WO1995034642A1 - Nouvelles transferase et amylase, procede de production de ces enzymes, utilisation, et genes les codant - Google Patents

Description

明 ism

ma 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ及 び ア ミ ラ ー ゼ、 そ れ ら の 製造法及び利用、 並 び に該新規酵素類の遺伝子 術 分 野

本発明 は、 I 一 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ 、 そ の製造法 及 び該酵 を用 い たォ リ ゴ糖の製造法、 並 び に該酵素の 遺伝子及 びそ の利用、 1 i — 新規 ア ミ ラ ー ゼ、 そ の 製造法 及 び該酵素を用 い た α , <2 — ト レ ノヽ ロ ー ス の製造法、 並 び に該酵素の遺伝子及びそ の利用 に 関す る も の で あ る 。

よ り 詳 し く は、

I 一 本発明 は、 少な く と ち 兀末端か り 3 つ以上の グ ル コ ー ス残基が α — 1 , 4 結合であ る 3 糖以上の糖.を基 質 と し て 、 そ の還元末端の α 一 1 ， 4 結合を — 1 , a 一 1 結合に転移 さ せ る 作用 を有す る 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ と そ の製造法 に 関 し 、 詳 し く は

S. u 1 f 0 1 0 b a 1 e s 目 の古钿菌、 例 え ば

S u 1 f o 1 o b u s 属、 A c i d i a n u s 属等の細 蘭の産生す る 上記酵素 に 関す る も の

ま た、 本発明 は、 上記 の新規酵素を用 い た ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖等の新規な製造法 に 関 し 、 更 に詳 し く は、 原 料 と し て マ ル ト オ リ ゴ糖等を用 い た効率的で、 かつ高収 率な、 例え ば、 グル コ シ ル 卜 レ ノ、 α ー ス及びマ ノレ ト オ リ ゴ シ ル 卜 レ ノヽ ロ ー ス な ど の ト レ ノヽ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 の 製造 法 に 関す る 。

ま た 、 本発明 は上記の新規 ト ラ ン フ ヱ ラ ー ゼを コ 一 ド す る D N A 断片及び こ の D Ν Α 断片の遺伝子工学的 な 利 用 に 関す る 。

本発明 は、 少な く と も 還兀末端か ら 3 つ以上の糖 が グル コ ー ス 単位で構成 さ れ る 3 糖以上の糖を基質 と し 兀末端か ら 加水分解 し て主 に単糖及 び /又 は 2 糖を遊 離す る 活性を有す る 新規 ァ ミ ラ ー ゼ と そ の製造法 に 関す る 0 し く は、 本発明 は、 少な く と も 還元末 ¾側 の 3 糖 が グル コ ー ス単位で構成 さ れ、 該末端側の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グル コ ー ス 間の結合が α 一 1 ， a ― 1 ta 口 で、 該末 端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間の結合が a - 1 ,

4 結合であ る 3 fe以上の糖を基質 と し 、 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間の a — 1 ， 4 結合を加水分解 し 、 な ， L 一 ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 主要な 活性を有す る 新規 / ラ ー ゼ及びそ の 製造法 に 関す る 0 該酵素 は更 に基質の分 子鎖中 の 一 1 , 4 結合を ェ ン ド型で加水分解す る 活性 を 合わせ て有す る 新規な ァ ミ ラ ― セ j' め つ て、

S u 1 f 0 1 0 b u s 属 に 属す る 細菌 κ よ っ て産生 さ れ う る 新規な酵素で の る o 本酵茶 は デ ン プ ン糖ェ業、 繊維 ェ業、 食ロロ _ll ^ の産業 に お い て有用 で あ る 。

ま た 、 本発明 は、 上記新規 ノ ミ ラ ー ゼ と 、 上記新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ と を組み合わせて作用 さ せ る こ と を特 徴 と す る α , _α — ト レ ハ ロ ー ス の 製造法 に 関す る 。 詳 し く は、 デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 或 い は マ ル ト オ リ ゴ 糖各単独又 は マ ル ト ォ リ ゴ糖 の 混 合物 を 原料 と し て用 い ま た酵素 と し て本発 明 の 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ 一ゼ と ァ ミ ラ ー ゼ と を 用 い て 高収率で a , a 一 ト レ ハ ロ ー ス を 製造 す る 方法 に 関す る 。

ま た 、 本発 明 は 上記 の 新規 ァ ミ ラ 一 ゼ を コ 一 ド す る D Ν Α 断片及 び こ の D N A 断 片 の 遺伝子工学的 な 利用 に 関 す る 。

背 景 技 術

I . 酵素 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ の 背景技術

デ ン プ ン 、 及 び マ ル ト オ リ ゴ糖等の デ ン プ ン 分解物 に 作用 す る 糖転移酵素 に つ い て は 、 今 ま で に 様 々 な グ ル コ シ ゾレ ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ、 及 び サ イ ク ロ デ キ ス ト リ ン グ ル カ ノ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ （ C G T a s e ) な どが見 出 さ れて い る (生物化学実験法 2 5 、 澱粉 · 関連糖質酵素 実験法、 学会 出版セ ン タ ー 刊、 及 び B I 0 I N D U S T R Υ , V 0 1 . 9 、 N 0 . 1 ( 1 9 9 2 ) 3 9 一 4 4 な ど参照） 。 こ れ ら の 酵素 は ダ ル コ シ ル基 を α - 1 ， 2 、 a - 1 , 3 、 a - 1 , 4 、 - 1 , 6 位 に 転移す る 酵素 で あ る 力 、 α - 1 , α — 1 位 に 転移す る よ う な 酵素 は 未 だ に 知 ら れ て い な い 。 α — 1 , α — 1 結合 に 作用 す な 酵 素 と し て は 、 ト レ ハ ロ ー ス 分解酵素で あ る ト レ ノヽ ラ ― セ があ る が、 あ く ま で ト レ ハ ロ ー ス を 唯一の 基質 と す る 分 解酵素で あ り 、 そ の 平衡及 び反 応速度 は 分解反応側 に 偏 つ て い る 。

と こ ろ で近年、 オ リ ゴ糖 に は 保湿性、 保形性、 粘性、 褐変防止等 の 理化学 的特性、 及 び低 カ ロ リ ー 性、 抗 ぅ 食 性、 ビ フ ィ ズ ス 活性等 の 生理活性 が あ る こ と が見 出 さ れ て お り 、 そ れ に 伴 い マ ル ト オ リ ゴ糖、 分岐オ リ ゴ糖、 フ ラ ク ト オ リ ゴ糖、 ガ ラ ク ト オ リ ゴ糖、 キ シ ロ オ リ ゴ糖等 の オ リ ゴ糖 が開発 さ れ て き た （甘 味料 （ 1 9 8 9 年版） メ デ ィ カ ノレ リ サ ー チ 社刊、 月 刊 フ ー ド ケ ミ カ ノレ （ 1 9 9 3 年 2 月 号） 2 1 — 2 9 な ど参照） 。

オ リ ゴ糖 の う ち 、 還元末端 の 存在 し な い オ リ ゴ糖 に 関 し て は、 還元性 を 持 た な い シ ョ 糖 を 骨格 と し た 、 フ ラ ク ト シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ に よ り 生産 さ れ る フ ラ ク ト ォ リ ゴ糖等が あ る 。 ま た マ ル ト オ リ ゴ糖等 の デ ン プ ン 分解 物で、 還元末端 を 持 た な い オ リ ゴ糖 と し て は 、 前記 C G T a s e に よ り 生産 さ れ る サ イ ク ロ デ キ ス ト リ ン 、 a , /S — ト レ ハ ロ ー ス （ ネ オ ト レ ハ ロ ー ス ） 、 及 び化学 合成 に よ り 還元末端 に 水素添加 し た オ リ ゴ糖還元物 （ォ リ ゴ糖 ア ル コ ー ル） 等 が あ る 。 こ れ ら の 還元末端 の 存在 し な い オ リ ゴ糖 に は 、 従来 の 水飴 、 マ ル ト オ リ ゴ糖 に は な い 、 様 々 な 物理化学 的特性及 び生理活性が あ る 。 よ つ て 、 マ ル ト ォ リ ゴ糖 に お い て そ の 還元末端側 力く な - 1 , a - 1 結合 を 有 し て い る オ リ ゴ糖 に つ い て も こ の オ リ ゴ 糖が還元末端 を有 さ な い こ と か ら 、 上記 の 還元末端を 有 さ な い ォ リ ゴ糖が持つ よ う な 物理化学的特性及 び生理活 性 を 有す る こ と が期待 さ れ う る 。

と こ ろ で、 上記 し た よ う な 還元末端側 力く 一 1 ， a - 1 結 合 を 有 し て い る マ ル ト オ リ ゴ糖 は 、 α ， α — ト レ ハ ロ ー ス に グ ル コ ー ス 又 は マ ノレ ト ォ リ ゴ糖 が結合 し た ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 で あ る と 考 え る こ と がで き る 。 よ っ て こ の よ う な ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 は 、 還元末端 を 有 さ な ぃ ォ リ ゴ糖が有す る 物理化学特性及 び生理活性 に 加 え て 更 に α , α — ト レ ハ ロ ー ス に 見 ら れ る 様 な 特徴 的 な 活性 (例 え ば、 特表 昭 6 3 — 5 0 0 5 6 2 号参照） も 有す る こ と が期待 さ れ う る 。

ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 に 関 し て は 、 自 然界で は酵母内 に 痕跡量認 め ら れ る と い う 報告 （ B i 0 s c i .

B i o t e c h . B i o c h e m . , 5 7 ( 7 ) ， 1 2 2 0 - 1 2 2 1 ( 1 9 9 3 ) ) が あ る が こ れ の み で あ り 、 ま た酵素 に よ る 合成 も 報告 （ 1 9 9 4 年度 日 本農 rt - •33Γ化学大会、 講演要 旨集、 2 4 7 ) さ れて は い る が、 そ の.方法 は 原料 と し て 高価 な ト レ ハ ロ ー ス を 用 い る も の で あ り 、 安価 な 供給 は 期待 で き て い な い の が現状で あ る 。

と こ ろ で、 L a m a ら は 古細菌 の 一種 で あ る

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s s t r a i n M T — 4 株 （ D S M 5 8 3 3 株） の 菌 体抽 出 液中 に 耐熱性 の デ ン プ ン 分解活性が あ る こ と を 見 出 し て い る （ B i o t e c h . F o r u m . E u r . 8 4 , 2 - 1 ( 1 9 9 1 ) ) 。 彼 ら は 更 に 、 こ の 活性 は、 デ ン プ ン カ、 ら ト レ ハ ロ ー ス 及 び グ ル コ ー ス を 生成す る 活 性 で あ る と も 報告 し て い る 。 し 力、 し な 力く ら 上記 の 報告 に は グ ノレ コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 、 マ ル ト オ リ ゴ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 等 の ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 の 存在 に つ い て は 全 く 触 れ ら れて い な い 。 更 に 上記 の 菌株以外 の 古細菌 に つ い て の 検討 も 全 く な さ れ て い な い 。

ま た 、 ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 の 効率 の よ い 生産 の た め に は 、 こ の 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 効率 の よ い 入手法 の 確立が必要で あ る と い え る 。

従 っ て、 ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 の 大量生産 の た め に は こ の 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 更 な る 大量取得が望 ま れ る 。 そ の た め に は 、 こ れ ら 酵素 の 遺伝子 を 取得 し 、 遺伝 子工学的 に そ れ を生産 す る こ と が好 ま し い 。 さ ら に 、 遣 伝子 を取得 出 来れ ば、 蛋 白 工学の 技術 を 用 い て、 耐熱性 耐 p H 性 の 向上、 反 応速度 が増大 さ れ た酵素 を 得 る こ と も 期待 出 来 る 。 し か し な 力く ら 、 こ の よ う な 酵素 に つ い て の 遺伝子 ク ロ ー ニ ン グ に 関す る 報告 は 未 だ な さ れて い な い o

本発 明 は 、 マ ル ト オ リ ゴ糖等 の 糖 力、 ら 、 代表的 に は グ ル コ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス 及 び マ ル ト ォ リ ゴ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス 等 の ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 を 生成す る 反応 の 触媒作用 を 有す る 新規 な ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ と 、 そ の 製造法、 並 び に 該酵素 を 用 い て マ ル ト ォ リ ゴ糖等 の 原料か ら 効率的 かつ 高収率で、 代表 的 に は 、 グ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 、 マ ル ト ォ リ ゴ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 等 の ト レ ノヽ ロ ー ス ォ リ ゴ 糖 を 製造す る 新規 な 方法 を 提供 す る こ と を 目 的 と す る 。

本発 明者 ら は 、 古細菌 の ト レ ハ ロ ー ス 生成活性 に つ い て 鋭意検討 し た 結果、 S u 1 f o 1 o b a 1 e s 目 に 属 し 、 詳 し く は S u 1 f o 1 o b u s 属、

A c i d i a n u s 属 等 に 属 す る 広 い 範囲 の 古細菌 の 菌 体抽 出 液が、 マ ル ト ト リ オ ー ス を 基質 と し て ダ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を 生成す る こ と を 見 出 し た 。 こ の 際、 デ ン プ ン を 基質 と し た し a m a ら に よ る 活性測定法で は ト レ ハ ロ ー ス と グ ソレ コ ー ス の 生成 は 確認 さ れ た も の の 、 グル コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス な ど の ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖 の 生成 の 確認 は 非常 に 困難で あ る こ と がわ か っ た 。 ま た 、 古細 菌 の 菌体抽 出 液の 精製過程 に お い て L a m a ら が見 出 し た ト レ ハ ロ ー ス の 生成活性 は 消失 さ れ て し ま う こ と も 知 見 し 、 総 じ て こ の よ う な 活性 を 有す る 酵素 自 体 の 精製及 び特定化 は 実質上不可能で あ る こ と が わ か つ た。

こ の よ う な 状況下 に あ っ て 本発 明者 ら は 更 に 研究 を 重 ね'、 マ ル ト オ リ ゴ糖 （例 え ば マ ル ト ト リ オ ー ス ） を 基質 と し 、 ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖 （例 え ば ダ ル コ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス ） を 生成す る 活性 を 指標 と す る 新 し い 活性測定法 を 思考す る に 至 り 、 こ の 測定法 を 実施 し た と こ ろ ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ 糖 （例 え ば グ ノレ コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス ） の 検 出 が容易 に 可能で あ る こ と を 見 出 し 、 更 に 種 々 の 菌株 に 関 し て こ の 活性 を 有す る 酵素 の 精製 を試み た と こ ろ 、 驚 く べ き こ と に こ う し て 得 ら れ た 酵素 は 、 還元末端 か ら 3 つ 以上 の グ ル コ ー ス 残基力く な 一 1 ， 4 結合で あ る マ ノレ ト ト リ オ ー ス 以上の 糖 に 作用 し て 還元末端 の グ ル コ ー ス 残 基 を a — 1 ， α — 1 に 転移 さ せ 、 グ ノレ コ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス な ど の ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 を 生産す る 能力 を 有す る 全 く 新規 な ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ で あ る こ と を 知見 し た。 な お、 マ ル ト ォ リ ゴ糖 等 の 還元末端 の グ ル コ ー ス 残基が a - 1 , α — 1 に 転移 し た ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 の 存在 は 一 N M R 及 び ¹。 C 一 N M R に よ り 確認 し た （実施 例 I — 1 、 7 及 び 8 参照） 。

本発明者 ら は 、 更 に 、 こ の よ う な 新規酵素 を用 い る こ と よ り マ ル ト オ リ ゴ糖等 の 糖 か ら 、 大量 に 、 例 え ば、 グ ル コ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス 及 び マ ノレ ト ォ リ ゴ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス 等の ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 を 生産す る こ と がで き る こ と を 見 出 し 、 本発明 を 完成す る に 至 っ た。

本発明者 ら は 、 更 に 、 こ の よ う な 新規酵素 の 遺伝子を 早離 し 、 こ の 遺伝子 を 利用 し て 組換 え 新規 ト ラ ン フ ヱ ラ ー ゼを遺伝子工学的 に 生産す る 手法 を 、 今般、 確立 し た 1 I . 酵素 ア ミ ラ ー ゼ の 背景技術

ァ ミ ラ ー ゼ は デ ン プ ン を 加水分解す る 酵素 の 総称で あ り 、 そ の 中 で α — ア ミ ラ ー ゼ は α — 1 , 4 グ ノレ コ シ ド結 合 を ェ ン ド 様式で加水分解す る 活性 を持つ 酵素で あ る 。 α — ア ミ ラ ー ゼ は生物界 に 広 く 存在 し 、 ほ乳類 に お い て は 、 消化酵素 と し て 、 唾液、 膝液中 に 認 め ら れ る 。 植物 に お い て は 、 麦芽等 に 多 く 認 め ら れ る 。 ま た 微生物界 に お い て も 広 く 分布 し て お り 、 特 に

A s p e r g i 1 1 u s 属 に 属す る 力、 ひ 、

B a c i 1 1 u s 属 に 属 す る 細菌 の 産生す る α — ァ ミ ラ ー ゼ等が産業上使用 さ れ て い る （ ア ミ ラ ー ゼ、 中 村道徳 監修、 学会出版セ ン タ ー刊、 1 9 8 6 年） 。

こ れ ら の α — ア ミ ラ ー ゼ は 産業上様 々 な 用 途で使用 さ れ て お り 、 例 え ば、 デ ン プ ン 糖工業 に お い て は デ ン プ ン の 液化工程で、 ま た繊維工業で は糊抜 き 工程等で広 く 用 い ら れ て お り 、 工業的 に 大変重要 な 酵素で あ る 。 「酵素 応用 の 知識」 （小巻利章、 幸書房刊、 1 9 8 6 年） に よ れ ば、 デ ン プ ン の 液化工程で 重要 な こ と と し て、 1 ) デ ン プ ン 分子を で き る だ け 完全 に 溶かす こ と 、 2 ) 液化生 成物が次 の 糖化工程 の 目 的 に 対 し て好都合で あ る こ と 、 3 ) 液化生成物が老化 し な い 条件で あ る こ と 、 4 ) 経済 的見地 か ら で き る だ け 高濃度 （ 3 0 ~ 3 5 % ) で実施す る こ と な ど が挙 げ ら れ て い る 。 デ ン プ ン の 液化工程 は 例 え ば、 連続恒温液化法、 ジ ヱ ッ ト ク ッ カ ー 法 な ど で実施 さ れ、 通常 α — ア ミ ラ ー ゼ含有 の 、 高濃度 デ ン プ ン 乳液 を 瞬 間 的 に 高温 （ 8 5 〜 1 1 0 °C前後） に ま で上 げ、 デ ン プ ン が糊化、 膨潤 し は じ め る と 同 時 に 、 α — ア ミ ラ ー ゼ を作用 さ せ て 液化 し て い る 。 す な わ ち 、 デ ン プ ン の 液 化工程で は酵素が作用 で き る よ う に デ ン プ ン を 膨潤 さ せ る だ け の 十分 な 温度 を 必要 と し て い る 。 こ の よ う な 分野 で使用 し う る 酵素 と し て は 、 例 え ば、 上述の

A s p e r g i 1 l u s 属 に 属 す る 麹菌や

B a c i 1 1 u s 属 に 属 す る 細菌 の 産生す る 耐熱性 α — ア ミ ラ ー ゼ が挙 げ ら れ る 。 こ れ ら の 酵素 の 耐熱性 を 更 に 向上 さ せ る た め に 、 カ ル シ ウ ム を 添加す る 必要が あ る 場 合 も あ る 。 も し デ ン プ ン の 液化工程 で膨潤 し 、 開裂 し か け た デ ン プ ン ミ セ ル 力く α — ァ ミ ラ ー ゼの 作用 を 受 け ず に ひ と た び温度 が低下す る と 、 デ ン プ ン は再 び集 ま り 、 α — ア ミ ラ ー ゼ で 液化 さ れ に く い 新 し い ミ セ ル （難溶性 デ ン プ ン ） を 作 っ て し ま う 。 そ の 結果、 生 じ た 糖液 は 混濁 し 、 難濾過性 と な る と い う 問題が知 ら れて い る 。 こ の よ う な 事態 を 防止す る た め に 、 液化度 （ D E = D e∑ t r o s e E q u i v a l e n t) を あ る 程度 ¾ め る 方法力く と ら れ て い る 。 し か し 酵素法 マ ル ト ー ス の 製造工程 の よ う に 、 収率 を 高 く 維持す る た め に な る ベ く こ の D E を 低 く （す な わ ち 糖鎖 の 重合度 を 高 く ） 保つ 必要が あ る 場 合 も あ る 。 従 っ て、 デ ン プ ン の 液化工程後、 次工程 で酵素 を 更 に 作用 さ せ る 場合、 高温 を 維持 し た ま ま 作用 さ せ う る 耐熱性酵素を 用 い る な ら ば、 デ ン プ ン 濃度 が高 い 場 合で も 、 こ れ を 用 い て難溶性 デ ン プ ン を生成 さ せ る こ と な く 反応 を 進 め る こ と が可能 で あ り 、 ま た 同 時 に 、 微生物汚染 の 危険 も 低減 さ せ う る た め に 工程管理、 衛生管理 の 面か ら も 有利 で あ る と い え る 。 ま た 、 酵素 を 反復使用 す る た め に 、 固定化 し てバ イ オ リ ア ク タ ー と し て 利用 す る 場 合 に は 、 酵素力 高 い 安定性、 特 に 耐熱性 を 有す る こ と が重要 で あ る と い わ れて い る 。 す な わ ち 、 固定化 の た め に 比較 的高温 に さ ら さ れ る こ と 力く あ る が、 耐熱性が低 い も の で は 固定化操 作 中 に 失活 し て し ま う 恐れ が あ る カヽ ら で あ る 。 以上 の こ と か ら 耐熱性 の 高 い 酵素 は 、 例 え ば デ ン プ ン の 液化工程 な ど の 場合 を 含 め 各種 の 産業 に お い て非常 に 有利 に 用 い る こ と 力くで き 、 かつ 、 望 ま れ て い る と 言 え よ う 。

ま た 、 近年 ア ミ ラ ー ゼ を 含 み 耐熱性酵素の 取得 に 関 し て は好熱性、 高度好熱性細菌 の ス ク リ ー ニ ン グが広 く 行 わ れて い る 。 そ の 中 に は T h e r m o c o c c a 1 e s 目 、 P y r o c o c c u s 属 に 属 す る 古細菌 も 対象 と な つ て お り 、 α — ア ミ ラ ー ゼ を 産生す る と の 報告が あ る

Ap p l i e d a n d Env i r o nm e n t a l Mi c r o b i o l o gy, 1 9.8 5 — 1 9 9 1 ( 1 9 9 0 ) ； 特 開平 6 — 6 2 8 6 9 な ど） 。 ま た S u 1 f o 1 o b u s 属 に 属 す る 古細菌 も そ の 対象 に な っ て お り 、 耐熱性酵素 の 単離が報告 さ れて い る 。 こ こ.に お い て、 S u 1 f o 1 o b u s 属 に 属す る 古細菌 と は 、 分類学上、 高度高熱性 （温度 ： 5 5 °C 〜 8 8 °C の 範 囲 で生育） 、 好酸性 （ p H ： 1 〜 6 の 範囲 で生育） 、 好 気性、 硫黄細菌 （球菌 （不規則） ： 直径 0 . 6 〜 2 ^ m ) と し て 定義 さ れ る 古細菌 を い う 。 よ っ て、

S u 1 f o 1 o b u s 属 に 属 す る 古細菌が ア ミ ラ ー ゼを 産生 し う る な ら ば こ の ア ミ ラ ー ゼ も 耐熱性 を 有す る こ と が期待 さ れ る 。 L a m a ζ> は ra 菌 の 一種で あ る

