WO1996006858A1

WO1996006858A1 - PROTEINE FIXANT LE (1→3)-β-D-GLUCANE, ANTICORPS RECONNAISSANT LA PROTEINE ET UTILISATION DE LA PROTEINE ET DE L'ANTICORPS

Info

Publication number: WO1996006858A1
Application number: PCT/JP1995/001735
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Tamura; Shigenori Tanaka
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 1994-09-01
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 1996-03-07
Also published as: EP0805161A1; US6156519A; CN1120847C; EP0805161A4; EP0805161B1; CN1185161A; DE69531958T2; JP3793573B2; DE69531958D1

Description

明細書

( 1 → 3 ) 一 /5 — D—グルカン結合性タンパク質、それを認識する抗体及びその利用

¾ g

本発明は、カブトガ二の血球から得られる（ 1 → 3 ) — ） 5 — D—グルカン結合性タンパク質またはその変異体およびその抗体に関する。

さらに本発明は、これらのタンパク質からなる（ 1 → 3 ) ― /5 — D—グルカンの測定剤、これらのタンパク質と該測定剤とからなるキット、これらのタンパク質と該抗体とをからなるキットおよびこれらのタンパク質を使用する（ 1 → 3 ) - 0 - Ώ ーグルカンの測定法に関する。

また、さらに本発明は、これらのタンパク質またはそれを結合した担体からなる（ 1 → 3 ) — /? — D—グルカンの除去剤および該除去剤を使用する（ 1 → 3 ) — — D—グルカンの除去法に関する。

またさらに本発明は、これらのタンパク質を使用する力ブトガニ . ァメボサイト . ライセート中に存在することがある G因子の活性化を阻害する方法に関する。

またさらに本発明は、これらのタンパク質を使用するエンドトキシンの測定法に関する。背景技術

1964年にカブトガニ血球抽出液（ァメボサイト · ライセート . 以下 L A L ということがある）が極微量のグラム陰性菌内毒素 (以下、エンドトキシン（ E t ) またはリポボリサッカライド ( L P S ) ということもある）によつて凝固（ゲル化）することが発見され、現在まで E t ( L P S ) 感受性因子（ C因子）を初めとするゲル化に関与する複数の因子（セリンブ口テア一ゼ前駆体）が明らかにされてきた。この反応は、哺乳類の血液凝固系と類似したカスケード機構よりなり、他の無脊椎動物でも同様のメカニズムが存在することが報告されている。

一方、 L A L は E t 以外にも極微量の（ 1 → 3 ) - β - Ό - グルカン（以下 9 —グルカンということもある）とも反応し、ゲル化を引き起こすことが知られており、 ^—グルカンを認識する感受性因子（ G因子）の存在も見出されている。そして、 C因子を介する経路（ C因子系）とは全く別経路（ G因子系）の凝固力スケードにより、 E t 同様のゲル化が誘導されることも明らかにされてきている。さらに、）5 —グルカンは真菌細胞壁の構成多糖でもあることから、この経路は C因子系同様、生体防御に密接な関わりを有していると推測される。

従来、 9 —グルカン結合性タンパク質としては、カブトガニの血液凝固 G因子 [FEBS Lett. , 129, 318-321 (1981) ] . カイコの /5 —グルカン認識タンバク（プロフエノ一ルォキシダ一ゼ） [J. Biol . Chem. , 263, 12056- 12062 (1988) ] . ヒト単球の /?— グルカンレセプター [J. Exp. Med. , 173, 1511-1520 (1991)] 、局所的ォプソニン化に伴う補体受容体 [J. Immunol . , 124, 3307-3315 (1985)] , 植物細胞に対する ^ ーグルカンエリシタ一

[J. Cel l Biol . , 78, 627 (1978) ] 、ストレプトコッカス - ソブリヌス（ Streptococcus sobrinus) 由来のグルカン結合性タンパク質 [Infect. Immun. , 60 (12) 5291 - 5293 (1992) ]、ッヅリガ由来の — グルカン特異的レクチン [Matha V. , 64, 35-42 (1990) ] などが報告されている。発明の開示

本発明者らは、 L A L中のゲル化因子について研究を進めていたところ、 L A L中に 9 ーグルカンと特異的に結合し、 β — グルカンによる G因子の活性化を阻害するタンパク質が存在することを見出し、このタンパク質を単離した。さらに、本発明者らは、このタンパク質を選択的に認識する抗体を見出した。

そして、これらのタンパク質あるいは抗体の性質を検討し、その用途を見出した。

すなわち、本発明の課題は、このような ^ ーグルカンに特異的に結合する新規なタンパク質およびその抗体を提供し、これを /? ーグルカンやエンドトキシンの検出、 9 ーグルカンの除去あるいは真菌感染治療薬に応用しょうとするものである。

すなわち本発明は、カブトガ二の血球から得られ、ドデシル硫酸ナトリウム —ボリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS- PAGE) で単一バンドを示すように精製された、次の理化学的性質を示す ^ ーグルカン結合性タンパク質である。

(1) 分子量：約 580 k ダルトン（非還元条件下におけるゲルろ過法）

約 170 k ダルトン（還元条件下における SDS-PAGE 法）

(2) 等電点：約 9.2

(3) 紫外部吸収スペクトル： 280nm に吸収極大を持つ

(4) 溶解性：水に易溶

(5) 物質の色：白色また、 N末端アミノ酸配列は次に示す通りである。

Lys-Ser-Gly-Phe- IIe-Leu-Thr-Ala-Pro- Lys-Ser-し eu-Thr-Leu -Gly-Arg-Asn-Asn-Arg-Leu-Asn-Leu-His-Leu-Phe-Asp-Ile-Asn -Thr-Asn-Gly-Phe-Xaa-Arg-Ile-Gly-Va卜し ys-Asp-Gln-Asn-Asp - Phe- Asn-

(式中、 Xaa は自然界に存在するアミノ酸のいずれかを示す）。また、本発明では前記タンパク質の変異体をも包含する。本発明における変異体は、前記タンパク質と機能的に同等な物質であって、この機能に実質的に影響を与えない該タンパク質のアミノ酸を置換、欠失または追加させたものをいう。

さらに、好ましくは、本発明における変異体とは、アミノ酸配列が高度の相同性を有し、目的とする効果が該タンパク質と実質的に同等であるタンパク質を意味する（以下、これらの変異体をも含めてタンパク質という）。

さらに本発明は、次のとおりの抗体、これらを使用するグルカン測定剤、測定キット及びダルカン測定法に関する。

(1) 上記タンパク質を選択的に認識する抗体。

(2) 上記タンパク質または標識された上記タンパク質からなる ( 1 → 3 ) — ^ — D —グルカンの測定剤。

(3) 上記タンパク質と上記抗体又は標識された上記抗体とからなる（ 1 → 3 ) _ 5 — D —グルカンの測定キット。

(4) 上記タンパク質と上記測定剤とからなる（ 1 → 3 ) 一 β — D —グルカンの測定キット。

(5) 上記タンパク質と検体中の（ 1 → 3 ) 一 β — Ό ーグルカンとを反応させて複合体を形成させ、該複合体を検出することを特徴とする、（ 1 → 3 ) — /? — D —グルカンの測定法。

(6) 上記複合体の検出が上記抗体又は標識されているかもしくは標識されうる抗体を用いて行なう方法である上記 (5)記載の測定法。

(7) 検体中の（ 1 → 3 ) — /5 — D —グルカンを、固相に固着しているかあるいは固相しうる上記タンパク質と該標識されたタンパク質とで挟んだ、サンドイッチ状複合体を形成させ、上記タンパクが固相に固着しうるものであるときは、該複合体を固相に固着させ、固相と液相とを分離した後、いずれかの相の標識物質を測定することを特徴とする（ 1 → 3 ) - β — D—グルカンを測定する方法。

またさらに、本発明は、このようなグルカンを舍有する試料からそれを除去するグルカン除去剤及び除去法に関する。

(8) 上記タンパク質あるいはそれを固着した担体からなる（ 1 - 3 ) ー一 D—グルカンの除去剤。

(9) 上記タンパク質又は担体に固着された上記タンパク質と試料中の（ 1 → 3 ) — β — D—グルカンとを反応させて複合体を形成させ、試料から該複合体を分離除去することを特徴とする、（ 1 → 3 ) — ^一 D—グルカンの除ま法。

