WO1996009320A1 - Antigenic polypeptide of chlamydia pneumoniae - Google Patents

Antigenic polypeptide of chlamydia pneumoniae Download PDF

Info

Publication number
WO1996009320A1
WO1996009320A1 PCT/JP1995/001896 JP9501896W WO9609320A1 WO 1996009320 A1 WO1996009320 A1 WO 1996009320A1 JP 9501896 W JP9501896 W JP 9501896W WO 9609320 A1 WO9609320 A1 WO 9609320A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
dna
ala
seq
lys
Prior art date
Application number
PCT/JP1995/001896
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Izutsu
Kazuhiko Obara
Akira Matsumoto
Original Assignee
Hitachi Chemical Company, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi Chemical Company, Ltd. filed Critical Hitachi Chemical Company, Ltd.
Priority to ES95932194T priority Critical patent/ES2321346T3/es
Priority to AU35329/95A priority patent/AU685680B2/en
Priority to CNB951962779A priority patent/CN100365017C/zh
Priority to DE69535914T priority patent/DE69535914D1/de
Priority to EP95932194A priority patent/EP0784059B1/en
Priority to US08/809,326 priority patent/US6165478A/en
Publication of WO1996009320A1 publication Critical patent/WO1996009320A1/ja
Priority to US09/689,913 priority patent/US6489122B1/en
Priority to US09/689,916 priority patent/US6491924B1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
    • C12N9/003—Dihydrofolate reductase [DHFR] (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/295—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Chlamydiales (O)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide containing it »Synthetic protein ⁇ , its DNA, recombinant vector containing the DNA, form K transformant containing the recombinant vector, antibody production method, antibody detection ⁇ Measurement method and wipes, diagnostic method for Chlamydia pneumoniae infection and diagnostic agent, Chlamydia And reagents
  • the present invention relates to a Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide, a protein containing the same, a recombinant protein containing the DNA, a DNA thereof, a transformant containing the recombinant vector, a method for producing an antibody, Antibody detection ⁇ Measuring method and reagent, Chlamydia pneumoniae infection rare method and rare drug, Chlamydia pneumoniae gene detection ⁇ Measurement probe and primer and Chlamydia pneumoniae gene detection ⁇ Measuring method And wipe.
  • the present invention is effectively used in the pharmaceutical industry, particularly in the production of rare drugs for Chlamydia pneumoniae infection.
  • Chlamydia bacteria include Chlamydia trachonalis, Chlanydia psittaci, Chlamydia pecorum Chlamydia pneumoniae, and others. (Species :) are known. Chlamydia trachomatis is the causative agent of trachoma, venereal lymphoma granuloma, genitourinary tract infections, inclusion body conjunctivitis, neonatal pneumonia, etc. Chlamydia pneumoniae is the causative agent of respiratory infections and atypical pneumonia.
  • Chlamydia pneumoniae Symptoms of respiratory infections caused by Chlamydia pneumoniae are often susceptible to diagnosis because they are similar to those caused by Mycoplasma pneumoniae difluenza virus. Therefore, the development of a simple diagnostic method for Chlamydia pneumoniae has been desired.
  • infectious diseases are definitively determined by detecting the presence of a causative bacterium at a site of infection, or by detecting the presence of an antibody (to the causative bacterium) in blood or other body fluids.
  • the former is called an antigen test
  • the latter is called an antibody test, both of which have significant clinical significance.
  • the antibody test for Chlamydia pneumoniae is based on the presence of antibodies using the basic body of Chlamydia pneumoniae. There is a known method for detecting the
  • Chlamydia pneumoniae contains antigens that are commonly present in Chlamydia JR bacteria other than Chlamydia pneumoniae, namely Chlamydia trachomatis or Chlamydia •
  • the method using this elementary body as an antigen has a drawback of lacking specificity.
  • pBBK10MM is known as a plasmid capable of expressing a large amount of a protein in a large-footed bacterium (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-117284).
  • This plasmid is capable of expressing a fusion protein of DHFR and an anti-allergic peptide. Since the obtained »protein also retains the DHFR enzymatic activity, the fusion protein can be easily purified using the properties and activity of DHFR.
  • JP-A-64-50083 and U.S. Pat. No. 5,218,518 disclose the Chlamydia pneumoniae chromosomal DNA itself or the chromosomal DNA with a restriction enzyme or the like. It only describes the use of the DNA fragment obtained by digestion as a probe. The sequence of base B2 of these DNAs is not clear, therefore the specificity of the probe is not known, and the setting of reaction conditions is also unclear. Have difficulty.
  • the present invention relates to Chlamydia's Chlamydia
  • Still another object of the present invention is to provide a technique for synthesizing this antigen polypeptide in a large amount using a gene recombination technique.
  • the present invention provides a method for producing an anti-Chlamydia pneumoniae-specific antibody, a method for detecting / measuring an anti-Chlamydia pneumoniae-specific antibody, a reagent thereof, and a Chlamydia using the antigen polypeptide.
  • the aim is to provide a rare drug for pneumoniae infection.
  • the present invention provides a probe and a primer for specifically detecting and determining Chlamydia pneumoniae gene, and further provides a Chlamydia pneumoniae gene using the probe or the primer. It is also an object of the present invention to provide offspring detection and measurement methods and wipes, as well as rare drugs for Chlamydia pneumoniae infection.
  • Still another object of the present invention is to provide an antigen polypeptide for detecting an antibody that reacts in common with Chlamydia bacteria such as Chlamydia * pneumoniae, Chlamydia trachomatis, and Chlamydia sp. I do. Summary of the Invention
  • the present invention relates to the following (1) to (45).
  • a plasmid comprising a polypeptide comprising at least five consecutive amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as polypeptide AJ)
  • polypeptide A is a polypeptide in which amino acid is missing from the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • Polypeptide A is strong, and the amino acid in the polypeptide of SEQ ID NO: 1 is different from other amino acids.
  • the antigen polypeptide described in the above (1) which is a polypeptide that is concealed with carboxylic acid or that has amino acid incorporated in the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • Polypeptide A is a polypeptide in which amino acid or peptide is combined with at least five consecutive amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • the antigen polypeptide according to (1) is a polypeptide in which amino acid or peptide is combined with at least five consecutive amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 1. The antigen polypeptide according to (1).
  • the polypeptide A is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the antigen polypeptide according to the above (1) is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Polypeptide A is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The antigen polypeptide described in (1).
  • Polypeptide A is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • a DNA encoding the antigen voriveptide according to any one of (1) to (7) or a DNA complementary thereto.
  • a method for producing an anti-Chlamydia pneumoniae antibody which comprises using the antigen boriveptide according to any one of (1) to (7) as an antigen.
  • a method for detecting and measuring an anti-Chlamydia 'pneumoniae antibody comprising using the antigen polypeptide according to any one of (1) to (7) as an antigen.
  • a drug for detecting and measuring an anti-Chlamydia 'pneumoniae antibody comprising the antigen polypeptide according to any one of (1) to (7) above as an antigen.
  • a diagnostic agent for Chlamydia pneumoniae infection comprising the antigen polypeptide according to any one of the above (1) to (7) as an active ingredient.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 14 directly or via an intervening amino acid sequence.
  • E A polypeptide containing at least 5 contiguous amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • Peptide hereinafter referred to as "polypeptide 8" is bound to dihydrofolate, which is an enzyme of Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide.
  • Polypeptide B has the amino acid in the polypeptide of SEQ ID NO: 1 substituted with another amino acid, or has no amino acid in the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence is the base sequence of E sequence number 17; the DNA 0 (26) above E (24) E base sequence is the clay base E sequence of SEQ ID NO: 18; (24) The DNA according to the above. (27) A recombinant vector containing the DNA according to any of (24) to (26) above.
  • (31) A method for detecting and measuring an anti-Chlamydia 7 / Pneumoniae antibody, comprising using the fusion protein K according to any one of (19) to (23) as an antigen.
  • a reagent for detecting and measuring an anti-Chlamydia pneumoniae antibody comprising the protein of any one of (19) to (23) as an antigen.
  • a drug for detecting and / or determining the presence of a clamophila / pneumoniae gene comprising the probe described in any of (34) to (36) above.
  • a diagnostic agent for Chlamydia pneumoniae infection comprising the probe according to any one of (34) to (36) as an active ingredient.
  • a wipe for detecting and measuring a Chlamydia pneumoniae gene comprising the primer according to any one of (40) to (42).
  • a diagnostic agent for Chlamydia pneumoniae infection comprising the brimer according to any of (40) to (42) as an active ingredient.
  • the present invention also resides in the following (46) to (52).
  • An antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae selected from the group consisting of:
  • An antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae selected from the group consisting of:
  • a deoxynucleotide having one base is referred to as monodeoxynucleotide, and a deoxynucleotide having two or more bases is collectively referred to as DNA unless otherwise specified.
  • the antigen polypeptide of the present invention comprises at least 5 g of amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of the small size of ft in which the peptide has antigenicity. It consists of polypeptides (hereinafter referred to as polypeptide AJ). Since the longer the amino acid sequence, the higher the sensitivity of the antigen-antibody reaction can be expected, the polypeptide A is preferably 20 or more, more preferably 100 or more, and more preferably 3 or more. Those composed of amino acids of 50 ⁇ or more are preferred.
  • polypeptide lacking an amino acid for example, 1 to 250
  • the antigenicity of polypeptide A as Chlamydia pneumoniae tends to be impaired.
  • the amino acids are rapidly converted to polypeptides (for example, in order to maintain the antigenicity of Chlamydia pneumoniae). (5 or more) It is preferable that these are missing.
  • amino acid (for example, 1 to 100) in the polypeptide of SEQ ID NO: 1 is used. It may be substituted with another amino acid, or the amino acid (for example, 1 to 100) is inserted into the polypeptide of SEQ ID NO: 1. There may be. If the number of amino acids to be replaced or inserted is too large, the antigenicity of polypeptide II as Chlamydia pneumoniae tends to be impaired.
  • polypeptide A is one in which amino acids are continuously (for example, 5 or more) modified or inserted.
  • the amino acids to be replaced preferably have similar properties, for example, substitution of glycine for alanine.
  • polypeptide A may have at least 5 amino acids consecutively in the polypeptide of SEQ ID NO: 1. It may be a polypeptide having an amino acid or a peptide bound to the sequence directly or via an intervening amino acid sequence.
  • such a peptide preferably has an amino acid sequence of 100 ⁇ or less, and preferably has an amino acid sequence of 500 or less. And more preferably those having 200 or less amino acid sequences.
  • Examples of such an amino acid or peptide include leucine, leucine monomethionine, dihydrofolate reductase (DHFR), and 5-galactosidase.
  • polypeptide when DHFR or / 8-galactosidase or the like is used as the peptide include, for example, DHFR-Chlamydia pneumoniae antigen, and) ⁇ butide fusion protein K or -galactosidase-Chlamydia pneumoniae antigen poly ⁇ Peptide »There is protein K. DHFR or 8-galactosidase and Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide may be directly spun or via an intervening amino acid sequence.
  • polypeptide A examples include, for example, the polypeptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 5.
  • the intervening amino acid sequence is not particularly limited, and examples thereof include a leucine and a leucine-methionine amino acid sequence.
  • a specific example of the synthetic protein of the present invention is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 including the entire 53 KDa antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae is desired. Good.
  • Methods for producing the antigen polypeptide of the present invention include a chemical synthesis method and a gene recombination method.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 1 of the present invention is an antigen polypeptide composed of 488 amino acid residues as shown in the sequence listing.
  • polypeptide of SEQ ID NO: 2 of the present invention is an antigen polypeptide consisting of 271 amino acid residues as shown in the sequence listing.
  • the polybeptide of SEQ ID NO: 5 of the present invention is an antigen polypeptide consisting of 259 amino acid residues as shown in the sequence listing.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 1 which contains the entire 53 KDa antigenic polypeptide of Chlamydia pneumoniae, is desirable.
  • Methods for producing the antigen polypeptide of the present invention include a chemical synthesis method and a gene recombination method.
  • a map (Malple Antigen Poptide. MAP) method, which is suitable for synthesizing a peptide consisting of 30 or less amino acid sequences. ⁇ Can be synthesized using a butyde synthesizer.
  • a recombinant vector is constructed by inserting a DNA encoding the antigenic polypeptide of the present invention into a vector, and the recombinant vector is inserted into a host to produce a transformant.
  • a method for purifying a target peptide from a transformant There is a method for purifying a target peptide from a transformant.
  • the DNA encoding the antigen polypeptide of the present invention will be described later.
  • Examples of the vector include Brasmid II phage.
  • Examples of the host include O. faecalis, Bacillus subtilis, and yeast.
  • pBR322 As the existing plasmid vector, for example, pBR322, pUC18, pUC19, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and the like can be used. pBR322, pUC18 and pUC19 are commercially available, and pBBKIOMM is described in detail in JP-A-4-117284.
  • phage vector As the phage vector, gtll phage, sglO phage and the like can be used. In each case, a recombinant vector corresponding to the parent vector used is obtained.
  • Examples of the recombinant vector containing the DNA of the present invention include pCPN533a plasmid, 53-3-S ⁇ phage and the like, as described later.
  • the obtained recombinant vector is put into a host to prepare a transformant.
  • Escherichia coli can be used as a host. Treat this host as a competent cell.
  • Combination cells obtained by treating the large bacterium HB101 are sold by Takara Shuzo.
  • a method for preparing a transformant by introducing the reaction product of the above E-clotting into a host is described in the literature, Molecular Cloning.
  • the resulting transformants are cultured to form colonies, and plasmid DNA is obtained from each colony, cut with appropriate restriction elements, and analyzed by agarose gel «electrophoresis to obtain the desired recombinant plasmid.
  • plasmid vector thus produced is p CPN 5330 [plasmid.
  • the transformant thus produced there is Escherichia coli HB101 strain containing the aforementioned recombinant vector pCPN5333 ⁇ .
  • DH FR Preparation of recombinant vector containing D **, which encodes an antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae, and preparation of a transformant containing the same
  • D ** which encodes an antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae
  • a linker if necessary.
  • a linker if necessary, a commercially available kit, for example, a DNA LAIGE YON KIT (Muro Shuzo) can be used. If the DNA obtained by ligation does not have an origin of replication and does not function as a brassmid, insert this DNA into a new brassmid vector.
  • pBR322> pUC18 can be used.
  • the reaction product of the above ligation is placed in a host to produce a form K transformant.
  • a brassmid derived from a large leg bacterium can be used. If it is a large host, bacteria can be used, and for example, the large Si strain HB101 can be used. Treat this host to become a competent cell. Large) Combinent cells obtained by treating one strain of HB101 are sold by Takara Shuzo. A method for preparing transformants by putting the reaction product of Kamikaze Renki into a host is described in the literature 'Molecular' Cloning '.
  • the resulting transformants are cultured to form colonies, and plasmid DNA is obtained from each colony, cut with an appropriate restriction enzyme, analyzed by agarose gel electrophoresis, and extracted with the desired recombinant plasmid. Select a transformant.
  • the plasmid vector thus prepared is, for example, pCPN533T brasmid.
  • Examples of the form R transformant thus produced include the above-mentioned recombinant vector PCPN5333T-containing H. coli strain HB101.
  • the culture of the transformant is performed by shaking the incubator at a suitable temperature in a medium in which the transformant K can grow until the antigen polypeptide is sufficiently accumulated in the transformant.
  • the E. coli HB101 strain containing the above-mentioned recombinant vector pCPN5333o [or PCPN5333T] is used as a transformant, use an LB medium containing ambicillin. Incubate overnight at * C with shaking, then inoculate this culture into TB medium containing ambicilin and incubate at 37 ° C with shaking.
  • a method for transcribing TB medium is described in the document 'Molecciura' 'Cloning'.
  • transformants To disrupt the cultured form K transformants, collect the transformants by centrifugation, suspend them in a buffer, and irradiate them with ultrasonic waves. If the transformant is O. cerevisiae, Lysozyme may be added to the solution, and the cells may be lysed by adding a buffer containing SDS.
  • target polypeptide is secretory, centrifuge the culture and obtain the supernatant.
  • the supernatant is killed with ammonium sulfate and centrifuged. Normally, a precipitate is obtained, but the target peptide may be contained in the supernatant. Sampling should be performed to confirm the presence of the target peptide.
  • the DNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1 refers to the polypeptide of SEQ ID NO: 1 in the triplet code table (1 to 6 for each amino acid). Are assigned to the same nucleotide sequence as in the above), and are selected from the DNA group (including the DNA of SEQ ID NO: 3) when amino acids are replaced with nucleotide sequences in accordance with It is.
  • the DNA encoding the antigen A is a DNA encoding the polypeptide A.
  • the DNA encodes the amino acid sequence of the polypeptide A according to the triplet coding table. DN selected from the DNA group read into the nucleotide sequence A thing.
  • polypeptide A examples include those described in the section of the antigen polypeptide, and the DNA encoding the polypeptide A also has a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of those polypeptides. .
  • the DNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is a DNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 in the triplet code table (1 to 6 different amino acid sequences). DNA sequence selected from the group consisting of DNAs when amino acids are replaced with nucleotide sequences in accordance with (SEQ ID NO: 4). It is.
  • the DNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 5 refers to a group of DNAs obtained by replacing the amino acid with the nucleotide sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 5 according to the Triblett coding table (including Is also included in the DNA of SEQ ID NO: 7).
  • the DNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 6 refers to a group of DNA obtained by replacing the amino acid of the SEQ ID NO: 6 with a nucleotide sequence in accordance with the Triblett coding table. (Including the DNA of No. 8).
  • the DNA encoding the fusion protein is not particularly limited as long as it is composed of the genetic code corresponding to the amino acid sequence of the fusion protein.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 is the nucleotide sequence of DNA coding for protein K, which is a combination of DHFR and the whole Chlamydia 'pneumoniae 53 kDa antigen borypeptide.
  • SEQ ID NO: 18 Has the nucleotide sequence of a DNA coding for a fusion protein of DHFR and a Chlamydia newmonier 53 kDa antigen polypeptide (-part). These DNAs can be produced by a chemical synthesis method or a gene recombination method.
  • the chemical synthesis method includes, for example, the phosphoramidite method, which is suitable for the synthesis of DNA consisting of a base sequence having a total length of 100 bases or less. Can be synthesized.
  • Gene recombination methods include, for example, the method of cloning DNA from the basic body of Chlamydia pneumoniae by the method described above, There is a PCR method using a primer prepared based on the base sequence at the position (1). ⁇ The gene recombination method can produce DNAs as long as 100 bases or more.
  • Chlamydia 7 pneumoniae includes, for example, Chlamydia 'Pneumoniae YK41' (Kanemoto et al .: Microbiological 'Immunology, 37, 495-498, 1993 (Y. Kananoto et al., Microbiol Immuno 1 .. Vol. 37, p. 495-498. 1993)). Purification of the basic body of Chlamydia pneumoniae
  • Chlamydia ⁇ Pneumoniae-infected HL cells are disrupted, centrifuged, and the supernatant is recovered. Add the supernatant to a continuous density gradient using Perographin (manufactured by Sealing) and centrifuge. In a preliminary experiment, it was confirmed by electron microscopy that basic white bodies of Chlamydia pneumoniae were contained in a white band with a yellow tint, so this band was collected. Chlamydia 'pneumoniae's genomic DNA silk
  • the basic body of Chlamydia pneumoniae is suspended in 10 mM Tris-HCl buffer (PH8.0) containing I mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (hereinafter referred to as TE buffer).
  • TE buffer I mM ethylenediaminetetraacetic acid
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • 0.1 M Tris-hydrochloric acid solution pH 8.0
  • Saturated phenol is added, stirred, eccentrically separated, and the aqueous layer is collected.
  • the cells are treated with an RNA degrading enzyme (RNase), treated with fuminol-clo mouth formnoisoamyl alcohol and treated with ethanol precipitation to obtain genomic DNA of Chlamydia pneumoniae.
  • RNase RNA degrading enzyme
  • Genomic DNA is digested with restriction enzymes Accl, HaeHI and AluI, and treated with phenol Z chloroform / isoamyl alcohol and precipitated with ethanol to obtain a partially digested DNA.
  • a linker, adenosine 5'-triphosphate (hereinafter abbreviated as ATP) and T4 ligase are added to the partially digested DNA, and T4 ligase is added to the partially digested DNA. Add a linker.
  • Chroma 'Spin 600 Chroma spin 6000
  • 10 mM Tris-HCl buffer containing 0.1 M NaCl and 1 mM EDTA as the mobile phase
  • eluate is collected.
  • It is reacted by addition of ATP and T 4 polynucleotide kinase in fractions obtained t recovering fractions containing DNA fragments from 1 kbp 7 kbp, to re phosphorylated 5 ' ⁇ of DNA fragments.
  • the reaction mixture is treated with phenol / chloroform-formamylisoamyl alcohol and precipitated with ethanol to obtain a 5'-end phosphorylated DNA fragment.
  • the above genomic DNA expression library was infected to the culture solution of E. coli Y1090 r-meg, cultured on an agar medium, and immersed in an aqueous solution of isopropylthio-11-D-galactoside (IPTG).
  • IPTG isopropylthio-11-D-galactoside
  • the protein produced in the cells by the expression of the inserted DNA is attached to the nitrocellulose filter.
  • This filter is subjected to a blocking reaction using bovine serum albumin and washed.
  • the filter is then reacted with a Chlamydia pneumoniae-specific monoclonal antibody.
  • Chlamydia pneumoniae-specific monoclonal antibodies include AY6E2E8 and SCP53.
  • Hypridoma producing AY6E2E8 has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERBP-5l54.
  • the hybridoma producing SCP53 is also described in Journal of Clinical Clinical Microbiology, 132, 583-588 (1994) (J. Clin. Microbiol .. Vol. 132. p. 583-588, 1994).
  • the filter is washed and reacted with an anti-mouse IgG antibody that has been stimulated with an enzyme such as peroxidase.
  • the filter is washed, and a coloring substrate solution is added to react.
  • a coloring substrate solution for example, a solution containing an aqueous solution of hydrogen peroxide and a methanol solution of 4-chloro-11-naphthol can be used. After the reaction, wash the filter and air dry.
  • D ⁇ is obtained from the phage and is produced.
  • a primer, tack polymerase (Taq Polymerase) and deoxynucleotides are added, and the steps of heating, cooling, and keeping the temperature are repeated, thereby widening the DNA inserted into the DNA.
  • the primer include a gtll forward primer (Agtll forward primer) and an Igtll reverse primer ( ⁇ gtll reverse primer) (both manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • the cupolase include ambri- tac DNA-polymerase (Amp1Taq DNA Polymerase). The general method of this DNA amplification method is PCR.
  • a commercially available kit can be used to obtain DNA. For example, a Wizard, PCR, and Blep Kit (Wizard PCR Prepki I) (Promega) can be used.
  • the nucleotide sequence can be determined by a fluorescent male terminating sequence method using tack polymerase.To use this method, a kit sold by Perkin Elma Japan Co., Ltd. Can be used.
  • a commercially available machine for example, a DNA type 3733A sequencer (Available Biosystems) can be used.
  • DNA base sequence is analyzed with a gene sequence analysis software to edit, link, and estimate the amino acid translation region.
  • DNA sequence E analysis software “DNA SISS (Hitachi Software Engineering) can be used.
  • the DNA encoding DHFR can be obtained by cutting the DNA from a plasmid vector containing the DNA using a restriction enzyme, or by converting the DNA containing the DNA into a ⁇ or ⁇ genomic DNA.
  • the DNA is obtained by performing PCR using a primer and amplifying the DNA.
  • a brassmid vector pBBK10MM or pCPN533T which is also the recombinant vector of the present invention, is used as a plasmid vector containing DNA encoding DHFR.
  • Brassmid can be obtained from this Escherichia coli (Blasmid-retaining bacterium) by following the usual method for obtaining a plasmid DNA, which is described in the literature * Molecular 'cloning'.
  • a DNA fragment of about 4.6 Kbp may be cut out using BamHI and Xho! As restriction enzymes.
  • the above-mentioned pBBK10MM or pCPN5333 can be used as it is as brassmid DNA
  • the genomic DNA of Bacillus S for example, can be used as genomic DNA
  • a general method of obtaining a genomic DNA may be used, and this method is described in the literature 'Molecular' cloning '.
  • the primer used in the latter method can be synthesized by considering the base E sequence at the 5 'end and 3' end of the DNA encoding DHF R. For example, it is possible to use an oligonucleotide having a sequence from the 1st to the 20th of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide having a sequence complementary to the sequence from the 46th to the 48th. it can. These oligonucleotides can be chemically synthesized using a commercially available DNA synthesizer.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 1 containing the entire 53 KDa antigenic polypeptide of Chlamydia pneumoniae is desirable.
  • Method for producing anti-Chlamydia 'pneumoniae antibody using antigen polypeptide as antigen is desirable.
  • mice are immunized with the antigen polypeptide of the present invention as an antigen, and the cells are fused with a myeloma cell line to produce a hybridoma.
  • Hybridomas that recognize the 53 kDa antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae can be selected from them, and the hybridomas can be obtained by culturing the hybridomas.
  • Myeloma cell lines include, for example, P3X63Ag8.653 (ATCCCRL 1 580) and P 3ZN SI / 1—Ag 4-1 (ATC CTIB— 18) can be used.
  • an anti-Chlamydia pneumoniae antibody is produced according to a known general method of immunizing a mouse to obtain an antibody. Detection of anti-Chlamydia pneumoniae antibodies using antigen polypeptides as antigens • Determination method and reagents, and diagnostic drug for Chlamydia humoniae infection using antigen polypeptides as active ingredients
  • To detect and measure the anti-Chlamydia * pneumoniae antibody for example, immobilize the antigen polypeptide on a carrier, add a sample, wash, add a secondary antibody that has been isolated, wash, This label is detected or measured directly or indirectly.
  • the carrier for example, latex particles, cellulose yarn, other plastic Atsulate TM particles, or the like can be used.
  • the specimen for example, blood of a human or the like is used.
  • Washing is performed using a phosphate buffer containing a surfactant or the like.
  • An example of a secondary antibody that has been grouped is a micronized anti-human monoclonal antibody.
  • a variety of males can be used, such as alkaline phosphatase, luciferase, peroxidase, and / 3-galactosidase.
  • a fluorescent substance such as an enzyme and fluorescine can be used.
  • a chemical substance such as biotin, avidin, streptoavidin, digoxigenin, etc. may be interposed between the antibody and the target substance.
  • a label directly or indirectly, for example, if the label is an enzyme If this is the case, add the substrate and detect and measure the light or color generated by the catalytic action of the enzyme or measure the change in absorbance.
  • the substance is a fluorescent substance
  • the reaction system is irradiated with ultraviolet light, and the generated fluorescence is detected and measured.
  • a sensitizer if necessary.
  • Anti-chlamydia using the above-mentioned antigen polypeptide as an antigen a detection and detection wipe for pneumoniae antibody, for example, a swab for immobilization of a princess antigen polypeptide on a carrier or the above-mentioned male Some of them contain the necessary amount of the secondary antibody, substrate, etc.
  • the above reagent can be used as it is.
  • Detection of Chlamydia pneumoniae Probes for measurement and primers DNA coding for 53 KDa antigen polypeptide specific to Chlamydia pneumoniae has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 .
  • the probe and the primer of the present invention are:
  • the length of the base sequence is preferably from 10 to 50 bases, and more preferably from 15 to 20 bases.
  • probe and the primer of the present invention include, for example, a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the probes and primers of the present invention can be easily synthesized using a commercially available DNA synthesizer S.
  • DNA synthesizers are sold by Applied Biosystems and others.
  • a short DNA fragment must be chemically synthesized in advance and used as a primer to perform the PCR method described below to produce a long DNA fragment. Can also.
  • the probes and primers of the present invention include those in which the above DNA is labeled with a complex.
  • Examples of the ridge fabric include chemical substances such as biotin, avidin, streploavidin, digoxigenin, alkaline phosphatase, and luciferase. There are enzymes such as Peroxidase) and 3-galactosidase, and fluorescent substances such as Fluorescine.
  • biotin for example, deoxyduridine-5'-triphosphate, which has been biotinylated, is added to the probe in the presence of terminal transferase.
  • Terminal transferase-piotinylated deoxydiridine 15'-triphosphate can be purchased as a kit from Boehringer Mannheim.
  • kits can also be used when adding labels other than biotin, and such kits can be purchased from Takara Shuzo Co., Ltd. or Toyo Fangata Co., Ltd. Alternatively, the target may be added in accordance with the method described in the document “Mole Kiura 1. Cloning”.
  • a radioisotope can be used as the label, in which case, for example, (7-32P) dATP is added to T4 polynucleotide kinase in the presence of T4 polynucleotide kinase.
  • 7-32P 7-32P
  • dATP 7-32P
  • T4 polynucleotide kinase can be purchased from Toyobo Co., Ltd.
  • (32P) d ATP can be purchased from Amersham Co., Ltd.
  • RNA corresponding to the nucleotide sequence of the probe or the primer of the present invention that is, thymine becomes peracil as a base!
  • Nucleic acid in which deoxyribose is replaced by ribose as a sugar can also be used as the probe or primer of the present invention.
  • Probes and primers whose components are RNA can also be detected by the method of the present invention. It can be used for measurement reagents.
  • Detection and measurement of Chlamydia pneumoniae gene using the probe of the present invention include, for example, electrophoresis of DNA in a sample, separation of the DNA by molecular weight, The DNA is transferred and fixed to a nitrocellulose filter, nylon membrane, or the like, and the probe of the present invention, which has been sensitized, is added to detect and measure the hybridization. This method is called the Southern blot method, and its general method is described in the literature 'Molecular. Cloning *'.
  • the PCR method is performed.
  • the specific steps of the method for detecting and measuring Chlamydia pneumoniae genes using the PCR method using the primers of the present invention are as shown in the lower era.
  • a buffer containing the primer, DNA polymerase, dATP, dCTP, dGTP and dTTP of the present invention is added to a sample containing DNA and heated.
  • the sample containing DNA in step (a) is, for example, a sample obtained by extracting nucleic acid from a patient's pharyngeal stick scraping material.
  • Tac polymerase can be used as the DNA polymerase in step (a).
  • Tack polymerase can be purchased from Toyobo.
  • the heating in the step (a) is performed, for example, at 90 to 100 and left for 0.5 to 10 minutes.
  • the cooling in the step (a) is performed, for example, at 45'C to 65 for 0.5 to 5 minutes, and the temperature is kept at, for example, 70. And 1-1 0 minute electrostatic S in Celsius to 8 0 hand, the heating is allowed to stand for 0.5 to 5 minutes at ⁇ 1 0 0 e C Te example 9 0.
  • step (II) The heating operation in the step (a) and the cooling, warming and heating operations in the step (a) are performed by using a DNA thermal cycler (registered trademark) (Perkin-elmer Cetus). ).
  • the number of repetitions of step (II) is not particularly limited, but is repeated about 30 times.
  • the reaction solution is subjected to electrophoresis using an agarose gel containing Oka Chemical Corporation, and the DNA contained in the reaction solution is separated by molecular weight. Irradiate with ultraviolet light. If the used primer of the present invention is ⁇ marked with a woven fabric ⁇ , the DNA is detected and measured using the ⁇ ⁇ .
  • the primer of the present invention to be added has a different base sequence, and the steps (a) to ( ⁇ ) are performed again, and then the step (e) is performed. You may enter.
  • Detection of Chlamydia pneumoniae geneWipe for measurement Detection of Chlamydia pneumoniae geneWater for the present invention is, for example, an aqueous solution containing the probe or primer of the present invention. Some are stored frozen in plastic containers.
  • plastic culture flasks phosphate bottom HL cells were ⁇ when to fold (7 5 cn J) slow ⁇ saline washed with (hereinafter, referred to. PBS) magnesium free (one) solution 5Al, Add 5 nl of PBS containing 0.1% (WZV) trypsin to spread over the entire cell surface, discard the solution, and incubate at 37 for 10 minutes, then 10% (v / v) fetal calf serum 5 nl of Dulbecco's MEM medium containing HL cells was added, and the HL cells were subjected to betting to prepare a cell suspension.
  • PBS magnesium free (one) solution 5Al
  • WZV 0.1%
  • a centrifuge tube containing 50% (w / v) sucrose contains 0.03M Tris monohydrochloride mouthwash (pH 7.4), followed by Perographin 76% (manufactured by Schering) with 3 volumes and 0.0 A mixture with 7 volumes of 3 M Tris-monohydrochloric acid bite solution (pH 7.4) was layered, and the previously collected upper layer was carefully layered and centrifuged at 8,000 rpm for 1 hour. . 50% (w / v) containing sucrose 0.0 3M Tris-hanic acid tt Quartz (PH7.4) layer and sediment were collected, and the same volume of SPG was added to the collected solution to obtain 10.0%. Separation was performed at 0 rpB for 30 minutes.
  • a 1% aqueous SDS solution (301) and a 1 ng / ml aqueous solution of proteinase K (301) were added, and the mixture was incubated with 56 for 30 minutes to dissolve the basic bodies.
  • 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) Saturated phenol Add 350 w 1 and mix well with a vortex mixer, then 4 min at 12.00 rp »for 5 min. Then, the aqueous layer was recovered (DNA extraction). This extraction operation was repeated once more. 1 Ong / Bl RNase solution was added, and the mixture was incubated at 37 for 2 hours to degrade RNA.
  • M-buffer for restriction enzyme 100 // 1 a restriction enzyme mixture (Acc I, Hae HI, and Al (Mixing) 101 was added and reacted at 37'C for 20 minutes.
  • the reaction time of 20 minutes was the time required for the DNA to be decomposed into partially digested DNA having a size of 1 kbp to 7 kbp, and was previously tested using a small amount of genomic DNA.
  • PCI to the above reaction solution 100 # 1 was added, mixed well with a vortex mixer, and centrifuged at 4,12,000 rpn for 5 minutes to collect an aqueous layer.
  • Tris-HCl buffer pH 7.6, below, for 10-fold concentration ligation »Mouth solution
  • Purified water 2 // 1 and T 4 ligase were added, and the mixture was reacted at 16 for 4 hours to add a linker.
  • the bone MB cell line used to produce the monoclonal antibody was P3ZNSIZ1—Ag411 (ATCCTIB-18).
  • the cells were cultured in a RPMI164 medium containing 10% (vv) fetal calf blood and subcultured.
  • Cells 0.1 to 3 mM 8-azaguanine, 0.5 gZni 1 MC—210 (Mycoplasma remover, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 10 % (v / v) fetal bovine serum, and M culture was performed once in RPMI 1640 medium, followed by ⁇ in normal medium.
  • mice were intraperitoneally injected with a purified S3 solution of 100 u ⁇ 1 with a protein concentration of 2700 u ⁇ / m ⁇ . Furthermore, on the 69th day, a suspension of purified basic bodies with a protein concentration of 800 # gZm1 was placed on the 5th and 9th days. The spleen was removed on the 95th day and subjected to cell contact.
  • the purified basic body of Chlamydia pneumoniae YK41 is solubilized with 1% (w / v) SDS, and it is added to 0.05M sodium bicarbonate solution containing 0.02% sodium azide (pH 9.6). After dialysis, dilute the protein to a protein concentration of l ⁇ 10 iz g / ml. Overnight to allow the antigen to be adsorbed. The supernatant was removed, and PBS was added to the wells with PBS 1501 containing 0.02% (w / V) Tween 20, left for 3 minutes, and then removed and washed.