S u 1 f 0 1 o b u s s ο 1 f a t a r i C U S s t r a i n M T 一 4 株 ( D S M 5 8 3 3 株） の 菌 体抽 出 液 に 耐熱性 の デ ン プ ン 分解活性が あ る こ と を 見 出 し て い る （ B i o t e c h . F o r u m . E u r . 8 , 4 , 2 - 1 ( 1 9 9 1 ) ) o こ の 文献 で は こ の 活性 は 、 デ ン プ ン カヽ ら α , a — ト レ ハ ロ ー ス 及 び グ ル コ ー ス を 生成 す る 活性 で あ る と 報告 し て い る o し か し な が ら こ の 活性 物質 に つ い て は 部分精製 し か し て お り ず、 活性本体 に つ い て の 特定 は し て い な い 。 ま た 活性 の 酵素学的諸性質 に つ い て も 全 く 解 明 し て い な い 。 本発 明者 ら の 研究 に よ れ ば （詳細 は後述す る ） 、 L a m a ら が デ ン プ ン に 作用 さ せ た 上 し 株 由 の 活性物質 は 複数 の 酵素の 混合体 で あ り ヽ こ れ を 用 い て得 ら れ た最終生成物が α , α 一 卜 レ ノヽ ロ ー ス と ダ ル コ 一ス で あ つ た の で あ る

と こ ろ で、 a — ゼ に は 初期 に ヨ ウ 素デ ン プ ン 反応 を 減少 さ せ る と い う 、 す な わ ち 、 a - 1 , 4 グ ゾレ 力 ン を ェ ン ド型 に 加水分解す る 活性 (液化活性） が あ る 。 こ の 液化型 ァ ミ ラ ー ゼ に も 反応機構上様 々 な 様式 が あ る す な わ ち 、 エ ン ド型 で加水分解す る 活性 と し て は 共通 し て い る が、 マ ノレ ト オ リ ゴ糖 の 分解パ 夕 一 ン に つ い て調べ て み る と 、 そ れ ぞれ特徴が め る と が知 ら れ て い る 。 例 え ば、 非還元末 側 か ら 特定 の 位置 を 認識 し て加水分解 す る も の 、 還元末端側 か ら 特定 の 位置 を認識 し て加水分 解す る も の が あ り 、 ま た 、 分解 さ れ た 主生成物が ダ ル コ ー ス で あ る も の 、 或 い は マ ノレ ト ー ス 又 は マ ル ト オ リ ゴ糖 で あ る も の な どが あ る 。 具体的 に は 、 す い 臓 由 来 の — ア ミ ラ ー ゼ は 還元末端 力、 ら 2 つ 目 、 或 い は 3 つ 目 の α — 1 ， 4 結合 を加水分解す る （澱粉 · 関連糖質酵素実験法 中 村 道 徳 · 貝 沼 圭 二 、 学 会 出 版 セ ン タ ー 刊 、 1 9 8 9 年） 。 ま た 、 枯草菌 由 来 の α — ア ミ ラ ー ゼ は 非還元末端 力、 ら 6 つ 目 あ る い は 還元末端か ら 3 つ 目 の α — 1 ， 4 結 合を 加水分解す る （酵素応用 の 知識、 小巻利章、 幸書房 刊、 1 9 8 6 年） 。 こ の よ う な α — ア ミ ラ ー ゼ の 反応様 式 の 差異 は、 各酵素 の 構造 に 起因す る と い わ れ て お り 、 こ れ ら の 現象 の 解釈 に つ い て は サ ブ サ イ ト 理論が提唱 さ れて い る 。 ま た転移活性、 縮合活性 を 持つ も の や 、 更 に は サ イ ク ロ デキ ス ト リ ン を生成す る よ う な 特殊 な α — ァ ミ ラ ー ゼ も 存在す る こ と が認 め ら れて い る 。

—方、 a , a: — ト レ ノヽ ロ ー ス は 、 2 分子 の グ ゾレ コ ー ス が そ の 還元性基 ど う し で α — 1 , α — 1 結合 し た も の で あ り 、 自 然界 の 多 く の 生物、 植物、 微生物 に 存在 し 、 生 体膜 の 凍結や乾燥か ら の 細胞保護や 、 昆虫 の エ ネ ルギ ー 源等、 多 く の 働 き を 持つ こ と が知 ら れ て い る 。 近年、 こ の a 、 a - ト レ ハ ロ ー ス は タ ン パ ク 質 の 凍結や乾燥 に 対 す る 安定化剤 と し て、 医薬品、 化粧品、 食品等の 分野で 検討 さ れて い る （特公平 5 — 8 1 2 3 2 、 特開昭 6 3 — 5 0 0 5 6 2 な ど） 。 し か し な 力 ら 現在 ま で の と こ ろ 安 価 な 大量生産法が確立 し て い な い た め か、 実際 に 利用 さ れ て い る 例 は ほ と ん ど な い

従来 の α , a 一 ト レ ヽ ロ ー ス の 製造法 と し て は 、 例 え ば、 酵母抽 出 に よ る 方法 （特 開平 5 — 9 1 8 9 0 、 特開 平 4 — 3 6 0 6 9 2 な ど） 、 酵母 に よ る 菌体内生産 に よ る 方法 （特開平 5 - 2 9 2 9 8 6 3 一 口 ッ パ特許 0 4 5 1 8 9 6 な ど：) 、 ス ク レ 口 チ ウ ム

( S c 1 e r 0 t i u m ) 属 、 或 い は リ ゾ ク ト ニ ア ( R h i z 0 c t o n i a ) 属 に 属 す る 微生物 に よ る 生 産法 （特開平 3 - 1 3 0 0 8 4 ) 等が試み ら れて い る 。 た だ' し 、 こ れ ら の 方法で は 菌体 内 生産 で あ る た め に 、 蘭 体破砕、 夾雑物 の 除去の 為 の 多 段階 の 精製工程 を 必要 と し て い る 。 ま た 、 ァ ル ス ロ パ ク タ ー

( A r t h r o b a c t e r ) 属 に 属 す る 微生物

( A g r i c . B i o l . C h e m . 3 3 N o . 2 1 9 0 , 1 9 6 9 S u z u k i T e t a 1 ) ノ カ ノレ デ ィ ア （ N o c a r d i a ) 属 に 属 す る 微生物 (.特開 昭 5 0 — 1 5 4 4 8 5 ) 、 グ ル 夕 ミ ン 酸生産菌 ( フ ラ ン ス 特許 2 6 7 1 0 9 9 、 特 開平 5 — 2 1 1 8 8 2 な ど） を 用 い た 発酵法 に よ る 菌体外生産 の 検討 も な さ れ て い る 。 更 に ま た 、 α , a - ト レ ロ ー ス の 生合成酵 素遺伝子 に よ る 生産 の 検討 も 試 み ら れ て い る （ P C T 特 許 9 3 — 1 7 0 9 ン 。 れ ら の 方法 は い ずれ も グ ル コ ー ス 等 の 糖源を用 い 、 か つ A T P U T P を エ ネ ノレギ ー と し て必要 と す る 代謝系 を 利用 す る も の で あ る 。 よ っ て 培養液か ら の な ， α — ト レ ハ ロ ー ス の 繁雑 な 精製工程 を 必要 と し て い る 。 ま た 更 に 、 ト レ ロ ー ス ホ ス ホ リ ラ ー ゼ を 用 い た方法 （特公 昭 6 3 — 6 0 9 9 8 ) 、 ト レ ヽ ラ ー ゼ を 用 い た 方法 （特開平 7 — 5 1 0 6 3 ) 等の 酵素法 に よ る 生産 の 検討 も 試み ら れ て い る が、 酵素 の 大量生産 酵素 の 安定性等 の 問題が あ る 。 以上 の よ う な 従来 の 方法 は い ずれ も 低収量、 精製工程 の 煩雑 さ 、 低生産量、 酵素 調製 の 煩雑 さ 等 の 問題が あ り 、 未 だ に 工業化 し う る 方法 は 確立 さ れ て お ら ず、 よ っ て、 よ り 効率の 良 い a , a - ト レ ハ ロ ー ス の 製造法 の 確立が強 く 望 ま れて い る の が現 状で あ る 。

, a — ト レ ハ ロ ー ス は上述の よ う に 自 然界 に 広 く 見 出 さ れ、 古細菌 に も そ の 存在が確認 さ れ て い る

S y s t e m . A p p 1 . M i c r o b i o l . 1 0 2 1 5 . 1 9 8 8 ) 。 具体 的 に は、 前述 し た よ う に 、 L a m a ら は古細菌 の 一種で あ る

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s s t r a i n M T — 4 株 （ D S M 5 8 3 3 株） の 菌 体抽 出 液 に 耐熱性 の デ ン プ ン 分解活性 が あ る こ と を 見 出 し て お り 、 そ の 生成物 中 に α α — ト レ ハ ロ ー ス の 存在 を 確認 し て い る （前掲 B i o t e c h . F o r u m . E u r . 8 , 4 2 — 1 ( 1 9 9 1 ) ) 。 こ の 文献で は こ の 活性 は デ ン プ ン か ら a , a - ト レ ノヽ ロ ー ス 及 び グ ル コ ー ス を 生成す る 活性 で あ る と 報告 は し て い て も 、 実際 に は 0 . 3 3 % 可溶性 デ ン プ ン を 基質 と し た 場 合 の 例 を 挙 げ て い る の み で 、 そ の 際生成 し た α , α — ト レ ノヽ ロ ー ス の 量 は 極僅 か な も の で あ り 、 し 力、 も a , α — ト レ ノヽ ロ — ス ： グ ル コ ー ス の 生成比 は 1 ： 2 で あ っ た。 従 っ て 大 量 の グ ル コ ー ス を 副生す る た め に そ の 分離 を必要 と し 、 a , α — ト レ ハ ロ ー ス の 大量生産法 .と し て の 目 的 を 達成 し う る も の で は 全 く な 力、 つ た の で あ る

本発 明者等 は 、 前述 し た よ う に 、

S u l f o l o b a l e s 目 に 属 す る 古細菌が、 少 な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上 の ダ ル コ 一 ス 残基力 α — 1 , 4 結合 で あ る 3 糖以上の 糖 を 基質 と し 、 そ の 還元末端の a - 1 , 4 結合 を α — 1 結 合 に 転移 さ せ る 作用 を 有す る ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 産生す る こ と を 見 出 し 、 更 に こ の 酵素 を 用 い た 、 マ ル ト ォ リ ゴ糖 力、 ら の グ ノレ コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 、 マ ノレ ト オ リ ゴ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス な ど の ト レ ハ 口 一 ス ォ リ ゴ糖 の 製造法 を 発 明 し た 。 な お 、 ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 と は 、 還元末端側 に — 1 , α — 1 結 合を 有 し て い る マ ル ト オ リ ゴ糖 を い う ο

ま た 一方、 従来知 ら れ て い る 各種酵素 の う ち で 、 マ ル ト オ リ ゴ糖の 還元末端力く 一 1 , a — 1 結 合 と な っ た ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖 を 、 そ の α — 1 , a 一 1 結合 の と.な り の α — 1 ， 4 結合 の 位置 で 特異的 に 加水分解 し て収率 よ く な ， α — ト レ ハ ロ ー ス を 遊離す る 作用 を 有す る 酵素 に 関 し て は 、 本発明者 ら の 知 る 限 り で は、 そ の よ う な 報 告 は 全 く な い 。 す な わ ち 、 卜 レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 の 還元 末端側 の 2 つ 巨 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の α — 1 ， 4 結 合を 特異的 に 加水分解 し て a , - ト レ ノヽ ロ ー ス を 遊離 す る こ と は 従来の ァ ミ ラ 一ゼで は 不可能で あ っ た 。 よ つ て、 デ ン プ ン 又 は デ ン プ ン 分解物分子鎖 中 の α — 1 , 4 結合を加水分解す る 活性 を 有す る と 共 に 、 上記 し た よ う な a , a 一 卜 レ ハ ロ ー ス 生成反応 を 触媒 し う る ア ミ ラ ー ゼ を 開発 し 得 た な ら ば、 a , a 一 ト レ ノヽ ロ ー ス の 大量生 産上益す る こ と は 多 大で あ ろ う

ま た 、 a , - 卜 レ ハ ロ ー ス の 大量生産 の た め に は、 こ の 新規 ァ ミ ゼ の 大量取得が望 ま れ る 。 そ の た め に は 、 こ れ り 素の 遺伝子 を取得 し 、 遺伝子ェ学的 に そ れ を生産す る こ と が好 ま し い 。 さ ら に 、 遺伝子 を 取得 出来 れ ぱ、 蛋 白 ェ学の 技術 を用 い て、 耐熱性、 耐 p H 性の 向 上、 反応迷度 が増犬 さ れ た酵素 を 得 る こ と も 期待 出来 る 本発明 は 、 デ ン プ ン 又 は デ ン プ ン 分解物分子鎖 中 の a 一 1 fcfc A.

， 4 ?π 口 を ェ ン ド型で加水分解す る 活性 を 有す る と 共 に 、 マ ル ト ォ リ ゴ糖 の 3S兀末端 力く a 一 1 , 一 1 結合 と な つ た 卜 レ ノヽ □ ー ス ォ リ ゴ糖 の 還元末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル ― ス 間 の a - 1 , 4 結合を特異 的 に 加水 分解 し て a , 一 卜 レ ノヽ ロ ー ス を 遊離す る 反応 を 触媒 し う る 新規 な ァ ー ゼ を 提供す る こ と 、 及 び該酵素 を製 造す る 方法 を 提供す る こ と 、 並 び に 該酵素を用 い て デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 或 い は マ ル ト オ リ ゴ糖等 の 安価 な 原料 力、'ら 効果 的、 かつ 高収率で、 a , 一 ト レ ハ ロ ー ス を 製造す る 新規 な 方法 を 提供す る こ と を 目 的 と す る 。

本発 明者 ら は 古細菌 の デ ン プ ン 分解活性 に つ い て鋭意 検討 し た 結果、 S u 1 f o 1 o b a 1 e s 目 に 属 し 、 詳 し く は S u 1 f o 1 o b u s 属 に 属 す る 広 い 範囲 の 古細 菌 の 菌体抽 出 液が、 耐熱性 の デ ン プ ン 分解活性 を 有す る こ と を 見 出 し た 。 そ の 際 デ ン プ ン の 分解 に よ っ て生成す る 糖 は 、 L a m a ら の 文献記載 に お け る の と 同様 に 、 主 に グ ル コ ー ス と a , a - ト レ ハ ロ ー ス で あ る こ と を 確認 し た 。 そ こ で、 更 に 種 々 の 菌株抽 出 液 に つ い て デ ン プ ン 分解活性 の 性質 を 調べ て み た と こ ろ 、 こ れ ら の 菌株が産 生す る 酵素が、 デ ン プ ン 分解活性や α , α — ト レ ハ ロ ー ス 生成活性 な ど の 酵素活性 の 点か ら 液化 ア ミ ラ ー ゼ、 グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ等 の ェ ン ド型、 ェ キ ソ 型 の 各種 ァ ミ ラ ー ゼ、 及 び ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ な ど に よ り 構成 さ れ て い る 酵素混 合体で あ る こ と を 発見 し た 。 し か も そ の 酵素活性 は 、 こ れ ら の 複数 の 酵素 に よ る 活性 の 相乗作用 に よ る も の で あ る こ と が わ か っ た 。 更 に 、 個 々 の 酵素 を精製 し よ う と し た 場合、 ヨ ウ 素デ ン プ ン 反応 に よ る 青色 の 減少 を 指標 と し た し a m a ら に よ る 活性測定法で は感度 お よ び 定量性が低 い た め か、 総 じ て こ の 様 な 酵素活性 を 有す る 酵素 の 精製 は 収率 の 点で低 く 、 し か も 操作が非常 に 困難 で あ る こ と がわ か っ た 。 ま た 本発明者 ら の 詳細 な 検討 に よ れ ば、 L a m a O 文献記載 の 部分精製方法で は 、 蛋 白 質 レ べ ノレ で は 全 く 精製、 単離が な さ れて い な い こ と が わ か つ た 。

の よ う な 状況下 に め 一し 本発 明者 ら は 更 に 研究 を 重 ね 、 ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 （例 え ば マ ノレ ト ト リ ォ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス ) を 基質 と し ゝ a , a ― ト レ ハ ロ ー ス を 遊離 す る 沽性 を 指標 と す る 新 し い 活性測定法 を 思考す る に 至 り 、 こ の 測定法 を 実施 し た と こ ろ 、 ァ ミ ラ ー ゼ活性 の 検 出 が容易 に 可能で あ る こ と を 見 出 し 、 更 に 種 々 の 菌株 に 関 し て こ の 活性 を 有す 酵素の 精製 を 試み た と こ ろ 、 最 終的 に ア ミ ラ ー ゼ の 単離精製 に 成功す る に 至 っ た 1 <— 単離精製 さ れ た ァ ミ ラ 一 ゼ に 関 し て酵素学的 な 諸性質 を 調ベて み た と こ ろ 、 驚 く ベ き こ と に こ う し て得 ら れ た酵 素 は、 デ ン プ ン ま た は デ ン プ ン 分解物 を ェ ン ド型で加水 分解す る 活 fe ¾r 有す る 他 に 、 デ ン プ ン 分解物 ま た は マ ル ト ォ リ ゴ糖 な ど を還元末端側 力、 ら 加水分解 し て単糖及 び /又 は 2 糖 を 生成す る 活性 を有 し 、 特 に還兀末 ½側 の 1 つ. 目 と 2 つ 目 の グ ル コ 一 ス 間 の 結合が α - 1 ， a 一 1 結 合で、 該末端側 の 2 つ 巨 と 3 つ 目 の グ ル コ 一 ス 間 の 結合 が a 一 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上 の 糖 （例 え ば ト レ ノヽ π 一 ス ォ リ ゴ糖） と の 反応性が、 そ れ ぞれ対応す る マ ル ト ォ リ ゴ糖 と 比較 し て 高 く 、 こ の よ う な 3 糖以上 の 糖 を基 質 と 、 JS元末端側 か ら 2 つ 百 と 3 つ 目 の グ ル コ 一 ス 間 の a - 1 , 4 結合を 加水分解 し て α , CL 一 ト レ ハ ロ ー ス を 遊離す る 活性 を 合 わ せ て有す る と い う 、 全 く 新規 な 作 用 機作 を 有す る 酵素で あ る こ と を 知見 し た 。

本発 明者 ら は 、 更 に 、 こ の よ う な 新規酵素の 遺伝子 を 単離 し 、 こ の 遺伝子 を 利用 し て 組換 え 新規 ア ミ ラ ー ゼ を 遺伝子工学的 に 生産す る 手法 を 、 今般、 確立 し た 。

発 明 の 開 示

I . 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ

本発 明 は 、 少 な く と も 還元 末端 か ら 3 つ 以上の ダ ル コ ー ス 残基力く α — 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上 の 糖 を 基質 と し 、 そ の 還元末端 の α — 1 ， 4 結合 を — 1 , α — 1 結 合 に 転移 さ せ る 作用 を 有す る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ

(以下、 本発明 の 新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ、 或 い は 単 に 本発 明 の 酵素又 は 本酵素 と も 称す る ） を 提供す る も の で i> ο

' 本発 明 は 、 ま た 、 他面 に お い て 、 す べ て の グ ル コ ー ス 残基 力く α — 1 ， 4 結 合で あ る マ ル ト オ リ ゴ糖 を基質 と し そ の 還元末端の α — 1 ， 4 結合を a - 1 , α — 1 結合 に 転移 さ せ る 作用 を 有す る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ を 提供 す る も の で あ る 。

本発 明 は 、 更 に 、 こ の よ う な 作用 を す る ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ産生能 を 有す る 細菌 を 培地 に 培養 し 、 培養物 よ り マ ル ト オ リ ゴ糖 を 基質 と し ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 を 生成 す る 活性 を指標 と す る 活性測定法 に 基づ い て、 該 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを単離精製す る こ と を特徴 と す る 本発 明 の 新規 ト ラ ン ス フ ラ ー ゼ の 製造法 を 提供す る も の で あ る 本発 明 は 、 更 に ま た 、 本発 明 の 酵素 を 用 い 、 少 な く と も 還元末端 か ら 3 つ 以上 の グ ル コ ー ス 残基 が α — 1 , 4 結 合で あ る 3 糖以上 の 糖 を基質 と し て作用 さ せ 、 少 な く と も 還元末端側 の 3 糖が グ ル コ ー ス 単位で構成 さ れ、 該 末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合力く α — 1 a - 1 結合で、 該末端側 の 2 つ 目 と .3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合が α — 1 , 4 結 合で あ る 糖 を 製造す る こ と を 特 徴 と す る 末端 の 2 糖 が α — 1 ， α — 1 結合で あ る 糖 の 製 造法を提供す る も の で あ る 。

本発 明 は ま た更 に 、 本発明 の 酵素 を 用 い 、 マ ル ト オ リ ゴ糖各単独又 は そ れ ら の 混 合物 を 基質 と し て作用 さ せ る こ と を特徴 と す る ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 の 製造法 を 提供 す る も の で あ る 。

ま た 、 本発 明 は新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ遺伝子の 提供 を そ の 目 的 と し て い る 。

ま た 、 本発 明 は前記遺伝子を 用 い た組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼお よ び そ の 製造法 の 提供 を 目 的 と し て い る さ ら に 本発 明 は 、 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを 用 い た 効率的 な ダ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 、 マ ル ト グ ル コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス な ど の ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 の 製造法 の 提供 を そ の 目 的 と し て い る 。

よ っ て、 本発明 に よ る D N A 断片 は 、 少 な く と も 還元 末端か ら 3 つ 以上の グ ル コ ー ス 残基が な - 1 , 4 結合で あ る 三糖以上 の 糖 を 基質 と し 、 そ の 還元末端の α - 1 , 4 結合 を な - 1 ， 結合 に 転移 さ せ る 作用 を 有す る 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ を コ 一 ドす る 遺伝子を 含 ん で な る も の 、 で あ る 。

ま た 、 本発 明 に よ る 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ は 上記 D N A 断片 の 発現産物 で あ る 。

さ ら に 、 本発 明 に よ る 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 製造法 は、

前記遺伝子で形 質転換 さ れ た 宿主細胞 を 培養 し 、 そ の 培養物 中 に 前記組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 生成 さ せ、 こ れ を 採取 す る こ と を 含ん で な る も の 、 で あ る 。

1 I . 新規 ア ミ ラ ー ゼ

本発明 は 、 少 な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の 糖 が グ ル コ ー ス 単位で構成 さ れ る 3 糖以上 の 糖 を基質 と し 、 還 元末端側 か ら 加水分解 し て主 に 単糖及 び Z又 は 2 糖 を遊 離す る 活性 を 有す る 新規 ァ ミ ラ ー ゼ を 提供す る も の で あ る o

，ま た 、 本発明 は 、 他面 に お い て、 少 な く と も 還元末端 側 の 3 糖が グ ル コ ー ス 単位で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結 合力く な 一 1 ， a - 1 結合 で、 該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合が a - 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上 の 糖 を 基質 と し 、 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の — 1 ， 4 結合を加水分解 し a , α — ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 主要 な 活性 を有す る 新 規 ァ ミ ラ ー ゼ を 提供す る も の で あ る 。

ま た 、 更 に 、 本発 明 は 、 別 の 面 に お い て、 上記 し た よ う な 活性を 有す る と 共 に 、 基質 の 分子鎖 中 の α — 1 , 4 結 合 を ェ ン ド型 で加水分解す る 活性 を 合わ せ有す る 新規 ァ ミ ラ ー ゼ を 提供す る も の で あ る 。

本発 明 は 、 更 に 、 上記 し た よ う な 本発 明 の ア ミ ラ ー ゼ を 産生す る 能力 を 有す る 細菌 を 培地 に 培養 し 、 培養物 よ り 、 ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 を 基質 と し て ， α — ト レ ハ ロ ー ス を生成す る 活性 を 指標 と す る 活性測定法 に 基づ い て 、 該 ア ミ ラ ー ゼ を 単離精製す る こ と を特徴 と す る 該 ァ ミ ラ ー ゼの 製造法 を 提供す る も の で あ る 。

本発 明者 ら は、 上記 し た よ う な 本発 明 の ア ミ ラ ー ゼ と 前述 し た 本発明 の ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ と を 、 デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 及 び マ ル ト ォ リ ゴ糖等の 糖質原料 に 組 み 合わ せ て作用 さ せ た と こ ろ 効率 的 に 、 かつ 高収率で α a — ト レ ハ ロ ー ス が生成す る こ と を 知見 し た。

