportant en outre la mutation E2 thermosensible. D'autres lignées cellulaires capables de complémenter la région El ont été décrites, basées notamment sur des cellules de carcinome de poumon humain A549 (WO94/28152) ou sur des rétinoblastes humains (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Par ailleurs, des lignées capables de trans-complémenter plusieurs fonctions de l'adénovirus ont également été décrites. En particulier, on peut citer des lignées complémentant les régions El et E4 (Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559 ; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322 ; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) et des lignées complémentant les régions El et E2 (WO94/28152, WO95/02697, WO95/27071).
Les adenovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse des cellules après environ 2 ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 2Λ à 36 heures). Après la lyse des cellules, les particules virales recombinantes sont isolées par centrifugation en gradient de chlorure de césium.
Pour la mise en oeuvre du procédé, l'ADN viral introduit peut être le génome viral recombinant complet, éventuellement construit dans une bactérie (WO96/25506) ou dans une levure (WO95/03400) , transfecté dans les cellules. Il peut également s'agir d'un virus recombinant utilisé pour infecter la lignée d'encapsidation. L'ADN viral peut aussi être introduit sous forme de fragments portant chacun une partie du génome viral recombinant et une zone d'homologie permettant, après introduction dans la cellule d'encapsidation, de reconstituer le génome viral recombinant par recombinaison homologue entre les différents fragments. Un procédé classique de production d'adénovirus comprend ainsi les étapes suivantes : Les cellules (par exemple les cellules 293) sont infectées en boite de culture avec un préstock viral à raison de 3 à 5 particules virales par cellule (Multiplicity of Infection (MOI) = 3 à 5), ou transfectées avec l'ADN viral. L'incubation dure ensuite de 40 à 72 heures. Le virus est alors libéré du noyau par lyse des cellules, généralement par plusieurs cycles de décongélation successifs. Le lysat cellulaire obtenu est ensuite centrifugé à basse vitesse (2000 à 4000 rpm) et le surnageant (lysat cellulaire clarifié) est ensuite purifié par centrifugation en présence de chlorure de césium en deux étapes :
- Une première centrifugation rapide de 1,5 heure sur deux couches de chlorure de césium de densités 1,25 et 1,40 encadrant la densité du virus (1,34) de façon à séparer le virus des protéines du milieu;
- Une deuxième centrifugation en gradient plus longue (de 10 à 40 heures selon le rotor utilisé), qui constitue la véritable et unique étape de purification du virus.
Généralement, après la seconde étape de centrifugation, la bande du virus est majoritaire. On observe néanmoins deux bandes moins denses, fines, dont l'observation en microscopie électronique a montré qu'il s'agissait de particules virales vides ou cassées pour la bande la plus dense, et de sous unités virales (pentons, hexons) pour la bande la moins den.se. Après cette étape, le virus est récolté par ponction à l'aiguille dans le tube de centrifugation et le césium est éliminé par dialyse ou dessalage.
Bien que les niveaux de pureté obtenus soient satisfaisants, ce type de procédé présente cependant certains inconvénients. En particulier, il est basé sur l'emploi de chlorure de césium, qui est un réactif incompatible avec une utilisation thérapeutique chez l'homme. De ce fait, il est impératif d'éliminer le chlorure de césium à l'issue de la purification. Ce procédé présente en outre certains autres inconvénients mentionnés plus loin, limitant son utilisation à une échelle industrielle. Pour remédier a ces problèmes, il a été proposé de purifier le virus obtenu après la lyse, non pas par gradient de chlorure de césium, mais par chromatographie. Ainsi, l'article de Huyghe et al. (Hum. Gen. Ther. 6 (1996) 1403) décrit une étude de différents types de chromatographies appliquée a la purification d'adénovirus recombinants. Cet article décrit notamment une étude de purification d'adénovirus recombinants utilisant une chromatographie d'échange d'anions faible (DEAE). Des travaux antérieurs décrivaient déjà l'utilisation de ce type de chromatographie dans ce but (Klemperer et al., Virology 9 (1959) 536 ; Philipson L., Virology 10 (1960) 459 ; Haruna et al., Virology 13 (1961) 264). Les résultats présentés dans l'article de Huyghe et al. montrent une efficacité assez médiocre du protocole de chromatographie par échange d'ions préconisé. Ainsi, la résolution obtenue est moyenne, les auteurs indiquant que des particules de virus sont présentes dans plusieurs pics chromatographiques ; le rendement est faible (rendement en particules virales : 67 %; rendement en particules infectieuses : 49 %); et la préparation virale obtenue à la suite de cette étape chromatographique est impure. En outre, un prétraitement du virus par différentes enzymes/protéines est nécessaire. Ce même article décrit par ailleurs une étude de l'utilisation de la chromatographie de perméation de gel, démontrant une très mauvaise résolution et des rendements très faibles (15-20 %).
La présente invention décrit un nouveau procédé de production d'adénovirus recombinants. Le procédé selon l'invention résulte de modifications des procédés antérieurs au niveau de la phase de production et/ou au niveau de la phase de purification. Le procédé selon l'invention permet maintenant d'obtenir de manière très rapide et industrialisable, des stocks de virus en quantité et de qualité très élevées.
L'un des premiers aspects de l'invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'adénovirus recombinants dans lequel les virus sont récoltés à partir du surnageant de culture. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'adénovirus comprenant une étape d'ultrafiltration. Selon un autre aspect, l'invention concerne également un procédé de purification d'adénovirus recombinants comprenant une étape de chromatographie d'échange d'anions. La présente invention décrit également un procédé amélioré de purification utilisant une chromatographie de perméation de gel, éventuellement couplée à une chromatographie d'échange d'anions. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des virus de qualité élevée, en terme de pureté, de stabilité, de morphologie, et d'infectivité, avec des rendements très élevés et dans des conditions production entièrement compatibles avec les exigences industrielles et avec la réglementation concernant la production de molécules thérapeutiques.
En particulier, en terme d'industrialisation, le procédé de l'invention utilise des méthodes de traitement de surnageants de cultures éprouvées à large échelle pour des protéines recombinantes, telles que la microfiltration ou filtration profondeur, et ultrafiltration tangentielle. Par ailleurs, du fait de la stabilité du virus à 37°C, ce procédé permet une meilleure organisation au stade industriel dans la mesure où, contrairement à la méthode intracellulaire, le temps de récolte n'a pas besoin d'être précis à la demi-journée près. De plus, il garantit une récolte maximum du virus, ce qui est particulièrement important dans le cas des virus défectifs dans plusieurs régions. D'autre part, le procède de l'invention permet un suivi plus facile et plus précis de la cinétique de production, directement sur des échantillons homogènes de surnageant, sans prétraitement, ce qui permet une meilleure reproductibilité des productions. Le procédé selon l'invention permet aussi de s'affranchir de l'étape de lyse des cellules. La lyse des cellules présente plusieurs inconvénients. Ainsi, il peut être difficile d'envisager de casser des cellules par des cycles de congélation -décongélation au niveau industriel. Par ailleurs, les méthodes alternatives de lyse (Dounce, X-press, sonication, cisaillement mécanique, etc) présentent des inconvénients : elles sont potentiellement génératrices d'aérosols difficiles à confiner pour des virus L2 ou L3 (niveau de confinement des virus, dépendant de leur pathogenicite ou de leur mode de dissémination), ces virus ayant par ailleurs tendance à être infectieux par voie aérienne; elles engendrent des forces de cisaillement et/ou une libération de chaleur difficiles a contrôler, et diminuant l'activité des préparation. La solution d'utiliser des détergents pour lyser les cellules demanderait à être validée et nécessiterait en outre une validation de l'élimination du détergent. Enfin, la lyse cellulaire conduit à la présence dans le milieu de nombreux débris cellulaires, qui rendent plus délicate la purification. En terme de qualité de virus, le procédé de l'invention permet potentiellement une meilleure maturation du virus conduisant à une population plus homogène. En particulier, dans la mesure où l'empaquetage de l'ADN viral est la dernière étape du cycle viral, la lyse prématurée des cellules libère potentiellement des particules vides qui, bien que non réplicatives, sont a priori infectieuses et à même de p.articiper à l'effet toxique propre du virus et d'augmenter le ratio d'activité spécifique des préparations obtenues. Le ratio d'infectivité spécifique d'une préparation est défini comme le rapport du nombre total de particules virales, mesuré par des méthodes biochimiques (DO260nm, CLHP, PCR, méthodes imuno-enzymatiques, etc) sur le nombre de particules virales générant un effet biologique (formation de plages de lyse sur cellules en culture en milieu solide, transduction de cellules). En pratique, pour une préparation purifiée, ce ratio est déterminé en faisant le rapport de la concentration des particules mesurée par DO à 260nm sur la concentration d'unités formant plage de la préparation. Ce ratio doit être inférieur à 100.
Les résultats obtenus montrent que le procédé de l'invention permet d'obtenir un virus d'une pureté au moins égale à son homologue purifié par centrifugation en gradient de chlorure de césium, en une seule étape et sans traitement préalable, en partant d'un surnageant viral concentré.
Un premier objet de l'invention concerne donc un procédé de production d'adénovirus recombinants caractérisé en ce que l'ADN viral est introduit dans une culture de cellules d'encapsidation et les virus produits sont récoltes après libération dans le surnageant de la culture. Contrairement aux procédés antérieurs dans lesquels les virus sont récoltés suite à une lyse cellulaire prématurée effectuée de façon mécanique ou chimique, dans le procédé de l'invention, les cellules ne sont pas lysées par l'intervention d'un facteur extérieur. La culture est poursuivie pendant une durée plus longue, et les virus sont récoltés directement dans le surnageant, après libération spontannée par les cellules d'encapsidation. Le virus selon l'invention est ainsi récupéré dans le surnageant cellulaire, alors que dans les procédés antérieurs, il s'agit d'un virus intracellulaire, plus particulièrement intranucléaire. La demanderesse a maintenant montré que, malgré l'allongement de la durée de la culture et malgré la mise en oeuvre de volumes plus grands, le procédé selon l'invention permet de générer des particules virales en quantité élevée et de meilleure qualité. En outre, comme indiqué ci-avant, ce procédé permet d'éviter les étapes de lyse qui sont lourdes au niveau industriel et génèrent de nombreuses impuretés.