またさらに、本発明は G因子の活性化阻害方法に閲する。

00) 上記タンパク質と力ブトガニ ' ァメボサイト · ライセートとを混合するか、または試料と上記タンパク質とを混合してから、該試料と力ブトガニ ' ァメボサイト · ライセートとを混合することからなる該カブトガニ · ァメボサイト · ライセ一ト中に存在することがある G因子の活性化を阻害する方法, またさらに、本発明は、エンドトキシンの測定法に関する ,

01) ( 1 → 3 ) 一ー D—グルカンを舍む試料中に舍まれるェンドトキシンを、力ブトガニ ' ァメボサイト · ライセートを用いたリムルス反応によって測定する際に、リムルス反応に先立って、試料と上記タンパク質とを混合するか、または該ライセートと上記タンパク質とを混合することを特徴とするエンドトキシンの測定法。

本発明のこれらの /? ーグルカン結合性タンパク質（以下、 G Β Ρ ともいう）は、カブトガニ（タキプレウス ' トリデンタツス (Tachypleus tr i den ta tus ) 、タキプレウス . ギガス (Tachyp lens g l gas)、リムクレス · ホリフエムス (L i mu 1 us DO l^phemus) カノレシノスコノレピウス · ロッンディカウダ (Carci noscorpi us rotundlcauda)等 ) の血球（ァメボサイト）から、通常のカブトガニ · ァメボサイト · ライセ一トの調製に用いられる低張液抽出法 [例えば、 J. Biochem. , 80, 110卜 1021 ( 1976)参照〗を応用して抽出することができる。

具体的には、力ブトガ二の血球に、 0〜 4 てに冷却した 0.02M トリスー塩酸緩衝液（PH 8.0)を加え、 0 〜 4 てで欖拌し、抽出する。抽出液を冷却遠心し、上澄液（ライセート）を得る。このライセ一ト中には、プロクロッティングェンザィム、コアギュローゲン、 G因子、 B因子、 C因子、 G B P、抗 L P S因子等種々の凝固系因子が舍有されている。このライセ一トを 0.02 〜0.05M トリス—塩酸緩衝液、 PH 7.0〜8.5( 0〜0.2M NaCl 舍有）で平衡化したデキストラン硫酸一セファロース CL- 6B ァフィニティーカラム（デキストラン硫酸、セファロース Cい 6B (Pharmacia製）を用いて、既知の方法（Anal . Biochem. 60, 149 - 152 (1974))で調製）にかけ、 0.2〜0.5M NaCl 舍有の前記緩衝液で溶出させる。この溶出画分のうち G B P活性を示す画分を採取する。このようにすると B因子、 C因子および G B P とが混在した画分を得る。この画分を凍結乾燥し、この凍結乾燥物をゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製する。

ゲルろ過クロマトグラフィ一は、 0.02〜 0.0811 トリス—塩酸緩衝液、 PH 6.5〜8.5 (0.4〜1M NaCl 含有）で平衡化したセフアクリル 300 HR(High Resolution) カラム（Pharmacia製）あるいはセルロフアイン G C L - 2000m カラム（生化学工業（株）販壳）などで行う。溶出は平衡化に用いた緩衝液で行い、好ましくは同様のクロマトグラフィーを少なくとも 2 回繰り返して行 c

ゲルろ過クロマトグラフィ一の溶出面分を分画し、それぞれの画分について G B P活性を測定し、この活性を示す画分を採取する。第 1 回のクロマトグラフィ一で B因子および C因子と G B P とはほぼ完全に分離され、さらに同様のカラムによるリクロマトグラフィ一によつて精製された G B Pを得る。この画分を集め凍結乾燥することによって、本発明の G B Pを得る。これは白色粉末で水に易溶性を示す。この G B P はボリァクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)で単一のバンドを示し、前記した理化学的性質を示す。

また本発明の G B P は、 N末端アミノ酸配列が判っているので公知の遺伝子工学的手法（例えば該配列から D N Aプライマ一を作成し、これを用いてカブトガニ血球より得られる c D N Aライブラリーから G B Pをコードする D N Aを得、この D N Aをベクターに組み込んで組換え体を作成し、これを常法によつて発現させる方法等）によって得ることができる。

本発明における G B P活性は、ーグルカン（ブクリヨゥ菌より Saito らの方法（Agrし Biol . Chem. , 32, 1261- 1269 (1968)) で調製したバキマン（Pachyman)の SOpg/mL 0.01M NaOH 水溶液） (0.05niL)に上記クロマトグラフィ一の各フラクション 0.05mLを加え、 37て、 10分間加温し、タキブレウス ' トリデンタツスのァメボサイト · ライセートより Obay as hi らの方法（Clin. Chim. Acta, 149, 55-65 (1985))で調製した G因子（0.04mいおよびブ口クロッティングェンザィム（0.02mい，さらに 1M MgS0₄ (0.01 « ) , 2M トリス —塩酸緩衝液、 pH8.0(0.01mい及びクロッティングェンザィムの基質として 5mM t—ブトキシカルボ二ルーし - 口イシル一グリシノレ一し一アルギニン一 p — 二トロアニリド (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA) (0.02mL) を加え、 37'C：、 20分間反応させ、遊離した P—二トロア二リンをジァゾカップリングによつて発色させた後、 545nm の吸光度を測定することによって行なわれる。そして、試料の代わりに水を用いたときの G因子活性化能（コントロール）を 100 %とした場合の相対活性により阻害活性を測定する。 G因子活性化能の阻害は、 G B P と ?ーグルカンとの結合によるものである（後の実施例参照）。よってこの G因子阻害活性を G B P活性とする。

また、本発明の G B P純度の検定は、ボリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE) (pH7.0〜8.0、 5〜7.5 %ゲルまたは pH4〜5、 5〜7. 5 %ゲル）、 SDS-PAGE(pH7.0〜8.0 、 6〜7. 5 %ゲル、 0. 1 〜0. 2 % S D S ) あるいは等電点電気泳動（IEF) を用いて行うことができる。

G B P の分子量測定は、 SDS-PAGE、セフアクリル S — 300 HR あるいはセル口ファイン G C L - 2000mなどによるゲルろ過、千涉光学系による沈降平衡、超遠心による沈降測定、粘度、光散乱、コロジオン膜等を用いる浸透圧測定、アミノ酸分折、レーザ一イオン化質量分折等により行うことができる。

ただし、本発明の G B Pは、特定の構造を有する ^ —グルカンに親和性を有する物質であり、さらに通常のタンパクに比べ分子量も非常に大きいことからダルコシド結合を有する不溶性担体によるゲルろ過や質量分折等の物理的測定の場合、真の値を得ることが困難である場合がある。そのため、このような干涉作用のない担体および条件を選択する必要がある。

また、本発明の G B Pの紫外部吸収スぺクトルを第 7図に示す。図に示されるように 280nm に吸収極大を示した。

また、本発明の G B Pの N末端アミノ酸配列は配列表配列番号 1 に示されるとおりである。

さらに、本発明は、前記したような変異体をも包含する。本発明の G B Pは、（ 1 → 3 ) — ? — D—ボリダルコシド構造を有する /? ーグルカンに特異的に結合し、カブトガニ G因子の活性化能も舍めた ^ ーグルカンの生物化学的性質および免疫薬理学的性質を中和する。さらに、直鎖の（ 1 → 3 ) - β - Ό —グルカン以外に（ 1 → 6 ) — ^ 一 D—あるいは（ 1 → 4 ) 一 /3 — D —等の分子内側鎮を有する分岐（ 1 → 3 ) — ^ 一 D—グルカンをも同様に中和する。

(抗体）

本発明の G Β Ρを選択的に認識する抗体（以下、抗 G Β Ρ抗体ということがある）は、精製した G Β Ρを抗原として得られる、この抗原に対する抗血清、ボリクローナル抗体およびモノクローナル抗体である。

本発明で使用するボリクローナル抗体の製造方法としては、該抗原をゥサギ、ャギ等の被免疫動物に投与し、得られた抗血清を、さらに精製する方法等を挙げることができる。被免疫動物に投与する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは抗体産生細胞を賦活するので望ましい。

本発明で使用するモノクローナル抗体の製造方法としては、該抗原をマウスまたはラットの腹腔内に投与した後に脾臓などを摘出し、該脾臓などから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハイプリドーマを樹立し、得られたハイプリドーマを試験管内にて連続増殖させ、さらに得られたハイプリドーマから上記抗原に対する特異抗体を継続的に産生する細胞株を選別し、この選別株を試験管内培養またはマウスの腹腔などの生体内にて培養することによって、モノクローナル抗体を大量に製造する方法等を挙げることができる。細胞融合で用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることができる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイプリドーマを得ることができる。