よ っ て、 本発明 は 、 更 に ま た、 上記 し た よ う な 本発明 の ア ミ ラ ー ゼ と ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ と を 組み 合わ せ て用 い る こ と を 特徵 と す る a ， a - ト レ ハ ロ ー ス の 製造法 を 提供す る も の で あ る 。

ま た 、 本発 明 は新規 ア ミ ラ ー ゼ、 お よ び そ の 遺伝子の 提供 を そ の 目 的 と し て い る 。

ま た 、 本発 明 は前記遺伝子を 用 い た 組換え新規 ア ミ ラ ー ゼ お よ び そ の 製造法 の 提供を そ の 目 的 と し て い る 。 さ ら に 本発 明 は 、 組換 え 新規 ア ミ ラ ー ゼ を 用 い た α ， a - ト レ ハ ロ ー ス の 製造法 の 提供 を そ の 目 的 と し て い る 従 っ て 、 本発 明 に よ る ア ミ ラ ー ゼ遺伝子 は 、

( 1 ) 糖鎖 中 の α - 1 , 4 ダ ル コ シ ド結 合を ェ ン ド型 で加水分解す る 活性、

( 2 ) 少 な く と も 還元末端 力、 ら 3 つ 以上 の 糖が グ ル コ ー ス 単位で構成 さ れ、 かつ そ の 結 合が α - 1 ， 4 結 合で あ る 3 糖以上 の 糖 を 基質 と し 、 還元末端側 か ら 加 水分解 し て主 に 単糖 お よ び Ζ ま た は 2 糖 を 遊離す る 活性 、 お よ び

( 3 ) 少 な く と も 還元末端側 の 3 糖が グ ル コ ー ス 単位 で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合力く α - l 結合で あ り 、 かつ 該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合が α - 1 ， 4 結合で あ る 3 糖以上 の 糖 を 基質 と し 、 2 つ 目 と 3 つ 目 の ダ ル コ ー ス 間 の α - 1 ， 4 結合 を加水分解 し 、 a ， a - 卜 レ ノヽ 口 ー ス を 遊離す る 主要 な 活性 を 有す る 新規 ア ミ ラ ー ゼ を コ ー ド す る D Ν Α 配列 を 含ん で な る も の 、 で あ る 。

ま た 、 本発 明 に よ る 組換 え 新規 ァ ミ ラ ー ゼ は 上記遺伝 子 の 発現産物 で あ る 。

更 に 本発 明 に よ る α , α - ト レ ハ ロ ー ス の 製造法 は 、 上記組換え 新規 ア ミ ラ ー ゼ、 お よ び

少 な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上 の グ ル コ ー ス 残基が a - 1 , 4 結合で あ る 三糖以上の 糖 を 基質 と し 、 そ の 還 元末端の 4 結合を な - 1 ， α - l 結合 に 転移 さ せ る 作用 を 有す る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ と を 、

少 な く と も 還元末端 か ら 3 つ 以上 の グ ル コ ー ス 残基が - 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上 の 糖 と 接触 さ せ る 工程 を 含ん で な る も の 、 で あ る 。 図面 の 簡単 な 説 明

図 1 は 、 実施例 I 一 1 で得 た S u 1 f G I 0 b u s

s o 1 f a t a r i c u s KMl株 由 来 の 菌体抽 出 液 に よ る 生成物 の TSK- g e l Am i d e- 80 H P L C に よ る 分析結果を 示す グ ラ フ で あ o

図 2 は 、 実施例 I ― 2 で得 た S u 1 f 01 Q b u s

s o 1 i a t a r i c u s KMl株 由 来 の 本酵素 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 温度安定性 を 示す グ ラ フ で あ る 。

' 図 3 は 、 実施例 I — 2 で得 た S u 1 f Q 10 b u s

s o 1 { a t a r i c u s KMl株 由 来 の 本酵素 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの P H 安定性 を 示す グ ラ フ で あ る 。

.図 4 は 、 実施例 I 一 2 で得 た S u Π Q 10 b 11 s

s 01 f a t a r i c u s KMl株 由 来 の 本酵素 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 各温度 に お け る 反応性 を 示す ダ ラ フ で あ る 。

図 5 は、 実施例 I 一 2 で得 た S u 1 f Q 1 Q b u s

s o 1 { a t a r i c u s KMl株 由 来 の 本酵素 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 反応至適 P H を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 6 は、 実施例 I 一 2 で得 た S u 1 ί Q 1 Q b u s s o l i a t a『 i c u s KMI 株 由 来 の 本酵素 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ に よ る 、 マ ル ト ト リ オ ー ス 力、 ら の 反応生成物の ノ タ ー ン を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 7 は 、 実施例 I — 2 で 得 た S u Π Q I Q b u s

s 01 f a t a r i c u s KMI 株 由 来 の 本酵素 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ に よ る 、 マ ル ト テ ト ラ オ ー ス 力、 ら の 反応生成物 の パ タ ー ン を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 8 は 、 実施例 I 一 2 で 得 た S u 1 f c I Q b u s

s o 1 f a t a r i c u s KMI株 由 来 の 本酵素 ト ラ ン ス フ ラ ー ゼ に よ る 、 マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス 力、 ら の 反応生成物の パ タ ー ン を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 9 は 、 実施例 I 一 2 で得 た S u 1 f Q 1 Q b u s

s o I f a t a r i c u s KMi株 由 来の 本酵素 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ に よ る 、 マ ル ト ォ リ ゴ糖混合物 か ら の 反応生成物 の

AM I NEX HPX-42 A HPLC に よ る 分析結果 を 示す グ ラ フ で あ 0

図 1 0 は 、 実施例 11一 1 で得 た S u 1 ί G 10 b u s

s o 1 { a t a r i c u s K M 1株 の 粗酵素液 を 作用 さ せ た マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 力、 ら の 反応生成物 の TSK-g e l

Am i d e- 80 HPLC に よ る 分析結果 を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 1 1 は 、 実施例 11— 1 で得 た Su l i o l obu s

s 0 I f a t a r i c u s KMI株 の 粗酵素液 を作用 さ せ た 可溶性 デ ン プ ン か ら の 反応生成物 の AM1 NEX H P X- 42 A HPLC に よ る 分 析結果 を 示す グ ラ フ で あ る 。 図 1 2 は、 実施例 11— 2 で得た S u 1 f o 1 o b u s

s 01 f a t a r i c u s KMl株 由来の本酵素 ア ミ ラ ー ゼ の温度安定 性を示す グ ラ フ で あ る 。

図 1 3 は、 実施例 11一 2 で得た S u 1 f 010 b u s

s 01 f a t a r i c u s KMl株由 来の本酵素ァ ミ ラ ー ゼの p H 安定 性を示す グ ラ フ で あ る 。

図 1 4 は、 実施例 1 1一 2 で得た S u 1 f 010 b u s

s 01 f a t a r i c u s KMl株由 来の 本酵素 ァ ミ ラ ー ゼの各反応温 度 に お け る 反応性を示す グ ラ フ で あ る 。

図 1 5 は、 実施例 11— 2 で得た S u 1 ί 010 b u s

s 01 f a t a r i c u s KMl株由来の本酵素 ァ ミ ラ ー ゼの反応至適 p H を示す グ ラ フ で あ る 。

図 1 6 は、 実施例 11— 2 で得 た S u 1 f 010 b u s

s 01 f a t a r i c u s KMl株由来の本酵素ァ ミ ラ ー ゼ の各種基質 に対す る 反応性を示す ダ ラ フ で あ る 。

図 1 7 は、 実施例 11— 2 で得た S u 1 f 0 I 0 b u s

s 01 f a t a r i c u s KMl株由来の本酵素ァ ミ ラ ー ゼを作用 さ せ た マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス 、 了 ミ ロ ー ス D P — 1 7 、 可溶性 デ ン プ ン か ら の反応生成物の A M 1 N E X H P X- 2 A H P L C に よ る 分析結果を示す グ ラ フ で あ ·3 o

図 1 8 は、 実施例 I 1— 2 で得 た S u H o I o " s

s 01 f a t a r i c u s KMl株由 来 の本酵素 ァ ミ ラ ー ゼを作用 さ せ た マ ル ト ト リ オ シ ソレ ト レ ハ ロ ー ス か ら の反応生成物の T S K- e 1 Am i d e - 80 H P L C に よ る 分析結果を示す グ ラ フ で め る 。

図 1 9 は 、 実施例 I I一 2 で 得 た S u 1 " 1 o " s

s 01 f a t a r i c u s KM1株 由 来 の 本酵素 ァ ミ ラ ー ゼ を 作用 さ せ た マ ノレ ト ペ ン 夕 オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス 力、 ら の 反応生成物 の T S K- g e 1 Am i d e - 80 H P L C に よ る 分析結果 を 示 す グ ラ フ で あ る o

図 2 0 は 、 実施例 11— 2 で 得 た S u 1 " 10 b u s

s o 1 { a t a r i c u s K 1 株 由 来 の 本酵素 ァ ミ ラ ー ゼ を 可溶性 デ ン プ ン に 作用 さ せ た と き の ヨ ウ 素発色 の 消 失及 び デ ン プ ン 加水分解率 の 経時変化 を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 2 1 は、 実施例 11— 2 で得 た S u 1 ί 010 " s

s 01 f a t a r i c u s KM1株 由 来 の 本酵素 ァ ミ ラ ー ゼ を作用 さ せ た 放射活性 ラ ベ ル化 し た マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス か ら の 反応 生成物 の 放射活性 の 経時変化 を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 2 2 は 、 実施例 11一 2 で 得 た S U 1 f 010 " s

s 01 f a t a r i c u s KM1株 由 来 の 本酵素 ア ミ ラ ー ゼを 作用 さ せ た 放射活性 ラ ベ ル化 し た マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス か ら の 反応生成物 の 放射活性 の 経時変化 を 示す ダ ラ フ で あ o

図 2 3 は 、 ブ タ 陴臓 由 来 の α — ア ミ ラ ー ゼ の 各種基質 に 対す る 反応性 を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 2 4 は 、 ブ タ 脖臓 由 来 の α — ア ミ ラ ー ゼ を作用 さ せ た マ ノレ ト ペ ン 夕 オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス か ら の 反応生成物の T S K- g e 1 Am i d e - 80 H P L C に よ る 分析結果を 示す グ ラ フ で あ る 。

図 2 5 は 、 実施例 11— 2 で得 た S u Π ο 1 c b u s

s o H a t a『 i c u s KM 1 株 由 来 の 本酵素 ァ ミ ラ ー ゼ及 び ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 作用 さ せ た 可溶性 デ ン プ ン か ら の 反応 生成物の AM1 NEX H PX - 42 A H P L C に よ る 分析結果 を 示 す グ ラ フ で あ る 。

図 2 6 は 、 実施例 I — 1 2 で得 ら れ た

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来 の 新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ遺伝子 を 含 む p K T l 、 p K T l l お よ び ρ Κ Τ 2 1 の 挿入断片 の 制 限酵素地図 を 示 し た 図 で あ る 。

図 2 7 は 、 ρ Κ Τ 2 2 プ ラ ス ミ ド の 構築方法 を 示 し た 図で あ る 。

図 2 8 は 、 マ ル ト ト リ オ ー ス に 組換 え 新規 ト ラ ン フ エ ラ ー ゼ を 作用 さ せ た と き の 生成物 の TSK- g e l Am i d e - 80 HPLCに よ る 分析結果 を 示 し た 図で あ る 。

図 2 9 は 、 実施例 I 一 1 6 で得 ら れ た S u 1 f o 1 o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T し C 3 d 9 0 9 株 由 来 の 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ遺伝子を 含む P 0 9 T 1 の 挿入断片 の 制 限酵素地 図 を 示 し た 図 で あ る 図 3 0 は 、 ρ 0 9 Τ 1 プ ラ ス ミ ド の 構築方法 を 示 し た 図で あ る 。

図 3 1 は 、 S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 と S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株由 来の 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼの ァ ミ ノ 酸配列 の相同性を示 し た 図で あ る 。

図 3 2 は、 S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 と

s u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由来の 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ遺 伝子の塩基配列 の相 同性を示 し た 図で あ る 。

図 3 3 は、 マ ル ト オ リ ゴ糖混合物 に組換え新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼを作用 さ せ た と き の生成物の AM1 NEX HPX- 42 A HPLC に よ る 分析結果を示 し た 図であ る 。

図 3 4 は、 S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由来の新規ア ミ ラ ー ゼ遺伝子を含む P K A 1 の 挿入断片の制限酵素地図を 示 し た図で あ る 。

図 3 5 は 、 p K A 2 の 制 限酵素地 図 を 示 し た 図で あ る

図 3 6 は、 （ A ) は本発明 に よ る 組換え新規ア ミ ラ ー せを マ ル ト ト リ オ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス に作用 さ せ た と き の 生成物の分析結果を 示 し た 図で あ り 、 ま た （ B ) は本発 明 に よ る 組換え新規 ァ ミ ラ ー ゼを可溶性デ ン プ ン に作用 さ せ た と き の生成物の 分析結果を示 し た図で あ る 。

図 3 7 は、 本発明 に よ る 組換え新規 ア ミ ラ ー ゼを可溶 性デ ン プ ン に 作用 さ せ た と き の ヨ ウ 素発色の消失 と 、 デ ン プ ン 加水分解率 の 経時的変化 を 示す グ ラ フ で あ る 。 図 3 8 は 、 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来 の 新規 ア ミ ラ ー ゼ遺伝子 を 含 む P 0 9 A 1 の 挿入 断 片 の 制 限酵素地 図 で あ る 。

図 3 9 は 、 P 0 9 A 2 よ り P 0 9 A 1 の 作成方 法 を 示 し た 図 で あ る 。

図 4 0 は 、 S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株， S u l f o l o b u s s o 1 f a t a r i c u s K M 1 株 由 来 の 新 規 ァ ミ ラ ー ゼの ァ ミ ノ 酸配列 に つ い て相 同性 を比較 し た 図で あ る 。

図 4 1 は 、 S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株， S u l f o l o b u s s o l f a t a T i c u s K M 1 株 由 来 の 新 規 ァ ミ ラ ー ゼ遺伝子 の 塩基配列 に つ い て相 同性を 比較 し た 図で あ る 。

図 4 2 は 、 1 0 % 可溶性 デ ン プ ン に 実施例 I I 一 1 9 の 組換 え 新規 ァ ミ ラ ー ゼ お よ び実施例 I 一 2 0 の 組換 え 新 規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ を 作用 さ せ た と き の 生成物 の 分析 果 を 示 し た 図 で あ る 。 発 明 を 実施す る た め の 最良 な 形態 微生物 の 寄託

本発 明者 ら に よ り 自 然界 か ら 実質的 に 純粋 な 形で分離 し た 後述 の 新菌株 K M 1 株 は 、 平成 6 年 （ 1 9 9 4 ) 4 月 1 曰 に 受託番号 F E R M B P — 4 6 2 6 の 番号 の も と に 工業技術院生命ェ学技術研究所 に 寄託 さ れ て い る 。

本発 明 に よ る 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ遺伝子 を 含 む プ ラ ス ミ ド ρ Κ Τ 2 2 (後記す る 実施例 I 一 1 4 参照） で 形質転換 さ れ た 大腸菌株 E . c 0 1 i J M 1 0 9 / p K T 2 2 は ヽ 平成 6 年 （ 1 9 9 4 年 ) 1 0 月 2 1 曰 に 受託番号 F E R M B P - 4 8 4 3 の 番号 の も と に 、 ま た プ ラ ス ミ ド、 ρ 0 9 T 1 (後記す る 実施例 I — 1 6 参照） で形質転換 さ れ た 大腸菌 E . c 0 1 i J M 1 0 9 / p 0 9 T 1 は 平成 7 年 （ 1 9 9 5 年） 5 月 9 日 に 受託番号 F E R M Β Ρ - 5 0 9 3 の 番号の も と に 工業技術院生 命工学技術研究所 に 寄託 さ れ て い る 。

ま た 、 本発 明 に よ る 新規 ア ミ ラ ー ゼ遺伝子 を 含む ブ ラ ス ミ ド P K A 2 (後記す る 実施例 11一 1 9 参照） で形質 έ換 さ れ た 大腸菌株 E . c 0 1 i J M 1 0 9 / p K A 2 は 、 平成 6 年 ( 1 9 9 4 年） 1 0 月 3 1 日 に 受託番号 F E R Μ B P - 4 8 5 7 の 番号 の も と に 、 ま た プ ラ ス ミ ド、 Ρ 0 9 A 1 (後記 す る 実施例 11一 2 2 参照） で形質 転換 さ れ た 大腸蘭 E . c 0 1 i J M 1 0 9 / P 0 9 A 1 は 平成 7 年 （ 1 9 9 5 年） 5 月 9 日 に 受託番号 F E R M B P — 5 0 9 2 の 番号 の も と に 工業技術院生命工学 技術研究所 に 寄託 さ れ て い る 。

I . 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ

本発 明 の 新規 ト ラ ン ス フ ニ ラ ー ゼ を 産生す る 微生物

本発 明 に お い て 利 用 さ れ う る 古細菌 と し て は 、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s A T C C 3 5 0 9 1 ( D S M 1 6 1 6 ) 株、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株、 S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 （本発 明者 ら に よ り 自 然 界 か ら 実 質 的 に 純 粋 な 形 で 分 離 し た 後述 の 新 菌 株リ 、 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 ( D S M 6 3 9 ) 株、 A c i d i a n u s

b r i e r 1 e y i D S M 1 6 5 1 株等 を 挙 げ る こ と 力〈 で き る 。

本発 明 の 新規 ト ラ ン ス フ ニ ラ ー ゼ を 産生す る 微生物 は こ の よ う に 、 分類学上 S u 1 f o 1 o b u s 及 び

A c i d i a n u s 属 カ 属 す る

S u 1 f o 1 o b a 1 e s 目 に 属 す る か な り 広 い 範囲 の 古細菌 に 及ぶ と 考 え ら れ る 。 こ こ に お い て 、

S u 1 f o 1 o b a 1 e s 目 と は 、 分類学上、 高度好酸 性好熱性、 好気性、 硫黄細菌 （球菌） と し て 定義 さ れ る 古細菌 で あ る 。 A c i d i a n u s 属 に 属 す る 上記 の A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株 は 以前 は S u 1 f o 1 o b u s

b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株 と し て 分類 さ れ て い た 菌 で あ り 、 ま た 、 上記 の S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株 は 以前 は C a l d a r i e l l a a c i d o p h i l s と 命 名 さ れ て い た 菌 で あ る 。 よ っ て 、 こ の よ う な 事実 力ヽ ら 、 上記 の 古細菌 に 遺伝学 的 に 或 い は 分類学的 に 近縁 で あ り か つ 同 種 の 酵素 を 産生 し う る 菌 は す べ て 本発 明 に お い て 使用 で き る こ と は 言 う ま で も な い 。

S _ 1 _f _ 0 _ 1ー0 _b_u― s s 0 1 _f _ a _ t a_r _ι _ c u _s

K M 1 株

上記 に お い て 例 示 し た 微生物 の 中 で、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 は 本発 明者 ら が群馬県 の 温泉 か ら 分離 し た 菌株 で あ っ て、 次 の 様 な 性質 を 示す も の で あ る 。

( 1 ) 形態 的性質

菌 の 形、 大 き さ ： 球菌 （不規則） 直径 0 . 6 〜 2 m

'( 2 ) 生育最適条件

p H _: 3 〜 5 . 5 の 範 囲 で生育 し 、 最適生育 p H は 3 . 5 ~ 4 . 5

温度 ： 5 5 °C ~ 8 5 °C の 範囲 で生育 し 、 最適生育温度 は 7 5 °C ~ 8 0 °C

硫黄 を 代謝 で き る ( 3 ) 好気性、 嫌気性 の 区別 ： 好気性

以上 の 性質力、 ら 、 B e r g e y ' s M a n u a l o f S y s t e m a t i c

B a c t e r i o l o g y V o l u m e 3 ( 1 9 8 9 ) に 従 い 菌株 の 同 定 を 行 っ た 結果、 本菌株 は

¾ u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s に 属 す る 菌株で あ り 、 従 っ て本菌株 を S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 と 命名 し た 。

上記 の 菌株 の 培養 に あ た っ て は 、 培地 は 液体で も 固体 で も よ く 、 通常 は 液体培地 を 用 い た 振 と う 培養又 は 通気 撹拌培養が行 な わ れ る 。 こ の よ う に 、 培地 は生育 に 適す る も の で あ れ ば特 に 限定 さ れず、 例 え ば、

A m e r i c a n T y p e C u l t u r e

C o l l e c t i o n ( A T C C ) 発行

C a t a l o g u e o f B a c t e r i a a n d P h a g e s 1 8 版 （ 1 9 9 2 ) 及 び

D e u t s c h e S a m m 1 u n g v o n

M i k r o o r g a n i s m e n u n d

2 e 1 1 k u 1 t u r e n G m b H ( D S M ) 発行 C a t a l o g u e o f S t r a i n s 5 版 ( 1 9 9 3 ) に 記載 の S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s M e d i u m等 を 好 ま し く 用 い る こ と がで き る 。 更 に 糖源 と し て デ ン プ ン 、 マ ル ト オ リ ゴ糖等 を加 え て も よ い 。 ま た 、 培養条件 も 上記 の 生 育可能 な 温度及 び P H の も と で あ れ ば特 に 限定 さ れ な い 本発 明 の 新規 ト ラ ン ス フ ニ ラ ー ゼ を 産生す る 微生物 の 培 *

本発 明 の 新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ産生 の た め の 培養条 件 は 、 該 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 産生 し う る 範囲 内 で適宜 選択す れ ば よ い 。 液体振 と う 培養又 は 通気撹拌培養 の 場 合 は 各微生物が生育す る p H 、 培養温度 で、 2 日 〜 7 曰 間 の 培 養 が適 当 で あ る 。 培地 と し て は 、 例 え ば、

A m e r i c a n T y p e C u l t u r e

C o l l e c t i o n ( A T C C ) 発行

C a t a l o g u e o f B a c t e r i a a n d P h a g e s 1 8 版 （ 1 9 9 2 ) 及 び

D e u t s c h e S a m m 1 u n g v o n

M i k r o o r g a n i s m e n u n d

Z e 1 1 k u 1 t u r e n G m b H ( D S M ) 発行 C a t a l o g u e o f S t r a i n s 5 版 ( 1 9 9 3 ) に 記載 の S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s M e d i u m等 を好 ま し く 用 い る こ と がで き る 。 更 に 糖源 と し て デ ン プ ン 、 マ ル ト オ リ ゴ糖等 を加 え て も よ い 。 .

