WO1996023805A1 - Tissu osseux completement dissous et procede pour le produire - Google Patents

Description

明 細 書

骨組織完全溶解体並びにその製法

技術分野

本発明は骨組織完全溶解体とその製法に係り、 特に人体に摂取 可能な機能性食品、 あるいは飼料、 医療品、 化粧品等に適用可能 な新規材料とその製法に関する。

こ こに、 「骨組織」 とは本特許において哺乳類、 鳥類及び魚類 の骨及び骨髄、 貝殻、 甲殻類外皮、 卵殻あるいは珊瑚等、 カルシ ゥム、 蛋白質、 多糖類その他微量元素を含む生物の組織の総称と して用いるものである。

背景技術

骨粗鬆症その他の骨疾病に対する補給食として、 カルシウムを 主とする機能性食品が各種市販されている。 これらのカルシウム 食品は、 現在のところ炭酸カルシウム、 乳酸カルシウム、 リ ン酸 カルシウムなどから作られるもの、 あるいは牛骨粉、 卵殻、 魚骨 粉などから作られるもの （天然の骨由来カルシウム） が主である, ところで体内に吸収されるカルシウム成分の性状と、 生体内に おける分解吸収との相関は未だ研究の余地を残している ものの、 一般的にいえば、 カルシウム塩の単純摂取に較べ、 天然の骨由来 力ルシゥムの摂取は骨疾病の回復という点で格段に優れていると 考えられる。 しかしながら従来市販されている天然カルシウム食 品、 例えば牛骨粉や魚骨粉等は、 粉砕によって顆粒にしたもので あり、 粒子が粗いために胃酸による分解が不十分で、 吸収性が悪 いという難点がある。

そこで、 カルシウム成分を効率よ く吸収させるため、 動物骨を 酸性溶液で脱灰するという技術が提案された （特開平 4 - 1 6165 号公報） 。 この技術は、 基本的には粉砕した骨粉を塩酸、 硫酸、 硝酸等の無機酸、 あるいはギ酸、 酢酸等の有機酸水溶液を用いて 脱灰した酸可溶性画分或いはこの画分に更に酵素を作用させ加水 分解して得られる水可溶性画分或いはこれらの画分から透析によ り骨由来のカルシウム塩を除去した面分に可溶性カルシウムを添 加したものをカルシウム吸収補助剤或いはカルシゥム補給剤とし て用いることを提案するものである。

より具体的には、 前記無機酸または有機酸を含有する p H 2〜 3の水溶液に粉砕した骨を懸濁させ、 3 0分〜数時間攬拌して脱 灰した後、 蛋白分解酵素 （例 ： ペプシン） を添加して酵素分解し、 0 分子量 3 0 0 0〜 6万 D aの酸可溶性画分または水溶性画分を力 ルンゥム吸収補助剤として用いるか或いはこれらの画分を脱塩し てペプチ ドと蛋白質との混合物からなる画分としこれに可溶性乳 酸カルシウム、 炭酸カルシウムを添加してカルシウム補給剤とす るものである。

s 他方動物骨はカルシウムだけでなく、 ペプチ ドやボリペプチ ド を含むコラーゲン蛋白、 ア ミ ノ酸やプリテオグリカ ン、 微量生理 活性元素等の生理活性物質を包含している。 カルシウム以外のこ れらの物質も、 生体内において重要な機能を発揮する生理活性 （ ホルモンバランスゃ腸内細菌の活性） の調整促進という面から骨 0 疾病に対する補給剤としても望ま しいことが知られている。 特に 近年発見された B M Pや B S P— I I等の蛋白質は骨形成に深く関 することが解明されており、 医薬品としての利用が検討されてい る o

ところでこの前述の従来技術では骨成分を強酸を使用して脱灰 5 するため、 生成物中には生理活性の低い成分しか残らない。 また 脱灰の前処理として動物骨を微小に粉砕するが、 この微粒化時点 で蛋白質やプリテオグリ カ ンのような生理活性のある成分が熱変 性を受けるため、 生成物は天然の骨そのままの成分を含むもので はない。