Le principe du procédé repose donc sur la récolte des virus libérés dans le surnageant. Ce procédé peut impliquer un temps de culture supérieur à celui des techniques antérieures basées sur la lyse des cellules. Comme indiqué ci-avant, le temps de récolte n'a pas à être précis à la demi-journée près. Il est essentiellement déterminé par la cinétique de libération des virus dans le surnageant de culture.
La cinétique de libération des virus peut être suivie de différentes manières. En particulier, il est possible d'utiliser des méthodes d'analyses telles que la RP-HPLC, la IE-HPLC, la PCR semi-quantitative (exemple 4.3), la coloration des cellules mortes au bleu trypan, la mesure de la libération d'enzymes intracellulaires du type LDH, la mesure des particules dans le surnageant par des appareils de type Coulter ou par diffraction de la lumière, des méthodes immunologiques (ELISA, RIA, etc) ou nephelometriques, la titration par aggrégation en présence d'anticorps, etc.
D'une manière préférée, la récolte est réalisée lorsque 50 % au moins des virus ont été libérés dans le surnageant. Le temps ou 50 % des virus ont été libérés peut être aisément déterminé en réalisant une cinétique selon les méthodes décrites ci-dessus. Encore plus préférentiellement, la récolte est réalisée lorsque 70 % au moins des virus ont été libérés dans le surnageant. Il est particulièrement préféré d'effectuer la récolte lorsque 90 % au moins des virus ont été libérés dans le surnageant, c'est-à-dire lorsque la cinétique atteint un plateau. La cinétique de libération du virus repose essentiellement sur le cycle de réplication de l'adénovirus, et peut être influencée par certains facteurs. En particulier, elle peut varier selon le type de virus utilisé, et notamment selon le type de deletion effectue dans le génome virai recombinant. En particulier, la deletion de la région E3 semble retarder la libération du virus. Ainsi, en présence de la région E3, le virus peut être récolte des 24-48 heures post infection. En revanche, en l'absence de la région E3, un temps de culture supérieur semble nécessaire. A cet égard, la demanderesse a effectué des expérience de cinétique de libération d'un adenovirus déficient pour les régions El et E3 dans le surnageant des cellules, et montré que la libération débute 4 a 5 jours environ post-infection, et dure jusqu'au jour 14 environ. La libération atteint généralement un plateau entre le jour 8 et le jour 14, et le titre reste stable au moins 20 jours post-infection.
Préférentiellement, dans le procédé de l'invention, les cellules sont cultivées pendant une période comprise entre 2 et 14 jours. Par ailleurs, la libération du virus peut être induite par expression dans la cellule d'encapsidation d'une protéine, par exemple virale, impliquée dans la libération du virus. Ainsi, dans le cas de l'adénovirus, la libération peut être modulée par expression de la protéine Death codée par la région E3 de l'adénovirus (protéine E3-11.6K), éventuellement exprimée sous contrôle d'un promoteur inductible. De ce fait, il est possible de réduire le temps de libération des virus et de récolter dans le surnageant de culture, plus de 50% des virus 24-48 heures post- infection.
Pour récupérer les particules virales, le surnageant de culture est avantageusement préalablement filtré. L'adénovirus ayant une taille de O.lμm environ (120nm), la filtration est réalisée au moyen de membranes ayant une porosité suffisamment importante pour laisser passer le virus, mais suffisamment fine pour retenir les contaminants. De préférence, la filtration est réalisée au moyen de membranes ayant une porosité supérieure a 0,2μm. Selon un mode de mise en oeuvre particulièrement avantageux, la filtration est réalisée par filtrations successives sur des membranes de porosité décroissante. Des résultats particulièrement bons ont été obtenus en réalisant la filtration sur des filtres profondeur de porosité décroissante lOμm, l.Oμm puis 0,8-0,2μm. Selon une autre variante préférée, la filtration est réalisée par microfiltration tangentielle sur membranes planes ou fibres creuses. On peut utiliser plus particulièrement des membranes planes Millipore ou des fibres creuses ayant une porosité comprise entre 0,2 et 0,6μm. Les résultats présentés dans les exemples montrent que cette étape de filtration a un rendement de 100 % (aucune perte de virus n'a été observée par rétention sur le filtre ayant la plus faible porosité).
Selon un autre aspect de l'invention, la demanderesse a maintenant mis au point un procédé permettant de récolter et purifier le virus a partir du surnageant. A cet effet, le surnageant ainsi filtré (ou clarifié) est .soumis à une ultrafiltration. Cette ultrafiltration permet (i) de concentrer le surnageant, les volumes impliqués étant important, (ii) d'effectuer une première purification du virus et (iii) d'ajuster le tampon de la préparation aux étapes ultérieures de préparation. Selon un mode de réalisation préféré, le surnageant est soumis a une ultrafiltration tangentielle. L'ultrafiltration tangentielle consiste a concentrer et fractionner une solution entre deux compartiments, rétentat et filtrat, séparés par des membranes de seuils de coupure déterminés, en réalisant un flux dans le compartiment rétentat du dispositif et en appliquant une pression transmenbranaire entre ce compartiment et le compartiment filtrat. Le flux est généralement realise au moyen d'une pompe dans le compartiment rétentat du dispositif et la pression transmenbranaire est contrôlée au moyen d'une vanne sur la veine liquide du circuit rétentat ou d'une pompe à débit variable sur la veine liquide du circuit filtrat. La vitesse du flux et la pression transmembranaire sont choisis de façon à générer peu de forces de cisaillement (nombre de reynolds inférieur à 5000 sec"1, préférentiellement inférieur à 3000 sec"1, pression inférieure à 1.0 bar) tout en évitant le colmatage des membranes. Différents systèmes peuvent être utilises pour réaliser l'ultrafiltration, comme par exemple des membranes spirales (Millipore, Amicon), membranes planes ou fibres creuses (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor). L'adénovirus ayant une masse de 1000 kDa environ, on utilise avantageusement dans le cadre de l'invention des membranes ayant un seuil de coupure inférieur a 1000 kDa, de préférence compris entre 100 kDa et 1000 kDa. L'utilisation de membranes ayant un seuil de coupure de 1000 kDa ou supérieur entraine en effet une perte importante de virus à cette étape. Préférentiellement, on utilise des membranes ayant un seuil de coupure compris entre 200 et 600 kDa, encore plus préférentiellement, entre 300 et 500 kDa. Les expériences présentées dans les exemples montrent que l'emploi d'une membrane ayant un seuil de coupure à 300 kDa permet la rétention de plus de 90% des particules virales tout en éliminant des contaminants du milieu (ADN, protéines du milieu, protéines cellulaires, etc.). L'utilisation d'un seuil de coupure de 500 kDa offre les mêmes avantages.
Les résultats présentés dans les exemples montrent que cette étape permet de concentrer des volumes de surnageant importants, sans perte de virus (rendement de 90%), et qu'elle génère un virus de meilleure qualité. En particulier, des facteurs de concentration de 20 à 100 fois peuvent être obtenus aisément.
Cette étape d'ultrafiltration constitue ainsi une purification supplémentaire par rapport au schéma classique dans la mesure où les contaminants de masse inférieure au seuil de coupure (300 ou 500 kDa) sont élimines au moins en partie. L'amélioration de la qualité de la préparation virale est nette lorsque l'on compare l'aspect de la séparation après la première étape d'ultracentrifugation selon les deux procédés. Dans le procédé classique impliquant une lyse, le tube de la préparation virale présente un aspect trouble avec un coagulum (lipides, protéines) venant parfois toucher la bande de virus, alors que dans le procédé de l'invention, la préparation après libération et ultrafiltration présente une bande déjà bien résolue des contaminants du milieu qui persistent dans la phase supérieure. L'amélioration de la qualité est aussi démontrée lorsque l'on compare les profils sur chromatographie d'échange d'ion d'un virus obtenu par lyse cellulaire par rapport au virus obtenu par ultrafiltration comme décrit dans la présente invention. Par ailleurs, il est possible d'améliorer encore la qualité en poursuivant l'ultrafiltration par une diafiltration du concentrât. Cette diafiltration est réalisée sur le même principe que l'ultrafiltration tangentielle, et permet d'éliminer plus complètement les contaminants de taille supérieure au seuil de coupure de la membrane, tout en réalisant l'équilibration du concentrât dans le tampon de purification.
Par ailleurs, la demanderesse a également montré que cette ultrafiltration permettait ensuite de purifier le virus directement par chromatographie sur colonne échangeuse d'ions ou par chromatographie de perméation de gel, permettant d'obtenir une excellente résolution du pic de particules virales sans avoir besoin de traitement de la préparation préalable à la chromatographie. Ceci est particulièrement inattendu et avantageux. En effet, comme indiqué dans l'article de Hyughe et al. précité, la purification par chromatographie de préparations virales donne des résultats médiocres et nécessite de plus un prétraitement de la suspension virale par de la Benzonase et des cyclodextrines.
Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est donc caractérisé en ce que les virus sont récoltes par ultrafiltration.
Comme indiqué ci-avant, le concentrât résultant est utilisable directement pour une purification du virus. Cette purification peut être réalisée par les techniques classiques antérieures, telles que la centrifugation en gradient de chlorure de césium ou autre milieu d'ultracentrifugation permettant de séparer les particules selon leur taille, densité ou coefficient de sédimentation. Les résultats présentés dans l'exemple 4 montrent en effet que le virus ainsi obtenu présente des caractéristiques remarquables. En particulier, selon l'invention, il est possible de remplacer le chlorure de césium par une solution de iodixanol,5,5'-[(2-hydroxy-l-3propanediyl)-bis(acetylamino)] bis[N,N'-bis(2,3dihydroxypropyl-2,4,6-triodo-l,3-benzenecarboxamide] dans laquelle le virus sedimente à l'équilibre à une densité relative comprise entre 1 ,16 et 1,24. L'utilisation de cette solution est avantageuse car, contrairement au chlorure de césium, elle n'est pas toxique. Par ailleurs, la demanderesse a également montré que, de manière avantageuse, le concentrât obtenu permettait aussi de purifier le virus directement par un mécanisme d'echangeuse d'ions ou par perméation de gel, et d'obtenir une excellente résolution du pic chromatographique de particules virales, sans avoir besoin de prétraitement.