得られたポリクローナル抗体およびモノクロ一ナル抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニゥム等の中性塩による塩折、低温アルコール沈殺およびボリエチレングリコ一ルまたは等電点による選択的沈殺分別法、ないしは電気泳動、

D E A E—担体、 C M—担体等のイオン交換体やプロテイン A ならびにハイドロキシアバタイト吸着体による脱吸着法、ゲルろ過および超遠心法等を挙げることができる。

(測定法）

本発明の G B P は、（ 1 → 3 ) — /9 — D—ボリダルコシド構造を有するーグルカン（以下、（ 1 → 3 ) — 一 D—グルカンということがある）に特異的に結合することから、該 G B P と検体中の（ 1 → 3 ) — 9 — D—グルカンとを反応させて複合体を形成させ、該複合体を検出することで（ 1 "→ 3 ) — β - Ό —グルカンを測定することができる。

本発明の（ 1 → 3 ) — 9 一 D—グルカンの測定法として、例えば以下の方法を挙げることができる。

検体中の（ 1 → 3 ) — / S — D—グルカンを、固相に固着しているかあるいは固着しうる G B P と標識された G B P とで挟んだサンドイッチ状複合休を形成させ、タンパク質またはその変異体が固相に固着しうるものであるときは、該複合体を固相に固着させ、固相と液相とを分離した後、いずれかの相の標識物質を該標識物質に応じた方法で測定することで（ 1 → 3 ) — β — D—グルカンを測定する方法が挙げられる。

この（ 1 → 3 ) — 一 D—グルカンを測定する方法としては例えば、固相に固着された G Β Ρに、（ 1 — 3 ) — β — Ώ ーグルカンを舍む検体を添加して、該 G B P と（〗 → 3 ) — ー D ーグルカンとを結合させ、同時または次いで予め標識物質で標識された G B Pを添加して、該（ 1 → 3 ) — β — Ό ーグルカンを、該 G B P と標識された G B P とで挟み、サンドイッチ状複合体を形成させるか又は予め標識物質で標識された G B P と ( 1 → 3 ) 一 ^ 一 D—グルカンを舍む検体とを混合して、該標識された G B P と（ 1 → 3 ) — / S — D—グルカンとを結合させて結合体を形成し、この結合体を、固相に固着された G B Pに添加して、上記のサンドイッチ状複合体を形成させるかした後、該複合体が固着した固相と液相とを分離し、いずれかの相の標識物質（例えば固相に固着した該複合体の標識物質）を該標識物質に適した方法で検出して測定する方法等を挙げることができる。

本発明で使用する標識された G Β Ρは、 G Β Ρを既知法に従い標識物質（酵素（ペルォキシダーゼ、アルカリホスファタ一ゼ、 9 一ガラクトシダ一ゼなど）、放射性同位元素（ ^{1 ζ 5} I , ¹³¹1 , ³ Ηなど）、蛍光物質（フルォレセインイソチオシァネート、ゥンベリフヱロンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、または他の物質（ピオチン、アビジン（好ましくはストレブトアビジン）など）等の標識物質で直接標識して得ることができる。

G B Pの標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば. 酵素を標識する際にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架撟法、カルボジィミド法など、放射性同位元素で標識する際にはクロラミン Τ法、ラクトペルォキシダーゼ法など（続生化学実験講座 5 免疫生化学研究法、東京化学同人、 1986年発行、欧州特許第 0163041号明細書参照）から適宜選択できる。本発明の G B Pをマイクロプレート、ビーズ、チューブ、メンブレン、ラテックス、試験管、濾紙ならびにァガロース、ボリアクリルアミド、セルロース及びデキストランなどの不瑢性担体等の固相に固着する方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法など固定化酵素の調製法として一般的な方法

(固定化酵素、 1975年、講談社発行、第 9 〜75頁参照）を応用することができる。特に物理的吸着法は簡便な点で好ましい。なお、 G B Pが結合していない部分は、血清アルブミン、ゼラチン、乳タンパクなどによってブロッキングすることが好ましい。

本発明の測定法をさらに詳細に説明する。

先ず、固相に G B Pを固着する。固着方法としては、例えば G B Pを pH 9〜10のリン酸緩衝液又は炭酸緩衝液に溶解して固相に加え、 4 てで 6 〜14時間保存して固着させる方法等を挙げることができる。上記固着後、ブロック体を添加して、該 G B Pが固着していない部分をあらかじめ被覆しておく必要がある, ブロック体としては、例えば牛等から採取できる、血清アルブミン、血清又はミルク蛋白等が挙げられる。

次いで、上記 G B Pが固着した固相に、（1→ 3 ) — β — Ό 一グルカンを舍む検体を添加し、上記 G B Pに（ 1 → 3 ) — β — D —グルカンを結合させる。（ 1 → 3 ) 一 0— Ό —グルカンを含む検体としては、人、牛、ラット、マウス等の血液や体液の他、後述の検体をそのまま試料として使用することができる。

( 1 → 3 ) — ^ 一 D —グルカンを結合させた後、一般的には固相をツイ一ン（Tween) 系界面活性剤等を添加したリン酸緩衝液等で洗浄することが推奨される。

さらに、上記の（ 1 → 3 ) — /9 — D —グルカンが結合した固相に、標識された G B Pを添加して、（ 1 → 3 ) — — D —グルカンに該標識された G B Pを結合させる。この操作によって、 ( 1 — 3 ) — 9 — D—グルカンを上記 G B P と該標識された G B P とで挟みサンドィツチ状複合体を形成させる。

次に、該サンドイッチ状複合体の標識物質を測定して（ 1 — 3 ) — /9 — D—グルカンを定量する。標識物質の測定方法としては、標識物質により異なるが、例えば標識物質にピオチンを使用する場合は、例えばアビジンまたはストレブトァビジンを結合させた酵素を、上記サンドィツチ状複合体を形成させた固相または不溶性担体に添加し、酵素をアジビンを介して複合体に結合させ、該酵素の酵素反応による基質の変化を測定する方法を挙げることができる。

次いで、（ 1 → 3 ) — ） 5 — D—グルカン濃度と標識物質の測定結果との関係について検量線を作成し、未知試料についての測定結果と該検量線とを用いて、未知検体中の（ 1 → 3 ) 一 β — D—グルカンを定量する。

また、本発明の測定法としては、固定された（ 1 → 3 ) — β — D—グルカン（例えば細胞や組織中に存在する（ 1 → 3 ) — 9一 D—グルカン、物理的または化学的に不溶性担体等に結合された（ 1 → 3 ) — — D—グルカンなど）に標識物質で標識された G B Pを添加して、該（ 1 → 3 ) — /9 — D— グルカンと該 G Β Ρ との複合体を形成させて、複合体の標識物質により ( 1 → 3 ) — ^ 一 D—グルカンを検出あるいは定量する方法を挙げることができる。

さらに、本発明の測定法として、上記の固定された（ 1 → 3 ) — /9 一 D—グルカンに G B Pを添加して、該（ 1 → 3 ) — β — D—グルカンと該 G B P との複合体を形成させて、ついで G B Pを選択的に認識する抗体を添加して、さらに該抗体を特異的に認識する物質で標識して、該物質により（ 1 — 3 ) - β ~ Ό ーグルカンを検出あるいは定量する方法、又は該複合体を形成させた後、予め標識物質で標識した該抗体を添加して、該標識物質により（ 1 → 3 ) — 一 D—グルカンを検出あるいは定量する方法等を挙げることができる。

該抗体を特異的に認識する物質としては、例えば抗免疫グロブリン抗体を既知法に従い標識物質（たとえばピオチン、アビジン、酵素、ァイソトーブ、蛍光色素、化学発光物質等）で標識した化合物等を挙げることができる。

本発明のキットは、 G B P と標識された G B P とで構成される。本発明のキットを使用するに当り、該 G B Pを固相に固着させる工程が必要となる力あらかじめ該 G B Pを固相に固着させておくことにより、該工程を省略することができる。

また本発明のキットは、 G B P と G B Pを選択的に認識する抗体とから構成されが、さらに標識された抗免疫グロブリン抗体を加えてもよい。

さらにまた本発明のキットは、 G B P と標識された抗 G B P 抗体とから構成される。

本発明の上記キットに、さらに上記固相、標識物質を検知するための試薬、緩衝液、標準物質などを加えてキットとしてもよい。

(除ま)

