JPH099974A

JPH099974A - クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド、それをコードするｄｎａ、そのｄｎａを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法

Info

Publication number: JPH099974A
Application number: JP7242095A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Izutsu; 浩井筒; Akira Matsumoto; 明松本
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co Ltd
Priority date: 1994-09-20
Filing date: 1995-09-20
Publication date: 1997-01-14
Anticipated expiration: 2015-09-20
Also published as: JP3814844B2; JP2005230015A

Abstract

(57)【要約】【課題】クラミジア・トラコマチスやクラミジア・シ
ッタシ等のクラミジア・ニューモニエ以外のクラミジア
属細菌に対する抗体に反応せず、クラミジア・ニューモ
ニエ特異的抗体とのみ反応し、これを検出するための抗
原ポリペプチド及びクラミジア・ニューモニエ、クラミ
ジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ等のクラミ
ジア属細菌に共通に反応する抗体を検出するための抗原
ポリペプチドを提供する。【解決手段】配列番号１のポリペプチドの中の連続し
た少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＡ
からなる、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチ
ド、この抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくは
それに相補的なＤＮＡ、このＤＮＡを含む組換えベクタ
ー、この組換えベクターを含む形質転換体及び前記抗原
ポリペプチドを抗原として用いることを特徴とする、抗
クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、クラミジア・ニュ
ーモニエ感染症の診断に有用なクラミジア・ニューモニ
エの抗原ポリペプチド、それをコードするＤＮＡ、その
ＤＮＡを含む組換えベクター、その組換えベクターを含
む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の
製造方法に関する。本発明は医薬品工業、特にクラミジ
ア・ニューモニエ感染症の診断薬の製造において有効に
利用される。

【０００２】

【従来の技術】クラミジア属の細菌は、クラミジア・ト
ラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニュ
ーモニエ等の種（Species）が知られている。クラミジ
ア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽
腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を
引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オ
ウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニ
エは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。

【０００３】クラミジア・ニューモニエの引き起こす呼
吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエや
インフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と
類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのた
め、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発
が望まれていた。

【０００４】感染症の診断は、通常、感染部位等におけ
る原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中におけ
る（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的に
なされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、
いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエ
の基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られ
ている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、クラミジア・
ニューモニエの基本小体は、クラミジア・ニューモニエ
以外のクラミジア属細菌、すなわち、クラミジア・トラ
コマチス又はクラミジア・シッタシにも共通に存在する
抗原を含むため、この基本小体を用いる方法ではクラミ
ジア・ニューモニエに対する抗体だけでなく、他の種の
クラミジアに対する抗体とも反応し、特異性に欠ける難
点があった。本発明は、クラミジア・トラコマチスやク
ラミジア・シッタシ等のクラミジア・ニューモニエ以外
のクラミジア属細菌に対する抗体に反応せず、クラミジ
ア・ニューモニエ特異的抗体とのみ反応し、これを検出
するための抗原ポリペプチドを提供することを目的とす
る。更には、本発明はクラミジア・ニューモニエ、クラ
ミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ等のクラ
ミジア属細菌に共通に反応する抗体を検出するための抗
原ポリペプチドを提供することも目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、クラミジ
ア・ニューモニエ特異的抗原ポリペプチド又はクラミジ
ア属細菌特異的（すなわち、クラミジア・ニューモニ
エ、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ
等のクラミジア属細菌共通の抗原ポリペプチド）を純粋
に、かつアミノ酸配列が解明された形で取得するため、
先ず、クラミジア・ニューモニエを宿主細胞中に培養
し、そのクラミジア・ニューモニエからゲノムＤＮＡを
抽出し、制限酵素で部分分解し、これをλgt11ＤＮＡに
挿入してゲノムＤＮＡライブラリーを作成し、これを大
腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、クラミジア・ニュー
モニエ特異的モノクローナル抗体又はクラミジア属細菌
特異的モノクローナル抗体を用いてクラミジア・ニュー
モニエの抗原ポリペプチドを発現する感染大腸菌のコロ
ニーをスクリーニングし、陽性の感染大腸菌からλファ
ージを抽出し、この操作を繰り返してλファージを精製
し、これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させて増幅さ
せた後そのＤＮＡの塩基配列を分析し、これをポリペプ
チドに翻訳して、抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を決
定し、本発明を完成した。

【０００７】本発明は、下記（１）〜（１５）に関する
ものである。（１）配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なく
とも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＡからな
る、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド。（２）ポリペプチドＡが、配列番号１のポリペプチドか
らアミノ酸が欠落しているポリペプチドである、上記
（１）記載の抗原ポリペプチド。（３）ポリペプチドＡが、配列番号１のポリペプチドの
中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか又は配
列番号１のポリペプチドの中にアミノ酸が挿入されてい
るポリペプチドである、上記（１）記載の抗原ポリペプ
チド。（４）ポリペプチドＡが、配列番号１のポリペプチドの
中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列にアミノ酸
若しくはペプチドが結合したポリペプチドである、上記
（１）記載の抗原ポリペプチド。（５）ポリペプチドＡが配列番号１のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（１）記載の抗原ポリペ
プチド。（６）ポリペプチドＡが配列番号２のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（１）記載の抗原ポリペ
プチド。（７）ポリペプチドＡが配列番号５のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（１）記載の抗原ポリペ
プチド。（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ若しくはそれに相補的なＤ
ＮＡ。（９）塩基配列が配列番号３の塩基配列である、上記
（８）記載のＤＮＡ。（１０）塩基配列が配列番号４の塩基配列である、上記
（８）記載のＤＮＡ。（１１）塩基配列が配列番号７の塩基配列である、上記
（８）記載のＤＮＡ。（１２）上記（８）〜（１１）のいずれかに記載のＤＮ
Ａを含む組換えベクター。（１３）組換えベクターが配列番号１０の塩基配列を有
するｐＣＰＮ５３３αプラスミドである、上記（１２）
記載の組換えベクター。（１４）上記（１２）又は上記（１３）記載の組換えベ
クターを含む形質転換体。（１５）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の抗原ポ
リペプチドを抗原として用いることを特徴とする、抗ク
ラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法。

【０００８】また、本発明は、下記（１６）〜（２２）
に関するものでもある。（１６）(a) 配列番号５のポリペプチド； (b) 配列番号５のポリペプチド中のアミノ酸の１又は２
以上に欠落のあるポリペプチド； (c) 配列番号５のポリペプチド中のアミノ酸の１又は２
以上が他のアミノ酸で置換されたポリペプチド；及び (d) 上記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドに他のアミ
ノ酸もしくはペプチドが結合してなる融合ポリペプチ
ド、からなる群から選ばれるクラミジア・ニューモニエ
の抗原ポリペプチド。

【０００９】（１７）(a) 配列番号６のポリペプチド； (b) 配列番号６のポリペプチド中のアミノ酸の１又は２
以上に欠落のあるポリペプチド； (c) 配列番号６のポリペプチド中のアミノ酸の１又は２
以上が他のアミノ酸で置換されたポリペプチド；及び (d) 上記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドに他のアミ
ノ酸もしくはペプチドが結合してなる融合ポリペプチ
ド、からなる群から選ばれるクラミジア・ニューモニエの抗
原ポリペプチド。

【００１０】（１８）上記（１６）のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ、又はそれに相補的なＤＮＡ。（１９）上記（１７）のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、又はそれに相補的なＤＮＡ。（２０）上記（１６）のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａが配列番号７である、上記（１８）のＤＮＡ。（２１）上記（１７）のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａが配列番号８である、上記（１９）のＤＮＡ。（２２）上記（１８）〜（２１）のいずれかのＤＮＡを
含む、組換えベクター。

【００１１】なお、本明細書において、塩基の数が１の
デオキシヌクレオチドはモノデオキシヌクレオチドとい
い、塩基の数が２以上のデオキシヌクレオチドは、特に
断らない限り、ＤＮＡと総称した。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。１．抗原ポリペプチド本発明の抗原ポリペプチドは、ペプチドが抗原性を有す
る最小の大きさの観点から、配列番号１のポリペプチド
の中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポ
リペプチド（以下「ポリペプチドＡ」という）からなる
ものである。アミノ酸配列が長いほうが高感度の抗原抗
体反応を期待できることから、ポリペプチドＡとして
は、望ましくは２０個以上、より望ましくは１００個以
上、さらに望ましくは２５０個以上のアミノ酸からなる
ものがよい。また、クラミジア・ニューモニエとしての
抗原性を有していれば、ポリペプチドＡとしては、配列
番号１のポリペプチドからアミノ酸（例えば１〜２５０
個）が欠落しているものであってもよい。欠落するアミ
ノ酸の個数が多すぎると、ポリペプチドＡのクラミジア
・ニューモニエとしての抗原性が損なわれる傾向があ
る。

【００１３】欠落するアミノ酸の個数が多い場合（例え
ば５個以上）、クラミジア・ニューモニエのとしての抗
原性を保つ上から、ポリペプチドＡは、アミノ酸が連続
して（例えば５個以上）欠落しているものであることが
好ましい。また、クラミジア・ニューモニエとしての抗
原性を有していれば、ポリペプチドＡとしては、配列番
号１のポリペプチドの中のアミノ酸（例えば１〜１００
個）が他のアミノ酸で置換されているものであってもよ
いし、あるいは、配列番号１のポリペプチドの中にアミ
ノ酸（例えば１〜１００個）が挿入されているものであ
ってもよい。置換又は挿入されるアミノ酸の数が多すぎ
ると、ポリペプチドＡのクラミジア・ニューモニエとし
ての抗原性が損なわれる傾向がある。置換又は挿入され
るアミノ酸の個数が多い場合（例えば５個以上）、クラ
ミジア・ニューモニエとしての抗原性を保つ上から、ポ
リペプチドＡは、アミノ酸が連続して（例えば５個以
上）置換又は挿入されているものであることが好まし
い。置換されるアミノ酸は類似の性質を有するものが好
ましく、例えば、グリシンとアラニンの置換がある。

【００１４】また、クラミジア・ニューモニエとしての
抗原性を有していれば、ポリペプチドＡとしては、配列
番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個の
アミノ酸配列に、直接又は介在アミノ酸配列を介して、
アミノ酸若しくはペプチドが結合したポリペプチドであ
ってもよい。このようなペプチドは、クラミジア・ニュ
ーモニエのとしての抗原性を保つ上から、１０００個以
下のアミノ酸配列からなるものが好ましく、５００個以
下のアミノ酸配列からなるものがより好ましく、２００
個以下のアミノ酸配列からなるものがさらに好ましい。
このようなアミノ酸若しくはペプチドとしては、例え
ば、ロイシン、ロイシン−メチオニン、ジヒドロ葉酸還
元酵素（ＤＨＦＲ）、β−ガラクトシダーゼ等がある。
介在アミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、ロイ
シン、ロイシン−メチオニンのアミノ酸配列等がある。
ポリペプチドＡの具体例としては、例えば、配列番号
１、配列番号２及び配列番号５のポリペプチドがある。

【００１５】配列番号１のポリペプチドからアミノ酸１
〜２５０個が欠落しているポリペプチドとしては、例え
ば、配列番号５のポリペプチドがある。本発明の配列番
号１のポリペプチドは、配列表に示すとおり、４８８個
のアミノ酸残基から成る抗原ポリペプチドである。本発
明の配列番号２のポリペプチドは、配列表に示すとお
り、２７１個のアミノ酸残基から成る抗原ポリペプチド
である。本発明の配列番号５のポリペプチドは、配列表
に示すとおり、２５９個のアミノ酸残基から成る抗原ポ
リペプチドである。本発明に係る配列番号６のポリペプ
チドは、配列表に示すとおり、５７１個のアミノ酸残基
から成る抗原ポリペプチドである。上記抗原ポリペプチ
ドの中では、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａの
抗原ポリペプチド全体を含む配列番号１のポリペプチド
が望ましい。

【００１６】２．抗原ポリペプチドの製造方法本発明の抗原ポリペプチドを製造する方法としては、化
学合成法や遺伝子組換え法がある。化学合成法として
は、例えば、マップ（Multiple Antigen Peptide、ＭＡ
Ｐ）法があり、３０個以下のアミノ酸配列からなるペプ
チドの合成に適しており、市販のペプチド合成機を使用
して合成することができる。遺伝子組換え法としては、
例えば、本発明の抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ
をベクターに挿入して組換えベクターを構築し、それを
宿主に挿入して形質転換体を作製し、その形質転換体か
ら目的のペプチドを精製する方法がある。本発明の抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡについては後述する。
ベクターとしては、例えば、プラスミドやファージ等が
ある。宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母等
がある。以下、形質転換体の作製法と、その形質転換体
を用いた目的のペプチドの精製法について詳しく説明す
る。