発明の開示

そこで本発明は、 骨組織が本来的に有する有効な成分を変性さ

5 せることなく純粋に、 かつ短時間で完全溶解するこ とにより骨疾 病に優れた効果を示す骨組織完全溶解体並びにその製造法を提供 することを目的とする。

本目的を達成するため本発明は、 粉砕した骨組織と可食酸とを 混合し、 減圧下において溶解する。 骨組織は哺乳類、 鳥類及び魚 , 0 類の骨を主とするが、 それらの骨髄や歯又は、 貝殻、 甲殻類外殻、 珊瑚を使用することが出来る。 また可食酸としては、 乳酸を使用 するこ とが望ま しい。

本発明に係る完全に可溶化された骨組織は骨組織を可食性の酸 性溶液と混合 （浸漬、 溶解、 懸濁） し、 減圧下で溶解するこ とに , 5 よって得られる。 減圧状態、 例えば真空状態にこの混合液を攪拌 したときには、 骨粉中の微小空隙内の空気が脱気され、 酸性溶液 が微小空隙に浸入する。

大気圧下で骨粉を可食酸と混合浸漬した場合には発泡現象が生 じ、 このために骨と溶解液との接触が阻まれるので迅速かつ十分 2 0 な溶解が達成されないが、 減圧下においては発泡が抑制されるの で、 消泡効果が高ま り、 骨と溶液との接触が促進され溶解、 処理 時間が短縮され、 溶解効率が向上する。

すなわち発泡を抑えた状態では、 骨粉は、 その外周面および内 部微小空隙がともに酸性溶液に確実に接触し、 溶解作用を受ける。 2 5 減圧により骨組織内部に浸入して接触する酸性溶液の絶対量は、 大気圧条件下に攪拌した場合における酸性溶液の接触量の数十倍 〜数百倍に達する。 このため溶解処理時間が飛躍的に短縮される とともに、 より重要な骨成分の完全溶解が可能となる （減圧度と 溶解度の関係は後述する図 7に示す通りである） 。 酸性溶液が微 小骨粉体の内部から接触し、 骨組織のカルシウム、 蛋白質、 微量 生理活性元素等が十分に抽出されるからである。

また溶解処理時間が短縮されることにより、 酸性溶液による骨 成分の変性は最小限に低滅されその収量が飛躍的に増大する。

本発明に係る骨組織完全溶解体の適用は機能性食品 （と く に力 ルシゥム補給剤） に限定されるものではない。 医薬品、 化粧品、 骨充塡剤 （医療素材） 、 歯磨き素材、 徐放性のある体内埋設ペレ ッ ト等にも適用できるものである。

但し、 機能性食品として人間が経口摂取する場合には、 人体に 害毒がないこ とが必要である。 この意味では塩酸等の強酸は、 本 発明には使用することが出来ない。 実験によれば原材料となる骨 成分に影響を与えず、 しかも人体に害毒を与えない可溶化溶液と して、 醉酸 （米酢を含む） 、 ワイ ンヴィ ネガ—、 ギ酸等の有機酸 は本願発明の実施に於いて好ま しいものである。

また溶解液として乳酸を使用した場合には、 最終生成物として 得られる骨組織完全溶解体は、 骨組織のカルシウム成分は乳酸力 ルシゥムに変換されるので、 人体への吸収性が極めて高く且つ、 骨 （組織） の全成分が完全に保たれた生理活性の高い生成物が得 られるこ とが確認できた。

図面の簡単な説明

図 1 は本発明に係る骨組織完全溶解体を例示するクロマ トグラ フィ 一である。

図 2は従来技術によって得た動物骨の脱灰成分を示すクロマ ト グラフ ィ 一である。

図 3は骨組織完全溶解体中に B M Pの存在を示すゥエスタンブ ロッテイ ング図である。

図 4 は骨組維完全溶解体のラ ッ ト背部皮下への埋植実験後の軟 X棣写真を基に作成した図である。

図 5は骨組織完全溶解体のアル力 リ フォスファターゼ活性の測 定値を示す図面である。

図 6 は骨組織完全溶解体中に B S P - Πの存在を示すウェス夕 ンブロ ッテイ ング図である。

図 7は減圧度と溶解時間の関係を示す図面である。

発明を実施するための最良の形態 図 1 は本発明に係る骨組織完全溶解体の成分を示すクロマ トグ ラフィ 一の一例である。 このように骨組織が本来有する有機物分 子量は、 最小数百 D aから最大 2 0 0万 D a以上として確認でき るが、 先述の技術では図 2に示すように 3 0 0 0〜 6万 D a程度 の狭い範囲の有機物を得るに過ぎない。 これは脱灰、 脱塩の処理 過程で、 生体利用性の高い成分を失うことを意味する。 これに対 し本発明によれば生体利用性の高い成分を失わず、 分子量 1 0 0 〜 2 0 0万 D a までの蛋白質 （ペプチ ドを含む） 、 多糖類等の有 機物を得るこ とが可能となった。