本発 明 の 新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ の 精製

上記微生物の 産生す る 本発 明 の 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼの 抽 出 は 、 ま ず上記の よ う な 培養方法 に よ り 得 ら れ た 培養物 か ら 公知 の 方法、 例 え ば遠心分離 に よ り 菌体 を 得 て、 こ れ を 適切 な 緩衝液 中 に 懸 濁 し 、 凍結融解、 超音波 処理、 磨砕等 に よ り 菌体 を 破砕 し 、 遠心分離 ま た は ろ 過 に よ り 該 ト ラ ン ス フ ラ ー ゼ を 含有す る 菌体抽 出 物 を 得 こ の 菌体抽 出 物 に 存在す る 本発 明 の 新規 ト ラ ン ス フ ラ ー ゼ の 精製 に は 、 公知 の 分離、 精製法を適 当 に 組 み 合 わ せ て行 う こ と が で き る 例 え ば 澱及 び溶媒沈澱 の よ う な 溶解性 を 利 用 す る 方法、 透析、 限外 ろ 過、 ゲ ル ろ 過及 び S D S — ポ リ ア ク リ ル 了 ミ ド ゲ ル電気泳動 の よ う な 分子量 の 差 を 利用 す る 方法、 イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 の よ う な 電荷 の 差 を 利用 す る 方法、 ァ フ ィ ニ テ ィ ー ク 口 マ ト グ ラ フ ィ 一 の よ う な 特異的親和性 を 利用 す る 方法、 疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 、 逆相 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 の よ う な 疎水性 の 差を 利用 す る 方法 、 更 に 等電点電 気泳動 の よ う な 等電点 の 差を利用 す る 方法等が挙 げ ら れ れ ら の 具体的 な 例 は 、 後述 の 実施例 I 一 2 〜 I 一

5 に 示す と お り で あ 取終的 に ネ ィ テ ィ ブ ポ リ ア ク リ ル ァ ミ ド ゲ ル、 S D S ポ リ ァ ク リ ル ァ ミ ド ゲ ル或 い は 等 ¾ h?-. 気冰動 に て単 ― ノ< ン ド を 示す酵素 を精製酵素 と し て得 る

上記 し た よ う な 各種 の 精製過程 に お い て分離 さ れ た酵 素或 い は酵素含有物 の 活性測定 に 関 し て は、 L a m a ら の 方法 に お け る 活性測定法で は デ ン プ ン を基質 と し て行 つ て お り 、 そ れ に よ れ ば、 ト レ ハ ロ ー ス と グ ル コ ー ス の 生成 は 確認で き る も の の 、 ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 の 生成 は 全 ヽ 検 出 で き ず 、 ま た 、 こ の 方法 で は 精製途 中 に お い て ト レ ノ、 Π ー ス 生成活性 さ え も 消失 し て確認 で き な く な る と い う 大 き な 問題が あ り 、 酵 ¾■性本体 の 精製、 特定 化 は 実質上不可能 で あ っ た と ろ が、 本発 明者 ら に よ り 、 マ ル ト ォ リ ゴ糖 （例 え ば マ ル h h リ オ ー ス ） を基質 と し 、 卜 レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖 （例 え ば グ ル コ シ ル 卜 レ ノヽ

Π 一ス ） を 生成す る 活性 を 指標 と す る 新 し い 活性測定法 を 採用 し た と こ ろ 、 初 め て 目 的 と す る 酵素 の 単離精製 が 可能 と な り 、 よ う や く に し て 、 本発 明 の 新規 ト ラ ン ス フ ェ フ 一ゼ活性本体 の 精製及 び特定化 を実現 し 得 た の で あ る ₀

本発明 の 新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ の 諸性質

本発 明 の 酵素例 と し て 、 S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株、 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株、 A c i d i a n u s b r i e r 1 e y i D S M 1 6 5 1 株 の 微生物が そ れ ぞ れ産生 し た ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ に つ い て そ れ ら の 酵素学 的 な 諸性質 を 下記の 第 1 表 に ま と め て示す。 な お、 表 中 の デ ー タ は 、 実施例 I 一 6 及 び 7 に 示 し た 具体例 に 基づ く も の で あ る 。 第 1 表

Sul folobus Su 1 fo 1 obus Sulfolobus Acidianus sol iatari cus so 1 { a t ar i cus acidocaldarius brierleyi 酵素特性 KM1 DSM5833 ATCC33909 應 1651

(1) 作用 ダルコ一スが 1, 4で結合したマルトトリオース以上の および ダルコ一スポリマーの還元末端側の 2糖を、 転移により 基質特異性 a-l, a -1で結合する。 マルトース、 ダルコ一スには作用 しない。

(2) 至適 Ρ Η 5.0 〜6.0 4.5 〜5.5 4.5 〜5.5 4.5 〜5.5

(3) 安定 ρΗ 4.0 -10.0 4.5 〜12.0 4.0 〜10.0 4.0 -12.0

(4) 至適- a¾ 6(！〜 80°C 70〜80°C 7卜 80^oC 70~80°C

(5) 安定性 85。C、 6 hr 80°C、 6 hr 80。C、 6 hr 85。C、 6 hr

91¾残存 残存 9fl¾残存 98¾残存

(6)

SDS-PAGE ?6000 75000 74000 74000 ゲル濾過 54000 56000 56000 135000

(.7) 6.1 5.3 5.6 6.3

(8) \ 5mM CuSO, 5mM CuS0₄ 5mM CuSO^ 5mM CuS0₄

100%阻害 100醒害 100腹害 100%阻害

： 経時変化

マ ' ル 卜 ト リ オ ー ス を基質 と し て用 い た場合 、 主反応で る グル コ シ ノレ 卜 レ ハ ロ ー ス の生成 と と も に 、 副反応 と し て マ ル ト ー ス 及 び グ ル コ ー ス が等 モ ル生成 さ れ た 。 マ ノレ ト テ ト ラ オ ー ス 以上 の 重合度 n を 持つ 糖で は 、 主 反応 と し て、 還元末端 の グ ル コ ー ス 単位 が α — 1 、 a - 1 結 合 し た 糖 が生成 さ れ、 同 様 に 副反 応 と し て等 モ ル ず つ の 重 合度 （ n — 1 ) 糖及 び グ ル コ ー ス が生成 さ れ た 。 註 2 ： 酵素作用 /酵素反応様式

還元末端が a - 1 , 4 結 合で グ ル コ ー ス 力く 3 つ 結 合 し た マ ル ト ト リ オ ー ス 以上 の 糖 の 還元末端 の 糖を 、 転移 に よ り α — 1 ， 一 1 で結合 さ せ る 活性 を 有す る 酵素 と 考 え ら れ る 。 ま た 基質濃度が低 い 場合、 及 び長時間反応 さ せ た 場 合等 に お い て は 、 副反応、 即 ち 、 グ ノレ コ ー ス ポ リ マ ー か ら グ ル コ ー ス を遊離す る 活性 も 有す る 。 こ の 詳細 は、 実施例 I - 7 の 具体例 に お い て示す通 り で あ る 。

以上、 本酵素 の 諸性質 を述べ た が、 酵素作用 酵素反 応様式 の と こ ろ で述べ た よ う に 、 本酵素 の 活性 は 、 還元 末端力く — 1 , 4 結合で グ ル コ ー ス 力く 3 つ 結合 し た マ ル ト ト リ オ ー ス 以上 の 糖 の 還元末端の 糖 を 、 転移 に よ り な

- 1 ， a - 1 で結 合 さ せ る と い う 活性 で あ り 、 こ れ は 全 く 新規 な 酵素活性 で あ る 。 但 し 、 以下 の 実施例 に お い て 明 ら 力、 な よ う に 、 こ の よ う な 酵素活性以 外 の 本酵素 の 諸 性質 に 関 し て は 、 菌株の 属或 い は種 の 違 い に よ り 若干 の 差違 が あ る 。 グ ノレ コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 及 び マ ノレ ト ォ リ ゴ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 等 の ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ 糖 の 製 造

本発 明 は、 本酵 い 、 少 な く と も 還兀 か ら 3 つ 以 上 の グ ル 3 ― ス 残基が α - 1 , 4 結合 で あ る 3 糖以 上 の 糖 を 基質 と し て作用 さ せ 、 少 な く と も 還 兀 末端側 の 3 糖が グ ル コ ― ス 単位で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル Z1 一ス 間 の 結 合が — 1 , a ― 1 合 で 、 該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合が a 一 1 , 4 結合で あ る 糖 を 製造す る こ と を 特徴 と す る 末端 の 2 糖が α , a 一 1 糸口 合で あ る 糖 の 製造法を 提供す る も の で あ る が 、 該本発明 の 製造法を 、 最 も 典型的 な 具体 例、 即 ち 、 グ ル コ シ ノレ ト レ ノ、 □ ー ス 及 び マ ル ト ォ リ ゴ シ ノレ 卜 レ ノヽ ο ― ス 等 の ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ 糖 の 製造法で も つ て以下説明す る

本発 明 に お け る グ ノレ コ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス 及 び マ ル ト ォ リ ゴ シ ル 卜 レ ノヽ □ ー ス 等 の ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 の 製造 法 は 、 古加柳 苗困 が産生す る 本酵素 に よ っ て、 マ ル ト オ リ ゴ 糖等 の 糖カヽ ら 、 典型的 に は 、 マ ル ト オ リ ゴ糖各単独又 は そ れ ら の 混合物 か ら 、 ダ ル コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 及 び マ ル ト オ リ ゴ シ ル 卜 レ ハ ロ ー ス 等 の ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ 糖 を 製造す る も の で あ る 。 従 っ て 、 古細菌 が産生す る 本酵素 が マ ル ト ォ リ ゴ糖等 の 糖 に 作用 可能 な 様態で あ る 限 り 、 本酵素 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ と マ ル ト ォ リ ゴ糖等の 糖 と の 接触の 様態 は特 に 限定 さ れ な い 。 具体 的 に は、 一般的 に 古細菌 の 菌体或 い は 菌体破砕物 か ら 粗酵素 を 得、 次 い で 各種精製工程 で得 ら れ た 精製酵素、 或 い は 各種精製手段 を経 て単離精製 さ れ た 酵素 を 直接 マ ル ト ォ リ ゴ糖等 の 糖 に 作用 さ せ れ ば よ い 。 或 い は 、 上記酵素 を 常法 に 準 じ て 担体 に 固定化 し 、 固定化 し た 酵素 と し て マ ル ト オ リ ゴ糖 等 の 糖 に 接触 さ せ て も よ い 。 な お 、 古細菌 の 複数種 か ら 得 た 二つ 以上 の 本酵素 を 共存 さ せ て、 マ ル ト オ リ ゴ糖等 の 糖 と 接触 さ せ て も よ い 。

上記 の 本発 明 の 製造法 に お い て代表的 な 基質原料 で あ る マ ル ト オ リ ゴ糖 の 混 合物 は 、 例 え ば デ ン プ ン を エ ン ド 型 ア ミ ラ ー ゼ、 枝切 り 酵素 な ど に よ る 分解或 い は 酸分解 に 処 し 、 少 な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上 の グ ル コ ー ス 残基が α — 1 ， 4 結合で あ る よ う に 適宜分解す る こ と に よ り 製造 し 得 る 。 そ の 際エ ン ド型 ア ミ ラ ー ゼ と し て は、 例 え ば、 B a c i 1 1 u s 属等 の ク テ リ ア 、

A s p e r g i 1 1 u s 属等 の か び、 麦芽等 の 植物 由 来 の 酵素等が利用 で き る 。 ま た 枝切 り 酵素 に つ い て は 、 例 え ば、 B a c i 1 l u s 属、 K l e b s i e l l a 属等 ク テ リ ア 由 来 の プ ル ラ ナ ー ゼ、 P s e u d o m o n a s 属 由 来 の ィ ソ ァ ミ ラ 一 ゼ等が利用 で き る 。 更 に こ れ ら の 酵素 を 組 み 合 わ せ て も 利用 で き る 。

マ ル ト オ リ ゴ糖等 の 糖 の 使用 濃度 は 、 用 い る 糖が溶解 さ れ う る 範囲 で あ れ ば、 本酵素の 比活性、 反応温度等 を 考慮 し て適宜選択す れ ば よ い 。 0 . 5 〜 7 0 % の 範囲 と す る の が一般的 で あ り 、 好 ま し く は 5 〜 4 0 % の 範囲 で あ る 。 糖 と 酵素 と の 反応 に お け る 反 応温度及 び p H 条件 は 、 本酵素 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 最適条件下で行 う こ と が好 ま し い 。 よ っ て 、 5 0 ~ 8 5 °C 程度、 p H 3 . 5 〜 6 . 5 程度 の 条件下で行 う の が一般 的 で あ り 、 好 ま し く は 6 0 〜 8 0 °C、 p H 4 . 5 〜 6 . 0 の 範囲で あ る 。

生成 さ れ た グ ノレ コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 或 い は マ ル ト オ リ ゴ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス 等 の ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 を 含 む反 応液 は 、 公知 の 方法 に 従 い 精製す る こ と が で き る 。 例 え ば、 得 ら れ た 反応液を イ オ ン 交換樹脂 に よ り 脱塩 し 、 活 性炭、 イ オ ン 交換樹脂 （ HS03型） 又 は 陽 イ オ ン 交換樹脂 ( Ca型） 等を分離剤 と す る ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ っ て 目 的 の 糖画分 を 分離 し 、 又 は 更 に 続 い て 濃縮 し 、 結晶化 す る こ と に よ り 、 高純度 の ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 を 得 る こ と がで き る 。

新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを コ 一 ドす る 遺伝子

本発 明 に よ れ ば、 更 に 上記 の 新規 ト ラ ン フ ユ ラ ー ゼを コ ー ドす る 遺伝子が提供 さ れ る 。

' 本発 明 に よ る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ を コ 一 ド し て い る 遺伝子 を 含ん で な る D N A 断片 と し て は 、 例 え ば 図 2 6 ま た は 図 2 9 に 示 さ れ る 制 限酵素地 図で表 さ れ る D N A 断片が挙 げ ら れ る 。

こ の D N A 断片 は、 S u 1 f o 1 o b a 1 e s 目 に 属 す る 古細菌 か ら 得 る こ と が 出 来、 好 ま し く は S u 1 f o 1 o b u s 属 に 属 す る 古細菌、 よ り 好 ま し く は 後記す る S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 ま た は

S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 力、 ら 単離す る こ と 力く 出 来 る 。

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 お よ び S u 1 f o 1 o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 力、 ら の そ の 好 ま し い 単離法 に つ い て は 、 後記す る 実施例 に お い て詳細 に 説 明 さ れ て い る 。

こ の D N A 断片 を 取得可能 と 思わ れ る 起源 の 具体例 と し て は 、 さ ら に S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s D S M 5 3 5 4 抹、 D S M 5 8 3 3 株、 A T C C 3 5 0 9 1 株、 A T C C 3 5 0 9 2 株、 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 4 9 4 2 6 株 S u l f o l o b u s s h i b a t a e D S M 5 3 8 9 、 A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M l 6 5 1 株等 を 挙 げ る こ と がで き る 。 こ れ ら の 古細菌 が、 本発明 に よ る D N A 断片 の 起源 と な り う る こ と は 、 後記す る 実施例 I — 1 7 の ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ 一 シ ョ ン 試験 に お い て 、 S u l f o l o b u s

s o 1 f a t a r i c u s K M 1 株 由 来 の 新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ遺伝子が、 こ れ ら 古細菌 の 染色体 D N A と ハ イ プ リ ッ ド を 形成す る こ と 、 さ ら に は、 上記 し た よ う に 酵素 自 体の 性質 も 酷似 し て い る こ と を 示 し て い る こ と か ら も 明 ら か で あ る 。 更 に こ の 実施例 の 結果 は、 本発明 に よ る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ遺伝子が、

S u 1 f 0 1 0 b a 1 e s 目 に 属す る 古細菌 に 特異的 に 高度 に 保存 さ れ て い る こ と を 示 し て い る と い え る 。

本発 明 の 好 ま し い 態様 に よ れ ば、 本発明 に よ る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ を コ ー ド し て い る 遺伝子 の 好 ま し い 具 体例 と し て、 配列番号 2 ま た は 4 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配 列 を コ ー ドす る D N A 配列 を 含ん で な る D N A 断片が提 供 さ れ る 。 さ ら に 、 配列番号 2 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 を コ ー ドす る D N A 配列 の 好 ま し い 具体例 と し て は、 配 列番号 1 に 示 さ れ る 塩基配列 の 3 3 5 番か ら 2 5 1 8 番 ま で の 塩基配列が挙 げ ら れ る 。 配列番号 4 に 示 さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 を コ ー ドす る D N A 配列 の 好 ま し い 具体例 と し て は 、 配列番号 3 に 示 さ れ る 塩基配列 の 8 1 6 番か ら 2 8 5 5 番 ま で の 塩基配列 が挙 げ ら れ る 。

—般 に 、 夕 ン パ ク 質の ァ ミ ノ 酸配列が与え ら れれば、 そ れを コ ー ドす る 塩基配列 は 、 い わ ゆ る コ ド ン 表 を参照 し て容易 に 定 ま る 。 よ っ て配列番号 2 ま た は 4 に 示 さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 を コ ー ド す る 種 々 の 塩基配列 を適宜選択 す る こ と が可能で あ る 。 従 っ て、 本発明 に お い て 「配列 番号 2 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸を コ ー ドす る D N A 配列」 と は、 配列番号 1 に 示 さ れ る 塩基配列 の 3 3 5 番か ら 2 5 1 8 番 の 配列 を 有す る も の 、 お よ び そ の 縮重関係 に あ る コ ド ン が使用 さ れ て い る 以外 は 同一 の 塩基配列 を 有 し か つ 配列番号 2 に 示 さ れ る ァ ミ ノ 酸 を コ ー ド す る 塩基配列 を も 意味す る も の と す る 。 ま た 「配列 番号 4 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 を コ ー ドす る D N A 配列」 と は 、 配列番号 3 に 示 さ れ る 塩基配列 の 8 1 6 番 か ら 2 8 5 5 番 の 配列 を 有 す る も の 、 お よ び そ の 縮重 関係 に あ る コ ド ン が使用 さ れ て い る 以外 は 同一 の 塩基配列 を 有 し かつ 配列番号 4 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 を コ ー ドす る 塩基配列 を も 意味す る も の と す る 。

さ ら に 、 後記す る よ う に 本発明 に よ る 新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ に は、 配列番号 2 ま た は 4 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 配列 の 等価配列 を も 包含す る も の で あ る 。 従 っ て、 本発 明 に よ る D N A 断片 に は 、 さ ら に こ の 等価配列 を コ ー ド す る 塩基配列 も 包含 さ れ る 。

な お、 配列番号 1 ま た は 3 に 示 さ れ る 塩基配列 と 相 同 性 を 有す る 配列 の 存在 に つ い て 、 塩基配列 デ ー タ バ ン ク ( E M B L ) を通 じ て、 配列解析 ソ フ ト ジ ヱ ネ テ ィ ッ ク ス （ ソ フ ト ウ ェ ア 開発） を 用 い て調べ た 結果、 そ の よ う な 配列 は存在 し な い こ と を 本発 明者 ら は 確認 し て い る 。

本発 明 に よ る 配列番号 1 に 示 さ れ る 塩基配列 の 3 3 5 番か ら 2 5 1 8 番 の 配列 を 有す る D N A 断片、 お よ び配 列番号 3 に 示 さ れ る 塩基配列 の 8 1 6 番 か ら 2 5 1 8 番 の 配列 を 有す る D N A 断片 は塩基配列 が定 ま っ て い る こ と か ら 、 そ の D N A 断片 を取得す る 一つ の 手段 は 核酸合 成の 手法 に 従 っ て製造す る こ と で あ る 。

ま た こ の 配列 は 、 前記 し た S u .1 f 0 1 0 b a 1 e s 目 に 属す る 古細菌、 好 ま し く は S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 ま た は

S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 か ら 遺伝子工学的 な 手法を 用 い て 得 る こ と 力 出 来 る 。 例 え ば、 M o 1 e c u 1 a r

C 1 o i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a 1 ( S a m b r o o k , M a n i a t i s ら 、 C o l d S p r i n g H a r b o u r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 9 ) ) な ど に 記載 の 手法で好 ま し く 行 う こ と がで き る 。 具体的 な 方法 は、 後記す る 実施 例 に 詳細 に 説 明 さ れて い る 。

組換え新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ

上記の 通 り 、 新規 ト ラ ン フ ェ ラ ー ゼの遺伝子が提供 さ れ た こ と か ら 、 本発 明 に よ れ ば、 こ の 遺伝子 の 発現産物 で あ る 組換 え 新規 ト ラ ン フ ヱ ラ ー ゼが提供 さ れ る 。

本発 明 に よ る 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 好 ま し い 具体例 と し て は 、 図 2 6 ま た は 図 2 9 に 示 さ れ る 制 限 酵素地図で表 さ れ る D N A 断片の 発現産物が挙 げ ら れ る 更 に 、 好 ま し い 具体例 と し て は、 配列表 の 配列番号 2 ま た は 4 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 ま た は そ の 等価配列 を 含ん で な る ポ リ ペ プ チ ドが挙 げ ら れ る 。 こ こ で、 「 そ の 等価配列」 と は 、 配列番号 2 ま た は 4 に 示 さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 に お い て、 い く つ か の ア ミ ノ 酸 の 挿入、 置換 ま た は 欠失、 若 し く は両 末端へ の 付加 が な さ れ た も の で あ つ て、 かつ そ の 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ作用 を 依然 と し て 保持す る も の を い う も の と す る 。 そ の 等価配列 に お け る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ作用 の 保持 と は、 そ の 作用 を利 用 し た 実際 の 使用 態様 に お い て 、 配列 番号 2 ま た は 4 に 示 さ れ る 配列 を 全 て 有す る ポ リ ペ プ チ ド と 、 同一 の 条件 で ほ ぼ同様 の 利用 が可能 な 程度 の 活性が維持 さ れ て い る こ と を い う も の と す る 。 こ の よ う な 「等価配列」 は 具体 的 に 実施例 I — 1 8 に お い て S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 お よ び

S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 の 2 株の 間で新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ 一ゼ の ァ ミ ノ 酸配列 の 相 同性がギ ヤ ッ プ を考慮 し て計算 し た 場合 4 9 %で あ っ て も 同一 の 活性が保持 さ れ て い る こ と か ら も 、 配列番号 2 お よ び 4 に 示 さ れ る 配列 を 参照 す れ ば、 当 業者で あ れ ば格別 の 困難性 な し に 選択 し 、 製 造可能で あ る こ と は 明 ら か で あ る 。

後記す る 実施例 I — 1 7 に お い て 明 ら か に さ れて い る よ う に 、 配列番号 1 お よ び 3 に 示 さ れ る 配列 を 有す る D N A 断片が、 こ の D N A 断片 の 起源で あ る

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 お よ び S u 1 f o 1 o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 以外 の 他 の 菌株 由 来 の D N A 断片 と ハ イ プ リ ッ ド を形成 し て い る 。 一方、 上記 し た よ う に 、 こ れ ら の 菌株 か ら 性 質の 酷似 し た新規 ト ラ ン ス フ ニ ラ ー ゼ の 存在を 今般確認 し た 。 ま た 後記す る 実施例 I 一 1 8 に お い て 明 か に さ れ る よ う に 、 S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 と

S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 の 2 株 の 間 で、 新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ の ア ミ ノ 酸配列 の 相 同性 は ギ ヤ ッ プを 考慮 し て計 算 し た 場合 4 9 %で あ る 。 従 っ て、 配列番号 2 ま た は 4 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 と あ る 程度 の 相 同性 あ る 配列 に お い て 、 新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ活性が保持 さ れ う る こ と は 当 業者 に 明 ら か で あ る と い え る 。

な お 、 配列番号 2 お よ び 4 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 と 相 同性 を 有す る 配列 の 存在 に つ い て 、 ア ミ ノ 酸配列 デ ー タ ノ ン ク （ S w i s s p r o t 、 お よ び N B R F - P F B ) を通 じ て、 配列解析 ソ フ ト ジ ヱ ネ テ ィ ッ ク ス ( ソ フ ト ウ ェ ア 開発） を 用 い て調べ た 結果、 そ の よ う な 配列 は 存在 し な い こ と を 本発 明者 ら は 確認 し て い る 。 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ を コ 一 ド す る 遺伝子の 発現

本発明 に よ る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを コ 一 ドす る D N A 断片を 、 宿主細胞 内 で複製可能で かつ 同遺伝子が 発現可能 な 状態で含む D N A 分子、 特 に 発現ベ ク タ ー 、 の 形態 と し て宿主細胞 の 形質転換 を 行 え ば、 宿主細胞 に お い て本発 明 に よ る 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ を 産 生 さ せ る こ と が で き る 。

従 っ て 、 本発 明 に よ れ ば、 さ ら に 本発 明 に よ る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ を コ 一 ド す る 遺伝子 を 含ん だ D N A 分 子、 特 に 発現 ベ ク タ ー 、 が提供 さ れ る 。 こ の D N A 分子 は 、 ベ ク タ ー 分子 に 本発 明 に よ る 新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ を コ 一 ド す る D N A 断片 を 組 み 込 む こ と に よ っ て得 る こ と が 出 来 る 。 本発 明 の 好 ま し い 態様 に よ れ ば、 こ の べ ク タ 一 は プ ラ ス ミ ド で あ る 。