【００１７】抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを含
む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の
作製スクリーニングで取得したλファージ自体（後述）も本
発明のＤＮＡを含む組換えベクターであるが、クラミジ
ア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ
（後述）を常法で既存のプラスミドベクターやファージ
ベクター等に挿入して、新たに組換えベクターを作製す
ることもできる。その際、必要に応じ、リンカーを使用
する。既存のプラスミドベクターとしては、例えばｐＢ
Ｒ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＢＫ１０ＭＭ
等を使用することができる。ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９は市販されており、また、ｐＢＢＫ１０
ＭＭについては特開平４−１１７２８４号公報に詳細に
記載されており、ｐＢＢＫ１０ＭＭを含む大腸菌は受託
番号ＦＥＲＭＢＰ−２３９４として工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている。また、ファージベ
クターとしてはλgt11ファージ、λgt10ファージ等が利
用できる。いずれも、用いた親ベクターに対応する組換
えベクターが得られる。本発明のＤＮＡを含む組換えベ
クターとしては、後述するようにｐＣＰＮ５３３αプラ
スミド、５３−３Ｓλファージ等がある。得られた組換
えベクターを宿主に入れ、形質転換体を作製する。大腸
菌由来のプラスミドやλファージを使用する場合は宿主
としては大腸菌を使用することができ、例えば大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を使用することができる。この宿主をコンピ
テントセルとなるように処理をする。大腸菌ＨＢ１０１
株を処理して得たコンピテントセルは宝酒造から販売さ
れている。上記連結の反応物を宿主に入れ、形質転換体
を作製する方法は文献″モレキュラー・クローニング″
（後述）に記載されている。

【００１８】得られた形質転換体を培養してコロニーを
形成させ、各コロニーからプラスミドＤＮＡを取得し、
適切な制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分
析し、所望の組換えプラスミドをもつ形質転換体を選択
する。このようにして作製されたプラスミドベクターと
しては、例えばｐＣＰＮ５３３αプラスミドがある。こ
のようにして作製された形質転換体をとしては、前述の
組換えベクターｐＣＰＮ５３３αが入った大腸菌ＨＢ１
０１株がある。形質転換体の培養は、その形質転換体が
成長しうる培地でこの抗原ポリペプチドが形質転換体内
に十分蓄積されるまで適温で培養器を振とうする。形質
転換体として前述の組換えベクターｐＣＰＮ５３３αが
入った大腸菌ＨＢ１０１株を使用する場合は、アンピシ
リンを含むＬＢ培地で３７℃で一晩振とう培養し、その
後、この培養液をアンピシリンを含むＴＢ培地等に接種
してさらに３７℃で一晩振とう培養する。ＴＢ培地の調
製方法は、文献″モレキュラー・クローニング″（後
述）に記載されている。

【００１９】培養した形質転換体を破砕する場合には、
遠心分離で形質転換体を集め、緩衝液に懸濁し、これに
超音波を照射する。形質転換体が大腸菌の場合は、上記
懸濁液にリゾチームを加え、ＳＤＳを含む緩衝液を加え
ることよって菌体を溶菌させてもよい。一方、目的のポ
リペプチドが分泌性のものである場合は、培養液を遠心
分離して上清を取得する。形質転換体を破砕又は溶解す
る後、遠心分離して細胞残渣を除去し、上清を取得す
る。上記のいずれかの上清にストレプトマイシン硫酸塩
を添加し、しばらく撹拌し、遠心分離することによっ
て、核酸を沈殿物として除去し、上清を取得する。この
上清を硫安沈殿させ、遠心分離する。通常、沈殿を取得
するが、目的のペプチドが上清に含まれていることもあ
り、サンプリングして、目的のペプチドの有無を確認し
ておく。上記沈殿を少量の緩衝液に溶解したものか又は
上記上清を液体クロマトグラフィーによって分画し、各
画分に含まれる蛋白質について、前述のクラミジア・ニ
ューモニエ特異的モノクローナル抗体を用い、ウェスタ
ン・ブロット法行い、抗原ポリペプチドを含む画分を取
得する。細胞膜等の残渣の除去、ストレプトマイシン硫
酸塩を添加するＤＮＡの除去、硫酸アンモニウムを添加
する蛋白質の取得、及びウェスタン・ブロット法の具体
的方法は、文献″モレキュラー・クローニング″（後
述）に記載されている。

【００２０】３．抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ本発明において、配列番号１のポリペプチドをコードす
るＤＮＡとは、配列番号１のポリペプチドをトリプレッ
ト暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通りの
ヌクレオチド配列が割り当てられている）に従ってアミ
ノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群
（この中には、配列番号３のＤＮＡも含まれる）から選
ばれるＤＮＡのことである。抗原ポリペプチドをコード
するＤＮＡとは、ポリペプチドＡをコードするＤＮＡで
あり、このＤＮＡは、ポリペプチドＡのアミノ酸配列を
トリプレット暗号表に従ってアミノ酸をヌクレオチド配
列に読み替えたときのＤＮＡ群から選ばれるＤＮＡのこ
とである。ポリペプチドＡとしては、前記抗原ポリペプ
チドの項で説明したものが挙げられ、ポリペプチドＡを
コードするＤＮＡも、それらのポリペプチドのアミノ酸
配列に対応したヌクレオチド配列のものがある。同様
に、本発明において、配列番号２のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡとは、配列番号２のポリペプチドをトリプ
レット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通
りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に従って
アミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ
群（この中には、配列番号４のＤＮＡも含まれる）から
選ばれるＤＮＡのことである。また、配列番号５のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡとは、配列番号５のポリペ
プチドをトリプレット暗号表に従ってアミノ酸をヌクレ
オチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群（この中には、
配列番号７のＤＮＡも含まれる）から選ばれるＤＮＡの
ことである。また、配列番号６のポリペプチドをコード
するＤＮＡとは、配列番号６のポリペプチドをトリプレ
ット暗号表に従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み
替えたときのＤＮＡ群（この中には、配列番号８のＤＮ
Ａも含まれる）から選ばれるＤＮＡのことである。

【００２１】ポリペプチドＡをコードするＤＮＡは、化
学合成法か遺伝子組換え法で作製することができる。化
学合成法としては、例えば、ホスホアミダイド法があ
り、全長が１００塩基以下の塩基配列からなるＤＮＡの
合成に適しており、市販のＤＮＡ合成機で化学合成する
ことができる。遺伝子組換え法としては、例えば、後述
するようにクラミジア・ニューモニエの基本小体からＤ
ＮＡをクローニングする方法や、既に取得したＤＮＡを
鋳型にし、そのＤＮＡの任意の位置の塩基配列を元にし
て作製したプライマーを利用したＰＣＲ法等がある。遺
伝子組換え法は、１００塩基以上の長いＤＮＡの作製も
可能である。次に、クラミジア・ニューモニエの基本小
体から抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニ
ング方法について詳しく説明する。

【００２２】クラミジア・ニューモニエの培養培養したＨＬ細胞等から細胞浮遊液を調製し、培養上清
を除去した後にクラミジア・ニューモニエの浮遊液を添
加してこれを培養し、遠心分離してクラミジア・ニュー
モニエ感染ＨＬ細胞を取得する。クラミジア・ニューモ
ニエとしては、例えばクラミジア・ニューモニエＹＫ４
１株(金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジー、3
7巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et al., Microbio
l. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))が使用でき
る。

【００２３】クラミジア・ニューモニエの基本小体の精
製クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリン
グ社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離する。予備実験で黄色味がかった白いバンドの
中にクラミジア・ニューモニエの基本小体が含有されて
いることを電子顕微鏡で確認しているので、このバンド
を回収する。

【００２４】クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡ
の調製クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（pH８．０）（以下、ＴＥ緩衝液とい
う。）に懸濁し、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）水溶液及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液を加え
て保温し、基本小体を溶解させる。０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノールを加えて撹拌し、
遠心分離し、水層を回収する。さらにＲＮＡ分解酵素
（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、
クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡを取得する。

【００２５】ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及びＡｌ
ｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化Ｄ
ＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデ
ノシン−５′−三リン酸（adenosine 5′-triphosphat
e、以下、ＡＴＰと略す。）及びＴ４リガーゼを添加し
て、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。これを、
０．１ＭＮａＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０
００（Chroma spin 6000）カラムにかけ、溶出液を分取
し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回
収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリ
ン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′
端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。このＤＮＡ
断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておいたλgt
11ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガーゼを加えて反応させ、
市販のパッケージングキットを用い、得られた組換えλ
gt11ＤＮＡをパッケージングし、ゲノムＤＮＡ発現ライ
ブラリーを作製する。

【００２６】抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡのク
ローニング大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発
現ライブラリーを感染させ、寒天培地上で培養し、イソ
プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶
液に浸漬したニトロセルロースフィルターを利用して、
挿入ＤＮＡの発現により菌体内に産生されたタンパク質
をニトロセルロースフィルターに付着させる。このフィ
ルターを牛血清アルブミンを用いてブロッキング反応さ
せ、洗浄し、次いでフィルターをクラミジア・ニューモ
ニエ特異的モノクローナル抗体と反応させる。クラミジ
ア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体としては、
例えば、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８やＳＣＰ５３を使用することが
できる。ＡＹ６Ｅ２Ｅ８を産生するハイブリドーマは工
業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５１５４として寄託されている。また、ＳＣＰ５
３を産生するハイブリドーマについてはジャーナル・オ
ブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、132巻、583-588
頁(1994)（J. Clin. Microbiol.,Vol.132, p.583-588,
1994）に記載されている。反応後、フィルターを洗浄
し、パーオキシダーゼ等の酵素で標識された抗マウスＩ
ｇＧ抗体を反応させる。反応後、フィルターを洗浄し、
発色基質液を添加して反応させる。発色基質液として
は、例えば、過酸化水素水溶液及び４−クロロ−１−ナ
フトールのメタノール溶液を含む液を利用することがで
きる。反応後、フィルターを洗浄し、風乾させる。

【００２７】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファ
ージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗
体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、クラ
ミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体反応性
のクラミジア・ニューモニエ特異的抗原ポリペプチドを
発現するλファージを取得する。

【００２８】クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの取得取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染さ
せ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキッ
トを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。こ
のＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Taq Poly
merase）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、
冷却、保温の工程を繰り返し、λgt11に挿入されたＤＮ
Ａを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt11
・フォワード・プライマー（λgt11 forward primer）
及びλgt11・リバース・プライマー（λgt11 reverse p
rimer）（いずれも宝酒造株式会社製）があり、タック
ポリメラーゼとしては、例えば、アンプリタック・ＤＮ
Ａ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA Polymerase）があ
る。このＤＮＡ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法として
知られており、詳細は「サムブロック他編集、モレキュ
ラー・クローニング第２版（コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー）(1989年)」（J.Samblook et a
l., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press （1989）、以下、本文献を文献″モ
レキュラー・クローニング″という）に記載されてい
る。

【００２９】増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決
定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用す
ることができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキ
ット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製品)
を使用することができる。また、塩基配列を決定はタッ
クポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクル
シークエンス法で行うことができ、この方法を用いるに
は、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売されてい
るキットを使用することができる。また、分析にあたっ
ては市販の機械、例えば３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ
（アプライドバイオシステムズ社）を利用することがで
きる。

【００３０】塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミ
ノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトと
しては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニ
アリング社）を用いることができる。解析の結果、完全
長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されて
いるＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによっ
て取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造
(株)から販売されているキットを使用することができ
る。

【００３１】４．抗原ポリペプチドを抗原として用いる
抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法抗クラミジア・ニューモニエ抗体を製造するには、本発
明の抗原ポリペプチドを抗原としてマウスを免疫し、そ
のひ臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマ
を作製し、その中からクラミジア・ニューモニエの５３
ＫＤａの抗原ポリペプチドを認識するハイブリドーマを
選択し、これを培養することによって得ることができ
る。骨髄腫細胞株としては、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．
６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０）やＰ３／ＮＳＩ
／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣＴＩＢ−１８）を使用す
ることができる。抗原として本発明の抗原ポリペプチド
を使用すること以外は、マウスを免疫して抗体を得る公
知の一般的手法に従い、抗クラミジア・ニューモニエ抗
体を製造する。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。

【００３３】以下の実施例において、使用したモノクロ
ーナル抗体は、ＳＣＰ５３、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８及び７０で
ある。ＳＣＰ５３及び７０は、本発明者の一人の松本等
がクラミジア・ニューモニエＫＫｐｎ−１株を抗原とし
て、マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマ細胞と
融合させて得られたハイブリドーマＳＣＰ５３及びハイ
ブリドーマ７０が分泌する抗体であり、また、ＡＹ６Ｅ
２Ｅ８は、本発明者の一人の井筒等が、クラミジア・ニ
ューモニエＹＫ−４１株の基本小体を抗原として、マウ
スを免疫し、その脾臓細胞をミエローマと細胞融合させ
て得られたハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が分泌する抗
体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８である。表１に示されるように、モノ
クローナル抗体のＳＣＰ５３及びAY6E2E8は C.ニューモ
ニエに特異的であり、モノクローナル抗体の７０はクラ
ミジア属細菌に特異的である。モノクローナル抗体の作
製方法については後述する。