  • the plate was added with PBS containing 1% (vZV) bovine serum albumin in PBS, and allowed to stand overnight at 4 ° C for blocking. After removing PBS containing bovine serum albumin, wash the cells twice with PBS containing 0.02% ( W / v) Tween 20 in the same manner. 1 was added, and the mixture was filtered at room temperature for 2 hours 0.03% (wZv) Twenty times after washing twice with PBS containing Tween 20, the well was washed with 25 ng Zm1 peroxidase.
  • the cell concentration of the combined cells was measured in a 24-well plastic culture vessel, and each was diluted with HT medium so that the cell number was 20 / m1.
  • 4 to 6-year-old mouse thymus cells suspended in HT medium were placed in a 96-liter plastic culture vessel at 2 x 05 cells / ml, and the »integrated cells (cell concentration of 20 1) was added in 5 0 1 wells, and cultured at 36 in a 5% (v / v) carbon dioxide atmosphere.One, seven and 14 days after that, 1-2 drops of HT medium were added. added.
  • the culture supernatant of ⁇ Xl in which ⁇ 1 was observed was collected at 50 it1, and production of the antibody was confirmed in the same manner as in E.
  • the dormer AY 6 E 2 E 8 is ⁇ fertilized with 1 0% (vZv) fetal bovine serum-containing RPM 1 1 6 4 0 medium 2 0 m 1 to 7 5 cm 2 Brass ticks manufactured cell culture flasks containing, Withdraw 16--18 ml from the culture every 3-4 days, and replace with a fresh medium containing 10% (v / v) fetal calf serum RPM1164 medium in total of 2 Om 1 and And subcultured. The extracted and collected cell culture solution was centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes to recover the supernatant (culture supernatant containing a monoclonal antibody).
  • the subclass of the monoclonal antibody was identified using I S OTYP EAb-STAT (manufactured by SangStadMedica1). As a result, the subclass of the monoclonal antibody produced by Hypri-Doma AY6E2E8 was 1 gG2b. Purification of monoclonal antibodies
  • the monoclonal antibody produced by the hybridoma AY6E2E8 was purified as follows. Hypridoma AY6E2E8 was injected into the mouse tt cavity containing the monoclonal antibody, and 1 volume of tt water was added to 3 volumes of PBS, combined, and then incubated at 300 rpm for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant was filtered with a filter having a pore size of 0.22, and the mixture was subjected to chromatography using a “Knob Super Brotin A column (4.6 IBX100 orchid B, manufactured by NGK Insulators, Ltd.). The column was previously equilibrated with PBS.
  • the monoclonal antibody was eluted by flowing for 5 minutes.
  • the eluted fractions of the monoclonal antibody were collected and diluted with TTBS solution.
  • Chlamydia Dissolves the basic body of Pneumonia and is contained in the basic body. Acquired the peptide. Using this peptide and the monoclonal antibody described above, austin blot was performed, and the specificity of the obtained monoclonal antibody was determined by 80%.
  • the obtained monoclonal antibody was found to be S »of Chlamydia 'pneumoniae 53 KDa antigen polypeptide.
  • Hybridoma 70 was obtained in the same manner as Hybridoma AY6E2E8, and the monoclonal antibody produced by Hybridoma 70 was reversed in the same manner as described above. Chlamydia 'New Monie 7 3 K
  • Da antigen polypeptide was K male.
  • the subclass of the monoclonal antibody produced by hybridoma 70 was found in the same manner as described above, and as a result, the subclass of this antibody was IgG.
  • I gill DNA library
  • the suspension was added to 0.1 to 10 # 1, and incubated at 37 ° C for 20 minutes to infect the bacteria; Igtll.
  • Igtll-infected bacteria were added to the liquid LB agar medium 2.5 incubate pre-incubated at 47, and this was immediately spread on the LB agar medium.
  • culture at 4 for 3 to 4 hours, and when plaques were observed, put a 2 trocellulose filter ( ⁇ 82 mm) soaked in 1 OmM 1 PTG aqueous solution on the upper agar medium.
  • the filter is marked by piercing the filter asymmetrically at three points with an ink needle, and the filter is removed from the agar medium and contains 150 mM NaCl and 0.1% Tween 20.
  • the plate was washed three times with 2 OmM Tris-hydrochloride buffer solution (PH7.5) (hereinafter referred to as TTBS buffer).
  • TTBS buffer 2 OmM Tris-hydrochloride buffer solution
  • TBS buffer 0.1% bovine serum albumin-containing solution
  • color developing substrate solution (30% aqueous solution of 60% aqueous solution of oxidized water in TBS buffer 100> nl 0.3% 4 -chloro- 1-1-naphthol in methanol solution 2 Oil was added, and the solution was left to stand at room temperature for about 30 minutes. When the color was sufficiently developed, the filter was taken out, washed with purified water, and air-dried.
  • the plaque on the agar medium corresponding to the color spot of the filter was searched and identified, and the agar in this area was pierced with a pasteur bite to collect the plaque.
  • the collected plaques were added with one drop of black-mouthed form, added with 0.1 M NaCl, 8 mM magnesium sulfate, and 0.1% gelatin. Phage was extracted from the plaques. The previous procedure was repeated until all plaques had reacted with the monoclonal D-nal antibody described above, and the DNA encoding the antigen polypeptide was cloned.
  • a ⁇ phage expressing a Chlamydia pneumoniae-specific antigen polypeptide reactive with a Chlamydia pneumoniae-specific monoclonal antibody was obtained, which was named 53-3-S ⁇ phage.
  • Cloth Form was added thereto, and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes for W for 10 minutes to remove the supernatant of the large bacterial cell, thereby obtaining a sphage suspension S solution.
  • Sphage DNA was purified using the Wizard ⁇ preps kit (Promega).
  • the PCR reaction was carried out using the PCR-type DNA as a »form and a fluorescent-labeled terminator cycle sequence method using Taq DNA polymerase, and a 3733A DNA sequencer (Applied Biosystems) Company).
  • DNA sequence analysis software “DNA SISJ (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.)
  • the obtained DNA sequence was compiled, estimated, and the amino acid translation gradient was estimated. Obtained.
  • the DNA encoding the Chlamydia pneumoniae antigen vorivepeptide can be obtained using a monoclonal antibody that is specific to Chlamydia ssp. Eumonie and recognizes the 53 KDa antigen polypeptide. This DNA has been cloned It encodes a 53 kDa antigen polypeptide.
  • Example 2 Preparation of recombinant vector containing DNA encoding a polypeptide containing a part of Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide, and preparation of transformant containing the same It is clear that the obtained DNA encodes a 53 KD a antigen polypeptide, but just in case, express the obtained DNA and determine whether it reacts with the K antibody as described below. » Beta.
  • Plasmid pBBK10MM was digested with restriction drunk * BaaiHI and Xhol, and subjected to 1.2% low temperature »agarose gel electrophoresis to cut out and purify a DNA fragment of about 4.6 Kbp. 1 ng of each of the synthetic DNAs of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 was added to this DNA fragment lOOng, and these DNA fragments were added using a DNA ligation kit (Ma Shuzo). ) NA was added. The reaction product was placed in a large strain HB101 strain competent cell (Sake Brewing Co., Ltd.) to produce a transformant, and a plasmid was obtained, which was named PADA431. After the plasmid was cleaved with R ⁇ llunl, it was treated with alkaline phosphatase to remove the 5 ′ phosphate group.
  • the 5 3-3 S ⁇ phage DNA was cut with the restriction enzyme EcoRl, and 5 ng of this DNA fragment was cut with the restriction enzyme Mn I as described above. ng was added to the mixture, and a transformant was prepared in the same manner to obtain a transformant.
  • a plasmid incorporating the restriction enzyme Ec0RI fragment of 53-3 SA phage DNA was obtained, and this was transformed into pCPN.
  • 5 3 3 This plasmid is a DNA of about 5.7 kbp having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and capable of expressing a polypeptide containing a part of the 53K antigen polypeptide in host E. coli. It is.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding a polypeptide containing a part of the 53K antigen polypeptide is as shown in SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence deduced from this nucleotide sequence is As in SEQ ID NO: 2.
  • Escherichia coli with Brasmid PC PN5 33 ⁇ is similarly cultured As a result of electrophoresis, transfer to nitrocellulose, and detection with a monoclonal antibody, a colored band corresponding to the above polypeptide was observed. It was shown that the E. coli having the expression of a 53K antigen polypeptide capable of reacting with a monoclonal antibody that specifically reacts with Chlamydia pneumoniae.
  • Example 3 Acquisition of DNA Encoding 53 kDa Antigen Polymorphide of Chlamydia pneumoniae Based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, a DNA having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 26 and 27 was It was synthesized using a DNA synthesizer.
  • reaction solution was extracted with phenol, ethanol was added, and the mixture was centrifuged to obtain a precipitate, which was dissolved in 101 purified water.
  • the reaction solution after the second PCR step was subjected to 1.2% low-melting point agarose gel electrophoresis.Agarose gel containing DNA of about 1.4 kb ⁇ was cut out.
  • a kit Promega was used. That is, the loose mouth liquid enclosed in the kit is added to the cut agarose gel, heated to dissolve the agarose gel, and the purified bile enclosed in the kit is added to form the DNA. The oil was adsorbed to the fat, and centrifuged to obtain the purified tree finger as a precipitate. The precipitate was washed with propanol and centrifuged again to obtain precipitate K. Purified water was added to the precipitate, DNA was eluted from the purification resin, and centrifuged to obtain a supernatant (aqueous DNA solution). The above steps are called DNA purification steps.
  • a sequence reaction was performed by a fluorescent labeling terminator cycle sequence method using Taq DNA polymerase that converts the contained DNA into a »form, and a 373A DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc.) The nucleotide sequence of the DNA was analyzed in).
  • rDNAS I Sj (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.) was used to estimate the extent of fiber collection, joining, and amino acid transmutation. The above process is called the nucleotide sequence analysis process.
  • the DNA was about 50 bp at the 3 'terminal end of the DNA encoding the Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide obtained in Example 1. Had the sequence. Furthermore, it was found that a coding region of about 0.7 kb containing a termination codon was present downstream of the nucleotide sequence.Based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, Chlamydia 'pneumoniae' As a primer corresponding to the upstream portion of the DNA encoding the antigen polypeptide, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30 is used as a primer, and the above-described nucleotide sequence containing a coding region of about 0.7 kb is also used.
  • a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 as a primer corresponding to the downstream portion of the DNA encoding the Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide. NA was synthesized using a DNA synthesizer.
  • DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 30 (20 pmo 1.u 1) 1 u 1 as a primer DNA A PCR step was performed using DNA (20 pm 0 ⁇ / n 1) 1 ⁇ 1 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31.
  • an EDNA purification step was performed to obtain about 1.5 kbp of DNA.
  • the above nucleotide sequence analysis step was performed using the obtained DNA aqueous solution.
  • the DNA had the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and encoded the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Example 4 Preparation of a recombinant vector containing DNA encoding the whole Chlamydia pneumoniae 53 KDa antigen polypeptide, and preparation of a transformant containing the same, Chlamydia pneumoniae 53 KDa
  • a recombinant vector containing DNA encoding the entire antigen polypeptide and a transformant containing the same can be prepared as follows.
  • DNA encoding the entire Chlamydia pneumoniae 53 KDa antigen polypeptide was used in the same manner as in Example 2.
  • DNA encoding the entire Chlamydia pneumoniae 53 KDa antigen polypeptide was used in the same manner as in Example 2.
  • Example 5 Preparation of DNA Encoding Chlamydia 'Pneumoniae's 73K Antigen Polypeptide Hybridpridoma AY6E2E8 I got The mouse ascites was obtained using Hypri-Doma 70, and the monoclonal antibody contained in the mouse was analyzed for its sex K. As a result, this monoclonal antibody was found to be the 73 kDa antigen of Chlamydia * pneumoniae, borivepti. Was found to be specific to the drug.
  • a monoclonal antibody 70 was used in place of the monoclonal antibody AY6E2E8, and the operation was performed in the same manner as in Example 1.
  • a clone 70-2S sphage was obtained, from which the sequence of SEQ ID NO: 13 was obtained.
  • Example 6 Production of Anti-Chlamydia pneumoniae Antibody Using Chlamydia pneumoniae Antigen Polypeptide as an Antigen
  • the anti-Chlamydia pneumoniae antibody was prepared using Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide. It can be manufactured as follows.
  • Bone M tumor cell line contains 10% (v / v) fetal calf serum of P3X63Ag 8.653 (AT CCCR L-158 0) RPM 1 16 4 0 Culture in the medium and subculture. Two weeks before cell conjugation, 0.13 mM 8-azaguanine, 0.5 g / ml OMC_210 (mycoplasma remover, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 10% (vZV ) Close culture for 1 week in RPMI 1610 medium containing fetal calf blood, and culture in normal medium for the following 1 week.
  • the antigen polypeptide was suspended in 0.02% (wZv) sodium azide containing 0.05 M sodium bicarbonate (PH9.6) so that the protein concentration was 1 to 10 // g / nl. Dialysis against 0.05 M sodium bicarbonate mouthwash containing 0.02% sodium azide (PH 9.6), and then diluted to a protein concentration of 1 to 10 g / ral Add 50 u1 to the 96-well EIA plate Leave overnight for 4 days to adsorb the antigen. Remove the supernatant, add PBS 150 u1 containing 0.02% (wZv) Tween 20 to the plate, leave for 3 minutes, then remove and wash.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was used as the antigen polypeptide, which was immobilized on a microtiter plate, and PBS containing bovine blood albumin was added. And perform blocking. After removing PBS containing bovine blood albumin and washing twice with PBS containing 0.02% (w / v) Tween 20 in the same manner, add patient serum to ⁇ : And leave for 2 hours. After washing three times with PBS containing 0.02% (w / V) Tween 20 in the same manner, peroxidase-labeled mouse anti-human IgG antibody was added to the pellet, and the mixture was released at room temperature for 2 hours. I do.
  • Plasmid pBBK10MM was digested with restriction enzymes BamHI and Xhol, and subjected to 1.2% low temperature »agarose gel electrophoresis to cut out and purify a DNA fragment of about 4.6 Kbp.
  • the 53-3S phage DNA was digested with the restriction enzyme EcoRl, and a DNA fragment of about 1.0 Kbp was similarly purified. DNA fragment was purified. Add 100 ng of the above-described 0.8 Kbp DNA fragment and 1 ng of each of the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 21 to 24 to the above-mentioned 0.8 fragment, 10 Ong, and DNA ligation kit (Takara Shuzo) to link these DNAs. Tied. The reaction product was placed in a bacterial cell HB101 strain competent cell (Ma Shuzo) to prepare a transformant.
  • This Form K transformant was spread on an LB agar medium containing 5 Omg / L of ambicillin, and cultured at 37 ° C for 24 hours. The resulting large colonies were inoculated into 3 Bl of L ground containing 5 OmgZL of ambicillin, and cultured with shaking at 37.
  • the plasmid vector was separated by the alkaline lysis method, cleaved with the restriction enzyme NruI, and analyzed by 0.8% agarose gel «electrophoresis, and DNA fragments of 6 16 bp and 4822 bp were generated. A large J strain having a recombinant plasmid vector was selected. The obtained recombinant plasmid was designated as PCPN5333T.
  • This plasmid vector is a DNA of about 5.4 kbp having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25, and contains a polypeptide containing Ichiro 53 KDa antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae at the C-terminus of DHFR. It expresses the linked protein.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding this »protein is as shown in E column No. 18, and the amino acid sequence E deduced from this base E sequence is shown as E column number 16 I was familiar.
  • Example 9 3 ⁇ 4K of fusion protein of DHFR and polypeptide containing a part of 53 KD a antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae
  • a large strain of Brassmid p CPN 533 ⁇ which harbors CPN 533 ⁇ was inoculated with 3 loops of LB medium containing 50 ig / 1 ambicillin, and cultured with shaking at 37 overnight.
  • a medium containing this large BR bacterium l Otf l contains 10 1 loading lozenge (0.01% promophenol blue, 10% mercaptoethanol, 20% glycerol, 5% SDS After adding 1.56 M Tris-HCl buffer solution (pH 6.8) and heating at 80 for 5 minutes, the reaction solution was subjected to a 5-20% polyacrylamide gradient gel swimmer.
  • a piece of filter paper moistened with 0.3 M tris aqueous solution containing 10% methanol, 0.05% sodium dodecyl sulfate, 10% methanol, 0.0% on the II electrode plate of the semi-drive blotting device One piece of filter paper moistened with a 25 mM aqueous solution of 5% sodium dodecyl sulfate, 10% methanol, 0.05% sodium dodecyl sulfate, 25 mM trisodium containing 4 OmM aminocabronic acid
  • a current of 1 W was applied at a frost flow density of 1 to transfer the protein in the polyacrylamide gel to nitrocellulose II.
  • This nitrocellulose was put in a TBS buffer solution containing 0.1% bovine blood alpmin, allowed to stand at room temperature for 1 hour or more, and blocked.
  • 37 "C 1 hour in monoclonal antibody solution (5-10 u in TTBS buffer) produced by Hypri-Doma SCP53
  • the cells were incubated in a peroxidase-treated anti-mouse IgG antibody solution (50 ng / nl in TTB S buffer) at 37 for 1 hour.
  • the chromogenic substrate solution was shaken.
  • Example 10 Acquisition of DNA Coding Entire Chlamydia * Pneumoniae 53 KDa Antigen Polypeptide
  • Example 3 DNA Encoding Entire Chlamydia pneumoniae 53 KDa Antigen Polypeptide was obtained, but this DNA was separately obtained as follows.
  • Genome walking is performed using Brasmid pCPN533T and the aforementioned ⁇ gt11 DNA library to obtain DNA encoding the entire Chlamydia pneumoniae 53 KDa antigen polypeptide. did.
  • this DNA has the nucleotide sequence of 484 to 1947 of SEQ ID NO: 17; 6 4 Encodes the 9th amino acid sequence I understand.
  • Example 11 Preparation of a recombinant vector containing DNA encoding a fusion protein of the whole 53 KD a antigen polypeptide of DHFR and Chlamydia pneumoniae, and preparation of a transformant containing the same
  • a recombinant vector containing DNA encoding the fusion protein of the entire DHFR and Chlamydia pneumoniae 53 KDa antigen polypeptide and a transformant containing the same can be prepared as follows. .
  • Example 1 Production of Anti-Chlamydia pneumoniae Antibody Using Synthetic Protein as Anti-Urine Anti-Chlamydia pneumoniae Antibody was Produced as Following Using 44 Syndrome Protein of the Present Invention as Antigen can do.
  • a hybridoma producing an anti-Chlamydia 'pneumoniae antibody is obtained in the same manner as in Example 6 except that the antigen used for immunization is the above-mentioned elaborated protein K. This is cultured, and an anti-Chlamydia 'pneumoniae antibody is produced from the culture.
  • Example 13 Detection and Puncture of Anti-Chlamydia 'Pneumoniae' Antibody Using 13 Toraito Protein as Antigen
  • the anti-Chlamydia pneumoniae antibody can be detected and measured in the following manner, using the protein of the present invention as an antigen.
  • Example 14 Extraction of Chlamydia pneumoniae Gene by PCR Method DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and DNA consisting of the nucleotide sequence of E column No. 20 were combined with a DNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems, Inc. The primers were named primer 53 F 2 and primer 53 R 2, respectively.
  • Each sample 1 w1 contains purified water 78.5 ⁇ 1, 2.5 mM d NTP aqueous solution 8/1, 500 mM KC1 and 15 mM MgC12 100 mM Tris-HCl Buffer solution (pH 8.3) 10/1> 30 ⁇ M aqueous solution of the above-mentioned primers 53 F 2 and 53 R 2 11 each, and 5 UZ 1 tack polymerase 0.5 ⁇ After adding 1 and overlaying mineral oil 50 ⁇ 1, a cycle of heating, cooling, and keeping warm for 94 to 30 seconds, 6 CTC for 30 seconds, and 72 to 60 seconds was repeated 30 times.
  • the antigen polypeptide of the present invention consisting of polypeptide A containing at least five contiguous amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 1 can be used for antibody testing of Chlamydia pneumoniae. Available to
  • the antigen polypeptide of the present invention in which the polypeptide A is a polypeptide in which 1 to 250 amino acids have been deleted from the polypeptide of SEQ ID NO: 1 has a short amino acid E sequence.
  • the number of anti-peptides that can be immobilized on a carrier or the like can be increased, which can be used for the production of highly sensitive diagnostic agents.
  • the antigen polypeptide of the present invention in which the polypeptide A is a polypeptide in which 1 to 100 amino acids in the polypeptide of SEQ ID NO: 1 have been substituted with other amino acids, Because it can create a structure that is not easily degraded by K-degrading enzymes, it has excellent stability as an antigen.
  • Polypeptide A has an amino acid sequence of at least 5 amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 1 or 2 to 100 amino acid sequences.
  • the antigen polypeptide of the present invention which is a polypeptide obtained by combining an amino acid or an amino acid sequence of 2 to 100 amino acids, can be immobilized on a carrier or the like. Deterioration or loss of sex is unlikely to occur.
  • the antigen polypeptide of the present invention in which the polypeptide A is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is an antigen polypeptide specific to Chlamydia's eumonie. Having the whole peptide is very suitable for antibody testing and accurate diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection.
  • antigen polypeptide of the present invention in which polypeptide A is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 5, has an antigen portion specific to Chlamydia pneumoniae. Chlamydia 'pneumoniae is extremely appropriate for the precise rarity of infection.
  • the DNA of the present invention which is a DNA encoding any of the above antigen polypeptides or a DNA complementary thereto, can be used for an antibody test for Chlamydia pneumoniae, diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection, and the like. Can be used for production of suitable antigen polypeptide 0
  • the DNA of the present invention whose nucleotide sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 encodes the whole antigen polypeptide specific to Chlamydia newmonie
  • the specific antibody test of Chlamydia 'two humoniae It can be used for the production of antigen polypeptides suitable for such applications.
  • the DNA of the present invention whose nucleotide sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or 7 encodes an antigenic fragment specific to Chlamydia pneumoniae, it is suitable for a specific antibody test of Chlamydia pneumoniae and the like. It can be used for the production of various antigen polypeptides.
  • the recombinant vector of the present invention containing any of the above DNAs can be used for antibody testing for Chlamydia pneumoniae and production of antigenic polypeptides suitable for the elimination of Chlamydia pneumoniae infectious diseases. .
  • the recombinant vector of the present invention which is a PCPN533a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, can express a polypeptide having an antigen portion specific to Chlamydia pneumoniae. Since it can be used, it can be used for production of antigen polypeptides which are extremely suitable for specific antibody tests of Chlamydia pneumoniae and the like.
  • the transformant of the present invention containing any of the above-mentioned recombinant vectors can be used for the production of an antigen polypeptide suitable for, for example, a specific antibody test for Chlamydia pneumoniae.
  • the method for producing an anti-Chlamydia pneumoniae antibody of the present invention which is characterized in that it is used as an antigen, can be used for the production of a diagnostic agent for Chlamydia nimmonie infection.
  • the anti-Chlamydia pneumoniae antibody detection of the present invention which is characterized by using any one of the above antigens (polypeptide) as an antigen.
  • A. He He is familiar with the rarity of pneumoniae infection.
  • an antigen polypeptide having a short amino acid sequence when used, the number of antigen polypeptides that can be immobilized on a carrier or the like can be increased, so that the sensitivity is high.
  • a platform that uses an antigen polypeptide in which the amino acid in the peptide is replaced with another amino acid can create a structure in which the antigen polypeptide is less susceptible to proteolytic degradation. Therefore, it has excellent stability and high reliability in detection and measurement.
  • an antigen polypeptide to which another amino acid sequence is added when used, a polypeptide used as an antigen is converted to an amino acid or an amino acid sequence of 2 to 1000 amino acids. Since it can be immobilized on a carrier or the like, the antigenicity is not easily reduced or lost due to the immobilization, and it is excellent in precluding Chlamydia pneumoniae infection.
  • an antigen polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 since the polypeptide used as the antigen has the entire antigen polypeptide specific to Chlamydia pneumoniae, antibody testing or Chlamydia Very suitable for the precise cutting of Jia pneumoniae infection.
  • the polypeptide used as an antigen has an antigen portion specific to Chlamydia pneumoniae.
  • the reagent for detecting and measuring an anti-Chlamydia pneumoniae antibody of the present invention containing any one of the above antigen polypeptides as an antigen is an antibody test for Chlamydia pneumoniae or a Chlamydia pneumoniae antibody test. It is suitable for the rarity of infection.
  • the number of antigen polypeptides that can be immobilized on a carrier or the like can be increased, resulting in high sensitivity.
  • the antigen polypeptide is subject to degradation by proteolytic enzymes. Excellent stability because it can create a structure that is difficult to receive, and high reliability of detection and measurement results.
  • a polypeptide used as an antigen is used as an amino acid or an amino acid sequence of 2 to 1000 amino acids. Since it can be immobilized on a carrier or the like, antigenicity is not easily reduced or lost due to immobilization, and is excellent in diagnosing Chlamydia pneumoniae infection.
  • an antigen polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is used, since the polypeptide used as the antigen has the whole antigen polypeptide specific to Chlamydia pneumoniae, the antibody Extremely appropriate for testing and accurate deprivation of Chlamydia 'pneumoniae infection.
  • an antigen polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 5 since the polypeptide used as an antigen has an antigen component specific to Chlamydia pneumoniae, antibody testing or Chlamydia pneumoniae Very appropriate for the precise rarity of Jia pneumoniae infection.
  • the anti-chlamydia eumonier infection rare drug of the present invention comprising any of the above antigen polypeptides as an active ingredient is suitable for the elimination of Chlamydia pneumoniae infection.
  • the use of an anti-polypeptide having a short length is highly sensitive since the number of anti-polypeptides that can be immobilized on a carrier or the like can be increased, and the amino tt in the polypeptide is When an antigen polypeptide substituted with another amino acid is used, the antigen polypeptide has a high stability because it can form a structure that is not easily degraded by proteolytic dextrin. High reliability.
  • a polypeptide used as an antigen can be converted to an amino acid or an amino acid sequence of 2 to 100 amino acids. Since it can be immobilized on a carrier or the like, the antigenicity is unlikely to be reduced or lost due to immobilization, and is excellent in precluding Chlamydia pneumoniae infection.
  • an antigen polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is used, Since the polypeptide used as the antigen contains the entire antigen polypeptide specific to Chlamydia pneumoniae, it is highly suitable for antibody testing and accurate deprivation of Chlamydia pneumoniae infection.
  • the polypeptide A of SEQ ID NO: 14 is directly or through an intervening amino acid sequence, and a polypeptide A containing at least 5 amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 1
  • the combined protein of the present invention can be used for testing antibodies to Chlamydia pneumoniae.
  • Polypeptide A is a polypeptide in which 1 to 250 amino acids are missing from the polypeptide of SEQ ID NO: 1, and the combined protein K of the present invention has a short amino acid sequence length.
  • the number of antigenic peptides that can be immobilized on a carrier or the like can be increased, which can be used for the production of highly sensitive diagnostic agents.
  • E of the present invention which is a polypeptide in which 1 to 100 amino acids in the polypeptide of column number 1 are substituted with another amino acid. Proteins are highly stable as antigens because they can form a structure that is less susceptible to degradation by protein degradation.
  • the protein of the present invention which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, has the entirety of Chlamydia pneumoniae-specific antigen polypeptide. ⁇ Very suitable for accurate diagnosis of pneumoniae infection.
  • the protein of the present invention which is a polypeptide consisting of the amino acid K sequence of SEQ ID NO: 16, has an antigen portion specific to Chlamydia pneumoniae, it can be used for antibody testing or Chlamydia pneumoniae. Very suitable for accurate diagnosis of infection.
  • the DNA of the present invention which is a DNA coding for any of the above-mentioned proteins or a DNA complementary thereto, is suitable for an antibody test for Chlamydia pneumoniae. Diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection, etc. »Can be used for the production of combined protein K.
  • the DNA of the present invention whose nucleotide sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, is encoded by this DNA. Since the protein has the entire antigen polypeptide specific to Chlamydia pneumoniae. It can be used for the production of fusion proteins suitable for testing specific antibodies to Chlamydia pneumoniae.
  • the DNA of the present invention whose nucleotide sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18, is encoded by the DNA. Since the combined protein K has an antigen portion specific to Chlamydia pneumoniae, ⁇ It can be used for the production of fusion proteins suitable for pneumonia specific antibody tests.
  • the recombinant vector of the present invention containing any one of the above-mentioned DNAs is suitable for testing antibodies to Chlamydia pneumoniae and for eliminating infectious diseases of Chlamydia pneumoniae. Available.
  • the recombinant vector of the present invention which is a pCPN5333T plasmid, can express Chlamydia pneumoniae-specific protein having a Fangiohara component, and is therefore a Chlamydia pneumoniae. It can be used for the production of synthetic proteins, which are extremely suitable for specific antibody tests.
  • the form K transformant of the present invention containing any of the recombinant vectors of the above E can be used for production of a cross-linked protein suitable for, for example, specific antibody screening of Chlamydia pneumoniae.
  • the method for producing an anti-Chlamydia pneumoniae antibody of the present invention which is characterized by using any of the above »E» synthetic protein as an antigen, can be used for the production of a diagnostic agent for Chlamydia pneumoniae infection.
  • the method of detecting and measuring the anti-Chlamydia pneumoniae antibody of the present invention characterized by using the protein complex described in any one of the above K as an antigen, comprises the following steps: A. Suitable for diagnosis of Pneumoniae infection.
  • a contact protein having a short amino acid sequence is used, the sensitivity is high because the number of antigen polypeptides that can be immobilized on a carrier or the like can be increased.
  • a fusion protein K in which the amino acid in the polypeptide is exchanged with another amino acid for B »a structure can be created in which the synthesized protein is not easily degraded by proteolytic enzymes. High stability, reliable High in nature.
  • Anti-Chlamydia of the present invention containing any of the above-mentioned fusion proteins K as an antigen.Detection of Pneumoniae antibodyM wipes are used for Chlamydia's pneumoniae antibody test or Chlamydia It is suitable for the pruning of pneumoniae infection.
  • the use of a »combined protein can increase the number of antigen polypeptides that can be immobilized on a carrier or the like;
  • amino acids in the polypeptide are replaced with other amino acids »When using a synthetic protein,» a structure can be created in which the synthetic protein is not easily degraded by proteolytic enzymes. Therefore, the stability is compromised, and the reliability of detection and measurement is high.
  • the protein K has the entire antigen polypeptide specific to Chlamydia pneumoniae. It is extremely suitable for antibody testing and accurate diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection.
  • the fusion protein used as an antigen has an antigen portion specific to Chlamydia pneumoniae, Very suitable for accurate diagnosis of M. pneumoniae infection.
  • the diagnostic agent for Chlamydia numoniae infection of the present invention comprising any one of the above-mentioned fused proteins K as an active ingredient is an antibody test for Chlamydia pneumoniae diagnosis of Chlamydia numoniae infection. It is suitable for.
  • a protein having a short amino acid sequence when used, the sensitivity is high because the number of antigen polypeptides that can be immobilized on a carrier or the like can be increased.
  • the amino acid in the polypeptide is replaced with another amino acid »When using a synthetic protein, it is necessary to create a structure in which the fusion protein is not easily degraded by proteolytic enzymes. It is excellent in stability because it can be detected, and the reliability of detection and measurement results is high.
  • the antibody when a fusion protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 is used, the antibody is used as an antigen because »the fusion protein has the entire antigenic polypeptide specific to Chlamydia pneumoniae. Extremely suitable for testing and accurate deprivation of Chlamydia pneumoniae infection.
  • fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • an antibody test or a Chlamydia pneumoniae-specific antigen portion may be used because the fusion protein used as an antigen has an antigen portion specific to Chlamydia pneumoniae. Very suitable for accurate diagnosis of Jia pneumoniae infection.
  • the probe and the primer of the present invention are suitable for detecting and measuring the Chlamydia pneumoniae gene and abstaining from Chlamydia pneumoniae infection.
  • probes and primers having the clay base sequence of SEQ ID NO: 19 or 20 have a specific sequence specific to Chlamydia pneumoniae, and thus can be used for diagnosis of Chlamydia 'numonie infection. Available.
  • the method for detecting and measuring the Chlamydia pneumoniae gene of the present invention using any of the above-described probes or primers is suitable for diagnosing Chlamydia pneumoniae infection.
  • the reagent for detecting and measuring the Chlamydia pneumoniae gene of the present invention which comprises any one of the above probes or primers, is suitable for diagnosing Chlamydia pneumoniae infection.
  • the diagnostic agent for Chlamydia pneumoniae infection of the present invention comprising any one of the above-described probes or primers as an active ingredient is suitable for diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection.
  • Sequence Listing SEQ ID NO: 1
  • Lys lie Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240
  • GGA CTC GCT GCG GGA CCT GCT 864 lie Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala
  • Ser Lys lie Ala Ser Lys Gin Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gin
  • Sequence type nucleic acid
  • Lys lie Ala Met Gin Thr Ser He Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu
  • Lys lie Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala Glu
  • Lys lie Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240
  • Sequence type nucleic acid
  • ATGTCTATTT CATCTTCTTC AGGACCTGAC AATCAAAAAA ATATCATGTC TCAAGTTCTG 60 ACATCGACAC CCCAGGGCGT GCCCCAACAA GATAAGCTGT CTGGCAACGA AACGAAGCAA 120 ATACAGCAAA CACGTCAGGG TAAAAACACT GAGATGGAAA GCGATGCCAC TATTGCTGGT 180 GCTTCTGGAA AAGACAAAAC TTCCTCGACT ACAAAAACAG AAACAGCTCC ACAACAGGGA 240 GTTCCTGCTG GGAAAGAATC CTCAGAAACT CAAAAGGCAC GTGCTGATAC TGGAGTATCA 300 GGAGCGGCTG CTACTACACC ATCAAATACT GCAACAAAAA TTGCTATGCA GACCTCTATT 360 GAAGAGGCGA GCAAAAGTAT GGAGTCTACC TTAGAGTCAC TTCAAAGCCT CAGTGCCGCGCG 420 CAAATGAAAG AAGTCGAAGC GGTTGTTGTT GCTGCC
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name C. pneumoniae
  • Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gin Lys Asn He Met Ser
  • AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA GTT 478 Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gin Gin Gly Val
  • GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA ACT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526
  • GAA GCG CTT GTT CTT GCT GCC CTC TCA GCG AAA ACT TCG GGT TCC GCA 718
  • Glu Val lie Glu lie Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala lie Gin Thr Leu 180 185 190
  • ATC GCG AAGGGCTTCG AATTCCAGCT GAGCGCCGGT CGCTAC 1048 lie Ala
  • TCCCCCGCCA TACCTGGGAA TCAATCGGTC GTCCGTTGCC AGGACGCAAA AATATTATCC 240
  • CAAGGATTAT TCCCTTCTGC CCAAGAAGAT GCCAACTTCG CAAAGGAGTT ATCTTCAGTA 660
  • CAGCCTAACT TCGATCACTC CACCCCTGAT CGTCACGCCG ATTTATGCCG CCTCGGCCAC 2400
  • GCGCAAACCA ACCCTTGGCA CAACATATCC ATCGCGTCCG CCATCTCCAG CAGCCGCACG 2640 CGGCCCATCT CGGGCAGCCT TGCGTCCTGG CCACGGGTCC GCATGATCGT GCTCCTGTCG 2700
  • AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA AAGGCCGCGT TGCTGGCGTT TTTCCATAC 3780
  • ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACC 4260
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • GenoDic DNA Organism name C. pneumoniae
  • GAT lie Gly Met Glu Ala Phe Leu Pro Gly Ser Gin He Asp Asn Lys 715
  • AAA GGA CGA CTT GCT CTA GGT CTC AAA CAA AAA GAG CAT AAT CCT TGG 1099 Lys Gly Arg Val Ala Leu Gly Leu Lys Gin Lys Glu His Asn Pro Trp
  • Lys lie Thr Leu Gly Val Lys Gin Leu Ser Ser Asn Pro Trp Asn Glu
  • AAA ATC ACT 3 ⁇ 4CA TTT GGA GCC TTT GTT GAG CTA CAA AAC GGG ATT GAA 1723