Selon un mode de réalisation préféré, les virus sont donc récoltés et purifiés par chromatographie d'échange d'anions.
Pour la chromatographie d'échange d'anions, différents types de supports peuvent être employés, tels que la cellulose, l'agarose (gels Sepharose), le dextran (gels Sephadex), l'acrylamide (gels Sephacryl, gels Trisacryl), la silice (gels TSK-gel SW), le poly[styrène-divinylbenzène] (gels Source ou gels Poros), le copolymère éthylène glycol-méthacrylate (gels Toyopearl HW et TSK-gel PW), ou des mélanges (agarose-dextran: gel Superdex). Par ailleurs, pour améliorer la résolution chromatographique, il est préférable dans le cadre de l'invention d'utiliser de supports sous forme de billes, ayant les caractéristiques suivantes : - le plus sphérique possible,
- de diamètre calibré (billes toutes identiques ou le plus homogènes possible), sans imperfections ni cassures,
- de diamètre le plus petit possible: des billes de 10 μm ont été décrites (MonoBeads de Pharmacia ou TSK-gel de TosoHaas, par exemple). Cette valeur semble constituer la limite inférieure pour le diamètre de billes dont la porosité doit par ailleurs être très élevée pour permettre la pénétration des objets à chromatographier à l'intérieur des billes (voir ci-dessous).
- tout en restant rigides pour résister à la pression.
Par ailleurs, pour chromatographier les adenovirus qui constituent des objets de taille très importante (diamètre > 100 nm), il est important de mettre en oeuvre des gels ayant une limite supérieure de porosité élevée, voire la plus élevée possible, pour permettre l'accès des particules virales aux groupements fonctionnels avec lesquels elles sont appelées à interagir.
Avantageusement, le support est choisi parmi l'agarose, le dextran, l'acrylamide, la silice, le poly[styrène-divinylbenzène], le copolymère éthylène glycol- méthacrylate, seuls ou en mélange.
Pour la chromatographie d'échange d'anions, le support utilisé doit être fonctionalisé, par greffage d'un groupement susceptible d'interagir avec une molécule anionique. Le plus généralement, le groupement est constitué d'une a iné qui peut être ternaire ou quaternaire. En utilisant une aminé ternaire, telle que le DEAE par exemple, on obtient un échangeur d'anions faible. En utilisant une aminé quaternaire, on obtient un échangeur d'anions fort.
Dans la cadre de la présente invention, il est particulièrement avantageux d'utiliser un échangeur d'anions fort. Ainsi, on utilise préférentiellement selon l'invention un support de chromatographie tel qu'indiqué ci-dessus, fonctionnalisé par des aminés quaternaires. Parmi les supports fonctionnants par des aminés quaternaires, on peut citer comme exemples les résines Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ et Poros QE, les résines de type Fractogel TMAE, et les résines Toyopearl Super Q. Des exemples préférés de résines utilisables dans le cadre de l'invention sont le
Source, notamment Source Q, tel que 15 Q (Pharmacia), les MonoBeads, tel que Q (Pharmacia), les résines de type Poros HQ et Poros QE. Le support MonoBeads (diamètre des billes 10 ± 0,5 μm) est disponible commercialement depuis plus de 10 ans et les résines de type Source (15 μm) ou Poros (10 μm ou 20 μm) depuis 5 ans environ. Ces deux derniers supports présentent l'avantage d'avoir une distribution des pores internes très large (ils vont de 20 nm à 1 μm) , permettant ainsi le passage de très gros objets à travers les billes. De plus ils offrent très peu de résistance à la circulation de liquide à travers le gel (donc très peu de pression) et sont très rigides. Le transport des solutés vers les groupements fonctionnels avec lesquels ils vont entrer en interaction est donc très rapide. La demanderesse a montré que ces paramètres sont particulièrement importants dans le cas de l'adénovirus, dont la diffusion est lente en raison de sa taille.
Les résultats présentés dans les exemples montrent que l'adénovirus peut être purifié à partir du concentrât en une seule étape de chromatographie d'échange d'anions, que le rendement de la purification est excellent (140% en terme de tdu, comparé à la valeur de 49% rapportée par Huyghes et al.) et que la résolution est excellente. En outre, les résultats présentés montrent que l'adénovirus obtenu présente une infectivité élevée, et possède donc les caractéristiques requises pour une utilisation thérapeutique. Des résultats particulièrement avantageux ont été obtenus avec un échangeur d'anions fort, c'est-a-dire fonctionnalisé par des aminés quaternaires, et notamment avec la résine Source Q. La résine Source Q15 est particulièrement préférée. A cet égard, un autre objet de l'invention concerne un procédé de purification d'adénovirus recombinants à partir d'un milieu biologique caractérisé en ce qu'il comprend une étape de purification par chromatographie d'échange d'anions fort.
Selon cette variante, le milieu biologique peut être un surnageant de cellules d'encapsidation productrices dudit virus, un lysat de cellules d'encapsidation productrices dudit virus, ou une solution prépurifiée dudit virus.
Préférentiellement, la chromatographie est effectuée sur un support fonctionnalisé avec une aminé quaternaire. Toujours selon un mode préféré, le support est choisi parmi l'agarose, le dextran, l'acrylamide, la silice, le poly[styrène- divinylbenzène], le copolymère éthylène glycol-méthacrylate, seul ou en mélange.
Un mode de réalisation particulièrement avantageux est caractérisé en ce que la chromatographie est effectuée sur une résine Source Q, de préférence Q15.
Par ailleurs, le procédé décrit ci-dessus est avantageusement réalisé à partir d'un surnageant de cellules productrices, et comprend une étape préalable d'ultrafiltration. Cette étape est avantageusement réalisée dans les conditions définies ci-avant, et notamment, il s'agit d'une ultrafiltration tangentielle sur membrane ayant un seuil de coupure compris entre 300 et 500 kDa.
Selon un autre mode de réalisation du procédé de l'invention, les virus sont récoltes et purifiés par chromatographie de perméation de gel.
La perméation de gel peut être réalisée directement sur le surnageant, sur le concentrât, ou sur le virus issu de la chromatographie d'échange d'anions. Les supports mentionnés pour la chromatographie d'échange d'anions peuvent être utilisés dans cette étape, mais sans fonctionnai isation.
A cet égard, les supports préférés sont l'agarose (gels Sepharose), le dextran (gels Sephadex), l'acrylamide (gels Sephacryl, gels Trisacryl), la silice (gels TSK-gel
SW), le copolymère éthylène glycol-méthacrylate (gels Toyopearl HW et TSK-gel PW), ou des mélanges (agarose-dextran: gel Superdex). Des supports particulièrement préférés sont :
- le Superdex 200HR (Pharmacia)
- le Sephacryl S-500HR, S-1000HR ou S-2000 (Pharmacia) - le TSK G6000 PW (TosoHaas).
Un procédé préféré selon l'invention comprend donc une ultrafiltration suivie d'une chromatographie d'échange d'anions.
Un autre procédé préféré comprend une ultrafiltration suivie d'une chromatographie d'échange d'anions, suivie d'une chromatographie de perméation de gel.
Une autre variante de l'invention concerne un procède de purification d'adénovirus a partir d'un milieu biologique comprenant une première étape d'ultracentrifugation, une deuxième étape de dilution ou dialyse, et une troisième étape de chromatographie d'échange d'anions. Préférentiellement, selon cette variante, la première étape est réalisée par ultracentrifugation rapide sur gradient de chlorure de césium. Le terme rapide signifie une ultracentrifugation allant de 0,5 a 4 heures environ. Au cours de la deuxième étape, le virus est dilue ou dialyse contre du tampon, pour faciliter son injection sur le gel de chromatographie, et l'élimination du milieu d'ultracentrifugation. La troisième étape est réalisée en utilisant une chromatographie d'échange d'anions telle que décrite ci-avant, de préférence d'anions forts. Dans une expérience typique, a partir du virus récolté dans le surnageant (ou éventuellement intracellulaire), une 1ère ultracentrifugation rapide est effectuée avec chlorure de césium (comme dans l'exemple 3). Ensuite, après une simple dilution de l'échantillon (par exemple par 10 volumes de tampon) ou après une simple dialyse dans du tampon, l'échantillon est chromatographie en échange d'ions (comme dans l'exemple 5.1.). L'avantage de cette variante du procède de l'invention, provient du fait qu'elle met en oeuvre 2 modes totalement différents de séparation du virus (densité et charge de surface), pouvant amener éventuellement le virus à un niveau de qualité combinant les performances des 2 méthodes. En outre, l'étape de chromatographie permet simultanément d'éliminer le milieu utilise pour l'ultracentrifugation (chlorure de césium par exemple, ou tout autre milieu équivalent cite plus haut).
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de iodixanol,5,5'-[(2- hydroxy-l-3propanediyl)-bis(acetylamino)]bis[N,N'-bis(2,3dihydroxypropyl-2,4,6- triodo- 1 ,3-benzenecarboxamide] pour la purification d ' adenovirus.
Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, différentes cellules d'encapsidation des adenovirus peuvent être utilisées. En particulier, les cellules d'encapsidation peuvent être préparées à partir de différentes cellules pharmaceutiquement utilisables, c'est-à-dire cultivables dans des conditions industriellement acceptables et n'ayant pas de caractère pathogène reconnu. Il peut s'agir de lignées cellulaires établies ou de cultures primaires et notamment de rétinoblastes humains, de cellules de carcinome de poumon humain, ou de cellules embryonnaires de rein. Il s'agit avantageusement de cellules d'origine humaine, infectables par un adenovirus. A cet égard, on peut citer les cellules KB, Hela, 293, Vero, gmDBP6, HER, A549, HER, etc.