【００３４】

【表１】以下、クラミジア・ニューモニエの宿主細胞の培養か
ら、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドの遺
伝子ＤＮＡ配列／アミノ酸配列の決定まで、順を追って
説明する。

【００３５】実施例１クラミジア・ニューモニエ特異
的５３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製（Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm²）の底面
いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液（以下、ＰＢＳという。）マグネシウム不含（−）液
５mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰ
ＢＳを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を
捨てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）
牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピ
ペッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を
調製した。

【００３６】７５cm²のプラスチック製培養フラスコで
培養するときは、培養フラスコに上記細胞浮遊液１ml及
び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培
地１５〜２０mlを加え、また、６ウェルプラスチック製
培養容器で培養するときは、上記細胞浮遊液８mlと１０
％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混
合液４mlずつを各ウェルに加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガ
ス雰囲気下で培養した。

【００３７】（Ｂ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４
１の培養６ウェルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖した
ＨＬ細胞の培養上清をピペットで取り除き、これにクラ
ミジア・ニューモニエＹＫ４１株（金本ら：Microbiol.
Immunol.,Vol.37,P.495-498,1993）の浮遊液〔クラミジ
ア・ニューモニエＹＫ４１保存液を、１リットルあたり
庶糖７５ｇ、リン酸一カリウム０．５２ｇ、リン酸二カ
リウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを含む水
溶液（以下、ＳＰＧという。）で１２ないし２４倍に希
釈し、超音波で１分間処理し、２，０００rpmで３分間
遠心分離した上清〕を１ウェルあたり２ml加えて、２，
０００rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着後、ク
ラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/mlシクロ
ヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダル
ベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％（ｖ／
ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養した。培養
後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞を回収し
た。これを８，０００rpmで３０分間遠心分離して、沈
殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した。

【００３８】（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４１
の基本小体の精製 −７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホモ
ジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１０
分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧに
懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の操
作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。

【００３９】別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含
む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）、次い
で、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０
％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のＳＰＧを加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分離
した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧに懸濁した。遠心分離
管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）と
０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％か
ら５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密度
勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００rp
mで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ４１の基本小体に相当する黄色味を帯びた白濁したバ
ンドを回収し、これをＳＰＧで２倍に希釈し、１０００
０rpmで３０分間遠心分離した。得られた沈殿をＳＰＧ
に懸濁し、タンパク質濃度を測定（バイオラッド社のタ
ンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標準とし
た）後、−７０℃で保存した。

【００４０】（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株のゲノムＤＮＡの調製上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本
小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７mg
/ml）を４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。
沈殿に１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液pH８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを
加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３
００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３
０μｌ及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを
加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を
溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操
作はもう一度繰り返した。１０mg/mlのＲＮａｓｅ溶液
を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮ
Ａを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアル
コールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、Ｐ
ＣＩという。）３００μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返し
た。

【００４１】得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸
アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分
間放置し、ＤＮＡを析出させたのち、４℃、１２，００
０rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール
水溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００
rpmで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈
管のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥さ
せ、これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に
保存した。

【００４２】（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作
製ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用M-buffer１
０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及び１
／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混
合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。な
お、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋ
ｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予
め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液に
ＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく
混ぜ、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水
層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μ
ｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分
間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、
沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混
ぜ、再び、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。上
清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。

【００４３】得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌ
に溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示す
リンカー（２０pmole/μl）１４μｌ、１０ｍＭＡＴ
Ｐ４．５μｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール及び５００μg/ml牛血清アルブミン含有
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍
濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製
水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時
間反応させ、リンカーを付加させた。

【化１】

【００４４】リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、
０．１ＭＮａＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラ
ムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を
０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐ
から７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得ら
れた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭＡ
ＴＰ２０μｌ、０．１ＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、
以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という。）２０
μｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加
え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端を
リン酸化した。ＰＣＩ２００μｌを加えてよく振り混
ぜた後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、
水層を回収した。２０mg/mlグリコーゲン水溶液１μ
ｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール
４００μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、
１２，０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を捨て、
沈殿に７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠
心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを
加え溶かした。

【００４５】この液０．６μｌに、予め制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断したλgt11 ＤＮＡ（１μg/μl、ストラタジ
ーン（Stratagene）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲーシ
ョン用緩衝液０．５μl、１０ｍＭＡＴＰ０．５μｌ、
Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、４℃
で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Gigapack）II
Goldパッケージングキット（ストラタジーン社）を用
い、得られた組換えλgt11ＤＮＡをパッケージングし
た。

【００４６】（Ｆ）クラミジア・ニューモニエ特異的モ
ノクローナル抗体の作製骨髄腫細胞株の培養及び継代モノクローナル抗体の作製に用いた骨髄腫細胞株は、Ｐ
３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣＴＩＢ−１
８）である。１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で培養し、継代した。細胞融合に供する
２週間前に、０．１３ｍＭの８−アザグアニン、０．５
μg/mlのＭＣ−２１０（マイコプラズマ除去剤、大日本
製薬(株)製）及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地で１週間培養し、その後の１週間は
通常の培地で培養した。

【００４７】マウスの免疫タンパク質の濃度が２７０μg/mlの上記基本小体の懸濁
液２００μｌを、１２０００rpmで１０分間遠心分離
し、沈殿に２００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁した。こ
れに２００μｌのフロイントコンプリートアジュバント
を加え、エマルジョンとし、その１５０μｌをマウスの
背中の皮下に注射した（この日を０日目とする）。１４
日目、３４日目及び４９日目に、タンパク質の濃度が２
７０μg/mlの精製基本小体の懸濁液１００μｌをマウス
の腹腔内に注射した。更に、６９日目にタンパク質の濃
度が８００μg/mlの精製基本小体の懸濁液５０μｌ、９
２日目に同懸濁液１００μｌをマウスの腹腔内に注射
し、９５日目に脾臓を取りだし、細胞融合に供した。

【００４８】細胞融合免疫したマウスの脾臓から得られた脾細胞１０⁸個に対
して骨髄腫細胞１０⁷個を丸底ガラスチューブにとり、
よく混合し、１４００rpmで５分間遠心分離し、上清を
除去した後、細胞を更によく混合した。予め３７℃に保
温しておいた３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール
を含むＲＰＭＩ１６４０培地０．４mlを加え、３０秒間
放置した。７００rpmで６分間遠心分離した後、ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地１０mlを加え、ポリエチレングリコール
がよく混ざるようにガラスチューブをゆっくり回転さ
せ、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を完全に
除去し、沈殿に５mlのＨＡＴ培地を加え、５分間放置し
た。更に１０〜２０mlのＨＡＴ培地を加え、３０分間放
置した後、骨髄腫細胞濃度が３．３×１０⁵/mlとなるよ
うにＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁させ、パスツールピ
ペットを用い９６ウェルプラスチック製培養容器のウェ
ルに２滴ずつ分注した。５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気
下、３６℃で培養し、１日後、７日後及び１４日後にウ
ェルにＨＡＴ培地を１〜２滴加えた。

【００４９】抗体生産細胞のスクリーニング精製したクラミジアニューモニエＹＫ４１の基本小体を
１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで可溶化し、０．０２％アジ化ソ
ーダ含有０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（pH９．６）に
対して透析したのち、タンパク質濃度が１〜１０μg/ml
となるように希釈した液を、塩化ビニル製９６ウェルＥ
ＩＡ用プレートのウェルに５０μｌとり、４℃で一晩放
置し、抗原を吸着させた。上澄みを除去し、ウェルに
０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳ１５０
μｌを加え、３分間放置し、その後除去・洗浄した。洗
浄操作を更に１回行なった後、ウェルに１％（ｖ／ｖ）
牛血清アルブミンを含むＰＢＳ１００μｌを加え、４℃
で一晩以上放置し、ブロッキングを行なった。牛血清ア
ルブミンを含むＰＢＳを除いた後、０．０２％（ｗ／
ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に２回洗浄後、ウ
ェルに融合細胞の培養上清を５０μｌ加え、室温で２時
間放置した。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含む
ＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルに２５ng/mlのペル
オキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を５０μｌ
加え、室温で２時間放置した。０．０２％（ｗ／ｖ）ツ
ィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルに
ＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を５０μｌ加え、室温で１
５分〜１時間放置して発色反応させた後、９６ウエルＥ
ＩＡプレート用光度計で４０５nmの吸光度を測定した。
この結果、陽性のウエルが見出され、その培養上清中に
は基本小体と反応する抗体が含まれていることが分かっ
た。このウェル中の細胞をそれぞれパスツールピペット
で回収し、２４ウェルプラスチック製培養容器に移し、
ＨＡＴ培地１〜２ｍｌを加え、同様に培養した。

【００５０】限界希釈法によるクローニング２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた融合細
胞の細胞濃度を測定し、細胞数が２０個／mlとなるよう
それぞれをＨＴ培地で希釈した。別にＨＴ培地に懸濁し
た４〜６週齢のマウス胸腺細胞を９６ウェルプラスチッ
ク製培養容器に２×１０⁵個／ウェルとり、これに上記
の融合細胞（細胞濃度が２０個／ml）を５０μｌ／ウェ
ルずつ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃
で培養し、その１日後、７日後及び１４日後にＨＴ培地
を１〜２滴／ウェル加えた。細胞の増殖が見られたウェ
ルの培養上清を５０μｌ回収し、上記と同様の方法で抗
体の生産を確認した。ウェル中に単一の細胞コロニーし
か存在せず、基本小体と反応する抗体を生産するもの
で、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き続き
２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた。更
に、同様のクローニング操作を繰り返し、最終的にハイ
ブリドーマ、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８を得た。

【００５１】モノクローナル抗体の生産ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８を、１０％（ｖ／ｖ）牛
胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地２０mlを入れた７５
cm²プラスチック製細胞培養用フラスコで増殖させ、３
〜４日ごとにその培養液から１６〜１８mlを抜き取り、
代わりに新鮮な１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地を総量で２０mlとなるように補い、継代
培養を続けた。抜き取って回収した細胞培養液は、１２
００rpmで５分間遠心分離し、上清（モノクローナル抗
体含有培養上清）を回収した。また、予め２週間前にプ
リスタン０．５mlを腹腔内に注射しておいたＢａｌｂ／
ｃマウスのその腹腔内に、１〜５×１０⁶個／mlとなる
ようＰＢＳで懸濁したハイブリドーマ株を１ml注射し
た。３週間後、ｂａｌｂ／ｃマウスの腹水を回収し、１
２００rpmで５分間遠心分離し、上清（モノクローナル
抗体含有腹水）を回収した。

【００５２】モノクローナル抗体の精製ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が生産するモノクロー
ナル抗体は以下のようにして精製した。ハイブリドーマ
ＡＹ６Ｅ２Ｅ８をマウス腹腔内に注射して得られたモ
ノクローナル抗体含有腹水１容に３容のＰＢＳを加えて
混合し、３０００rpmで１０分間遠心分離し、その上清
をポアサイズ０．２２μｍのフィルタで濾過後、これを
クロマトップスーパープロテインＡカラム（径４．６mm
×１００mm、日本ガイシ(株)製）を用いるＨＰＬＣで精
製した。カラムは予め、ＰＢＳで平衡化しておいた。
０．２２μｍフィルタで濾過後のサンプル１ｍｌをカラ
ムに注入後、ＰＢＳを１ml/minで３分間流し、次いで、
５ml/minで４分間流してカラムを洗浄した後、精製水１
ＬにＮａＣｌ８．７７ｇ、クエン酸（一水和物）１
６．７ｇ及びＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ１４．７２ｇを
溶かした液を２ml/minで５分間流してモノクローナル抗
体を溶出した。モノクローナル抗体の溶出画分を集め、
ＴＴＢＳ溶液で希釈した。クラミジア・ニューモニエの
基本小体を溶解し、基本小体に含有されているペプチド
を取得した。このペプチドと上記モノクローナル抗体を
用いてウェスタンブロットを行い、取得したモノクロー
ナル抗体の特異性を確認した。その結果、取得したモノ
クローナル抗体はクラミジア・ニューモニエ５３ＫＤａ
抗原ポリペプチドを認識することがわかった。ハイブリ
ドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８と同様にして、ハイブリドーマ
ＳＣＰ５３及びハイブリドーマ７０を取得した。上記の
方法と同様にしてハイブリドーマＳＣＰ５３及びハイブ
リドーマ７０が産生するモノクローナル抗体の特異性を
調べた結果、これらのモノクローナル抗体は、それぞ
れ、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペ
プチド及び７３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認識すること
がわかった。また、上記の方法と同様にしてハイブリド
ーマＳＣＰ５３及びハイブリドーマ７０が産生するモノ
クローナル抗体のサブクラスを調べた結果、これらの抗
体のサブクラスは、それぞれ、ＩｇＧ₁及びＩｇＧであ
った。