本発明の G B P と試料中の（ 1 → 3 ) — ^ 一 D—グルカンとを反応させて複合体を形成させ、試料から該複合体を分離除去することで、（ 1 → 3 ) — /? — D—グルカンを除去することができる。該複合体の分離除去法としては、公知のタンパク質分離法を使用できる。しかし好ましくは、 G B Pを固着した担体さらに好ましくは不溶性担体に、検体中の（ 1 → 3 ) — β _ Ό —グルカンを接触させて、該 G B P と（ 1 → 3 ) 一 0 — Ό— グルカンとで複合体を形成させ、該複合体を分離除去する方法が好ましい。

このとき使用する担体の形状としては、膜状（フィルタ一形、中空糸形、チューブ形、平膜形等）、粒状、ラテックス、チップ状、粉末形、マイクロプレート状等の形態を有するものを举げることができる。担体は（ 1→ 3 ) — /? 一 D —グルカンフリ一であることが好ましい。

担体に G B Pを結合させるには、ボリスチレン系およびボリプロピレン系等の担体に物理的に G B Pを結合させるかあるいは、ポリアミド系、セルロース系、ァガロース系、ポリアクリルアミド系、デキストラン系、ビュルポリマー系（グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートとの多孔性共重合体）等の担体に G B Pを化学的に結合させることができる。化学的な結合法としては、担体の芳香族アミノ基を利用してジァゾカップリングさせるジァゾ化法、担体の水酸基を C N B r で活性化してペプチド結合させる C N B r法、担体のヒドラジン誘導体等を用いてぺプチド結合させる酸アジド法、ハロゲン等の反応性に富む担体の官能基を利用して蛋白質をァルキル化するアルキル化法、グルタルアルデヒドのような遊離のァミノ基と反応する架橋試薬によって担体と蛋白質の遊離のァミノ基の間を架橋する方法、カルポジイミド法、エポキシ活性化法、さらにこれらの方法を用いてスぺーサーを介して結合させる方法等の公知の結合法から担体の種類に応じて適宜に選択して G B Pの結合に利用することができる。

G B Pを結合した担体と（ 1 → 3 ) — /? 一 D — グルカンを舍む試料との接触方法は、公知の固液接触手段によればよく、例えば、フィルター状の担体に試料を通液させる方法；粒状の担体を充塡したカラムに試料を通液させる方法；マイク口プレート状の担体のゥュルに試料を入れ、一定時間放置した後、試料を分離する方法；任意の形状の担体を試料に添加し、一定時間振盪するか、静置し、通常の固液分離手段（濾過、遠心分離、吸引、デカンテーシヨン等）によって（ 1 → 3 ) — β — Ό — グルカンの除去された試料を得る方法等を一例として挙げることができる。

さらにカブトガ二 . ァメボサイト · ライセ一トを用いたリムノレス反応による E t 測定において、 L A Lまたは試料に該 G B Pを加えることによって、 β — グ）レカンに該 G B Ρが結合して複合体を形成し、これにより —グルカン感受性因子（ G因子）の活性化を阻害することを利用して、 L A L中の C因子系反応により /9 ーグルカンを舍む試料中の E t を、 9 ーグルカンの影響を受けることなく特異的に測定することができる。

このようにして本発明の G B Pは /9 ーグルカンや E t の検出及び測定試薬として用いることができる力く、さらに、 ^ 一グルカンは真菌細胞壁の構成多糖であり、 G B Pはこの多糖と結合し、真菌等の増殖に影響を与える可能性があるため、医薬、特に抗真菌剤としての開発が期待される。

本発明の（ 1 → 3 ) — ^ 一 D—グルカンの測定あるいは除去法は、血清、血漿、尿、髄液等の体液、非経口医薬品、輸液、注射用水、生物学的製剤等の検体試料中に舍有される（ 1 → 3 ) — 5 — D—グルカンの検出あるいは除去に用いることができる。また本発明のエンドトキシンの測定については、上記と同じ試料中に舍有されるェンドトキシンの検出に用いることができる。図面の簡単な説明

第 1 図は、実施例 1 によるカブトガニ血球抽出物のデキストラン硫酸一セファロース Cい 6B カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す。

第 2図は、第 1 図の G B P活性画分のセフアクリル S-300 HR クロマトグラフイーバターンを示す。

第 3図は、第 2図の G B P活性画分のセフアクリル S- 300 HR によるリク口マトグラムを示す。

第 4図は、セフアクリル S- 300 HR を用いたゲル濾過法による本発明の G B Pの推定分子量を示す。

第 5図は、 SDS-PAGEによる本発明の G B Pの推定分子量を示す。

レーン Aは、分子量マーカーを、レーン Bは、還元条件下における G B Pの分子量をそれぞれ示す。

第 6図は、等電点電気泳動分析法による本発明の G B Pの等電点を示す。

レーン Aは、 G B P の等電点を、レーン Bは、マーカーの等電点をそれぞれ示す。

第 7図は、本発明の G B Pの紫外部吸収スぺクトルを示す。第 8図は、本発明の G B Pの G因子活性化阻害能と G B P用量を示す。

第 9図は、本発明の測定法による（ 1 → 3 ) — ー D — グルカンの濃度と吸光度との関係を示す検量線である。発明を実施するための最良の形態

次に、実施例を挙げて本発明を実施するための最良の形態を示す。

なお、本実施例において用いる全てのガラス器具類は、乾熱滅菌（250て、 2時間）等により ^ -グルカンフリーにして使用した。また試薬類の一部は、活性炭処理後、 121 てて' 20〜90分間ォ一トクレーブ処理することにより /5 —グルカンフリーとした。以下の操作はすべて 5 —グルカンフリーで行った。

実施例 1

G B Pの精製および理化学的性質

〈 1 〉 G B Pの精製

日本産のカブトガニ（タキブレウス · トリデンタツス）血リンバ液 2.5L を 4 て、 l,500rpmで 10分間遠心し、その沈殺部分 (血球；ァメボサイト）約 50 g に 0.02M トリスー塩酸緩衝液 (pH 8.0) 500mLを加えホモゲナイザー（ボリトロン!？ RT 10 (商品名）、 Kinematica社製）にて均一に破砕および抽出し、 4 て . 10.000 XG で 30分問冷却遠心し、上澄液（ライセート） 450mLを得た。

この全量を 0.02M トリスー塩酸緩衝液（PH8.0) で平衡化したデキストラン硫酸一セファロ一ス Cい 6Bカラム（ 5 X23cm) に添加し、同一の缓衝液 1.0Lで洗浄後、 0.2M NaCl を舍む 0.02M トリスー塩酸緩衝液（PH 8.0) 1.5Lで溶出させ、次いで 0.45M NaClを含む 0.02M トリス —塩酸緩衝液（pH 8.0)、 1.5Lを用いて溶出させた。これらの溶出液は lOraLずつの分画として採取した < このようにして溶出された画分の活性を、 Obayashi らの方法 (Clin. Chini. Acta, 149, 55- 65 (1985) )に従って測定した。すなわち、プロクロッティングェンザィム、 B因子、 C因子および G因子の活性測定は 405nmの吸光度、コアギュローゲンの活性測定は 360nmの吸光度で行なった。また、 G B P活性は後述の方法（実施例 2- (4) 実験 3参照、なおコントロールは G B P の代わりに水を用いた）で測定した。結果を第 1 図に示した。

G B Pは、 0.45M NaC 1溶出画分に存在し、 9 —グルカンによる G因子の活性化を強く阻害した。この画分 310mL をナス型フラスコに集め凍結乾燥した。この凍結乾燥物を水 25mLに溶解し、その全量を、 0.05M トリスー塩酸緩衝液、 PH8.0 (0.5M NaCl 、 4mM CaCl ₂ 舍有）で平衡化したセファクリノレ S-300 HR カラム（2.2 X 95cm) に添加し、 18mL/ r の流速で溶出させ、 2.5 mLずつ分画した。 G B P活性は、上述の方法で測定し、 G因子活性化能の 50%阻害量を 100 単位とした。なお、以下 G B P活性の単位は uni ts あるいは単に u で表す。また、 B因子と C因子活性は Obayashi らの方法 (Cl in. Chim. Acta, 149, 55- 65 (1985) )に従い、 545nm の吸光度を測定して求めた。この結果を第 2図に示す。第 2図に示すように G B P活性がフラクション 70〜 88 (47.5niL) にみられた < この画分を凍結乾燥し、水 8mLで溶解し、前記と同様の緩衝液で平衡化したセフアクリル S-300 HR カラム（1.4 X 95cm) に再度添加し、 4.5mL/hrの流速で 0.93mLずつ分画し、 G B P活性を測定した。その結果を 3図に示す。第 3図に示すようにフラクション 81〜84に G B P活性がみられた。