Les cellules de la lignée KB sont issues d'un carcinome épidermique humain. Elles sont accessibles à l'ATCC (réf. CCL17) ainsi que les conditions permettant leur culture. La lignée de cellules humaines Hela est issue d'un carcinome de l'épithelium humain. Elle est également accessible à l'ATCC (réf. CCL2) ainsi que les conditions permettant sa culture. Les cellules de la lignée 293 sont des cellules de rein embryonnaire humain (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Cette lignée contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de l'adénovirus humain Ad5 (12 %). La lignée de cellules gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624) est constituée de cellules Hela portant le gène E2 d'adénovirus sous le contrôle du LTR de MMTV.
Il peut s'agir également de cellules d'origine canine (BHK, MDCK, etc). A cet égard, les cellules de la lignée canines MDCK sont préférées. Les conditions de culture des cellules MDCK ont été décrites notamment par Macatney et al., Science 44 (1988) 9.
Différentes lignées de cellules d'encapsidation ont été décrites dans la littérature et sont mentionnées dans les exemples. Il s'agit avantageusement de cellules trans- complémentant la fonction El de l'adénovirus. Encore plus préférentiellement, il s'agit de cellules trans-complémentant les fonctions El et E4 ou El et E2a de l'adénovirus. Ces cellules sont préférentiellement dérivées de cellules embryonnaires humaines de rein ou de la rétine, ou de carcinomes humains de poumon.
L'invention fournit ainsi un procédé de production d'adénovirus recombinants particulièrement avantageux. Ce procédé est adapté à la production de virus recombinants défectifs pour une ou plusieurs régions, et en particulier, de virus défectifs pour la région El, ou pour les régions El et E4. Par ailleurs, il est applicable à la production d'adénovirus de sérotypes différents, tels qu'indiqués ci-avant.
Selon un mode particulièrement avantageux, le procédé de l'invention est utilisé pour la production d'adénovirus recombinants dans lesquels la région El est inactivée par délétion d'un fragment PvuII-BglII allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328, sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Cette séquence est accessible dans la littérature et également sur base de données (voir notamment Genebank n° M73260). Dans un autre mode de réalisation préféré, la région El est inactivée par délétion d'un fragment HinfII-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446. Dans un mode particulier, le procédé permet la production de vecteurs comprenant une délétion de la totalité de la région E4. Ceci peut être réalisé par excision d'un fragment Maell-Mscl correspondant aux nucléotides 35835-32720. Dans un autre mode particulier, seule une partie fonctionnelle de E4 est délétée. Cette partie comprend au moins les phases ORF3 et ORF6. A titre d'exemple, ces phases codantes peuvent être délétées du génome sous forme de fragments PvuII-AluI et BglII-PvuII respectivement, correspondant aux nucléotides 34801-34329 et 34115-33126 respectivement. Les délétions de la région E4 du virus Ad2 dl808 ou des virus Ad5 dll004, Ad5 dll007, Ad5 dllOll ou Ad5 dll014 peuvent également être utilisées dans le cadre de l'invention. A cet égard, les cellules de l'invention sont particulièrement avantageuses pour la production de virus comprenant une région El inactive et une délétion dans la région E4 du type de celle présente dans le génome de Ad5 dll014, c'est-à-dire de virus E4" conservant la phase de lecture ORF4.
Comme indiqué ci-avant, la délétion dans la région El couvre avantageusement tout ou partie des régions El A et E1B. Cette délétion doit être suffisante pour rendre le virus incapable de réplication autonome dans une cellule. La partie de la région El délétée dans les adenovirus selon l'invention couvre avantageusement les nucléotides 454-3328 ou 382-3446.
Les positions données ci-dessus font référence à la séquence de l'adénovirus
Ad5 sauvage telle que publiée et accessible sur base de donnée. Bien que des variations mineures puissent exister entre les différents sérotypes d'adénovirus, ces positions sont généralement applicables à la construction d'adénovirus recombinants selon l'invention à partir de tout sérotype, et notamment des adenovirus Ad2 et Ad7.
Par ailleurs, les adenovirus produits peuvent posséder d'autres altérations au niveau de leur génome. En particulier, d'autres régions peuvent être délétées pour augmenter la capacité du virus et réduire ses effets secondaires liés à l'expression de gènes viraux. Ainsi, tout ou partie de la région E3 ou IVa2 notamment peut être délétée. Concernant la région E3, il peut cependant être particulièrement avantageux de conserver la partie codant pour la protéine gpl9K. Cette protéine permet en effet d'éviter que le vecteur adénoviral fasse l'objet d'une réaction immunitaire qui (i) limiterait son action et (ii) pourrait avoir des effets secondaires indésirables. Selon un mode particulier, la région E3 est délétée et la séquence codant pour la protéine gpl9k est réintroduite sous contrôle d'un promoteur hétérologue.
Comme indiqué avant, les adenovirus constituent des vecteurs de transfert de gènes très efficaces pour des applications de thérapie génique et cellulaire. Pour cela, une séquence d'acides nucléiques hétérologue dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché peut être insérée dans leur génome. Cette séquence peut comporter un ou plusieurs gènes thérapeutiques, tels qu'un gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet thérapeutique. Parmi les produits thérapeutiques, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (WO94/25073), la dystrophine ou une minidystrophine (WO93/06223), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (WO94/24297) , les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc, les gènes suicides : thymidine kinase, cytosine désaminase, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc, WO94/29446), etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Le gène thérapeutique peut peut aussi être un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Généralement, la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule infectée, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. L'ensemble de ces éléments constitue la cassette d'expression. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux ou de toute séquence promotrice ou dérivée, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon inductible ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes E1A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, α-actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofilaments, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CFTR, facteur VIII, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (pyruvate kinase, villine, promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, promoteur de l'actine a des cellules du muscle lisse, promoteurs spécifiques pour le foie ; Apo AI, Apo AU, Albumine humaine etc) ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc.). En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire. Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Par ailleurs, la séquence d'acides nucléiques hétérologue peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
La cassette d'expression du gène thérapeutique peut être insérée en différents sites du génome de l'adénovirus recombinant, selon les techniques décrites dans l'art antérieur. Elle peut tout d'abord être insérée au niveau de la délétion El. Elle peut également être insérée au niveau de la région E3, en addition ou en substitution de séquences. Elle peut également être localisée au niveau de la région E4 délétée.
La présente invention concerne également les préparations virales purifiées obtenues selon le procédé de l'invention, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adenovirus recombinants défectifs préparés selon ce procédé. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. D'autres excipients peuvent être utilisés tels que par exemple un hydrogel. Cet hydrogel peut être préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique. De tels polymères ont par exemple été décrits dans la demande WO93/08845. Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adenovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et ÎO***^ pfu, et de préférence 10° à 10***υ pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution d'adénovirus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Selon le gène thérapeutique, les virus ainsi produits peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), etc.
La présente invention .sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1 : Etude de la stabilité de l'adénovirus purifie selon l'exemple 4.
Figure 2 : Analyse en HPLC (phase inverse) de l'adénovirus purifie selon l'exemple 4. Comparaison avec l'adénovirus de l'exemple 3.
Figure 3 : Cinétique de libération de l'adénovirus Ad-βGal dans le surnageant de cellules 293, mesurée par PCR semi-quantitative et Plaque Assay. Figure 4 : Profil d'elution sur Source Q15 d'un surnageant d'adénovirus ultrafiltre (exemple 5.1).
Figure 5 : Analyse en CLHP Ressource Q du pic de virus récolte par chromatographie sur résine Source Q15 d'un surnageant d'adénovirus ultrafiltre (exemple 5.1). Figure 6 : (A) Profil d'elution sur résine Source Q15 d'un surnageant d'adénovirus Ad-APOAl ultrafiltre (exemple 5.3); et (B) Analyse en CLHP (Resource Q) du pic de virus récolte.
Figure 7 : (A) Profil d'elution sur Source Q15 d'un surnageant d'adénovirus Ad-TK ultrafiltre (exemple 5.3). Analyse en CLHP (Resource Q) des différentes fractions (début et fin de pic) de virus récoltées : (B) Fraction F2, milieu du pic; (C) Fraction F3, borne du pic; (D) Fraction F4, fin du pic.
Figure 8 : Profil d'elution sur résine Mono Q d'un surnageant concentre de culture de cellules productrices d'adénovirus (exemple 5.4). BG25F1: Virus surnageant concentre et purifie sur césium. BG25C : Surnageant infecte, concentre. Figure 9 Profil d'elution sur gel POROS HQ d'un surnageant concentre de culture de cellules productrices d'adénovirus (exemple 5 4) BG25F1 Virus surnageant concentre et purifie sur césium BG25C Surnageant infecte, concentre
Figure 10 A et B Profil de purification par perméation de gel sur Sephacryl S 1 OOOHR/Superdex 200HR d'un surnageant d'adénovirus ultrafiltre (exemple 6)
Figure 1 1 Analyse en microscopie électronique d'un stock d'adénovirus purifié selon l'invention
Figure 12 Analyse en microscopie électronique de la bande de virus de densité 1 27
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorése sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature [Maniatis T et al , "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y , 1982, Ausubel F M et al (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories) Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 12 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1 : Lignées cellulaires d'encapsidation
Les cellules d'encapsidation utilisées dans le cadre de l'invention peuvent provenir de toute lignée cellulaire infectable par un adenovirus, compatible avec une utilisation à des fins thérapeutiques. Il s'agit plus préférentiellement d'une cellule choisie parmi les lignées suivantes :
- Les cellules de la lignée 293 : La lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires de rein humaines contenant l'extrémité gauche (environ 11-12%) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation, la région El, incluant Ela, Elb, la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine pIVa2 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Cette lignée est capable de trans-complémenter des adenovirus recombinants défectifs pour la région El, c'est- à-dire dépourvus de tout ou partie de la région El, et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés - Les cellules de la lignée A549
Des cellules complémentant la région El de l'adénovirus ont été construites à partir des cellules A549 (Imler et al., Gène Ther. (1996) 75). Ces cellules contiennent un fragment re^reint de la région El, dépourvue de l'ITR gauche, placée sous le contrôle d'un promoteur inductible.