【００５３】（Ｇ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａのクローニング大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭＭｇＳ
Ｏ₄３ml、０．２％マルトース及び５０μg/mlアンピシ
リン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ５ｇ、ポリペプ
トン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、
３７℃で一晩振とう培養したのち、これを２，０００rp
mで１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ
ＭｇＳＯ₄水溶液９mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液
の０．３５mlを採り、これにλgt11（ＤＮＡライブラリ
ー）懸濁液を０．１〜１０μｌ加え、３７℃で２０分間
インキューベートし、大腸菌にλgt11を感染させた。予
め４７℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５mlに、上記
λgt11感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ寒天培地上
に撒いた。上層寒天培地が固化した後、４２℃で３〜４
時間培養し、プラークが観察された時点で１０ｍＭＩ
ＰＴＧ水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルター
（φ８２mm）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で１２時間
培養した。黒インクをつけた注射針で非対称に３ヵ所突
き刺してフィルターに目印をつけた後、フィルターを寒
天培地からとり出し、１５０ｍＭＮａＣｌ及び０．１
％ツィーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH
７．５）（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗浄し
た。寒天培地は冷蔵庫中に保存した。

【００５４】フィルターを１５０ｍＭＮａＣｌ含有２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH７．５）（以下、ＴＢＳ
緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸
し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行っ
た。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄し
たのち、５〜１０μg/mlのクラミジア・ニューモニエ特
異的モノクローナル抗体（ＳＣＰ５３又はAY6E2E8）の
ＴＴＢＳ溶液に浸し、３７℃、１時間振とうした。フィ
ルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシ
ダーゼ標識の（５０ng/ml）抗マウスＩｇＧ抗体溶液
（ＴＴＢＳ緩衝液）中、３７℃で１時間振とうした。フ
ィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で
３回洗浄した後、発色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００mlに
３０％過酸化水素水溶液６０μｌと０．３％４−クロ
ロ−１−ナフトールのメタノール溶液２０mlを加えて調
製）に浸漬し、室温で約３０分間放置した。十分発色し
た時点でフィルターをとり出し、精製水で洗浄し、風乾
した。

【００５５】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパ
スツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回
収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ
ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラ
チン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）（以
下、ＳＭ緩衝液という）中に採り、４℃で一晩放置しプ
ラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記
モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操
作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを
クローン化した。このようにして、クラミジア・ニュー
モニエ特異的モノクローナル抗体反応性のクラミジア・
ニューモニエ特異的抗原ポリペプチドを発現するλファ
ージが得られ、これを５３−３Ｓλファージと命名し
た。

【００５６】（Ｈ）５３−３Ｓλファージの培養とＤＮ
Ａ精製前記（Ｇ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成さ
せ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液
に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ
培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μ
ｌに、λファージ液５〜１０μｌを加え、３７℃で２０
分間放置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３
７℃に温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬ
Ｂ培地５０mlに接種し、λファージによる大腸菌の溶菌
が起こるまで３７℃で５〜７時間振とう培養した。２５
０μｌのクロロホルムを加え、３，０００rpmで１０分
間遠心分離し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁液
を得た。λファージＤＮＡは、Wizard λ preps キット
（プロメガ社）を用いて精製した。

【００５７】（Ｉ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの増幅６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μ
ｌ、１０倍濃度反応用緩衝液（５００ｍＭＫＣｌ、
１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチンを含むトリ
ス−塩酸緩衝液pH８．３）１０μｌ、２０ｍＭｄＮＴ
Ｐ１μｌ、５３−３ＳλファージＤＮＡ溶液０．１μ
ｌ、２０ｎＭ λgt11 forward primer（宝酒造株式会
社）１μｌ、２０ｎＭ λgt11 reverse primer（宝酒
造株式会社）１μｌ、AmpliTaq DNA Polymerase ０．５
μｌを入れ、ミネラルオイルを２〜３滴重層した。９４
℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７３℃ ２分のサイクル
のインキュベーションを３０回繰返し、ＤＮＡを増幅し
た。反応後、１．２％低温融解アガロースゲル電気泳
動を行い、増幅されたＤＮＡを切り出して WizardPCR P
rep キット（プロメガ社）で精製した。

【００５８】（Ｊ）ＤＮＡ塩基配列分析ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型
として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミ
ネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行
い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオ
システムズ社）で分析を行った。得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフ
トウェアエンジニアリング社）を用いて、編集、連結、
アミノ酸翻訳領域の推定を行ない、配列番号９の配列を
得た。配列番号９の配列の解析結果から、５３ＫＤａ抗
原ポリペプチドについて、そのＮ末端からＣ末端に向け
て約６０％のアミノ酸配列が解明されたことが分かっ
た。上記クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドを
コードするＤＮＡは、クラミジア・ニューモニエに特異
的で、かつ、５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認識するモ
ノクローナル抗体を利用してクローニングされたので、
このＤＮＡは、明らかに５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを
コードしている。配列番号９の塩基配列及びアミノ酸配
列の相同性検索をＧｅｎＢａｎｋデータベースで行なっ
た結果、高い相同性を示す既知の配列は無かった。

【００５９】実施例２クラミジア・ニューモニエの抗
原ポリペプチドの一部を含むポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形
質転換体の作製前述したように、取得したＤＮＡが５３ＫＤａ抗原ポリ
ペプチドをコードしていることが明らかであるが、念の
ため、下記のようにして、取得したＤＮＡを発現させ、
上記抗体と反応するか否か調べた。プラスミドｐＢＢＫ
１０ＭＭを制限酵素BamHIとXhoIで切断し、１．２％低
温融解アガロースゲル電気泳動を行い、約４．６Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を切り出して精製した。このＤＮＡ断片10
0ngに、配列番号１１及び配列番号１２の合成ＤＮＡ各
１ngを添加し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）
を用いてこれらのＤＮＡを連結した。この反応物を大腸
菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造）に入れ、形
質転換体を作製し、プラスミドを取得し、これをｐＡＤ
Ａ４３１と名付けた。このプラスミドを制限酵素MunIで
切断した後、アルカリホスファターゼ処理し５′リン酸
基を除去した。一方、５３−３ＳλファージＤＮＡを制
限酵素EcoRIで切断し、このＤＮＡ断片５０ngに、上記
の制限酵素ＭｕｎＩで切断したｐＡＤＡ４３１プラスミ
ドＤＮＡ１００ngを添加し、同様に連結し、形質転換体
を作製し、５３−３ＳλファージＤＮＡの制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ断片が組み込まれたプラスミドを取得し、これを
ｐＣＰＮ５３３αと名付けた。このプラスミドは、配列
番号１０の塩基配列を有する約５．７ｋｂｐのＤＮＡで
あり、５３Ｋ抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチ
ドを宿主大腸菌で発現させることができるものである。
この５３Ｋ抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチド
をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号４のようにな
っており、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は
を配列番号２のようになっていた。プラスミドｐＣＰＮ
５３３αをもつ大腸菌を同様に培養し、電気泳動、ニト
ロセルロース膜への転写、モノクローナル抗体での検出
を同様に行った結果、上記ポリペプチドに相当する発色
したバンドが観察され、プラスミドｐＣＰＮ５３３αを
もつ大腸菌が、クラミジア・ニューモニエに特異的に反
応するモノクローナル抗体と反応することができる５３
Ｋ抗原ポリペプチドを発現していることが示された。

【００６０】実施例３クラミジア・ニューモニエの５
３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡの取
得配列番号９の塩基配列を元に、配列番号１４及び１５の
塩基配列を有するＤＮＡを、ＤＮＡ合成機を用いて合成
した。実施例１で得たクラミジア・ニューモニエＹＫ４
１株のゲノムＤＮＡの水溶液１０μｌ（ＤＮＡ含有量：
約１μｇ）に、１０倍濃縮Ｋバッファ５μｌ、精製水３
５μｌ及び制限酵素ＨｉｎｄIII（１９Ｕ／μｌ）５μ
ｌを添加し、３７℃で３時間保温した。得られた反応液
をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、遠心分離
して沈殿を取得した。この沈殿に、ＰＣＲ in vitro Cl
oning Kit(宝酒造(株)製品名)中のＨｉｎｄIIIカセット
ＤＮＡ（２０ng/μl）５μｌ、ライゲーション溶液１５
μｌを添加し、１６℃で３０分間保温した。取得した反
応液をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、遠心
分離して沈殿を取得し、これを１０μｌの精製水に溶解
した。得られた溶液１μｌに、精製水７８．５μｌ、１
０倍濃縮ＰＣＲ用バッファ１０μｌ、２．５ｍＭｄＮＴ
Ｐ８μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ（５Ｕ／μ
ｌ）を添加し、さらに、プライマーＤＮＡとして、配列
番号１４の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１
μｌ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡ（２０
pmol/μl）（上記キットにおいて、プライマーＣ１とし
て同封されていたもの）１μｌを添加して、これらを
０．６ｍｌのマイクロチューブに入れ、ミネラルオイル
２滴を重層し、９４℃３０秒、５５℃２分、７２℃３分
の温度サイクルを３０回繰り返した。以上の工程をＰＣ
Ｒ工程という。ＰＣＲ工程後の反応液１μｌに、プライ
マーＤＮＡとして、配列番号１５の塩基配列を有するＤ
ＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号１７の塩基配
列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）（上記キットにおい
て、プライマーＣ２として同封されていたもの）１μｌ
を用い、再度ＰＣＲ工程を行った。２番目のＰＣＲ工程
後の反応液を１．２％低融点アガロースゲル電気泳動さ
せ、約１．４ｋｂｐの大きさのＤＮＡが含有されている
アガロースゲルを切り出した。ＤＮＡの精製には Wizar
d PCR Prep キット（プロメガ社）を用いた。即ち、切
り出したアガロースゲルにキットに同封されている緩衝
液を添加し、加熱してアガロースゲルを溶解し、キット
に同封されている精製用樹脂を添加してＤＮＡを樹脂に
吸着させ、遠心分離して精製用樹脂を沈殿として取得し
た。沈殿をプロパノールで洗浄し、再度遠心分離して沈
殿を取得した。沈殿に精製水を添加し、精製用樹脂から
ＤＮＡを溶出して、遠心分離し、上清（ＤＮＡ水溶液）
を得た。以上の工程をＤＮＡ精製工程という。取得した
ＤＮＡ水溶液を用い、含まれるＤＮＡを鋳型とするTaq
DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイク
ルシークエンス法でシークエンス反応を行い、３７３Ａ
型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ
社）でそのＤＮＡの塩基配列を分析した。得られたＤＮ
Ａ塩基配列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」
（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を用いて、編
集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行なった。以上の
工程を塩基配列解析工程という。取得したＤＮＡの塩基
配列を解析した結果、このＤＮＡは実施例１で取得した
クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドをコード
するＤＮＡの中の３′末端側の約５０ｂｐの塩基配列を
有していた。さらに、その塩基配列の下流には、終始コ
ドンを含有する約０．７ｋｂのコード領域が存在してい
ることがわかった。配列番号９の塩基配列を元に、ク
ラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドのをコード
するＤＮＡの上流部分に相当するプライマーとして、配
列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを、また、上記の
約０．７ｋｂのコード領域を含む塩基配列を元に、クラ
ミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドのをコードす
るＤＮＡの下流部分に相当するプライマーとして、配列
番号１９の塩基配列を有するＤＮＡを、それぞれ、ＤＮ
Ａ合成機を用いて合成した。実施例１で得たクラミジア
・ニューモニエＹＫ４１株のゲノムＤＮＡの水溶液１μ
ｌを用い、プライマーＤＮＡとして配列番号１８の塩基
配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番
号１９の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μ
ｌを用いてＰＣＲ工程を行った。３番目のＰＣＲ工程後
の反応液を用い、上記ＤＮＡ精製工程を行い、約１．５
ｋｂｐのＤＮＡを取得した。取得したＤＮＡ水溶液を用
い、上記塩基配列解析工程を行った。取得したＤＮＡの
塩基配列を解析した結果、このＤＮＡは配列番号４の塩
基配列を有しており、配列番号１のアミノ酸配列をコー
ドしていることがわかった。またプラスミドｐＣＰＮ５
３３αと前述のλgt11のＤＮＡライブラリーを用いてゲ
ノムウォーキングを行い、クラミジア・ニューモニエの
５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡを
取得した。

【００６１】実施例４クラミジア・ニューモニエの５
３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡを含
む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の
作製クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチ
ド全体をコードするＤＮＡを用い、実施例２と同様にし
てクラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプ
チド全体をコードするＤＮＡを含む組換えベクターとそ
れを含む形質転換体を作製する。