こ の 本発 明 に よ る D N A 分子の 作成 は 前掲 の

M o l e c u l a r C 1 o i n g ： A

L a b o r a t o r y M a n u a 1 に 記載 の 方法 に 準 じ て行 う こ と 力 で き る 。

本発 明 に お い て利用 さ れ る べ ク タ ー は 、 使用 す る 宿主 細胞 の 種類 を 勘案 し な が ら 、 ウ イ ル ス 、 ブ ラ ス ミ ド、 コ ス ミ ド ベ ク タ ー な ど か ら 適宜選択す る こ と がで き る 。 例 え ば、 宿主細胞 が大腸菌 の 場合 は ス フ ァ ー ジ 系 の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ 、 p B R , p U C 系 の プ ラ ス ミ ド、 枯草菌 の 場 合 は p U B 系 の プ ラ ス ミ ド 、 酵母 の 場合 は Y E p 、 Y C p 系 の ベ ク タ ー が挙 げ ら れ る O

こ の プ ラ ス ミ ド は形質転換体 の 選択 マ ー カ 一を 含む の が好 ま し く 、 選択 マ ー カ ー と し て は 薬剤耐性 マ ー カ ー 、 栄養要求 マ ー カ ー 遺伝子 を 使用 す る こ と がで さ る 0 さ ら に 、 本発明 に よ る 発現ベ ク タ ー と し て の D N A分 子 は、 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ遺伝子の 発現 に必要な D N A配列、 例 え ば プ ロ モ ー タ ー 、 転写開始信号、 リ ボ ゾ ー ム 結合部位、 翻訳停止 シ グ ナ ル、 転写終結信号な ど の 転写調節信号、 翻訳調節信号 な ど を 有 し て い る の が好 ま し い 。

プ ロ モ ー タ ー と し て は 、 挿入断片 に 含 ま れ る 宿主 中で も 機能す る こ と がで き る プ ロ モ ー タ ー は も ち ろ ん の こ と 大腸菌 に お い て は ラ ク ト ー ス ォ ペ ロ ン （ 1 a c ) 、 ト リ ブ ト フ ァ ン オ ペ ロ ン （ t r p ) 等 の プ ロ モ ー タ ー 、 酵母 で は ア ル コ ー ノレ デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ遺伝子 （ A D H ) 、 酸 性 フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ遺伝子 （ P H O ) 、 ガ ラ ク ト ー ス遗 伝子 （ G A L ) 、 グ リ セ ロ ア ノレ デ ヒ ド 3 リ ン 酸デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ遺伝子 （ G P D ) 等 の プ ロ モ ー タ ー が好 ま し く 用 い る こ と がで き る も の と し て挙 げ ら れ る 。

こ こ で、 配列番号 1 に 示 さ れ る 塩基配列 の 1 番か ら 2 5 7 8 番 ま で の 塩基配列 お よ び配列番号 3 に 示 さ れ る 塩 基配列 の 1 番か ら 3 4 6 7 番 ま で の 塩基配列 は、 上記の 発現 に 必要 な 配列 を 含ん で い る と 思わ れ る こ と か ら 、 こ の 配列 を そ の ま ま 利用 す る の も 好 ま し い 。

ま た 、 宿主細胞が枯草菌、 酵母 の 場合 に は 、 分泌型べ ク タ 一を 使用 し て、 菌体外 に 組換え新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ酵素を 分泌す る こ と も 有利 で あ る 。

宿主細胞 と し て は、 大腸菌 の 他 に 、 枯草蘭、 酵母、 高 等真核生物 を 用 い る こ と がで き る 。 枯草菌 と し て は 例 え ば B a c i 1 u s 属 に 属 す る 微生物 を 用 い る こ と が好 ま し い 。 該属 に は 、 タ ン パ ク 質 を 多 く 菌体外へ分泌す る 株 が存在す る こ と が知 ら れ て い る 。 従 っ て 、 分泌型 べ ク タ 一を 用 い る こ と に よ り 、 培養液 中 に 多 量 の 組換 え 新規 ァ ミ ラ ー ゼ を 分泌 さ せ る こ と が 出 来 る 。 さ ら に 培養上清 か ら の 精製 も 容易 と な る の で好 ま し い 。 ま た 、 該属 に は 菌 体 外 に プ ロ テ ア ー ゼ を ほ と ん ど 分泌 し な い 株 も 知 ら れ て お り 、 こ の よ う な 株 を 用 い る こ と に よ り 、 本発 明 に よ る 組換 え 新規 ア ミ ラ ー ゼ を 効率 よ く 生産す る こ と が 出 来 る の で好 ま し い 。 ま た 、 宿主細胞 と し て ダ ル コ ア ミ ラ ー ゼ を 産生 し な い 生物 を選択す る と 、 菌体抽 出 液、 ま た は 簡 単 な 精製 を 行 っ た 粗酵素 の 状態で本発 明 に よ る 組換 え 新 規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 得 て、 そ れ を そ の ま ま 後記す る ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖 の 製造 に 用 い る こ と がで き る の で 極 め て 有利 で あ る 。

前記 し た 形質転換体 の 産生す る 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ は 、 次 の よ う に し て 得 る こ と 力く 出来 る 。 ま ず上 記 の 宿主細胞 を 適切 な 条件下で培養 し 、 得 ら れ た 培養物 か ら 公知 の 方法、 例 え ば遠心分離 に よ り 菌体 を 得 て 、 こ れ を 適切 な 緩衝液 中 に 懸 濁 し 、 凍結融解、 超音波処理、 磨砕等 に よ り 菌体 を 破砕 し 、 遠心分離 ま た は ろ 過 に よ り 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ラ ー ゼを 含有す る 菌体抽 出物 を る o こ の 菌体抽 出 物 に 存在す る 組換 え新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ の 精製 に は 、 公知 の 分離、 精製法 を適 当 に 組み 合わ せ て行 う こ と が で き る 。 例 え ば、 熱処理 の よ う な 耐熱性 の 差 を 利用 す る 方法、 塩沈澱 お よ び溶媒沈澱の よ う な 溶 解性 の 差 を 利用 す る 方法、 透析、 限外 ろ 過、 ゲ ル ろ 過 お よ び S D S — ポ リ ア ク リ ノレ ア ミ ド ゲ ル電気泳動 の よ う な 分子量 の 差 を 利用 す る 方法、 イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 の よ う な 電荷 の 差 を 利 用 す る 方法、 ァ フ ィ 二 テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 の よ う な 特異 的親和性 を 利用 す る 方 法、 疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 、 逆相 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー の よ う な 疎水性 の 差を 利用 す る 方法、 更 に 等電点電気泳 動 の よ う な 等電点 の 差 を利用 す る 方法等が挙 げ ら れ る 。 こ の 組換 え新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ は 耐熱性を有す る た め 、 熱処理 に よ り 宿主 の タ ン パ ク 質を変性 さ せ る こ と に よ り 、 こ れ を沈澱 と し て 除去で き る た め 、 精製を 非常 に 簡単 に 行 う こ と がで き る 。

組換 え新規 ト ラ ン フ ヱ ラ ー ゼを 用 い た ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 の 製造

更 に 本発明 に よ れ ば、 上記 の 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ を 用 い た 、 グ ノレ コ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス お よ び マ ル ト オ リ ゴ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 等 の い わ ゆ る ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 の 製造法が提供 さ れ る 。

す な わ ち 、 本発 明 に よ る 方法 は 、 少 な く と も 還元末端 側 の 三糖が グ ル コ ー ス 単位 で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合力く α - 1 ， a - 1 結合 で、 該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合が a - 1 , 4 結 合で あ る ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 の 製造法で あ っ て 、 上記組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ を 、 少 な く と も 還元末端 か ら 3 つ 以上 の グ ル コ ー ス 残基が α - 1 ， 4 結合で あ る 三糖以上 の 糖 と 接触 さ せ る こ と を 含ん で な 0

少 な く と も 還元末端 か ら 3 つ 以上 の グ ル コ ー ス 残基が a - 1 , 4 結 合で あ る 三糖以上 の 糖 は 特 に 限定 さ れ な い が、 デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 マ ル ト オ リ ゴ糖等が挙 げ ら れ る 。 こ こ で デ ン プ ン 分解物 と し て は、 デ ン プ ン を エ ン ド型 ア ミ ラ ー ゼ、 枝切 り 酵素 な ど に よ る 分解 ま た は 酸分解 に 付 し 、 少 な く と も 還元末端 か ら 3 つ 以上 の グ ル コ ー ス 残基が な - 1 , 4 結合で あ る よ う に 適宜分解す る こ と に よ り 製造 さ れ た も の が挙 げ ら れ る 。 こ こ で用 い ら れ る エ ン ド型 ア ミ ラ ー ゼ と し て は 、 例 え ば、

8 3 。 1 1 1 1 5 属等 の ノ ク テ リ ァ 、

A s p e r g i 1 l u s 属等 の か び、 麦芽等 の 植物 由 来 め 酵素等が利用 で き る 。 ま た 枝切 り 酵素 と し て は 、 例 え ば B a c i 1 l u s 属 、 K l e b s i e l l a 属 等ノ < ク テ リ ア 由 来 の プ ノレ ラ ナ一ゼ、 P s e u d o m o n a s 属 由 来 の イ ソ ア ミ ラ ー ゼ等が利用 で き る 。 更 に こ れ ら の 酵 素 を 組 み 合わ せ て利用 す る こ と も 可能で あ る 。

本発 明 に よ る 組換え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ と 、 少 な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上 の グ ル コ ー ス 残基が α - 1 4 結合で あ る 三糖以上 の 糖 と の 接触態様 お よ び そ の 条件 は 、 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼが該糖 に 作用 可能 な 様態で あ る 限 り 特 に 限定 さ れ な い 。 溶液 中 で接触 さ せ る 場 合の 好 ま し い 態様 を 示せ ば次 の 通 り で あ る 。 す な わ ち マ ル ト オ リ ゴ糖等 の 糖 の 使用 濃度 は 、 用 い る 糖が溶解 さ れ う る 範囲 で あ れ ば、 本酵素 の 比活性、 反応温度等 を 考 慮 し て適宜選択 し て よ い が、 0 . 5 〜 7 0 % の 範囲 と す る の が一般的 で あ り 、 好 ま し く は 5 〜 4 0 % の 範囲 で あ る 。 糖 と 酵素 と の 反応 に お け る 反応温度 お よ び ρ Η 条件 は 、 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ラ ー ゼ の 最適条件下で行 う こ と が好 ま し い 。 よ っ て、 5 0 ~ 8 5 °C程度、

P H 3 . 5 〜 6 . 5 程度の 条件下で行 う の が一般的 で あ り 、 好 ま し く は 6 0 〜 8 0 °〇 、 ^1 4 . 5 〜 6 . 0 の 範 囲 で あ る 。

ま た 、 組換え新規 ト ラ ン ス フ ラ ー ゼの 精製 の 程度 も 適宜選択す る こ と がで き 、 形質転換体 の 菌体破碎物 か ら 粗酵素の ま ま 用 い る こ と も で き 、 ま た 、 各種精製工程 で 得 ら れ た 精製酵素 と し て利用 し て も よ い 。 さ ら に は 各種 精製手段 を 経 て単離精製 さ れ た 酵素 と し て用 い て も よ い さ ら に 酵素 は 、 常法 に 準 じ て 担体 に 固定化 し 、 固定化 し た 状態で 、 糖 と 接触 さ せ て も よ い 。

生成 し た ダ ル コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 、 マ ル ト オ リ ゴ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 等 の ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 は 、 反応液を 公 知 の 方法 に 従 い 精製 す る こ と に よ り 得 る こ と が 出 来 る 。 例 え ば、 得 ら れ た 反 応液 を イ オ ン 交換樹脂 に よ り 脱塩 し 活性炭、 イ オ ン 交換樹脂 （ H S 0 3 型） 又 は 陽 イ オ ン 交 換樹脂 （ C a 型） 等 を 分離剤 と す る ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ っ て 目 的 の 糖 画 分 を 分離 し 、 又 は 更 に 続 い て 濃縮 し 結晶 化す る こ と に よ り 、 高純度 の ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 を 得 る こ と 力《で き る 。

I I . 新規 ア ミ ラ ー ゼ

本発 明 の 新規 ァ ミ ラ ー ゼ を 産生す る 微生物

本発 明 に お い て 利 用 さ れ う る 古細菌 と し て は 、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 （本発 明者 ら に よ り 自 然界か ら 実質的 に 純粋 な 形で分離 し た 前述 の 新菌株） 、 S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株、 S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 ( D S M 6 3 9 ) 株等を 挙 げ る こ と 力く で き る 。

本発 明 の 新規 ア ミ ラ ー ゼ を 産生す る 微生物 は 、 こ の よ う に 、 分類学上 S u 1 f o 1 o b a 1 e s 目 に 属 す る か な り 広 い 範 囲 の 古細 菌 に 及ぶ と 考 え ら れ る 。 こ こ に お い て 、 S u l f o l o b a l e s 目 と は 、 分類学上、 高度 好熱性 （温度 ： 5 5 °C 〜 8 8 °C の 範囲 で生育） 、 好酸性 ( H ： 1 ~ 6 の 範囲 で生育） 、 好気性、 硫黄細菌 （球 菌 （不規則） ： 直径 0 . 6 〜 2 m ) と し て定義 さ れ る 古細菌 で あ る 。 上記 の S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株 は 以前 は C a l d a r i e l 1 a a c i d o p h i l a と 命 名 さ れ て い た 菌 で あ る 。 よ っ て 、 こ の よ う な 事実 力、 ら 、 上記 の 古細菌 に 遺伝学 的 に 或 い は 分類学的 に 近縁 で あ り か つ 同 種 の 酵素 を 産生 し う る 菌、 及 び該菌 の 菌株 を 各種 変異剤 に よ っ て 処理 し て 得 ら れ る 変異株 は す べ て 本発 明 に お い て使用 で き る こ と は 言 う ま で も な い 。

上記 に お い て例示 し た 微生物 の 中 で 、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 は 本発明者 ら が群馬県の 温泉 か ら 分離 し た 菌株 で あ っ て 、 そ の 性質、 培 養法並 び に 寄託 に 関 し て は 、 前 述 に お い て詳 し く 説 明 し た と お り の も の で あ る 。

本発明 の 新規 ァ ミ ラ ー ゼ を 産生す る 微生物 の 培養

本発明 の 新規 ア ミ ラ ー ゼ産生の た め の 培養条件 は 、 該 ア ミ ラ ー ゼ を産生 し う る 範囲 内 で適宜選択す れ ば よ い 。 液体振 と う 培養又 は 通気撹拌培養 の 場 合 は 各微生物が生 育す る p H 、 培養温度 で、 2 曰 〜 7 日 間 の 培養が適 当 で あ る 。 培地 と し て は 、 例 え ば、 A m e r i c a n

T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n

( A T C C ) 発行 C a t a l o g u e o f

B a c t e r i a a n d P h a g e s 1 8 版

( 1 9 9 2 ) 及 び D e u t s c h e S a m m 1 u n g v o n M i k r o o r g a n i s m e n u n d Z e l 1 k u 1 t u r e n G m b H ( D S M ) 発行 C a t a l o g u e o f S t r a i n s 5 版 ( 1 9 9 3 ) に 記載 の も の を 好 ま し く 用 い る こ と が で き る 。 更 に 糖源 と し て デ ン プ ン 、 マ ル ト オ リ ゴ糖等 を 加 え て も よ い 。

本発 明 の 新規 ァ ミ ラ ー ゼ の 精製

上記微生物 の 産生 す る 本発 明 の 新規 ァ ミ ラ ー ゼ の 抽 出 は 、 ま ず上記 の よ う な 培養方 法 に よ り 得 ら れ た 培 養物 か ら 公知 の 方法、 例 え ば、 遠心分離 に よ り 菌体 を 得 て、 こ れ を 適切 な 緩衝液 中 に 懸濁 し 、 凍結融解、 超音波処理、 磨砕等 に よ り 菌体 を 破砕 し 、 遠心分離又 は ろ 過 に よ り 該 ァ ミ ラ ー ゼ を 含有す る 菌体抽 出 物 を 得 る 。

こ の 菌体抽 出物 に 存在す る 本発 明 の 新規 ァ ミ ラ ー ゼの 精製 に は 、 公知 の 分離、 精製法 を 適 当 に 組 み 合わ せ て行 う こ と が で き る 。 例 え ば、 塩沈澱及 び溶媒沈澱 の よ う な 溶解性 を 利用 す る 方法、 透析、 限外 ろ 過、 ゲ ル ろ 過、 及 び S D S — ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル電気泳動 の よ う な 分 子量 の 差 を 利用 す る 方 法、 イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ — の よ う な 電荷 の 差 を 利用 す る 方法、 ァ フ ィ 二 テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 の よ う な 特異的親和性 を 利用 す る 方法 疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 、 逆相 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー の よ う な 疎水性 の 差 を 利用 す る 方法、 更 に 等電点電気泳動 の よ う な 等電点 の 差 を 利用 す る 方法等が挙 げ ら れ る 。 こ れ ら の 具体的 な 例 は 、 後述の 実施例 11— 2 〜 11一 4 に 示す と お り で あ る 。 最終的 に ネ イ テ ィ ブ ポ リ ア ク リ ノレ ア ミ ド ゲ ル、 S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル或 い は 等電点電気 泳動 に て単一バ ン ド を 示す酵素 を 精製酵素 と し て 得 る 。

上記 し た よ う な 各種 の 精製過程 に お い て 分離 さ れ た 酵 素或 い は 酵素含有物 の 活性測定 に 関 し て は 、 L a m a ら の 方法 に お け る 活性測定法 で は デ ン プ ン を 基質 と し て行 つ て お り 、 そ れ に よ れ ば、 各種 ア ミ ラ ー ゼが複数存在 し て い る 状態で は デ ン プ ン の 分解が検 出 で き る も の の 、 そ れ ら の ァ ミ ラ ー ゼが そ れ ぞ れ分離 さ れ た 状態 で は 検 出 感 度、 定量性が共 に 低 く 、 ま た 、 こ の 方法で は 精製途 中 に お い て デ ン プ ン 分解活性 は ほ と ん ど 消失 し て確認で き な く な る と い う 大 き な 問題が あ り 、 酵素活性本体の 精製、 特定化 は 実質上不可能で あ っ た 。 と こ ろ が、 本発 明者 ら に よ り 、 ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖 （例 え ば マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ロ ー ス ） を 基質 と し 、 α ， α — ト レ ロ ー ス と マ ル ト オ リ ゴ糖 （例 え ば マ ル ト ト リ オ ー ス ） に 分解す る 活性 を 指標 と す る 新 し い 活性測定法 を 採用 し た と こ ろ 、 非常 に 特異性、 検 出 感度、 及 び定量性が高 く 、 初 め て 目 的 と す る 酵素 の 単離精製 が可能 と な り 、 よ う や く に し て 本発 明 の 新規 ァ ミ ラ ー ゼ活性本体 の 精製及 び特定化 を 実 現 し 得 た の で あ る 。 本発明 の新規 ァ 一ゼの諸性質

本発明の酵素例 と し て、 S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株、 及 び S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 ( D S M 6 3 9 ) 株の 古細菌がそ れぞれ産生 し た新規 ァ ミ ラ ー ゼ に つ い て そ れ ら の 酵素学的 な 諸性質を下記の 第 2 表 に ま と め て示す。 な お、 表中 の デ ー タ は、 実施例 11— 5 に示 し た具体例 に基づ く も の で あ る 。

第 2 表

Sul f 0 lobus Su 1 fo 1 obus Sulfolobus so 1 ί a t a r i cus sol iataricus acidocaldarius 酵素特性 K 1 DS 5833 ATCCa3909

(1) 酵素作用 グルコースが 一 1, 4で結合したマルトトリオース以上の 及び のグルコースポリマーをェンド型で加水分解する。 また還元 末端から主として単糖、 2糖を する活性を有する。 特に還元末端側の結合が α— 1， α— 1結合であり、 それ以 外が α— 1， 4結合であるトレハロースオリゴ糖からな， a 一トレハロースを遊離する活性カ い。

(2) 至適 pH 4.5 〜5.5 4.5〜5· 3 5.0-5.5

(3) 安定 pH 3.5 〜 0 3.卜 12.0 4.卜 13.0

(4) 至適 7(！〜 85。C 70 〜85°C 60 〜80^oC

(5) 温度安定性 85°C、 6 lir 85 。C、 6 lir 80 。C、 6 hr

100¾残存 100¾残存 100¾残存

(6) 好量

SDS-PAGE 61, 000 62, 000 64, 000

(7) 等電点 4.8 4. 3 5.4

(8) 阻害剤 5mM CuSO 5mM CuSO 5m CuSO

4 4 4

100 阻害 100%阻害 應阻害 1 ： 経時変化

可溶性デ ン プ ン を基質 と し て用 い た場合、 反応初期 に ヨ ウ 素 デ ン プ ン 反応が速 や か に 消失 し 、 引 き 続 き 、 マ ル ト ー ス 、 ダ ル コ 一ス を 主成分 と し て 若干量 の マ ル ト ト リ オ ー ス 、 マ ル ト ア ト ラ オ 一 ス を生成す る よ う に 分解 し た 註 2 ： 酵素作用 Ζ酵素反応

本酵素 は デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 及 び マ ル ト オ リ ゴ糖 を 基質 と し た場 合、 加水分解反 応 に よ り 主 に グ ル コ ー ス 、 マ ル ト ー ス を 生成 し 、 少量 の マ ル ト ト リ オ ー ス 、 マ ノレ ト テ ト ラ オ ー ス を 生成す る 。 本活性 の 作用 機作 に つ い て は こ れ ら の 基質 に 対 し て ェ ン ド 型 に 作用 す る ァ ミ ラ ー ゼ活性 と 共 に そ の 還元末端側 か ら 主 に 単糖、 2 糖 を生 成す る 活性 を 有す る 。

特 に 、 還元末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合力く α — 1 ， 一 1 ロ □ で、 該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ノレ コ ー ス 間 の 結合が な — 1 ， 4 結合で あ る 3 糖以 上 の 糖 （例 え ば ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖） と の 反応性が高 く 、 こ れ を 基質 と し た 場合、 還元末端側 か ら 2 つ 目 と 3 つ 目 の ダ ル コ 一ス 間 の α — 1 ， 4 結合 を加水分解 し て反 応 の 初期 に 特異 的 に α ， - ト レ ハ ロ ー ス を 遊離す る 活 性 'を 有す る 。

よ っ て 、 本酵素 は 新規 な ァ ミ ラ ー ゼで あ る と 考 え ら れ る 。 こ の 詳細 は 、 実施例 1 1 — 5 の 具体 的 な 例 に お い て示 す通 り で あ る 。

以上、 本酵素 の 諸性質 を 述べ た が、 第 2 表及 び後述 の 実施例 か ら 明 ら か な よ う に 、 酵素活性以外の 本酵素の 諸 性質 に 関 し て は 、 菌株 の 属或 い は 種 の 違 い に よ り 若干の 差異が あ る の が認 め ら れ る 。

, α — ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造 に お い て 用 い ら れ る ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ

本発 明 の a , a 一 ト レ ハ ロ ー ス の 製造法 に お い て使用 す る ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ と し て は 、 前述の I . 新規 ト ラ ン フ ヱ ラ ー ゼの 項 に お い て詳説 し た 本発 明 の ト ラ ン フ ヱ ラ ー ゼ を 用 い る こ と が で き る 。 具体 的 に は 、 例 え ば S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s A T C C 3 5 0 9 1 ( D S M 1 6 1 6 ) 株、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株、 S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株、

S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 ( D S M 6 3 9 ) 株、

A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株等が産生す る ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ を 挙 げ る こ と がで き る 。

'上記 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ は 、 例 え ば、 後述す る 実施例 I — 2 〜 I — 5 に 示す方法 に 従 っ て製造す る こ と がで き る 。 こ う し て得 ら れ た ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ は 後述 の 実施 例 I ― 6 に お い て 示す よ う な 諸性質 を 有す る も の で あ る , a — ト レ ロ ー ス の 製造