- Les cellules de la lignée HER
Le cellules embryonnaires de la rétine humaine (HER) peuvent être infectées par un adenovirus (Byrd et al., Oncogene 2 (1988) 477). Des cellules d'encapsidation d'adénovirus préparées à partir de ces cellules ont été décrites par exemple dans la demande WO94/28152 ou dans l'article de Fallaux et al. (Hum.Gene Ther. (1996) 215). On peut citer plus particulièrement la lignée 911 comprenant la région El du génome de l'adénovirus Ad5, du nucléotide 79 au nucléotide 5789 intégrée dans le génome de cellules HER. Cette lignée de cellules permet la production de virus défectifs pour la région El.
- Les cellules IGRP2
Les cellules IGRP2 sont des cellules obtenues a partir de cellules 293, par intégration d'une unité fonctionnelle de la région E4 sous contrôle d'un promoteur inductible. Ces cellules permettent la production de virus défectifs pour les régions El et E4 (Yeh et al., J. Virol (1996) 70).
- Les cellules VK
Les cellules VK (VK2-20 et VK10-9) sont des cellules obtenues a partir de cellules 293, par intégration de l'intégralité de la région E4 sous contrôle d'un promoteur inductible, et de la région codant pour la protéine pIX. Ces cellules permettent la production de virus défectifs pour les régions El et E4 (Krougliak et al., Hum. Gène Ther. 6 (1995) 1575).
- Les cellules 293E4
Les cellules 293E4 sont des cellules obtenues a partir de cellules 293, p.ar intégration de l'intégralité de la région E4. Ces cellules permettent la production de virus défectifs pour les régions El et E4 (WO95/02697; Cancer Gène Ther. (1995) 322).
Exemple 2 : Virus utilises
Les virus produits dans le cadre des exemples qui suivent sont un adenovirus contenant le gène marqueur LacZ de E.coli (Ad-βGal), un adenovirus contenant le gène codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès type I (Ad-TK), un adenovirus contenant le gène codant pour la protéine suppresseur de tumeur p53 humaine et un virus codant pour l'apolipoproteine Al (Ad-apoAI). Ces virus sont dérivés du serotype Ad5 et possèdent la structure suivante :
- Une deletion dans la région El recouvrant par exemple les nucléotides 382 (site Hinfl) à 3446 (site Sau3a).
- Une cassette d'expression du gène, sous contrôle du promoteur RSV ou CMV, insérée au niveau de ladite deletion. - Une deletion de la région E3.
La construction de ces virus a ete décrite dans la littérature (WO94/25073,
WO95/14102, FR 95.01632, Stratford-Perricaudet et al. J. Clin. Invest (1992) p626).
Il est entendu que toute autre construction peut être produite selon le procède de l'invention, et notamment des virus portant d'autres gènes heterologues et/ou d'autres deletions (E1/E4 ou E1/E2 par exemple).
Exemple 3 : Production de virus par lyse des cellules
Cet exemple reproduit la technique antérieure de production de virus, consistant a lyser les cellules d'encapsidation pour récupérer les virus produits.
Les cellules 293 sont infectées à 80-90% de confluence en boite de culture avec un préstock de virus Ad-βGal ou Ad-TK (exemple 2) à raison de 3 à 5 virus par cellule (Multiplicity of Infection MOI = 3 à 5). L'incubation dure de 40 à 72 heures, le timing de récolte étant jugé par l'observation au microscope des cellules qui s'arrondissent, deviennent plus réfringentes et adhèrent de plus en plus faiblement au support de culture. Dans la littérature la cinétique du cycle viral dure de 24 à 36 heures.
Au niveau d'une production de labo il est important de récolter les cellules avant qu'elles ne se détachent afin d'éliminer le milieu d'infection au moment de la récolte sans perdre de cellules puis de les reprendre dans un volume minimum (le facteur de concentration est selon la taille de la culture de l'ordre de 10 à 100 fois).
Le virus est alors libéré du noyau par 3 à 6 cycles de décongélation successifs (ethanol carboglace à -70°C, bain-marie à 37°C) Le lysat cellulaire obtenu est ensuite centrifugé a basse vitesse (2000 à 4000 rpm) et le surnageant (lysat cellulaire clarifié) est ensuite purifié par ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium en deux étapes:
- Une première ultracentrifugation (step) rapide de 1,5 heure 35000 rpm rotor sw 41, sur deux couches de césium 1.25 et 1.40 encadrant la densité du virus (1.34) de façon a séparer le virus des protéines du milieu; les rotors peuvent être des rotors 'swinging'(Sw28,S 41Beckman ) ou angle fixe (Ti 45, Ti 70,Ti 70.1 Beckman) selon les volumes à traiter;
- Une deuxième ultracentrifugation en gradient plus longue (de 10 à 40 heures selon le rotor utilisé), par exemple 18 heures à 35000 rpm en rotor sw 41 qui constitue la véritable et unique purification du virus. Le virus se retrouve dans un gradient linéaire a l'équilibre à une densité de 1.34.
Généralement, a cette étape, la bande du virus est majoritaire. On observe néanmoins parfois deux bandes moins denses, fines dont l'observation en microscopie électronique a montré qu'il s'agissait de virus vides ou cassés et pour la bande la moins dense de sous unités virales (pentons, hexons). Après cette étapes le virus est récolté dans le tube par ponction a l'aiguille et le césium est éliminé par dialyse ou dessalage sur G25.
Exemple 4 : Production de virus dans le surnageant Cet exemple décrit une expérience de production de virus par récupération après libération spontannee. Le virus est ensuite récolte par ultrafiltration, puis purifie par chlorure de césium.
4.1. Protocole
Dans cette méthode, contrairement a l'exemple 3, les cellules ne sont pas récoltées 40 à 72 heures post- infection, mais l'incubation est prolongée entre 8 à 12 jours de façon à obtenir une lyse totale des cellules sans avoir besoin de procéder aux cycles de congélations décongélations. Le virus se retrouve dans le surnageant. Le surnageant est alors clarifié par filtration sur des filtres profondeur de porosité décroissante(10 μm/1.0 μm/0.8-0.2 μm).
Le virus a une taille de 0.1 μm et à cette étape nous n'avons observé aucune perte de virus par rétention sur le filtre a la plus faible porosité( 0.22 μm)
Le surnageant une fois clarifié est ensuite concentré par ultrafiltration tangentielle sur membrane spirale Millipore ayant un seuil de coupure de 300 kDa. Dans les expériences rapportées dans la présente invention, le facteur de concentration est dicté par le volume mort du système qui est de 100 ml. Des volumes de surnageant de 4 à 20 litres ont ete concentrés avec ce système, permettant d'obtenir des volumes de concentrât de 100 ml à 200 ml sans difficultés, ce qui correspond a un facteur de concentration de 20 à 100 fois. Le concentrât est ensuite filtré sur 0.22 μm puis purifié par centrifugation sur chlorure de césium comme décrit dans l'exemple 3, suivi d'une étape de dialyse.
4.2. Résultats
Pureté
Alors que le tube de virus intracellulaire (exemple 3) présente un aspect trouble avec un coagulum (lipides, protéines) venant parfois toucher la bande de virus, la préparation virale obtenue après la première étape de centrifugation sur chlorure de césium par le procède de l'invention présente une bande de virus déjà bien isolée des contaminants du milieu qui persistent dans la phase supérieure. L'analyse en chromatographie liquide haute performance sur colonne Resource Q (cf exemple 5) montre aussi ce gain en pureté du matériel de départ obtenu par ultrafiltration de surnageant infecté avec une diminution des contaminants acides nucléiques (ratio DO 260/280 supérieur ou égal à 1,8) et proteiques (ratio DO 260/280 inférieur à 1).
Stabilité du virus dans un surnageant à 37°C :
La stabilité du virus a ete déterminée par titration par la méthode de plaque assay d'un surnageant de culture infectieux dont des aliquots ont été prelevées à différents temps d'incubation à 37°C post -infection. Les résultats sont présentés ci- dessous:
Virus Ad-TK :
. titre 10 jours post-infection= 3.5 x 108 pfu/ml
. titre 20 jours post-infection= 3.3 x 108 pfu/ml
Virus Ad-βGal
. titre 8 jours post-infection= 5.8 x 108 pfu/ml
. titre 9 jours post-infection= 3.6 x 108 pfu/ml
. titrelO jours post-infection= 3.5 x 108 pfu/ml
. titre 13 jours post-infection= 4.1 x 108 pfu/ml
. titre 16 jours post-infection= 5.5 x 108 pfu/ml
Les résultats obtenus montrent que, jusqu'à au moins 20 jours post- infection, le titre du surnageant est stable dans la limite de précision du dosage. Par ailleurs, la Figure 1 montre que, dans le tampon d'elution, le virus est stable au moins 8 mois, a - 80 C comme a -20 C.
Infectivité spécifique des préparations Ce paramètre, correspondant au ratio du nombre de particules virales mesuré par HPLC sur le nombre de pfu, rend compte du pouvoir infectieux des préparations virales. Selon les recommandations de la FDA, il doit être inférieur à 100. Ce paramètre a ete mesure comme suit : Deux séries de flacons de culture contenant des cellules 293 ont été infectées en parallèle au même moment avec le même prestock viral dans les mêmes conditions. Cette expérience à été réalisée pour un adenovirus recombinant Ad-bgal, puis répétée pour un adenovirus Ad-TK. Pour chaque adenovirus, une série de flacons est récoltée 48 heures post- infection et est considérée comme une production de virus intracellulaire purifié sur gradient de césium après congélation décongélation. L'autre série est incubée 10 jours post- infection et le virus est récolté dans le surnageant. Les préparations purifiées obtenues sont titrées par plaque assay et la quantification du nombre de particules virales totales est déterminée par la mesure de la concentration en protéine PVII par CLHP de phase inverse sur une colonne C4 Vydac 4.6x50 mm après denaturation des échantillons en guanidine 6.4M. La quantité de protéines PVII est correlée au nombre de particules virales considérant 720 copies de PVII par virus (HorwitzNirology .second édition (1990)). Cette méthode est correlée avec les mesures de particules virales sur préparations purifiées par la méthode densitometrique à 260 nm prenant pour coefficient d'extinction spécifique 1.0 unité d'absorbance = 1.1 1012 particules par ml
Les résultats obtenus montrent que, pour le virus Ad-βGal, ce ratio est de 16 pour le virus surnageant et de 45 pour le virus intracellulaire. Pour le virus Ad-TK, le ratio est de 78 dans le cas de la récolte de virus dans la méthode surnageant et de 80 pour le virus récolté par la méthode intracellulaire.