【００６２】実施例５クラミジア・ニューモニエの７
３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製モノクローナル抗体ＳＣＰ５３又はＡＹ６Ｅ２Ｅ８の代
わりに、モノクローナル抗体７０を使用し、実施例１と
同様の手順で操作した。クローン７０−２Ｓλファージ
が得られ、これから配列番号１３の配列が得られた。配
列番号１３の配列の解析結果から、クラミジア・ニュー
モニエの７３Ｋ抗原タンパク質については、そのＮ末端
からＣ末端に向けて約９０％のアミノ酸配列が解明され
たことが分かった。配列番号１３の塩基配列及びアミノ
酸配列の相同性検索をＧｅｎＢａｎｋデータベースで行
なった結果、これはクラミジア・トラコマチスから単離
された遺伝子塩基配列（L.M.Sardinia et al:J. Bacter
iol., Vol.171, 335-341(1989)）と高い相同性を示すも
のであった。

【００６３】実施例６クラミジア・ニューモニエの抗
原ポリペプチドを抗原として用いる、抗クラミジア・ニ
ューモニエ抗体の製造（Ａ）骨髄腫細胞株の培養及び継代骨髄腫細胞株はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１５８０）を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、継代する。細胞融合
に供する２週間前に、０．１３ｍＭの８−アザグアニ
ン、０．５μg/mlのＭＣ−２１０（マイコプラズマ除去
剤、大日本製薬(株)製）及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血
清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養し、その後
の１週間は通常の培地で培養する。

【００６４】（Ｂ）マウスの免疫タンパク質の濃度が２７０μg/mlの上記抗原ポリペプチ
ドの懸濁液２００μｌを、１２０００rpmで１０分間遠
心分離し、沈殿に２００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁す
る。これに２００μｌのフロイントコンプリートアジュ
バントを加え、エマルジョンとし、その１５０μｌをマ
ウスの背中の皮下に注射する（この日を０日目とす
る）。１４日目、３４日目及び４９日目に、タンパク質
の濃度が２７０μg/mlの上記抗原ポリペプチドの懸濁液
１００μｌをマウスの腹腔内に注射し、更に、６９日目
にタンパク質の濃度が８００μg/mlの上記抗原ポリペプ
チドの懸濁液５０μｌ、９２日目に同懸濁液１００μｌ
をマウスの腹腔内に注射し、９５日目に脾臓を取り出
し、細胞融合に供する。

【００６５】（Ｃ）細胞融合上記脾臓から得られる脾細胞１０⁸個に対して骨髄腫細
胞１０⁷個を丸底ガラスチューブにとり、よく混合し、
１４００rpmで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞
を更によく混合する。予め３７℃に保温してある３０％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含むＲＰＭＩ１６
４０培地０．４mlを加え、３０秒間放置する。７００rp
mで６分間遠心分離した後、ＲＰＭＩ１６４０培地１０m
lを加え、ポリエチレングリコールがよく混ざるように
ガラスチューブをゆっくり回転させ、１４００rpmで５
分間遠心分離し、上清を完全に除去し、沈殿に５mlのＨ
ＡＴ培地を加え、５分間放置する。更に１０〜２０mlの
ＨＡＴ培地を加え、３０分間放置し、骨髄腫細胞濃度が
３．３×１０⁵/mlとなるようにＨＡＴ培地を加えて細胞
を懸濁させ、パスツールピペットを用い９６ウェルプラ
スチック製培養容器のウェルに２滴ずつ分注する。５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で培養し、１日
後、７日後及び１４日後にウェルにＨＡＴ培地を１〜２
滴加える。

【００６６】（Ｄ）抗体生産細胞のスクリーニング上記抗原ポリペプチドをタンパク質濃度が１〜１０μg/
mlとなるように０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ソーダ含有
０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（pH９．６）に懸濁し、
０．０２％アジ化ソーダ含有０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩
衝液（pH９．６）に対して透析し、その後、タンパク質
濃度が１〜１０μg/mlとなるように希釈した液を、塩化
ビニル製９６ウェルＥＩＡ用プレートのウェルに５０μ
ｌとり、４℃で一晩放置し、抗原を吸着させる。上澄み
を除去し、ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０
を含むＰＢＳ１５０μｌを加え、３分間放置し、その後
除去・洗浄する。洗浄操作を更に１回行なった後、ウェ
ルに１％（ｖ／ｖ）牛血清アルブミンを含むＰＢＳ１０
０μｌを加え、４℃で一晩以上放置し、ブロッキングを
行なう。牛血清アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、
０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様
に２回洗浄後、ウェルに融合細胞の培養上清を５０μｌ
加え、室温で２時間放置する。０．０２％（ｗ／ｖ）ツ
ィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルに
２５ng/mlのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を５０μｌ加え、室温で２時間放置する。０．０
２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回
洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を５０μ
ｌ加え、室温で１５分〜１時間放置して発色反応させ、
９６ウエルＥＩＡプレート用光度計で４０５nmの吸光度
を測定する。そして陽性のウエル中の細胞をそれぞれパ
スツールピペットで回収し、２４ウェルプラスチック製
培養容器に移し、ＨＡＴ培地１〜２mlを加え、同様に培
養する。

【００６７】（Ｅ）限界希釈法によるクローニング２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた２株の
融合細胞の細胞濃度を測定し、細胞数が２０個/mlとな
るようそれぞれをＨＴ培地で希釈する。別にＨＴ培地に
懸濁した４〜６週齢のマウス胸腺細胞を９６ウェルプラ
スチック製培養容器に１〜２×１０⁵個/ウェルとり、こ
れに上記の融合細胞（細胞濃度が２０個/ml）を５０μl
/ウェルずつ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、
３６℃で培養し、その１日後、７日後及び１４日後にＨ
Ｔ培地を１〜２滴／ウェル加える。細胞の増殖が見られ
たウェルの培養上清を５０μｌ回収し、上記（Ｄ）の
「抗体生産細胞のスクリーニング」と同様の方法で抗体
の生産を確認する。ウェル中に単一の細胞コロニーしか
存在せず、基本小体と反応する抗体を生産するもので、
かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き続き２４
ウェルプラスチック製培養容器で増殖させる。更に、同
様のクローニング操作を繰り返し、抗クラミジア・ニュ
ーモニエ抗体を産生するハイブリドーマを取得する。こ
れを培養し、その培養上清から抗クラミジア・ニューモ
ニエ抗体を製造する。

【００６８】

【発明の効果】請求項１記載の抗原ポリペプチドは、ク
ラミジア・ニューモニエの抗体検査等に利用できる。請
求項２記載の抗原ポリペプチドは、請求項１記載の抗原
ポリペプチドの効果を奏し、さらに、アミノ酸配列の長
さが短いため、担体等に固定化できる抗原ペプチドの数
を多くすることができ、それにより、感度の高い診断薬
の製造に利用できる。請求項３記載の抗原ポリペプチド
は、請求項１記載の抗原ポリペプチドの効果を奏し、さ
らに、タンパク質分解酵素による分解を受けにくい構造
をつくることができるので、抗原として安定性に優れ
る。請求項４記載の抗原ポリペプチドは、請求項１記載
の抗原ポリペプチドの効果を奏し、さらに、アミノ酸若
しくは２〜１０００個のアミノ酸配列を利用して担体等
に固定化できるので、固定化による抗原性の低下又は喪
失が生じにくい。請求項５記載の抗原ポリペプチドは、
請求項１記載の抗原ポリペプチドの効果を奏し、さら
に、クラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプ
チドの全体を有するので、抗体検査やクラミジア・ニュ
ーモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。請求項
６記載の抗原ポリペプチドは、請求項１記載の抗原ポリ
ペプチドの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモ
ニエに特異的な抗原部分を有するので、抗体検査やクラ
ミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切で
ある。請求項７記載の抗原ポリペプチドは、請求項１記
載の抗原ポリペプチドの効果を奏し、さらに、クラミジ
ア・ニューモニエに特異的な抗原部分を有するので、抗
体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に
極めて適切である。請求項８記載のＤＮＡは、クラミジ
ア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニ
エ感染の診断等に好適な抗原ポリペプチドの製造に利用
できる。請求項９記載のＤＮＡは、請求項８記載のＤＮ
Ａの効果を奏し、さらに、このＤＮＡにコードされてい
る抗原ポリペプチドはクラミジア・ニューモニエに特異
的な抗原ポリペプチドの全体を有するので、クラミジア
・ニューモニエの特異的抗体検査等に好適な抗原ポリペ
プチドの製造に利用できる。請求項１０記載のＤＮＡ
は、請求項８記載のＤＮＡの効果を奏し、さらに、この
ＤＮＡにコードされている抗原ポリペプチドはクラミジ
ア・ニューモニエに特異的な抗原部分を有するので、ク
ラミジア・ニューモニエの特異的抗体検査等に好適な抗
原ポリペプチドの製造に利用できる。請求項１１記載の
ＤＮＡは、請求項８記載のＤＮＡの効果を奏し、さら
に、このＤＮＡにコードされている抗原ポリペプチドは
クラミジア・ニューモニエに特異的な抗原部分を有する
ので、クラミジア・ニューモニエの特異的抗体検査等に
好適な抗原ポリペプチドの製造に利用できる。請求項１
２記載の組換えベクターは、クラミジア・ニューモニエ
の抗体検査やクラミジア・ニューモニエの感染症の診断
に好適な抗原ポリペプチドの製造に利用できる。請求項
１３記載の組換えベクターは、請求項１２記載の組換え
ベクターの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモ
ニエに特異的な抗原部分を有するポリペプチドを発現さ
せることができるので、クラミジア・ニューモニエの特
異的抗体検査等に極めて適切な抗原ポリペプチドの製造
に利用できる。請求項１４記載の形質転換体は、クラミ
ジア・ニューモニエの特異的抗体検査等に好適な抗原ポ
リペプチドの製造に利用できる。請求項１５記載の抗ク
ラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法は、クラミジア
・ニューモニエ感染の診断薬製造に利用できる。

【００６９】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：488 配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met 1 5 10 15 Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys 20 25 30 Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys 35 40 45 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60 Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly 65 70 75 80 Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr 100 105 110 Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu 115 120 125 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu 130 135 140 Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175 Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr 180 185 190 Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln 195 200 205 Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile 210 215 220 Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240 Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val 245 250 255 Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala Ala 260 265 270 Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala 275 280 285 Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr 290 295 300 Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val Lys 305 310 315 320 Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile Lys 325 330 335 Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val Lys 340 345 350 Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala Lys 355 360 365 Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val Ile 370 375 380 Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val 385 390 395 400 Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser Glu 405 410 415 Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu Gln 420 425 430 Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln Ala 435 440 445 Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gln 450 455 460 Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ile 465 470 475 480 Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 485 488

【００７０】配列番号：2 配列の長さ：271 配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met 1 5 10 15 Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys 20 25 30 Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys 35 40 45 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60 Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly 65 70 75 80 Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr 100 105 110 Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu 115 120 125 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu 130 135 140 Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175 Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr 180 185 190 Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln 195 200 205 Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile 210 215 220 Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240 Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val 245 250 255 Met Ile Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu Ile Asn 260 265 270 271

【００７１】配列番号：3 配列の長さ：1464 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG 48 Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met 1 5 10 15 TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG 96 Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys 20 25 30 CTG TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA 144 Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys 35 40 45 AAC ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA 192 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60 GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA 240 Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly 65 70 75 80 GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT 288 Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA 336 Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr 100 105 110 AAA ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG 384 Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu 115 120 125 TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA 432 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu 130 135 140 GTC GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC 480 Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160 GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA 528 Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175 TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA 576 Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr 180 185 190 TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA 624 Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln 195 200 205 GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA 672 Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile 210 215 220 AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA 720 Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240 CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG 768 Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val 245 250 255 ATG ATC GCG GTT TCT GTT GCC ATT ACA GTT ATT TCT ATT GTT GCT GCT 816 Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala Ala 260 265 270 ATT TTT ACA TGC GGA GCT GGA CTC GCT GGA CTC GCT GCG GGA GCT GCT 864 Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala 275 280 285 GTA GGT GCA GCG GCA GCT GGA GGT GCA GCA GGA GCT GCT GCC GCA ACC 912 Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr 290 295 300 ACG GTA GCA ACA CAA ATT ACA GTT CAA GCT GTT GTC CAA GCG GTG AAA 960 Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val Lys 305 310 315 320 CAA GCT GTT ATC ACA GCT GTC AGA CAA GCG ATC ACC GCG GCT ATA AAA 1008 Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile Lys 325 330 335 GCG GCT GTC AAA TCT GGA ATA AAA GCA TTT ATC AAA ACT TTA GTC AAA 1056 Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val Lys 340 345 350 GCG ATT GCC AAA GCC ATT TCT AAA GGA ATC TCT AAG GTT TTC GCT AAG 1104 Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala Lys 355 360 365 GGA ACT CAA ATG ATT GCG AAG AAC TTC CCC AAG CTC TCG AAA GTC ATC 1152 Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val Ile 370 375 380 TCG TCT CTT ACC AGT AAA TGG GTC ACG GTT GGG GTT GGG GTT GTA GTT 1200 Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val 385 390 395 400 GCG GCG CCT GCT CTC GGT AAA GGG ATT ATG CAA ATG CAG CTC TCG GAG 1248 Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser Glu 405 410 415 ATG CAA CAA AAC GTC GCT CAA TTT CAG AAA GAA GTC GGA AAA CTG CAG 1296 Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu Gln 420 425 430 GCT GCG GCT GAT ATG ATT TCT ATG TTC ACT CAA TTT TGG CAA CAG GCA 1344 Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln Ala 435 440 445 AGT AAA ATT GCC TCA AAA CAA ACA GGC GAG TCT AAT GAA ATG ACT CAA 1392 Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gln 450 455 460 AAA GCT ACC AAG CTG GGC GCT CAA ATC CTT AAA GCG TAT GCC GCA ATC 1440 Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ile 465 470 475 480 AGC GGA GCC ATC GCT GGC GCA GCA 1464 Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 485 488