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書
クラ ミ ジァ ·ニューモニエの抗原ポリぺプチド、 それを含む »合タンパク κ、 その DNA、 その D N Aを含む組換えベクター、 その組換えベクターを含む形 K 転換体、 抗体の製造方法、 抗体の検出 ·測定方法及び拭薬、 クラミ ジァ 'ニュー モニエ感染の診断方法及び診断薬、 クラミ ジァ ·ニューモニエ遺伝子の検出 ·測 定用ブローブ及びブライマ一並びにクラミ ジァ ·ニューモニエ遺伝子の検出 ·測 定方法及び試薬
技術分野
本発明は、 クラミ ジァ ·ニューモニエの抗原ポリペプチ ド、 それを含む »合タ ンパク質、 その DNA、 その DN Aを含む組換えベクター、 その組換えベクター を含む形質転換体、 抗体の製造方法、 抗体の検出 ·測定方法及び試薬、 クラミ ジ ァ ·ニューモニエ感染の珍断方法及び珍断薬、 クラミ ジァ ·ニューモニエ遺伝子 の検出 ·測定用プローブ及びプライマー並びにクラミジァ ·ニューモニエ遗伝子 の検出 ·測定方法及び拭薬に する。 本発明は、 医薬品工業、 特にクラミ ジァ · ニューモニエ感染症の珍断薬の製造において有効に利用される。
背景技術
クラミ ジァ厲の細菌は、 クラミジァ · トラコマチス（Chla襲 ydia trachonalis)、 クラミ ジァ · シッ夕シ（Chlanydia psittaci)、 クラミジァ 'ペコラム（Chlamydia pecorum) クラミ ジァ ·二ユーモニエ（Chlamydia pneumoniae)等の種 (Species ：) が知られている。 クラミ ジァ ' トラコマチスは、 トラコーマ、 性病性リ ンパ 肉芽腫、 泌尿生殖器感染症、 封入体結膜炎、 新生児肺炎等を引き起こす原因菌で あり、 クラミ ジァ ' シッタシは、 ォゥム病等の原因菌であり、 またクラ ミ ジァ ' ニューモニエは、 呼吸器感染症、 異形肺炎等の原因菌である。
クラ ミ ジァ 'ニューモニエの引き起こす呼吸器感染症の症状は、 マイコブラズ マ ·ニューモニエゃィンフルェンザウィルスが原因で起こる感染症の症状と類似 しているので、 しばしば謓診されやすい。 そのため、 クラ ミ ジァ 'ニューモニエ の簡便な診断方法の開発が望まれていた。 感染症の珍断は、 通常、 ®染部位等における原因菌の存在の検出か、 血淸 · そ の他の体液中における （原因菌に対する） 抗体の存在の検出により確定的になさ れる。 前者は抗原検査、 後者は抗体検査と呼ばれ、 いずれも臨床で重要な意義が あり、 クラミ ジァ 'ニューモニエの抗体検査としては、 クラミ ジァ 'ニューモニ ェの基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られている。
しかし、 クラ ミ ジァ 'ニューモニエの基本小体は、 クラミジァ 'ニューモニエ 以外のクラミ ジァ JR細菌、 すなわち、 クラミ ジァ · トラコマチス又はクラ ミ ジァ • シッタシにも共通に存在する抗原を含むため、 この基本小体を抗原として用い る方法では特異性に欠ける難点があった。
一方、 大脚菌においてタンパク を大量に発現させることのできるブラスミ ド として、 p B B K l 0 M Mが知られている （特開平 4 - 1 1 7 2 8 4号公報） 。 このプラスミ ドは、 D H F Rと抗アレルギー性ペプチドとの融合タンパク質を発 現させることができる。 ここで得られる »合タンパク にも D H F Rの酵素活性 も保持されているので、 この融合タンパク質の精製は D H F Rの特性と活性を利 用して容易に行うことができる。
また、 感染症の診断法としては遺伝子検査法もある。 これは、 核酸ブロープ等 を用いて検体中に検出対象の微生物の遗伝子が存在するか否かを稠ベる方法であ る o
クラミジァ .ニューモニエの遺伝子検査法としては、 特表昭 6 4 - 5 0 0 0 8 3号公報、 米国特許第 5 . 2 8 1 . 5 1 8号公報、 及び国際公開公報 9 4 0 4
5 4 9号公報に記載された方法が知られている。
しかし、 特表昭 6 4— 5 0 0 0 8 3号公報及び米国特許第 5 . 2 8 1 . 5 1 8 号公報には、 クラミ ジァ ' ニューモニエ染色体 D N Aそのもの又は染色体 D N A を制限酵素等で分解して得られる D N A断片をブローブとして用いることが記載 されているだけであり、 これらの D N Aの塩基 B2列は明らかではなく、 それゆえ プローブの特異性が定かではなく、 また反応条件の設定も困難である。
—方、 国際公開公報 9 4 Z 0 4 5 4 9号公報に記載された方法は、 リポソーム R N A又はそれをコー ドする D N Aにハイブリダィズするプローブを用いるもの であるが、 リボソーム R N Aはすべての生物において比絞的相同性が高いため、 このプローブの特異性も定かではない。 発明の開示
本発明は、 クラミジァ ' トラコマチスやクラミ ジァ · シッタシ等のクラミ ジァ
• ニューモニエ以外のクラミ ジァ厲細菌に対する抗体に反応せず、 クラミ ジァ · ニューモニエ特異的抗体とのみ反応し、 これを検出するための抗原ボリべプチ ド を提供することを目的とする。
更には、 本発明は、 遗伝子組換え技術を用いてこの抗原ポリペプチドを大量に 合成する技術を提供することも目的とする。
更には、 本発明は、 この抗原ポリベプチドを利用する、 抗クラミ ジァ ·ニュー モニエ特異的抗体の製造方法、 抗クラミ ジァ . ニューモニエ特異的抗体の検出 · 測定方法及びその試薬、 並びにクラミ ジァ · ニューモニエ感染の珍断薬を提供す ることも目的とする。 更には、 本発明は、 クラミ ジァ · ニューモニエ遗伝子を 特異的に検出 · M定するためのプローブ及びブライマーを提供し、 さらに、 この プローブ又はブライマーを利用する、 クラミ ジァ ·ニューモニエ遗伝子の検出 · 測定方法及び拭薬、 並びにクラミ ジァ ·ニューモニエ感染の珍断薬を提供するこ とも目的とする。
更には、 本発明は、 クラミジァ *ニューモニエ、 クラミ ジァ ' トラコマチス、 クラミ ジァ · シッタシ等のクラミジァ厲細菌に共通に反応する抗体を検出するた めの抗原ポリぺプチドを提供することも目的とする。 発明の概要
本発明は、 下圮 （ 1 ) 〜 （ 4 5 ) に閼するものである。
( 1 ) 配列番号 1のポリぺブチドの中の連統した少なく とも 5個のァミ ノ酸配列 を含むポリペプチド （以下、 Γポリペプチ ド A J という） からなる、 クラ ミ ジァ
• ニューモニエの抗原ボリぺブチド。
( 2 ) ポリペプチド Aが、 配列番号 1のボリペプチドからアミ ノ酸が欠落してい るボリペプチドである、 上記 （ 1 ) 記載の抗原ポリぺプチ ド。
( 3 ) ポリペプチ ド A力く、 配列番号 1のポリべプチ ドの中のアミ ノ酸が他のアミ ノ酸で隱換されているか、 又は配列番号 1のボリベプチドの中にァミ ノ酸が揷入 されているポリぺプチ ドである、 上記 （ 1 ) 妃載の抗原ポリベプチド。
( 4 ) ポリぺブチド Aが、 配列番号 1のポリべプチドの中の連統した少なく とも 5個のァミ ノ酸配列にァミ ノ酸若しくはべプチ ドが桔合したボリべプチ ドである. 上圮 （ 1 ) 記載の抗原ポリぺブチド。
( 5 ) ポリぺブチド Aが配列番号 1のァミノ酸配列からなるポリぺブチドである. 上記 （ 1 ) 記載の抗原ポリぺブチド。
( 6 ) ポリぺブチド Aが配列番号 2のァミ ノ酸配列からなるボリべプチドである. 上妃 （ 1 ) 記載の抗原ボリベプチド。
( 7 ) ボリベプチ ド Aが配列番号 5のアミ ノ酸配列からなるボリぺブチドである. 上記 （ 1 ) 記載の抗原ポリぺブチド。
( 8 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 7 ) のいずれかに記載の抗原ボリベプチ ドをコ一 ドする D N A若しくはそれに相補的な DN A。
(9) 塩基配列が配列番号 3の堪基配列である、 上記 （8) 圮載の DNA。
(1 0) 塩基配列が配列番号 4の塩基配列である、 上記 （8) 記載の DNA。
(1 1) 塩基配列が配列番号 7の堪基配列である、 上 E (8)記載の DNA。
(1 2) 上記 （8) 〜 （1 1〉 のいずれかに記載の DN Aを含む組換えベクター,
(13) 組換えベクターが配列番号 1 0の埴基 E列を有する P CPN 533 <zブ ラスミ ドである、 上記 （12) 記載の組換えベクター。
(1 4) 上妃 （1 2) 又は上記 （1 3) 紀載の組換えベクターを含む形 K転換体 <
( 1 5) 上記 （ 1 ) 〜 （ 7 ) のいずれかに記載の抗原ボリベプチドを抗原として 用いることを特徼とする、 抗クラミ ジァ ·ニューモニエ抗体の製造方法。
( 1 6 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 7 ) のいずれかに記載の抗原ポリぺブチドを抗原として 用いることを特徴とする、 抗クラ ミ ジァ 'ニューモニエ抗体の検出 ·測定方法。
( 1 7) 上記 ( 1 ) 〜 （ 7 ) のいずれかに記載の抗原ボリぺプチドを抗原として 含有してなる、 抗クラミ ジァ 'ニューモニエ抗体の検出 ·測定用轼薬。
( 1 8 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 7 ) のいずれかに記載の抗原ポリぺブチ ドを有効成分と する、 クラ ミ ジァ ' ニューモニエ感染の診断薬。 ( 1 9) 配列番号 1 4のポリベプチドに、 直接に又は介在ァミノ酸配列を介して. E列番号 1のポリぺプチドの中の連统した少なくとも 5個のァミ ノ酸配列を含む ポリぺプチ ド （以下 Γポリぺブチド8」 という） が結合した、 ジヒ ドロ葉酸 ¾元 酵素一クラミ ジァ 'ニューモニエの抗原ポリベプチド »合タンパク質。
( 2 0 ) ポ ぺプチド Bが、 配列番号 1のポリぺプチドからァミノ酸が欠落して いるボリべプチドである、 上記 （ 1 9) 記載の »合タンパク質。
( 2 1 ) ポリぺプチ ド Bが、 配列番号 1のボリぺプチドの中のァミ ノ酸が他のァ ミ ノ酸で置換されているか、 又は配列番号 1のボリぺブチドの中にアミノ酸が揷 入されているポリペプチドである、 上記 （ 1 9 ) 記載の融合タンパク »。 （ 2
2) 融合タンパク質が配列番号 1 5のアミ ノ酸配列からなるポリぺブチドである, 上記 （ 1 9 ) 記載の融合タンパク質。
( 2 3 ) »合夕ンパク質が配列番号 1 6のアミ ノ酸配列からなるポリぺプチドで ある、 上記 （ 1 9) 記載の融合タンパク »。
(2 4 ) 上記 （ 1 9) 〜 （2 3) のいずれかに記載の »合タンパク Kをコードす る DN A若しくはそれに相補的な DN A。
(2 5) 塩基配列が E列番号 1 7の墙基配列である、 上 E (2 4 ) E載の DNA0 (2 6) 塩基配列が配列番号 1 8の埴基 E列である、 上記 （24 ) 記載の DNA。 (27) 上記 （24〉 〜 （26) のいずれかに記載の DN Aを含む組換えべクタ
0
(2 8 組換えベクターが p C PN 53 3 Tプラスミ ドである上 E (2 7 記載 の組換えベクター。
( 2 9 ) 上記 （ 2 7 ) 又は上記 （2 8 ) 記載の組換えベクターを含む形質転換体。
( 3 0) 上記 （ 1 9 ) 〜 （2 3 ) のいずれかに記載の »合タンパク質を抗原とし て用いることを特徵とする、 抗クラミ ジァ 'ニューモニエ抗体の製造方法。
( 3 1 ) 上記 （ 1 9 ) 〜 （ 2 3 ) のいずれかに記載の融合タンパク Kを抗原とし て用いることを特徴とする、 抗クラミ ジ 7 ·ニューモニエ抗体の検出 ·測定方法。
( 3 2 ) 上記 （ 1 9 )〜 （ 2 3 ) のいずれかに記載の触合タンパク質を抗原とし て含有してなる、 抗クラ ミ ジァ ·ニューモニエ抗体の検出 ·測定用試薬。
( 3 3 ) 上記 （ 1 9 ) ~ ( 2 3 ) のいずれかに記載の融合タンパク Kを有効成分 とする、 クラ ミ ジァ ·ニューモニエ感染の診断薬。
( 3 4 ) (a) 配列番号 3の DNAの中の連続した少なく とも 1 0塩基の塩基配 列を有する DNA、
(b) 上紀 （ a) の DN Aに相捕的な DN A、 又は
( c ) 上記 （a) 若しくは （b) の DNAと 9 0 %以上の相同性を有する D N A . のいずれかを含有する D N Aからなる、 クラミ ジァ ·ニューモニエ遺伝子の検出
•刺定用ブローブ。
(3 5 ) 塩基配列が E列番号 1 9の塩基配列である、 上記 （ 34 ) E載のブロー
( 3 6) 塩基配列が配列番号 2 0の塩基配列である、 上記 （ 34 ) K載のブロー ブ。
( 3 7 ) 上記 （ 3 4 ) 〜 （ 36 ) のいずれかに記載のプローブを用いる、 クラミ ジァ · ニューモニエ遗伝子の検出 ·《«定方法。
( 3 8) 上記 （34 ) 〜 （3 6) のいずれかに E載のプローブを含有してなるク ラ ミ ジァ · ニューモニエ遺伝子の検出 ·剿定用轼薬。
( 3 9 ) 上記 （3 4 ) 〜 （3 6) のいずれかに記載のプローブを有効成分とする' クラ ミ ジァ · ニューモニエ感染の診断薬。
(4 0) (a) 配列番号 3の DNAの中の連统した少なくとも 1 0塩基の塩基配 列を有する DN A、
(b ) 上記 （a) の DN Aに相補的な DN A、 又は
(c) 上紀 （a) 若しくは （b) の DNAと 9 0 %以上の相同性を有する D N A , のいずれかを含有する DNAからなる、 クラミ ジァ ·ニューモニエ遺伝子の検出 •測定用ブライマー。
( 4 1 ) 塩基配列が配列番号 1 9の塩基配列である、 上記 （ 4 0 ) 記載のプライ マー0
(4 2 ) 塩基配列が配列番号 2 0の塩基配列である、 上記 （4 0) 記載のブライ マ一o
( 4 3 ) 上記 （ 4 0 ) 〜 ( 4 2 ) のいずれかに記載のブライマーを用いる、 クラ ミ ジァ . ニューモニエ遗伝子の検出 ·刺定方法。 (4 ) 上記 （ 4 0 ) 〜 （ 4 2 ) のいずれかに記載のブライマーを含有してなる クラミ ジァ ·ニューモニエ遺伝子の検出 ·測定用拭薬。
( 4 5 ) 上記 （ 4 0 ) 〜 （ 4 2 ) のいずれかに記載のブライマーを有効成分とす る、 クラミジァ ·ニューモニエ感染の診断薬。 また、 本発明は、 下圮 （ 4 6)〜（5 2) に閣するものでもある。
( 6 ) (a) 配列番号 5のボリぺプチド；
(b) 配列番号 5のポリぺブチド中のァミノ酸の 1又は 2以上に欠落のあるポリぺ プチド； （c) 配列番号 5のポリべプチド中のァミノ酸の 1又は 2以上が他のァミ ノ酸で置換されたポリベプチド；及び
(d) 上記（a)〜（c)のいずれかのポリぺプチドに他のァミ ノ酸もしくはぺブチドが 結合してなる »合ポリぺブチド、
からなる群から選ばれるクラミ ジァ · ニューモニエの抗原ポリベプチド。
(4 7 ) (a) 配列番号 6のポリぺプチド；
(b) 配列番号 6のボリべプチド中のアミノ酸の 1又は 2以上に欠落のあるポリべ プチド； （c) 配列番号 6のポリぺプチド中のァミノ酸の 1又は 2以上が他のァミ ノ酸で置換されたポリペプチド；及び
(d) 上 TE(a)〜（c)のいずれかのポリぺブチドに他のアミノ ttもしくはべプチドが 結合してなる »合ポリべプチド、
からなる群から選ばれるクラミジァ ·ニューモニエの抗原ポリべプチド。
( 4 8 ) 上記 （ 4 6 ) のボリペプチドをコードする DNA、 又はそれに相補的な D N A。
( 9 ) 上記 （ 4 7 ) のポリペプチドをコードする D NA、 又はそれに相捕的な
( 5 0 ) 上記 （ 4 6 ) のポリペプチ ドをコー ドする D N Aが配列番号 7である、 上記 （ 4 8 ) の D N A。
( 5 1 ) 上記 （ 4 7 ) のボリぺプチドをコ一ドする DNAが配列番号 8である、 上記 （ 4 9 ) の D N A。
( 5 2 ) 上記 （ 4 8 ) 〜 （ 5 1 ) のいずれかの DNAを含む、 組換えベクター。 発明の詳細な説明
本明細書において、 塩基の数が 1のデォキシヌクレオチドはモノデォキシヌク レオチドといい、 塩基の数が 2以上のデォキシヌクレオチドは、 特に断らない限 り、 D N Aと総称した。
以下、 本発明を詳細に説明する。 抗原ボリべプチド
本発明の抗原ボリべプチドは、 ぺプチドが抗原性を有する ft小の大きさの観点 から、 配列番号 1のポリぺブチドの中の連統した少なく とも 5 gのァミ ノ酸配列 を含むポリぺブチド （以下 Γボリペプチド A J という） からなるものである。 ァミ ノ酸配列が長いほうが高感度の抗原抗体反応を期待できることから、 ボリ ぺプチド Aとしては、 望ましくは 2 0俚以上、 より望ましくは 1 0 0倕以上、 さ らに 3ましくは 2 5 0 β以上のァミ ノ酸からなるものがよい。
また、 クラミ ジァ ·ニューモニエとしての抗原性を有していれば、 ポリべプチ ド Αとしては、 配列番号 1のポリぺプチドからアミノ酸 （例えば 1 〜 2 5 0但） が欠落しているものであってもよい。 欠落するアミ ノ酸の但数が多すぎると、 ポ リペプチド Aのクラミジァ ·ニューモニエとしての抗原性が損なわれる傾向があ る《
欠落するァミノ酸の钃数が多い埸合 （例えば 5 β以上） 、 クラミ ジァ ·ニュー モニエとしての抗原性を保つ上から、 ポリぺプチド Αは、 ァミ ノ酸が速統して (例えば 5個以上） 欠落しているものであることが好ましい。
また、 クラミ ジァ. ニューモニエとしての抗原性を有していれば、 ポリべプチ ド Aとしては、 配列番号 1のポリぺブチドの中のァミ ノ酸 （例えば 1 〜 1 0 0 個） が他のァミ ノ酸で置換されているものであってもよいし、 あるいは、 配列番 号 1のポリペプチ ドの中にアミ ノ酸 （例えば 1 〜 1 0 0個） が挿入されているも のであってもよい。 ϋ換又は挿入されるアミ ノ酸の数が多すぎると、 ポリべプチ ド Αのクラ ミ ジァ · ニューモニエとしての抗原性が損なわれる傾向がある。 SB換 又は挿入されるァミ ノ酸の個数が多い埸合 （例えば 5個以上） 、 クラ ミ ジァ '二 ユーモニエとしての抗原性を保つ上から、 ボリペプチド Aは、 アミ ノ酸が連統し て （例えば 5個以上） 匱換又は挿入されているものであることが好ましい。 鼸換 されるアミノ酸は類似の性質を有するものが好ましく、 例えば、 グリシンとァラ ニンの置換がある。
また、 ク^ミ ジァ ，ニューモニエとしての抗原性を有していれば、 ポリぺブチ ド Aとしては、 配列番号 1のポリぺブチドの中の連統した少なく とも 5個のァミ ノ酸配列に直接又は介在ァミ ノ酸配列を介してァミノ酸若しくはべプチドが結合 したポリペプチドであってもよい。
このようなペプチドは、 クラミ ジァ ·ニューモニエとしての抗原性を保つ上か ら、 1 0 0 0 β以下のアミノ酸配列からなるものが好ましく、 5 0 0但以下のァ ミ ノ酸配列からなるものがより好ましく、 2 0 0個以下のァミ ノ酸配列からなる ものがさらに好ましい。
このようなアミ ノ酸若しくはぺブチドとしては、 例えば、 ロイシン、 ロイシン 一メチォニン、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （D H F R ) 、 5—ガラク トシダーゼ等が め Ο。
ペプチドとして D H F Rや /8—ガラク トシダーゼ等を用いた場合のボリぺブチ ド Αとしては、 例えば、 D H F R—クラミ ジァ ·ニューモニエ抗原ポ、)ぺブチド 融合タンパク Kや ーガラクトシダーゼ一クラミジァ ·ニューモニエ抗原ポリぺ プチド»合タンパク Kがある。 D H F Rや 8—ガラク トシダーゼとクラミ ジァ ' ニューモニエ抗原ポリべプチドとは、 直接紡合してもよいし、 介在ァミノ酸配列 を介してもよい。
ポリペプチド Aの具体例としては、 例えば、 配列番号 1、 配列番号 2、 及び配 列番号 5のポリべプチドがある。
介在アミ ノ酸配列は特に限定されないが、 例えば、 ロイシン、 ロイシンーメチ ォニンのアミ ノ酸配列等がある。
本発明の »合タンパク の具体例としては、 配列番号 1 5のァミ ノ酸配列から なるボリぺプチドゃ配列番号 1 6のアミノ酸配列からなるポリぺブチ ドがある。 上記 ¾合夕ンパク質の中では、 クラ ミ ジァ 'ニューモニエの 5 3 K D aの抗原 ポリぺブチ ド全体 含む配列番号 1 5のアミ ノ酸配列からなるポリぺプチ ドが望 ましい。
本発明の抗原ポリぺプチドを製造する方法としては、 化学合成法や遺伝子組換 え法がある。
本発明の配列番号 1のボリぺブチ ドは、 配列表に示すとおり、 4 8 8個のァミ ノ酸残基から成る抗原ポリべプチドである。
本発明の配列番号 2のボリぺブチ ドは、 配列表に示すとおり、 2 7 1個のァミ ノ酸残基から成る抗原ポリぺブチドである。
本発明の配列番号 5のボリベプチドは、 配列表に示すとおり、 2 5 9俚のァミ ノ酸残基から成る抗原ポリべプチドである。
上記抗原ポリぺブチドの中では、 クラミ ジァ ' ニューモニエの 5 3 K D aの抗 原ポリぺブチ ド全体を含む配列番号 1のボリぺプチドが望ましい。 抗原ボリぺブチドの製造方法
本発明の抗原ポリぺブチドを製造する方法では、 化学合成法や遺伝子組換え法 がある。
化学合成法としては、 例えば、 マップ （Ma l U p l e Ant i gen Pop t i de. MAP) 法 があり、 3 0個以下のァミ ノ酸配列からなるぺプチドの合成に適しており、 市販 のぺブチド合成機を使用して合成することができる。
遗伝子組換え法としては、 例えば、 本発明の抗原ポリペプチドをコードする D N Aをベクターに挿入して組換えベクターを構築し、 それを宿主に揷入して形 転換体を作製し、 その形質転換体から目的のぺブチドを精製する方法がある。 本発明の抗原ポリぺブチドをコ一ドする D N Aについては後述する。
ベクターとしては、 例えば、 ブラスミ ドゃファージ等がある。
宿主としては、 例えば、 大臛菌、 枯草菌、 酵母等がある。
以下、 形 K転換体の作製法と、 その形質転換体を用いた目的のペプチドの糈製 法について詳しく説明する。 抗原ポリべプチ ドをコ一ドする D N Aを含む組換えベクターの作製、 及びそれ を含む形質転換体の作製 スク リ一二ングで取得したスファージ自体 （後述） も本発明の DN Aを含む組 換えベクターであるが、 クラミ ジァ ·ニューモニエ抗原ポリペプチドをコー ドす る DNA (後述） を常法で既存のブラスミ ドベクターやファージベクター等に揷 入して、 新たに組換えベクターを作製することもできる。 その際、 必要に応じ、 リ ンカーを使用する。 既存のブラスミ ドベクターとしては、 例えば p B R 3 2 2 , p UC 1 8、 p UC 1 9、 ρ Β ΒΚ Ι ΟΜΜ等を使用することができる。 p BR 3 2 2、 p UC 1 8、 p U C 1 9は市販されており、 また、 p B BK l OMMに ついては特開平 4 - 1 1 7 2 8 4号公報に詳細に記載されている。 また、 ファー ジベクターとしては； I gtllファージ、 ス gllOファージ等が利用できる。 いずれも， 用いた親ベクターに対応する組換えベクターが得られる。
本発明の DN Aを含む組換えベクターとしては、 後述するように p C P N 5 3 3 aプラスミ ド、 5 3— 3 S λファージ等がある。
得られた組換えベクターを宿主に入れ、 形 転換体を作製する。 大 J»菌由来の ブラスミ ドゃスファージを使用する場合は宿主としては大腸菌を使用することが でき、 例えば大 »菌 HB 1 0 1株を使用することができる。 この宿主をコンビテ ン トセルとなるように処理をする。 大 II菌 H B 1 0 1株を処理して得たコンビテ ントセルは宝酒造から阪売されている。 上 E速結の反応物を宿主に入れ、 形質転 換体を作製する方法は文献， モレキュラー · クローニング， に記載されている。 得られた形 転換体を培養してコロニーを形成させ、 各コロニーからプラスミ ド DNAを取得し、 適切な制限 »素で切断し、 ァガロースゲル «気泳動で分析し、 所望の組換えブラスミ ドをもつ形質転換体を選択する。 このようにして作製され たブラスミ ドベクターとしては、 例えば p CPN 5330 [プラスミ ドがある。 このようにして作製された形質転換体をとしては、 前述の組換えべクター p C P N 5 3 3 αが入った大腸菌 H B 1 0 1株がある。
DH F R—クラミ ジァ ·ニューモニエの抗原ポリペプチド Κ合タンパク質をコ 一ドする D ΝΑ*·含む組換えべクターの作製、 及びそれを含む形質転換体の作製 クラミ ジァ ·ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードする D N A (後述） と、 DH F Rをコードする DNA (後述） とを、 市販のキッ トを使用して連桔する。 その際、 必要に応じ、 リ ンカーを使用する。 市販のキッ トとしては例えば、 DN Aライゲー ヨ ンキッ ト（室酒造）を用いることができる。 連結によって得られた DNAが複製起点をもたず、 ブラスミ ドとしては機能しない場合はこの DN Aを 新たなブラスミ ドベクターに挿入する。 この新たなプラスミ ドベクターとしては. 例えば p B R 3 2 2 > p U C 1 8等を使用することができる。
上記連結の反応物を宿主に入れ、 形 K転換体を作製する。 大脚菌由来のブラス ミ ドを使用する «合は宿主としては大) »菌を使用することができ、 例えば大 Si菌 H B 1 0 1株を使用することができる。 この宿主をコンビテントセルとなるよう に処理をする。 大 )1菌 H B 1 0 1株を処理して得たコンビテントセルは宝酒造か ら販売されている。 上妃連桔の反応物を宿主に入れ、 形 転換体を作製する方法 は文献' モレキュラー ' クローニング" に記載されている。
得られた形 転換体を培養してコロニーを形成させ、 各コロニーからブラスミ ド DNAを取得し、 適切な制限醉素で切断し、 ァガロースゲル電気泳動で分析し， 所望の組換えブラスミ ドをもつ形質転換体を ¾択する。 このようにして作製され たブラスミ ドベクターとしては、 例えば p C PN 5 3 3 Tブラスミ ドがある。 このようにして作製された形 R転換体をとしては、 前述の組換えベクター P C PN 5 3 3 Tが入った大) i菌 HB 1 0 1株がある。
形 転換体の培養は、 その形 K転換体が成長しうる培地でこの抗原ボリぺブチ ドが形質転換体内に十分蓄積されるまで適温で培養器を振とうする。 形質転換体 として前述の組換えべクター p C PN 5 3 3 o [や P C PN 5 3 3 Tが入った大腸 菌 H B 1 0 1株を使用する場合は、 アンビシリ ンを含む L B培地で 3 7 *Cで一晩 振とう培養し、 その後、 この培養液をアンビシリ ンを含む T B培地等に接種して さらに 3 7 °Cでー晚振と う培養する。 T B培地の翻製方法は、 文献' モレキユラ 一 ' クローニング' に記載されている。
培養した形 K転換体を破砕する埸合には、 遠心分離で形 転換体を集め、 緩衝 液に懸《し、 これに超音波を照射する。 形質転換体が大臊菌の場合は、 上記, 濁 液にリゾチームを加え、 S D Sを含む緩衝液を加えることよって菌体を溶菌させ てもよい。
—方、 目的のポリペプチ ドが分泌性のものである場合は、 培養液を遠心分離し て上清を取得する。
形質転換体の破砕後、 遠心分離して細胞残渣を除去し、 上潸を取得する。 上記 のいずれかの上清にス トレブトマイシン硫酸塩を添加し、 しばらく it拌し、 遠心 分離することによって、 核酸を沈殿物として除去し、 上淸を取得する。
この上淸を硫安沈殺し、 遠心分離する。 通常、 沈殿を取得するが、 目的のぺブ チドが上清に含まれることもあり、 サンプリ ングして目的のぺプチドの有無を確 認しておく。
この沈殿を少量の緩衝液に溶かしたものか、 又は上圮上淸を液体クロマ トグラ フィ一によつて分画し、 各画分に含まれる蛋白質について、 前述のクラミ ジァ · ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用い、 ウェスタン . ブロッ ト法行い、 抗原ポリぺプチドを含む画分を取得する。 ボリぺプチド Aが D H F Rとの »合タ ンパク Kである場合は、 液体クロマ トグラフィー用カラムとして、 メソ トレキセ 一トカラムが使用できる。 钿胞腆等の残潦の除去、 ス トレブトマイシン硫酸塩を 添加する D N Aの除去、 硫酸アンモニゥムを添加する蛋白 の取得、 及びゥ ス タン ' ブロッ ト法の具体的方法は、 文献 * モレキュラー · クローニング' に記載 されている。 抗原ポリペプチドをコードする D N A
本発明において、 配列番号 1のポリぺブチ ドをコ一ドする D N Aとは、 配列番 号 1のポリべプチ ドを ト リブレツ ト暗号表 （それぞれのァミ ノ酸に対して、 1〜 6通りのヌクレオチ ド配列が割り当てられている） に従ってアミ ノ酸をヌク レオ チ ド配列に読み替えた時の D N A群 （この中には、 配列番号 3の D N Aも含まれ る） から選ばれる D N Aのことである。
抗原ポリべプチ ド Aをコー ドする D N Aとは、 ポリべプチ ド Aをコー ドする D N Aであり， この D N Aは， ポリペプチ ド Aのアミ ノ酸配列をトリプレッ ト暗号 表に従ってアミ ノ酸をヌ ク レオチ ド配列に読み替えた D N A群から選ばれる D N Aのことである。
ポリぺプチ ド Aとしては、 前記抗原ポリベプチドの項で説明したものが挙げら れ、 ポリペプチド Aをコードする DN Aもそれらのポリペプチドのアミ ノ酸配列 に対応したヌクレオチ ド配列の のがある。
同様に、 本発明において、 配列番号 2のポリべプチ ドをコ一ドする DN Aとは 配列番号 2のポリペプチ ドをトリブレツ ト暗号表 （それぞれのァミ ノ酸に対して 1〜 6通りのヌクレオチド配列が割り当てられている） に従ってアミ ノ酸をヌク レオチ ド配列に铳み替えた時の DN A群 （この中には、 配列番号 4の DN Aも含 まれる） から選ばれる DNAのことである。
また、 配列番号 5のポリぺブチ ドをコ一ドする D N Aとは、 配列番号 5のポリ ペプチドをトリブレツ ト暗号表に従ってァミ ノ酸をヌクレオチ ド配列に読み替え た時の DNA群 （この中には、 配列番号 7の DN Aも含まれる） から運ばれる D N Aのことである。
また、 配列番号 6のポリぺプチドをコードする DN Aとは、 配列番号 6のポリ ぺプチ ドをトリブレツ ト暗号表に従ってァミノ酸をヌクレオチド配列に読み替え た時の DNA群 （この中には、 配列番号 8の DN Aも含まれる） から選ばれる D NAのことである。
融合タンパク質をコードする DNAは、 »合タンパク質のァミ ノ酸配列に対応 する遺伝暗号から構成されるものであれば特に限定されないが、 例えば配列番号 1 7の塩基配列や配列番号 1 8の塩基配列がある。
配列番号 1 7の塩基配列は、 DH F Rとクラミ ジァ 'ニューモニエ 5 3 k D a 抗原ボリべプチド全体との礅合タンパク Kをコードする DN Aの塩基配列となつ ており、 配列番号 1 8の塩基配列は、 DH F Rとクラミ ジァ ·二ュ一モニエ 5 3 k D a抗原ポリペプチ ド （—部） との融合タンパク質をコー ドする D N Aの塩基 配列となっている。 これらの DNAは、 化学合成法か遗伝子組換え法で作製することができる。 化学合成法としては、 例えば、 ホスホアミ ダイ ド法があり、 全長が 1 0 0塩基 以下の塩基配列からなる D NAの合成に適しており、 市販の DNA合成機で化学 合成することができる。
遗伝子組換え法としては、 例えば、 前述したような方法でクラミ ジァ ·ニュー モニエの基本小体から DN Aをクローニングする方法や、 既に取得した DN Aを 铸型にし、 その D N Aの任意の位置の塩基配列を元にして作製したブライマ一を 利用した P CR法等がある。 遗伝子組換え法は、 1 0 0塩基以上の長い D NAの 作製も可能である。
次に、 クラミ ジァ ·ニューモニエの基本小体から抗原ポリべプチドをコ一ドす る DN Aのクローニング方法について詳しく説明する。 クラ ミジァ ·ニューモニエの培養
培養した H L細胞から細胞浮遊液を !8製し、 培養上淸を除去した後にクラミ ジ ァ ·ニューモニエの浮遊液を添加してこれを培養し、 遠心分離してクラ ミ ジァ · ニューモニエ感染 H L細胞を取得する。 クラミジ 7 ·ニューモニエとしては、 例 えばクラミ ジァ 'ニューモニエ YK 4 1株（金本ら ： ミ クロバイオロジカル ' ィ ムノロジー、 37巻、 495-498頁、 1993年（Y. Kananoto et al. , Microbiol. Immuno 1.. Vol.37, p.495-498. 1993))が使用できる。 クラミ ジァ ·ニューモニエの基本小体の精製
クラミジァ♦ニューモニエ感染 HL細胞を破砕し、 遠心分離し、 上淸を回収す る。 ゥログラフィ ン （シ ーリング社製） を用いた連統密度勾配液にこの上淸を 添加して遠心分離する。 予備実験で黄色味がかかった白いバン ドの中にクラミ ジ ァ ·ニューモニエの基本小体が含有されていることを電子顕微眛で確 SSしている ので、 このバン ドを回収する。 クラ ミ ジァ 'ニューモニエのゲノム DNAの綢製
クラ ミ ジァ .ニューモニエの基本小体を、 I mM エチレンジァミ ン四酢酸 (E D T A) を含む 1 0 mMト リスー塩酸緩衝液 （PH8 · 0 ) (以下、 T E緩衝 液という。 ） に懸阑し、 1 % ドデシル硫酸ナ ト リ ウム （ S D S ) 水溶液及び 1 nig /mlプロティナーゼ K水溶液を加えて保温し、 基本小体を溶解させる。 0. 1 M トリスー塩酸緩街液 （pH8. 0 ) 飽和フ ノールを加えて撹拌し、 違心分離し、 水層を回収する。 さらに RN A分解酵素 (RN a s e ) 処理をし、 フユノール クロ口ホルムノイソアミルアルコール処理とエタノール沈 IS処理をし、 クラミ ジ ァ -ニューモニエのゲノム D N Aを取得する。 ゲノム D N A発現ライブラ 、)一の作製
ゲノム DN Aを制限酵索 A c c l、 H a e HI及び A l u lで消化し、 フエノ ール Zクロロホルム/イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、 部 分消化 DNA 取得する。 この部分消化 DN Aにリ ンカ一、 アデノ シン一 5 ' — 三リ ン酸 （adenosine 5' -triphosphate> 以下、 A T Pと略す。 ） 及び T 4 リガ ーゼを添加して、 部分消化 DN Aにリ ンカーを付加させる。
これを、 0. 1 M N a C l及び l mM E D T A含有 1 0 m Mトリスー塩酸 緩衝液を移動相とするクロマ ' スピン 6 0 00 (Chroma spin 6000) カラムにか け、 溶出液を分取し、 1 k b pから 7 k b pの D N A断片を含む分画を回収する t 得られた分画に ATP及び T 4ポリ ヌクレオチドキナーゼを加えて反応させ、 D N A断片の 5 ' 蟣をリ ン酸化する。 反応液をフ ノール/クロ口ホルムノイソァ ミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、 5 ' 端がリ ン酸化された DNA 断片を取得する。
この DN A断片に、 予め制陌醇紫 E c o R Iで切断しておいた λ gtllDN Α、 ATP及び Τ 4 リガーゼを加えて反応させ、 市販のパッケージングキッ トを用い， 得られた組換え； IgtllDN Αをパッケージングし、 ゲノム DN Α発現ライブラリ 一を作製する。 抗原ポリべプチドをコ一ドする DNAのクローニング
大腸菌 Y 1 0 9 0 r—抹の培養液に上記ゲノム DNA発現ライブラリーを感染 させ、 寒天培地上で培養し、 イ ソプロピルチオ一 一 D—ガラク トシ ド （ I PT G) 水溶液に浸濱したニ トロセルロースフィルターを利用して、 挿入 DNAの発 現により菌体内に産生されたタンパク をニ トロセルロースフィルターに付着さ せる。 このフィ ルターを牛血清アルブミ ンを用いてブロッキング反応させ、 洗浄 し、 次いでフィ ルターをクラ ミ ジァ · ニューモニエ特異的モノ クローナル抗体と 反応させる。 クラ ミ ジァ · ニューモニエ特異的モノ クローナル抗体と しては、 例 えば、 AY 6 E 2 E 8や S C P 5 3を使用することができる。 AY 6 E 2 E 8を 産生するハイプリ ドーマは工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 F E R B P— 5 1 5 4 と して寄託されている。 また、 S C P 5 3を産生するハイブ リ ドーマについてはジャーナル · ォブ · ク リニカル ' ミ クロバイオロジー、 132 巻、 583-588頁（1994) (J. Clin. Microbiol.. Vol.132. p.583-588, 1994) に記 載されている。 反応後、 フィ ルターを洗浄し、 パーォキシダーゼ等の酵素で棵熾 された抗マウス I g G抗体を反応させる。 反応後、 フィ ルターを洗浄し、 発色基 質液を添加して反応させる。 発色基 K液と しては、 例えば、 過酸化水素水溶液及 び 4一クロロー 1一ナフ トールのメタノール溶液を含む液を利用することができ る。 反応後、 フィ ルターを洗浄し、 風乾させる。
フィ ルターの発色スポッ トに対応する寒天培地上のブラークを同定し、 ブラー クに含まれるスファージを取得する。 プラークが全て上紀モノ クローナル抗体と 反応するようになるまで前記操作を繰り返し、 抗原ボリべプチ ドをコ一ドする D NAをクローン化し、 クラ ミ ジァ · ニューモニエ特異的モノ クローナル抗体反応 性のクラ ミ ジァ ' ニューモニエ特異的抗原ポリぺブチ ドを発現する λファージを 取得する。 クラ ミ ジァ . ニューモニエ抗原ボリぺブチ ドをコ一ドする DN Αの取得 取得したスファージを大腸菌 Y 1 0 9 0 r—株に感染させ、 培養し、 λファー ジを大量に生産する。 市販のキッ 卜を用いてス ファージから D Ν Αを取得 · 稱製 する。 この DNAにプライマー、 タ ッ クポリ メ ラーゼ （Taq Polymerase) 及びデ ォキシヌ ク レオチ ド類を添加し、 加熱、 冷却、 保温の工程を繰り返し、 に 挿入された DN Aを增幅させる。 ブライマーと しては、 例えば、 ス gtll · フォヮ 一ド ' ブライマー （ A gtll forward primer) 及び； I gtll · リバース · ブライマ 一 ( λ gtll reverse primer) (いずれも宝酒造株式会社製） があり、 タ ッ クポ リ メ ラーゼと しては、 例えば、 アンブリ タ ッ ク · D N A · ポリ メ ラーゼ （ Amp 1 iT aq DNA Polymerase) がある。 この D N A增幅方法の一般的手法は P C R法と し て知られており、 詳細は 「サムブロック他編集、 モレキュラー · クローニング 第 2版 （コール ド ' スプリ ング .ハーバー · ラボラ トリー） （1989年）」 (J.Samb look et al.. Molecular Cloning 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess ( 1989) 、 以下、 本文献を文献' モレキュラー · クローニング' という） に 記載されている。
增幅された DN Aを取得し、 塩基配列を決定，解析する。 DNAの取得には市 販のキッ トを使用することができ、 例えばウイザ一ド · P C R · ブレップキッ ト (Wizard PCR Prep ki I) (プロメガ（Pronega)社製品）を使用することができる。 ま た、 塩基配列を決定はタックポリメラーゼを用いた蛍光棵雄ターミネ一タザイク ルシークェンス法で行うことができ、 この方法を用いるには、 パーキン 'エルマ 一 · ジャパン社から販売されているキッ トを使用することができる。 また、 分析 にあたっては市販の機械、 例えば 3 7 3 A型 DNAシークェンサ （アブライ ドバ ィォシステムズ社） を利用することができる。
塩基 E列の決定後、 得られた DN A塩基 列を ¾伝子配列分析ソフ 卜で解析し、 編集、 連結、 ァミ ノ酸翻釈領域の推定を行なう。 遗伝子 E列分析ソフ トとしては、 「DNA S I S J (日立ソフ トウエアエンジニアリング社） を用いることができ る。
解析の桔果、 完全長の遺伝子が取得できていない «合は、 既に取得されている D N Aの前後の D N Aをゲノムウォーキングによって取得する。 ゲノムウォーキ ングを行うには、 宝酒造（株）から販売されているキッ トを使用することができる。
DH F Rをコー ドする DN Aの親製
DH F Rをコー ドする DNAは、 その DNAを含むブラスミ ドベクターから制 限酵素を用いてその D N Aを切り出すか、 あるいはその DN Aを有するブラスミ ド DN Aやゲノム DN Aを铸型とし、 適切なブライマーを用いて P C R法を行つ てその DN Aを增幅することによって取得する。
前者の方法では、 DH F Rをコー ドする DNAを含むブラスミ ドベクターと し て、 例えばブラスミ ドベクター p B B K l 0 MMや本発明の組換えべクターでも ある p C P N 5 3 3 Tを利用することができる。 P C P N 5 3 3 Tを含む大腸菌、 p B B K 1 0 MMを含む大脚菌は、 それぞれ、 受託番号 F E RM B P— 5 2 2 2、 F ERM B P - 2 3 7 4として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託 されている。 この大腸菌（ブラスミ ド保持菌）からブラスミ ドを取得するには、 通 常のブラスミ ド DN A取得方法に従えば良く、 この方法は文献 * モレキュラー ' クローニング' に記載されている。 プラスミ ド p B B K l 0 MMを用いる場合は 制限酵素として BamHI及びと Xho!を使用し、 約 4.6Kbpの D N A断片を切り出せば よい。
後者の方法では、 ブラスミ ド DNAとして例えば前述の p B BK 1 0MMや p C P N 5 3 3ャをそのまま利用することができ、 ゲノム D N Aとしては例えば枯 草 Sのゲノム DN Aを使用することができる。 ゲノム DN Aを取得するには通常 のゲノム DN A取得方法に従えば良く、 この方法は文献' モレキュラー ' クロー ニング' に記載されている。
後者の方法に使用するブライマーは、 DHF Rをコードする DNAの 5 ' 末端 と 3 ' 末 ¾にある塩基 E列を考慮して投叶♦合成することができる。 例えば配列 番号 5の塩基配列の 1番目から 2 0番目の配列を有するォリゴヌクレオチドと 4 6 1番目から 4 8 0番目の配列に相捕的な配列を有するォリゴヌクレオチドを使 用することができる。 これらのオリゴヌクレオチドは市販の D N A合成機を用い て化学合成することができる。
上記抗原ポリぺブチドの中では、 クラミ ジァ ·ニューモニエの 53 KD aの抗 原ポリぺプチド全体を含む配列番号 1のボリぺブチドが望ましい。 抗原ポリぺプチドを抗原として用いる抗クラミ ジァ 'ニューモニエ抗体の製造 方法
抗クラ ミ ジァ ' ニューモニエ抗体を製造するには、 本発明の抗原ポリぺプチ ド を抗原としてマウスを免疫し、 そのひ《細胞を骨髄腫細胞株と融合させてハイブ リ ドーマを作製し、 その中からクラ ミ ジァ ·ニューモニエの 5 3 KD aの抗原ポ リぺプチ ドを認雄するハイブリ ドーマを選択し、 これを培養することによって得 ることができる。
骨髄腫細胞株と しては、 例えば P 3 X 6 3 A g 8. 6 5 3 (A T C C C R L 一 1 5 8 0 ) や P 3ZN S I / 1— Ag 4— 1 (ATC C T I B— 1 8 ) を使 用することができる。
抗原と して本発明の抗原ポリべプチドを使用すること以外は、 マウスを免疫し て抗体を得る公知の一般的手法に従い、 抗クラ ミ ジァ ·ニューモニエ抗体を製造 する。 抗原ポリべプチドを抗原として用いる抗クラ ミ ジァ ·ニューモニエ抗体の検出 •脷定方法及び試薬、 並びに抗原ポリぺブチ ドを有効成分とするクラミ ジァ ·二 ユーモニエ感染の轸断薬
抗クラミ ジァ *ニューモニエ抗体を検出 ·測定するには、 例えば、 上記抗原ポ リペプチドを担体に固定化し、 検体を添加し、 洗浄し、 棵班化された二次抗体を 添加し、 洗浄し、 この標識を直接的又は間接的に検出，測定する。
担体としては、 例えば、 ラテッ クスの粒子やセルロースの糸、 その他ブラスチ ック製のアツセィブレートゃ粒子等を利用することができる。
上記抗原ポリぺプチドを担体に面定化するには、 例えば共有結合や物理吸着を 利用する。
検体としては、 例えばヒ 卜の血淸等を使用する。 なお、 検体中の他の抗体等が 担体に非特異的に括合するのを防止するため、 検体の添加前に牛血淸アルブミ ン 等で担体の表面をブロッキングしておく ことが望ましい。
洗浄は界面活性剤を含むリ ン酸緩衝液等を利用して行う。
棟班化された二次抗体としては、 例えば棵繊化された抗ヒ トモノクローナル抗 体がある。 棵雄と しては種々のものが利用でき、 例えばアル力リフ ォスファタ一 ゼ （Alkaline phosphatase) 、 ルシフヱラーゼ （Luciferase) 、 ペルォキシダ一 ゼ （Peroxidase) 、 /3—ガラク トシダーゼ （ S -ga lactos idase) 等の酵素、 フル ォレセイン （Fluorescine) 等の蛍光物 を利用することができる。 また、 抗体 と棵識物の間にピオチン （Biotin) 、 アビジン （Avidin) 、 ス ト レブトァビジン (Streptoavidin) 、 ディ ゴキシゲニン （Digoxigenin) 等の化学物質を介在させ てもよい。
標辫を直接的又は間接的に検出 '測定するには、 例えば、 その標識が酵素であ る埸合は基質を添加し、 酵素の触媒作用により発生する光や発色を検出 ·測定す るか吸光度の変化を測定する。 また、 椽雜が蛍光物質である埸合は反応系に紫外 線を照射し、 発生する蛍光を検出 ·測定する。 必要に応じ、 增感剤を使用する。 上記抗原ポリぺプチドを抗原として用いる抗クラミ ジァ ·ニューモニエ抗体の 検出 ·測定用拭薬としては、 例えば上妃抗原ポリべプチドを担体に固定化したも のやさらに上記標雄化された二次抗体や基質等が必要量同封されたものがある。
上記抗原ポリぺプチ ドを有効成分とするクラミ ジァ ·ニューモニエ感染の轸断 薬としては、 例えば上記試薬をそのまま利用することができる。 クラ ミ ジァ ·ニューモニエ遗伝子の検出 ·測定用プローブ及びブライマ一 クラミ ジァ ·ニューモニエに特異的である 5 3 KD a抗原ポリペプチドをコー ドする DN Aは配列番号 3の塩基配列を有する。
本発明のプローブ及びブライマ一は、
(a ) 配列番号 3の DN Aの中の連統した少なく とも 1 0塩基の塩基配列を有す る D N A、
(b) 上記 （a) の DN Aに相補的な DNA、 又は
( c ) 上記 （a ) 若しくは （b) の DNAと 9 0 %以上の相同性を有する D N A、 のいずれかを含有する D N Aからなる。
塩基配列の長さとしては、 1 0〜 5 0塩基が好ましく、 より好ましくは 1 5〜 2 0塩基である。
本発明のプローブ及びブラィマーの具体例としては、 例えば、 配列番号 1 9の 塩基配列からなる D N Aや配列番号 2 0の塩基配列からなる D N Aがある。
本発明のプローブ及びブライマーは市販の D N A合成装 Sを使用して容易に合 成することができる。 DNA合成装置はアプライ ドバイオシステムズ （Applied Biosystems) 社等で販売されている。 また、 予め短い D N A断片を化学合成し、 これをプライマーと して後述の P C R法を行って長い D N A断片を作製すること もできる。
本発明のプローブ及びブライマーには、 上記 D N Aを棵雜物で標雜されたもの も含まれる。
棟織物としては、 例えば、 ピオチン （Biotin) 、 アビジン （Avidin) 、 ストレ ブトアビジン （Streploavidin) 、 ディ ゴキシゲニン （Digoxigenin) 等の化学物 質、 ァルカ リ フォスファターゼ （Alkaline phosphatase) 、 ルシフヱラーゼ （Lu ciferase) 、 ペルォキシダーゼ （Peroxidase) 、 3—ガラク トシダーゼ （ 9-gal actosidase) 等の酵素、 フルォレセイ ン （Fluorescine) 等の蛍光物質がある。 プローブにビォチンを付加させるには、 例えば、 ターミナルトランスフェラーゼ (Terminal transferase) 存在下で、 プローブにピオチン化されたデォキシゥリ ジン- 5 ' —三リ ン酸 (deoxyuridine 5' -triphosphate) を添加する。 ターミ ナルトランスフェラーゼゃピオチン化されたデォキシゥリジン一 5 ' —三リ ン酸 はキッ トとしてべ一リ ンガーマンハイム（Boehringer Mannheim)社から購入でき る。 ビォチン以外の標識物を付加する場合も市販のキッ トを使用することができ， このようなキッ トは宝酒造（株）や東洋枋（株）から購入できる。 また、 文献' モレ キユラ一 . クローニング， に記載されている方法に従って標雄物を付加させても よい。
また、 標識物としては放射性同位元素を利用することもでき、 その場合は例え ば、 T 4ポリヌクレオチドキナーゼ （T4 polynucleotide kinase) 存在下、 これ に （ 7— 32P) dATPを添加する。 放射性同位元素で標»する一般的手法は文 献 ' モレキュラー ' クローニング' に記載されている。 T 4ポリ ヌク レオチドキ ナーゼは東洋紡（株）から、 （ァ一 32P) d AT Pは（株）アマシャムから購入でき る。
なお、 構成成分が DNAである本発明のプローブやブライマーの代わりに、 本 発明のプローブやブライマーの塩基配列に対応する RNA、 即ち、 塩基としてチ ミ ンがゥラシルに!！換され、 糖と してデォキシリボースがリボースに置換された 核酸、 も本発明のプローブやプライマーとして使用でき、 これらの構成成分が R N Aであるプローブやブライマーも本発明の検出 '刺定方法や検出 '測定用試薬 に使用することがてきる。 クラミ ジァ ·ニューモニエ遗伝子の検出 ·測定方法 本発明のプローブを用いてクラミ ジァ 'ニューモニエ遺伝子を検出 ·測定する には、 例えば 検体中の DN Aを電気泳動して分子量で分離し、 その DNAを二 トロセルロースフィルターやナイロンメ ンプレン等に移して固定し、 棵敏化され た本発明のプローブを添加し、 棵雜を検出 ·測定する。 この方法はサザンブロッ ト法と呼ばれており、 その一般的手法は文献' モレキュラー . クローニング * に 記載されてい 。
本発明のブライマ一を用いてクラミ ジァ ·ニューモニエ遺伝子を検出 ·測定す るには、 例えば P C R法を行う。 P C R法については既に述べているが、 本発明 のプライマーを用いて P C R法を行うクラミ ジァ ·ニューモニエ遗伝子の検出 · 測定方法の具体的な工程は、 下紀の通りである。
(ァ） DNAを含む検体に、 本発明のブライマー、 DNAボリメラーゼ、 d AT P、 d CTP、 d GTP及び d TT Pを含む緩衝液を添加し、 加熱する。