実施例

本発明に係る骨組織完全溶解体は、 例えば以下のような手順に 従って得る。

まず、 動物骨又は貝殻を発熱を極力抑えつつ適当粒径の粉体に 粉砕し、 水でよく洗浄する。 粉体の粒径は、 例えば 5 m m以下と することが望ま しい。 洗浄後、 これを適当濃度、 例えば 1 0 %濃 度の乳酸溶液と混合し、 容器ごと脱気装置内に擾拌して、 減圧状 態に放置する。 この場合、 脱気の程度が進むほど、 骨組織の溶解 処理速度が早くなる。 減圧に伴う成分変化は確認できなかった。 従って、 処理時間を最も短くするためには真空により近い状態に おいて容器を擾拌すれば良い。 擾拌温度は限定されないが、 雑菌 の繁殖を防止する等の目的から出来るだけ低温 （例えば摂氏 0 °C 以上 2 0て以下） 好ま しく は 4 ^eC程度で処理を行う ことが望ま し い

以上のような真空条件下でおよそ 5〜 6時間攪拌すると、 動物 骨及び貝殻組織の全成分を完全に溶解するこ とが出来る。 減圧し ない場合の処理時間に較べると、 処理時間は格段に早く なる。 し かも、 減圧しない場合には骨組織の全成分の溶解体は得られない 力 減圧によって全成分を未変性のまま得ることが可能となる。

以上のような減圧条件下 （必ずしも真空条件でなく とも良い） では、 骨組織が本来有するカルシウム、 有機物及び微量元素の収 量が、 非減圧の場合に較べ、 著しく増加する。 1 0 %乳酸溶液を 使用し、 減圧状態 （例えば真空状態） に置いた場合と非减圧条件 に 81拌した場合の収量を比較すると、 真空状態に置いた場合の方 が非滅圧の場合より も上述の収量が約 6〜 1 0倍となることが判 つた o

また、 以上のような減圧条件下 （必ずしも真空条件でなく とも 良い） では、 骨が本来有するカルシウム、 有機物及び微量元素を、 ほぼ完全に得ることが可能となる。 すなわち健常な天然骨組織の 蛋白質 （ペプチ ドを含む） は、 図 1 に示すように、 その分子量が 数百〜 2 0 0万 D a以上の広がりをもつが、 減圧しない条件下で 得られる骨溶解物の分子量は、 図 2に示す如くせいぜい 3千〜 6 万 D a程度である。 これに対し減圧状態に骨粉一乳酸溶液混合容 器を攪拌した場合には、 分子量 1 0 0〜 2 0 0万 D aの広がり をもつた骨組維成分を得ることが可能となった。

本発明に基づく骨組織完全溶解体は、 蛋白質を未変性の状態で 可溶化させたものであり、 生理活性を充分保持した蛋白質を含有 していると考えられる。 このことから、 骨組織完全溶解体中に存 在する B S P— II (骨シァロ蛋白質、 Bone Sialoprotein II) 及 び B M P (骨形成蛋白質、 Bone Morphogenet i c Protein) につい て、 その存在の有無と B M Pについてはその生理活性の有無につ いて確認した。

図 3は骨組織完全溶解体に BM Pが存在しているかについて検 討したものである。 方法はウエスタンブロッ トで、 抗ゥシ B M P 一 2モノ クロナール抗体を用いて確認した。 この結果、 レーン 2 には抗ゥシ B M P— 2モノ ク ローナル抗体に反応するバン ドが分 子量約 2 4 0 0 0のところに検出された。 一方、 レーン 4 にも同 様に分子量約 2 8 0 0 0に検出された。 これは骨組織完全溶解体 中に B M Pが存在し、 しかも一般に行われているグァニジン抽出 による方法より も、 より完全な伏態で存在しているこ とが示唆さ れ 7こ 0