【００７２】配列番号：4 配列の長さ：８１３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＡＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＣＴ
ＧＡＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＧ 48 Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met 1 5 10 15 TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG 96 Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys 20 25 30 CTG TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA 144 Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys 35 40 45 AAC ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA 192 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60 GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA 240 Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly 65 70 75 80 GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT 288 Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA 336 Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr 100 105 110 AAA ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG 384 Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu 115 120 125 TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA 432 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu 130 135 140 GTC GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC 480 Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160 GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA 528 Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175 TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA 576 Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr 180 185 190 TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA 624 Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln 195 200 205 GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA 672 Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile 210 215 220 AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA 720 Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240 CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG 768 Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val 245 250 255 ATG ATC GCG AAG GGG TTC GAA TTG CCA TGG GGG CCC TTA ATT AAT 813 Met Ile Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu Ile Asn 260 265 270 271

【００７３】配列番号：5 配列の長さ：２５９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＭｅｔＳｅｒＩｌｅＳｅｒＳｅｒＳｅｒＳｅｒＧｌｙＰｒｏ
ＡｓｐＡｓｎＧｌｎＬｙｓＡｓｎＩｌｅＭｅｔ１ 5 10 15 Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys 20 25 30 Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys 35 40 45 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60 Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly 65 70 75 80 Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr 100 105 110 Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu 115 120 125 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu 130 135 140 Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175 Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr 180 185 190 Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln 195 200 205 Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile 210 215 220 Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240 Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val 245 250 255 Met Ile Ala 259

【００７４】配列番号：6 配列の長さ：571 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Pro Lys Gln Ala Glu Tyr Thr Trp Gly Ser Lys Lys Ile Leu Asp 1 5 10 15 Asn Ile Glu Cys Leu Thr Glu Asp Val Ala Glu Phe Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Tyr Thr Ala His Arg Ile Thr Ser Ser Glu Glu Glu Ser Asp Asn Glu 35 40 45 Ile Gln Pro Gly Ala Ile Leu Lys Gly Thr Val Val Asp Ile Asn Lys 50 55 60 Asp Phe Val Val Val Asp Val Gly Leu Lys Ser Glu Gly Val Ile Pro 65 70 75 80 Met Ser Glu Phe Ile Asp Ser Ser Glu Gly Leu Val Leu Gly Ala Glu 85 90 95 Val Glu Val Tyr Leu Asp Gln Ala Glu Asp Glu Glu Gly Lys Val Val 100 105 110 Leu Ser Arg Glu Lys Ala Thr Arg Gln Arg Gln Trp Glu Tyr Ile Leu 115 120 125 Ala His Cys Glu Glu Gly Ser Ile Val Lys Gly Gln Ile Thr Arg Lys 130 135 140 Val Lys Gly Gly Leu Ile Val Asp Ile Gly Met Glu Ala Phe Leu Pro 145 150 155 160 Gly Ser Gln Ile Asp Asn Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asp Tyr Val 165 170 175 Gly Lys Val Cys Glu Phe Lys Ile Leu Lys Ile Asn Val Glu Arg Arg 180 185 190 Asn Ile Val Val Ser Arg Arg Glu Leu Leu Glu Ala Glu Arg Ile Ser 195 200 205 Lys Lys Ala Glu Leu Ile Glu Gln Ile Ser Ile Gly Glu Tyr Arg Lys 210 215 220 Gly Val Val Lys Asn Ile Thr Asp Phe Gly Val Phe Leu Asp Leu Asp 225 230 235 240 Gly Ile Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Asp Met Thr Trp Lys Arg Ile 245 250 255 Arg His Pro Ser Glu Met Val Glu Leu Asn Gln Glu Leu Glu Val Ile 260 265 270 Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu Lys Gly Arg Val Ala Leu Gly Leu Lys 275 280 285 Gln Lys Glu His Asn Pro Trp Glu Asp Ile Glu Lys Lys Tyr Pro Pro 290 295 300 Gly Lys Arg Val Leu Gly Lys Ile Val Lys Leu Leu Pro Tyr Gly Ala 305 310 315 320 Phe Ile Glu Ile Glu Glu Gly Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Glu 325 330 335 Met Ser Trp Val Lys Asn Ile Val Asp Pro Ser Glu Val Val Asn Lys 340 345 350 Gly Asp Glu Val Glu Ala Ile Val Leu Ser Ile Gln Lys Asp Glu Gly 355 360 365 Lys Ile Ser Leu Gly Leu Lys Gln Thr Glu Arg Asn Pro Trp Asp Asn 370 375 380 Ile Glu Glu Lys Tyr Pro Ile Gly Leu His Val Asn Ala Glu Ile Lys 380 385 390 395 Asn Leu Thr Asn Tyr Gly Ala Phe Val Glu Leu Glu Pro Gly Ile Glu 400 405 410 Gly Leu Ile His Ile Ser Asp Met Ser Trp Ile Lys Lys Val Ser His 415 420 425 Pro Ser Glu Leu Phe Lys Lys Gly Asn Ser Val Glu Ala Val Ile Leu 430 435 440 Ser Val Asp Lys Glu Ser Lys Lys Ile Thr Leu Gly Val Lys Gln Leu 445 450 455 Ser Ser Asn Pro Trp Asn Glu Ile Glu Ala Met Phe Pro Ala Gly Thr 460 465 470 475 Val Ile Ser Gly Val Val Thr Lys Ile Thr Ala Phe Gly Ala Phe Val 480 485 490 Glu Leu Gln Asn Gly Ile Glu Gly Leu Ile His Val Ser Glu Leu Ser 495 500 505 Asp Lys Pro Phe Ala Lys Ile Glu Asp Ile Ile Ser Ile Gly Glu Asn 510 515 520 Val Ser Ala Lys Val Ile Lys Leu Asp Pro Asp His Lys Lys Val Ser 525 530 535 Leu Ser Val Lys Glu Tyr Leu Ala Asp Asn Ala Tyr Asp Gln Asp Ser 540 545 550 560 Arg Thr Glu Leu Asp Phe Lys Asp Ser Gln Gly 565 570 571

【００７５】配列番号：7 配列の長さ：777 配列の型：核酸鎖の数:二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 ATGTCTATTT CATCTTCTTC AGGACCTGAC AATCAAAAAA ATATCATGTC TCAAGTTCTG 60 ACATCGACAC CCCAGGGCGT GCCCCAACAA GATAAGCTGT CTGGCAACGA AACGAAGCAA 120 ATACAGCAAA CACGTCAGGG TAAAAACACT GAGATGGAAA GCGATGCCAC TATTGCTGGT 180 GCTTCTGGAA AAGACAAAAC TTCCTCGACT ACAAAAACAG AAACAGCTCC ACAACAGGGA 240 GTTGCTGCTG GGAAAGAATC CTCAGAAAGT CAAAAGGCAG GTGCTGATAC TGGAGTATCA 300 GGAGCGGCTG CTACTACAGC ATCAAATACT GCAACAAAAA TTGCTATGCA GACCTCTATT 360 GAAGAGGCGA GCAAAAGTAT GGAGTCTACC TTAGAGTCAC TTCAAAGCCT CAGTGCCGCG 420 CAAATGAAAG AAGTCGAAGC GGTTGTTGTT GCTGCCCTCT CAGGGAAAAG TTCGGGTTCC 480 GCAAAATTGG AAACACCTGA GCTCCCCAAG CCCGGGGTGA CACCAAGATC AGAGGTTATC 540 GAAATCGGAC TCGCGCTTGC TAAAGCAATT CAGACATTGG GAGAAGCCAC AAAATCTGCC 600 TTATCTAACT ATGCAAGTAC ACAAGCACAA GCAGACCAAA CAAATAAACT AGGTCTAGAA 660 AAGCAAGCGA TAAAAATCGA TAAAGAACGA GAAGAATACC AAGAGATGAA GGCTGCCGAA 720 CAGAAGTCTA AAGATCTCGA AGGAACAATG GATACTGTCA ATACTGTGAT GATCGCG 777

【００７６】配列番号：8 配列の長さ：1712 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列ＡＴＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＡＴＣＴ
ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＡＴＡＧＡＡＴＧＣ 60 CTCACAGAAG ACGTTGCCGA ATTTAAAGAT TTGCTTTATA CGGCACACAG AATTACTTCG 120 AGCGAAGAAG AATCTGATAA CGAAATACAG CCTGGCGCCA TCCTAAAAGG TACCGTAGTT 180 GATATTAATA AAGACTTTGT CGTAGTTGAT GTTGGTCTGA AGTCTGAGGG AGTGATCCCT 240 ATGTCAGAGT TCATAGACTC TTCAGAAGGT TTAGTGCTTG GAGCTGAAGT AGAAGTCTAT 300 CTCGACCAAG CCGAAGACGA AGAGGGCAAA GTTGTCCTTT CTAGAGAAAA AGCCACACGA 360 CAACGTCAAT GGGAATACAT CTTAGCTCAT TGTGAAGAAG GTTCTATTGT TAAAGGTCAA 420 ATTACACGTA AAGTCAAAGG CGGCCTTATT GTAGATATTG GAATGGAAGC CTTCCTACCT 480 GGATCACAAA TTGACAACAA GAAAATCAAA AATTTAGATG ATTATGTCGG AAAAGTTTGT 540 GAATTCAAAA TTTTAAAAAT TAACGTTGAA CGTCGCAATA TTGTTGTCTC AAGAAGAGAA 600 CTCTTAGAAG CTGAGAGAAT CTCTAAGAAA GCCGAACTTA TTGAACAAAT TTCTATCGGA 660 GAATACCGCA AAGGAGTTGT TAAAAACATT ACTGACTTTG GTGTATTCTT AGATCTCGAT 720 GGTATTGACG GTCTTCTCCA CATTACCGAT ATGACCTGGA AGCGCATACG ACATCCTTCC 780 GAAATGGTCG AATTGAATCA AGAGTTGGAA GTAATTATTT TAAGCGTAGA TAAAGAAAAA 840 GGACGAGTTG CTCTAGGTCT CAAACAAAAA GAGCATAATC CTTGGGAAGA TATTGAGAAG 900 AAATACCCTC CTGGAAAACG AGTTCTTGGT AAAATTGTGA AGCTTCTCCC CTACGGAGCT 960 TTCATTGAAA TTGAAGAGGG CATTGAAGGT CTAATTCACA TTTCTGAAAT GTCTTGGGTG 1020 AAAAATATTG TAGATCCTAG TGAAGTCGTA AATAAAGGCG ATGAAGTTGA AGCCATTGTT 1080 CTATCTATTC AGAAGGACGA AGGAAAAATT TCTCTAGGAT TAAAGCAAAC AGAACGTAAT 1140 CCTTGGGACA ATATCGAAGA AAAATATCCT ATAGGTCTCC ATGTCAATGC TGAAATCAAG 1200 AACTTAACCA ATTACGGTGC TTTCGTTGAA TTAGAACCAG GAATTGAGGG TCTGATTCAT 1260 ATTTCTGACA TGAGTTGGAT TAAAAAAGTC TCTCACCCTT CAGAACTATT CAAAAAAGGA 1320 AATTCTGTAG AGGCTGTTAT TTTATCAGTA GACAAAGAAA GTAAAAAAAT TACTTTAGGA 1380 GTTAAGCAAT TAAGTTCTAA TCCTTGGAAT GAAATTGAAG CTATGTTCCC TGCTGGCACA 1440 GTAATTTCAG GAGTTGTGAC TAAAATCACT GCATTTGGAG CCTTTGTTGA GCTACAAAAC 1500 GGGATTGAAG GATTGATTCA CGTTTCAGAA CTTTCTGACA AGCCCTTTGC AAAAATTGAA 1560 GATATTATCT CCATTGGAGA AAATGTTTCT GCAAAAGTAA TTAAGCTAGA TCCAGATCAT 1620 AAAAAAGTTT CTCTTTCTGT AAAAGAATAC TTAGCTGACA ATGCTTATGA TCAAGACTCT 1680 AGGACTGAAT TAGATTTCAA GGATTCTCAA GG 1712