(ィ） 冷却し、 保温し、 加熱する。
(ゥ） （ィ） の操作を緣返す。
(ェ） 反応液に含まれる DN Aを検出 ·剥定する。
工程 （ァ） の DNAを含む検体としては、 例えば、 患者の咽頭部練棒擦過材料 等から核酸を抽出したものがある。
工程 （ァ） の DNAポリメラーゼとしては例えばタック （T a q) ポリメラー ゼを使用することができる。 タックポリメラーゼは東洋紡（株）から購入できる。 工程 （ァ） の加熱は例えば 9 0て〜 1 0 0てで 0. 5〜 1 0分間静置する。
工程 （ィ） の冷却は例えば 4 5 'C〜6 5 で 0. 5〜5分間静匱し、 保温は例 えば 7 0。C〜 8 0てで 1〜 1 0分間静 Sし、 加熱は例えば 9 0て〜 1 0 0 eCで 0. 5〜 5分間静置する。
工程 （ァ） の加熱操作や工程 （ィ） の冷却、 保温及び加熱の操作は、 DNAサ 一マルサイクラ一 （DNA thermal cycler) (登録商標） （パーキン-エルマー シ 一タス （Perkin- elmer Cetus) 製） を使用して行うことができる。 工程 （ゥ） の繰返し回数は特に限定されないが、 3 0回程度繰り返す。
工程 （ェ） の反応液に含まれる D N Aを検出 '測定するには、 例えば、 反応液 を奥化工チジゥム含有ァガロースゲルを用いて電気泳動して反応液に含まれてい る D N Aを分子量で分離し、 紫外線を照射する。 使用した本発明のプライマーが 欏織物で標雄されている場合はその棵镟を利用して D N Aを検出 ·測定する。 なお、 一度工程 （ァ） 〜工程 （ゥ） を行った後、 添加する本発明のプライマー を別の塩基配列のものにし、 再度工程 （ァ） 〜工程 （ゥ） を行ってから工程 （ ェ） に入ってもよい。 クラミ ジァ ·ニューモニエ遗伝子の検出 ·測定用拭薬 本発明のクラ ミ ジァ ·ニューモニエ遗伝子の検出 ·制定用拭薬としては、 例え ば、 本発明のプローブ叉はブライマーを含む水溶液が凍結された状態でプラスチ ック製の容器に納められているものがある。
発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれにより何ら制限 されるものではない。
以下、 クラミ ジァ 'ニューモニエの宿主細胞の培養から、 クラミ ジァ 'ニュー モニエの抗原ポリぺプチドの遺伝子 DN A配列 アミ ノ酸配列の決定まで、 順を 追って锐明する。
実施例 1 クラミ ジァ ·ニューモニエ特異的 5 3 K抗原ポリペプチドをコードす る DN Aの作製
(A) 宿主細胞 （H L細胞） の培養
予め、 プラスチック製培養フラスコ （7 5 cnJ) の底面いつばいに增殖させた H L細胞をリン酸緩銜化生理食塩液 （以下、 P B Sという。 ） マグネシウム不含 (一） 液 5alで洗浄し、 0. 1 % (WZV) トリプシンを含む P B Sを 5nl加え て細胞表面全体に行き渡らせ、 その液を捨てた後、 3 7でで 1 0分間保温し、 1 0 % ( v/v) 牛胎児血清を含むダルベッコ MEM培地 5nlを加え、 ビベッティ ングにより HL細胞を剁雌して、 細胞浮遊液を a製した。
7 5 cniのブラスチック製培養フラスコで培養するときは、 培養フラスコに上 E細胞浮遊液 1鶴 1及び 1 0% (v/v) 牛胎児血清含有ダルベッコ MEM培地 1 5〜2 0蘿 1を加え、 また、 6ゥ tルブラスチック製培養容器で培養するときは、 上記細胞浮遊液 8朧 1と 1 0%牛胎児血淸含有ダルベッコ MEM培地 2 9 2 mlとの 混合液 4B1ずつを各ゥュルに加え、 5 % (v/v) 炭酸ガス雰囲気下で培養した。
(B) クラ ミ ジァ · ニューモニエ YK 4 1の培養
6ゥ ルブラスチック製培養容器 （底面上） に増殖した H L細胞の培養上淸を ピペッ トで取り除き、 これにクラミ ジァ 'ニューモニエ YK 4 1株の浮遊液 （Ka nanoto et al.. Microbiol. Inounol.. Vol.37, p.495-498. 1993 ) 〔クラミ ジ ァ .ニューモニエ YK 4 1保存液を、 1 リ ッ トルあたり庶糖 7 5 g、 リ ン酸一力 リウム 0. 5 2 g、 リ ン酸二カリウム 1 · 2 2 g及びグルタ ミ ン酸 0. 7 2 gを 含む水溶液 （以下、 S P Gという。 ） で 1 2ないし 2 4倍に希釈し、 超音波で 1 分間処理し、 2. 0 0 0 rpmで 3分間遠心分離した上清〕 を 1 ゥ ルあたり 2 nil 加えて、 2, 0 0 0 rpnで 1時間遠心吸着を行った。 遠心吸着後、 クラ ミ ジ 7 · ニューモニエ浮遊液を除き、 1 g/mlシクロへキシミ ド及び 1 0 % (v/v) 牛 胎児血淸を含むダルベッコ MEM培地をゥ： cルあたり 4 ml加え、 5 % ( v/ v) 炭酸ガス雰囲気下、 3 6 で 3日間培養した。 培養後、 滅菌したシリコン片で細 胞を剝離し、 細胞を回収した。 これを 8， 0 0 0 rpmで 3 0分間遠心分離して、 沈 Kを S P Gに再懸«し、 一 7 0でで保存した。
(C) クラミ ジァ ·ニューモニエ YK 4 1の基本小体の精製
- 7 0てに保存しておいたクラミ ジァ ·ニューモニエ YK 4 1感染凍結 H L钿 胞浮遊液を »解し、 テフロンホモジナイザーでホモジナイズした。 2. 5 0 0 rp mで 1 0分間遠心分離し、 上淸を回収した。 沈 Kは再び S P Gに懇 Sし、 同様の 操作を行い、 上清を回収した。 同様の搡作を更に 2回行い、 得られた上清は集め て合わせた。
別途、 遠心管に 5 0 % (w/v) 庶糖を含む 0. 0 3Mトリス一塩酸綬銜液 (pH7. 4 ) 、 次いで、 ゥログラフィ ン 7 6 % (シエーリング社製） 3容量と 0. 0 3 Mトリス一塩酸緩銜液 (pH7. 4 ) 7容量との混合液を重層し、 この上に先 に回収した上淸を注意深く重層し、 8， 0 0 0 rpuで 1時間遠心分 «した。 5 0 % (w/v) 庶糖を含む 0. 0 3Mトリスー埴酸 tt衢液 （PH7. 4 ) 層及び沈黢 を回収し、 この回収液に同容量の S P Gを加え、 1 0. 0 0 0 rpBで 3 0分 W遠 心分離した。 上淸を捨て、 沈 »を S P Gに懸 »した。 遠心分 «管に、 ゥログラフ イ ン 7 6 % (シヱ一リング社製） と 0. 0 3 Mトリス-塩酸緩衝液 （PH7. 4 ) の 3 5 %から 5 0 % (総量に対する前者の容量比） までの連統密度勾配液を作製 し、 この上に懸 ffi液を重層し、 8 0 0 0 rpmで 1時間遠心分離した。 黄色味がか つた白いバンドを少量摂取し， 電子顕微餽で観察した結果. クラミ ジァ 'ニュー モニエの基本小体が含まれていた。 そこでそのバン ドを回収し、 これを S P Gで 2倍に希釈し、 1 0 0 0 0 rpmで 3 0分間遠心分離した。 得られた沈殷を S P G に懸 «し、 タンパク K濃度を測定 （バイオラッ ド社のタンパク刺定キッ トを用い、 牛血清アルブミ ンを棵準と した） 後、 一 7 O'Cで保存した。 (D) クラ ミ ジァ ' ニューモニエ YK— 4 1株のゲノム DN Aの SS製
上記精製クラミ ジァ ·ニューモニエ YK— 4 1株の基本小体の懸 »液 3 0 0 β 1 (タンパク質濃度： 1. 3 7 ng/Bl) を 4で、 1 2 , 0 0 0 rpnで 5分間違心分 «した。 沈鍛に 1 mME DT Aを含む 1 0 mMトリスー塩酸緩衝液 pH8. 0 (以 下、 TE緩衝液という） 5 0 0 # 1を加えて懸觸した。 同様の遠心分離を再度行 い、 沈殿を 3 0 0 ^ 1の TE緩街液に懸濁した。 1 %SD S水溶液 3 0 1及び 1 ng/mlプロティナーゼ K水溶液 3 0 1を加え、 5 6でで 3 0分 インキュべ — 卜し、 基本小体を溶解させた。 0. 1 Mトリスー塩酸緩銜液 （pH8. 0) 飽和 フエノール 3 5 0 w 1を加え、 ボルテツクスミキサーでよく混合後、 4で、 1 2. 0 0 0 rp»で 5分 K遠心分雌し、 水層を回収した （DNAの抽出） 。 この抽出操 作はもう一度級り返した。 1 Ong/Blの RN a s e溶液を 2 1加え、 3 7でで 2時間イ ンキュベートし、 RNAを分解した。 0. 1 Mトリスー塩酸接衝液 （pH 8. 0 ) 飽和フ iノール、 クロロホルム及びィソァミルアルコールの 25 : 2 4 ： 1 (容量比） の混合液 （以下、 P C Iという。 ） 3 0 0 # 1を加え、 ボルテ ックスミキサーでよく混合し、 4で、 1 2, 0 0 0 ΓΡΒで 5分間遠心分離し、 水 層を回収した。 この操作を合計 5回緣り返した。
得られた液にその 1 /1 0容の 1 0 M舴酸アンモニゥム水溶液及び 2容のエタ ノールを加え、 5分 BB放置し、 DNAを析出させたのち、 4で、 1 2. 00 0 rp ■で 5分 遠心分 Kした。 沈 Rは 7 0%エタノール水溶液 6 0 0 Iを加え、 混 合し、 4で、 1 2， 00 Orp膽で 5分 Γ遠心分 «する洗浄を 2回練り返した。 遠 沈管のふたを開けたまま 1 5分 H放置して沈 Kを乾 «させ、 これに TE 2 0 0 ^ Iを加えて溶かし、 一 2 0 に保存した。
(E) ゲノム D N A発現ライブラリーの作製
ゲノム D N A溶液 1 0 0 1に、 制限酵素用 M-buffer 1 0 // 1、 制限酵素混合 液 （A c c I、 H a e HI及び 1 5 0希釈の A l u l各 0. と TE 2 0 1を混合） 1 0 1を加え、 3 7 'Cで 2 0分間反応させた。 なお、 上記 2 0分 の反応時間は、 DNAが 1 k b p〜7 k b pの大きさの部分消化 D N Aに分解さ れる時間で、 予め少量のゲノム D N Aを用いて試験した。 上記反応液に P C Iを 1 0 0 # 1加え、 ボルテックスミキサ一でよく混ぜ、 4 、 1 2. 0 0 0 rpnで 5分間遠心分 «し、 水層を回収した。 これに 3M舴酸ナトリゥム水溶液 1 0 1 及びエタノール 2 2 0 // 1 を加え、 一 8 0でに 1 5分間静 Bし、 郁分消化 DNA を析出させた。 4で、 1 2, 0 0 O rpmで 5分 W遠心分離し、 上淸液を捨てたの ち.、 沈殿に 7 0 %エタノール水溶液 5 0 0 1 を加えて混ぜ、 再び、 1 2, 0 0 0 rpnで 5分間遠心分離した。 上淸液を捨て、 沈 ¾を減圧下に乾爆した。
得られた部分消化 D N Aを精製水 2 0 1に溶かし、 その 1 9 1をとり、 こ れに下記塩基配列で示されるリンカ一 （ 2 0 pBole/ / 1) 1 4 / 1、 1 0 mM AT P 4. 5 1、 5 0 mM M g C 12、 5 0 mMジチオスレィ トール及び 5
0 0 / g/al牛血淸アルブミ ン含有 0. 2 Mトリスー塩酸接衝液 （pH7. 6、 以下, 1 0倍濃度ライゲーシ sン用 »銜液という） 4. 5 1、 精製水 2 // 1及び T 4 リガーゼ を加え、 1 6でで 4時間反応させ、 リ ンカ一を付加させた。
5 ' 一 AATTCGAAC C C CTTCG - 3'
3 ' 一 G CTTGGGGAAGC p - 5' リ ンカ一を付加させた部分消化 DN Aを、 0. 1 MN a C 1及び 1 mME DT A含有 1 OmMトリスー填酸緩銜液を移動相とする Chrow spin 6000カラムにか けた。 溶出液 2滴ずつを分取し、 各分画の一 »を 0. 8%ァガロースゲル電気泳 動で分析して、 l k b pから 7 k b pの D N A断片を含む分酉を回収した。 得ら れた分画 1 4 4 / 1 に、 精製水 1 3 ^ 1、 1 0 mMAT P 2 0 1 > 0. 1 MM g C 12、 5 0 mMジチオスレィ トール、 1 mMスペルミ ジン塩酸塩及び 1 mM EDTA含有 0, 5 Mトリスー塩酸緩衝液 （PH7. 6、 以下、 1 0倍濃度リ ン酸 化反応用锾衡液という。 ） 2 0 ^/ 1、 及び T 4ポリヌク レオチ ドキナーゼ 3 ^/ 1 を加え、 3 7てで 3 0分間反応させ、 DNA断片の 5 ' 端をリ ン酸化した。 P C
1 2 0 0 1を加えてよく振り混ぜた後、 4で、 1 2 , 0 0 0 rpnで 5分間遠心 分離し、 水層を回収した。 2 Omg/nlグリコーゲン水溶液 1 1、 3 M舴酸ナト リウム水溶液 2 0 1及びェタノール 4 0 0 1 を加えてヌクレオチドを析出さ せた。 4。に 1 2 , 0 0 0 rpmで 1 0分間逸心分離し、 上淸を捨て、 沈殿に 7 0 %エタノール 2 0 0 u \を加え混ぜ、 再び遠心分離し、 上清を捨て、 沈殿を風乾 し、 精製水 1 u 1を加え溶かした。
この液 0. 6 w 1 に、 予め制限酵紊 E c 0 R Iで切断した； I gtllDNA ( 1 u g/ U ス トラタジーン （Stratagene) 社） 1 1 、 1 0倍濃度ライゲーシ s ン 用緩街液 0. 5 1、 l O mMAT P O . 5 1 、 T 4 リガーゼ 0. 4 I及び 精製水 2 # 1を加え、 4でで一晚反応させた。 次いで、 ギガパック （Gigapack)
11 Goldパッケージングキッ ト （ストラタジーン社） を用い、 得られた組換え； l g HID N Aをパッケージングした。
(F) クラミ ジァ ·ニューモニエ特異的モノクローナル抗体の作製 骨 fit腫細胞株の培養及び継代
モノクローナル抗体の作製に用いた骨 MB細胞株は、 P 3 ZN S I Z 1 — A g 4一 1 (AT C C T I B— 1 8 ) である。 1 0 % ( v v ) 牛胎児血淸を含む R PM I 1 6 4 0培地で培養し、 継代した。 細胞] H合に供する 2通間前に、 0. 1 3 mMの 8—ァザグァニン、 0. 5 gZni 1の MC— 2 1 0 (マイコブラズ マ除去剤、 大日本製薬 （株） 製） 及び 1 0 % (v/v) 牛胎児血清を含む R PM 1 1 6 4 0培地で 1通 M培養し、 その後の ΙϋΜは通常の培地で培養した。 マゥスの免疫
タンパク質の濃度が 2 Ί 0 μ g/m 1の上 基本小体の懸»¾ 2 0 0 # 1 を、
1 2 0 0 0 r pmで 1 0分 遠心分 «し、 沈 Rに 2 0 0 1の P B Sを加え、 再 懸菊した。 これに 2 0 0 〃 1のフロイン トコンプリートアジュバントを加え、 ェ マルジヨンとし、 その 1 5 0 // 1をマウスの背中の皮下に注射した （この日を 0 曰目とする） 。 1 4 曰目、 3 4 曰目及び 4 9曰目に、 タンパク質の濃度が 2 7 0 u ε/m \の精製基本小体の懸 S3液 1 0 0 ^ 1をマウスの腹腔内に注射した。 更 に、 6 9曰目にタンパク質の濃度が 8 0 0 # gZm 1の精製基本小体の懸«液 5 0 1、 9 2日目に同懸 «液 1 0 0 〃 1をマウスの腹腔内に注射し、 9 5日目に 脾臓を取りだし、 钿胞触合に供した。 細胞》合
免疫したマウスの胖纖から得られた胖钿胞 1 08俚に対して骨 K膽钿胞 1 07個 を丸底ガラスチューブにとり、 よく混合し、 1 4 0 0 r pmで 5分間遠心分雌し 上淸を除去 た後、 細胞を更によく混合した。 予め 3 7てに保温しておいた 3 0 % (wZv) ポリエチレンダリコールを含む RPM 1 1 6 4 0培地 0. 4 m 1を 加え、 3 0秒間放置した。 7 0 0 r pmで 6分間遠心分離した後、 RPM I 1 6 4 0培地 1 Om 1を加え、 ポリエチレンダリコールがよく混ざるようにガラスチ ユーブをゆっく り回転させ、 1 4 0 0 r pmで 5分 遠心分離し、 上淸を完全に 除去し、 沈殿に 5 m 1の HAT培地を加え、 5分 W放置した。 更に 1 0〜2 0 m 1の HAT培地を加え、 3 0分 放 Bした後、 骨 ««钿胞演度が 3. 3 1 05 Zm 1 となるように HAT培地を加えて細胞をお '»させ、 バスツールビぺッ トを 用い 9 6ゥュルブラスチック製培養容 Sのゥュルに 2滴ずつ分注した。 5% ( V Zv) 炭酸ガス雰囲気下、 3 6でで培養し、 1日後、 7日後及び 1 4曰後にゥェ ルに HAT培地を 1〜 2滴加えた。 抗体生産細胞のスクリーニング
精製したクラミジァニューモニエ YK 4 1の基本小体を 1 % (w/v) S D S で可溶化し、 0. 02 %アジ化ソーダ含有 0. 0 5M重炭酸ソーダ緩銜液 （pH 9. 6 ) に対して透析したのち、 タンパク ¾濃度が l〜 1 0 iz g/m l となるよ うに希釈した液を、 塩化ビニル製 9 6ゥ I ル E 1 A用プレー トのゥエルに 5 0 u 1 とり、 4でで一晩放匱し、 抗原を吸着させた。 上澄みを除去し、 ゥエルに 0. 0 2% (w/ V ) ツイーン 2 0を含む P B S 1 5 0 1を加え、 3分間放置し、 その後除去 ·洗浄した。 洗浄操作を更に 1回行なった後、 ゥュルに 1 % (vZ V ) 牛血清アルブミ ンを含む P B S l O O lを加え、 4てで一晩以上放置し、 ブロッキングを行なった。 牛血清アルブミ ンを含む P B Sを除いた後、 0. 0 2 % (W/ v) ツイーン 2 0を含む P B Sで同様に 2回洗浄後、 ゥ Xルに融合細胞 の培養上清を 5 0 " 1加え、 室温で 2時間放匱した。 0. 0 2 % (wZv) ツイ ーン 2 0を含む P B Sで同様に 3回洗浄後、 ゥエルに 2 5 n gZm 1のペルォキ シダーゼ標識化ャギ抗マウス I g G抗体を 5 0 1加え、 室温で 2時間放 IIした《 0. 0 2 % (w/v) ツイーン 2 0を含む P B Sで同様に 3回洗浄後、 ゥ ルに A B T S溶液 （KP L社製） を 5 0 1加え、 室温で 1 5分〜 1時間放匱して発 色反応させた後、 9 6ゥェル£ 1八ブレート用光度計で 4 0 5 n mの吸光度を測 定した。
この枯果、 I»性のゥエルが見出され、 その培養上清中には基本小体と反応する 抗体が含まれていることが分かった。 このゥ ル中の細胞をそれぞれパスツール ビぺッ トで回収し、 2 4ゥ tルブラスチック製培養容器に移し、 HAT培地 1〜 2 m 1 を加え、 同様に培養した。 ffi界希釈法によるクローニング
2 4ゥ ルプラスチック製培養容器で增¾させた》合細胞の細胞濃度を測定し， 細胞数が 2 0 /m 1 となるようそれぞれを HT培地で希釈した。 別に HT培地 に懸簡した 4〜6¾齡のマウス胸腺細跑を 9 6ゥ ルブラスチック製培養容器に 2 】 05個/ゥ ルとり、 これに上 の »合細胞 （細胞濃度が 2 0個 Zm 1 ) を 5 0 1 Ζゥェルずつ加え、 5% (v/v) 炭酸ガス雰囲気下、 3 6でで培養 し、 その 1 日後、 7日後及び 1 4曰後に HT培地を 1〜2滴 ウ ル加えた。 細 昀の增 1が見られたゥ Xルの培養上清を 5 0 it 1回収し、 上 Eと同様の方法で抗 体の生産を確 した。
ゥュル中に単一の細胞コロニーしか存在せず、 基本小体と反応する抗体を生産 するもので、 かつ增¾が早い細胞をゥュルから回収し、 引き統き 2 4ゥ ルブラ スチック製培養容器で坳殖させた。 更に、 同様のクローニング操作を繰り返し、 最終的にハイブリ ドーマ、 A Y 6 E 2 E 8を得た。 モノ クローナル抗体の生産
ハイプリ ドーマ AY 6 E 2 E 8を、 1 0 % (vZv) 牛胎児血清含有 RPM 1 1 6 4 0培地 2 0 m 1 を入れた 7 5 cm2ブラスチック製細胞培養用フラスコで增 殖させ、 3〜4 日ごとにその培養液から 1 6〜 1 8 m lを抜き取り、 代わりに新 鲜な 1 0 % (v/v ) 牛胎児血清含有 R PM 1 1 6 4 0培地を総量で 2 O m 1 と なるように補い、 継代培養を統けた。 抜き取って回収した細胞培養液は、 1 2 0 0 r pmで 5分間遠心分 «し、 上淸 （モノ クローナル抗体含有培養上淸） を回収 した。
また、 予め 2週間前にプリスタン 0. 5 m l を腹腔内に注射しておいた B a 1 b/ cマウスのその腹腔内に、 1〜5 X 1 06個 Zm 1 となるよう P B Sで懸 SJ したハイプリ ドーマ株を l m l注射した。 3通 ¾後、 b a 1 bZcマウスの腹水 を回収し、 1 2 0 0 r 0111で 5分間遠心分«し、 上淸 （モノクローナル抗体含有 tt水） を回収した。 モノクローナル抗体のサブクラスの同定
I S OTYP E A b - S TAT (S a n g S t a t M e d i c a 1社製） を 用い、 モノ クローナル抗体のサブクラスを同定した。 その桔果、 ハイプリ ドーマ A Y 6 E 2 E 8が生産するモノクローナル抗体のサブクラスは 1 g G 2bであった。 モノクローナル抗体の精製
ハイプリ ドーマ AY 6 E 2 E 8が生産するモノクローナル抗体は以下のように して精製した。 ハイプリ ドーマ A Y 6 E 2 E 8をマウス tt腔内に注射して得られ たモノクローナル抗体含有 tt水 1容に 3容の P B Sを加えて «合し、 3 0 0 0 r pmで 1 0分 Γ 遠心分雌し、 その上清をポアサイズ 0. 2 2 のフィルタで慮 逷後、 これをクロマト "ノブスーパーブロティン Aカラム （径 4. 6IBX 1 0 0蘭 B、 日本ガイシ（株）製） を用いる H P L Cで精製した。 カラムは予め、 P B Sで平衡 化しておいた。
0. 2 2 mフィルタで 後のサンブル 1 m 1 をカラムに注入後、 P B Sを
1 m 1 /m i nで 3分間流し、 次いで、 5 m 1 Zm i nで 4分間流してカラムを 洗浄した後、 精製水 1 Lに N a C 1 8. 7 7 g、 クェン酸 （一水和物） 1 6. 7 g及び N a2HP04 ' 1 2 H20 1 4. 7 2 gを溶かした液を 2 m l /m i nで
5分間流してモノクローナル抗体を溶出した。 モノクローナル抗体の溶出画分を 集め、 TT B S溶液で希釈した。
クラ ミ ジァ . ニューモニエの基本小体を溶解し、 基本小体に含有されているぺ プチ ドを取得した。 このぺブチドと上記モノクローナル抗体を用いてゥュスタン ブロッ トを行い、 取得したモノクローナル抗体の特異性を 8¾ベた。
その桔果、 取得したモノクローナル抗体はクラミ ジァ 'ニューモニエ 5 3 KD a抗原ポリぺブチ ドを S»することがわかった。
ハイプリ マ AY 6 E 2 E 8と同様にして、 ハイプリ ドーマ 7 0を取得した, 上記の方法と同様にしてハイプリ ドーマ 7 0が産生するモノクローナル抗体の特 異性を翻べた結果、 このモノ クローナル抗体はクラ ミ ジァ ' ニューモニエ 7 3 K
D a抗原ボリぺブチドを K雄することがわかった。
また、 上記の方法と同様にしてハイプリ ドーマ 7 0が産生するモノクローナル 抗体のサブクラスを興べた結果、 この抗体のサブクラスは I gGであった。
(G) 抗原ボリぺブチドをコードする DN Aのクローニング
大 I»菌 Y 1 0 9 0 r—抹の一白金耳を 1 0 mMMg S 043蠤 1、 0. 2 %マル トース及び 5 0 g/纖 1アンビシリン含有の L B (水 1 L中に N a C 1 5 g、 ポリ ペプトン 1 0 g及び眯母エキス 5 gを含む） 培地に接種し、 3 7でで一晩振とう 培養したのち、 これを 2, 00 Orp鵬で 1 0分 遠心分離した。 沈殿 （大 I»菌） に 1 0 mMM g S 04水溶液 9 alを加えて混ぜ、 この大 I»菌懸 «液の 0. 3 5 nl を採り、 これに； I gill (DN Aライブラリー） 懸鯽液を 0. 1〜 1 0 # 1加え、 37でで 2 0分 I»ィンキューべ一トし、 大 »菌に； Igtllを感染させた。 予め 4 7 でに保温した液状 L B寒天培地 2. 5黼 1に、 上記； Igtll感染大 »菌を加え、 これ を直ちに L B寒天培地上に撒いた。 上雇寒天培地が固化した後、 4 2でで 3〜4 時間培養し、 プラークが観察された時点で 1 OmM 1 PTG水溶液に浸濱した 二トロセルロースフィルター φ 8 2mm) を上層寒天培地に乗せ、 3 7でで 1 2 時間培養した。 黑イ ンクをつけた注射針で非対称に 3力所突き刺してフィルター に目印をつけた後、 フィルターを寒天培地からとり出し、 1 5 0mMN a C l及 び 0. 1 %ツイ ーン 2 0含有 2 OmMト リスー塩酸緩街液 （PH7. 5 ) (以下、 TTB S緩衝液という） で 3回洗浄した。 寒天培地は冷蔵庫中に保存した。
フィ ルターを 1 5 O mMN a C 1含有 2 O mMト リ スー塩酸緩衝液（ρΗ 7.
5 ) (以下、 T B S緩衝液という） の 0. 1 %牛血清アルブミ ン含有液に浸し、 3 7 で 1時間振とう し、 ブロッキング反応を行った。 次いで、 フィルターを T T B S接衝液で 2回洗浄したのち、 1 0 g/mlのクラミ ジァ 'ニューモニエ特異 的モノ クローナル抗体 TTB S溶液に浸し、 3 7 、 1時間振とう した。 フィ ル ターを TTB S«»液で 3回洗浄した後、 バーオキシダーゼ標雄の （5 Ong/ml ) 抗マウス I g G抗体溶液 （TTB S緩街液） 中、 3 7でで 1時間振とう した。 フィ ルターを TTB S緩銜液で 3回、 及び TB S緩衝液で 3回洗浄した後、 発色 基質液 （T B S緩衝液 1 0 0>nlに 3 0 %通酸化水衆水溶液 6 0 # 1 と 0. 3 % 4一クロロー 1一ナフ トールのメタノール溶液 2 Oilを加えて M製） に浸濱し、 室温で約 3 0分間放置した。 十分発色した時点でフィルターをとり出し、 精製水 で洗浄し、 風乾した。
フィルターの発色スポッ トに対応する寒天培地上のプラークを搜して同定し、 この部分の寒天をパスツールビぺッ 卜でつき刺し、 プラークを回収した。 回収し たプラークはクロ口ホルム 1滴を加えた 0. l MN a C l、 8 mM硫酸マグネシ ゥム及び 0. 0 1 %ゼラチン含有 5 OmMトリスー埴酸緩銜液 （pH7. 5) (以 下、 SM緩銜液という） 中に採り、 4でで一晩放匿しプラーク中の； Iファージを 抽出した。 プラークが全て上記モノク D—ナル抗体と反応するようになるまで、 前 操作を級り返し、 抗原ポリペプチドをコードする DN Aをクローン化した。 このようにして、 クラミ ジァ ·ニューモニエ特異的モノクローナル抗体反応性 のクラミ ジァ ·ニューモニエ特異的抗原ポリぺプチドを発現する λファージが得 られ、 これを 5 3— 3 S λファージと命名した。
(Η) 5 3— 3 Sス ファージの培養と DN Α»製
前記 （F) で述べた方法と同様にしてプラークを形成させ、 一つのプラークを 回収し、 1 0 0 1の SM緩衝液に入れ、 4 eCで一晩放置し λファージを抽出し た。 L Β培養液で一晩培養した大腸菌 Y 1 0 9 0 r—株 2 5 0 1に、 λファー ジ液 5〜 1 0 1を加え、 3 7でで 2 0分間放置し、 大腸菌にスファージを感染 させた。 予め 3 7 に温めておいた 1 0 mM硫酸マグネシウムを含む L B培地 5 1 に接種し、 スファージによる大腸菌の溶菌が起こるまで 3 7てで 5〜7時 振とう培養した。 2 5 0 1のクロ口ホルムを加え、 3, 0 0 0 rpmで 1 0分 W遠心分離し大 J»菌钿胞残澄を除き、 スファージ懸 S液を得た。 スファージ DN Aは、 Wizard^ prepsキッ ト （プロメガ社） を用いて精製した。
( I ) クラミ ジァ ·ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードする D N Aの增幅
6 0 0 1用のマイクロチューブに、 糠製水 6 1. 5 ^ 1 > 1 0倍濃度 反応 用緩衝液 （ 5 0 0 mM K C 1、 1 5 mM Mg C 12、 0. 0 1 %ゼラチンを 含むトリス-塩酸緩衝液 pH8. 3 ) 1 0 2 0 mM d NT P 1 ^ 5 3— 3 S λファージ DNA溶液 0. 1 // 1、 2 0 ηΜ λ gtll forward priner
(宝酒造株式会社） 1 1、 2 0 ηΜ λ gtll reverse priner (ま酒造株式会 社） 1 ju K AnpiiTaq DNA Polynerase 0. 5 # 1を入れ、 ミ ネラルオイルを 2 〜3滴重層した。 9 4で 3 0秒、 5 5で 3 0秒、 7 3 "C 2分のサイクルの イ ンキュベーショ ンを 3 0回繰返し、 DNAを增幅した。 反応後、 1. 2 % 低 £融解ァガロースゲル電気泳動を行い、 增楊された DNAを切り出して Wizard PCR Prepキッ ト （プロメガ社） で精製した。
(J) DN A堪基配列分析
DNA塩基 E列分析は、 P CRで增«した DNAを »型として、 Taq DNA ボリ メラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークェンス法でシークェンス 反応を行い、 3 7 3 A型 DNAシークェンサ （アプライ ドバイオシステムズ社） で分析を行った。 得られた DN A塩基配列を遺伝子配列分析ソフ ト 「DNA S I S J (日立ソフ トウェアエンジニアリング社） を用いて、 纏集、 速桔、 アミ ノ酸 翻訳傾域の推定を行ない、 配列番号 9の配列を得た。
配列番号 9の配列の解析桔果から、 5 3 KD a抗原ポリペプチドについて、 そ の N末端から C末端に向けて約 6 0 %のァミ ノ酸配列が解明されたことが分かつ た。
上記クラミ ジァ 'ニューモニエ抗原ボリべプチドをコードする DN Aは、 クラ ミ ジァ .二ユーモニエに特異的で、 かつ、 5 3 K D a抗原ポリぺプチドを認雄す るモノクローナル抗体を利用してクローニングされたので、 この DNAは、 明ら かに 5 3 KD a抗原ポリペプチドをコードしている。
配列番号 9の塩基配列及びァミ ノ酸配列の相同性検索を G e n B a n kデータ ベースで行なつた桔果、 高い相同性を示す既知の配列は無かった。 実施例 2 クラミ ジァ · ニューモニエの抗原ボリぺプチドの一部を含むボリぺブ チドをコードする DN Aを含む組換えベクターの作製、 及びそれを含む形質転換 体の作製 前述したように、 取得した DNAが 5 3 KD a抗原ボリペプチドをコードして いることが明らかであるが、 念のため、 下記のようにして、 取得した DNAを発 現させ、 上 K抗体と反応するか否か »ベた。
プラスミ ド p B B K 1 0 MMを制限醉 *BaaiHIと Xholで切断し、 1. 2 %低温 »解ァガロースゲル電気泳動を行い、 約 4. 6 Kb pの DNA断片を切り出して 精製した。 この DN A断片 lOOngに、 配列番号 1 1及び配列番号 1 2の合成 DN A各 1 ngを添加し、 DNAライゲーシヨンキッ ト （ま酒造） を用いてこれらの！） NAを連桔した。 この反応物を大 »菌 HB 1 0 1株コンビテントセル （¾酒造） に入れ、 形 転換体を作製し、 プラスミ ドを取得し、 これを PADA 4 3 1と名 付けた。 このブラスミ ドを制 R»¾llunlで切断した後、 アルカリホスファターゼ 処理し 5 ' リ ン酸基を除去した。
一方、 5 3— 3 S λファージ DNAを制限眯素 EcoRlで切断し、 この DNA断 片 5 Ongに、 上記の制限酵紊 Mu n Iで切断した p ADA 4 3 1プラスミ ド DN A 1 0 0 ngを添加し、 同様に連桔し、 形質転換体を作製し、 5 3— 3 S Aファー ジ DN Aの制限酵素 E c 0 R I断片が組み込まれたブラスミ ドを取得し、 これを p C PN 5 3 3 と名付けた。 このブラスミ ドは、 配列番号 1 0の塩基配列を有 する約 5. 7 k b pの DNAであり、 5 3 K抗原ボリペプチドの一部を含むボリ ぺプチ ドを宿主大腸菌で発現させることができるものである。 この 5 3 K抗原ポ リベプチドの一部を含むポリぺブチ ドをコ一ドする DN Aの塩基配列は配列番号 4のようになっており、 この塩基配列から推定されるァミ ノ酸配列はを配列番号 2のようになつていた。 ブラスミ ド P C PN 5 3 3 αをもつ大腸菌を同様に培養 し、 電気泳動、 ニ トロセルロース腆への転写、 モノ クローナル抗体での検出を同 様に行った結果、 上記ポリぺプチドに相当する発色したバンドが観察され、 ブラ スミ ド p C PN 5 3 3 aをもつ大媵菌が、 クラミ ジァ ·ニューモニエに特異的に 反応するモノクローナル抗体と反応することができる 5 3 K抗原ポリペプチドを 発現してい ことが示された。 実施例 3 クラミ ジァ 'ニューモニエの 5 3 KD a抗原ボリぺブチド全体をコー ドする D N Aの取得 配列番号 9の塩基配列を元に、 配列番号 26及び 2 7の塩基配列を有する DN Aを、 DN A合成機を用いて合成した。
実施例 1で得たクラ ミ ジァ ' ニューモニエ YK 4 1株のゲノム DN Aの水溶液 I 0 a \ (DN A含有量：約 1 / g) に、 1 0倍濃糖 Kバッファ 5 1、 精製水 3 5 // 1及び制限醉素 H i n d I I I ( 1 9 V/u 1 ) 5 ^ 1を添加し、 3 7で で 3時間保温した。
得られた反応液をフ ノールで抽出し、 エタノールを添加し、 遠心分雌して沈 黢を取得した。 この沈 JSに、 PCR in vitro Cloning Kit (ま酒造（株）製品名） 中の H i n d i 】 Iカセッ ト DNA (2 0 n s/u 1 ) 5〃 1、 ライゲーシ sン 溶液 1 5 ju lを添加し、 1 6でで 3 0分 IW保 fiした。
取得した反応液をフ ノールで抽出し、 エタノールを添加し、 遠心分離して沈 殿を取得し、 これを 1 0 1の精製水に溶解した。
得られた溶液 1 / 1に、 精製水 7 8. 5 ^ 1 0倍濃箱 P CR用バッファ 1 0 / 1、 2. 5 mMd NTP 8〃 l及び T a qポリメラーゼ 0. ( 5 UZ ti 1 ) を添加し、 さらに、 ブライマー DNAとして、 配列番号 2 6の塩基配列を 有する DNA ( 2 0 p m 0 1 / w 1 ) 1 1及び配列番号 2 8の塩基配列を有す る DNA ( 2 0 p m 0 1 / u 1 ) (上記キッ 卜において、 ブライマー C 1として 同封されていたもの） 1 〃 1を添加して、 これらを 0. 6m lのマイクロチュー ブに入れ、 ミネラルオイル 2滴を重層し、 9 4て 3 0秒、 5 5eC2分、 7 2で 3 分の温麽サイクルを 3 0回繰り返した。 以上の工程を P C R工程という。 P C R工程後の反応液 1 ^ 1 に、 プライマー DNAとして、 配列番号 2 7の塩 基配列を有する DNA ( 2 0 p m 0 1 1 ) 1 1及び配列番号 2 9の塩基配 列を有する D N A ( 2 0 p m 0 1 / 1 ) (上記キッ トにおいて、 ブライマー C 2として同封されていたもの） 1 β 1 を用い、 再度 P C R工程を行った。
2番目の P C R工程後の反応液を 1. 2 %低融点ァガロースゲル電気泳動させ. 約 1. 4 k b ρの大きさの D N Aが含有されているァガロースゲルを切り出した《 DNAの精製には Wizard PCR Prepキッ ト （プロメガ社） を用いた。 即ち、 切り 出したァガロースゲルにキッ トに同封されている緩銜液を添加し、 加熱してァガ ロースゲルを溶解し、 キッ トに同封されている精製用樹胆を添加して DN Aを樹 脂に吸着させ、 遠心分離して精製用樹指を沈殿として取得した。 沈》をプロパノ ールで洗浄し、 再度遠心分離して沈 Kを取得した。 沈殿に精製水を添加し、 精製 用榭脂から DN Aを溶出して、 遠心分雌し、 上清 （DNA水溶液） を得た。 以上 の工程を DN A精製工程という。
取得した DN A水溶液を用い、 含まれる DN Aを »型とする Taq DNA ポリメラ ーゼを用いた蛍光標繳ターミネータサイクルシークェンス法でシークェンス反応 を行い、 37 3 A型 DNAシークェンサ （アプライ ドバイオシステムズ社） でそ の D N Aの塩基配列を分析した。 得られた DNA塩基配列を遠伝子配列分析ソフ ト rDNAS I Sj (日立ソフ トウェアエンジニアリング社） を用いて、 纖集、 連結、 ァミ ノ酸翻釈頓域の推定を行なった。 以上の工程を塩基配列解析工程とい ラ o
取得した DN Aの塩基配列を解析した結果、 この DN Aは実施例 1で取得した クラミ ジァ .ニューモニエの抗原ポリペプチドをコードする D N Aの中の 3 ' 末 端側の約 5 0 b pの塩基配列を有していた。 さらに、 その塩基配列の下流には、 終始コ ドンを含有する約 0. 7 k bのコード領域が存在していることがわかった, 配列番号 9の塩基配列を元に、 クラミ ジァ 'ニューモニエの抗原ポリぺブチ ド のをコードする DN Aの上流部分に相当するブライマーとして、 配列番号 3 0の 塩基配列を有する DN Aを、 また、 上記の約 0 · 7 k bのコード領域を含む塩基 配列を元に、 クラミ ジァ 'ニューモニエの抗原ポリペプチドのをコー ドする D N Aの下流部分に相当するブライマーとして、 配列番号 3 1の塩基配列を有する D NAを、 それぞれ、 D N A合成機を用いて合成した。
実施例 1で得たクラミ ジァ ·ニューモニエ YK 4 1株のゲノム D N Aの水溶液 1 1を用い、 ブライマー DNAとして配列番号 3 0の塩基配列を有する D N A ( 2 0 pmo 1 .u 1 ) 1 u 1及び配列番号 3 1の塩基配列を有する DN A ( 2 0 p m 0 \ / n 1 ) 1 〃 1を用いて P C R工程を行った。
3番目の P CR工程後の反応液を用い、 上 !EDN A精製工程を行い、 約 1. 5 k b pの DN Aを取得した。
取得した DN A水溶液を用い、 上記塩基配列解析工程を行った。
取得した DN Aの塩基配列を解析した結果、 この DN Aは配列番号 3の塩基配 列を有しており、 配列番号 1のァミノ酸配列をコードしていることがわかった。
また, ブラスミ ド p C PN 5 3 3 aと前述の λ gtllの D Ν Αライブラリ一を用 いてゲノムウォーキングを行い、 クラミ ジァ 'ニューモニエの 5 3 KD a抗原ボ リぺプチド全体をコー ドする DN Aの取得した。 実施例 4 クラミ ジァ ·ニューモニエの 5 3 KD a抗原ポリぺブチド全体をコー ドする DN Aを含む組換えベクターの作製、 及びそれを含む形質転換体の作製 クラミ ジァ ·ニューモニエ 5 3 KD a抗原ポリべプチド全体をコードする DN Aを含む耝換えべクタ一及びそれを含む形 転換体は、 以下のようにして作製す ることができる。
クラ ミ ジァ .ニューモニエの 5 3 KD a抗原ボリペプチド全体をコードする D N Aを用い、 実施例 2と同様にしてクラミ ジァ 'ニューモニエの 5 3 KD a抗原 ポリぺブチド全体をコードする DN Aを含む組換えベクターとそれを含む形質転 換体を作製する。 実施例 5 クラミ ジァ 'ニューモニエの 7 3 K抗原ボリペプチドをコー ドする D N Aの作製 ハイプリ ドーマ AY 6 E 2 E 8を得る方法と同様にして、 ハイプリ ドーマ 7 0 を取得した。 ハイプリ ドーマ 7 0を利用してマウスの腹水を取得し、 その上淸に 含まれているモノクローナル抗体の性 Kを解析した結果、 このモノクローナル抗 体は、 クラミジァ *ニューモニエの 7 3 KD aの抗原ボリベプチ ドに特異的であ ることがわかった。
モノクローオル抗体 A Y 6 E 2 E 8の代わりに、 モノクローナル抗体 7 0を使 用し、 実施例 1 と同様の手順で操作した。 クローン 7 0— 2 Sスファージが得ら れ、 これから 列番号 1 3の配列が得られた。
配列番号 1 3の配列の解析結果から、 クラミ ジァ · ニューモニエの 7 3 K抗原 夕ンパク質については、 その N末靖から C末端に向けて約 9 0 %のァミ ノ酸配列 が解明されたことが分かった。
E列番号 1 3の塩基配列及びァミノ酸配列の相同性検索を G e n B a n kデー タベースで行なった結果、 これはクラミジァ ' トラコマチスから単離された遺伝 子塩基配列 (L. U. Sardinia et al:J. Bacteriol.. Vol.171. 335-341(1989)) と 高い相同性を示すものであった。 実施例 6 クラミ ジァ ·ニューモニエの抗原ボリぺブチドを抗原として用いる、 抗クラミ ジァ ·ニューモニエ抗体の製造 抗クラミ ジァ ·ニューモニエ抗体は、 クラミ ジァ ' ニューモニエの抗原ポリぺ プチドを用い、 次のようにして製造することができる。
(A) 骨 ft膽钿胞株の培養及び輾代
骨 M腫細胞株は P 3 X 6 3 A g 8. 6 5 3 (AT C C CR L— 1 5 8 0 ) を 1 0 % ( v/ v) 牛胎児血清を含む R PM 1 1 6 4 0培地で培養し、 継代する。 細胞 ¾合に供する 2週間前に、 0. 1 3 mMの 8 -ァザグァニン、 0. 5 g/ml OMC_ 2 1 0 (マイコプラズマ除去剤、 大日本製薬（株）製） 及び 1 0 % ( vZ V ) 牛胎児血澝を含む R PM 1 1 6 4 0培地で 1週閉培養し、 その後の 1週間は 通常の培地で培養する。
( B ) マウスの免疫 タンパク質の濃度が 2 7 0 g/Blの上記抗原ポリベプチドの溶液 2 0 0 1 に 2 0 0 1のフロイン トコンブリー トアジュバン トを加え、 ェマルジヨ ンと し、 その 1 5 0 / 1をマウスの背中の皮下に注射する （この日を 0日目とする） 。 1 4 日目、 3 4 日目及び 4 9日目に、 タンパク の濃度が 2 7 0〃g/alの上記抗原 ポリべプチ ドの懸 »液 1 0 0 〃 1をマウスの »腔内に注射し、 更に、 6 9日目に タンパク の濃度が 8 0 0 / g/nlの上記抗原ポリベプチドの懸 »液 5 0 1、 9 2日目に同懸菊液 1 0 0 1をマウスの腹腔内に注射し、 9 5日目に胖職を取り 出し、 細胞》合に供する。
(C) 細胞 »合
上記胖識から得られる胖钿胞 1 08俚に対して骨 β腫細胞 1 07個を丸底ガラス チューブにとり、 よく混合し、 1 4 0 Ο ΓΡΒで 5分間遠心分離し、 上淸を除去し、 細胞を更によく港合する。 予め 3 7でに保 Sしてある 3 0% (w/v) ポリェチ レングリコールを含む RPM I 1 6 4 0培地 0. 4纖 1を加え、 3 0秒間放置する。
7 0 0 rpmで 6分間遠心分離した後、 RPM I 1 6 4 0培地 1 O BIを加え、 ポリ エチレングリコールがよく Sざるようにガラスチューブをゆつく り回転させ、 1 4 0 O rpaで 5分間遠心分離し、 上淸を完全に除去し、 沈 Kに 5 mlの H A T培地 を加え、 5分 M放覼する。 更に 1 0〜2 0編 1の H AT培地を加え、 3 0分間放鱖 し、 骨 ft霾細胞濃度が 3. 3 X 1 05/膽 1となるように HAT培地を加えて細胞を 懸 »させ、 パスツールビぺプ トを用い 9 6ゥュルプラスチック製培養容器のゥェ ルに 2滴ずつ分注する。 5 % ( vZv) 炭酸ガス雰囲気下、 3 6でで培養し、 1 曰後、 7曰後及び 1 4 曰後にゥ ルに HAT培地を 1〜 2滴加える。
(D ) 抗体生産細胞のスクリーニング
上記抗原ボリぺブチドをタンパク 濃度が 1〜 1 0 //g/nlとなるように 0. 0 2 % (wZv) アジ化ソーダ含有 0. 0 5 M重炭酸ソーダ綏衝液 （PH9. 6 ) に 懸濁し、 0. 0 2 %アジ化ソーダ含有 0. 0 5 M重炭酸ソーダ接銜液 （PH9. 6 ) に対して透析し、 その後、 タンパク質濃度が 1〜 1 0 g/ralとなるように希 釈した液を、 ^化ビュル製 9 6ゥエル E I A用プレー トのゥエルに 5 0 u 1 と り、 4てで一晩放置し、 抗原を吸着させる。 上澄みを除去し、 ゥュルに 0. 0 2 % (wZv) ツイーン 2 0を含む P B S 1 5 0 u 1を加え、 3分間放置し、 その後 除去 ·洗浄する。 洗浄操作を更に 1回行なった後、 ゥエルに 1 % (v/v) 牛血 淸アルブミ ンを含む P B S 1 0 0 / 1を加え、 4でで一晩以上放置し、 プロッキ ングを行なう <»·牛血淸アルブミ ンを含む P B Sを除いた後、 0. 0 2 % (wZ V ) ツイーン 2 0を含む P B Sで同様に 2回洗浄後、 ゥ ルに融合細胞の培養上 淸を 5 0 // 1加え、 室温で 2時間放置する。 0. 0 2 % (wZ V ) ツイーン 2 0 を含む P B Sで同様に 3回洗浄後、 ゥエルに 2 5 ng/nlのペルォキシダーゼ棵雄 化ャギ抗マウス I g G抗体を 5 0 1加え、 室温で 2時間放置する。 0. 0 2 % (w/v) ツイーン 2 0を含む P B Sで同様に 3回洗浄後、 ゥェルに A B T S 溶液 （K P L社製） を 5 0 1加え、 室 で 1 5分〜 1時間放置して発色反応さ せ、 9 6ゥェル£ 1 プレート用光度計で 4 0 5 ηπιの吸光度を測定する。 そして »性のゥエル中の細胞をそれぞれパスツールビぺッ 卜で回収し、 2 4ゥエルプラ スチック製培養容器に移し、 H AT培地 1〜2Β1を加え、 同様に培養する。
(Ε) Κ界希釈法によるクローニング
2 4ゥ ルブラスチック製培養容 Sで增 Μ [させた 2株の »合細昀の細胞濃度を «I定じ、 細昀数が 2 0 «/膽 1となるようそれぞれを ΗΤ培地で希釈する。 別に Η Τ培地に Κ¾した 4~6通齡のマウス胸腺細胞を 9 6ゥ ルブラスチック製培養 容器に 1〜 2 X 1 05但 /ゥ ルとり、 これに上紀の »合細胞 （細胞濃度が 2 0個 /ml) を 5 0 # 1/ゥェルずつ加え、 5 % (v/v) 炭酸ガス雰囲気下、 3 6でで 培養し、 その 1 日後、 7日後及び 1 4 日後に HT培地を 1 ~2滴 ゥヱル加える, 細胞の増殖が見られたゥ ルの培養上淸を 5 0 1回収し、 上記 (D) の 「抗体 生産細胞のスク リーニング」 と同様の方法で抗体の生産を確認する。
ゥ ル中に単一の細胞コロニーしか存在せず、 基本小体と反応する抗体を生産 するもので、 かつ増殖が早い細胞をゥヱルから回収し、 引き統き 2 4ゥヱルブラ スチック製培養容器で増殖させる。 更に、 同様のクローニング操作を緣り返し、 抗クラミ ジァ 'ニューモニエ抗体を産生するハイプリ ドーマを取得する。 これを 培養し、 その培養上清から抗クラ ミ ジァ ·ニューモニエ抗体を製造する。 実施例 7 枋原ポリぺブチドを抗原として用いる抗クラミ ジァ 'ニューモニエ抗 体の検出 ·測定 抗クラミ ジァ ·ニューモニエ抗体は、 本発明の抗原ポリぺプチドを抗原として 用い、 次のようにして検出 ·測定することができる。
抗原ポリぺブチドとして、 配列番号 1のァミ ノ酸配列からなるポリぺブチドを 用い、 これをマイクロタイタープレートに固定し、 牛血淸アルブミ ンを含む P B Sを加え、 4でで一晩以上放置し、 ブロッキングを行なう。 牛血淸アルブミ ンを 含む P B Sを除いた後、 0. 0 2 % (w/v ) ツイーン 2 0を含む P B Sで同様 に 2回洗浄後、 ゥ：《 ルに患者の血清を加え、 室 fiで 2時間放置する。 0. 0 2 % (w/ V ) ツイ ーン 2 0を含む P B Sで同様に 3回洗浄後、 ゥ Λルにパーォキシ ダーゼ標識化マウス抗ヒ ト I gG抗体を加え、 室温で 2時間放鼴する。 0. 0 2 % (w/v) ツイーン 2 0を含む PB Sで同様に 3回洗浄後、 ゥェルに ABT S 溶液 （KPL社製） を加え、 室おで〗 5分〜 1時間放置して発色反応させ、 9 6 ゥエル E I Aプレート用光度計で 4 0 5 UBの吸光度を剷定する。 実施例 8 DHFRとクラミジァ ·ニューモニエの抗原ポリぺブチドのー »を含 むポリぺプチドの »合タンパク Kをコードする DN Aを含む組換えベクターの作 製、 及びそれを含む形 K転換体の作製 プラスミ ド p B B K 1 0 MMを制限酵紊 BamHIと Xholで切断し、 1. 2 %低温 »解ァガロースゲル電気泳動を行い、 約 4. 6Kbpの DNA断片を切り出して精 製した。
一方、 5 3— 3 S ス ファージ DN Aを制限醉素 EcoRlで切断し、 同様に約 1. 0 Kbpの D NA断片を精製した後、 さらに制限酵素 Availで切断し、 同様に約 0. 8Kbpの DN A断片を精製した。 上記の約 4. 6 の0 八断片 1 0 Ongに上記 の約 0. 8 Kbpの D N A断片 1 0 0 ng、 配列番号 2 1〜 2 4の合成 D N A各 1 ng を添加し、 DNAライゲーシヨ ンキッ ト （宝酒造） を用いてこれらの DNAを連 結した。 この反応物を大 ϋ菌 H B 1 0 1株コンビテン トセル （ま酒造） に入れ、 形 »転換体を作製した。
この形 K転換体を、 5 Omg/Lのアンビシリ ンを含む LB寒天培地に塗布し、 3 7てで 2 4時間培養した。 得られた大) »菌のコロニーを 5 OmgZLのアンビシリ ンを含む L 地 3 Blに接種し、 3 7でで一晚振とう培養した。 アルカリ溶解法 でプラスミ ドベクターを分 «し、 制限酵素 N r u Iで切断し、 0. 8 %ァガロー スゲル «気泳動で分析し、 6 1 6bpと 4 8 2 2 bpの D N A断片が生じている組换 えブラスミ ドベクターをもつ大 J»菌を ¾択した。 得られた組換えプラスミ ドべク ターを P C PN 5 3 3 Tと名付けた。 このブラスミ ドベクターは、 配列番号 2 5 の塩基配列を有する約 5. 4 k b pの DNAであり、 DHFRの C末端にクラミ ジァ ·ニューモニエの 5 3 KD a抗原ポリぺプチドの一郎を含むポリベプチドを 連結した »合タンパク質を発現させるものである。 この »合タンパク をコー ド する DN Aの塩基配列は E列番号 1 8のようになっており、 この塩基 E列から推 定されるアミ ノ酸 E列はを E列番号 1 6のようになつていた。 実施例 9 DHFRとクラミジァ 'ニューモニエの 53 KD a抗原ボリペプチド の一部を含むポリベプチドの融合タンパク質の ¾K
ブラスミ ド p CPN 533 Τを保持する大 »菌 ΗΒ 1 0 1株 1白金耳を 5 0 ig /1のアンビシリンを含む L B培地 3纖 1に接種し、 37でで一晩振とう培養した。 この大 BR菌を含む培地 l O tf lに 1 0 1のローディ ング緩銜液 （0. 0 1 %プロ モフエノールブルー、 1 0 %メルカブトエタノール、 2 0%グリセロール、 5 % S D Sを含む 0. 1 5 6 Mトリス塩酸緩銜液、 PH6. 8 ) を加え、 8 0でで 5分 間加熱した後、 反応液を 5— 2 0 %ポリアク リルァミ ドグラジェン トゲル 気泳 勳にかけた。 セミ ドライブロッティ ング装置の II極板上に、 1 0 %メタノール、 0. 0 5 %ドデシル硫酸ナトリウムを含む 0 · 3 Mトリ ス水溶液で湿らせたろ紙 1枚、 1 0 %メタノール、 0. 0 5 %ドデシル硫酸ナトリウムを含む 2 5 mMト リ ス水溶液で湿らせたろ紙 1枚、 1 0 %メタノール、 0. 0 5 %ドデシル硫酸ナ ト リゥム、 4 O mMアミ ノカブロン酸を含む 2 5 mM卜リス水溶液で湿らせた二 トロセルロース膜 1枚、 上記電気泳動の終了したポリアク リルアミ ドゲル、 4 0 mMァミ ノカブロン酸を含む 2 5 mMト リス水溶液で湿らせたろ紙 2枚をこの順 序で重ね、 眩極板をセッ トして 2.
Figure imgf000047_0001