本発明 は、 本発明 の 新規 ア ミ ラ ー ゼ と ト ラ ン ス フ ェ ラ ゼ と を用 い て 、 a a ― ト レ ヽ ロ ー ス を 製造す る 方法 を 提供す る も の で あ る が、 該本発 明 の 製造法を 、 最 も 典 型 的 な 具体例 、 即 ち 、 デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 及 び マ ル ト ォ リ ゴ糖等の 糖原料 か ら 、 α a - ト レ ロ ー ス を 製造す る 方法で も つ て 以下説 明 す る 。 'よ お 、 デ ン プ ン 等 に 上記 の 2 つ の 酵素が作用 す る 機構 は 、 多分、 以下の 通 り で あ る と 考 え ら れ る 。 す な わ ち 、 デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 或 い は マ ル ト オ リ ゴ 糖 に 本発明 の 新規 ァ ミ ラ ゼが そ の ェ ン ド型活性 に よ り 、 ま ず作用 し て こ の も の を ア ミ 口 ー ス 又 は マ ル ト オ リ ゴ糖 に 分解 し 、 続 い て 、 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼの 作用 に よ っ て該 ア ミ ロ ー ス 又 は マ ル ト オ リ ゴ糖 の 還元末端 の α — 1 , 4 結合を α — 1 , a ― 1 結合 に 転位 さ せ、 更 に 、 再 び新規 ァ ミ ラ ー ゼが作用 し T a , a ― 卜 レ ノ、 口 ー ス と 、 重合度 を 2 つ 減 じ た ァ ミ 口 ー ス 又 は マ ル ト オ リ ゴ糖 を 生成 し 、 こ う し て生 じ た ァ ミ ロ ー ス 又 は マ ル ト ォ リ ゴ糖 に 上記 の 反応が繰 り 返 さ れて、 延'い て は 、 高収率で a , — ト レ 口 ー ス が生成 さ れ る よ う に な る の で は な い 力、 と 考え ら れ る 。

こ の よ う な 作用 機構 は 、 還元末 側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合力く α — 1 a 一 1 結合で、 該末端 側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合が α — 1 4 結合で あ る 3 糖以上の 糖 （例 え ば ト レ ノ、 ロ ー ス ォ リ ゴ糖） に 対す る 反応性が、 そ れ ぞれ対応す る マ ル ト オ リ ゴ糖 と の 反応性 に 比較 し C 问 く 、 上記 の 3 糖以上 の 糖 の 還元末 端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の α — 1 ， 4 結合 を 特異的 に 加水分解 し て a , a - ト レ ハ ロ ー ス を 遊離す る と い う 、 本発明 の 新規 ァ ミ ラ 一 ゼ の 特異 的 な 反 応様式 に 起 因す る も の と 考 え ら れ る 。

本発 明者 ら の 知 る 限 り で は 、 従来知 ら れ て い る ァ ミ ラ ー ゼで、 マ ル ト ォ リ ゴ糖 の 還元末端力く cr — 1 , α — 1 結 合 と な つ た マ ル ト オ リ ゴ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス を 、 そ の 一

1 ， a 一 1 結合 の と な り の α — 1 ， 4 結合の 位置 で特異 的 に 加水分解 し 、 収率 よ く α , a - ト レ ハ ロ ー ス を 遊離 す る 活性 を 有す る も の は な く 、 従 つ て α , α — ト レ ノヽ ロ ー ス を 高 い 収率で生成す る こ と は ほ と ん ど不可能で あ つ 本発明 に お け る α , α — ト レ ハ ロ ー ス の 製造法 は 、 古 細菌 が産生す る 本発 明 の ア ミ ラ ー ゼ （本酵素） が デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 及 び マ ル ト オ リ ゴ糖等の 糖 に 作用 可能 な 様態で あ る 限 り 、 該 ア ミ ラ ー ゼ、 及 び ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ と デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 及 び マ ル ト オ リ ゴ糖等 の 糖 と の 接触 の 様態 は 特 に 限定 さ れ な い 。 具体 的 に は 、 一般的 に 、 古細菌 の 菌体或 い は 菌体破砕物か ら 粗 酵素を 得、 次 い で各種精製工程で得 ら れ た 精製酵素、 或 い は 各種精製手段 を経 て単離精製 さ れ た 酵素 を 直接 デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 或 い は マ ル ト オ リ ゴ糖等の 糖 に 作用 さ せ れ ば よ い 。 或 い は 、 そ の よ う に し て得 た 酵素を 担体 に 固定化 し 、 固定化 さ れ た 酵素 と し て デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 或 い は マ ル ト オ リ ゴ糖等の 糖 に 接触 さ せ て も よ い 。 な お古細菌 の 複数種 か ら 得 た二つ 以上 の 本酵 素 を 共存 さ せ て、 デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 或 い は マ ル ト オ リ ゴ糖等 の 糖 と 接触 さ せ て も よ い 。

本発 明 の ， a — ト レ ハ ロ ー ス の 製造法 に お い て、 上 記 ァ ミ ラ ー ゼ 、 及 び ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ の 使用 量 に つ い て は 、 い ず れ も 最適範 囲 内 で使用 さ れ る べ き で あ る 。 即 ち 、 過剰 の ア ミ ラ ー ゼ は 、 還元末端力く ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ に よ り 作用 を 受 け て い な い デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物 或 い は マ ノレ ト ォ リ ゴ糖 に 作用 し て グ ゾレ コ ー ス 、 マ ル ト 一 ス を 生成す る よ う に な り 、 一方、 過剰 の ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ は、 同酵素 に よ っ て生成 し た マ ル ト オ リ ゴ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 等 の ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖 を 副反応 に よ り 分解 し 、 グ ル コ ー ス を 生成す る よ う に な る か ら で あ る 。

具体的 に は 、 ア ミ ラ ー ゼ及 び ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼの 基 質 に 対す る 濃度 は 、 そ れ ぞれ 1 . 5 U Zml及 び 0 . 1 U Z'ml以上、 好 ま し く は そ れ ぞれ 1 . 5 U /ml及 び 1 . 0 U Z ml以上、 更 に 好 ま し く は そ れ ぞれ 1 5 U / ml及 び 1 . O U Z ml以上 で あ り 、 ま た 、 ア ミ ラ ー ゼ対 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ の 濃度比 は 1 0 0 〜 0 . 0 7 5 、 好 ま し く は 4 0 〜 3 で あ る 。

デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 及 び マ ル ト オ リ ゴ糖等の 糖の 使用 濃度 は 、 用 い る 糖が溶解 さ れ う る 範囲 で あ れ ば 用 い る 酵素の 比活性、 反応温度等 を 考慮 し て適宜選択す れ ば よ い 。 0 . 5 7 0 % の 範囲 と す る の が一般的 で あ り 、 好 ま し く は 5 4 0 % の 範囲 で あ る 。 糖 と 酵素 と の 反応 に お け る 反応温度及 び p H 条件 は 、 ア ミ ラ ー ゼ、 及 び ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 最適条件で行 う こ と が好 ま し い よ っ て 、 5 0 8 5 °C 程度、 p H 3 . 5 8 程度 の 条件 下で行 う の が一般 的 で あ り 、 好 ま し く は 6 0 7 5 °C p H 4 . 5 6 . 0 の 範囲 で あ る 。

ま た 、 用 い る 糖原料が高重合度 の デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物等 の 場合 は 、 補助的 に 他 の ェ ン ド型液化 ァ ミ ラ ー ゼを 併用 す る こ と に よ り 、 a , α - ト レ ハ ロ ー ス の 生成 を促進 さ せ る こ と がで き る 。 更 に プ ル ラ ナ ー ゼ、 イ ソ ァ ミ ラ ー ゼ等 の 枝切 り 酵素を用 い る こ と も で き る 。 こ の 場 合の エ ン ド型 ア ミ ラ ー ゼ、 プ ル ラ ナ ー ゼ、 イ ソ ア ミ 'ラ ー ゼ等 に つ い て は、 古細菌が産生す る 酵素で あ る 必要 は な い。 よ っ て、 特 に 限定 さ れ な い が、 例 え ば、

B a c i l l u s 属等 の ク テ リ ア 、

A s p e r g i 1 1 u s 属等 の か び、 麦芽等 の 植物 由 来 の ア ミ ラ ー ゼが利用 で き る 。 ま た 枝切 り 酵素 に つ い て は 例 え ば B a c i 1 l u s 属、 K l e b s i e l l a 属等 ク テ リ ァ 由 来の プ ゾレ ラ ナ ー ゼ （耐熱性 の プ ル ラ ナ ー ゼ を 含む） 、 P s e u d o m o n a s 属 由 来 の イ ソ ア ミ ラ ー ゼ等が利用 で き る 。 更 に こ れ ら の 酵素 ど う し を組み 合 わせ て も 利用 で き る 。

た だ し 、 過剰量の ア ミ ラ ー ゼ の添加 は ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ に よ っ て利用 さ れな い グル コ ー ス 、 マ ゾレ ト ー ス を生 成す る 可能性があ る 。 ま た、 枝切 り 酵素に お い て も 同様 に 、 過剰量の 添加 は 1 ， 6 結合の切断 に よ る 基質の 溶解 度 の 低下を 引 き 起 こ し 、 利用 さ れな い 高粘度の 不溶物質 ( ア ミ ロ ー ス ） を生 じ る よ う に な る 。 よ っ て、 用 い る ァ ミ ラ ー ゼ及び枝切 り 酵素等の量 は、 過剰の グル コ ー ス 、 マ ル ト ー ス 、 或 い は不溶性物質を生成 さ せ な い よ う に 注 意 し て調節す る 必要が あ る 。 例え ば、 枝切 り 酵素 に 関 し て は、 そ の使用濃度 は、 本発明の ア ミ ラ ー ゼの比活性、 反応温度等を考慮 し 、 かつ不溶性物質を生成 さ せ な い範 囲で適宜選択す る 必要があ る 。 具体的 に は、 4 0 °C に て l h r 処理す る 場合は、 基質 に対 し て 0 . 0 1 〜 1 0 0 U / m 1 の範囲 と す る の が一般的で あ り 、 好ま し く は 0 . l 〜 2 5 U Z m l の範囲であ る 。 （枝切 り 酵素の活 性 の 定義に つ い て は実施例 1 1 — 6 ， 1 3 及び 1 4 参照。 ） 枝切 り 酵素を用 い る 場合 は、 な ， α — ト レハ ロ ー ス の生 成'反応の前 に予 め基質を枝切 り 酵素 に て前処理す る 方法、 又 は α ， a — ト レ ハ ロ ー ス の生成反応 に 際 し て いずれか の 段階で ァ ミ ラ ー ゼ及 び ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ と 共存 さ せ て用 い る 方法な ど い ずれで あ っ て も よ い。 な お、 そ の 際 枝切 り 酵素 は いずれかの段階で 1 回以上組み合わせ て用 い る の が好ま し く 、 特 に初期の段階で 1 回以上組み合わ せ て用 い る の が好 ま し い 。 な お 、 耐熱性枝切 り 酵素 を用 い る 場合 は ， a — ト レ ハ ロ ー ス 生成反応 に 際 し て い ず れか の 段階、 或 い は 初期 の 段階 に お い て 、 1 回添加す る の み で 同様 の 効果が得 ら れ る 。

生成 さ れ た α , α — ト レ ハ ロ ー ス を 含む反応液 は 、 公 知 の 方 法 に 従 い 精製す る こ と が で き る 。 例 え ば、 得 ら れ た 反応液を イ オ ン 交換樹脂 に よ り 脱塩 し 、 活性炭、 ィ ォ ン 交換樹脂 （ HS 0 3 型） 、 又 は 陽 イ オ ン 交換樹脂 （ C a型） 等を 分離剤 と す る ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に よ つ て 目 的 の 糖 画分 を 分離 し 、 又 は 更 に 続 い て 濃縮 し 、 結晶化す る こ と に よ り 、 高純度 の α — ト レ ハ ロ ー ス を 得 る こ と がで さ る

新規 ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ドす る 遺伝子

本発 明 に よ れ ば更 に 上記の 新規 ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ド す る 遺伝子が提供 さ れ る 。

本発 明 に よ る 新規 ァ ミ ラ ー ゼ を コ 一 ド し て い る 遺伝子 を 含 む D N A 断 片 の 具 体 例 と し て は 、 図 3 4 ま た は 図 3 8 に 示 さ れ る 制 限酵素地図 で表 さ れ る D N A 断片が挙 げ ら れ る 。

こ の D N A 断片 は 、 S u 1 f o 1 o b a 1 e s 目 に 属 す る 古細菌か ら 得 る こ と が 出 来、 好 ま し く は

S u 1 f o 1 o b u s 属 に 属 す る 古細菌、 よ り 好 ま し く は後記す る S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 ま た は S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 力、 ら 単離す る こ と 力く 出 来 る 。

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 お よ び S u 1 f o 1 o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 か ら の そ の 好 ま し い 単離法 に つ い て は 、 後記す る 実施例 に お い て詳細 に 説明 さ れ て い る 。

こ の D N A 断片 を 取 得可能 と 思 わ れ る 起源 の 具体例 と し て は 、 さ ら に S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s D S M 5 3 5 4 株、

D S M 5 8 3 3 株、 A T C C 3 5 0 9 1 株、 A T C C 3 5 0 9 2 株 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 4 9 4 2 6 株 S u l f o l o b u s s h i b a t a e D S M 5 3 8 9 株 A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株等 を 挙 げ る こ と 力 で き る 。 こ れ ら の 古 細菌が、 本発 明 に よ る D N A 断片 の 起源 と な り う る こ と は 、 後記す る 実施例 I 1一 2 4 の ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ョ ン 試験 に お い て 、 S u 1 f o 1 o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 お よ び

S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来 の 新規 ァ ミ ラ ー ゼ遺伝子が、 こ れ ら 古細菌 の 染色体 D N A と ハ イ プ リ ッ ド を 形成す る こ と 、 さ ら に は 、 上記 し た よ う に 酵素 自 体 の 性質 も 酷似 - 1 1 - し て い る こ と を 示 し て い る こ と か ら も 明 ら かで あ る 。 更 に こ の 実施例 の 結果 は、 本発明 に よ る 新規 ア ミ ラ ー ゼ遺 伝子が、 S u 1 f o 1 o b a 1 e s 目 に 属す る 古細菌 に 特異的 に 高度 に 保存 さ れて い る こ と を 示 し て い る と い え な o

本発 明 の 好 ま し い 態様 に よ れ ば、 本発明 に よ る 新規 ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ド し て い る 遺伝子 の 好 ま し い 具体例 と し て、 配列番号 6 ま た は 8 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 を コ ー ド す る D N A 配 列 を 含 ん で な る D N A 断 片 が 提 供 さ れ る 。 さ ら に 、 配列番号 6 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 を コ ー ド す る D N A 配列 の 好 ま し い 具体例 と し て は 、 配列番号 5 に 示 さ れ る 塩基配列 の 6 4 2 番 か ら 2 3 1 5 番 ま で の 塩基配列が、 ま た配列番号 8 の ア ミ ノ 酸配列 を コ ー ドす る D N A 断片の 好 ま し い 具体例 と し て配列番号 7 に 示 さ れ る 塩 基 配列 の 1 1 7 6 番 か ら 2 8 4 3 番 が挙 げ ら れ る ₀

一般 に 、 タ ン パ ク 質の ア ミ ノ 酸配列 が与え ら れれ ば、 そ れ を コ ー ドす る 塩基配列 は、 い わ ゆ る コ ド ン 表 を参照 し て容易 に 定 ま る 。 よ っ て配列番号 6 ま た は 8 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 を コ ー ドす る 種 々 の 塩基配列 を 適宜選択 す る こ と が可能で あ る 。 従 っ て、 本発 明 に お い て 「配列 番 号 6 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 を コ ー ド す る D N A 配 列」 と は 、 配列番号 5 に 示 さ れ る 塩基配列 の 6 4 2 番か ら 2 3 1 5 番の 配列 を有す る も の 、 お よ び そ の 縮重関係 に あ る コ ド ン が使用 さ れて い る 以外 は 同一の 塩基配列 を 有 し かつ 配列番号 6 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸 を コ ー ドす る 塩 基配列 を も 意味す る も の と す る 。 ま た 「配列番号 8 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 を コ ー ド す る D N A 配列」 と は 、 配 列番号 7 に 示 さ れ る 塩基配列 の 1 1 7 6 番か ら 2 8 4 3 番 の 配列 を 有す る も の 、 お よ び そ の 縮重関係 に あ る コ ド ン が使用 さ れ て い る 以外 は 同一 の 塩基配列 を有 し かつ 配 列番号 8 に 示 さ れ る ァ ミ ノ 酸 を コ ー ド す る 塩基配列 を も 意味す る も の と す る 。

さ ら に 、 後記す る よ う に 本発 明 に よ る 新規 ア ミ ラ ー ゼ に は 、 配列番号 6 ま た は 8 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 の 等 価配列 を も 包含す る も の で あ る 。 従 っ て、 本発明 に よ る D N A 断片 に は 、 さ ら に こ の 等価配列 を コ ー ド す る 塩基 配列 も 包含 さ れ る 。

そ し て さ ら に 、 本発 明 に よ る 新規 ア ミ ラ ー ゼ に は 、 配 列番号 6 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 の N 末端 に 更 に M e t が付加 し た配列 が包含 さ れ る 。 よ っ て 、 本発明 に よ る 新 規 ア ミ ラ ー ゼを 含む D N A 断片 に は 、 配列番号 5 に 示 さ れ る 塩基配列 の 6 3 9 番 か ら 2 3 1 5 番 の 配列 を 有す る も の 力く包含 さ れ る 。

な お 、 配 列 番 号 5 お よ び 7 に 示 さ れ る 塩基配列 と 相 同性 を 有す る 配列 の 存在 に つ い て、 塩基配列 デ ー タ バ ン ク （ E M B L ) を通 じ て、 配列解析 ソ フ ト ジ ヱ ネ テ イ ツ ク ス （ ソ フ ト ウ ェ ア 開発） を 用 い て調 べ た結果、 そ の よ う な 配列 は存在 し な い こ と を 本発明者 ら は 確認 し て い る 本発明 に よ る 配列 番号 5 に 示 さ れ る 塩基配列 の 6 3 9 番 ま た は 6 4 2 番か ら 2 3 1 5 番 の 配列 を 有す る D N A 断片、 ま た は配列番号 7 に 示 さ れ る 塩基配列 の 1 1 7 6 番 か ら 2 8 4 3 番 の 配列 を 有す る D N A 断片 は塩基配列 が定 ま っ て い る こ と か ら 、 そ の D N A 断片 を取得す る一 つ の 手段 は 核酸合成 の 手法 に 従 っ て製造す る こ と で あ る ま た こ の 配列 は 、 前記 し た

S u 1 f 0 1 0 b a 1 e s 目 に 属 す る 古細菌、 好 ま し く は S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 ま た は S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 か ら 遺伝子工学的 な 手法 を用 い て得 る こ と が 出来 る 。 例 L ば、 M o l e c u l a r C l o i n g :

A L a b o r a t o r y M a n u a l

( S a m b r o o k , M a n i a t i s ら 、 C o l d S p r i n g H a r b o u r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 9 ) ) な ど に記載 の 手法で好 ま し く 行 う こ と がで き る 。 具体的 な 方法 は 、 後記す る 実施例 に 詳細 に 説 明 さ れ て い る 。

組'換え新規 ア ミ ラ ー ゼ

上記 の 通 り 、 新規 ア ミ ラ ー ゼ の 遺伝子が提供 さ れ た こ と か ら 、 本発明 に よ れ ば、 こ の 遺伝子 の 発現産物で あ る 組換 え新規 ァ ミ ラ ー ゼが提供 さ れ る 。

本発明 に よ る 組換 え新規 ァ ミ ラ ー ゼの 好 ま し い具体例 と し て は 、 図 3 4 ま た は 図 3 8 に 示 さ れ る 制限酵素地図 で表 さ れ る D N A 断片の 発現産物が挙 げ ら れ る 。 更 に 、 好 ま し い 具体例 と し て は 、 配列表 の 配列番号 6 ま た は 8 に 示 さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 ま た は そ の 等価配列 を 含ん で な る ポ リ ペ プ チ ド が挙 げ ら れ る 。 こ こ で、 「 そ の 等価配列」 と は 、 配列番号 6 ま た は 8 に 示 さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 に お い て 、 い く つ か の ア ミ ノ 酸 の 挿入、 置換、 ま た は 欠失、 若 し く は 両末端へ の 付加 が な さ れ た も の で あ つ て、 かつ そ の 上記 し た 新規 ア ミ ラ ー ゼ活性 を 依然 と し て保持す る も の を い う も の と す る 。 そ の 等価配列 に お け る 新規 ア ミ ラ ー ゼ活性 の 保持 と は 、 そ の 活性 を利用 し た 実際 の 使用 態様 に お い て 、 配列番号 6 ま た は 8 に 示 さ れ る 配列 を 全 て 有す る ポ リ べ プ チ ド と 、 同一 の 条件で ほ ぼ 同様 の 利 用 が可能 な 程度 の 活性が維持 さ れ て い る こ と を い う も の と す る 。 こ の よ う な 「等価配列」 は 具体的 に 実 施例 11— 2 3 に お い て S u 1 f o 1 o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 と

S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 の 2 株 の 間 で、 新規 ア ミ ラ ー ゼの 相 同性が ァ ミ ノ 酸配列 レ ベ ル で ギ ヤ ッ プ を 考慮 し て計算 し た 場 合 5 9 % で あ っ て も 、 同 一 の 活性が保持 さ れて い る こ と か ら も 、 配列 番号 6 ま た は 8 に 示 さ れ る 配列 を参 照す れ ば、 当 業者 で あ れ ば格別 の 困難性 な し に 選択 し 、 製造可能で あ る こ と は 明 ら か で あ る 。

さ ら に 、 本発 明 の 別 の 態様 に よ れ ば、 こ の 配列番号 6 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 の N 末端 に M e t が更 に 付加 さ れ た ア ミ ノ 酸配列 が更 に 提供 さ れ る 。 本発明 に よ る 新規 ァ ミ ラ ー ゼ は そ の 天然型 に お い て配列番号 6 に 示 さ れ る 配列 を 有 し て い た 。 し か し な が ら 、 後記す る よ う に 単離 さ れ た そ の 遺伝子情報か ら 、 そ の 配列 を 利用 し て遺伝子 組換 え の 手法 に よ り 新規 ア ミ ラ ー ゼ を 得 た 場合、 配列番 号 6 の ア ミ ノ 酸配列 の N 末端 に 更 に M e t が付加 し た も の が得 ら れ る こ と が わ か る 。 更 に こ の 配列 が新規 ァ ミ ラ ー ゼ活性 を 有す る こ と は 明 ら か で あ り 、 よ っ て、 こ の M e t が付加 し た ア ミ ノ 酸配列 も 本願発明 に 包含 さ れ る 後記す る 実施例 11— 2 4 に お い て 明 ら か に さ れ て い る よ う に 、 配列番号 7 に 示 さ れ る 1 3 9 3 番 か ら 2 1 1 6 番 ま で の 配列 を 有す る D N A 断片が、 こ の D N A 断片 の 起源で あ る S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 ま た は S u l f o l o b u s

s o 1 f a t a r i c u s K M 1 株以外の 他 の 菌株 由 来の D N A 断片 と ノヽ ィ プ リ ッ ド を形成 し て い る 。 一方、 上記 し た よ う に 、 こ れ ら の 菌株 か ら 性質の 酷似 し た 新規 ア ミ ラ ー ゼの 存在 を 今般確認 し た。 ま た後記す る 実施例 11 - 2 3 に お い て 明 ら か に さ れ る よ う に 、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 と S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 の 2 株 の 間で、 新規 ア ミ ラ ー ゼ の ア ミ ノ 酸配列 の 相 同性 は ギ ャ ッ プ を 考慮 し て計算 し た 場合 5 9 %で あ る 。 従 つ て、 配列番号 6 ま た は 8 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 と あ る 程度 の 相 同性 あ る 配列 に お い て、 新規 ア ミ ラ ー ゼ活性が 保持 さ れ う る こ と は 当 業者 に 明 ら か で あ る と い え る 。

な お 、 配列 番号 6 お よ び 8 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 と 相 同性 を 有す る 配列 の 存在 に つ い て、 ア ミ ノ 酸配列 デ ー タ ノく ン ク （ S w i s s p r o t 、 お よ び N B R F - P F B ) を 通 じ て 、 配列解析 ソ フ ト ジ ヱ ネ テ ィ ッ ク ス （ ソ フ ト ウ ェ ア 開発） を 用 い て調 べ た 結果、 そ の よ う な 配列 は 存在 し な い こ と を 本発 明者 ら は 確認 し て い る 。