【００７７】配列番号：9 配列の長さ：1048 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：C. ニューモニエ株名：YK-41 直接の起源クローン：53-3S 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：236..1012 特徴を決定した方法：P 配列 TCAGTATCGG CGGAATTCGA ACCCCTTCGC GGCTCTTTCT GGAACTCTAG AATCTTTACA 60 TCTCGAAGAG TTAACTCAAG GATTATTCCC TTCTGCCCAA GAAGATGCCA ACTTCGCAAA 120 GGAGTTATCT TCAGTAGTAC ACGGATTAAA AAACCTAACC ACTGTAGTTA ATAAACAAAT 180 GGTTAAAGGC GCTGAGTAAA GCCCTTTGCA GAATCAAACC CCTTAGGATA CAAAC ATG 238 Met 1 TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG TCT 286 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met Ser 5 10 15 CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG CTG 334 Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys Leu 20 25 30 TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA AAC 382 Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys Asn 35 40 45 ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA GAC 430 Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys Asp 50 55 60 65 AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA GTT 478 Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly Val 70 75 80 GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526 Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp Thr 85 90 95 GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA AAA 574 Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr Lys 100 105 110 ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG TCT 622 Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu Ser 115 120 125 ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA GTC 670 Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu Val 130 135 140 145 GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC GCA 718 Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser Ala 150 155 160 AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA TCA 766 Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg Ser 165 170 175 GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA TTG 814 Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr Leu 180 185 190 GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA GCA 862 Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln Ala 195 200 205 CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA AAA 910 Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile Lys 210 215 220 225 ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA CAG 958 Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu Gln 230 235 240 AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG ATG 1006 Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val Met 245 250 255 ATC GCG AAGGGGTTCG AATTCCAGCT GAGCGCCGGT CGCTAC 1048 Ile Ala 259

【００７８】配列番号：10 配列の長さ：5702 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖配列の種類：他の核酸プラスミド配列 ATCGATGTTA ACAGATCTAA GCTTAACTAA CTAACTCCGG AAAAGGAGGA ACTTCCATGA 60 TCAGTCTGAT TGCGGCGTTA GCGGTAGATC GCGTTATCGG CATGGAAAAC GCCATGCCGT 120 GGAACCTGCC TGCCGATCTC GCCTGGTTTA AACGCAACAC CTTAAATAAA CCCGTGATTA 180 TGGGCCGCCA TACCTGGGAA TCAATCGGTC GTCCGTTGCC AGGACGCAAA AATATTATCC 240 TCAGCAGTCA ACCGGGTACG GACGATCGCG TAACGTGGGT GAAGTCGGTG GATGAAGCCA 300 TCGCGGCGTG TGGTGACGTA CCAGAAATCA TGGTGATTGG CGGCGGTCGC GTTTATGAAC 360 AGTTCTTGCC AAAAGCGCAA AAACTGTATC TGACGCATAT CGACGCAGAA GTGGAAGGCG 420 ACACCCATTT CCCGGATTAC GAGCCGGATG ACTGGGAATC GGTATTCAGC GAATTCCACG 480 ATGCTGATGC GCAGAACTCT CACAGCTATG AGTTCGAAAT TCTGGAGCGG CGGATCCAAT 540 TCGAACCCCT TCGCGGCTCT TTCTGGAACT CTAGAATCTT TACATCTCGA AGAGTTAACT 600 CAAGGATTAT TCCCTTCTGC CCAAGAAGAT GCCAACTTCG CAAAGGAGTT ATCTTCAGTA 660 GTACACGGAT TAAAAAACCT AACCACTGTA GTTAATAAAC AAATGGTTAA AGGCGCTGAG 720 TAAAGCCCTT TGCAGAATCA AACCCCTTAG GATACAAACA TGTCTATTTC ATCTTCTTCA 780 GGACCTGACA ATCAAAAAAA TATCATGTCT CAAGTTCTGA CATCGACACC CCAGGGCGTG 840 CCCCAACAAG ATAAGCTGTC TGGCAACGAA ACGAAGCAAA TACAGCAAAC ACGTCAGGGT 900 AAAAACACTG AGATGGAAAG CGATGCCACT ATTGCTGGTG CTTCTGGAAA AGACAAAACT 960 TCCTCGACTA CAAAAACAGA AACAGCTCCA CAACAGGGAG TTGCTGCTGG GAAAGAATCC 1020 TCAGAAAGTC AAAAGGCAGG TGCTGATACT GGAGTATCAG GAGCGGCTGC TACTACAGCA 1080 TCAAATACTG CAACAAAAAT TGCTATGCAG ACCTCTATTG AAGAGGCGAG CAAAAGTATG 1140 GAGTCTACCT TAGAGTCACT TCAAAGCCTC AGTGCCGCGC AAATGAAAGA AGTCGAAGCG 1200 GTTGTTGTTG CTGCCCTCTC AGGGAAAAGT TCGGGTTCCG CAAAATTGGA AACACCTGAG 1260 CTCCCCAAGC CCGGGGTGAC ACCAAGATCA GAGGTTATCG AAATCGGACT CGCGCTTGCT 1320 AAAGCAATTC AGACATTGGG AGAAGCCACA AAATCTGCCT TATCTAACTA TGCAAGTACA 1380 CAAGCACAAG CAGACCAAAC AAATAAACTA GGTCTAGAAA AGCAAGCGAT AAAAATCGAT 1440 AAAGAACGAG AAGAATACCA AGAGATGAAG GCTGCCGAAC AGAAGTCTAA AGATCTCGAA 1500 GGAACAATGG ATACTGTCAA TACTGTGATG ATCGCGAAGG GGTTCGAATT GCCATGGGGG 1560 CCCTTAATTA ATTAACTCGA GAGATCCAGA TCTAATCGAT GATCCTCTAC GCCGGACGCA 1620 TCGTGGCCGG CATCACCGGC GCCACAGGTG CGGTTGCTGG CGCCTATATC GCCGACATCA 1680 CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG GGCTCATGAG CGCTTGTTTC GGCGTGGGTA 1740 TGGTGGCAGG CCCGTGGCCG GGGGACTGTT GGGCGCCATC TCCTTGCATG CACCATTCCT 1800 TGCGGCGGCG GTGCTCAACG GCCTCAACCT ACTACTGGGC TGCTTCCTAA TGCAGGAGTC 1860 GCATAAGGGA GAGCGTCGAC CGATGCCCTT GAGAGCCTTC AACCCAGTCA GCTCCTTCCG 1920 GTGGGCGCGG GGCATGACTA TCGTCGCCGC ACTTATGACT GTCTTCTTTA TCATGCAACT 1980 CGTAGGACAG GTGCCGGCAG CGCTCTGGGT CATTTTCGGC GAGGACCGCT TTCGCTGGAG 2040 CGCGACGATG ATCGGCCTGT CGCTTGCGGT ATTCGGAATC TTGCACGCCC TCGCTCAAGC 2100 CTTCGTCACT GGTCCCGCCA CCAAACGTTT CGGCGAGAAG CAGGCCATTA TCGCCGGCAT 2160 GGCGGCCGAC GCGCTGGGCT ACGTCTTGCT GGCGTTCGCG ACGCGAGGCT GGATGGCCTT 2220 CCCCATTATG ATTCTTCTCG CTTCCGGCGG CATCGGGATG CCCGCGTTGC AGGCCATGCT 2280 GTCCAGGCAG GTAGATGACG ACCATCAGGG ACAGCTTCAA GGATCGCTCG CGGCTCTTAC 2340 CAGCCTAACT TCGATCACTG GACCGCTGAT CGTCACGGCG ATTTATGCCG CCTCGGCGAG 2400 CACATGGAAC GGGTTGGCAT GGATTGTAGG CGCCGCCCTA TACCTTGTCT GCCTCCCCGC 2460 GTTGCGTCGC GGTGCATGGA GCCGGGCCAC CTCGACCTGA ATGGAAGCCG GCGGCACCTC 2520 GCTAACGGAT TCACCACTCC AAGAATTGGA GCCAATCAAT TCTTGCGGAG AACTGTGAAT 2580 GCGCAAACCA ACCCTTGGCA GAACATATCC ATCGCGTCCG CCATCTCCAG CAGCCGCACG 2640 CGGCGCATCT CGGGCAGCGT TGGGTCCTGG CCACGGGTGC GCATGATCGT GCTCCTGTCG 2700 TTGAGGACCC GGCTAGGCTG GCGGGGTTGC CTTACTGGTT AGCAGAATGA ATCACCGATA 2760 CGCGAGCGAA CGTGAAGCGA CTGCTGCTGC AAAACGTCTG CGACCTGAGC AACAACATGA 2820 ATGGTCTTCG GTTTCCGTGT TTCGTAAAGT CTGGAAACGC GGAAGTCAGC GCCCTGCACC 2880 ATTATGTTCC GGATCTGCAT CGCAGGATGC TGCTGGCTAC CCTGTGGAAC ACCTACATCT 2940 GTATTAACGA AGCGCTGGCA TTGACCCTGA GTGATTTTTC TCTGGTCCCG CCGCATCCAT 3000 ACCGCCAGTT GTTTACCCTC ACAACGTTCC AGTAACCGGG CATGTTCATC ATCAGTAACC 3060 CGTATCGTGA GCATCCTCTC TCGTTTCATC GGTATCATTA CCCCCATGAA CAGAAATTC 3120 CCCCTTACAC GGAGGCATCA AGTGACCAAA CAGGAAAAAA CCGCCCTTAA CATGGCCCG 3180 CTTTATCAGA AGCCAGACAT TAACGCTTCT GGAGAAACTC AACGAGCTGG ACGCGGATG 3240 AACAGGCAGA CATCTGTGAA TCGCTTCACG ACCACGCTGA TGAGCTTTAC CGCAGCTGC 3300 CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGT 3360 CACAGCTTGT CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG CGTCAGCGG 3420 GTGTTGGCGG GTGTCGGGGC GCAGCCATGA CCCAGTCACG TAGCGATAGC GGAGTGTAT 3480 ACTGGCTTAA CTATGCGGCA TCAGAGCAGA TTGTACTGAG AGTGCACCAT ATGCGGTGT 3540 GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA TACCGCATCA GGCGCTCTTC CGCTTCCTC 3600 GCTCACTGAC TCGCTGCGCT CGGTCGTTCG GCTGCGGCGA GCGGTATCAG CTCACTCAA 3660 AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCA 3720 AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA AAGGCCGCGT TGCTGGCGTT TTTCCATAG 3780 GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT GGCGAAACC 3840 CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCT 3900 GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGC 3960 GCTTTCTCAA TGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGC 4020 TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTAT 4080 CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAA 4140 CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTA 4200 ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACC 4260 TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGG 4320 TTTTTTTGTT TGCAAGCAGC AGATTACGCG CAGAAAAAAA GGATCTCAAG AAGATCCTT 4380 TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTG 4440 GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTT 4500 TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCA 4560 GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCC 4620 GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGAT 4680 ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAA 4740 GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT ATTAATTGT 4800 TGCCGGGAAG CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCAT 4860 TGCTGCAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTT 4920 CCCAACGATC AAGGCGAGTT ACATGATCCC CCATGTTGTG CAAAAAAGCG GTTAGCTCC 4980 TTCGGTCCTC CGATCGTTGT CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG TGTTATCACT CATGGTTAT 5040 GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT CTGTGACTG 5100 GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGC 5160 CCGGCGTCAA CACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCAT 5220 TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTT 5280 CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTT 5340 TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACG 5400 GAAATGTTGA ATACTCATAC TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTT 5460 ATTGTCTCAT GAGCGGATAC ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTT 5520 CCGCGCACAT TTCCCCGAAA AGTGCCACCT GACGTCTAAG AAACCATTAT TATCATGAC 5580 ATTAACCTAT AAAAATAGGC GTATCACGAG GCCCTTTCGT CTTCAAGAAT TAATTGTTA 5640 TCCGCTCACA ATTAATTCTT GACAATTAGT TAACTATTTG TTATAATGTA TTCATAAGC 5700 TT 5702

【００７９】配列番号：11 配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GATCCAATTG CCATGGGGGC CCTTAATTAA TTAAC 35

【００８０】配列番号：12 配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TCGAGTTAAT TAATTAAGGG CCCCCATGGC AATTG 35