このように G B P は、デキストラン硫酸一セファロ一スによるァフィ二ティークロマトグラフィー（第 1 図）の後、セファクリル S-300 H によるゲルろ過により、 B因子及び C因子とほぼ完全に分離することが可能であり（第 2図）、さらに同様の担体によるリクロマトグラフィ一によつて高純度の精製品を得ることができる。この精製工程の比活性を第 1 表に示した。なお、ライセート（粗抽出液）中では大量の G因子が存在しているため、 G B P活性を測定することが不可能で、このようなクロマトグラフィーを行ない、 G因子と相互分離したことにより、はじめて G B P活性および G B Pの存在を知り得たものである。なお、該 G B P は他の種のカブトガニ（例えばリムルス ' ポリフエムス、タキプレウス ' ギガス、カルシノスコノレピオス . ロッンディ力ウダ等）のライセートからも同様にして調製することができる

第 1 表

精製工程全タンク質全活性比活性収率精製度

ing) ) (u/mg) (%) (-倍）粗抽出液 4502.0

キス卜ラン硫酸- 60.8 2.13 X 10: 3.5 X 10³ 100 セファ π—ス Cし- 6B

セファク^ I S-300 11.9 6.31 X 10' 5.3 X 10³ 29.6 1.5 (第 1 回）

セフ 7ク ) I S-300 3.5 5.95 X 10' 1.7 X 10⁴ 27.9 4.9 (第 2 回）

( 2 ) G B P の理化学的性質

( 1 ) 分子量の測定

前記のセフアクリル S- 300 HR カラム（1.4 X 95cm、ベッド体積（Vt) = 146.2mいによるクロマトグラフィーで、 G B P活性のみられる画分の溶出位置（Ve)を箕出し、 High Molecular Weigh t Gel Filtration K i t (Pharmac i a製）の各タンパク質における見かけの分配係数（（Ve-V。/Vt-V。）、 Kavと表す）を分子量の対数に対してプロットした検量線により、 G B P の分子量を推定した。その結果、第 4図にみられるように、この G B P活性画分における G B Pの分子量は約 580 k ダルトンであった。

また、前記方法により精製した G B P (1.9 X 10³ uni ts/mL. タンパク質濃度： 245.2 g /mい 0,3mLを、分子量 5, 000カツトの遠心濾過チューブ（0.3mし容量、ウルトラフリー C3LCC、ミリポア製）に入れ、 4 'C下で遠心 U, 500 X g , 50分）後、濃縮液（0.03mいに水を加え、 0.3mLとした後、再度同様の条件で 0.03 mLになるまで遠心濾過濃縮を行った。このサンプルを、 Laemm 1 i の方法〔Nature， 227, 680-685 (1970) 〕に従い、 2 — メルカプトエタノールによる還元条件下で SDS- PAGEを行ない、クマシ一 ' ブリリアント ' ブルー R — 2 5 0 によって染色し、分子量を測定したところ、第 5図にみられるように約 170 k ダルトンを示した。

なお、マーカーとして次の 6 種類のタンパク（Boehringer Mannheim GmbH 製）を使用した。

a 2 一マクログロブリン（170 k) 、 |9 — ガラクトシダ一ゼ (116.4 k) 、フルクトース _ 6—リン酸キナーゼ（85.2 k)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（55.6 k)、アルドラーゼ（39.2 k)、トリオ一スリン酸ィソメラーゼ（26.6 k)。

( 2 ) 等電点の測定

さらに、 PhastGel IEF gradient 3-9 (Pharmacia製）を使用し、常法 ( In Gel Electrophoresis and Isoelectric Focusing of Proteins 236- 240 (1984) ) iこ従ヽ、 PhastSystem ™ (Pharmacia 製）を用いて等電点電気泳動を行った。泳動後のゲルは、クマシ一 ' ブリリアント ' ブルー R — 2 5 0 で染色した。その結果を第 6図に示した。第 6図に示されるように単一のバンドで、等電点（Pi)は、約 9.2 であった。

なお、マーカ一として次に示す 1 0種のタンパク（Pharmacia 製）を用いた。トリブシノーゲン（Pi 9.30)、レンズ豆レクチン一塩基性側バンド（pi 8.65) 、レンズ豆レクチン一中間バンド（pi 8.45) 、レンズ豆レクチン一酸性側バンド（Pi 8.15) 、ミオグロビン —塩基性側バンド（pi 7.35) 、ミオグロビン —酸性側バンド（P I 6.85) 、ゥシカーボニックアンヒドラ一ゼ B (p I 5.85)、 /9 一ラクトグロブリン（P I 5.20) 、大豆トリプシンィンヒビター（pi 4.55) 及びアミログルコシダーゼ（pi 3.50) 。 ( 3 ) G B Pの N末端アミノ酸部分配列の決定

G B Pの N末端ァミノ酸配列の決定を、 Matsudairaの方法

[J. Biol . Chem. , 262, 10035〜10038 (1987)] によって行なつた。 7.5 %のスラブゲルに G Β Ρ (1 · 7 X 10⁴ uni ts/mL) を、 1 レーンあたり O.OlmL負荷し、 30mAの定電流で泳動した。泳動後のゲルを切り出し、水で 5分間洗浄後、トランスファ一 ' バッファー〔 0.01 M 3 - (シクロへキシルァミノ） - 1 -プロノ、 ·ンスルホン酸（CAPSi ZlO^メタノール〕に 15分間浸した。その後トランスブロッティングサンドィツチ装置を用いて、ゲルからボリビユリデンジフルオリド（PVDF)膜（Bio-Rad Labora tor i es .製）に， 4 , 18時間（20V、定電圧）でタンパク質を転写した。 PVDF膜を取り出し、 5分間水洗し、 0.1 %クマシ一ブリリアントブル一 R-250/50%メタノールで 5分間染色後、水洗を 3度操り返し、クリーンルームで 1 時間乾燥させた後一 35てで保存した。目的のバンドを滅菌力ッターナイフで切り取り、常法に従って. 気相アミノ酸シークェンサ一（島津製作所， PPSQ-10)により分折した。

その結果、次の N末端のアミノ酸配列が得られた。

Lys-Ser-Gly-Phe-Ile-Leu-Thr-Ala-Pro— Lys-Ser-し eu-Thr-し eu -Gly-Arg-Asn-Asn-Arg-Leu-Asn-Leu-His-Leu-Phe-Asp-Ile-Asn -Thr-Asn-Gly-Phe-Xaa-Arg- Ile-Gly-Val-Lys-Asp-Gln-Asn-Asp -Phe- Asn-

(式中、 Xaa は自然界に存在するアミノ酸のいずれかを示す） ( 4 ) G B Pの紫外部吸収スペクトルおよび物質の性状

この画分の紫外部吸収スぺクトルを測定したところ、第 7図に示すとおり 280nm に最大吸収をもつ固有のスぺクトルが得られた。また、この画分を凍結乾燥したところ白色粉末が得られた。この白色粉末は水に易溶であった。

実施例 2

G B Pの作用の検討

( 1 ) G因子に対する阻害活性

実施例 1 で得られた精製 G B P (10, 20, 40, 60, 80 u g/mL) をそれぞれ 0.05mL とり、前記の方法に従って G因子に対する阻害活性（G B P活性）を求めた。その結果を第 8図に示す。第 8図に示す通り、 G B P活性は用量依存性であることが明らかになった。

( 2 ) G B Pの加熱処理による活性変化

実施例 1 で得られた精製 G B Pを、 100 てで 3分間処理した後の遠心（1.000 X g , 15分間）上清を、水で 10倍に希釈し、その 0.05mLを取り、前記の方法に従って、処理前後における G因子に対する阻害活性を比較した。その結果を第 2表に示す。

第 2 表

方法全活性（U) 残存活性（％) 対照 (無処理） 42.8 100

加熱 (100 'C、 3 分） 4.1 9.6 第 2表から G B P は易熱性（熱不安定性）タンパク質であることが判明した。

( 3 ) G B Pの結合特異性

G B P (1.6 X 10⁴ uni ts/niL) 0.05mLに、直鎖 ( 1 → 3 ) 一 β — D—グルカンおよび分岐（ 1 → 3 ) — /ff — D—グルカンを加え、前記した方法で G B P活性を測定し、残存活性を測定し阻害率を算出した。その結果を第 3表に示す。なお、ここで用いた直鎖（ 1 → 3 ) — 一 D—グルカンおよび分岐（ 1 → 3 ) — β — ϋ ーグルカンの入手先を以下に示す。