新規 ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ドす る 遺伝子の 発現

本発 明 に よ る 新規 ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ド す る D N A 断片 を 、 宿主細胞 内 で複製可能で かつ 同遺伝子が発現可能 な 状態で 含む D N A 分子、 特 に 発現ベ ク タ ー 、 の 形態 と し 宿主細胞 の 形質転換 を 行え ば、 宿主細胞 に お い て本発 明 に よ る 新規 ァ ミ ラ ー ゼを産生 さ せ る こ と がで き る 。

従 っ て、 本発 明 に よ れ ば、 さ ら に 本発 明 に よ る 新規 ァ ミ ラ ー ゼを コ ー ドす る 遺伝子を 含ん だ D N A 分子、 特 に 発現 ベ ク タ ー 、 が提供 さ れ る 。 こ の D N A 分子 は 、 べ ク タ ー 分子 に 本発 明 に よ る 新規 ァ ミ ラ ー ゼ を コ 一 ド す る D N A 断片 を組 み込む こ と に よ っ て得 る こ と が 出来 る 。 本 発明 の 好 ま し い 態様 に よ れ ば、 こ の ベ ク タ ー は プ ラ ス ミ ド で あ る 。

こ の 本発 明 に よ る D N A 分子の 作成 は前掲 の M o l e c u l a r C 1 o i n g : A

L a b o r a t o r y M a n u a l に Ϊ己載 の 方法 に 準 じ て行 う こ と 力 で き る 。

本発明 に お い て利用 さ れ る ベ ク タ ー は 、 使用 す る 宿主 細胞 の 種類 を 勘案 し な が ら 、 ウ イ ノレ ス 、 プ ラ ス ミ ド、 コ ス ミ ド ベ ク タ ー な ど か ら 適宜選択す る こ と がで き る 。 例 え ば、 宿主細胞 が大腸菌 の 場 合 は ； I フ ァ ー ジ 系 の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ 、 p B R、 p U C 系 の プ ラ ス ミ ド、 枯草菌 の 場 合 は p U B 系 の プ ラ ス ミ ド 、 酵母 の 場 合 は Y E p 、 Y C p 系 の ベ ク タ ー が挙 げ ら れ る 。

こ の プ ラ ス ミ ド は 形質転換体 の 選択 マ ー カ ー を 含む の が好 ま し く 、 選択 マ ー カ ー と し て は 薬剤耐性 マ ー カ ー 、 栄養要求 マ ー カ ー 遺伝子 を 使用 す る こ と がで き る 。

さ ら に 、 本発明 に よ る 発現 ベ ク タ ー と し て の D N A分 子 は 、 新規 ア ミ ラ ー ゼ遺伝子 の 発現 に 必要 な D N A配列 例 え ば プ ロ モ ー タ ー 、 転写開始信号、 リ ボ ゾ ー ム 結合部 位、 翻訳停止 シ グ ナ ル、 転写終結信号 な ど の 転写調節信 号、 翻訳調節信号 な ど を 有 し て い る の が好 ま し い 。

'プ ロ モ ー タ ー と し て は 、 挿入 断片 に 含 ま れ る 宿主 中 で も 機能す る こ と がで き る プ ロ モ ー タ ー は も ち ろ ん の こ と 大腸菌 に お い て は ラ ク ト ー ス ォ ペ ロ ン （ 1 a c ) ヽ ト リ ブ ト フ ァ ン オ ペ ロ ン （ t r p ) 等 の プ ロ モ ー タ ー 、 酵母 で は ア ル コ ー ル デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ遺伝子 （ A D H ) 、 酸 性 フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ遺伝子 （ P H O ) 、 ガ ラ ク ト ー ス遗 伝子 （ G A L ) 、 グ リ セ ロ ア ノレ デ ヒ ド 3 リ ン 酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ遺伝子 （ G P D ) 等 の プ ロ モ ー タ ー が好 ま し く 用 い る こ と がで き る も の と し て挙 げ ら れ る 。

こ こ で 、 配列番号 5 に 示 さ れ る 塩基配列 の 1 番 か ら 2 6 9 1 番 ま で の 塩基配列 お よ び配列 番号 7 に 示 さ れ る 塩基配列 の 1 番か ら 3 6 0 0 番 ま で の 塩基配列 は大腸菌 に お い て新規 ア ミ ラ ー ゼ を 効率 よ く 発現 さ せ る 。 よ っ て こ の 配列番号 5 お よ び 7 に 示 さ れ る 塩基配列 は 、 少な く と も 大腸菌 に お け る 発現 に 必要 な 配列 を 含ん で い る と 思 わ れ る こ と 力、 ら 、 こ の 配列 を そ の ま ま 利用 す る の も 好 ま し い o

ま た 、 宿主細胞が枯草菌、 酵母 の 場 合 に は 、 分泌型べ ク タ 一を 使用 し て、 菌体外 に 新規 ア ミ ラ ー ゼを 分泌す る こ と も 有利 で あ る 。

宿主細胞 と し て は 、 大腸菌 の 他 に 、 枯草菌、 酵母、 高 等真核生物を 用 い る こ と が で き る 。 枯草菌 と し て は例 え ば B a c i 1 u s 属 に 属す る 微生物 を 用 い る こ と が好 ま し い。 該属 に は 、 タ ン パ ク 質を 多 く 菌体外へ分泌す る 株 が存在す る こ と が知 ら れ て い る 。 従 っ て、 分泌型べ ク タ 一を 用 い る こ と に よ り 、 培養液 中 に 多量 の 組換え 新規 ァ ミ ラ ー ゼを分泌 さ せ る こ と が 出 来 る 。 さ ら に 培養上清か ら の 精製 も 容易 と な る の で好 ま し い 。 ま た 、 該属 に は 菌 体外 に プ ロ テ ア ー ゼを ほ と ん ど分泌 し な い 株 も 知 ら れ て お り 、 こ の よ う な 株 を 用 い る こ と に よ り 、 本発 明 に よ る 組換え 新規 ア ミ ラ ー ゼ を効率 よ く 生産す る こ と が 出 来 る の で好 ま し い 。 ま た 、 宿主細胞 と し て ダ ル コ ア ミ ラ ー ゼ を 産生 し な い 生物 を 選択す る と 、 菌体抽 出 液、 ま た は 簡 単 な 精製 を行 っ た 粗酵素 の 状態で本発 明 に よ る 組換 え 新 規 ア ミ ラ ー ゼを 得 て 、 そ れ を そ の ま ま 後記す る a ， a - ト レ ハ ロ ー ス の 製造 に 用 い る こ と がで き る の で、 極 め て 有利 で あ る 。

前記 し た形質転換体 の 産生す る 組換 え 新規 ァ ミ ラ ー ゼ は 、 次 の よ う に し て 得 る こ と が 出 来 る 。 ま ず上記 の 宿主 細胞 を 適切 な 条件下 で培養 し 、 得 ら れ た 培養物か ら 公知 の 方法、 例 え ば遠心分離 に よ り 菌体 を 得 て 、 こ れを適切 な 緩衝液 中 に 懸濁 し 、 凍結融解、 超音波処理、 磨砕等 に よ り 菌体 を破砕 し 、 遠心分離 ま た は ろ 過 に よ り 組換 え 新 規 ァ ミ ラ 一 ゼを 含有す る 菌体抽 出 物 を 得 る 。

こ の 菌体抽 出物 に 存在す る 組換 え 新規 ァ ミ ラ ー ゼ の 精 製 に は 、 公知の 分離、 精製法を 適 当 に 組 み 合わ せ て行 う こ と がで き る 。 例 え ば、 熱処理 の よ う な 耐熱性の 差 を 利 用 す る 方法、 塩沈緞 お よ び溶媒沈澱の よ う な 溶解性 の 差 を'利用 す る 方法、 透析、 限外 ろ 過、 ゲ ル ろ 過 お よ び S D S — ポ リ ア ク リ ル ァ ミ ド ゲ ル電気泳動 の よ う な 分子量 の 差 を 利用 す る 方法、 イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー の よ う な 電荷 の 差 を利用 す る 方法、 ァ フ ィ 二 テ ィ ー ク 口 マ ト グ ラ フ ィ 一 の よ う な 特異的親和性 を利用 す る 方法、 疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 、 逆相 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー の よ う な 疎水性 の 差を 利用 す る 方法、 更 に 等電点電気泳動 の よ う な 等電点'の 差 を 利用 す る 方法等が挙 げ ら れ る 。 こ の 組換 え新規 ア ミ ラ ー ゼ は 耐熱性 を 有す る た め 、 熱処理 に よ り 宿主 の タ ン パ ク 質 を 変性 さ せ る こ と に よ り 、 こ れ を 沈緞 と し て 除去で き る た め 、 精製 を 非常 に 簡単 に 行 う こ と が で き る 。

組換 え 体 を 用 い た α ， α - ト レ ハ ロ ー ス の 製造

本発 明 に よ れ ば、 上記 の 組換 え 新規 ア ミ ラ ー ゼ と 、 前 記 し た 組換え新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを 用 い た 、 a , a - ト レ ハ ロ ー ス の 製造法が提供 さ れ る 。

, α - ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造法 の 好 ま し い 態様 に よ れ ば、 本発 明 に よ る 組換え新規 ア ミ ラ ー ゼ と 、 組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ は 同 時 に デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物 マ ル ト オ リ ゴ糖等の 糖 と 、 混合 さ れ、 接触 さ れ て よ い。 ま た 、 組換え新規 ト ラ ン フ ェ ラ ー ゼ及 び組換え新規'ア ミ ラ ー ゼ の い ずれか一方 を 天然 由 来 の 酵素 に 置 き 換 え る こ と も 好 ま し い 。

デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 マ ル ト オ リ ゴ糖等 の 糖 の 使用 濃度 は、 用 い る 糖が溶解 さ れ う る 範囲で あ れ ば、 本 酵素 の 比活性、 反応温度等 を 考慮 し て 適宜選択 さ れ て良 い 力く、 0 . 5 〜 7 0 % の 範囲 と す る の が一般的 で あ り 、 好 ま し く は 5 〜 4 0 % の 範囲 で あ る 。 糖 と 酵素 と の 反応 に お け る 反応温度及 び Ρ Η 条件 は 本発明 に よ る 組換え新 規 ア ミ ラ ー ゼ、 お よ び組換 え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 最適条件で行 う こ と が好 ま し い 。 よ っ て 5 0 〜 8 5 °C程 度、 p H 3 . 5 〜 8 程度が一般的 で あ り 、 好 ま し く は 6 0 〜 7 5 °C、 p H 4 . 5 〜 6 . 0 の 範囲で あ る 。

ま た 高重 合度 の デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物等 の 糖 に お い て は 、 補助 的 に エ ン ド型液化 ア ミ ラ ー ゼ、 枝切 り 酵素 を 用 い る こ と に よ り な ， α - ト レ ハ ロ ー ス の 生成 を 促進 さ せ る こ と が で き る 。 こ の よ う な エ ン ド型液化 ア ミ ラ ー ゼ と し て は 、 例 え ば、 B a c i 1 1 u s 属 等 の パ ク テ リ ァ 、 A s p e r g i 1 1 u s 属 等 の か び、 麦芽等 の 植物 由 来の 酵素等が利用 で き る 。 ま た 枝切 り 酵素 に つ い て は 例 え ば B a c i 1 l u s 属、 K l e b s i e l l a 属等 ノく ク テ リ ア 由 来 の プ ノレ ラ ナ一ゼ、 P s e u d o m o n a s 属 由 来の ィ ソ ァ ミ ラ ー ゼ等が利用 で き る 。 更 に こ れ ら の 酵素を組み 合わ せ て使用 す る こ と も 可能で あ る 。

た だ し 、 過剰量の エ ン ド型液化 ア ミ ラ ー ゼ の 添加 は新 規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ に よ っ て利用 さ れ な い グ ル コ ー ス マ ル ト ー ス を 生成す る 。 ま た プ ル ラ ナ ー ゼ に お い て も 同 様 に 過剰量の 添加 は な - 1 ， 6 結合の 切断 に よ る 基質の 溶解度 の 低下 を 引 き 起 こ し 利用 さ れ な い 高粘度 の 不溶物 を生 じ る 。 よ っ て こ の 際 に 用 い る エ ン ド型液化 ア ミ ラ ー ゼ お よ び プ ゾレ ラ ナ一ゼ の 量 は 過剰 の グ ル コ ー ス 、 マ ル ト — ス 、 ま た は 不溶物を生成 し な い よ う 調節 さ れ る の が好 ま し い 。

ま た 、 プ ル ラ ナ ー ゼを 用 い る 場合 は、 基質 を あ ら か じ め プ ル ラ ナ ー ゼ に て前処理す る 方法、 ま た は a , a - ト レ ハ ロ ー ス の 生成反応 に 際 し て い ずれ か の 段階 で組換 え 新規 ァ ミ ラ ー ゼ お よ び新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ と を共存 さ せ て用 い る 方法 の い ず れで あ っ て も よ い 。

生成 さ れ た ， a - ト レ ハ ロ ー ス は 、 反応液を 公知 の 方法 に 従 い 精製す る こ と に よ っ て 得 る こ と が 出 来 る 。 例 え ば、 得 ら れ た 反応液 を イ オ ン 交換樹脂 に よ り 脱塩 し 、 活性炭、 イ オ ン 交換樹脂 （ H S 0 3 型） 、 ま た は 陽 ィ ォ ン 交換樹脂 （ C a 型） 等 を 分離剤 と す る ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に よ つ て 目 的 の 糖画 分 を 分離 し 、 ま た は 更 に 続 い て 濃縮 し 、 結晶化 さ せ る こ と に よ り 、 高純度の a ， a - ト レ ノヽ ロ ー ス を 得 る こ と が で き る 。

以下 に 、 具体 的 な 実施例 を 示 し 、 本発 明 を よ り 詳細 に 説明す る が、 本発 明 が こ れ ら の 実施例 に 制 限 さ れ な い こ と は 言 う ま で も な い 。

実施例 I 一 1 古細菌 の ダ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 生成活 下記 の 第 3 表 に 示す菌株 に つ い て グ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 生成活性 を 調べ た 。 方法 と し て は 、 各菌株 の 培養菌 体 を 超音波破砕処理、 遠心分離 を 行 い 、 そ の 上清 に 基質 で あ る マ ル ト ト リ オ ー ス を 最終 的 に 1 0 % と な る よ う に 加 え 、 6 0 °C で 2 4 時間反応後、 1 0 0 °C で 5 分間加熱 処理 し て反応 を 停止 さ せ た 後、 生成 し た ダ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を 、 以下 に 示す条件の H P L C 分析法 に よ り 測 定 し た。

カ ラ ム TO SOH T S K- g e I Am i " - 80 ( 4. 6 x 250 mm ) 溶媒 7 5 % ァ セ ト ニ ト リ ノレ

流速 1 . 0 m I /m i n

室温

QJ Έδ 示差屈折計

酵素活性 は、 マ ル ト ト リ オ ー ス を 1 時間 に 1 m o 1 の ダル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス に 変換す る 酵素活性を 1 ュニ ッ ト と し て示 し た。 但 し 、 第 3 表 に お い て は菌体 g 当 り の活性 と し て示 し た。

そ の H P L C チ ャ ー ト は図 1 ( B ) に示す通 り であ る 図 に示す よ う に、 主反応物 は H P L C チ ャ ー ト 上で は ァ ノ マ ー の な い一本の ピ ー ク と し て、 未反応基質よ り やや 遅れて現れた。 な お、 こ の主生成物を T S K- g e l am i d e - 80 HP L C c o l umn にて分取 し 、 一 N M R 、 ^{1 3} C - N M R に よ り 解析の結果、 グノレ コ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス で あ る こ と を確認 し た。 化学式 は以下の通 り で あ る 。

そ の結果、 S u 1 f o 1 o b a 1 e s 目 に 属す る 菌株 の細胞抽 出液 は ダル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス生成活性、 即 ち 本酵素 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ活性を 有す る こ と がわ か っ た 第 3 表

株る 酵素活性 (Units/g-cell)

Sulfolobus so 1 i a t a r l cus ATCC 35091 6. 8

ATCC 35092 6. 0

DSM 5354 13. 0

DS 5833 5. 6

KM1 13. 5

Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909 13. 0

ATCC 49426 2. 4

Sulfolobus shibatae DSM 5389 12. 0

Ac i di anus brierieyi DSM 1651 6. 7 実施例 I 一 2 S u 1 f o 1 o b u s

s 0 1 f a a r i c u s K M 1 株由来の本酵素 ト ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の精製

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株を、 2 g Z リ ッ ト ル の可溶性デ ン プ ン及 び 2 g リ ッ ト ル の 酵母エ キ ス を含む

A m e r i c a n T y p e C u l t u r e

C o l l e c t i o n ( A T C C ) 発行 C a t a l o g u e o f B a c t e r i a a n d P h a g e s 1 8 版 （ 1 9 9 2 ) に 記載 の 培地番号 1 3 0 4 の 培地 で 7 5 °C、 3 日 間培養 し た 。 遠心分離 に よ り 集菌 し 、 — 8 0 °C に て保存 し た 。 菌体 の 収率 は 3 . 3 g Z リ ッ ト ル で あ っ た 。

上記 の よ う に し て 得 ら れ た 菌体 2 0 0 g を 5 m M の E D T A を 含む 5 0 m M酢酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) 4 0 0 m 1 に 懸濁 し 、 0 °C で 1 5 分 間、 超音波 破砕処理 に よ り 溶菌 し 、 次 に 遠心分離 を 行 い 上清溶液 を 得 た。 こ れ に 硫安 を 6 0 % 飽和 と な る よ う に 加 え た 。

遠心分離 し て得 ら れ た沈澱 を 1 M の 硫安、 5 m M の E D T A を 含む 5 O m M酢酸 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に 溶解 し 、 同緩衝液 に て平衡化 し た 疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TOSOH T S K- g e 1 Ph eny l - TOYOPE ARL 650 S 8 0 0 m 1 ) に 通 し た 。 カ ラ ム を j¾]緩 衝液 に て洗浄 し 、 次 に 6 0 0 m 1 の 1 M〜 0 M硫安の 線 状勾配で標的 ト ラ ン ス フ X ラ ー ゼ を 溶離 し た 。 活性画分 を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 弓卜き 続 き 1 O m M酢酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た 。

次 い で 同緩衝液 に て平衡化 し た イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TO SOH TSK— g e l D E A E - T 0 Y 0 P E A R L 650 S 3 0 0 m l ) に 通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て 洗浄 し 引 き 続 き 9 O O m l 0 O M〜 O . 3 M食塩 の 線状勾配で 標 的 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ を 溶離 し た 。 活性画分 を 限外濾 過膜 （分子量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 引 き 続 き 0 . 1 5 M の 食塩、 5 m M の E D T A を 含む 5 0 m M酢 酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た 次 に 脱塩濃縮液を ゲ ル濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： Ph a rma c i a H i L o a d 16/60 S u p e r d e x 200 p g ) に 載せ 同緩衝液 に て標的 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ を 溶 出 し た 。 活性 画分 を を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃 縮 し 、 引 き 続 き 5 0 m M 酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に 脱塩濃縮液 に 1 M と な る よ う 硫安を 溶解 し 、 同緩 衝液 に て平衡化 し た疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TOSOH T S K- g e 1 P h e n y 1 - 5 PW HP L C ) に 通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 3 0 m l の l M 〜 0 M硫安 の 線状勾配で標的 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼを 溶離 し た 。 活性 画分 を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 1 0 m M酢酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 0 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

'次 に 同緩衝液 に て平衡化 し た イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TOSOH TSK-g e I D E A E 5 PW HPL C ) に 通 し た 。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 3 O m l の 0 M 〜 0 . 3 M 食塩 の 線状勾配で標 的 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ を 溶離 し た 。 活性画分 を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し た 。 最終的 に ネ ィ テ ィ ブ ポ リ ア ク リ ル ァ ド ゲル、 S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲル、 及 び等電点電気泳動 に て単一 バ ン ド を 示す精製酵素を得 た

な お、 活性測定 は 、 実施例 I — 1 と 同様 に行 つ た。 各精製 ス テ ッ プ に お け る 総酵素活性 、 総蛋 白量、 比活 性を以下の第 4 表 に 示す。 精製画分 総酵活性 比活性 . 回収率 精製度

(lin i i s ) (m g ; (L'n i t s/mg) (%) (倍） 抽出上清 653 17000 0. 038 100 1

60%硫安沈港 625 15000 0. 04 95. 1 1. 1

Pheny l 83 533 0. 16 12. 1 4. 2

DEAE 150 31 4. 90 23. 0 129 ゲル濾過 111 2 55. 1 11. 0 1466

Pheny lリク口マト 48 0. 11 211 1. 4 7289

DEAEリクロマト 30 0. 05 598 4. 6 15737 実施例 I 一 3 S u 1 f o 1 o b u s

s ' 0 1 f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株由来の本 酵素 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の精製

S u 1 f o 1 o b u s s o 1 f a t a r 1 c u s

D S M 5 8 3 3 株を 、 2 g Z リ ッ 卜 ノレ の可溶性デ ン プ ン 及び 2 g Z リ ッ ト ル の酵母エ キ ス を含む

A m e r i c a n y e C u 1 t u r e C o l l e c t i o n ( A T C C ) 発行

C a t a l o g u e o f B a c t e r i a a n d P h a g e s 1 8 版 （ 1 9 9 2 ) に 記載 の 培地番号 1 3 0 4 の 培地 で 7 5 °C、 3 日 間培 養 し た 。 遠心分離 に よ り 集菌 し 、 一 8 0 °C に て 保存 し た 。 菌体 の 収率 は 1 . 7 g リ ッ ト ル で あ っ た 。

上記 の よ う に し て 得 ら れ た 菌体 5 6 g を 5 m M の E D T A を 含 む 5 0 m M酢酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) 1 0 0 m 1 に 懸濁 し 、 0 °C で 1 5 分 間、 超音波 破砕処理 に よ り 溶菌 し 、 次 に 遠心分離 を行 い 上清溶液を 得 た。

次 に 上清溶液 に 1 M と な る よ う 硫安 を溶解 し 、 1 Mの 硫安、 5 m M の E D T A を 含む 5 O m M齚酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て平衡化 し た 疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TOSOH TSK-ge l Ph e ny 1 -TOYOPEARL 650 S 2 0 0 m l ) に通 し た 。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 次 い で 6 0 0 m 1 の 1 M〜 0 M硫安 の 線状勾配で標的 ト ラ ン ス フ X ラ ー ゼを 溶離 し た。 活性画分を 限外濾過膜 (分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 引 き 続 き 1 0 m M ト リ ス 塩酸緩衝液 （ p H 7 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た 。

次 に 同緩衝液 に て平衡化 し た イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TO S 0 H TSK-g e l D E A E - T 0 Y 0 P E A R L 650 S 3 0 0 m l ) に 通 し た 。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 9 0 0 m 1 の 0 M〜 0 . 3 M食塩 の 線状勾配で標 的 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 溶離 し た 。 活性画分を 限外濾過 膜 （分子量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 5 m M の E D T A を 含 む 5 O m M酢酸 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液

( P H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た 。

次 に 脱塩濃縮液 に 1 M と な る よ う 硫安 を 溶解 し 、 同緩 衝液 に て平衡化 し た 疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TO SOH T S K- e 1 P h e n y 1 - T 0 Y 0 P E A R L 650 S 2 0 0 m l ) に 通 し た 。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 6 0 0 m 1 の 1 M〜 0 M 硫安 の 線状勾配で標 的 ト ラ ン ス フ ヱ ラ 一ゼ を 溶離 し た。 活性画分 を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 弓 1 き 続 き 0 . 1 5 M の 食塩、 5 m M の E D T A を 含む 5 O m M酢酸 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液

( P H 5 . 5 ) に て 洗浄、 脱塩 し た 。

次 に 脱塩濃縮液を ゲ ル濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： Ph a rma c i a H i Lo a d 16/60 S u p e r d e x 200 p g ) に 載せ 同緩衝液 に て標 的 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 溶 出 し た 。 活性 画分を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し'、 弓 i き 続 き 2 5 m M ビ ス - ト リ ス H C 1 緩衝液

( p H 6 . 7 ) に て透析 し た 。

次 に 同緩衝液 に て 平衡化 し た ク ロ マ ト フ ォ 一 力 シ ン グ

( カ ラ ム ： フ ァ ノレ マ シ ア Mon o P HR/5/20 ) に 通 し た 。 サ ン プ ル を 注入後、 直 ち に 1 0 % ポ リ バ ッ フ ァ ー 7 4 H C 1 ( p H 5 . 0 フ ァ ノレ マ シ ア 社製） に て標的 ト ラ ン ス フ エ ラ 一ゼを溶離 し た。 活性画分を 限外濾過膜 （分子 量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 2 5 m M ビ ス - ト リ ス H C 1 緩衝液 ( P H 6 . 7 ) に て透析 し た さ ら に 同様の 条件 に て ク ロ マ ト フ ォ — カ シ ン グを行 い 標的 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼを 溶離 し た。 活性画分を 限外濾 過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き

5 m M の E D T A を含む 5 0 m M酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 ( P H 5 . 5 ) に て洗浄、 SJL -in し o

最終的 に 不 ィ テ ィ ブ ポ リ ァ ク リ ル ァ ミ ド ゲ ノレ、 S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 、 及び等電点電気泳動 に て単一 バ ン ド を示す精製酵素を 得た。

な お 、 活性測定 は、 実施例 I 一 1 と 同榇 に行 つ た。 各精製 ス テ ッ プ に お け る 総酵素活性、 総蛋 白量、 比活 性を以下の 第 5 表 に 示す。

第 5

精製画分 総酵素活性

比活性 回収率 精製度

(Un i t s ) (m g) (Un i t s/mg) (%) (倍） 抽出上清 541 10000 0. 06 100 1

PH eny 1 1039 988 1. 05 192 19

DEAE 383 147 2. 60 70. 7 4 ?