の霜流密度で 1時 W電流を流し、 ポ リアクリルアミ ドゲル中のタンパク をニトロセルロース胰に転写した。 この二 トロセルロース胰を 0. 1 %牛血淸アルプミ ンを含む T B S緩衝液に入れ、 室温 で 1時間以上放隱し、 ブロッキングした。 ニ トロセルロース膜を TTB S緩銜液 で 2回洗浄した後、 ハイプリ ドーマ S C P 5 3が生産するモノクローナル抗体溶 液 （ 5〜 1 0 u TT B S緩衝液中） 中で 3 7 "C、 1時間振とうした。 ニト ロセルロース Kを TTB S緩衝液で 3回洗浄した後、 バーオキシダーゼ棵 »した 抗マウス I g G抗体溶液 （ 5 0 ng/nl TTB S緩衝液中） 中で 3 7で1時«振と うした。 ニ トロセルロース腹を TTB S緩衢液で 3回洗浄した後、 発色基質液
( 1 0 0 nlの T B S緩衝液に 6 0 # 1の 3 0 %«酸化水素水溶液と 2 O BIの 4一 クロロー 1一ナフ トールメタノール溶液を混合する） に入れ、 室温で 3 0分閗反 させた。 ニ トロセルロース を取り出し、 精製水で洗浄した後風乾した。 この 桔果、 融合タンパク Kの大きさに相当する位置に発色したバン ドが観察され、 ブ ラスミ ド P C P N 5 3 3 Tをもつ大 »菌が、 クラミ ジァ ·ニューモニエ特異的に 反応するモノクローナル抗体と反応することのできる 5 3 KD a抗原を含む »合 タンパク質を発現していることが示された。 実施例 1 0 クラミジァ *ニューモニエの 5 3 KD a抗原ポリべプチド全体をコ 一ドする DN Aの取得 実施例 3で、 クラミ ジァ ·ニューモニエの 5 3 KD a抗原ボリべプチド全体を コードする D N Aを既に取得したが、 別途、 次のようにして、 この DNAを取得 した。
ブラスミ ド p C PN 5 3 3 Tと前述の λ g t 1 1の DNAライブラリーを用い てゲノムウォーキングを行い、 クラミ ジァ .ニューモニエの 5 3 K D a抗原ポリ ぺプチ ド全体をコードする DNAを取得した。 この D N Aの塩基配列を分析 ·解 析した桔果、 この D NAは配列番号 1 7の 4 8 4〜1 9 4 7番目の塩基配列を有 しており、 配列番号 1 5の 1 6 2〜 6 4 9番目のァミ ノ酸配列をコードしている ことがわかった。 実施例 1 1 DHFRとクラミ ジァ 'ニューモニエの 5 3 KD a抗原ポリぺブチ ド全体の融合タンパク質をコードする DN Aを含む組換えべクタ一の作製、 及び それを含む形質転換体の作製
DH FRとクラミ ジァ ·ニューモニエの 5 3 KD a抗原ポリぺプチド全体の融 合タンパク質をコードする DN Aを含む組換えベクターとそれを含む形 転換体 は次のようにして作製することができる。
ブラスミ ド p B BK l 0 MMと前記クラミジァ 'ニューモニエの 5 3 KD a抗 原ポリぺプチ ド全体をコードする DN Aを用い、 実施例 8と同様にして DHFR とクラ ミ ジァ ·ニューモニエの 5 3 K D a抗原ポリぺプチド全体の »合タンパク 質をコードする DN Aを含む組換えベクターとそれを含む形質転換体を作製する, この »合タンパク Hをコードする DN Aの塩基配列は配列番号 1 7のようになつ ており、 この塩基配列から推定されるァミノ酸配列はを E列番号 1 5のようにな つている。 実施例 1 2 »合タンパク質を抗尿として用いる、 抗クラミ ジァ 'ニューモニエ 抗体の製造 抗クラミ ジァ .ニューモニエ抗体は、 本発明の «4合タンパク を抗原として用 い、 次のようにして製造することができる。
免疫に使用する抗原を上記敲合タンパク Kとする以外は、 上記実施例 6と同様 にし、 抗クラミ ジァ 'ニューモニエ抗体を産生するハイプリ ドーマを取得する。 これを培養し、 その培養上淸から抗クラ ミ ジァ 'ニューモニエ抗体を製造する。 実施例 1 3 戳合タンパク質を抗原として用いる抗クラミ ジァ 'ニューモニエ抗 体の検出 ·刺定 抗クラミ ジァ ·ニューモニエ抗体は、 本発明の »合タンパク を抗原として用 い、 次のようにして検出 ·測定することができる。
»合タンパク として、 配列番号 1 5のアミ ノ酸配列からなるボリぺプチドを 用い、 これをマイクロタイタープレートに固定し、 牛血清アルブミ ンを含む P B Sを加え、 4 tCで一晩以上放 Bし、 ブロッキングを行なう。 牛血清アルブミ ンを 含む P B Sを除いた後、 0. 0 2 % (wZv) ツイ ーン 2 0を含む P B Sで同様 に 2回洗浄後、 ゥ ルに患者の血淸を加え、 室温で 2時 放鼴する。 0. 0 2 % (w/v) ツイーン 2 0を含む P B Sで同様に 3回洗浄後、 ゥ ルにバーオキシ ダーゼ棵 »化マウス抗ヒ ト I g G抗体を加え、 室 fiで 2時間放隱する。 0. 0 2 % (w/ V ) ツイーン 2 0を含む P B Sで同様に 3回洗浄後、 ゥ： tルに A B T S 溶液 （K P L社製） を加え、 室温で 1 5分〜 1時間放 Bして発色反応させ、 9 6 ゥエル E I Aブレート用光度計で 4 0 5 nmの吸光度を測定する。 実施例 1 4 P CR法によるクラミジァ ·ニューモニエ遺伝子の梭出 配列番号 1 9の塩基配列からなる D N Aと E列番号 2 0の塩基配列からなる D NAをアプライ ドバイオシステムズ社製の DN A合成機で化学合成し、 それぞれ プライマー 5 3 F 2、 プライマー 5 3 R 2と名付けた。
クラ ミ ジァ * ニューモニエ YK 4 1株、 またはクラミ ジ 7 · トラコマチス L 2 株、 又はクラミ ジァ · シッタシ B u g d. 1 7— S L株を感染させた細胞を遠心 分離で回収し、 KC 1 5 0mM、 Mg C 12 2. 5mM、 ゼラチン 0. 1 ng /ial、 ノニデッ ト P 4 0 (Nonidet P40) 0. 4 5 %トウィーン 2 0 (Tween 20) 0. 4 5 %、 プロティネース K 0. 1 ng/mlを含む 5 0 mMトリス一塩酸緩銜 液 （PH8. 3 ) 0. 1 mlを加え、 5 6 eCで 1時間保温した後、 9 5 で 1 0分間 加熱してブロティネース Kを失活させ、 各クラミ ジァの遗伝子を含む拭料とした。 各試料 1 w 1 に、 精製水 7 8. 5 ^ 1、 2. 5 mM d NT P水溶液 8 / 1、 5 0 0 mM K C 1及び 1 5 mM M g C 12を含む 1 0 0 mMトリスー塩酸緩 衝液 （pH8. 3 ) 1 0 / 1 > 3 0 〃 Mの上記ブライマー 5 3 F 2及びブライマー 5 3 R 2の水溶液各 1 1、 並びに 5 UZ 1 タックポリメラーゼ 0. 5 ^ 1を添加し、 ミネラルオイル 5 0 〃 1 を重層した後、 9 4て 3 0秒、 6 CTC 3 0 秒、 7 2て 6 0秒の加熱、 冷却、 保温のサイクルを 3 0回繰り返した。
反応終了後、 反応液 2 u Iを取得し、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 ゲルを
0 . 5 ;/ /ID1の臭化工チジゥムに浸し、 紫外線照射下で D N Aのバンドを観察し た。
その桔果、 クラミ ジァ 'ニューモニエ Y K 4 1株から得た轼料について、 配列 番号 3の塩基配列のうち、 ブライマー 5 3 F 2の塩基配列とブライマー 5 3 R 2 の塩基配列に相補的な塩基配列で挾まれた傾城に相当する 3 6 0 b pの大きさの D N Aのバン ドが観察された。 しかし、 他の株から得た拭料についてはバンドが 観察されなかった。 産業上の利用可能性
配列番号 1のポリぺブチドの中の連狭した少なくとも 5個のァミ ノ酸配列を含 むポリべプチド Aからなる本発明の抗原ポリぺブチドは、 クラミ ジァ 'ニューモ ニェの抗体検査等に利用できる。
ポリべプチド Aが、 配列番号 1のポリべプチドからアミノ酸 1〜2 5 0個が欠 落しているポリぺブチドである本発明の抗原ポリぺブチドは、 ァミノ酸 E列の長 さが短いため、 担体等に固定化できる抗厥ぺプチドの数を多くすることができ、 それにより、 感度の Hい診断薬の製造に利用できる。
ポリぺプチド Aが、 配列番号 1のポリぺプチドの中のァミノ酸 1〜 1 0 0個が 他のアミ ノ酸で置換されているポリぺプチドである本発明の抗原ポリぺブチドは, タンパク K分解酵素による分解を受けにくい構造を作ることができるので、 抗原 として安定性に優れる。 ポリぺプチド Aが、 配列番号 1のポりぺプチドの中の 速铰した少なく とも 5個のアミ ノ酸配列にァミ ノ酸若しく は 2〜 1 0 0 0個のァ ミ ノ酸配列が桔合したポリべプチドである本発明の抗原ポリベプチ ドは、 ァミ ノ 酸若しくは 2〜 1 0 0 0個のアミ ノ酸配列を利用して担体等に固定化できるので, 固定化による抗原性の低下又は喪失が生じにくい。
ポリぺブチド Aが、 配列番号 1のァミ ノ酸配列からなるポリペプチドである本 発明の抗原ポリぺプチ ドは、 クラ ミ ジァ '二ユーモニエに特異的な抗原ポリぺブ チドの全体を有するので、 抗体検査やクラミ ジァ ·ニューモニエ感染の正確な診 断に極めて適切である。
ボリぺプチド Aが、 配列番号 2又は 5のァミノ酸配列からなるポリぺプチドで ある本発明の抗原ポリぺブチドは、 クラミ ジァ ·ニューモニエに特異的な抗原部 分を有するので、 抗体検査やクラミ ジァ 'ニューモニエ感染の正確な珍断に極め て適切である。
上記のいずれかの抗原ボリぺブチドをコ一ドする D N A若しくはそれに相捕的 な D N Aである本発明の D N Aは、 クラミ ジァ ·ニューモニエの抗体検査やクラ ミ ジァ ·ニューモニエ感染の診断等に好適な抗原ポリぺブチドの製造に利用でき る 0
塩基配列が配列番号 3の塩基配列である本発明の D N Aは、 クラミ ジァ ·ニュ 一モニエに特異的な抗原ボリぺブチドの全体をコードするので、 クラミ ジァ '二 ユーモニエの特異的抗体検査等に好適な抗原ポリベプチドの製造に利用できる。 塩基配列が配列番号 4又は 7の塩基配列である本発明の D N Aは、 クラミ ジァ •ニューモニエに特異的な抗原郎分をコードするので、 クラミ ジァ ·ニューモニ ェの特異的抗体検査等に好適な抗原ポリぺプチドの製造に利用できる。
上言己 いずれかの D N Aを含む本発明の組換えベクターは、 クラミ ジァ 'ニュ 一モニエの抗体検査やクラミジァ ·ニューモニエの感染症の珍断に好適な抗原ポ リぺプチドの製造に利用できる。
配列番号 1 0の塩基配列を有する P C P N 5 3 3 aブラスミ ドである本発明の 組換えべク夕一は、 クラミ ジァ 'ニューモニエに特異的な抗原部分を有するポリ ぺブチドを発現させることができるので、 クラミ ジァ ·ニューモニエの特異的抗 体検査等に極めて適切な抗原ポリぺプチドの製造に利用できる。
上記のいずれかの組換えベクターを含む本発明の形 転換体は、 クラミ ジァ ' ニューモニエの特異的抗体検査等に好適な抗原ポリぺプチドの製造に利用できる C 上記のいずれかの抗原ボリペプチドを抗原として用いることを特徼とする本発 明の抗クラ ミ ジァ ·ニューモニエ抗体の製造方法は、 クラ ミ ジァ 'ニ ーモニエ 感染の診断薬製造に利用できる。 上 Kのいずれかの抗原ボリぺブチドを抗原として用いることを特微とする本発 明の抗クラミ ジァ ·ニューモニエ抗体の検出 · flij定方法は、 クラミジァ 'ニュー モニエの抗体検査やクラ ミ ジァ · ニューモニエ感染の珍断に好通である。
特に、 ァミ ノ酸配列の長さが短い抗原ポリぺブチドを利用する場合は、 担体等 に固定化できる抗原ポリぺブチ ドの数を多くすることができるので高感度である, また、 ポリぺプチド中のァミ ノ酸が他のァミノ酸で置換されている抗原ポリぺ プチ ドを利用する埸台は、 抗原ボリぺブチドがタンパク質分解醉紊による分解を 受けにくい構造を作ることができるので安定性に優れており、 検出 ·測定桔果の 倌頼性が高い。
さらに、 他のァミ ノ酸配列が付加された抗原ポリぺプチドを利用する場合は、 抗原として用いられるポリペプチドを、 アミ ノ酸若しくは 2〜 1 0 0 0儀のアミ ノ酸配列を利用して担体等に固定化できるので、 固定化による抗原性の低下又は 喪失が生じにく く、 クラミ ジァ ' ニューモニエ感染を珍断する上で優れている。 また、 配列番号 1のァミ ノ酸 列からなる抗原ポリぺプチドを利用する場合は， 抗原として用いられるボリペプチドがクラミジァ ' ニューモニエに特異的な抗原 ポリべプチド全体を有するので、 抗体検査やクラミ ジァ · ニューモニエ感染の正 確な畛断に極めて適切である。
また、 配列番号 2又は 5のアミ ノ酸配列からなる抗原ポリべプチドを利用する 合は、 抗原として用いられるポリペプチドがクラミジァ ·ニューモニエに特異 的な抗原部分を有するので、 抗体検査やクラ ミ ジァ · ニューモニエ感染の正確な 診断に極めて適切である。
上記のいずれかの抗原ボリぺプチドを抗原として含有してなる本発明の抗クラ ミ ジァ ' ニューモニエ抗体の検出 ·測定用試薬は、 クラミ ジァ ' ニューモニエの 抗体検査やクラ ミ ジァ · ニューモニエ感染の珍断に好適である。
特に、 アミ ノ酸配列の長さが短い抗原ボリペプチドを利用する場合は、 担体等 に固定化できる抗原ポリぺブチドの数を多くすることができるので高感度である < また、 ポリペプチ ド中のアミ ノ酸が他のァミ ノ酸で置換されている抗原ポリベ プチ ドを利用する場合は、 抗原ポリぺプチ ドがタ ンパク質分解酵素による分解を 受けにくい構造を作ることができるので安定性に優れており、 検出 ·測定桔果の 信頼性が高い。
さらに、 他のァミ ノ酸配列が付加された抗原ボリべプチドを利用する埸合は、 抗原として用いられるポリペプチドを、 アミノ酸若しくは 2〜 1 0 0 0俚のアミ ノ酸配列を禾 用して担体等に固定化できるので、 固定化による抗原性の低下又は 喪失が生じにく く、 クラミ ジァ ·ニューモニエ感染を診断する上で優れている。 また、 配列番号 1のァミ ノ酸配列からなる抗原ボリぺブチドを利用する場合は, 抗原として用いられるポリぺブチドがクラミ ジァ · ニューモニエに特異的な抗原 ポリぺブチド全体を有するので、 抗体検査やクラミ ジァ 'ニューモニエ感染の正 確な珍断に極めて適切である。
また、 配列番号 2又は 5のアミノ酸配列からなる抗原ポリべプチドを利用する «合は、 抗原として用いられるポリペプチドがクラミ ジァ ·ニューモニエに特異 的な抗原郎分を有するので、 抗体検査やクラミ ジァ · ニューモニエ感染の正確な 珍断に極めて適切である。
上記のいずれかの抗原ポリべプチドを有効成分とする本発明のクラミ ジァ ·二 ユーモニエ感染の珍断薬は、 クラミ ジァ ·ニューモニエ感染の珍断に好適である, 特に、 ァミノ KK列の長さが短い抗厥ポリペプチドを利用する埸合は、 担体等 に固定化できる抗展ポリぺプチドの数を多くすることができるので高感度である, また、 ボリぺプチド中のァミノ ttが他のァミノ酸で置換されている抗原ポリぺ プチドを利用する場合は、 抗原ポリベプチドがタンパク質分解醉素による分解を 受けにくい構造を作ることができるので安定性に優れており、 検出 ·測定桔果の 信頼性が高い。
さらに、 他のァミ ノ酸配列が付加された抗原ポリぺプチドを利用する埸合は、 抗原として用いられるポリペプチドを、 アミ ノ酸若しくは 2〜 1 0 0 0個のアミ ノ酸配列を利用して担体等に固定化できるので、 固定化による抗原性の低下又は 喪失が生じにく く、 クラミ ジァ ' ニューモニエ感染を珍断する上で優れている。 また、 配列番号 1のァミ ノ酸配列からなる抗原ポリぺプチ ドを利用する場合は、 抗原として用いられるポリペプチドがクラミ ジァ · ニューモニエに特異的な抗原 ポリべプチド全体を有するので、 抗体検査やクラ ミ ジァ ' ニューモニエ感染の正 確な珍断に極めて適切である。
また、 配列番号 2又は 5のァミ ノ酸配列からなる抗原ポリべプチドを利用する 場合は、 抗原として用いられるポリペプチドがクラ ミ ジァ ' ニューモニエに特異 的な抗原部分を有するので、 抗体検査やクラミ ジァ ' ニューモニエ感染の正確な 轸断に極めて適切である。
配列番号 1 4のポリぺブチドに、 直接に又は介在ァミノ酸配列を介して、 配列 番号 1のポリべプチドの中の連暁した少なく とも 5但のアミ ノ酸配列を含むポリ ぺプチド Aが結合した本発明の »合タンパク は、 クラミジァ 'ニューモニエの 抗体検査等に利用できる。
ポリベプチド Aが、 配列番号 1のポリぺプチドからアミノ酸 1〜 2 5 0個が欠 落しているポリべプチドである本発明の »合タンパク Kは、 ァミ ノ酸配列の長さ が短いため、 担体等に固定化できる抗原ペプチドの数を多くすることができ、 そ れにより、 感度の高い診断薬の製造に利用できる。
ポリぺプチド A力く、 E列番号 1のポリぺプチドの中のァミ ノ酸 1〜 1 0 0個が 他のアミ ノ酸で置換されているポリぺプチドである本発明の) B合タンパク は、 夕ン ぐク質分解醇素による分解を受けにくい構造を作ることができるので、 抗原 として安定性に優れる。
配列番号 1 5のアミ ノ酸配列からなるポリぺプチドである本発明の »合タンバ ク は、 クラミ ジァ · ニューモニエに特異的な抗原ポリぺブチドの全体を有する ので、 抗体検査ゃクラミ ジァ ·ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切であ る。
配列番号 1 6のアミ ノ酸 K列からなるポリぺプチドである本発明の 合タンパ ク質は、 クラミ ジァ · ニューモニエに特異的な抗原部分を有するので、 抗体検査 やクラ ミ ジァ · ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。
上記のいずれかの »合タンパク質をコードする D N A若しく はそれに相補的な D N Aでぁる本発明のD N Aは、 クラミ ジァ ' ニューモニエの抗体検査ゃクラ ミ ジァ . ニューモニエ感染の診断等に好適な »合タンパク Kの製造に利用できる。 塩基配列が配列番号 1 7の塩基配列である本発明の D N Aは、 この D N Aにコ 一ドされている »合夕ンパク がクラミ ジァ · ニューモニエに特異的な抗原ポリ ぺブチドの全体を有するので、 クラミ ジァ · ニューモニエの特異的抗体検査等に 好適な融合タンパク の製造に利用できる。
塩基配列が配列番号 1 8の塩基配列である本発明の D N Aは、 この D N Aにコ ードされている »合タンパク Kがクラミ ジァ · ニューモニエに特異的な抗原部分 を有するので、 クラミ ジァ · ニューモニエの特異的抗体検査等に好適な融合タン パク質の製造に利用できる。
上記のいずれかの D N Aを含む本発明の組換えベクターは、 クラミ ジァ 'ニュ 一モニエの抗体検査やクラ ミ ジァ . ニューモニエの感染症の珍断に好適な »合夕 ンパク質の製造に利用できる。
p C P N 5 3 3 Tブラスミ ドである本発明の組換えベクターは、 クラミ ジァ · ニューモニエに特異的な枋原郎分を有する »合タンパク を発現させることがで きるので、 クラミ ジァ · ニューモニエの特異的抗体検査等に極めて適切な »合タ ンパク質の製造に利用できる。
上 Eのいずれかの組換えベクターを含む本発明の形 K転換体は、 クラミジァ ' ニューモニエの特異的抗体桷査等に好適な戮合タンパク の製造に利用できる。 上 Eのいずれかの »合タンパク質を抗原として用いることを特微とする本発明 の抗クラミ ジァ ·ニューモニエ抗体の »造方法は、 クラミ ジァ 'ニューモニエ感 染の診断薬製造に利用できる。
上 Kのいずれかに記載の »合タンパク を抗原として用いることを特微とする 本発明の抗クラミ ジァ · ニューモニエ抗体の検出 ·測定方法は、 クラミ ジァ ·二 ユーモニエの抗体検査ゃクラミ ジァ · ニューモニエ感染の診断に好適である。 特に、 アミ ノ酸配列の長さが短い触合タンパク質を利用する場合は、 担体等に 固定化できる抗原ポリぺプチドの数を多くすることができるので高感度である。 また、 ポリペプチド中のアミ ノ酸が他のァミ ノ酸で B換されている融合タンパ ク Kを利用する場合は、 »合タンパク質がタンパク質分解酵素による分解を受け にくい構造を作ることができるので安定性に優れており、 検出 ·刺定結果の信頼 性が高い。
また、 配列番号 1 5のアミ ノ酸配列からなる »合タンパク を利用する場合は、 抗原として用いられる融合タンパク質がクラミ ジァ · ニューモニエに特異的な抗 原ボリベプチ ド全体を有するので、 抗体検査やクラミ ジァ · ニューモニエ感染の 正確な診断に.極めて適切である。
また、 配列番号 1 6のアミ ノ酸配列からなる »合タンパク Kを利用する場合は， 抗原として用いられる緻合タンパク質がクラミ ジァ 'ニューモニエに特異的な抗 原郎分を有するので、 抗体検査やクラミ ジァ ' ニューモニエ感染の正確な珍断に 極めて適切である。
上記のいずれかの融合タンパク Kを抗原として含有してなる本発明の抗クラミ ジァ · ニューモニエ抗体の検出 · M定用拭薬は、 クラミ ジァ 'ニューモニエの抗 体検査やクラ ミ ジァ · ニューモニエ感染の珍断に好適である。
待に、 アミ ノ酸配列の長さが短い »合タンパク を利用する場合は、 担体等に 固定化できる抗原ポリぺプチドの数を多くすることができるので; «感度である。 また、 ポリべプチド中のァミノ酸が他のァミ ノ酸で置換されている »合タンパ ク質を利用する場合は、 »合タンパク がタンパク 分解酵素による分解を受け にくい構造を作ることができるので安定性に侵れており、 検出 ·測定桔果の信頼 性が高い。
また、 配列番号 1 5のアミノ»¾列からなる »合タンパク »を利用する場合は- 抗原として用いられる》合タンパク Kがクラミ ジァ · ニューモニエに特異的な抗 原ボリぺブチド全体を有するので、 抗体検査やクラ ミ ジァ ' ニューモニエ感染の 正確な診断に極めて適切である。
また、 配列番号 1 6のアミ ノ酸配列からなる融合タンパク質を利用する埸合は- 抗原として用いられる融合タンパク質がクラ ミ ジァ ' ニューモニエに特異的な抗 原部分を有するので、 抗体検査やクラ ミ ジァ ' ニューモニエ感染の正確な診断に 極めて適切である。
上記のいずれかの融合夕ンパク Kを有効成分とする本発明のクラ ミ ジァ ' ニュ 一モニエ感染の診断薬は、 クラミ ジァ 'ニューモニエの抗体検査ゃクラ ミ ジァ ' 二ユーモニエ感染の診断に好適である。 特に、 アミ ノ酸配列の長さが短い »合タ ンパク を利用する場合は、 担体等に 固定化できる抗原ポリぺブチドの数を多くすることができるので高感度である。 また、 ポリべプチ ド中のァミ ノ酸が他のァミ ノ酸で置換されている »合タンパ ク Κを利用する場合は、 融合タンパク がタンパク質分解酵素による分解を受け にくい構造を作ることができるので安定性に優れており、 検出 ·測定桔果の信頼 性が高い。
また、 配列番号 1 5のアミノ酸配列からなる融合タンパク Κを利用する埸合は, 抗原として用いられる »合タンパク Κがクラミ ジァ · ニューモニエに特異的な抗 原ポリぺプチド全体を有するので、 抗体検査やクラミ ジァ · ニューモニエ感染の 正確な珍断に極めて適切である。
また、 配列番号 1 6のアミ ノ酸配列からなる融合タンパク Κを利用する場合は、 抗原として用いられる »合タンパク質がクラミ ジァ · ニューモニエに特異的な抗 原部分を有するので、 抗体検査やクラミ ジァ ·ニューモニエ感染の正確な轸断に 極めて適切である。
本発明のブローブ及びブライマ一は、 クラミ ジァ ·ニューモニエ遺伝子の検出 •測定やクラミジァ ·ニューモニエ感染の珍断に好適である。
特に、 配列番号 1 9又は 2 0の埴基配列を有するブロープ及びブライマーは、 クラミ ジァ ニューモニエに特異的な ¾基 Ε列を有するので、 クラミ ジァ 'ニュ 一モニエ感染の正磯な診断に利用できる。
上記のいずれかのプローブ又はプライマーを用いる本発明のクラミ ジァ ·ニュ 一モニエ遺伝子の検出 ·測定方法は、 クラミ ジァ · ニューモニエ感染の診断に好 でめる。
上記のいずれかのプローブ又はブライマーを含有してなる本発明のクラ ミ ジァ • ニューモニエ遺伝子の検出 ·測定用試薬は、 クラ ミ ジァ ' ニューモニエ感染の 診断に好適である。
上記のいずれかのプローブ又はブライマーを有効成分とする本発明のクラミ ジ ァ . ニューモニエ感染の診断薬は、 クラミ ジァ · ニューモニエ感染の診断に好適 である。 配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 488
配列の型： アミ ノ酸
配列の種類 ： ぺプチド
配列
Met Ser He Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gin Lys Asn lie Met
1 5 10 15
Ser Gin Val Leu Thr Ser Thr Pro Gin Gly Val Pro Gin Gin Asp Lys
20 25 30
Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gin lie Gin Gin Thr Arg Gin Gly Lys
35 40 45
Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr He Ala Cly Ala Ser G】y Lys
50 55 60
Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gin Gin Cly 65 70 75 80
Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gin Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr
100 105 110
Lys He Ala Met Gin Thr Ser He Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu
115 120 125
Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gin Ser Leu Ser Ala Ala Gin Met Lys Glu
130 135 140
Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160
Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg
165 170 175 Ser Glu Val He Glu lie Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala lie Gin Thr
180 185 190
Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gin
195 200 205
Ala Gin Ala Asp Gin Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gin Ala He
210 215 220
Lys lie Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240
Cln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val
245 250 255
Met lie Ala Val Ser Val Ala 〖le Thr Val lie Ser He Val Ala Ala
260 265 270 lie Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala
275 280 285
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr
290 295 300
Thr Val Ala Thr Gin He Thr Val Gin Ala Val Val Gin Ala Val Lys 305 310 315 320
Gin Ala Val He Thr Ala Val Arg Cln Ala lie Thr Ala Ala lie Lys
325 330 335
Ala Ala Val Lys Ser Gly lie Lys Ala Phe He Lys Thr Leu Val Lys
340 345 350
Ala lie Ala Lys Ala lie Ser Lys Gly 1 le Ser Lys Val Phe Ala Lys
355 360 365
Gly Thr Gin Met lie Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val lie
370 375 380
Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val 385 390 395 400
Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly lie Met Cln Met Gin Leu Ser Glu 405 410 415
Met Gin Gin Asn Val Ala Gin Phe Gin Lys Glu Val Gly Lys Leu Gin
420 425 430
Ala Ala Ala Asp Met lie Ser Met Phe Thr Gin Phe Trp Gin Gin Ala
435** 440 445
Ser Lys He Ala Ser Lys Gin Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gin
450 455 460
Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gin He Leu Lys Ala Tyr Ala Ala lie 465 470 475 480
Ser Gly Ala lie Ala Gly Ala Ala
485 488 配列番号： 2
E列の長さ ： 271
配列の型： アミ ノ酸
配列の種類：ぺプチド
配列
Met Ser lie Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gin Lys Asn ！ le Met
1 5 10 15
Ser Gin Val Leu Thr Ser Thr Pro Gin Gly Val Pro Gin Gin Asp Lys
20 25 30
Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gin lie Gin Gin Thr Arg Gin Gly Lys
35 40 45
Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr lie Ala Gly Ala Ser Gly Lys
50 55 60
Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gin Gin Gly 65 70 75 80
Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gin Lys Ala Gly Ala Asp M 耱本：： ： ¾Q？羝 通 ：
Figure imgf000061_0001
ε： 檗 2ΐ
\LZ OLZ 992 09Z
usy ail "31 0Jd Aio d i OJJ naq nj ai AI D sAq β[ν »l I 13J»
9SZ 09Z
ΙΒΛ J«ll usy l¾A J«U dsy 13H J«U *I0 nI3 na1 dsy sAiュ as sAq ujg
Figure imgf000061_0002
njo BIV BIV sAq iay| r»io ujg JAi njg no 8JV njg sAq dsy an SAq
023 12 OIZ ai I BIV ui9 sAq njg na λ[0 na sAq usy qi ujg dsy e【v UIO BIY
S02 002 S61
uiD Jill J3S BIV JAi usy Jas naq BJV J3S sAq jqj, BJV IM JJ AI JJ naq
061 981 081
JiU uiD an «IV sAq BJV naq BJV naq ；） an ni;j an JBA "10 J3S
911 OLl S9I
8JV OJJ Jqi ; ΒΛ Al9 QJd sAq OJJ na njg OJJ JIJ丄 ιη;) naq sAq B JV
091 9SI OSI 9H jas Ai3 jas J3S sA ；） Jas nai BJV ^IV l«A Ι^Λ Ι«Λ ^IV "13 !«A
OH 98t 081 nig sA ujg BJV Biv "s na s u]3 na jas IM JJ naq Ji|丄 s
SZT 02T SIT
nio 13» Jas sAq jas BIV njg njg an jas jqi ujg iaw BIV an sAq
Oil 901 001
J»11 «IV JM1 usy J3S BIV Jqi JHI BIV ¾IV BIV A|9 J3S A ^19 J«U I0/S6dT/XDd 0∑£60/96 OAA, ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG 48
Met Ser lie Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gin Lys Asn lie Met
1 5 10 15
TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG 96
Ser Gin Val Leu Thr Ser Thr Pro Gin Gly Val Pro Gin Gin Asp Lys
20 25 30
CTG TCT GCC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA 144
Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gin lie Gin Gin Thr Arg Gin Gly Lys
35 40 45
AAC ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GCT CCT TCT GGA AAA 192
Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr lie Ala Gly Ala Ser Gly Lys
50 55 60
GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA 240
Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gin Gin Gly
65 70 75 80
GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT CAT 288
Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gin Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA 336
Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr
100 105 110
AAA ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG 384 Lys lie Ala Met G】n Thr Ser lie Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu
115 120 125
TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC ACT GCC GCG CAA ATG AAA GAA 432
Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gin Ser Leu Ser Ala Ala Gin Met Lys Glu
130 135 140
CTC GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA ACT TCG GGT TCC 480
Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser
145 150 155 160
GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA 528
Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg
165 170 175
TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA 576
Ser Glu Val lie Glu lie Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala lie Gin Thr
180 185 190
TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA 624
Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gin
. 195 200 205
GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA 672
Ala Gin Ala Asp Gin Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gin Ala He
210 215 220
AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA 720 Lys lie Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala Glu
225 230 235 240
CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG 768
Gin Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val
245 250 255
ATC ATC GCG GTT TCT GTT GCC ATT ACA GTT ATT TCT ATT GTT CCT GCT 816
Met lie Ala Val Ser Val Ala lie Thr Val He Ser lie Val Ala Ala
260 265 270
ATT TTT ACA TGC GGA GCT GGA CTC GCT GGA CTC GCT GCG GGA CCT GCT 864 lie Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala
275 280 285
GTA CCT GCA GCG GCA GCT GGA GGT GCA GCA GGA GCT GCT GCC GCA ACC 912
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr
290 295 300
ACG GTA GCA ACA CAA ATT ACA GTT CAA GCT GTT CTC CAA GCG GTG AAA 960
Thr Val Ala Thr Gin lie Thr Val Gin Ala Val Val Gin Ala Val Lys
305 310 315 320
CAA GCT GTT ATC ACA GCT GTC AGA CAA GCG ATC ACC GCC GCT ATA AAA 1008
Gin Ala Val lie Thr Ala Val Arg Gin Ala lie Thr Ala Ala lie Lys
325 330 335
GCG GCT GTC AAA TCT GGA ATA AAA GCA TTT ATC AAA ACT TTA CTC AAA 1056
Ala Ala Val Lys Ser Gly lie Lys Ala Phe lie Lys Thr Leu Val Lys 340 345 350
GCG ATT GCC AAA GCC ATT TCT AAA GGA ATC TCT AAG GTT TTC GCT AAG 1104
Ala He Ala Lys Ala lie Ser Lys Gly lie Ser Lys Val Phe Ala Lys
355 360 365
GGA ACT CAA ATG ATT GCG AAG AAC TTC CCC AAG CTC TCG AAA GTC ATC 1152
Gly Thr Gin Met lie Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val He
370 375 380
TCG TCT CTT ACC ACT AAA TGG GTC ACG GTT GGG GTT GGG GTT GTA GTT 1200
Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val
385 390 395 400
GCG GCG CCT GCT CTC GCT AAA GGG ATT ATG CAA ATG CAG CTC TCG GAG 1248
Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly lie Met Gin Met Gin Leu Ser Glu
405 410 415
ATG CAA CAA AAC GTC CCT CAA TTT CAC AAA GAA GTC GGA AAA CTC CAG 1296
Met Gin Gin Asn Val Ala Gin Phe Gin Lys Glu Val Gly Lys Leu Gin
420 425 430
GCT GCG GCT GAT ATG ATT TCT ATG TTC ACT CAA TTT TGG CAA CAG GCA 1344
Ala Ala Ala Asp Met lie Ser Met Phe Thr Gin Phe Trp Gin Gin Ala
435 440 445
ACT AAA ATT GCC TCA AAA CAA ACA GGC GAG TCT AAT GAA ATG ACT CAA 1392
Ser Lys lie Ala Ser Lys Gin Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gin
450 455 460 AAA CCT ACC AAG CTC GGC GCT CAA ATC CTT AAA GCG TAT GCC GCA ATC 1440
Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gin He Leu Lys Ala Tyr Ala Ala lie
465 470 475 480
AGC GGA GCC ATC CCT GGC GCA GCA 1464
Ser Gly Ala lie Ala Gly Ala Ala
485 488 配列番号： 4
配列の長さ ： 813
配列の型：核酸
鎖の数：ニ本鑌
£列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG 48
Met Ser lie Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gin Lys Asn He Met
1 5 10 15
TCT CAA CTT CTC ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAC 96
Ser Gin Val Leu Thr Ser Thr Pro Gin Gly Val Pro Gin Gin Asp Lys
20 25 30
CTG TCT GGC AAC GAA ACC AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA 144
Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gin lie Gin Gin Thr Arg Gin Gly Lys
35 40 45
AAC ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA 192 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr lie Ala Gly Ala Ser Gly Lys
50 55 60
GAC AAA ACT TCC TCC ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA 240
Asp Lys Thr'Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gin Gin Gly
65 70 75 80
GTT CCT GCT GCG AAA GAA TCC TCA GAA ACT CAA AAG GCA GGT GCT GAT 288
Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gin Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA 336
Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr
100 105 110
AAA ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA ACT ATG GAG 384
Lys lie Ala Met Gin Thr Ser He Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu
115 120 125
TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA 432
Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gin Ser Leu Ser Ala Ala Gin Met Lys Glu
130 135 140
GTC GAA GCG GTT GTT CTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC 480
Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser
145 150 155 160
GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC CGG CTG ACA CCA AGA 528
Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175
TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA 576
Ser Glu Val lie Glu lie Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala lie Gin Thr
180 185 190
TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA ACT ACA CAA 624
Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gin
195 200 205
GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA 672
Ala Gin Ala Asp Gin Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gin Ala lie
210 215 220
AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA 720
Lys lie Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala Glu
225 230 235 240
CAG AAG TCT AAA CAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG 768
Gin Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val
245 250 255
ATC ATC GCG AAG GGG TTC GAA TTG CCA TGG CGG CCC TTA ATT AAT 813
Met lie Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu lie Asn
260 265 270 271 配列番号： 5
配列の長さ ： 259
配列の型 ： アミ ノ酸 902 00Z S6i ujo Jill J3S BIV "丄 usy J3S naq E|v J9S s JlU eIV "ID na
061 281 081
jqi u|3 an BIV sAn ejy na BJV naq AJ O an njo an Ι ΒΛ "I D J3S
Gil Oil S9I
3jy ojd JIU 1¾Λ ojd sAi oij naq no OJJ JI "ID sAi BIV
091 SSr 091 ^1 8S AID J3S J3S sAi X|3 Jas na Bjy B[V [HA ΙΒΛ 1¾Λ ¾IV «10 I^A
OH 98T οει njo sAq U| BIV «IV "S n31 "S «10 naq ias "10 "81 JM1 "S
S31 021 911 njo 13N J3S sAi jas «IV nig n|o au J3S J«U aiD 13|» «IV ail sAq
Oil SOT 001
JiU BIV JM1 usv J3S «IV JiU JMl BIV BIV BIV AO jas 1¾Λ 13 JM1
S6 06 58
dsy BJV A(0 B[v sAi ujg jas njg jas jas nj sAq A【j) B|V B[V ΙΒΛ
08 91 01 Q9
A13 uj9 u[3 ojj BIV Jqi njQ 丄 sA j i jq丄 jas jas JiU sAi dsy
09 99 OS sAq A[0 J3S BIV 3 BIV ail J»U B1V dsy jas njg 13H n|g jqj, usy
Ofr SG
sAi Aio u[9 8jy Ji|丄 ιηο U|g a【〖 ιη;) sA jq丄 ίη;) usy M3 J3S naq
08 92 02
sAq dsy u【；） UJQ OJJ 【BA A【JJ iqj) OJJ 丄 jas jq na [ΒΛ ujg jas
Si 0Ϊ S I
13H ail usy s UJ Q usy dsy o Ao jas Jas "s Jas ail
據！！ ： ー ^ arfH I0/S6df/JOd 0Z£6Q96 O/A Ala Gin Ala Asp Gin Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gin Ala lie
210 215 220
Lys lie Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240
Gin Lys SerAys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val
245 250 255
Met lie Ala
259 配列番号： 6
配列の長さ ： 571
配列の型： アミ ノ酸
トポロジー ：直鑌状
E列の種類：ぺプチド
配列
Met Pro Lys Gin Ala Glu Tyr Thr Trp Cly Ser Lys Lys He Leu Asp