直鎖（1→3)— /? 一 D—グルカン：

ノ、'キマン（PachymanHAgri Biol . Chem. , 32, 1261 - 1269 (1968)に従い調製）

カート' ラン (Curdlan) (Alcaligenes faecalis var . my xogenes 由来、和光純薬工業（株）販壳）

カノレボキシメチノレカードラン（Carboxymethylated Curdlan； CMPS) (Phytochemistry, 1, 175- 188 (1962)に従い調製。置換度 0.63)

ノヾラミロン (Paramylon) (Eug 1 ena grac i 11 i s 由来、 Biochim. Biophys. Acta, 44, 16レ 163 (1960) に従い調製）

分岐（1→3) _ 9 — D—グルカン：

(1→6) , (1→3)— β — ϋ — グルカン：シゾフィラン（Shizoph ylla) (Sonifilan;科研製薬（株）販壳）、レンチナン（Len t i nan) (味の素（株）販壳）、ラミナラン（Laminaran) (Laminaria digi tata由来、シグマ社販売）、ラミナラン（Lam i naran)

araborea由来、ナカライテスク（株）販壳）

(1→4) , (1→3)— /? — D— グルカン：リケナン（Lichenan) ( Cetraria islandica由来、シグマ社販売）、大麦 /? — D—グルカン（Barley β -D-glucan) ( シグマ社製）

ラミナラン、カスレボキシメチノレカードラン、シゾフィラン (2 X 10"⁶£ Ζηιしのもの）、レンチナン（2X10—⁸ gZroLのもの）、リケナン、大麦 9 一 D— グルカンは蒸留水、ノ、'キマン、カードランは 0.1M NaOH水溶液、ノ、'ラミロン、シゾフィラン（1 X 10— ' g/mLのもの）、レンチナン（2X 10—'° g/mLのもの）は 0.3M NaOH水溶液にそれぞれ溶解し、蒸留水あるいは 0.01M NaOH水溶液で適宜希釈して使用した。

第 3表

グノレ力ン結合様式数平均グルカン阻害度ノ J ネ量港 } f又

(kD) (g mL) (%) パキ (J →3)- β -D 80 5X 10" ¹ ' 99.0

(0.1M NaOH) 万 t →3)- β - V 丄 D X 1丄 Π U - ¹ i y o . D

U*丄 Π N aUH

35 ¾ ί - π u 0 QQ

(] .→3) - β

ート n u、パラ ϋ ^(] →3) - β -D >118 2.5X 10'^{1 1} 99.2

^ u . π IM a u n /

K L . d l l t a 13 →6) , 0 ς · β 00 1 X丄 u ΰ， 0 由来） (1→3) - β -D (DW)

(E . ara bor ea に— 6), 16.8 1 X 10—⁷ 95.2 田米 ) ri→ u ¾■) P - u Uri)

[→6)₅ 7 C 0 9

7 c

( D .0 丄 X 1U Do . D ， o ) β -D (0.3M NaOH)

[→6), 2X 10'⁶ 60.6

(1→3) n

一 - D (DW;、レンチナン (] 1→6), 94.7 2 X 10- ' ⁰ 59.4

(1→3) a

P - U (.U . or! NaUH

(] 1→6), 2 X 10"⁸ 57.5

(1→3) β -D (DW) リケナン ί→4) , 22 7.5 X 10-⁷ 40.7

(1→3) β - D (DW)

L→4), >23.1 1.25x10 36.2

(1→3) 0 -D (DW)

DW NaOHは、試料の溶解液を示す。 DWは蒸留水、 NaOHは水酸化ナトリゥム水溶液を意味する。

また、 G B P (1.6 X 10² uni ts/mL) 0.025 mL に、 β — グ）レカン以外の各種多糖の試料 0.025mL を添加し 37' (：、 10分間加温後 lOOpg ZmLのバキマン 0.025mLを加え、さらに 37てで 10分間放置した。その後、 G因子（0.04mL)、プロクロッティングェンザィム（Pro CE) (0.02mい、 1(1 MgS0₄ (0.01mい、 2Mトリス —塩酸緩衝液（PH8.0) (0.01mい、 5mM Boc-Leu-Gly- Arg-pNA (0.02mL) を加え、 37'Cで 20分間反応させ、残存活性を測定し、阻害率を算出した。その結果を第 4 表に示した。なお、ここで用いた多糖の入手先を以下に示す。

(1→4)— /? — D—グルカン：カルボキシメチルセルロース

(Carboxymethy 1 eel lulose) (ナトリウム塩、ナラカイテスク

(株）販売）

(1→6) — /9 一 D — グルカン：ジロフォラン（Gyrophoran) (G^roghora esculent a ; ¾ J. Ferment. Techno 1. , 50, 388-396 (1971)に従い調製）

( 1 → 6 ) — or — D — グルカン：デキストラン（Dextran) (Leuconostoc sp.由来、分子量〜 40, 000、生化学工業（株）販壳）

(1→4) , (1→6) - ct - D — グルカン：ブルラン（Pullulan) (Pullularia pullulans由来、林原生物化学研究所販壳）

(1→2) , (1-→3) , (1→6) — or — D—マンナン：酵母 α — D — マンナン（シグマ社販壳）

(1— 3)— 5 — D—キシラン（Xylan)： (キシロースのボリダリコシド。 Caulerpa brachypus由来、 Nature, 187, 82-83 (1960) の方法に従い調製）

カルボキシメチルセルロース、デキストランおよびプルランは蒸留水で溶解、ジロフォランは 0. NaOH 水溶液で溶解、 a -D- マンナンおよびキシランは 0.3M NaOH 水溶液で溶解し、それぞれ蒸留水で適宜希釈して使用した。第 4表グルカン結合様式タ

力 ftiキシメチ Aセ ΛΠ—ス (1→4) - β -D 1 X 10-⁷ 1.5

(DW)

ジ Πフォラン (1→6) - β -D 2 Χ 10- " 1.1

(0.1M NaOH)

テキストラン (1→6) - or -D 1 X 10- 7 1.0

(DW)

ブルラン (1→4) , 1 X 10-⁷ 1.0

(1→6) - ar -D (DW)

酵母 a -D-マンナン (1→2)，（1→3) , 1 X 10"^B 1.2

(1→6) - a -D (0.3M NaOH)

キシラン (1→3) - 9 -D 1 X 10—⁷ 1.1

(0.3M NaOH)

DW. NaOHは、試料の溶解液を示す。 DWは蒸留水、 NaOHは水酸化ナトリウム水溶液を意味する。第 3表に示すように、直鎮（1—3) — )9 — D —グルカン以外にも、（1→6) , (1→3) — ? — D—及び（1→4) , (1→3) - β - Ώ - グルカンのような分技（1→3) — /9 — D —グルカンならびにカルボキシメチル化（1→3) — — D —グルカンに対する阻害活性が認められた。

また、（1→3) — 9 _ D—グルカン以外の構造を有する多糖の場合、上記したようにあらかじめ G Β Ρ と混合加温後、さらに (1→3) ー /9 — D —グルカンを添加し、どの程度（1—3) - β - Ό ーグルカン結合能、すなわち G因子に対する阻害活性が抑制されるかによって判定した。第 4表から明らかなように、カルボキシメチルセルロース（（1→4) — — D —）、ジロフォラン

((1→6) - β - Ό - ) 、デキストラン（（1→6) — cr — D —）、プルラン（（1→4) , (1→6) - a - Ό - ) 、酵母 or — マンナン

( (1→2) , (1→3) , (1→6) - a - Ό - ) 、キシラン（キシロー

2 スのボリグリコシド。（1→3)— 9 — D —) には全く阻害活性の抑制が認められなかつた。

( 4 ) G B Pによる G因子阻害作用の詳細な検討

実験 1 ： G因子 0.04mし、プロクロッティングェンザィム（p_ro CE) 0.02raL、 1M MgS0₄ 0.01mし、 2M トリス—塩酸緩衝液（pH8.0) O.OlraLs 50pg/niL パキマン（以下 BGということもある） 0.05mL を混合し、 37'Cで 20分間加温後、 G B P (1.6 X 10⁴ uni ts/mL) を 0.05mし、 5mM 基質（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA ；以下 Subとよぶこともある）を 0.02mLそれぞれ加え、 37てで 3分間反応させ、遊離 p —二トロアニリンを既知の方法（Tamura,H.ら， Thromb. Res. 27, 51-57 (1982)) に従い、ジァゾカップリングによって発色させた後、 545nm の吸光度を測定した。