【００８１】配列番号：13 配列の長さ：1954 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：C. ニューモニエ株名：YK-41 直接の起源クローン:70-2S 配列の特徴特徴を表す記号：−３５ signal 存在位置：146..151 特徴を決定した方法：Ｓ配列の特徴特徴を表す記号：−１０ signal 存在位置：169..174 特徴を決定した方法：Ｓ配列の特徴特徴を表す記号：ＲＢＳ存在位置：199..205 特徴を決定した方法：Ｓ配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：215..1927 特徴を決定した方法：Ｓ配列 TTGACACCAG ACCAACTGGT AATGGTAGCG ACCGGCGCTC AGCTGGAATT CGAACCCCTT 60 CGCCTTATAC ATCTCTAGAA CGGAAGTATA GGATTTTACG ATTAATTCGA TTATATAGAA 120 CTAATCGTCT CCTGCAAGGG AGGTCTTGCC TTTTTTAAGG TTTATATTTA CACTGTCTTT 180 TTTGACTTTG TAGTTTTTAG GAGAATAACA ATAA ATG CCA AAA CAA GCT GAA TAT 235 Met Pro Lys Gln Ala Glu Tyr 1 5 ACT TGG GGA TCT AAA AAA ATT CTG GAC AAT ATA GAA TGC CTC ACA GAA 283 Thr Trp Gly Ser Lys Lys Ile Leu Asp Asn Ile Glu Cys Leu Thr Glu 10 15 20 GAC GTT GCC GAA TTT AAA GAT TTG CTT TAT ACG GCA CAC AGA ATT ACT 331 Asp Val Ala Glu Phe Lys Asp Leu Leu Tyr Thr Ala His Arg Ile Thr 25 30 35 TCG AGC GAA GAA GAA TCT GAT AAC GAA ATA CAG CCT GGC GCC ATC CTA 379 Ser Ser Glu Glu Glu Ser Asp Asn Glu Ile Gln Pro Gly Ala Ile Leu 40 45 50 55 AAA GGT ACC GTA GTT GAT ATT AAT AAA GAC TTT GTC GTA GTT GAT GTT 427 Lys Gly Thr Val Val Asp Ile Asn Lys Asp Phe Val Val Val Asp Val 60 65 70 GGT CTG AAG TCT GAG GGA GTG ATC CCT ATG TCA GAG TTC ATA GAC TCT 475 Gly Leu Lys Ser Glu Gly Val Ile Pro Met Ser Glu Phe Ile Asp Ser 75 80 85 TCA GAA GGT TTA GTG CTT GGA GCT GAA GTA GAA GTC TAT CTC GAC CAA 523 Ser Glu Gly Leu Val Leu Gly Ala Glu Val Glu Val Tyr Leu Asp Gln 90 95 100 GCC GAA GAC GAA GAG GGC AAA GTT GTC CTT TCT AGA GAA AAA GCC ACA 571 Ala Glu Asp Glu Glu Gly Lys Val Val Leu Ser Arg Glu Lys Ala Thr 105 110 115 CGA CAA CGT CAA TGG GAA TAC ATC TTA GCT CAT TGT GAA GAA GGT TCT 619 Arg Gln Arg Gln Trp Glu Tyr Ile Leu Ala His Cys Glu Glu Gly Ser 120 125 130 135 ATT GTT AAA GGT CAA ATT ACA CGT AAA GTC AAA GGC GGC CTT ATT GTA 667 Ile Val Lys Gly Gln Ile Thr Arg Lys Val Lys Gly Gly Leu Ile Val 140 145 150 GAT Ile Gly Met Glu Ala Phe Leu Pro Gly Ser Gln Ile Asp Asn Lys 715 Asp ATT GGA ATG GAA GCC TTC CTA CCT GGA TCA CAA ATT GAC AAC AAG 155 160 165 Lys ATC AAA AAT TTA GAT GAT TAT GTC GGA AAA GTT TGT GAA TTC AAA 763 AAA Ile Lys Asn Leu Asp Asp Tyr Val Gly Lys Val Cys Glu Phe Lys 170 175 180 ATT TTA AAA ATT AAC GTT GAA CGT CGC AAT ATT GTT GTC TCA AGA AGA 811 Ile Leu Lys Ile Asn Val Glu Arg Arg Asn Ile Val Val Ser Arg Arg 185 190 195 GAA CTC TTA GAA GCT GAG AGA ATC TCT AAG AAA GCC GAA CTT ATT GAA 859 Glu Leu Leu Glu Ala Glu Arg Ile Ser Lys Lys Ala Glu Leu Ile Glu 200 205 210 215 CAA ATT TCT ATC GGA GAA TAC CGC AAA GGA GTT GTT AAA AAC ATT ACT 907 Gln Ile Ser Ile Gly Glu Tyr Arg Lys Gly Val Val Lys Asn Ile Thr 220 225 230 GAC TTT GGT GTA TTC TTA GAT CTC GAT GGT ATT GAC GGT CTT CTC CAC 955 Asp Phe Gly Val Phe Leu Asp Leu Asp Gly Ile Asp Gly Leu Leu His 235 240 245 ATT ACC GAT ATG ACC TGG AAG CGC ATA CGA CAT CCT TCC GAA ATG GTC 1003 Ile Thr Asp Met Thr Trp Lys Arg Ile Arg His Pro Ser Glu Met Val 250 255 260 GAA TTG AAT CAA GAG TTG GAA GTA ATT ATT TTA AGC GTA GAT AAA GAA 1051 Glu Leu Asn Gln Glu Leu Glu Val Ile Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu 265 270 275 AAA GGA CGA GTT GCT CTA GGT CTC AAA CAA AAA GAG CAT AAT CCT TGG 1099 Lys Gly Arg Val Ala Leu Gly Leu Lys Gln Lys Glu His Asn Pro Trp 280 285 290 295 GAA GAT ATT GAG AAG AAA TAC CCT CCT GGA AAA CGA GTT CTT GGT AAA 1147 Glu Asp Ile Glu Lys Lys Tyr Pro Pro Gly Lys Arg Val Leu Gly Lys 300 305 310 ATT GTG AAG CTT CTC CCC TAC GGA GCT TTC ATT GAA ATT GAA GAG GGC 1195 Ile Val Lys Leu Leu Pro Tyr Gly Ala Phe Ile Glu Ile Glu Glu Gly 315 320 325 ATT GAA GGT CTA ATT CAC ATT TCT GAA ATG TCT TGG GTG AAA AAT ATT 1243 Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Glu Met Ser Trp Val Lys Asn Ile 330 335 340 GTA GAT CCT AGT GAA GTC GTA AAT AAA GGC GAT GAA GTT GAA GCC ATT 1291 Val Asp Pro Ser Glu Val Val Asn Lys Gly Asp Glu Val Glu Ala Ile 345 350 355 GTT CTA TCT ATT CAG AAG GAC GAA GGA AAA ATT TCT CTA GGA TTA AAG 1339 Val Leu Ser Ile Gln Lys Asp Glu Gly Lys Ile Ser Leu Gly Leu Lys 360 365 370 375 CAA ACA GAA CGT AAT CCT TGG GAC AAT ATC GAA GAA AAA TAT CCT ATA 1387 Gln Thr Glu Arg Asn Pro Trp Asp Asn Ile Glu Glu Lys Tyr Pro Ile 380 385 390 GGT CTC CAT GTC AAT GCT GAA ATC AAG AAC TTA ACC AAT TAC GGT GCT 1435 Gly Leu His Val Asn Ala Glu Ile Lys Asn Leu Thr Asn Tyr Gly Ala 395 400 405 TTC GTT GAA TTA GAA CCA GGA ATT GAG GGT CTG ATT CAT ATT TCT GAC 1483 Phe Val Glu Leu Glu Pro Gly Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Asp 410 415 420 ATG AGT TGG ATT AAA AAA GTC TCT CAC CCT TCA GAA CTA TTC AAA AAA 1531 Met Ser Trp Ile Lys Lys Val Ser His Pro Ser Glu Leu Phe Lys Lys 425 430 435 GGA AAT TCT GTA GAG GCT GTT ATT TTA TCA GTA GAC AAA GAA AGT AAA 1579 Gly Asn Ser Val Glu Ala Val Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu Ser Lys 440 445 450 455 AAA ATT ACT TTA GGA GTT AAG CAA TTA AGT TCT AAT CCT TGG AAT GAA 1627 Lys Ile Thr Leu Gly Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Pro Trp Asn Glu 460 465 470 ATT GAA GCT ATG TTC CCT GCT GGC ACA GTA ATT TCA GGA GTT GTG ACT 1675 Ile Glu Ala Met Phe Pro Ala Gly Thr Val Ile Ser Gly Val Val Thr 475 480 485 AAA ATC ACT GCA TTT GGA GCC TTT GTT GAG CTA CAA AAC GGG ATT GAA 1723 Lys Ile Thr Ala Phe Gly Ala Phe Val Glu Leu Gln Asn Gly Ile Glu 490 495 500 GGA TTG ATT CAC GTT TCA GAA CTT TCT GAC AAG CCC TTT GCA AAA ATT 1771 Gly Leu Ile His Val Ser Glu Leu Ser Asp Lys Pro Phe Ala Lys Ile 505 510 515 GAA GAT ATT ATC TCC ATT GGA GAA AAT GTT TCT GCA AAA GTA ATT AAG 1919 Glu Asp Ile Ile Ser Ile Gly Glu Asn Val Ser Ala Lys Val Ile Lys 520 525 530 535 CTA GAT CCA GAT CAT AAA AAA GTT TCT CTT TCT GTA AAA GAA TAC TTA 1867 Leu Asp Pro Asp His Lys Lys Val Ser Leu Ser Val Lys Glu Tyr Leu 540 545 550 GCT GAC AAT GCT TAT GAT CAA GAC TCT AGG ACT GAA TTA GAT TTC AAG 1915 Ala Asp Asn Ala Tyr Asp Gln Asp Ser Arg Thr Glu Leu Asp Phe Lys 555 560 565 GAT TCT CAA GGC GAA GGG GTT CGA ATT CCG CCG ATA CTG 1954 Asp Ser Gln Gly Glu Gly Val Arg Ile Pro Pro Ile Leu 570 575 580

【００８２】配列番号：14 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCTGCCGAAC AGAAGTCTAA 20

【００８３】配列番号：15 配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＣＴＣＧＡＡＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＡＴＡＣ
20

【００８４】配列番号：16 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTACATATTG TCGTTAGAAC GCG 23

【００８５】配列番号：17 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TAATACGACT CACTATAGGG AGA 23

【００８６】配列番号：18 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCGGATCCTG ATGTCTATTT CATCTTCT ２
８

【００８７】配列番号：１９配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATCTCGAGTT TTATGCTGCT GCGCCAGCGA ３
０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/571 33/571 Ａ６１Ｋ 39/118 ＡＢＬ // Ａ６１Ｋ 39/118 ＡＢＬＡＣＤＡＣＤＡＣＶＡＣＶ 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (54)【発明の名称】クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１のポリペプチドの中の連続し
た少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＡ
からなる、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチ
ド。
【請求項２】ポリペプチドＡが、配列番号１のポリペ
プチドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドであ
る、請求項１記載の抗原ポリペプチド。
【請求項３】ポリペプチドＡが、配列番号１のポリペ
プチドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている
か又は配列番号１のポリペプチドの中にアミノ酸が挿入
されているポリペプチドである、請求項１記載の抗原ポ
リペプチド。
【請求項４】ポリペプチドＡが、配列番号１のポリペ
プチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列に
アミノ酸若しくはペプチドが結合したポリペプチドであ
る、請求項１記載の抗原ポリペプチド。
【請求項５】ポリペプチドＡが配列番号１のアミノ酸
配列からなるポリペプチドである、請求項１記載の抗原
ポリペプチド。
【請求項６】ポリペプチドＡが配列番号２のアミノ酸
配列からなるポリペプチドである、請求項１記載の抗原
ポリペプチド。
【請求項７】ポリペプチドＡが配列番号５のアミノ酸
配列からなるポリペプチドである、請求項１記載の抗原
ポリペプチド。
【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載の抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ若しくはそれに相補的な
ＤＮＡ。
【請求項９】塩基配列が配列番号３の塩基配列であ
る、請求項８記載のＤＮＡ。
【請求項１０】塩基配列が配列番号４の塩基配列であ
る、請求項８記載のＤＮＡ。
【請求項１１】塩基配列が配列番号７の塩基配列であ
る、請求項８記載のＤＮＡ。
【請求項１２】請求項８〜１１のいずれかに記載のＤ
ＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１３】組換えベクターが配列番号１０の塩基
配列を有するｐＣＰＮ５３３αプラスミドである、請求
項１２記載の組換えベクター。
【請求項１４】請求項１２又は請求項１３記載の組換
えベクターを含む形質転換体。
【請求項１５】請求項１〜７のいずれかに記載の抗原
ポリペプチドを抗原として用いることを特徴とする、抗
クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法。