次に、 この蛋白質が生理活性を保持しているかについて、 ラ ッ ト背部皮下への埋植実験を行い、 骨形成能の有無を調べた。

図 4 はラ ッ ト背部皮下への埋植実験を行った後の軟 X線写真を 基に作成した図である。 2及び 3で不透過像を呈しているこ とか ら骨形成能が骨組維完全溶解体に存在していることが示された。 図 5 は石灰化を起こしたペレッ ト中のアルカ リ フ ォスファ タ一 ゼ活性を測定した結果である。 2及び 3は 1 のコン トロールより 明らかに高く、 3は 2 より若干ではあるが活性が高かった。 よつ て、 図 4の不透過像は単にカルシウムの沈着ではなく骨形成を意 味するものであると考えられる。

図 6 は骨組織完全溶解体に B S P— IIが存在しているかについ て検討したものである。 抗ゥシ B S P— Hモノ クローナル抗体を 用いたゥヱスタンプロッ ト法で確認した。 この図からわかるよう に、 骨組織完全溶解体 （レーン 2 , 3 ) 中に抗ゥシ B S P— Πモ ノ クローナル抗体に反応するバン ドが検出された。

以上のように本発明に基づいて製造される骨組織完全溶解体中 には近年骨粗鬆症等の骨疾病の治療上注目されている B M P及び B S P一 I I等の骨形成に関する蛋白の存在が確認された訳で、 本 骨組織完全溶解体は単にカルシウム塩の補給だけでなく、 他の微 量生理活性元素と共に骨形成を促進する蛋白質を供給するこ とに より骨疾病の回復に寄与する各種製品の提供を可能にするもので あ 。

尚、 乳酸を使用して減圧した場合、 骨カルシウムは主として可 溶性カルシウムのかたちで得られる。 機能性食品として使用した 場合には消化吸収性は他のカルシウム塩に較べて格段に優れる。

本発明に係る骨組織完全溶解体の製造は必ずしも乳酸溶液を使 用することに限定されない。 同じ乳酸溶液を使用する場合でも、 骨組織粉に牛乳 （粉乳） を加え （必要に応じて砂糖を添加し） 、 これに乳酸菌を添加して、 室温より も高い雰囲気温度、 例えば 3 7て程度に «拌すると、 牛乳は乳酸溶液に変化して骨組織粉の 溶解作用を営む。 従って、 牛乳に乳酸菌を添加して骨組織粉と混 合し、 これを減圧条件下に置けば前記実施例と同様に天然骨成分 を短時間で完全溶解するこ とが可能となる。 この場合、 初期の温 度条件は高い方が望ま しいが、 牛乳が乳酸溶液に変じた時点で減 圧をかければ、 前記実施例と同様の結果を得る。 但し、 この条件 では乳酸への変化を待つぶん処理時間がやや長くなる。

尚、 本発明に係る骨組織完全溶解体は、 前記実施例の如き処理 過程によつて得るものに限定されない。 例えば使用する可食酸は 乳酸に限定されない。 前記実施例で乳酸を例示したのは、 溶解物 を骨疾病の回復剤あるいは機能性食品としてそのまま食するこ と を前提とした場合に、 味その他の面で最も抵抗感なく食すること の可能な溶解物を得るためであり、 食材として消化吸収したとき、 人体に害毒のない溶解物を得ることが出来るならば、 溶解液とし

5 てと く に乳酸を使用するまでもないからである。 結果において同 様である限り、 酢酸、 クェン酸、 酸性果汁などを溶解溶液として 使用しても構わない。 勿論であるが、 最終生成物 （骨組織完全溶 解体） を食材として使用しないのであれば、 塩酸その他の非可食 酸を使用するこ とも可能である。

> o また前記実施例では、 骨組織粉と乳酸溶液との混合容器を減圧 状態 （例えば真空状態） に攙拌すると説明したが、 減圧するこ と の意味は、 粉粒内空隙への酸性溶液の侵入を容易にするこ とであ る。 従って、 溶解作用をより促進させるには、 骨組織粉内部空隙 と酸性溶液との接触機会を増加させるこ とが望ま しい。 そのため _{1 5} には、 減圧状態を変化させるこ とによって、 微小空隙内に侵入す る酸性溶液の満ち干きさせても良い。 例えば 3 0分間真空状態に 攬拌後、 5分間大気圧に戻し、 さらに 3 0分間真空というイ ンタ 一バルを繰り返す等である。 イ ンタ一バルの時間は特に限定しな い。 骨粉の溶解がより短時間で完全なものとなる減圧 -非減圧の 2 0 繰り返しパターンであれば良い。