実験 2 ： G因子 0.04ml に G B Pを 0.05mL加え、 37'C 10分間 ¾Π ¾ ¾ . 50pg/mし BG 0·05πιし、 ProCE (K02mし、 1M MgS0₄ 0.01 mL、 2M トリス一塩酸緩衝液（pH8.0) O.OlrnL. 5mM Sub を 0.02mL それぞれ加え、 37'Cで 20分間反応させ、（1) と同様にジァゾ力ッブリングによって発色させた後、 545ntn の吸光度を測定した。実験 3 ： BG 0.05ml に、 G B Pを 0.05m 1加え、 37て 10分間加温後、 G因子 0.04mL 、 ProCE 0.02mし、 1M MgS0₄ 0.01mL、 2H トリス一塩酸緩衝液（PH8.0) O.OlraL. 5mM Sub を 0.02mLそれぞれ加え、 37てで 20分間反応させ、（1) と同様に、ジァゾカップリングによって発色させた後、 545nm の吸光度を測定した。

実験 4 ： G因子 0.04mL に、 ProCE 0.02mL、 50pg/mL BG 0.05 mL、 1M MgSO* 0.01mし 2M トリスー塩酸緩衝液（pH8.0) O.OlmL. 5mM Sub 0.02mLの混合液に、 G B Pを 0.05mL加え、 37てで 20分間反応させ、遊離 P —二トロア二リンを（1) と同様にジァゾ力ップリングによって発色させた後、 545ηηι の吸光度を測定した。

(1) 〜（4) のそれぞれについて、 G B Pの代わりに水を用いたものをコントロールとして、 G因子活性化阻害率（％ ) を算出した。結果を第 5表に示す。

第 5表実験手順阻害度（％)

FG + BG + ProCE(37*C、 20分）

→ + GBP + Sub(37'C、 3 分）

FG + GBP(37*C、 10分） 37.5

→ + BG + ProCE + Sub(37*C、 20分)

BG + GBP(37'C、 10分) 100

→ + FG + ProCE 十 Sub(37'C、 20分)

4 FG + BG + GBP + ProCE +Sub(37*C . 20分） 33.4

FGは G因子、 BGはバキマン（（1— 3) - |？グルカン）、 Pro CEはプロクロッティングェンザィム、 GBP はデキストラン硫酸ーセファロース Cい 6B の 0.45M NaCl 溶出画分（本発明のタンパク質を含んでいる）、 S ubは基質（Boc-Leu- Gly-Arg-pNA) をそれぞれ示す。第 5表より、本発明のタンパク質（ G B P ) を、あらかじめ ( 1 → 3 ) 一 )5 — D —グルカンと混合し、加温（ 37て）することにより、著しく G因子活性化阻害能が高められることが示された。従って、これは従来より知られている低分子の水溶性ボリダルコシド ( G因子活性化阻害剤；国際公開 W090/02951 参照）、例えばラミナランオリゴ糖ゃカードランのギ酸水解物に δめられるような、 G因子活性化阻害剤が直接 G因子と結合すとによる ( 1 → 3 ) — ^ — D—グルカン（BG)との拮抗阻害ではなく、（ 1 → 3 ) — /9 一 D —グルカンと G B P との直接結合、すなわちレクチン様相互作用による G因子の活性化阻害と考えられ、本発明のタンパク質（ G B P ) の（ 1 — 3 ) — /? 一

D —グルカンへの直接結合が支持された。

これらのことより、 G B P は、（ 1 → 3 ) — 一 D —グルカンを引き金とする G因子系の制御及び調節、生体内における ( 1 — 3 ) — ^ 一 D—グルカンの輪送、真菌増殖の抑制等に重要な役割を担っていると考えられる。

実施例 3

G B Pに対する抗血清の調製及び精製

400 μ s /ml の精製 G B P水溶液 500 1 と等容量のフロイントの完全アジュバント（ャトロン（株））と混合した。これをゥサギ（ J W、雄、体重 1.8kg) 2匹に皮下注射した。 2週間毎に 4 回同様の感作を行った後、追加免疫として 100 g/mlの G B P水溶液 0.2mlを静脈注射した。最後の注射から 1 週間後、該ゥサギから全採血した。ひきつづき室温で 1 時間、 4 てで一晩放置後、 2000r_Pm で、 5分間遠心分離を行い、得られた血清 60 mlを 56てで 30分間加熱処理を行い非働化した後、防腐剤として 0.06 g のアジ化ナトリゥムを添加し（0.1% (W/V)) 、抗血清を得た。抗血清の抗体価はォクタロニ一二重拡散法で調べた。

さらに、該抗血清を硫酸ァンモニゥムによる塩折とプロティン A によるァフィ二ティ一クロマトグラフィーとによって常法に準じて精製し、精製免疫グロプリンを得た。

実施例 4

G B Pを用いた（ 1 → 3 ) — /? — D —グルカンの定量精製 G B P水溶液（400 g/ml) を 0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液（PH9.6) で 10³ 倍希釈した溶液 50 1 を /9 —グルカンフリ一 96穴マイクロプレート（トキシぺットプレート、生化学工業 (株）販売）に分注し、 4 てで 12時間放置することにより、該 G B Pをプレート固相に吸着（固着）させた。該溶液を吸い取り、 P B S緩衝液（以下、 P B S ) で 3 回洗浄した後、全てのゥエルを 5 %ゥシ血清アルブミン（ B S A ) をふくむ P B S でブロッキングし、 37てで 2時間加温した。引き続き、 0.1 %ッィーン— 20 (Tween-20) を舍む P B S (以下、 P B S — T W) で 3 回洗浄し、（ 1 — 3 ) — /9 一 D —グルカン溶液（0.1， 1, 10, 100, 1000ng/ml) 100 u 1 を加え、 37てで 2時間反応させた。次に P B S — T Wで 3 回洗浄し、ピオチン標識 G B P水溶液（0.2 / g/ml) 100 1 を添加し、 37· (：、 2時間反応させた後、ペルォキシダーゼ（ H R P ) 標識ストレブトァビジン（1〃 g/ml) 100 1を添加し、 37て、 2時間放置した。さらに、発色基質溶液 [( テトラメチルベンジジン 10mgおよび 30% H₂0_z 2 μ】を舍む 50mM酢酸緩衝液、 pH5.0(10ml)〗 100 u 1 を加え、室温で 10分間加温後、 2M硫酸 50 μ 1 を加えて反応を止め、 450nm の吸光度（対照： 630nm) をマイクロブレートリーダー（ゥエルリーダー SK601 、生化学工業（株）販売）で測定した。

( 1 → 3 ) 一 /9 一 D —グルカンの用量依存性（ G B P との反応性、検量線）を第 9図に示す。

実施例 5

G B Pを用いた（ 1 → 3 ) — /? — D —グルカンの検出

抗原として（ 1 → 3 ) — /9 — D —グルカンとゥシ血清アルブミン（ B S A ) とのコンジュゲート（Agric. Biol. Chem. , 54. 1953- 1959 (1990) によって調製した） 1.5 g を舍む抗原溶液 100 U 1 を 96穴の /5 —グルカンフリーマイクロプレート（トキシぺットプレート 96 F、生化学工業（株）販壳）のゥエルに加え、 4 てで 1 2時間放置して抗原をプレートにコートした。抗原溶液を吸い取り、リン酸緩衝溶液（ P B S ) で 3 回洗浄後、すべてのゥエルを 5 % B S Aを舍む P B S (以下、ブロッキング榕液）で満たし、 37てで 2時間加温した。ゥエル中のブロッキング溶液を除き、 0.1 %ツイーンー 20 (Tween-20) を舍む P B S (以下、 PBS-Tween-20と略す）で 3 回洗浄した。次いで、 1 mlの G B P水溶液 100 1 をゥエルに加え、 37てで 2時間インキュべ一卜した。ゥエルを PBS-Tween- 20で洗浄後、 1 :5000、 1 : 10000 および 1:50000の割合で P B Sで希釈した抗 G B P血清または正常ゥサギ血清をゥエルに加え、 37てで 2時間加温した。

PBS-Tween-20で洗浄後、 1:1000の割合で P B S で希釈したペルォキシダーゼ標識ヒッジ抗ゥサギ I g G血清を加え、 37てで 2 時間インキュベートした。ゥエルを PBS-Tween-20で洗浄後、発色基質溶液（テトラメチルベンジジン 1 Omgおよび 30 % H ₂ 0₂ 2 μ 1 を舍む 50mmol/l酢酸緩衝液、 _PH5.0 ( 10m 1 ) ) 100 u 1 を加え、室温で 10分間インキュベートした。 2 M硫酸 50 1 を加えて反応を止め、 660nm を対照として 450nra の吸光度をマイク口プレートリーダ一（ゥエルリーダー SK601、生化学工業（株）販売）で測定した。