Analyse en microscopie électronique:
Cette méthode permet de déceler la présence de particules vides ou sous unités virales libres copurifiées, ainsi que d'apprécier une contamination protéique des préparations virales purifiées ou la présence d'aggregats non dissociables de particules virales. Protocole: 20 μl d'échantillon sont déposés sur une grille carbonée puis traités pour l'observation en coloration négative par l'acétate d'uranyl à 1,5%. Pour l'observation, on utilise un microscope électronique Jeol 1010 de 50kV à 100 kV.
Résultat: L'analyse effectuée sur un virus récolté dans le surnageant montre une péparation propre, sans contaminants, sans aggrégats et sans particules virales vides. Il est de plus possible de distinguer les fibres du virus ainsi que sa structure géométrique régulière. Ces résultats confirment la grande qualité des particules virales obtenues selon l'invention.
Analyse du profil protéique en HPLC et SDS PAGE :
Analyse en SDS PAGE:
20μl d'échantillon est dilué dans le tampon de Laemmli (Nature 227 (1970) 680-685), réduit 5 min à 95 °c, puis chargé sur des gels Novex 1 mm x 10 puits gradient 4-20%. Après migration, les gels sont colorés au bleu de coomassie et analysés sur sur Image Master VDS Pharmacia. L'analyse révèle un profil electrophorétique pour le virus récolté dans le surnageant en accord avec les données de la littérature (Lennart Philipson, 1984 H.S Ginsberg editors, Plénum press, 310- 338).
Analyse en HPLC reverse phase:
La figure 2 montre la superposition de 3 chromatogrammes obtenus à partir de deux échantillons de virus récoltés en intracellulaire et un échantillon de virus purifié par la méthode surnageant. Les conditions expérimentales sont les suivantes : colonne Vydac ref 254 Tp 5405, RPC44.6x50 mm, SolvantXA : H2O +TFA0.07%; Solvant B : CH3CN+TFA 0.07%, gradient linéaire : T=0min %B=25; T=50min %B=50%; Débit =lml/min, détecteur =215 nm. Les chromatogrammes montrent une parfaite identité entre les échantillons, sans différence dans les intensités relative de chaque pic. La nature de chaque pic a été déterminée par séquencage et met en évidence que les protéines présentes sont toutes d'origine virale (Voir Tableau ci-dessous). PIC (Min) IDENTIFICATION
19-20 Précurseur PVII
21-22 Précurseur PVII; Précurseur PX 1 a 12
27-28 Précurseur PVI; Précurseur PX
32-33 Précurseur PX
34
35-36 PVII mature
37 PVII mature; PVIII précurseur
39-41 PVI mature
45 pX
46 pIX
Analvse in vitro de l'efficacité de transduction et de la cvtotoxicité
L'analyse de la cytotoxicité est effectuée en infectant des cellules HCT116 en plaques 24 puits pour des MOI croissantes et en déterminant le pourcentage de cellules vivantes par rapport à un témoin non infecté , 2 et 5 jours post-infection, à l'aide de la technique de coloration au cristal violet. Les résultats sont présentes dans le tableau ci-dessous :
Adenovirus MOI=3.0 MOI=10.0 MOI=30.0 MOI=100.0
SurnageantJ2 91% 96% 87% 89%
SumageantJ5 97% 90% 10% <5%
Analyse de l'efficacité de transduction
Pour un adenovirus AD-βGal, l'efficacité de transduction d'une préparation est déterminée en infectant des cellules W162, non permissives à la réplication, cultivées en plaques 24 puits, avec des concentrations croissantes de particules virales. Pour une même quantité de particules virales déposées, on dénombre, 48 heures post-infection, les cellules exprimant l'activité betagalactosidase après incubation avec l'X-gal comme substrat. Chaque cellule bleue est dénombrée comme une unité de transduction (TDU), le résultat est multiplié par la dilution de l'échantillon afin d'obtenir la concentration en unité de transductions de l'échantillon. L efficacité de transduction est ensuite exprimée en faisant le rapport de la concentration en particules virales sur la concentration en TDU. Les résultats obtenus montrent que les virus purifies présentent une bonne efficacité de transduction in vitro.
Analyse de l'expression intracerebrale In vivo
Dans le but d'évaluer l'efficacité des adenovirus selon l'invention pour le transfert et l'expression de gènes in vivo, les adenovirus ont été injectés par voie stéréotaxique dans le striatum de souris immunocompétentes OF1. Pour cela, des volumes de lμl à 10' pfu de virus ont été injectés aux repères stéréotaxiques suivants (pour la barre d'incisives à 0mm) : An téro- postérieur: +0.5; Médio-latéral :2; Profondeur: -3.5.
Les cerveaux ont été analysés 7 jours après l'injection. Les résultats obtenus montrent que l'efficacité de transduction est grande : milliers de cellules transduites, expression très intense dans le noyau et diffusion fréquente et intense dans le cytoplasme.
4.3. Cinétique de libération du virus
Cet exemple décrit une étude de la cinétique de libération des adenovirus dans le surnageant de culture des cellules d'encapsidation.
Cette étude a ete réalisée par PCR semi-quantitative au moyen d'oligonucleotides complémentaires de régions du génome de l'adénovirus. A cet effet, l'ADN viral linéarise (1-10 ng) a ete incube en présence de dXTP (2 μl, lOmM), d'un couple d'oligonucleotides spécifiques et de Taq Polymérase (Cetus) dans un tampon 10XPCR, et soumis a 30 cycles d'amplification sans les conditions suivantes : 2 min a 91C, 30 cycles (1 min 91C, 2 min a température d'annealing, 3 min a 72C), 5 min 72C, puis 4C. Des expériences de PCR ont ete réalisées avec les couples d'oligonucleotides de séquence : - Couple 1 :
TAATTACCTGGGCGGCGAGCACGAT (6368) - SEQ ID n° 1
ACCTTGGATGGGACCGCTGGGAACA (6369) - SEQ ID n° 2
-Couple 2 :
TTTTTGATGCGTTTCTTACCTCTGG (6362) - SEQ ID n° 3
CAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGA (6363) - SEQ ID n° 4
- Couple 3 :
TGTTCCCAGCGGTCCCATCCAAGGT (6364) - SEQ ID n° 5
AAGGACAAGCAGCCGAAGTAGAAGA (6365) - SEQ ID n° 6
- Couple 4 :
GGATGATATGGTTGGACGCTGGAAG (6366) - SEQ ID n° 7
AGGGCGGATGCGACGACACTGACTT (6367) - SEQ ID n° 8
La quantité d'adénovirus libère dans le surnageant a ete déterminée sur un surnageant de cellules 293 infectées par l'Ad-βGal, a différents temps post-infection. Les résultats obtenus sont présentes dans la figure 3. Ils montrent que la libération cellulaire débute à partir du 5 ou 6eme jour post infection.
Il est entendu que toute autre technique de détermination de virus peut être utilisée dans le même but, sur toute autre lignée d'encapsidation, et pour tout type d'adénovirus.
Exemple 5 : Purification du virus par ultrafiltration et échange d'ions Cet exemple illustre comment l'adénovirus contenu dans le concentrât peut être purifié directement et en une seule étape chromatographique d'échange d'ions, avec des rendements très élevés.
5.1. Protocole
Dans cette expérience, le matériel de départ est donc constitué du concentrât
(ou rétentat d'ultrafiltration) décrit dans l'exemple 4. Ce rétentat a une teneur en protéines totales comprise entre 5 et 50 mg/ml, et plus préférentiellement entre 10 et 30 mg/ml, dans du tampon PBS (10 mM phosphate, pH 7,2 contenant 150 mM NaCl).
Le surnageant d'ultrafiltration obtenu à partir d'une préparation de virus est injecté sur une colonne contenant du Source Q 15 (Pharmacia) équilibrée dans du tampon Tris/HCl 50 mM pH 8,0 contenant 250 mM NaCl, 1.0 mM MgC12, et 10 % glycérol (tampon A). Après rinçage avec 10 volumes de colonne de tampon A, les espèces adsorbées sont éluées avec un gradient linéaire de NaCl (250 mM à 1 M) sur 25 volumes de colonne à un débit linéaire de 60 à 300 cm/h, plus préférentiellement 12 cm/h. Le profil d'elution typique obtenu à 260 nm est présenté sur la figure 4. La fraction contenant les particules virales est collectée. Elle correspond à un pic fin, symétrique, dont le temps de rétention coïncide avec le temps de rétention obtenu avec une préparation de particules virales purifiées par ultracentrifugation. Il est possible d'injecter dans les conditions décrites çi-dessus, au minimum 30 mg de protéines totales par ml de résine Source Q 15 tout en conservant une résolution excellente du pic de particules virales.
Dans une expérience représentative effectuée à partir d'une préparation d'un adenovirus β-gal (Exemple 2), 12,6 mg de protéines totales ont été injectées sur une colonne Resource Q (1 ml), soit 5 x 10'° PFU et 1,6 x 1010 TDU. Le pic de particules virales collecté après chromatographie (3,2 ml; Fig. 5) contenait 173 μg de protéines et 3,2 x 1010 PFU et 2,3 x 10'° TDU. Les particules virales ont donc été purifiées 70 fois (en terme de quantité de protéines) et le rendement de la purification est de 64% en PFU et de 142 % en TDU (Voir Tableau ci-dessous).