1 5 10 15
Asn lie Glu Cys Leu Thr Glu Asp Val Ala Glu Phe Lys Asp Leu Leu
20 25 30
Tyr Thr Ala His Arg lie Thr Ser Ser Glu Glu Glu Ser Asp Asn Glu
35 40 45
lie Gin Pro Gly Ala He Leu Lys Gly Thr Val Val Asp lie Asn Lys
50 55 60
Asp Phe Val Val Val Asp Val Gly Leu Lys Ser Glu Gly Val He Pro 65 70 75 80
Met Ser Glu Phe lie Asp Ser Ser Glu Gly Leu Val Leu Gly Ala Glu
85 90 95
Val Glu Val Tyr Leu Asp Gin Ala Glu Asp Glu Glu Gly Lys Val Val
100 105 HO Leu Ser Arg Glu Lys Ala Thr Arg Gin Arg Gin Trp Glu Tyr lie Leu
115 120 125
Ala His Cys Glu Glu Gly Ser lie Val Lys Gly Gin lie Thr Arg Lys
130 135 140
Val Lys Gly Gly Leu lie Val Asp lie Gly Met Glu Ala Phe Leu Pro 145 150 155 160
Gly Ser Gin lie Asp Asn Lys Lys lie Lys Asn Leu Asp Asp Tyr Val
165 170 175
Gly Lys Val Cys Glu Phe Lys lie Leu Lys lie Asn Val Glu Arg Arg
180 185 190
Asn lie Val Val Ser Arg Arg Glu Leu Leu Glu Ala Glu Arg lie Ser
195 200 205
Lys Lys Ala Clu Leu lie Glu Gin lie Ser lie Gly Glu Tyr Arg Lys
210 215 220
Gly Val Val Lys Asn He Thr Asp Phe Gly Val Phe Leu Asp Leu Asp 225 230 235 240
Gly lie Asp Gly Leu Leu His lie Thr Asp Met Thr Trp Lys Arg lie
245 250 255
Arg His Pro Ser Glu Met Val Glu Leu Asn Gin Glu Leu Glu Val lie
260 265 270 lie Leu Ser Val Asp Lys Glu Lys Gly Arg Val Ala Leu Gly Leu Lys
275 280 285
Gin Lys Glu His Asn Pro Trp Glu Asp lie Glu Lys Lys Tyr Pro Pro
290 295 300
Gly Lys Arg Val Leu Gly Lys lie Val Lys Leu Leu Pro Tyr Gly Ala 305 310 315 320
Phe lie Glu lie Glu Glu Gly lie Glu Gly Leu lie His lie Ser Glu
325 330 335
Met Ser Trp Val Lys Asn He Val Asp Pro Ser Glu Val Val Asn Lys S 0i9 S99
A[3 u|9 jas dsy sA dm dsy nai no Ji|丄 8jy
09S 099 ^9 OfrS i3S dsy uo dsy 丄 B【V usy dsy B【y nai 丄 ιη;) sAq |ΒΛ JSS nai
9£9 0S9 929
J3S ΙΒΛ sAq sAq SIH dsy OJJ dsy na s 3[【 八 SAq B|y J3S I«A
029 5IS 019 usy nig AID d\\ jas 3(1 an dsy njg aj i sAq BJV aqd OJJ sA dsy
909 00S S6
jas na ιη;) jas [ SIR an nai 3 n[g an Aio usy ujg naq nio
06» S8 08»
Ι«Λ ai BIV o aqj BJV Jqi ail sAq jqi ΙΒΛ IBA A|0 J3S ail l«A
S 0 S9^ 09
JtU AiJ) BJV OJd aqj ian e〖v IMJJ au nig usy dJ丄 OJJ usy jas Jas
ss^ os s naq ujg sAq JBA A[3 nai Jill 311 sA sAq s njg sA7 dsy [e^ "s ss οε
nai ai I Ι«Λ «IV niD Ι^Λ "S usy Ai3 sAq sAq a j naq njQ jas OJJ
S 0 S
s!H J8S 【ΒΛ sAq sA an dJ丄 J3S 18« dsy jas an SIH an naq Ajg
0 SO^ 00， .
nio ail AID OJJ njg naq ιη;) ΙΒΛ aqd BIV "丄 usy Ji|丄 "31 usy
S6B 06E S8C 08E sAq ail nio BIV usy Ι¾Λ s!H naq Xio an OJd 丄 sAq njg an
088 51E - OiS usy dsy dJi OJJ usy 3jy no jq丄 iqj) sAi naq Ajg naq jas an sAq
998 098 99£
AIO "10 dsv sAq uja an jas naq JBA an BJV nij) JBA "19 dsy Aja
OSS ο^ε I0/S6df/XDd 0Z£60/96 配列番号： 7
配列の長さ ： 777
配列の型： 核酸
鑌の数：ニ本鑌
トポロジー ： 直饋状
配列の種類 ： Genomi c DNA
配列
ATGTCTATTT CATCTTCTTC AGGACCTGAC AATCAAAAAA ATATCATGTC TCAAGTTCTG 60 ACATCGACAC CCCAGGGCGT GCCCCAACAA GATAAGCTGT CTGGCAACGA AACGAAGCAA 120 ATACAGCAAA CACGTCAGGG TAAAAACACT GAGATGGAAA GCGATGCCAC TATTGCTGGT 180 GCTTCTGGAA AAGACAAAAC TTCCTCGACT ACAAAAACAG AAACAGCTCC ACAACAGGGA 240 GTTCCTGCTG GGAAAGAATC CTCAGAAACT CAAAAGGCAC GTGCTGATAC TGGAGTATCA 300 GGAGCGGCTG CTACTACACC ATCAAATACT GCAACAAAAA TTGCTATGCA GACCTCTATT 360 GAAGAGGCGA GCAAAAGTAT GGAGTCTACC TTAGAGTCAC TTCAAAGCCT CAGTGCCGCG 420 CAAATGAAAG AAGTCGAAGC GGTTGTTGTT GCTGCCCTCT CAGGGAAAAG TTCGGGTTCC 480 GCAAAATTGG AAACACCTGA GCTCCCCAAG CCCGCGGTGA CACCAAGATC AGAGCTTATC 540 GAAATCGGAC TCGCGCTTGC TAAAGCAATT CAGACATTGG GAGAAGCCAC AAAATCTGCC 600 TTATCTAACT ATGCAAGTAC ACAACCACAA GCAGACCAAA CAAATAAACT AGCTCTAGAA 660 AAGCAAGCGA TAAAAATCCA TAAAGAACGA GAACAATACC AAGAGATCAA GGCTCCCGAA 720
CAGAAGTCTA AAGATCTCGA AGGAACAATG GATACTGTCA ATACTGTGAT GATCGCG 777
配列番号： 8
配列の長さ ： 1712
配列の型：核酸
艇の数 ：ニ本鎮
トポロジー ： 直鑌状
配列の種類： Genom i c DNA
配列
ATGCCAAAAC AAGCTGAATA TACTTCGGGA TCTAAAAAAA TTCTCGACAA TATACAATGC 60 CTCACACAAG ACGTTGCCGA ATTTAAAGAT TTGCTTTATA CCGCACACAG AATTACTTCG 120 AGCGAACAAG AATCTCATAA CGAAATACAG CCTGGCGCCA TCCTAAAAGG TACCGTAGTT 180 CATATTAATA AAGACTTTCT CCTAGTTCAT CTTGCTCTCA AGTCTGAGGC AGTCATCCCT 240 ATGTCAGAGT TCATAGACTC TTCAGAAGGT TTAGTGCTTG GAGCTGAAGT AGAAGTCTAT 300 CTCGACCAAG CCGAAGACGA AGAGGGCAAA GTTCTCCTTT CTAGAGAAAA AGCCACACGA 360 CAACGTCAAT GGGAATACAT CTTAGCTCAT TGTGAAGAAG GTTCTATTGT TAAAGGTCAA 420 ATTACACGTA AAGTCAAAGG CGGCCTTATT GTACATATTG GAATGGAAGC CTTCCTACCT 480 08C I V03V1113VI IVVVVVVVIO VVVOVVVOVO ViOVOiVIIi IVliOlDOOV 3V丄 3丄3丄丄 vv
02£ΐ VD3VVVVVV3 I1V13VV0V0 ilDO VOiOi 3丄 3VVVVVV丄 XVDD110V3I V3V0101I1V
0921 IVOllVDiOJ. 933V0I1VV0 9V30VV9VI1 VV01130III D0139DV1XV V30VV11DVV
0021 0VV0IVVV31 03XVV3I01V 3013I03VIV I301V1VVVV V3VV001V1V V3V3D91I33
OH I IVVI03VV3V 3VVV03VVV1 1V33V1D101 X1VVVVV09V V93V3DVV0V 3HVID1VX3
0801 LLu ov vai avvaiv 33D3VVVIVV <i3vv; oviooivavi oixvivvvvv
OZOT 3I003I1D1D IVVV0131I1 V0V3UVV1D 139VVD1IV3 093VDVV91J, VVV3UV3U
096 IDOVOOaViD D3013X13DV VDI311VVVV ID31131I9V DDVVVVDDX3 OIODOVIVVV
006 3VV3VD11VJ. V9VV99D1I3 31VV1VD3V9 VVVVV3VVV0 IDXOOVIDIO D11DV00VD9
0^8 VVVVVDVVVi V9V133DVV1 IIIVIIVVID VVD0110V9V VOlVVOliVV 301DD1VVV0 081 0DVIVD003V V I VIUV J.V30DVI1V0 VD013I1D1D 90V011V1D0 OZi 1V3010XV0V ΠΟΠνΐΟΙΟ 9I110V910V UV3VVVVV丄 13UDVD0VV V09D0V1VV0
099 V3301VX31I 丄 VVV3VV3丄丄 VUDVVODDO VVVDVV1013 1VV9V3V0J.3 0VV0VI131D
009 VV9V3VV9VV 0131311311 VIVV00D130 VVD1190VV1 IVVVVVUXl VVVVOilVVO
0 S UDVVVV OOOIOIVUV DlVOVlliVV VVVOIVVVVO VV3VV0V011 VVV3V3XV00
968I0/S6df/IOd 0Z£60 96 OMi GTTAAGCAAT TAAGTTCTAA TCCTTGGAAT GAAATTGAAG CTATGTTCCC TGCTGGCACA 1440
GTAATTTCAG GAGTTGTGAC TAAAATCACT GCATTTGGAG CCTTTGTTCA GCTACAAAAC 1500
GGGATTGAAG GATTGATTCA CGTTTCAGAA CTTTCTGACA AGCCCTTTGC AAAAATTGAA 1560
GATATTATCT CCATTGCAGA AAATGTTTCT GCAAAAGTAA TTAAGCTACA TCCACATCAT 1620
AAAAAACTTT CTCTTTCTGT AAAAGAATAC TTAGCTGACA ATGCTTATGA TCAAGACTCT 1680
AGGACTGAAT TAGATTTCAA GGATTCTCAA GG 1712
配列番号： 9
配列の長さ ： 1048
£列の型：核酸
銀の數：二本饑
トポロジー ：直鎮状
配列の種類： Genoni c DNA
源
生物名 ： C.ニューモニエ
株名 ： YK-41
直接の起源
クローン ： 53-3S
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位 S ： 236. . 1012
特徴を決定した方法 ： P 配列
TCAGTATCGG CGGAATTCGA ACCCCTTCGC GGCTCTTTCT GGAACTCTAG AATCTTTACA 60
TCTCCAACAG TTAACTCAAG CATTATTCCC TTCTGCCCAA GAAGATGCCA ACTTCGCAAA 120
CGAGTTATCT TCAGTAGTAC ACGGATTAAA AAACCTAACC ACTGTAGTTA ATAAACAAAT 180
GCTTAAAGGC GCTGAGTAAA CCCCTTTCCA GAATCAAACC CCTTAGCATA CAAAC ATG 238
Met
1
TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG TCT 286
Ser lie Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gin Lys Asn He Met Ser
5 10 15
CAA GTT CTG ACA TCC ACA CCC CAG GGC GTC CCC CAA CAA CAT AAC CTG 334
Gin Val Leu Thr Ser Thr Pro Cln Cly Val Pro Gin Cln Asp Lys Leu
20 25 30
TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CCT CAG GGT AAA AAC 382
Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gin lie Gin Gin Thr Arg Gin Gly Lys Asn
35 40 45
ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA GAC 430
Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr He Ala Gly Ala Ser Gly Lys Asp
50 55 60 65
AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA GTT 478 Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gin Gin Gly Val
70 75 80
GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA ACT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526
Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gin Lys Ala Gly Ala Asp Thr
85 90 95
GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA AAA 574
Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr Lys
100 105 110
ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA ACT ATG GAG TCT 622
He Ala Met Gin Thr Ser lie Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu Ser
115 120 125
ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC ACT GCC GCG CAA ATG AAA GAA GTC 670
Thr Leu Glu Ser Leu Gin Ser Leu Ser Ala Ala Gin Met Lys Glu Val
130 135 140 145
GAA GCG CTT GTT CTT GCT GCC CTC TCA GCG AAA ACT TCG GGT TCC GCA 718
Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser Ala
150 155 160
AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC CCG GTG ACA CCA AGA TCA 766
Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg Ser
165 170 175
GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA TTG 814
Glu Val lie Glu lie Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala lie Gin Thr Leu 180 185 190
GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT CCA ACT ACA CAA GCA 862
Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gin Ala
195 200 205
CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA AAA 910
Gin Ala Asp Gin Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gin Ala lie Lys
210 215 220 225
ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC CAA CAG 958 lie Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala Glu Gin
230 235 240
AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT CTC ATG 1006
Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val Met
245 250 255
ATC GCG AAGGGCTTCG AATTCCAGCT GAGCGCCGGT CGCTAC 1048 lie Ala
259 配列番号： 10
配列の長さ ： 5702
配列の型 ：核酸
鎮の数 ：ニ本趙
配列の種類：他の核酸 プラスミ ド
配列
ATCGATGTTA ACAGATCTAA GCTTAACTAA CTAACTCCGG AAAAGGAGGA ACTTCCATGA 60 TCACTCTGAT TGCGGCGTTA GCGGTAGATC CCGTTATCGG CATGGAAAAC GCCATGCCGT 120 GGAACCTGCC TGCCGATCTC GCCTCGTTTA AACGCAACAC CTTAAATAAA CCCGTGATTA 180
TCCCCCGCCA TACCTGGGAA TCAATCGGTC GTCCGTTGCC AGGACGCAAA AATATTATCC 240
TCACCAGTCA ACCGGGTACG GACGATCGCG TAACGTGGGT GAAGTCGGTG GATGAAGCCA 300
TCGCGGCGTG TGGTGACGTA CCAGAAATCA TGGTGATTGG CGGCGGTCGC GTTTATGAAC 360
AGTTCTTGCC AAAAGCGCAA AAACTGTATC TGACGCATAT CGACGCAGAA GTGGAACGCG 420
ACACCCATTT C-CCGGATTAC GAGCCCGATG ACTGGGAATC GGTATTCAGC CAATTCCACG 480
ATGCTCATGC GCAGAACTCT CACAGCTATG AGTTCGAAAT TCTGGAGCGG CGCATCCAAT 540
TCGAACCCCT TCGCGGCTCT TTCTGGAACT CTAGAATCTT TACATCTCCA AGACTTAACT 600
CAAGGATTAT TCCCTTCTGC CCAAGAAGAT GCCAACTTCG CAAAGGAGTT ATCTTCAGTA 660
CTACACGGAT TAAAAAACCT AACCACTGTA GTTAATAAAC AAATGGTTAA AGGCGCTGAG 720
TAAAGCCCTT TGCAGAATCA AACCCCTTAG GATACAAACA TGTCTATTTC ATCTTCTTCA 780
GGACCTGACA ATCAAAAAAA TATCATGTCT CAAGTTCTGA CATCCACACC CCAGGGCGTG 840
CCCCAACAAG ATAAGCTCTC TGGCAACGAA ACGAAGCAAA TACAGCAAAC ACGTCAGGGT 900 TGGTG TGG ACTGTT
TCGGGCTG C CACTT GCGCTCATGA CTTGT CT CGTA TGGG CACCCGCG AACGGT CGGTTGCT TAT CGACATC
ATAATGATCC AAGTCACGACG GA CCTCTAGACGC GAAA AA GC GGTCTGTAA iTCCGTATAGG CCGAG GTGGGTCGAAT CATGGTC GG o
AAGAAGAG AGAACA ACAATC AGAGATAGAG CTGCGAA AACCCGAGTCAGTTTA AACCGAA
€T3 o AAGACAAGAGAAAACi A CC CCC GG AATGCAGCG TGCCTTGAAGC CA TCTACA -
C5
> - TA ACCAAGCCCCCAACC CGGGGTGCCGGACT CCGCTTGT CCC -
-3 -9 ATGT AGTGGA AACCCTCAGTTTGTG CTGCCTCTCGG GC ,
oo OS 05 C
o CO C
OO t o oo o CD o o o o o t o o o o o
GTCAAT T AAAGA AGGCGAGTTACT TAGATCACC GCCG
T ACT CAAAAAAGCTGC ATCAG GAGAAAGG TGCTGA TGAGTCGGCTG TCTAACA TCG MAAG GCCGGC, TAAAAA ATAGCGCT GG TCCTCATA AAGACAGCCCA CACGGC CAAC - TGTGG TTGAAAAG GCCACT ATTGCCT A AGCACT AAT AGATCAAA CCCGG TGCGGCGGCG GTGCTCAACG GCCTCAACCT ACTACTGGGC TGCTTCCTAA TGCAGGAGTC 1860
GCATAAGGGA GACCGTCGAC CGATGCCCTT GAGAGCCTTC AACCCACTCA GCTCCTTCCG 1920
GTGGGCGCGG GGCATGACTA TCGTCGCCGC ACTTATGACT GTCTTCTTTA TCATGCAACT 1980
CGTAGGACAG GTGCCGGCAG CGCTCTGGGT CATTTTCGGC GAGGACCGCT TTCGCTGGAG 2040
CGCGACGATG ATCGGCCTGT CGCTTGCGGT ATTCGGAATC TTGCACGCCC TCCCTCAAGC 2100
CTTCGTCACT GGTCCCGCCA CCAAACGTTT CGGCGAGAAG CAGGCCATTA TCGCCGGCAT 2160
GGCGGCCGAC GCGCTGGGCT ACCTCTTGCT GGCCTTCGCG ACCCGAGGCT CGATGCCCTT 2220
CCCCATTATG ATTCTTCTCG CTTCCGGCGG CATCCGCATG CCCGCGTTCC ACGCCATCCT 2280
GTCCAGGCAG GTAGATGACG ACCATCAGGG ACAGCTTCAA GGATCGCTCC CCGCTCTTAC 2340
CAGCCTAACT TCGATCACTC CACCCCTGAT CGTCACGCCG ATTTATGCCG CCTCGGCCAC 2400
CACATGGAAC GGGTTGGCAT GCATTGTAGG CGCCGCCCTA TACCTTGTCT GCCTCCCCGC 2460
GTTCCGTCGC GGTGCATGGA GCCGGGCCAC CTCGACCTGA ATGGAAGCCC GCCGCACCTC 2520
GCTAACGGAT TCACCACTCC AAGAATTGGA CCCAATCAAT TCTTGCGGAG AACTGTGAAT 2580
GCGCAAACCA ACCCTTGGCA CAACATATCC ATCGCGTCCG CCATCTCCAG CAGCCGCACG 2640 CGGCCCATCT CGGGCAGCCT TGCGTCCTGG CCACGGGTCC GCATGATCGT GCTCCTGTCG 2700
TTGAGGACCC GGCTAGGCTG GCGGGGTTGC CTTACTGGTT AGCAGAATCA ATCACCGATA 2760
CGCGAGCGAA CGTGAAGCGA CTGCTGCTGC AAAACGTCTG CGACCTGAGC AACAACATGA 2820
ATGGTCTTCG GTTTCCGTGT TTCGTAAAGT CTCGAAACGC GGAAGTCAGC GCCCTGCACC 2880
ATTATGTTCC CGATCTGCAT CGCAGGATGC TGCTGGCTAC CCTCTGGAAC ACCTACATCT 2940
GTATTAACCA AGCGCTGGCA TTGACCCTGA GTGATTTTTC TCTGGTCCCG CCGCATCCAT 3000
ACCGCCACTT GTTTACCCTC ACAACGTTCC AGTAACCGGG CATGTTCATC ATCAGTAACC 3060
CGTATCCTGA GCATCCTCTC TCGTTTCATC GGTATCATTA CCCCCATGAA CAGAAATTC 3120
CCCCTTACAC GGAGGCATCA AGTGACCAAA CAGGAAAAAA CCGCCCTTAA CATGGCCCG 3180
CTTTATCAGA AGCCAGACAT TAACGCTTCT GGAGAAACTC AACGAGCTGG ACGCGGATG 3240
AACAGGCAGA CATCTGTGAA TCCCTTCACG ACCACGCTGA TGAGCTTTAC CGCAGCTGC 3300
CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGT 3360
CACAGCTTGT CTGTAAGCGG ATCCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCC CGTCAGCGG 3420
CTGTTGGCCG GTGTCGGGGC GCAGCCATGA CCCAGTCACG TAGCGATAGC GGAGTGTAT 3480
ACTGGCTTAA CTATGCGGCA TCAGAGCAGA TTGTACTGAG AGTGCACCAT ATGCGGTGT 3540 CAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA TACCGCATCA GGCGCTCTTC CGCTTCCTC 3600
GCTCACTGAC TCGCTGCGCT CGGTCGTTCG GCTGCGGCGA GCGGTATCAG CTCACTCAA 3660
AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCA 3720
AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA AAGGCCGCGT TGCTGGCGTT TTTCCATAC 3780
GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCACACGT GGCGAAACC 3840
CGACAGGACT ATAAAGATAC CACCCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCT 3900
GTTCCCACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCCCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGC 3960
GCTTTCTCAA TGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGC 4020
TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCACC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTAT 4080
CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGCTAA 4140
CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT CGTGGCCTA 4200
ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACC 4260
TTCCGAAAAA CAGTTGGTAC CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGG 4320
TTTTTTTGTT TGCAAGCAGC AGATTACGCG CAGAAAAAAA GGATCTCAAG AAGATCCTT 4380 TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACCCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTG 4440
GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TACATCCTTT TAAATTAAAA ATGAACTTT 4500
TAAATCAATC TAAAGTATAT ATCAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT CCTTAATCA 4560
GTGAGGCACC TATCTCAGCC ATCTCTCTAT TTCGTTCATC CATACTTGCC TGACTCCCC 4620
GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTCC TGCAATGAT 4680
ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAA 4740
GGGCCGAGCG CAGAAGTGCT CCTCCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT ATTAATTGT 4800
TGCCGGGAAC CTACAGTAAC TAGTTCGCCA GTTAATACTT TCCGCAACGT TGTTGCCAT 4860
TGCTGCAGCC ATCCTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTT 4920
CCCAACGATC AACGCGAGTT ACATGATCCC CCATGTTGTG CAAAAAAGCG CTTACCTCC 4980
TTCGGTCCTC CGATCGTTGT CAGAAGTAAG TTGCCCGCAG TGTTATCACT CATGGTTAT 5040
GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT CTCTGACTG 5100
GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGACAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGC 5160
CCGGCGTCAA CACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCAT 5220
TCGAAAACCT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA CATCCAGTT 5280 CGATGTAACC CACTCCTCCA CCCAACTCAT CTTCACCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTT 5340
TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACG 5400
GAAATGTTGA ATACTCATAC TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTT 5460
ATTGTCTCAT GACCGGATAC ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTT 5520
CCGCGCACAT TTCCCCGAAA AGTGCCACCT GACGTCTAAG AAACCATTAT TATCATGAC 5580
ATTAACCTAT AAAAATAGGC GTATCACGAG GCCCTTTCGT CTTCAAGAAT TAATTGTTA 5640
TCCGCTCACA ATTAATTCTT GACAATTAGT TAACTATTTG TTATAATGTA TTCATAAGC 5700
TT 5702
E列番号： 11
配列の長さ ： 35
配列の型：核酸
蛾の数：一本繽
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
GATCCAATTG CCATGGGGGC CCTTAATTAA TTAAC 35 配列番号： 12
配列の長さ ： 35
配列の型：核酸
鑌の数：一本鑲
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCGAGTTAAT TAATTAAGGG CCCCCATGGC AATTG 35
配列番号： 13
配列の長さ ： 1954
配列の型：核酸
鎮の数：ニ本鑌
トポロジー ：直鑲状
配列の種類： GenoDic DNA 生物名 ： C.ニューモニエ
株名： YK-41
直接の起源
クローン： 70-2S
配列の特微
特微を表す記号：一 3 5 signal
存在位置 ： 146..151
特徴を決定した方法： S
配列の特徼
特微を表す記号： ー 1 0 signal
存在位置 ： 169..174
特微を決定した方法： S
配列の特徴
特徴を表す記号 ： R B S 存在位置 ： 199..205
特徵を決定した方法： S
配列の特微
特徴を表す記号： CDS
存在位 B !-215..1927
特徴を決定した方法： S
配列
TTGACACCAG ACCAACTGCT AATGGTAGCG ACCGGCGCTC AGCTGGAATT CCAACCCCTT 60
CGCCTTATAC ATCTCTAGAA CGGAAGTATA GGATTTTACC ATTAATTCCA TTATATAGAA 120
CTAATCGTCT CCTGCAAGGG AGGTCTTGCC TTTTTTAAGC TTTATATTTA CACTCTCTTT 180
TTTGACTTTC TAGTTTTTAG GAGAATAACA ATAA ATG CCA AAA CAA CCT CAA TAT 235
Met Pro Lys Gin Ala Glu Tyr
1 5
ACT TGG GGA TCT AAA AAA ATT CTC GAC AAT ATA GAA TGC CTC ACA GAA 283
Thr Trp Gly Ser Lys Lys He Leu Asp Asn He Glu Cys Leu Thr Glu
10 15 20
CAC GTT GCC GAA TTT AAA GAT TTG CTT TAT ACG GCA CAC AGA ATT ACT 331
Asp Val Ala Glu Phe Lys Asp Leu Leu Tyr Thr Ala His Arg lie Thr
25 30 35
TCG ACC GAA GAA CAA TCT GAT AAC GAA ATA CAG CCT GGC GCC ATC CTA 379
Ser Ser Glu Glu Glu Ser Asp Asn Glu lie Gin Pro Gly Ala lie Leu
40 45 50 55 AAA GGT ACC GTA GTT GAT ATT AAT AAA GAC TTT GTC GTA GTT CAT GTT 427
Lys Gly Thr Val Val Asp lie Asn Lys Asp Phe Val Val Val Asp Val
60 65 70
GGT CTG AAG TCT GAG GGA CTG ATC CCT ATG TCA GAG TTC ATA GAC TCT 475
Gly Leu Lys Ser Glu Gly Val lie Pro Met Ser Glu Phe lie Asp Ser
75 80 85
TCA GAA GGT TTA GTG CTT GGA CCT GAA GTA GAA GTC TAT CTC GAC CAA 523
Ser Glu Gly Leu Val Leu Gly Ala Glu Val Glu Val Tyr Leu Asp Gin
90 95 100
GCC GAA GAC GAA GAG GGC AAA GTT GTC CTT TCT AGA GAA AAA GCC ACA 571
Ala Glu Asp Glu Glu Gly Lys Val Val Leu Ser Arg Glu Lys Ala Thr
105 110 115
CGA CAA CCT CAA TGG GAA TAC ATC TTA CCT CAT TGT GAA GAA GGT TCT 619
Arg Gin Arg Gin Trp Glu Tyr lie Leu Ala His Cys Glu Glu Gly Ser
120 125 130 135
ATT GTT AAA GGT CAA ATT ACA CCT AAA CTC AAA GGC GGC CTT ATT GTA 667 lie Val Lys Gly Gin lie Thr Arg Lys Val Lys Gly Gly Leu lie Val
140 145 150
GAT lie Gly Met Glu Ala Phe Leu Pro Gly Ser Gin He Asp Asn Lys 715
Asp ATT GGA ATG GAA GCC TTC CTA CCT GGA TCA CAA ATT GAC AAC AAG
155 160 165
Lys ATC AAA AAT TTA GAT GAT TAT GTC GGA AAA GTT TGT GAA TTC AAA 763 AAA lie Lys Asn Leu Asp Asp Tyr Val Gly Lys Val Cys Glu Phe Lys
170 175 180
ATT TTA AAA ATT AAC GTT GAA CGT CGC AAT ATT CTT GTC TCA AGA AGA 811 lie Leu Lys He Asn Val Glu Arg Arg Asn lie Val Val Ser Arg Arg
185 190 195
GAA CTC TTA CAA GCT GAG AGA ATC TCT AAG AAA GCC GAA CTT ATT GAA 859
Glu Leu Leu Clu Ala Glu Arg lie Ser Lys Lys Ala Glu Leu lie Glu
200 205 210 215
CAA ATT TCT ATC GGA GAA TAC CGC AAA GGA CTT GTT AAA AAC ATT ACT 907
Gin He Ser lie Gly Glu Tyr Arg Lys Gly Val Val Lys Asn lie Thr
220 225 230
GAC TTT GGT GTA TTC TTA GAT CTC GAT GCT ATT GAC GCT CTT CTC CAC 955
Asp Phe Gly Val Phe Leu Asp Leu Asp Gly lie Asp Gly Leu Leu His
235 240 245
ATT ACC GAT ATG ACC TGG AAG CGC ATA CGA CAT CCT TCC GAA ATG GTC 1003 lie Thr Asp Met Thr Trp Lys Arg lie Arg His Pro Ser Glu Met Val
250 255 260
GAA TTG AAT CAA GAG TTC GAA CTA ATT ATT TTA AGC GTA GAT AAA GAA 1051
Glu Leu Asn Gin Glu Leu Glu Val He lie Leu Ser Val Asp Lys Glu
265 270 275
AAA GGA CGA CTT GCT CTA GGT CTC AAA CAA AAA GAG CAT AAT CCT TGG 1099 Lys Gly Arg Val Ala Leu Gly Leu Lys Gin Lys Glu His Asn Pro Trp
280 285 290 295
CAA GAT ATT GAG AAG AAA TAC CCT CCT CGA AAA CGA GTT CTT GGT AAA 1147
Glu Asp I le^lu Lys Lys Tyr Pro Pro Gly Lys Arg Va】 Leu Gly Lys
300 305 310
ATT CTC AAG CTT CTC CCC TAC CGA CCT TTC ATT GAA ATT GAA CAG GGC 1195
He Val Lys Leu Leu Pro Tyr Gly Ala Phe He Clu lie Glu Clu Gly
315 320 325
ATT GAA GGT CTA ATT CAC ATT TCT GAA ATG TCT TGC GTG AAA AAT ATT 1243
He Glu Gly Leu He His lie Ser Glu Met Ser Trp Val Lys Asn He
330 335 340
GTA GAT CCT ACT GAA CTC GTA AAT AAA GGC GAT GAA GTT GAA GCC ATT 1291
Val Asp Pro Ser Clu Val Val Asn Lys Gly Asp Glu Val Clu Ala lie
345 350 355
GTT CTA TCT ATT CAG AAG GAC GAA GGA AAA ATT TCT CTA GGA TTA AAG 1339
Val Leu Ser He Gin Lys Asp Glu Gly Lys lie Ser Leu Gly Leu Lys
360 365 370 375
CAA ACA GAA CGT AAT CCT TGG GAC AAT ATC GAA GAA AAA TAT CCT ATA 1387
Gin Thr Glu Arg Asn Pro Trp Asp Asn He Glu Glu Lys Tyr Pro He
380 385 390
GGT CTC CAT GTC AAT GCT GAA ATC AAG AAC TTA ACC AAT TAC GGT GCT 1435
Gly Leu His Val Asn Ala Glu lie Lys Asn Leu Thr Asn Tyr Gly Ala 395 400 405
TTC GTT GAA TTA GAA CCA GGA ATT GAG GGT CTG ATT CAT ATT TCT GAC 1483
Phe Val Glu Leu Glu Pro Gly lie Glu Gly Leu He His He Ser Asp
410 415 420
ATG ACT TGG ATT AAA AAA GTC TCT CAC CCT TCA GAA CTA TTC AAA AAA 1531
Met Ser Trp lie Lys Lys Val Ser His Pro Ser Glu Leu Phe Lys Lys
425 430 435
GGA AAT TCT GTA GAG GCT GTT ATT TTA TCA GTA GAC AAA GAA AGT AAA 1579
Gly Asn Ser Val Glu Ala Val lie Leu Ser Val Asp Lys Glu Ser Lys
440 445 450 455
AAA ATT ACT TTA GGA GTT AAG CAA TTA AGT TCT AAT CCT TGG AAT GAA 1627
Lys lie Thr Leu Gly Val Lys Gin Leu Ser Ser Asn Pro Trp Asn Glu
460 465 470
ATT GAA GCT ATG TTC CCT CCT GGC ACA GTA ATT TCA GGA GTT GTG ACT 1675
He Glu Ala Met Phe Pro Ala Gly Thr Val He Ser Gly Val Val Thr
475 480 485
AAA ATC ACT ¾CA TTT GGA GCC TTT GTT GAG CTA CAA AAC GGG ATT GAA 1723
Lys He Thr Ala Phe Gly Ala Phe Val Glu Leu Gin Asn Gly Me Glu
490 495 500
GGA TTG ATT CAC GTT TCA GAA CTT TCT GAC AAG CCC TTT GCA AAA ATT 1771
Gly Leu He His Val Ser Glu Leu Ser Asp Lys Pro Phe Ala Lys lie
505 510 515 GAA GAT ATT ATC TCC ATT GGA GAA AAT GTT TCT GCA AAA GTA ATT AAG 1919
Glu Asp He He Ser lie Gly Glu Asn Val Ser Ala Lys Val He Lys
520 525 530 535
CTA GAT CCA GAT CAT AAA AAA GTT TCT CTT TCT GTA AAA GAA TAC TTA 1867
Leu Asp Pro Asp His Lys Lys Val Ser Leu Ser Val Lys Glu Tyr Leu
540 545 550
GCT GAC AAT GCT TAT GAT CAA GAC TCT AGG ACT GAA TTA GAT TTC AAG 1915
Ala Asp Asn Ala Tyr Asp Gin Asp Ser Arg Thr Glu Leu Asp Phe Lys
555 560 565
GAT TCT CAA GGC GAA GGG GTT CGA ATT CCG CCG ATA CTG 1954
Asp Ser Gin Gly Glu Gly Val Arg lie Pro Pro lie Leu
570 575 580
E列 S号： 14
配列の長さ ： 160
配列の型： アミノ酸
配列の種類：ぺプチド
配列
Met lie Ser Leu He Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val lie Gly Met
1 5 10 15
Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys
20 25 30
Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val lie Met Gly Arg His Thr Trp Glu
35 40 45
Ser lie Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn lie lie Leu Ser Ser 50 55 60
Gin Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80
Ala Me Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu lie Met Val lie Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Val Tyr Glu Gin Phe Leu Pro Lys Ala Gin Lys Leu Tyr Leu
100 105 110
Thr His lie Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr
115 120 125
Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp
130 135 140
Ala Gin Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu lie Leu Glu Arg Arg He 145 150 155 160
E列番号： 15
E列の長さ ： 649
配列の型： アミノ酸
E列の種類：ぺプチド
£列
Met lie Ser Leu He Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val He Gly Met
1 5 10 15
Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Aia Asp Leu Ala Trp Phe Lys
20 25 30
Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val He Met Gly Arg His Thr Trp Glu
35 40 45
Ser He Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn lie lie Leu Ser Ser
50 55 60
Gin Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 A|o jas J3S sAq Aio J3S "31 BIV BIV ΙΒΛ Ι^Λ 1«Λ «IV "13 Ι^Λ "10
ΟΟδ S6Z 062 sAq w u【j) Bjv Bjv "S "31 "s uig na jas n[3 naq jq丄 jas ι υ
982 08Z Si2
law J3S sXi jas BIV n| D N I 3 31 1 J 3S JM1 « 19 W BIV 81 1 JMI
LZ S9Z 092
B IV J l usv J3S B JV jqi jqi B JV B J V ¾IV M3 J8S Ι ^Λ A|g Jqi dsy
99Z osz s z
BIV AI D BIV sAq uig jas jas J3S nio sAq A[3 B|v ¾IV Ι«Λ
0 Z OCZ 9ZZ uio UJ OJJ BIV -nil nio qi sAq jqi qx ias Jas -"II sAi dsy siq
OZZ 91Z IZ
Ajo J3S B!V ^IO BfV 3(1 J«U BIV dsy jas njg an nja im usy sAq