抗 G B P血清を用いて上記のようにして、 G B P と（ 1 → 3 ) 一 9 一 D —グルカンとが直接結合することが実験的に証明され

( 1 → 3 ) — /9 — D —グルカンと G B Pの複合体に対するゥサギ抗 G B P血清の反応性の結果を第 6表に示す。

第 6表抗血清抗体の希釈率 450ηηιの吸光度抗 G B P血清 1 ： 5000 2.856

1 ： 10000 2.632

1 ： 50000 0.752

ゥサギ血清 1 ： 5000

(対照） 1 ： 10000 0.074

1 ： 50000 0.016 実施例 6

G B Pを用いた（ 1 → 3 ) — /5 — D —グルカンの除去

jS — D —グルカンフリ一の Sepharose 4B (フアルマシア製） 100ml をガラスフィルター（ # 2 ) に移し、 2 リットルの注射用蒸留水（以下、 DW) で吸引洗浄した後、 1 リットル容量のビ一力一に入れ、 DW200 mlを加えた。マグネチックスターラーで攪拌しながら、 ION NaOHによって ρΗ11〜12に調整し、次に DW500 m 1に溶解した臭化シアン（ C N B r ) 25 g を徐々に添加し、 pH が変化しなくなった時点で反応を終了させた。該 C N B r活性化 Sepharose 4B をガラスフィルターで濾過し、冷水 2 リットル， 0.1M NaHC0₃ 1リットルで洗浄した。この活性化 Sepharose 4B 10mlに 0.2 mg/ml になるように涑結粉末 G B P 2mgを加え、ローテ一ターで攬拌しながら 4 てで、 24時問処理した。反応後、残存する不純物（ィミドカーボネート体）を不活化するために、 0.2M トリス一塩酸緩衝液 PH8.0中で 5時間放置した。 G B P 固定化 Sepharose 4B 0.5g に（ 1 → 3 ) — ー D —グルカン溶液（0.1, 1.0, 10, 100 μ g/ml) を加え、マルチシエイカーで 8時間連続攬拌した。引き続き、 3000rpm 、 10分間の遠心後、上清 50 / I に（ 1 → 3 ) — ー D —グルカン特異的合成基質試 m (グルスぺシ一、生化学工業（株）販壳） 1 を加え、溶液に残存する（ 1 → 3 ) — ー D —グルカン量を測定した。担体フリーで同様の操作を行った場合を 100%として、本担体による（ 1 — 3 ) — 5 — D —グルカン除去率を算出した。 G B P固定化担体による（ 1 → 3 ) — 9 — D —グルカン除去試験として、結果を第 7 表に示す。第 Ί表

産業上の利用可能性

以上、述べたとおり、本発明の（ 1 → 3 ) — ）9 — D—グルカン結合性タンパク質及びそれを認識する抗体は、検体中のェンドトキシン、（ 1 → 3 ) — /9 — D—グルカン等を特異的に検出したりあるいは試料中の（ 1 → 3 ) — 9 — D—グルカンを効率的に除去したりすることができるのでこれらの物質の検出試薬あるいは除去剤として用いることができる。従って、検体や試料中のこれらの物質を検出し、それを無毒化するのに用いることができる。

さらに、本発明の（ 1 → 3 ) — — D—グルカン結合性タンパク質は、真菌細胞壁の主要構成多糖である（ 1 → 3 ) - β - D—グルカンと結合し、真菌の増殖を抑制する可能性が有り、医薬、特に抗真菌剤として開発が期待される。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 44

配列の型：アミノ酸

トボロジー直鎮状

配列の種類タンパク

起カブトガニ血球

配列

し ys Ser Gly Phe lie Leu Thr Ala Pro し ys 1 5 10

Ser Leu Thr し eu Gly Arg Asn Asn Arg し eu

15 20 Asn Leu His し eu Phe Asp lie Asn Thr Asn

25 30 Gly Phe Xaa Arg lie Gly Val し ys Asp Gin

35 40

Asn Asp Phe Asn

Claims

1. ボリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを示し、次の理化学的性質を有する（ 1 → 3 ) — /? — D —グルカンに特異的に結合するタンパク質またはその変異体。

青

約 170 k ダルトン（還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム一ボリアクリルアミドゲル電気泳動法）

(2) 等電点：約 9.2 囲

(3) 紫外部吸収スペクトル： 280nm に吸収極大を持つ

(4) 溶解性：水に易溶

(5) 物質の色：白色

2. N末端アミノ酸配列が次の配列を示す請求の範囲第 1 項記載のタンパク質またはその変異体。

Lys—Ser-Gly-Phe- I le-Leu-Thr-Ala—Pro-Lys-Ser-Leu-Thr- Leu-Gly—Arg— Asn-Asn-Arg-l^eu-Asn-l^eu-His-Leu— Phe-Asp- lle-Asn-Thr-Asn-Gly-Phe-Xaa-Arg- I le-Gly-Val-し ys-Asp - Gln-Asn-Asp-Phe-Asn-

(式中、 Xaa は自然界に存在するアミノ酸のいずれかを示す）

3. カブトガニ血球由来のものである請求の範囲第 1 項または第 2項記載のタンパク質またはその変異体。

4. 請求の範囲第 1 〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質またはその変異体を選択的に認識する抗体。

5. 請求の範囲第 1 〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質またはその変異体からなる（ 1 → 3 ) — /5 — D — グルカンの測定剤。

6. タンパク質またはその変異体が標識物質で標識されたものである請求の範囲第 5項記載の測定剤。

7. 請求の範囲第 1 〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質またはその変異体と請求の範囲第 4 項記載の抗体とからなる

( 1 → 3 ) — — D—グルカンの測定キット。

8. 抗体が標識物質で標識されたものである請求の範囲第 Ί項記載の測定キット。

9. 請求の範囲第 1 〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質またはその変異体と請求の範囲第 6項記載の測定剤とからなる（ 1 → 3 ) — /? 一 D—グルカンの測定キット。

10. 請求の範囲第 1 〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質またはその変異体と検体中の（ 1 → 3 ) — ^ — D—グルカンとを反応させて複合体を形成させ、該複合体を検出することを特徴とする、（ 1 → 3 ) — /9 — D—グルカンの測定法。

11. 複合体の検出が請求の範囲第 4 項記載の抗体を用いて行なう方法である請求の範囲第 10項記載の測定法。

12. 抗体が標識されているかあるいは標識されうるものである請求の範囲第 11項記載の測定法。

13. 検体中の（ 1 → 3 ) — β — Ό ーグルカンを、固相に固着しているかあるいは固着しうる請求の範囲第 1 〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質またはその変異体と標識物質で標識された請求の範囲第 1 〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質またはその変異体とで挟んだ、サンドイッチ状複合体を形成させ、タンパク質またはその変異体が固相に固着しうるものであるときは、該複合体を固相に固着させ、固相と液相とを分離した後、いずれかの相の標識物質を測定することを特徴とする（ 1 → 3 ) — /? — D—グルカンの測定法。

14. 請求の範囲第 1 〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質またはその変異体からなる（ 1 — 3 ) — ^— D—グルカンの除去剤。

15. タンパク質またはその変異体が担体に固着したものである請求の範囲第 14項記載の除去剤。

16. 請求の範囲第 1〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質またはその変異体と試料中の（ 1 → 3 ) — /? 一 D—グルカンとを反応させて複合体を形成させ、試料から該複合体を分離除去することを特徴とする、（ 1 → 3 ) — ー D—グルカンの除去法。

17. タンパク質またはその変異体が担休に固着されたものである請求の範囲第 16項記載の除去法。

18. 請求の範囲第 1〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質もしくはその変異体とカブトガニ ♦ ァメボサイト * ライセ一トとを混合するか、または試料と該タンパク質もしくはその変異体とを混合してから、該試料とカブトガニ · ァメボサイト · ライセ一卜とを混合することからなる該カブトガニ · ァメボライト · ライセート中に存在することがある G因子の活性化を阻害する方法。

19. ( 1 → 3 ) — D—グルカンを舍む試料中に含まれるェンドトキシンを、カブトガニ · ァメボサイト ' ライセートを用いたリムルス反応によって測定する際に、リムルス反応に先立って、試料と請求の範囲第 1〜 3項のいずれか 1 項に記載のタンパク質もしくはその変異体とを混合するか、または該ライセ一トと該タンパク質もしくはその変異体とを混合することを特徴とするェンドトキシンの測定法。