Etapes Concentration Volumes Volumes Rendements Facteur de échantillon déposes récupères Purification
SURNAGEANT 5000 ml 5000 ml 100 %
ULTRAProteines:6.3 mg/ml 5000 ml 200 ml 100 % 5
FILTRATION PFU:2.5xl010/ml
300 kd TDU:8.1x 109/ml Particle 3.8 xlθ"/rnl
Part/pfu ratio:16.0 Part/tdu ratio:47.0
PFU:1.0x 1010/ml Proteines=85%
PURIFICATION TDU:7.2xl09/ml 2.0 ml de 3.0 ml PFU=64% 70
ECHANGE Particle:2.0xl0! i/ml concentrât elution TDU=140%
IONS Particles=84%
(une étape) Part/pfu ratio=20 Part/tdu ratio=27 HPLC Purete=98.4%
PFU:1.0xl0n/ml) 28.3 ml de QSP 4.1 PFU=66%
GRADIENT TDU:7.5x 10IO/ml concentrât ml TDU=130% 70
CsCl Particle:2.2xl012/ml Particles=84%
Part/pfu ratio=22 HPLC par/tdu ratio=29 purete=98.4%
5.2. Pureté
Après cette étape de purification, la fraction collectée présente une pureté 98% en particules virales (détection UV à 260 nm), lorsqu'elle est analysée par chromatographie liquide haute performance (CLHP) sur une colonne de Resouce Q (1 ml) dans un système chromatographique suivant: 10 μl de la fraction purifiée par chromatographie comme décrit à l'exemple 5.1 sont injectés sur une colonne Resource Q15 (1ml de gel; Pharmacia) équilibrée dans du tampon Tris/HCl 50 mM pH 8,0 (tampon B). Après rinçage avec 5 ml de tampon B, les espèces adsorbées sont éluées avec un gradient linéaire de 30 ml de NaCl (0 à 1 M) dans le tampon B à un débit de 1 ml/min. Les espèces éluées sont détectées à 260 nm. Cette analyse par CLHP (Figure 5) montre de plus que l'albumine sérique bovine résiduelle présente dans le rétentat d'ultrafiltration est totalement éliminée au cours de la chromatographie préparative. Sa teneur dans la fraction purifiée est estimée être < 0,1 %. L'analyse en Western blot avec un anticorps polyclonal anti-BSA (avec révélation ECL; Amersham) indique que la teneur en BSA dans la préparation chromatographique est inférieure à 100 ng par mg de virus.
L'analyse en électrophorèse de la fraction adénovirale purifiée par chromatographie est effectuée en gel de polyacrylamide (4-20 %) en conditions dénaturantes (SDS). Les bandes de protéines sont ensuite révélées au nitrate d'argent.
Cette analyse montre que la préparation adénovirale obtenue par chromatographie a un niveau de pureté au moins égal à celui de la préparation ontenue classiquement par ultracentrifugation puiqu'elle ne présente pas de bande de protéines supplémentaire qui indiquerait une contamination de la préparation par des protéines non adénovirales.
La préparation adénovirale obtenue par chromatographie présente un ratio d'absorbance A 260 nm A 280 nm égal a 1,30 ± 0.05. Cette valeur, qui est identique à celle obtenue pour les meilleures préparation obtenues par ultracentrifugation, indique que la préparation est dépourvue de protéines contaminantes ou d'acides nucléiques contaminants.
L'analyse en microscopie électronique effectuée dans les conditions décrites dans l'exemple 4.2 sur un virus Ad-βgal purifié par chromatographie montre une préparation propre, sans contaminants, sans aggrégats et sans particules virales vides (figure 11). De plus, l 'ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium de cette préparation révèle une seule bande de densité 1.30, ce qui confirme l'absence de contamination des préparations chromatographiques par d'éventuelles particules vides ou des fragments de capsides. Lors de la purification, le pic chromatographique du virus est suivi d'un épaulement (ou pic secondaire) dans sa partie arrière, qui n'est pas collecté avec le pic principal. L' ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium de cette fraction révèle une bande de densité 1.27, et l'analyse de la composition de cette fraction montre qu'elle ne contient pas d'acides nucléiques. L'analyse en microscopie électronique montre que cette fraction contient des particules de forme irrégulière, présentant des perforations à la surface (figure 12). Il s'agit donc de particules vides (dépourvues d'ADN) et incomplètes. Ceci démontre donc que la purification de l'adénovirus par chromatographie élimine les particules vides présentes en faible quantité dans les préparations avant purification.
5.3. Purification d'adénovirus comportant un gène thérapeutique tel que les gènes codant pour les protéines ApoAl ou thimidine kinase.
Cet exemple illustre comment des adenovirus comportant dans leurs génomes des séquences d'acides nucléiques hétérologues codant pour des protéines thérapeutiques peuvent être purifiés directement et en une seule étape chromatographqiue d'échange d'ions. Il montre aussi que le comportement chromatographique de l'adénovirus est indépendant des séquences d'acides nucléiques hétérologues qu'il porte, ce qui permet de mettre en oeuvre le même procédé de purification pour différents adenovirus porteurs de séquences d'acides nucléiques hétérologues diverses.
Dans une expérience typique de purification, un adenovirus comportant dans son génome une séquence d'acides nucléiques hétérologue codant pour la protéine ApoAl (Exemple 2, WO94/25073) est purifié en chromatographiant, dans le système décrit à l'exemple 5.1, 18 ml (72 mg de protéines; 1,08 x 10'3 particules) de surnageant concentré d'une culture cellulaire récoltée 10 jours post-infection (Figure 6A). Le pic de particules virales collecté après chromatographie (14 ml; 1 ,4 mg de protéines) contenait 9,98 x 1012 particules, ce qui indique un rendement en particules de 92% et un facteur de purification de 51. Après cette étape de purification, la fraction collecté présentait (Figure 6B) une pureté supérieure à 98% en particules virales lors de l'analyse chromatographique dans les conditions décrites en 5.2. L'analyse par électrophorèse de la fraction adénovirale purifiée par chromatographie effectuée dans les conditions décrites à l'exemple 5.2. a montré que cette préparation avait un niveau de pureté au moins égal à celui de la préparation obtenue classiquement par ultracentrifugation, et qu'elle est dépourvue de protéines contaminantes ou d'acides nucléiques contaminants.
Dans une autre expérience typique de purification, un adenovirus comportant dans son génome une séquence d'acides nucléiques hétérologue codant pour la protéine thimidine kinase de herpès simplex de type 1 (Exemple 2, WO95/14102) est purifié en chromatographiant dans le système décrit à l'exemple 5.1. 36 ml (180 mg de protéines; 4,69 x 1013 particules) de surnageant concentré d'une culture cellulaire (Figure 7A). Le pic de particules virales collecté après chromatographie (20 ml; 5,6 mg de protéines) contenait 4,28 x 10n particules, ce qui indique un rendement en particules de 91% et un facteur de purification de 32. Après cette étape de purification, la fraction collectée présentait (Figures 7B-D) une pureté supérieure à 99% en particules virales lors de l'analyse chromatographique dans les conditions décrites à l'exemple 5.2. et un ratio d'absorbance de 1,29. L'analyse en électrophorèse de la fraction adénovirale purifiée par chromatographie effectuée dans les conditions décrites à l'exemple 5.2. a montré que cette préparation avait un niveau de pureté au moins égal à celui de la préparation obtenue classiquement par ultracentrifugation, et qu'elle est dépourvue de protéines contaminantes ou d'acides nucléiques contaminants.
5.4. Purification d'adénovirus intracellulaire par échange d'anion fort.
Cet exemple illustre comment un adenovirus comportant dans son génome une séquence d'acide nucléique hétérologue peut être purifié directement en une seule étape chromatographique d'échange d'ions a partir d'un lysat de cellules d'encapsidation productrices dudit virus.
Dans une expérience typique de purification, un adenovirus comportant dans son génome une séquence d'acide nucléiques hétérologue codant pour la protéine β- gal est purifié en chromatographiant dans le système décrit à l'exemple 5.1 (colonne
FineLine Pilot 35, Pharmacia, 100 ml de résine Source 15Q), 450 ml (soit 2.5 x 10*4 particules) de lysat concentré d'une culture cellulaire récoltée 3 jours post-infection par lyse chimique (1% Tween-20). Le pic de particules virales collecté après chromatographie (110 ml) contenait 2.15 x 10 4 particules, ce qui indique un rendement en particules de 86%. Après cette étape de purification, la fraction collectée présentait une pureté supérieure à 98% en particules virales lors de l'analyse chromatographique dans les conditions décrites en 5.2. L'analyse par électrophorèse de la fraction adénovirale purifiée par chromatographie effectuée dans les conditions décrites à l'exemple 5.2 a montré que cette préparation avait un niveau de pureté au moins égal a celui d'une préparation obtenue classiquement par ultracentrifugation, et ' qu'elle est dépourvue de protéines contaminantes ou d'acides nucléiques contaminants. 5.5. Purificaton du virus par ultrafiltration et chromatographie d'échange d'ions sur différentes colonnes.
Cet exemple illustre comment l'adénovirus contenu dans le concentrât peut être purifié directement et en une seule étape chromatographique d'échange d'ions en utilisant un gel différent du support Source 15 Q, tout en fonctionnant sur le même principe de séparation, l'échange d'anions par interaction avec les groupements aminés quaternaires de la matrice.
Dans une expérience typique de purification de l'adénovirus, différents adenovirus recombinants (codant pour la βGal, l'apolipoprotéine AI et la TK) ont été purifiés par chromatographie sur une colonne de gel Source Q30 en suivant le protocole décrit à l'exemple 5.1. Les résultats obtenus montrent que le gel Source Q30 permet d'obtenir des préparation virales d'une pureté de l'ordre de 85%, avec un rendement compris entre 70 et 100 %. En outre, les résultats obtenus montrent que Q30 possède, pour la purification d'adénovirus, une efficacité (exprimée par le nombre de plateux théoriques) de 1000 et une (quantité maximum de virus qui peut être chromatographiée sans que les pics ne s'altèrent) de 0,5 à 1 x 1012 pv par ml. Ces résultats montrent que le gel Source Q30 peut donc convenir à la purification d'adénovirus recombinants, même si ses propriétés demeurent inférieures à celles du Source Q15 (pureté de l'ordre de 99%, efficacité de l'ordre de 8000 et capacité de l'ordre de 2,5 à 5 1012 pv par ml).