902 QOZ 961
A[9 u[3 8jy Jill u【3 a[g an «M3 sAq Ji}i n{Q usv Al3 J»S "81 sAq
061 S8T 08T
dsy uig ujo OJJ I«A «13 o』d jas iqx na 【BA ajg jas 13||
9il 01.1 991
a【i usy sA u[g usy dsy OJJ 3 jas jas jas au "s Ian nai
091 991 OS! S ail 8iV 3JV nig na 3| 1 njg aqj nja 丄 "s IH J3S usy uig BJV
OH SSI OSI
dsy Bjv dsy S ; H aqj nig jas aqd 1 ¾A "s nij) dii dsy dsy OJJ n(g
9ZT ΟΖΐ 9Π
JA丄 dsv 0Jd aqj S ! H JiU dsy A13 njo Ι ¾Λ "19 «IV dsy-an S ; H jqi
Oil SOI 001
naq JAi naq sAq UJ Q BJV sAq O j na aqj ajg njg JA丄 I BA 8JV AID
96 06 98
3 ^13 an Ι»Λ 18H ail «19 j (ΒΛ dsy A[9 SA3 B|y BJ V ajj BJ V I0/S6df/XDd . 0 60/96 OM 305 310 315 320
Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro
325 330 335
Arg Ser Glu Val lie Glu He Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala He Gin
340 345 350
Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr
355 360 365
Gin Ala Gin Ala Asp Gin Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gin Ala
370 375 380
lie Lys lie Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala 385 390 395 400
Glu Gin Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr
405 410 415
Val Met He Ala Val Ser Val Ala lie Thr Val lie Ser lie Val Ala
420 425 430
Ala He Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala
435 440 445
Ala Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala
450 455 460
Thr Thr Val Ala Thr Gin lie Thr Val Gin Ala Val Val Gin Ala Val 465 470 475 480
Lys Gin Ala Val lie Thr Ala Val Arg Gin Ala He Thr Ala Ala lie
485 490 495
Lys Ala Ala Val Lys Ser Gly lie Lys Ala Phe lie Lys Thr Leu Val
500 505 510
Lys Ala lie Ala Lys Ala He Ser Lys Gly lie Ser Lys Val Phe Ala
515 520 525
Lys Gly Thr Gin Met He Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val
530 535 540 lie Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val 545 550 555 560
Val Ala Ala Pro Ala Leu Giy Lys Gly He Met Gin Met Gin Leu Ser
565 570 575
Glu Met Gin Gin Asn Val Ala Gin Phe Gin Lys Glu Val Gly Lys Leu
580 585 590
Gin Ala Ala Ala Asp Met lie Ser Met Phe Thr Gin Phe Trp Gin Gin
595 600 605
Ala Ser Lys lie Ala Ser Lys Gin Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr
610 615 620
Gin Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gin lie Leu Lys Ala Tyr Ala Ala 625 630 635 640
He Ser Gly Ala lie Ala Gly Ala Ala
645 649 配列番号： 16
配列の長さ ： 432
配列の型： アミノ酸
配列の種類：ぺプチド
配列
Met lie Ser Leu lie Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val He Gly Met
1 5 10 15
Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys
20 25 30
Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val lie Met Gly Arg His Thr Trp Glu
35 40 45
Ser lie Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn lie lie Leu Ser Ser
50 55 60
Gin Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 002 962 062 sAq law ui D ¾IV ^IV naq jas uio nai jas njg naq 丄 jag njg
582 082 SAZ
]9N J3S sA7 jas 8[v nj3 n\ an J8S J 41 «10 law ejy an sAq JIU
OLZ 99Z 09Z
¾1V Jm usy J3S BIV Jm Jm ¾IV ¾IV BIV ^IO Jas ΙΒΛ ^10 JM1 dsv
S9Z OSZ
B【V Λ[0 BIV sAq u[ J3S no s J3S no sAq AJD B[V BIV I«A 3
Figure imgf000098_0001
uio in;) ojj Bjv JiU iMjj jqi sAq jqj, jq丄 jas J8S Ml SAI dsy sAq
OZZ 513 012
AlO J3S «IV A13 »IV ai I qi «IV dsy jas njg )3|| njg Ji|i asy sAq
902 002 961
AI9 uio 3jy jqi uig u]3 an «19 sA jqi usy A[3 as naq s
061 981 081
dsy uio uio OJJ (ΒΛ AJO OJO o j JIJX as J«U nai JBA «13 J3S 13)1
911 Oil S9T
ail usy sA uo usy dsy o A|Q jas "S jas au Jas layj naq
09Ϊ SSI OQl S^I
311 8jy 8 y no na an ni3 aqd "10 J^j, as s!H jaS usy ujg 8[y
OH 921 οει dsv BIV dsy SfH ai|d jas aq<j \n\ J3S njg d ^ dsy dsy OJJ ntg
9ZI 021 9IT
JAi dsy o j 8Md siH JM1 dsy ^13 njg 【BA no B[y dsy 3(1 s!n JI^
Oil SOI 00†
"31 JAi nai s U[o BJV sA OJJ na aqj UJO nja JAi !BA 8JV Ajj)
96 06 98
^13 AO 3[[ ΙΒΛ law an OJJ I«A dsy Ajg SAQ BJV BJV 3【 【 B[V
08 SZ. OL 99 lOS6dT/IOd 0Z 6Q 6 OM. Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320
Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro
325 330 335
Arg Ser Glu Val lie Glu lie Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala lie Gin
340 345 350
Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr
355 360 365
Gin Ala Gin Ala Asp Gin Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gin Ala
370 375 380
lie Lys lie Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala
385 390 395 400
Glu Gin Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr
405 410 415
Val Met He Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu He Asn
420 425 430 432
E列番号： 17
E列の長さ ： 1947
配列の型：核酸
鑌の数：ニ本鑌
配列の種類：他の核酸 合成 D NA
配列
ATG ATC ACT CTG ATT GCG GCG TTA GCC GTA GAT CGC GTT ATC GGC ATG 48
Met lie Ser Leu lie Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val lie Gly Met
1 5 10 15
GAA AAC GCC ATG CCG TGG AAC CTC CCT GCC GAT CTC GCC TGG TTT AAA 96 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys
20 25 30
CGC AAC ACC TTA AAT AAA CCC GTG ATT ATG GGC CGC CAT ACC TGG GAA 144
Arg Asn Thr iseu Asn Lys Pro Val lie Met Gly Arg His Thr Trp Glu
35 40 45
TCA ATC GGT CGT CCG TTG CCA GGA CGC AAA AAT ATT ATC CTC AGC AGT 192
Ser lie Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn lie lie Leu Ser Ser
50 55 60
CAA CCC GGT ACG GAC GAT CGC CTA ACG TGG GTG AAG TCG GTG GAT GAA 240
Gin Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu
65 70 75 80
GCC ATC GCG GCG TGT GGT GAC GTA CCA GAA ATC ATG GTG ATT GGC GGC 288
Ala lie Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu lie Met Val He Gly Gly
一. 85 90 95
GGT CGC GTT TAT GAA CAG TTC TTG CCA AAA GCG CAA AAA CTC TAT CTG 336
Gly Arg Val Tyr Glu Gin Phe Leu Pro Lys Ala Gin Lys Leu Tyr Leu
100 105 110
ACG CAT ATC GAC GCA GAA GTG GAA GCC GAC ACC CAT TTC CCG GAT TAC 384
Thr His lie Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr
115 120 125
GAG CCG GAT GAC TCG GAA TCG GTA TTC AGC GAA TTC CAC GAT GCT GAT 432
Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140
GCG CAG AAC TCT CAC AGC TAT GAG TTC GAA ATT CTG GAG CGG CGG ATC 480
Ala Gin Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Clu He Leu Glu Arg Arg He
145 150 155 160
CTG ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC 528
Leu Met Ser lie Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gin Lys Asn lie
165 170 175
ATC TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT 576
Met Ser Gin Val Leu Thr Ser Thr Pro Gin Gly Val Pro Gin Gin Asp
180 185 190
AAG CTG TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CCT CAG GGT 624
Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gin lie Gin Gin Thr Arg Gin Cly
195 200 205
AAA AAC ACT GAC ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT CCT TCT GGA 672
Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr lie Ala Gly Ala Ser Gly
210 215 220
AAA CAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG 720
Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gin Gin
225 230 235 240
GGA GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA ACT CAA AAG CCA GGT GCT 768
Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gin Lys Ala Gly Ala
245 250 255 CAT ACT GGA CTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA 816
Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala
260 265 270
ACA AAA ATT-GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA ACT ATG 864
Thr Lys lie Ala Met Gin Thr Ser He Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met
275 280 285
GAG TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA 912
Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gin Ser Leu Ser Ala Ala Gin Met Lys
290 295 300
GAA GTC GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT 960
Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
TCC GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTC ACA CCA 1008
Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro
325 330 335
AGA TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG 1056
Arg Ser Glu Val He Glu lie Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala lie Gin
340 345 350
ACA TTG GGA GAA CCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA 1104
Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr
355 360 365
CAA GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAC CAA GCG 1152 Gin Ala Gin Ala Asp Gin Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gin Ala
370 375 380
ATA AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC 1200
He Lys He Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala
385 390 395 400
GAA CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT CTC AAT ACT 1248
Glu Gin Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr
405 410 415
GTG ATG ATC GCG GTT TCT GTT GCC ATT ACA GTT ATT TCT ATT GTT GCT 1296
Val Met lie Ala Val Ser Val Ala He Thr Val lie Ser lie Val Ala
420 425 430
GCT ATT TTT ACA TGC GGA GCT GGA CTC GCT GGA CTC GCT GCG GGA GCT 1344
Ala lie Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala
435 440 445
GCT GTA GCT GCA GCG GCA GCT GGA GCT GCA GCA GGA GCT GCT GCC GCA 1392
Ala Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala
450 455 460
ACC ACG GTA GCA ACA CAA ATT ACA GTT CAA GCT GTT GTC CAA GCG GTG 1440
Thr Thr Val Ala Thr Gin lie Thr Val Gin Ala Val Val Gin Ala Val
465 470 475 480
AAA CAA GCT GTT ATC ACA GCT GTC AGA CAA GCG ATC ACC GCG GCT ATA 1488 Lys Gin Ala Val lie Thr Ala Val Arg Gin Ala lie Thr Ala Ala lie
485 490 495
AAA GCG GCT GTC AAA TCT GGA ATA AAA GCA TTT ATC AAA ACT TTA GTC 1536
Lys Ala Ala Val Lys Ser Gly lie Lys Ala Phe lie Lys Thr Leu Val
500 505 510
AAA GCG ATT GCC AAA GCC ATT TCT AAA GGA ATC TCT AAG GTT TTC GCT 1584
Lys Ala He Ala Lys Ala lie Ser Lys Gly lie Ser Lys Val Phe Ala
515 520 525
AAG GGA ACT CAA ATG ATT GCG AAG AAC TTC CCC AAG CTC TCG AAA CTC 1632
Lys Gly Thr Gin Met He Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val
530 535 540
ATC TCG TCT CTT ACC ACT AAA TGG GTC ACG GTT GGG GTT GGG GTT GTA 1680 lie Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val
545 550 555 560
GTT GCG GCG CCT CCT CTC GGT AAA GGG ATT ATC CAA ATG CAG CTC TCG 1728
Val Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly lie Met Gin Met Gin Leu Ser
565 570 575
GAG ATG CAA CAA AAC GTC CCT CAA TTT CAG AAA GAA GTC GCA AAA CTG 1776
Glu Met Gin Gin Asn Val Ala Gin Phe Gin Lys Glu Val Gly Lys Leu
580 585 590
CAG CCT GCG GCT GAT ATC ATT TCT ATG TTC ACT CAA TTT TGC CAA CAG 1824
Gin Ala Ala Ala Asp Met 〗le Ser Met Phe Thr Gin Phe Trp Gin Gin 595 600 605
CCA ACT AAA ATT GCC TCA AAA CAA ACA GGC GAG TCT AAT GAA ATG ACT 1872
Ala Ser Lys lie Ala Ser Lys Gin Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr
610 - 615 620
CAA AAA GCT ACC AAG CTG GGC GCT CAA ATC CTT AAA GCG TAT GCC GCA 1920
Gin Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gin lie Leu Lys Ala Tyr Ala Ala
625 630 635 640
ATC ACC GGA GCC ATC GCT CGC GCA GCA 1947 lie Ser Gly Ala lie Ala Gly Ala Ala
645 649 配列番号： 18
配列の長さ ： 1296
配列の型：核酸
鎖の数：二本 tt
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATG ATC ACT CTG ATT GCG GCG TTA GCG GTA GAT CGC GTT ATC GGC ATG 48
Met lie Ser Leu lie Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val He Gly Met
1 5 10 15
GAA AAC GCC ATG CCG TGG AAC CTG CCT GCC GAT CTC GCC TGG TTT AAA 96
Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys
20 25 30
CGC AAC ACC TTA AAT AAA CCC GTG ATT ATG GGC CGC CAT ACC TGG GAA 144 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val lie Met Gly Arg His Thr Trp Glu
35 40 45
TCA ATC GGT CCT CCG TTG CCA GGA CGC AAA AAT ATT ATC CTC AGC ACT 192
Ser lie Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn He lie Leu Ser Ser
50 55 60
CAA CCG GGT ACG GAC GAT CGC GTA ACG TGG CTG AAG TCC GTG CAT GAA 240
Gin Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu
65 70 75 80
GCC ATC GCG GCG TGT GGT GAC GTA CCA GAA ATC ATG GTG ATT GGC GGC 288
Ala lie Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu lie Met Val lie Gly Gly
85 90 95
GGT CGC GTT TAT GAA CAG TTC TTG CCA AAA GCG CAA AAA CTG TAT CTG 336
Gly Arg Val Tyr Glu Gin Phe Leu Pro Lys Ala Gin Lys Leu Tyr Leu
100 105 110
ACG CAT ATC GAC GCA GAA GTG GAA GGC GAC ACC CAT TTC CCG GAT TAC 384
Thr His lie Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr
115 120 125
GAG CCG GAT GAC TGG GAA TCG GTA TTC AGC GAA TTC CAC GAT GCT GAT 432
Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp
130 135 140
GCG CAG AAC TCT CAC AGC TAT GAG TTC GAA ATT CTG GAG CGG CGG ATC 480 Ala Gin Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu lie Leu Glu Arg Ar lie 145 150 155 160
CTG ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC 528
Leu Met Ser He Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gin Lys Asn He
165 170 175
ATG TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG CGC GTG CCC CAA CAA GAT 576
Met Ser Gin Val Leu Thr Ser Thr Pro Gin Gly Val Pro Gin Gin Asp
180 185 190
AAG CTG TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT 624
Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gin He Gin Gin Thr Arg Gin Gly
195 200 205
AAA AAC ACT GAG ATG GAA AGC CAT GCC ACT ATT CCT GGT GCT TCT GGA 672
Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr He Ala Gly Ala Ser Gly
210 215 220
AAA GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG 720
Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gin Gin
225 230 235 240
GGA GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA ACT CAA AAG GCA CGT GCT 768
Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gin Lys Ala Gly Ala
245 250 255
GAT ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA 816
Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala 260 265 270
ACA AAA ATT CCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG 864
Thr Lys lie Ala Met Gin Thr Ser lie Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met
275 280 285
GAG TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA 912
Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gin Ser Leu Ser Ala Ala Gin Met Lys
290 295 300
GAA CTC GAA GCG CTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT 960
Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
TCC CCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA 1008
Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro
325 330 335
AGA TCA GAG GTT ATC GAA ATC CGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG 1056
Arg Ser Glu Val He Glu He Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala He Gin
340 345 350
ACA TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA 1104
Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr
355 360 365
CAA GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG 1152
Gin Ala Gin Ala Asp Gin Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gin Ala
370 375 380 ATA AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC 1200 lie Lys He Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gin Glu Met Lys Ala Ala
385 390 395 400
GAA CAG AATS'TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT 1248
Glu Gin Lys Ser Lys Asp Leu Glu Cly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr
405 410 415
GTC ATG ATC GCG AAG GGG TTC GAA TTG CCA TGG GGG CCC TTA ATT AAT 1296
Val Met lie Ala Lys Cly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu lie Asn
420 425 430 432
配列番号： 19
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
饋の数：一本鎮
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ACCTGTCTGG CAACGAAACG 20
配列番号： 20
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鑌の数：一本饋
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCAGCAACAA CAACCGCTTC 20 E列番号： 21
配列の長さ ： 29
配列の型：核酸
瞜の数 ：一本蛾
E列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GATCCTGATG TCTATTTCAT CTTCTTCAG 29
配列番号： 22
配列の長さ ： 28
配列の型：核酸
«の数：一本鎮
E列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GTCCTGAAGA AGATGAAATA GACATCAG 28
配列番号： 23
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AATTGCCATG GGGGCCCTTA ATTAATTAAC 30 配列番号： 24
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎮の数：一本鑌
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
TCGAGTTAAT TAATTAAGGG CCCCCATGGC 30
配列番号： 25
K列の長さ ： 5438
配列の型：核酸
«の数：二本錶
BB列の種類：他の核酸 プラスミ ド
£列
ATCGATGTTA ACAGATCTAA GCTTAACTAA CTAACTCCCG AAAAGGAGGA ACTTCCATGA 60 TCAGTCTCAT TGCGCCCTTA GCCCTAGATC GCCTTATCGG CATGGAAAAC GCCATGCCCT 120 GGAACCTGCC TGCCGATCTC GCCTGGTTTA AACGCAACAC CTTAAATAAA CCCGTGATTA 180 TGGGCCGCCA TACCTGGGAA TCAATCGGTC GTCCCTTGCC AGGACGCAAA AATATTATCC 240 TCAGCAGTCA ACCGGGTACG GACGATCGCG TAACGTGGGT GAAGTCGGTG GATGAAGCCA 300 TCGCGGCCTG TGGTGACGTA CCAGAAATCA TGGTGATTGG CGGCCGTCGC GTTTATGAAC 360 ACTTCTTGCC AAAAGCGCAA AAACTGTATC TGACGCATAT CGACGCAGAA GTGGAAGGCG 420 ACACCCATTT CCCGGATTAC GAGCCGGATG ACTGGGAATC GGTATTCAGC GAATTCCACG 480
ATGCTGATGC CCAGAACTCT CACAGCTATG AGTTCCAAAT TCTGGAGCGG CGGATCCTGA 540
TCTCTATTTC -ATCTTCTTCA GGACCTGACA ATCAAAAAAA TATCATGTCT CAAGTTCTGA 600
CATCGACACC CCAGGGCGTG CCCCAACAAG ATAAGCTGTC TCGCAACGAA ACGAAGCAAA 660
TACAGCAAAC ACGTCAGGGT AAAAACACTG ACATCGAAAG CGATGCCACT ATTGCTGGTC 720
CTTCTGGAAA AGACAAAACT TCCTCGACTA CAAAAACAGA AACAGCTCCA CAACAGGGAG 780
TTGCTGCTCG CAAAGAATCC TCAGAAAGTC AAAACCCAGG TCCTGATACT GGAGTATCAG 840
GAGCGGCTCC TACTACAGCA TCAAATACTG CAACAAAAAT TGCTATGCAG ACCTCTATTG 900
AAGAGGCGAG CAAAAGTATC GACTCTACCT TACAGTCACT TCAAAGCCTC AGTGCCGCGC 960
AAATGAAAGA AGTCGAAGCG GTTCTTCTTG CTGCCCTCTC AGGGAAAAGT TCGGGTTCCG 1020
CAAAATTGGA AACACCTCAG CTCCCCAAGC CCGGGGTGAC ACCAAGATCA GAGGTTATCG 1080
AAATCGGACT CCCCCTTGCT AAAGCAATTC AGACATTGGG AGAAGCCACA AAATCTGCCT 1140
TATCTAACTA TGCAAGTACA CAAGCACAAG CAGACCAAAC AAATAAACTA GGTCTAGAAA 1200
AGCAAGCCAT AAAAATCCAT AAACAACGAG AAGAATACCA AGAGATGAAG GCTGCCGAAC 1260
AGAACTCTAA AGATCTCGAA GGAACAATGG ATACTGTCAA TACTGTGATG ATCGCGAAGG 1320 CCTTCCAATT CCCATGGGGG CCCTTAATTA ATTAACTCCA GAGATCCAGA TCTAATCGAT 1380
GATCCTCTAC GCCGGACGCA TCGTGGCCGG CATCACCGGC GCCACAGGTG CGGTTGCTGG 1440
CGCCTATATC GCCGACATCA CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG GGCTCATGAG 1500
CGCTTCTTTC GGCCTGGGTA TGGTCCCAGG CCCCTGCCCG GCGCACTCTT CCCCCCCATC 1560
TCCTTGCATG CACCATTCCT TGCGGCGGCG CTGCTCAACG GCCTCAACCT ACTACTGGGC 1620
TGCTTCCTAA TGCAGGAGTC GCATAAGGGA GAGCGTCGAC CGATGCCCTT GAGAGCCTTC 1680
AACCCAGTCA 6CTCCTTCCG GTGGGCGCGG GCCATGACTA TCCTCGCCGC ACTTATGACT 1740
GTCTTCTTTA TCATGCAACT CGTAGGACAG GTGCCGGCAG CGCTCTGGGT CATTTTCGGC 1800
GAGGACCGCT TTCGCTGGAC CGCGACCATC ATCCGCCTGT CGCTTGCGGT ATTCGGAATC 1860
TTGCACGCCC TCGCTCAACC CTTCGTCACT GCTCCCGCCA CCAAACGTTT CGGCGAGAAG 〗920
CAGGCCATTA TCGCCGGCAT GGCGGCCGAC GCCCTGGGCT ACGTCTTGCT GGCGTTCGCG 1980
ACGCGAGGCT GGATGGCCTT CCCCATTATC ATTCTTCTCG CTTCCGGCGG CATCGGGATG 2040
CCCGCGTTGC AGCCCATGCT GTCCAGGCAG GTAGATGACG ACCATCAGGG ACACCTTCAA 2100
GGATCGCTCG CGGCTCTTAC CAGCCTAACT TCGATCACTG GACCGCTGAT CGTCACGGCG 2160 ATTTATGCCC CCTCGCCGAG CACATCGAAC GCCTTGCCAT GCATTGTAGG CGCCGCCCTA 2220
TACCTTGTCT CCCTCCCCGC CTTCCGTCGC GGTGCATGGA GCCGGGCCAC CTCGACCTGA 2280
ATGGAAGCCG GCCCCACCTC GCTAACGGAT TCACCACTCC AAGAATTGGA GCCAATCAAT 2340
TCTTGCGGAG AACTGTGAAT CCCCAAACCA ACCCTTGGCA GAACATATCC ATCGCGTCCG 2400
CCATCTCCAG CAGCCGCACG CCGCCCATCT CGGGCAGCGT TGGGTCCTGG CCACGGGTGC 2460
GCATCATCGT GCTCCTCTCG TTGAGGACCC GGCTAGGCTG GCGCGGTTGC CTTACTGGTT 2520
AGCAGAATGA ATCACCGATA CCCCAGCGAA CGTCAAGCGA CTCCTGCTGC AAAACGTCTG 2580
CGACCTGAGC AACAACATGA ATGGTCTTCG GTTTCCCTGT TTCGTAAAGT CTGGAAACGC 2640
GGAACTCAGC GCCCTCCACC ATTATGTTCC GGATCTGCAT CGCAGGATGC TGCTGGCTAC 2700
CCTGTGGAAC ACCTACATCT GTATTAACGA AGCCCTGGCA TTGACCCTGA GTGATTTTTC 2760
TCTGGTCCCG CCGCATCCAT ACCCCCAGTT GTTTACCCTC ACAACGTTCC AGTAACCGGC 2820
CATGTTCATC ATCAGTAACC CGTATCGTGA GCATCCTCTC TCGTTTCATC GGTATCATTA 2880
CCCCCATGAA CAGAAATTCC CCCTTACACG GAGGCATCAA GTGACCAAAC AGGAAAAAAC 2940
CGCCCTTAAC ATCGCCCGCT TTATCAGAAG CCAGACATTA ACGCTTCTGG AGAAACTCAA 3000
CGAGCTGGAC GCGGATCAAC AGGCAGACAT CTGTGAATCG CTTCACGACC ACGCTGATGA 3060 GCTTTACCGC AGCTGCCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT GAAAACCTCT GACACATGCA 3120
GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC GGGAGCAGAC AAGCCCGTCA 3180
GGGCGCGTCA GCGGGTGTTC GCGGGTCTCG GGGCGCAGCC ATGACCCAGT CACGTAGCGA 3240
TAGCGGAGTG TATACTGGCT TAACTATGCG GCATCACAGC AGATTGTACT GAGAGTGCAC 3300
CATATGCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGCGCTCT 3360
TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCCC TCCGTCCTTC GGCTGCGGCG AGCGCTATCA 3420
GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACCCTTATCC ACAGAATCAG CCCATAACGC ACGAAAGAAC 3480
ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAACCCCACG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT CCTCGCGTTT 3540
TTCCATAGGC TCCCCCCCCC TGACGACCAT CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG 3600
CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC 3660
TCTCCTGTTC CGACCCTCCC CCTTACCGGA TACCTCTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC 3720
GTGCCGCTTT CTCAATGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGT CGTTCGCTCC 3780
AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC 3840
TATCGTCTTG ACTCCAACCC GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT 3900 AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGCTGGCCT 3960
AACTACGGCT ACACTAGAAG GACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC 4020
TTCGGAAAAA *€AGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT 4080
TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAAAAAAAG GATCTCAAGA AGATCCTTTG 4140
ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTCGTC 4200
ATGAGATTAT CAAAAAGGAT CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA 4260
TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATCCTT AATCAGTCAG 4320
CCACCTATCT CACCCATCTC TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT CCCCGTCGTG 4380
TACATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT GATACCGCGA 4440
GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGCCCGAG 4500
CGCAGAACTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA 4560
GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTGCAGGC 4620
ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATC GCTTCATTCA GCTCCGGTTC CCAACGATCA 4680
AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG 4740
ATCCTTGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCACTG TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT 4800 AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC 4860
AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAACACGG 4920
GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA AAAGTGCTCA TCATTGGAAA ACGTTCTTCG 4980
GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG TTGAGATCCA CTTCGATGTA ACCCACTCGT 5040
GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA 5100
GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA AAAGGCAATA AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA 5160
CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTCTCTCAT GACCGGATAC 5220
ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC CGCCCACATT TCCCCGAAAA 5280
GTGCCACCTG ACGTCTAAGA AACCATTATT ATCATGACAT TAACCTATAA AAATAGCCGT 5340
ATCACGAGGC CCTTTCGTCT TCAAGAATTA ATTGTTATCC GCTCACAATT AATTCTTGAC 5400
AATTAGTTAA CTATTTGTTA TAATGTATTC ATAAGCTT 5438
配列番号： 26
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本趙
配列の種類 ：他の核酸 合成 D N A 配列
CCTCCCGAAC AGAAGTCTAA 20
配列番号 ： 27"
配列の長さ ： 20
E列の型：核酸
蛾の数：一本 «Ϊ
E列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CTCGAAGGAA CAATGGATAC 20
配列番号： 28
£列の長さ ： 23
£列の型：核酸
鎮の数：一本鎮
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GTACATATTG TCGTTAGAAC GCG 23
配列番号： 29
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
繽の数：一本鑌
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TAATACGACT CACTATAGGG ACA 2o 配列番号： 30
配列の長さ ： 28
配列の型：垓酸
饋の数 ：一本鎮
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCGGATCCTG ATGTCTATTT CATCTTCT 28
配列番号： 31
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
饑の数：一本鱭
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATCTCGAGTT TTATGCTGCT GCGCCAGCGA 30