産業上の利用の可能性

本発明に係る骨組織完全溶解体は、 カルシウムのみならず近年 骨疾病 （例えば骨粗鬆症） の治療に注目されている B M Pや B S P - Π等の骨形成蛋白質を完全な形で包含するので骨粗鬆症等の

2 5 骨疾病の骨形成により積極的に作用する機能性食品の提供を可能 にする。 更に、 乳酸溶解剤として使用した場合、 骨組織カルシゥ ムは可溶性カルシウムのかたちでえられるので、 機能性食品と し - 1 o - て使用した場合の消化吸収性は他のカルシウム塩に較べて格段に 優れる。

Claims

請求の範囲

1. 天然骨組織を溶解して得た、 少なく とも蛋白質を含む有機物 とカルシウム並びに微量成分元素を包含し、 該有機物が未変性 の形で存在する骨組織完全溶解体。

₅ 2. 天然骨組織を溶解して得た蛋白質が骨形成蛋白質及び骨シァ 口蛋白質を含むこ とを特徵とする骨組織完全溶解体。

3. 可溶性カルシウムを含む 1 項記載の骨組織完全溶解体。

4. 1 項及び 2項の骨組織完全溶解体を含む食品、 飼料、 医薬品 又は化粧品。

_{] 0} 5. 粉砕した骨組織と可食酸を混合し、 該混合物を減圧下にて溶 解させるこ とを特徴とする骨組織完全溶解体の製法。

6. 溶解温度が 0〜 2 0 "Cの間である 5項記載の骨組織完全溶解 体の製法。

7. 骨組織粉と乳酸溶液とを混合し、 該混合物を減圧下で溶解さ _{1 5} せることを特徴とする骨組織完全溶解体の製法。

8. 乳酸溶液が乳汁に乳酸菌を添加し、 室温以上の温度に攪拌す るこ とにより得られる 7項記載の骨組織完全溶解体の製法。

補正書の請求の範囲

[ 1 996年 6月 27日 （27. 06. 96) 国際事務局受理：出願当初の請求の範囲 2 , 5， 6, 9及び 1 1は補正された ；請求の範囲 4， 7， 8, 1 0及び 1 2は追加された；他の請求の範囲は変 更無し。 （ 1頁） ]

I. 天然骨組織を溶解して得た、 少なく とも蛋白質を含む有機物 とカルシウム並びに微量成分元素を包含し、 該有機物が未変性 の形で存在する骨組織完全溶解体。

₅ 2. (補正後） 天然骨組織を溶解して得た蛋白質が骨形成蛋白質

又は骨シァロ蛋白質を含むこ とを特徴とする 1項記載の骨組織 完全溶解体。

3. 可溶性カルシウムを含む 1 項記載の骨組織完全溶解体。

4. (追加） 可溶性カルシウムを含む 2項記載の骨組織完全溶解体。 。

5. (補正後） 1 〜 4項のいずれか 1 項の骨組織完全溶解体を含

む食品、 飼料、 医薬品又は化粧品。

6. (補正後） 粉砕した骨組織と酸を混合し、 該混合物を減圧下 にて溶解させるこ とを特徴とする骨組織完全溶解体の製法。

7. (追加） 酸が可食性の酸であることを特徴とする 6項記載の 5 骨組織完全溶解体の製法。

8. (追加） 可食性の酸が乳酸溶液であることを特徴とする 7項 記載の骨組織完全溶解体の製法。

9. (補正後） 乳酸溶液が乳汁に乳酸菌を添加し、 室温以上の温 度に攪拌することにより得られることを特徴とする 8項記載の _ϊ0 骨組織完全溶解体の製法。

10. (追加） 減圧状態から大気圧に少なく とも 1 回戻すこ とを特 徵とする 6〜 9項記載のいずれか 1項の骨組織完全溶解体の製法。

II. (補正後） 溶解温度が 0〜 2 0 °Cの間である 6〜 9項記載の いずれか 1 項の骨組織完全溶解体の製法。

₂₅ 12. (追加） 溶解温度が 0〜 2 0ての間である 1 0項記載の骨組

織完全溶解体の製法。 補正された用紙 (条約第 19