Dans une autre expérience typique de purification de l'adénovirus, un adenovirus β-Gal est purifié par chromatographie sur une colonne de MonoQ HR 5/5 en suivant le protocole décrit à l'exemple 5.1. L'image chromatographique correspondant au rétentat d'ultrafiltration et à la préparation virale purifiée ainsi obtenue est illustrée sur la Figure 8.
Dans une autre expérience typique de purification de l'adénovirus, un adenovirus β-Gal est purifié par chromatographie sur une colonne Poros HQ/M en suivant le protocole décrit à l'exemple 5.1. L'image chromatographique correspondant au rétentat d'ultrafiltration et à la préparation virale purifiée ainsi obtenue est illustrée sur la Figure 9.
Exemple 6 : Purification du virus par ultrafiltration et perméation de gel
Cet exemple illustre comment l'adénovirus contenu dans le concentrât (rétentat d'ultrafiltration) peut être purifié directement par chromatographie de perméation de gel, avec des rendements très élevés.
6.1. Protocole
200 μl du rétentat d'ultrafiltration obtenu dans l'exemple 4 (soit 1,3 mg de protéines) sont injectés sur une colonne HR 10/30 (Pharmacia) remplie de Sephacryl S-1000SF (Pharmacia) équilibrée par exemple dans du tampon PBS, pH 7,2 contenant 150 mM NaCl (tampon C). Les espèces sont fractionnées et éluées avec le tampon C à un débit de 0,5 ml/min et détectées en sortie de la colonne en UV à 260 nm. Alternativement, on peut utiliser dans les même conditions de mise en oeuvre, une colonne remplie de Sephacryl S-2000, qui permet une résolution meilleure que la colonne Sephacryl S-1000HR pour des particules de 100 nm à 1000 nm.
La résolution des deux systèmes chromatographiques de perméation de gel décrit çi-dessus peut être avantageusement améliorée en chromatographiant le surnageant d'ultrafiltration (200 μl) sur un système de 2 colonnes HR 10/30 (Pharmacia) couplées en série (colonne de Sephacryl S-1000HR ou S-2000 suivie d'une colonne de Superdex 200 HR) équilibrées dans le tampon C. Les espèces sont éluées avec le tampon C à un débit de 0,5 ml/min et détectées en UV à 260 nm. Dans ce système, le pic de particules virales est très nettement mieux séparé des espèces de plus faible poids moléculaire que dans le système comportant une colonne Sephacryl S-1000 HR ou Sephacryl S-2000 seule. Dans une expérience représentative, un rétentat d'ultrafiltration (200 μl, 1.3mg de protéines) a été chromatographie sur un système de 2 colonnes Sephacryl S- ÎOOOHR-Superdex 200 HR 10/30 (Figure 10). Le pic chromatographique contenant les particules virales a été collecté. Son temps de rétention coincide avec le temps de rétention obtenu avec une préparation de particules virales purifiées par ultracentrifugation. Le pic de particules virales collecté après chromatographie (7 ml) contennait 28 μg de protéines et 3.5 109 PFU. Son analyse par chromatographie analytique d'échange d'ions dans les conditions décrites à l'exemple 5.2. montre la présence d'un pic contaminant plus fortement retenu sur la colonne d'analyse, dont la surface représentre environ 25% de la surface du pic viral. Son ratio d'absorbance 260nm/280nm qui a une valeur de 1,86 indique que ce pic contaminant correspond à des acides nucléiques. Les particules virales ont donc été purifiées environ 50 fois (en terme de quantité de protéines) et le rendement de la purification est de 85% en PFU.
Alternativement, il est possible de chromatographier les préparations de particules virales (ultrafiltrats ou fractions en sortie de chromatographie d'échange d'anions) sur une colonne TSK G6000 PW (7,5 x 300 mm; TosoHaas) équilibrée dans le tampon C. Les espèces sont éluées avec le tampon C à un débit de 0,5 ml/min et détectées en UV à 260 nm. De même il peut être avantageux d'augmenter la résolution dusystème chromatographique, en particulier d'augmenter la séparation du pic de particules virales des espèces de plus faible poids moléculaire, en chromatographiant le surnageant d'ultrafiltration (50 à 200 μl) sur un système de 2 colonnes couplées en série [colonne de TSK G6000 PW (7,5 x 300 mm) suivie d'une colonne de Superdex 200 HR] équilibrées dans le tampon C. Les espèces sont éluées avec le tampon C à un débit de 0,5 ml/min et détectées en UV à 260 nm.
Exemple 7 : Purification du virus par Ultrafiltration. Echange d'ions et Perméation de Gel
La fraction de particules virales issue de la chromatographie d'échange d'anions (exemple 5) peut être avantageusement chromatographiée dans l'un des systèmes chromatographiques par perméation de gel décrit çi-dessus, par exemple dans le but d'améliorer encore le niveau de pureté des particules virales, mais aussi principalement dans le but de conditionner les particules virales dans un milieu compatible ou adapté aux utilisations ultérieures de la préparation virale (injection,....). LISTE DE SEQUENCES
( 1 ) INFORMATIONS GENERALES :
( l ) DEPOSAN :
(A) NOM: Rhône Poulenc Rorer SA
(B) RUE: 20, avenue Raymond Aron
(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 920165
(n) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE DE PRODUCTION D'ADENOVIRUS RECOMBINANTS .
(m) NOMBRE DE SEQUENCES: 8
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (Λ) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: Simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 :
TAATTACCTG GGCGGCGAGC ACGAT 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ACCTTGGΛTG GGACCGCTGG GAACA 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: TTTTTGATGC GTTTCTTACC TCTGG 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAGACAGCGΛ TGCGGAAGAG AGTGA 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TGTTCCCAGC GGTCCCATCC AAGGT 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
AAGGACAAGC AGCCGAAGTA GAAGA 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7: (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (Λ) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: GGATGATATG GTTGGACGCT GGAAG 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
AGGGCGGΛTG CGΛCGACACT GACTT 25

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production d'adénovirus recombinants caractérisé en ce que l'ADN viral est introduit dans une culture de cellules d'encapsidation et les virus produits sont récoltes après libération dans le surnageant.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la récolte est réalisée lorsque 50% au moins des virus ont ete libères dans le surnageant.
3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la récolte est réalisée lorsque 70% au moins des virus ont ete libères dans le surnageant.
4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la récolte est réalisée lorsque 90% au moins des virus ont ete libères dans le surnageant.
5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les virus sont récoltes par ultrafiltration.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'ultrafiltration est une ultrafiltration tangentielle.
7. Procédé selon la revendication 5 ou 6 caractérisé en ce que l'ultrafiltration est réalisée sur une membrane ayant un seuil de coupure inférieur a 1000 kDa.
8. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les virus sont récoltes par chromatographie d'échange d'anions.
9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que la chromatographie d'échange d'anions est une chromatographie d'échange d'anions forts.
10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la chromatographie d'échange d'anions forts est réalisée sur un support choisi parmi les résines Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ et Poros QE, les résines de type Fractogel TMAE et Toyopearl Super Q.
11. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les virus sont récoltes par chromatographie de perméation de gel.
12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que la chromatographie de perméation de gel est réalisée sur un support choisi parmi les gels Sephacryl S-500 HR, Sephacryl S- 1000 SF, Sephacryl S- 1000 HR, Sephacryl S-2000, Superdex 200 HR, Sepharose 2B, 4B ou 6B et TSK G6000 PW.
13. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les virus sont récoltes par ultrafiltration suivie d'une chromatographie d'échange d'anions.
14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que les virus sont récoltes par ultrafiltration suivie d'une chromatographie d'échange d'anions puis d'une chromatographie de perméation de gel.
15. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la cellule d'encapsidation est une cellule trans-complementant la fonction El de l'adénovirus.
16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que la cellule d'encapsidation est une cellule trans-complementant les fonctions El et E4 de l'adénovirus.
17. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que la cellule d'encapsidation est une cellule trans-complementant les fonctions El et E2a de l'adénovirus.
18. Procédé selon l'une des revendications 15 a 17 caractérisé en ce que la cellule est une cellule embryonnaire de rein humaine, un retinoblaste humain ou une cellule d'un carcinome humain.
19. Procédé de purification d'adénovirus recombinants a partir d'un milieu biologique caractérisé en ce qu'il comprend une étape de purification par chromatographie d'échange d'anions fort.
20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que le milieu biologique est un surnageant de cellules d'encapsidation productrices dudit virus.
21. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que le milieu biologique est un lysat de cellules d'encapsidation productrices dudit virus.
22. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que le milieu biologique est une solution prepurif iee dudit virus.
23. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que la chromatographie est effectuée sur un support fonctionnalise avec une aminé quaternaire.
24. Procédé selon la revendication 23 caractérisé en ce que le support est choisi parmi l'agarose, le dextran, l'acrylamide, la silice, le polyfstyrene- divinylbenzene], le copolymère ethylene glycol-méthacrylate, seul ou en mélange.
25. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que la chromatographie est effectuée sur une résine Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ, Poros QE, Fractogel TMAE, ou Toyopearl Super Q.
26. Procédé selon la revendication 25 caractérisé en ce que la chromatographie est effectuée sur une résine Source Q, de préférence Source Q15.
27. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable d'ultrafiltration.
28. Procédé selon la revendication 27 caractérisé en ce que l'ultrafiltration est une ultrafiltration tangentielle sur membrane ayant un seuil de coupure compris entre
300 et 500 kDa.
29. Préparation virale purifiée obtenue selon le procède de la revendication 1 ou 19.
30. Composition pharmaceutique comprenant une préparation virale selon la revendication 29 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
31. Utilisation de iodixanol,5,5'-[(2-hydroxy-l-3propanediyl)-bis (acetylamino)]bis[N,N '-bis(2,3dihydroxypropyl-2,4,6-triodo-l ,3-benzenecarboxa mi de] pour la purification d'adénovirus.
32. Procède de purification d'adénovirus à partir d'un milieu biologique comprenant une première étape d'ultracentrifugation, une deuxième étape de dilution ou dialyse, et une troisième étape de chromatographie d'échange d'anions.
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