Claims

特許 I»求の範囲
1. 配列番号 1のポリぺブチドの中の連铳した少なく とも 5個のァミ ノ酸配列を 含むポリぺプチ ド Aからなる、 クラ ミ ジァ ·ニューモニエの抗原ポリぺプチ ド。
2. ポリぺプチ ド Aが、 配列番号 1のポリぺブチ ドからァミ ノ酸が欠落している ポリぺプチ ドである、 請求項 1記載の抗原ポリぺプチド。
3. ポリぺプチド Aが、 配列番号 1のポリぺブチ ドの中のァミ ノ酸が他のァミ ノ 酸で置換されているか、 又は配列番号 1のボリぺブチドの中にァミ ノ酸が挿入さ れているポリぺブチドである、 請求項 1記載の抗原ポリぺプチ ド。
4. ポリぺプチド Aが、 配列番号 1のポリぺブチドの中の連続した少なく とも 5 βのァミ ノ酸配列にァミ ノ酸若しくはぺプチドが桔合したポリベプチ ドである、 請求項 1記載の抗原ポリぺブチド。
5. ポリぺプチド Αが配列番号 1のァミ ノ酸配列からなるボリべプチ ドである、 »求項 1妃載の抗原ポリぺブチド。
6. ボリべプチド Aが配列番号 2のァミ ノ酸配列からなるボリべプチ ドである、 Λ求項 1記載の抗原ボリぺブチ ド。
7. ポリぺブチド Αが配列番号 5のァミ ノ酸配列からなるポリぺプチドである、 請求項 1記載の抗原ボリぺブチド。
8. »求項 1〜了のいずれかに 載の抗原ボリべプチドをコ一ドする DNA若し くはそれに相補的な D N A。
9. 塩基配列が E列番号 3の塩基配列である、 I»求項 8記載の DNA。
1 0. 塩基配列が配列番号 4の塩基配列である、 蹐求項 8記載の DNA。
1 1. 塩基配列が配列番号 7の塩基配列である、 猜求項 8記載の DNA。
1 2. 請求項 8〜 1 1のいずれかに記載の D N Aを含む組換えべクタ一。
1 3. 組換えベクターが配列番号 1 0の塩基配列を有する P C PN 5 3 3 crブラ スミ ドである、 請求項 1 2記載の組換えベクター。
1 . 請求項 1 2又は請求項 1 3記載の組換えベクターを含む形質転換体。
1 5. 講求項 1〜 7のいずれかに記載の抗原ポリペプチ ドを抗原として用いるこ とを特檄とする、 抗クラ ミ ジァ · ニューモニエ抗体の製造方法。
1 6. »求項 1〜 7のいずれかに紀載の抗原ボリぺプチ ドを抗原として用いるこ とを特微とする、 抗クラ ミ ジァ ·ニューモニエ抗体の検出 ·測定方法。
1 7. 請求項 1〜7のいずれかに記載の抗原ポリべプチ ドを抗原として含有して なる、 抗クラ ミ ジァ ·ニューモニエ抗体の検出 ·測定用試薬。
1 8. 請求項 1〜7のいずれかに圮載の抗原ポリペプチドを有効成分とする、 ク ラ ミ ジァ ·ニューモニエ感染の診断薬。
1 9. 配列番号 1 4のポリぺプチドに、 直接に又は介在ァミ ノ酸配列を介して、 配列番号 1のポリぺプチドの中の連統した少なく とも 5個のァミ ノ酸配列を含む ポリべプチ ド Bが接合した、 ジヒ ドロ葉酸 «元酵素一クラミ ジァ ·ニューモニエ の抗原ポリぺプチド融合夕ンパク質。
2 0. ポリぺプチド Bが、 配列番号 1のポリぺブチドからァミ ノ酸が欠落してい るポリべプチドである、 請求項 1 9記載の »合タンパク »。
2 1. ポリぺプチド Bが、 配列番号 1のポリぺプチドの中のァミノ酸が他のァミ ノ酸で匿換されているか、 又は配列番号 1のポリベプチドの中にァミ ノ酸が挿入 されているポリペプチドである、 請求項 1 9記載の融合タンパク質。
2 2. »合タンパク質が配列番号 1 5のアミノ酸配列からなるポリぺプチドであ る、 »求項 1 9記載の »合タンパク K。
2 3. 敲合夕ンパク質が配列 *号 1 6のアミノ酸配列からなるポリぺプチドであ る、 »求項 1 9Ε載の) »合タンパク質。
2 4. 請求項 1 9〜2 3のいずれかに 載の融合タンパク質をコードする DNA 若しくはそれに相補的な DN Α。
2 5. 塩基配列が配列番号〗 7の塩基配列である、 請求項 2 4記載の DNA。 2 6. 塩基配列が配列番号 1 8の塩基配列である、 ί育求項 2 4記載の DNA。 2 7. 躋求項 2 4〜 2 6のいずれかに記載の D N Aを含む組換えべクター。
2 8. 組換えベクターが P C PN 5 3 3 Tブラスミ ドである請求項 2 7記載の組 換えべクター。
2 9. St求項 2 7又は If求項 2 8記載の組換えベクターを含む形質 換体。
3 0. 請求項 1 9〜 2 3のいずれかに記載の ¾合タンパク質を抗原として用いる ことを特徴とする、 抗クラ ミ ジァ ·ニューモニエ抗体の製造方法。
3 1. 請求項 1 9〜 2 3のいずれかに記載の融合タンパク Kを抗原として用いる ことを特徴とする、 抗クラミ ジァ ·ニューモニエ抗体の検出 ·測定方法。
3 2. «求項 1 9〜 2 3のいずれかに記載の融合タンパク Kを抗原として含有し てなる、 抗クラミ ジァ ·ニューモニエ抗体の検出 ·測定用試薬。
3 3. »求項 1 9〜 2 3のいずれかに記載の融合タンパク質を有効成分とする、 クラミ ジァ ·ニューモニエ感染の診断薬。
3 4. (a ) 配列番号 3の DNAの中の連統した少なく とも 1 0塩基の塩基配列 を有する DNA、
(b) 上記 （a ) の DNAに相補的な DNA、 又は
( c ) 上紀 （a ) 若しくは （b) の DNAと 9 0 %以上の相同性を有する D N A . のいずれかを含有する DNAからなる、 クラミ ジァ ·ニューモニエ遺伝子の検出
•測定用プローブ。
3 5. 塩基 E列が配列番号 1 9の塩基配列である、 請求項 3 4記載のプローブ。
3 6. 塩基配列が配列番号 2 0の塩基配列である、 請求項 3 4 S己載のプローブ。
3 7. 請求項 3 4〜 3 6のいずれかに記載のプローブを用いる、 クラミ ジァ ·二 ユーモニエ遺伝子の検出 ·測定方法。
3 8. 請求項 3 4〜3 6のいずれかに圮載のプローブを含有してなるクラミ ジァ •ニューモニエ遗伝子の梭出 · iW定用 K薬。
3 9. »求項 3 4〜3 6のいずれかに記載のプローブを有効成分とする、 クラミ ジァ ·ニューモニエ感染の珍断薬。
4 0. ( a ) 配列番号 3の D N Aの中の連統した少なく とも 1 0塩基の塩基配列 を有する DN A、
(b) 上記 （ a ) の D N Aに相補的な D N A、 又は
( c ) 上記 （ a ) 若しくは （b) の DNAと 9 0 %以上の相同性を有する D N A . のいずれかを含有する D N Aからなる、 クラミ ジァ 'ニューモニエ遺伝子の検出 •測定用プライマー。
4 1. 塩基配列が配列番号 1 9の塩基配列である、 請求項 4 0記載のブライマー < 4 2. 塩基配列が配列番号 2 0の塩基配列である、 請求項 4 0記載のブライマー, 4 3. 請求項 4 0 ~ 4 2のいずれかに記載のブライマーを用いる、 クラ ミ ジァ ' ニューモニエ遗伝子の検出 ·測定方法。
4 4 . 請求項 4 0〜 4 2のいずれかに記載のプライマーを含有してなるクラ ミ ジ ァ · ニューモニエ遺伝子の検出 ·測定用拭薬。
4 5 . »求項 4 0〜 4 2のいずれかに記載のブライマーを有効成分とする、 クラ ミ ジァ · ニューモニエ感染の診断薬。
要約會
配列番号 1のポリぺプチ ドの中の連統した少なく とも 5個のァミ ノ酸配列を含 むボリペプチ ド Aからなる、 クラミ ジァ 'ニューモニエ （以下 「C. ニューモニ ェ J という） の抗原ポリぺブチ ド、 該ポリペプチ ドをコードする DNA、 該 DN Aを含む組換えベクター、 該組換えベクターを含む形質転換体、 該抗原ポリぺプ チドを抗原として用いることを特微とする抗 C. ニューモニエ抗体の製造方法、 抗 C. ニューモニエ抗体の検出 ·測定方法及び該抗原ポリペプチ ドの用途、 並び に配列番号 1 4のポリぺブチドに、 配列番号 1のポリぺプチドの中の少なく とも 5個のァミ ノ E列を含むポリぺプチド Aが結合した、 ジヒ ドロ ¾酸¾元酵素一 C. ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質、 該融合タンパク質をコー ドする DNA、 該 DNAを含む組換えベクター、 該組換えベクターを含む形 K転 換体、 該融合タンパク質を抗原として用いることを特徴とする抗 C. ニューモニ ェ抗体の製造方法、 該勳合タンパク »を抗原として用いることを特徵とする抗 C. ニューモニエ抗体の検出 ·測定方法、 該合タンパク の用途、 C. ニューモニエ 遺伝子の検出 ·測定用プローブ及びブライマ一、 該プローブ又はブライマーを用 いる C. ニューモニエ遺伝子の検出 ·測定方法及び該プローブ又はブライマーの 用 。
PCT/JP1995/001896 1994-09-20 1995-09-20 Antigenic polypeptide of chlamydia pneumoniae WO1996009320A1 (en)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES95932194T ES2321346T3 (es) 1994-09-20 1995-09-20 Polinucleotidos que codifican un polipeptido antigenico de chlamydia pneumoniae.
AU35329/95A AU685680B2 (en) 1994-09-20 1995-09-20 Antigenic polypeptide of chlamydia pneumoniae
CNB951962779A CN100365017C (zh) 1994-09-20 1995-09-20 肺炎衣原体抗原多肽
DE69535914T DE69535914D1 (de) 1994-09-20 1995-09-20 Polynukleotide die einen antigenes polypeptid aus chlamydia pneumoniae kodieren
EP95932194A EP0784059B1 (en) 1994-09-20 1995-09-20 Polynucleotides encoding an antigenic polypeptide of chlamydia pneumoniae
US08/809,326 US6165478A (en) 1994-09-20 1995-09-20 DNA encoding Chlamydia pneumoniae antigenic polypeptide
US09/689,913 US6489122B1 (en) 1994-09-20 2000-10-12 Method of detecting anti-Chlamydia pneumoniae antibody using Chlamydia pneumoniae-specific antigens
US09/689,916 US6491924B1 (en) 1994-09-20 2000-10-12 Chlamydia pneumoniae antigenic polypeptide

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP22471194 1994-09-20
JP6/224711 1994-09-20
JP7/106006 1995-04-28
JP7/106011 1995-04-28
JP7/106008 1995-04-28
JP10601095 1995-04-28
JP10600695 1995-04-28
JP7/106009 1995-04-28
JP10600895 1995-04-28
JP10600995 1995-04-28
JP7/106010 1995-04-28
JP10601195 1995-04-28

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09/689,914 Division US6485914B1 (en) 1994-09-20 2000-10-12 Method of detecting chlamydia pneumoniae gene using polynucleotides
US09/689,916 Division US6491924B1 (en) 1994-09-20 2000-10-12 Chlamydia pneumoniae antigenic polypeptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1996009320A1 true WO1996009320A1 (en) 1996-03-28

Family

ID=27552239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1995/001896 WO1996009320A1 (en) 1994-09-20 1995-09-20 Antigenic polypeptide of chlamydia pneumoniae

Country Status (7)

Country Link
US (4) US6165478A (ja)
EP (2) EP2045261A1 (ja)
CN (1) CN100365017C (ja)
AU (1) AU685680B2 (ja)
DE (1) DE69535914D1 (ja)
ES (1) ES2321346T3 (ja)
WO (1) WO1996009320A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7132512B2 (en) 1999-02-05 2006-11-07 Neutec Pharma Plc Medicament for the treatment of chlamydial infection

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE323164T1 (de) 1997-06-23 2006-04-15 Loke Diagnostics Aps Oberfläche-exponierte proteine von chlamydia pneumoniae
DE69841894D1 (de) 1997-11-21 2010-10-21 Merck Serono Biodevelopment Sa Äusseres Membranpolypeptid von Chlamydia pneumoniae sowie Fragmente davon und deren Verwendung, insbesondere zur Diagnose, Prävention und Behandlung einer Infektion
BR9814878A (pt) * 1997-11-21 2000-10-03 Genset Sa Sequência genÈmica e polipeptìdeos de chlamydia pneumoniae, fragmentos dos mesmos e usos dos mesmos, em particular para o diagnóstico, a prevenção e o tratamento de infecção
US20030147924A1 (en) * 1998-07-27 2003-08-07 Aventis Pasteur Limited/Aventis Pasteur Limitee Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
WO2000006739A2 (en) * 1998-07-27 2000-02-10 Connaught Laboratories Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
EP1100919A1 (en) * 1998-07-27 2001-05-23 Aventis Pasteur Limited $i(CHLAMYDIA) ANTIGENS AND CORRESPONDING DNA FRAGMENTS AND USES THEREOF
US20040014943A1 (en) * 1998-07-31 2004-01-22 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Antibodies for detecting microorganisms
CA2341637A1 (en) * 1998-08-20 2000-03-02 Connaught Laboratories Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
US6649370B1 (en) * 1998-10-28 2003-11-18 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US6403102B1 (en) * 1998-10-29 2002-06-11 Connaught Laboratories Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
JP2002531093A (ja) 1998-12-01 2002-09-24 アベンティス、パストゥール、リミテッド クラミジア抗原および対応するｄｎａ断片ならびにその使用
US20020061848A1 (en) 2000-07-20 2002-05-23 Ajay Bhatia Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6447779B1 (en) 1998-12-08 2002-09-10 Corixa Corporation Compounds for the diagnosis of Chlamydial infection
US6555115B1 (en) 1998-12-08 2003-04-29 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
WO2000034483A2 (en) * 1998-12-08 2000-06-15 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6565856B1 (en) 1998-12-08 2003-05-20 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6448234B1 (en) 1998-12-08 2002-09-10 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6432916B1 (en) 1998-12-08 2002-08-13 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
JP2003512017A (ja) 1998-12-23 2003-04-02 アベンティス、パストゥール、リミテッド クラミジア抗原および対応するｄｎａ断片ならびにその使用
US7297341B1 (en) 1998-12-23 2007-11-20 Sanofi Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
WO2000066739A2 (en) * 1999-05-03 2000-11-09 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
DE60133190T2 (de) 2000-04-21 2009-04-02 CORIXA CORP., Wilmington Verbindungen und verfahren zur behandlung und diagnose von chlamydia-infektionen
US6919187B2 (en) 2000-04-21 2005-07-19 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
WO2002078847A1 (fr) * 2001-03-28 2002-10-10 Hitachi, Ltd. Instrument et procede permettant de recuperer de l'acide nucleique
EP1531860A4 (en) * 2001-06-05 2005-11-02 Us Gov Health & Human Serv PEPTIDES FOR THE DIAGNOSIS OF CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE AND THE VACCINE AGAINST CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE
WO2004073492A2 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Chlamydia pneumoniae associated chronic intraocular disorders and treatment thereof
CA2612900C (en) * 2005-06-23 2016-08-09 Claus Aagaard Improved tuberculosis vaccines
DE102006003814A1 (de) * 2006-01-26 2007-08-02 Sirs-Lab Gmbh Verfahren zur in-vitro-Diagnose von Chlamydophila pneumoniae Infektionen
CA2864521A1 (en) * 2012-03-30 2013-10-03 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method for determining severity of pneumococcal pneumonia
CN107312797B (zh) * 2017-07-28 2021-06-18 广州中科蓝华生物科技有限公司 一种蛋白调控系统及其制备方法和应用
CN117305261B (zh) * 2023-11-30 2024-02-23 北京智源人工智能研究院 一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04297871A (ja) * 1990-05-08 1992-10-21 Hitachi Chem Co Ltd クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤
JPH05317097A (ja) * 1992-05-21 1993-12-03 Fuso Yakuhin Kogyo Kk クラミジアの検出法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3789597T3 (de) 1986-05-01 2006-10-26 Washington Research Foundation, Seattle Nachweis eines mit atmungskrankheiten verbundenen einzelstammes von chlamydia.
US5281518A (en) * 1986-05-01 1994-01-25 Washington Research Foundation Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease
US5085986A (en) * 1989-06-14 1992-02-04 Eastman Kodak Company Diagnostic test kit and method for determination of chlamydial antigen using a membrane having surface hydroxy groups
JPH04117284A (ja) * 1990-05-15 1992-04-17 Agency Of Ind Science & Technol ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質
US5374718A (en) * 1992-08-26 1994-12-20 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to chlamydia pneumoniae

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04297871A (ja) * 1990-05-08 1992-10-21 Hitachi Chem Co Ltd クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤
JPH05317097A (ja) * 1992-05-21 1993-12-03 Fuso Yakuhin Kogyo Kk クラミジアの検出法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INFECTION AND IMMUNITY, Dec. 1991, Vol. 59, No. 12, KIKUTA L.C. et al., "Isolation and Sequence Analysis of the Chlamydia Pneumoniae GroE Operon", pages 4665-4669. *
INFECTION AND IMMUNITY, Feb. 1991, Vol. 59, No. 2, KORNAK J.M. et al., "Sequence Analysis of the Gene Encoding the Chlamydia Pneumoniae DnaK Protein Homolog", pages 721-725. *
INFECTION AND IMMUNITY, Jun. 1991, Vol. 59, No. 6, MELGOSA M.P. et al., "Sequence Analysis of the Major Outer Membrane Protein Gene of Chlamydia Pneumoniae", pages 2195-2199. *
See also references of EP0784059A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7132512B2 (en) 1999-02-05 2006-11-07 Neutec Pharma Plc Medicament for the treatment of chlamydial infection

Also Published As

Publication number Publication date
CN100365017C (zh) 2008-01-30
DE69535914D1 (de) 2009-03-26
EP0784059B1 (en) 2009-02-11
EP0784059A1 (en) 1997-07-16
US6165478A (en) 2000-12-26
ES2321346T3 (es) 2009-06-04
CN1163619A (zh) 1997-10-29
AU3532995A (en) 1996-04-09
EP2045261A1 (en) 2009-04-08
US6489122B1 (en) 2002-12-03
US6491924B1 (en) 2002-12-10
EP0784059A4 (en) 1999-11-17
US6485914B1 (en) 2002-11-26
AU685680B2 (en) 1998-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1996009320A1 (en) Antigenic polypeptide of chlamydia pneumoniae
Goebel et al. Cloning and functional characterization of the plasmid-encoded hemolysin determinant of Escherichia coli
Vazquez-Boland et al. Nucleotide sequence of the lecithinase operon of Listeria monocytogenes and possible role of lecithinase in cell-to-cell spread
US5928900A (en) Bacterial exported proteins and acellular vaccines based thereon
JP3878207B2 (ja) ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド
JP2007289194A (ja) 空胞形成毒素欠損Ｈ．ｐｙｌｏｒｉおよび関連する方法
Langford et al. Cloning and molecular characterization of Cu, Zn superoxide dismutase from Actinobacillus pleuropneumoniae
US6436409B1 (en) Polynucleotide functionally coding for the LHP protein from Mycobacterium tuberculosis, its biologically active derivative fragments, as well as methods using the same
CN110117621A (zh) 一种碱基编辑器及其制备方法和应用
KR100603552B1 (ko) 포피로모나스 긴기발리스 폴리펩티드 및 뉴클레오티드
Myllykallio et al. Cytochrome c (y) of Rhodobacter capsulatus is attached to the cytoplasmic membrane by an uncleaved signal sequence-like anchor
US6156322A (en) Polynucleotides and polypeptides in pathogenic mycobacteria and their use as diagnostics, vaccines and targets for chemotherapy
CZ285116B6 (cs) Imunogenní polypeptid
WO1995025738A1 (en) Recombinase-deficient helicobacter pylori and related methods
US20040110269A1 (en) Protection against mycobacterial infections
KR100810699B1 (ko) 항원 유전자 서열의 동정 방법
Kaul et al. Cloning, expression, and primary structure of a Chlamydia trachomatis binding protein
KR101488110B1 (ko) 나노아케움 이퀴탄스 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 제조 및 이를 이용한 hot-start PCR 응용
CN111991550B (zh) Hip-55在制备用于诊断和防治心肌缺血再灌注损伤产品中的应用
US20040076976A1 (en) Aopb gene, protein,homologs, fragments and variants thereof, and their use for cell surface display
Arvidson et al. Neisseria gonorrhoeae mutants altered in toxicity to human fallopian tubes and molecular characterization of the genetic locus involved
JPH09501308A (ja) 接触仲介性溶血素のレギュレーター
JP3692599B2 (ja) 抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法及びその試薬並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬
JPH099974A (ja) クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド、それをコードするｄｎａ、そのｄｎａを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法
JPH099976A (ja) ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、それをコードするｄｎａ、そのｄｎａを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 95196277.9

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CN US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08809326

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1995932194

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1995932194

Country of ref document: EP