Ph eny lリク口マト 248 49. 5 5. 00 45. 8 91 ゲル濾過 196 3. 69 53. 0 36. 1 964

Mono P 92 0. 32 287 Π. 0 5218

Mono Pリク口マト 64 0. 13 494 11. 9 8982 実施例 I 一 4 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来 の 本酵素 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ の 精製

S u 1 f 0 1 0 b u s

a c i d 0 c a 1 d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 を 、 2 g / リ ッ ト ル の 可溶性 デ ン プ ン 及 び 2 g Z リ ツ ト ル の 酵母エ キ ス を 含む A m e r i c a n T y e C u l t u r e C o 1 1 e c t i o n ( A T C C ) 発 行 C a t a 1 0 g u e o f B a c t e r i a a n d P h a g e s 1 8 版 （ 1 9 9 2 ) に記載 の 培 地番号 1 3 0 4 の 培地 （ P H 3 . 0 ) で 7 5 °C、 3 曰 間 培養 し た o 心分離 に よ り 集菌 し 、 一 8 0 °C に て保存 し た。 菌体 の 収率 は 2 . 9 g / リ ッ ト ルで あ つ た。

上記の よ う に し て得 ら れ た 菌体 9 2 . 5 g を 5 m M の E D T A を 含む 5 0 m M酢酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ P H 5 . 5 ) 2 0 0 m 1 に 懸濁 し、 0 °C で .1 5 分間、 超音波 破砕処理 に よ り 溶菌 し 、 次 い で遠心分離 を行 い上清溶液 を得 た。

'次 に 上清溶液 に 1 M と な る よ う 硫安 を 溶解 し 、 1 M の 硫： 5?、 5 m M の E D T A を 含む 5 O m M酢酸 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て平衡化 し た 疎水 ク ロ マ ト ダ ラ フ ィ — （ カ ラ ム ： TO S OH T S K- g e 1 P h e n y 1 - T 0 Y 0 P E A L 650 S 4 0 0 m l ) に 通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 次 い で 6 0 0 m 1 の 1 M〜 0 M硫安の 線状勾配で標的 ト ラ ン ス フ ニ ラ ー ゼを 溶離 し た 。 活性画分 を 限外濾過膜 (分子量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 弓 1 き 続 き 1 0 m M ト リ ス 塩酸緩衝液 （ p H 7 . 5 ) に て 洗浄、 脱塩 し た 。

次 に 同緩衝液 に て平衡化 し た イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TOSOH T SK-g e l D E A E - T 0 Y 0 P E A R L 650 S 3 0 0 m 1 ) に 通 し た 。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 9 0 0 m 1 の 0 M〜 0 . 3 M 食塩 の 線状勾配で標 的 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 溶離 し た 。 活性画 分 を 限外滤過 膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 弓 I き 続 き 5 m M の E D T A を含む 5 O m M酢酸 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 ( P H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に 脱塩濃縮液 に 1 M と な る よ う 硫安 を 溶解 し 、 同緩 衝液 に て平衡化 し た疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TO SOH TSK- e l Ph e "ト TOYOPEARL 650 S 2 0 0 m l ) に 通 し た 。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 6 0 0 m 1 の 1 M〜 0 M硫安 の線状勾配 で標的 ト ラ ン ス フ ヱ ラ 一ゼ を 溶離 し た 。 活性画分 を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 弓 I き 続 き 0 . 1 5 M の 食塩、 5 m M の E D T A を 含む 5 O m M酢酸 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 ( H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た 。

次 に 脱塩濃縮液を ゲ ル濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： Ph a rma c i a H i " " 16/60 S u p e r d e x 200 p g ) に 載せ 同緩衝液 に て 標的 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 溶 出 し た 。 活性 画分 を を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃 縮 し 、 引 き 続 き 2 5 m M ビ ス - ト リ ス H C 1 緩衝液 ( H 6 . 7 ) に て 透析 し た 。

次 に 同 緩衝液 に て 平衡化 し た ク ロ マ ト フ ォ ー カ シ ン グ ( カ ラ ム ： フ ァ ノレ マ シ ア Mo no P HR/5 /20 ) に 通 し た 。 サ ン プ ル を 注入後、 直 ち に 1 ◦ % ポ リ バ ッ フ ァ ー 7 4 H C 1 ( p H 5 . 0 フ ァ ノレ マ シ ア 社製） に て標 的 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 溶離 し た 。 活性画分 を 限外濾過膜 （分 子量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 弓 Iき 続 き 2 5 m M ビ ス - ト リ ス H C 1 緩衝液 （ p H 6 . 7 ) に て透析 し た さ ら に 同様の 条件 に て ク ロ マ ト フ オ ー カ シ ン グ を行 い 標的 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼを 溶離 し た。 活性画分を 限外濾 過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 引 き 続 き 5 m M の E D T A を 含む 5 O m M酢酸 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 ( p H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

最終 的 に ネ イ テ ィ ブ ポ リ ア ク リ ノレ ア ミ ド ゲ ル、 S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル、 及 び等電点電気泳動 に て単一 バ ン ド を 示す精製酵素 を 得 た 。

'な お 、 活性測定 は 、 実施例 I 一 1 と 同様 に 行 っ た 。 各精製 ス テ ッ プ に お け る 総酵素活性、 総蛋 白量、 比活 性 を 以下の 第 6 表 に 示す。 第

精製画分 総職活性

比活性 回収率 精製度

(Units ) (mg) (Uni t s/mg) (%) (倍） 抽出上清 912 38000 0.24 100 1

Phen 1 559 660 0.85 61.3 3.5

DEAE 806 丄 1

Phenylリクロマト 636 35.1 18.1 69.1 75 ゲル濾過 280 2.68 104 30.7 433

Mono P 126 0.35 411 13.8 1713

Mono Pリク口マト 86.9 0.24 362 9.5 1508 実施例 I — 5 A c d a n u s

b i e r 1 e y D S M 6 5 1 株由来の本酵素 ト ラ ン ス フ ェ ー ゼの 精製

A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株を、 D e u t s c h e S a m m 1 u n g v o n M i k r o o r g a n i s m e n u n d Z e l 1 k u 1 t u r e n G m b H ( D S M ) 発行 C' a t a l o g u e o f S t r a i n s 5 版

( 1 9 9 3 ) に記載の 培地番号 1 5 0 の 培地で 7 0 °C、 3 日 間培養 し た。 遠心分離 に よ り 集菌 し 、 一 8 0 °C に て 保存 し た。 菌体の収率 は 0 . 6 g Z リ ッ ト ルであ っ た。

上記の よ う に し て得 ら れた菌体 1 2 g を 5 m M の E D T A を含む 5 0 m M酡酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ p H 5 . 5 ) 1 2 0 m l に 懸濁 し 、 0 °C で 1 5 分 間、 超音波 破砕処理 に よ り 溶菌 し 、 次 い で遠心分離 を 行 い上清溶液 を 得 た 。

次 に 上清溶液 に 1 M と な る よ う 硫安 を 溶解 し 、 1 M の 硫安、 5 m M の E D T A を 含 む 5 O m M 詐酸 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て平衡化 し た 疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TO SOH TSK- g e l P h e n y 1 - T 0 Y 0 P E A R L 650 S 2 0 0 m l ) に 通 し た。 カ ラ ム を 同 緩衝液 に て 洗浄 し 次 い で 6 0 0 m 1 の 1 Μ〜 Ο Μ 硫安の 線状勾配で 標 的 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 溶離 し た 。 活性画分 を 限外濾過膜 (分子量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 弓 I き 続 き 1 0 m M ト リ ス 塩酸緩衝液 （ p H 7 . 5 ) に て 洗浄、 脱塩 し た o

次 に 同緩衝液 に て平衡化 し た イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 （ カ ラ ム ： TG SOH TSK-g e 1 D E A E - T 0 Y 0 P E A R L 65 O S 3 0 0 m l ) に通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 9 0 0 m l O 0 M〜 0 . 3 M食塩 の 線状勾配 で標 的 ト ラ ン ス フ ラ ー ゼ を溶離 し た。 活性画分 を 限外濾過 膜' （分子量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 引 き 続 き 0 . 1 5 M の 食塩、 5 m M の E D T A を 含 む 5 0 m M酢 酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た 次 に 脱塩濃縮液 を ゲ ル濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： Ph a rma c i a H i L o a d 16/60 S u p e r d e x 200 p g ) に 載せ 同緩衝液 に て標的 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 溶 出 し た 。 活性 画分 を を 限外濾過膜 (分子重 カ ツ 卜 1 3 0 0 0 ) に て 濃 縮 し 、 引 き 続 き 2 5 m M ビ ス - ト リ ス H C 1 緩衝液 ( H 6 . 7 ) に て透析 し た 。

次 に 同緩衝液 に て平衡化 し た ク π マ 卜 フ ォ 一 力 シ ン グ ( カ ラ ム ： フ ア ル マ シ ァ Mo n o P HR 5/20) に 通 し た 。 サ ン プ ル を 注入後、 直 ち に 1 0 % ポ リ ノ ッ フ ァ - 7 4 H C 1 ( P H 5 . 0 フ ァ ノレ マ シ ァ 社製） に て 標 的 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー セ を 溶離 し た 。 活性画 分 を 限外濾過膜 （分 子量 カ ツ h 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 引 き 続 き 5 m M の E D T A を 含む 5 0 m M酔酸 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 （ P H 5 . 5 ) に て洗浄、 し た。

最終 的 に ネ ィ テ ィ ブ ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲル、 S D S ポ リ ア ク リ ノレ ア ミ ド ゲ ル、 及 び等 点 ^メ '冰動 に て単一 バ ン ド を 示す精製酵素 を 得 た 。

な お 、 活性測定 は 、 実施例 I — 1 と 同様 に 仃 つ た 。 各精製 ス テ ッ プ に お け る 総酵素活性、 総蛋 白量、 比活 性 を 以下の 第 7 表 に 示す

第 7 表

精製画分 総隨活性 比活性 回収率

(Units ) (m g) (Uni ts/mg (%) (倍) 抽出上清 310 264 1.17 100 1

Phenyl Π6 19.2 9.20 56.9 7.9

DEAE 70 5.02 13.8 22.5 12

ゲル濾過 54 0.18 298 17.3 255

Mono P 27 0.07 318 8.6 323 実施例 I 一 6 本酵素 ト ン ス フ エ 一ゼ の 諸性質の 検 実施例 I 一 2 で得 ら れ た 精製酵素の 酵素学的諸性質を 測 定 し た

( 1 ) 分子量

ネ ィ テ ィ ブ な 状態 で の 精製酵素 の 分子量測定 は 、 ゲ ル 濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 カ ラ ム ： Ph a rma c i a H i L o a d 16/60 S u p e r d e∑ 200 p g) に よ り 行 っ た 。 マ ー カ ー タ ン パ ク 質 と し て 分子量 2 0 0 ， 0 0 0 ； 9 7 , 4 0 0 ； 6 8 0 0 0 ; 4 3 , 0 0 0 ； 2 9 , 0 0 0 ； 1 8 , 4 0 0 ; 1 4 , 3 0 0 の も の を 用 い た。

そ の 結果、 該 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 分子量 は

5 4 ， 0 0 0 で あ つ

ゲ ル濃度 6 % の S D S ポ リ ア ク リ ノレ ア ミ ド ゲ ル電気泳 動 に よ り 分子量測定 を 行 っ た。 マ ー カ ー タ ン ノヽ。 ク 質 と し て分子量 2 0 0 , 0 0 0 ； 1 1 6 , 3 0 0 : 9 7 , 4 0 0 ; 6 6 , 3 0 0 ； 5 5 , 4 0 0 ； 3 6 , 5 0 0 ; 3 1 ， 0 0 0 ； 2 1 ， 5 0 0 ; 1 4 , 4 0 0 の も の を 用 い'た 。

そ の 結果、 該 ト ラ ン ス フ X ラ ー ゼ の 分子量 は

7 6 ， 0 0 0 で あ つ た 。

ゲ ル濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 と S D S ポ リ ア ク リ ル ァ ミ ド ゲ ル電気泳動 に お け る 分子量の 測定値 に 相違が見 ら れ た が、 こ れ は多分、 ゲ ル濾過 カ ラ ム の 充填剤 と タ ン パ ク 質 と の 間 に 何 ら かの相互作用 が働 く た め で は な い か と 考え ら れ る 。 よ っ て、 ゲル濾過 に よ る 分子量の値 は本酵 素の ネ ィ テ ィ ブな 状態で の 分子量を 示 し て い る と は必ず し も い え な い。

( 2 ) 等電点

ァ ガ ロ ー ス ゲル等電点電気泳動の 結果、 等電点 は 6 . 1 で あ っ た。

( 3 ) 安定性

得 ら れた精製酵素の 各温度、 各 p H に お け る 安定性を そ れぞれ図 2 、 図 3 に 示す。 測定 は、 p H 3 〜 5 の 間 は グ リ シ ン塩酸系緩衝液を、 p H 4 〜 6 の 間 は酢酸ナ ト リ ゥ ム 系緩衝液を、 p H 5 〜 8 の 間 は燐酸ナ ト リ ウ ム 系緩 衝液を、 p H 8 〜 9 の 間 は ト リ ス塩酸系緩衝液を 、 p H 9 〜 1 0 の 間 は炭酸水素 ナ ト リ ゥ ム 系緩衝液を、 p H 1 1 〜 1 3 の 間 は K C 1 — N a O H系緩衝液を そ れ ぞれ用 い た。

本酵素 は 8 5 °Cで 6 時間の処理で安定で あ り 、 ま た p H 4 . 0 〜 1 0 . 0 の 室温 6 時間の 処理で安定であ つ た'。

( 4 ) 反応性

得 ら れた精製酵素の 各温度、 各 p H に お け る 反応性を そ れぞれ図 4 、 図 5 に 示す。 測定 は、 p H 3 〜 5 の 間 は グ リ シ ン塩酸系緩衝液 （□ ) を、 p H 4 〜 5 . 5 の 間 は 酢酸ナ ト リ ウ ム 系緩衝液 （參） を、 p H 5 〜 7 . 5 の 間 は燐酸 ナ ト リ ウ ム 系緩衝液 （△ ) を 、 p H 8 〜 9 の 間 は リ ス 塩酸系緩衝液 （◊ ) を そ れ ぞれ用 い た 。

本酵素 は 6 0 〜 8 0 °C付近 に 反応最適温度、 p H 5 . 0 〜 6 . 0 付近 に 反応最適 P H を 有す る 。

( 5 ) 各種活性化剤 、 阻害剤 の 影響

実施例 I 一 1 の ダ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 生成活性 の 測 定法 に お い て以下 の 第 8 表 に 示す物質 を 基質 と 共 に 添加 し 、 そ れ ぞ れ の 場 合 の 活性測定 を 実施例 I 一 1 と 同様 に 行 い 、 活性化又 は 阻害 の 有無 を調べ た 。 そ の 結果、 鋦 ィ オ ン 、 S D S に て 阻害 を 受 け る こ と が わ か っ た 。 糖関連 酵素で は カ ル シ ゥ ム イ オ ン に よ っ て 活性化 さ れ る 場 合が 多 く 認 め ら れ る が、 本酵素で は カ ノレ シ ゥ ム イ オ ン に よ つ て は 活性化 さ れ な い 。

^{8 ¾}

¾¾¾¾力 πに ¾"ォる

(mmu) ffi '1 対 <Λ J'? f s¾ |_ control 艇添加 100. o

CaC 1 η U 93 6

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J u1. n u U l ϋ 8 008 h

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1 Π U» (J, u 5 r t; 1 q ϋ q(l (I

Q JR U. 08 Jl- プ卜ェタノー ! ϋ 1 (1(1 5 チ； i "ス レイ 1—ゾし

ゲ し—，一ス η U. u ζ u f . ϋ k しノヽ Ί一ス η U. υ R 1 (17 8 マゾし

マルトペンタオース 0. 5 101. 9 マル卜へキサオース 0.5 91. 0 マルトへプタオ一ス 0.5 93.5 01 -

( 6 ) 基質特異性

本精製酵素を以下の 第 9 表 に 示す基質 に作用 さ せ て、 a - 1 , α — 1 転移体の生成の 有無を 調べ た。 な お、 活 性測定 は実施例 I 一 1 と 同様 に 行 っ た。 第 9 表

^応 te

グルコース

マルトース

マルトトリオース （G3) +

マルトテトラオース （G4) + +

マルトペン夕オース （G5) + +

マルトへキサオース （G6) + +

マルトへプタオース （G7) + +

イソマルトトリオース

ィソマルトテトラオース

ィソマルトペン夕オース

パノース そ の 結果、 本精製酵素 に 関 し て は、 マ ル ト ト リ オ ー ス ( G 3 ) 〜 マ ル ト ヘ プ 夕 オ ー ス （ G 7 ) 力、 ら ト レ ノヽ 口 一 ス オ リ ゴ糖の生成が確認 さ れ た。 ま た、 a — 1 , 6 結合 を還元末端か ら 1 つ 目 〜 4 つ 目 、 又 は 2 つ 目 に有す る ィ ソ マ ル ト ト リ オ ー ス 、 イ ソ マ ノレ ト テ ト ラ オ ー ス 、 イ ソ マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス 、 パ ノ ー ス に 対 し て は い ずれ も 反応 し な 力、 つ た。

な お 、 実施例 I — 3 〜 I 一 5 で得 た

S u l i o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株、 S u l f o l o b u s a c i d o c a 1 d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株、

A c i d i a n u s b r i e r 1 e y i D S M 1 6 5 1 株 由 来の 各精製酵素 に つ い て も 同様 の 方法 に よ り 酵素学的性質を調べ、 そ の 結果を前記 し た 第 1 表 に 示 I ナ- 実施例 I 一 7 マ ル ト オ リ ゴ糖か ら の ダル コ シ ル ト レ ハ D 一 ス 及 び マ ル ト ォ リ ゴ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造

基質を 1 0 O m M の マ ル ト ト リ オ ー ス （ G 3 ) 〜 マ ル ト ヘ プ 夕 オ ー ス （ G 7 ) と し 、 実施例 I — 2 で得 ら れた 精製酵素 1 3 . 5 Un i t s/m l ( マ ノレ ト ト リ オ ー ス を基質 と し て作用 さ せ た と き の 酵素活性） を そ れぞれ作用 さ せ、 対応す る α — 1 , α — 1 転移体 を生成 さ せ た。 各生成物 の 分析法 は実施例 I 一 1 の方法 に よ り 行 い 、 そ の収率及 び酵素活性を調べ た。 な お、 第 1 0 表 中で の 酵素活性 は 各マ ル ト オ リ ゴ糖を 1 時間 に 1 ί ΐη ο ΐ の 対応す る α — 1 _α — 1 転移体 に変換す る 酵素活性を 1 ュ ニ ッ ト と し て示 し た。 結果 は以下の 第 1 0 表 に 示 し た通 り で あ る 。 03 — 第 10表

酵素ヽ活性 収率

uni t s/mU Ooソ

マルトトリオース (G3) 13. 5 44. 6 マルトテトラオ一ス (G4) 76. 3 73. 1 マルトペンタォース (G5) 111. 3 68. 5 マル卜へキサォ一ス (G6) 100. 9 63. 5 マルトへプタオ一ス (G7) 70. 5 68. 7 表の 結果 よ り 、 基質 は G 5 の 時、 最 も 活性が高 く 、

G 3 の お よ そ 8 倍を 示 し た。 ま た、 収率 は G 3 の 場合 4 4 . 6 % で あ る 力く、 G 4 以上で は 6 3 . 5 〜 7 3 . 1 % で あ つ 7t_

ま た 、 G 3 、 G 4 、 及び G 5 を基質 と し て得 ら れた反 応生成物の組成を調べ た と こ ろ そ の 結果 は、 そ れぞれ図 6 〜 8 に示 し た通 り で あ つ た。

す な わ ち 、 マ ノレ ト ト リ オ一 ス を基質 と し て用 い た場合 主反応で あ る ダル コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス の 生成 と と も に 、 副反応 と し て等モ ルずつ の マ ル ト 一 ス 及 び グル コ ー ス が 生成 さ れ た。

マ ノレ ト テ ト ラ オ ー ス 以上の 重合度 n を持つ 糖を基質 と し て用 い た場合で は、 主反応 と し て ま ず還元末端の グ ル コ ー ス 単位力く α — 1 ， ― 1 結合 し た 重合度 n の糖が生 成 さ れ、 同様 に副反応 と し て等モ ルずつ の 重合度 （ n — 0 4

1 ) 糖及 び グゾレ コ ー ス が生成 さ れた。 さ ら に こ れ ら の 糖 の 反応が進む と 、 二次的 に 、 重合度 （ η — 1 ) 糖か ら 同 様 の 反応が進ん だ （ な お、 図 7 、 8 に お い て 3 糖又 は 4 糖 と 示 し た糖 に は そ れぞれ、 未反応の マ ル ト ト リ オ ー ス 又 は マ ル ト テ ト ラ オ 一 ス と 、 二次的 に 同様の 反応が進み そ の 末端力く α — 1 , a - 1 結合 し た糖が含 ま れて い る ） ま た、 重合度 （ n + 1 ) 以上 の 糖、 す な わ ち 分子間の転 移体の 生成 は認 め ら れ な か つ た 。 な お、 副反応で あ る 加 水分解 は鎖長が G 4 以上 に な る と 少 な く な る こ と が認め ら れ た。

こ れ ら の主反応物の例 と し て、 基質 G 3 、 G 4 、 及 び G 5 か ら の主生成物で あ る 3 糖、 4 糖、 及 び 5 糖を T S Κ - g e l a m i d e - 8 0 H P L C c o 1 u m nに て分取 し 、 ¹ Η - N M R 、

3 C 一 N M R に よ り 解析を行 っ た。 そ の 結果、 い ずれ も 還-元末端の グル コ ー ス 残基 1 個が α — 1 , ひ 一 1 で結合 し た構造を示 し 、 そ れぞれ グ ル コ シ ル ト レ ロ ー ス ( α 一 D — マ ノレ ト シ ノレ α — D — グル コ ピ ラ ノ シ ド ） 、 マ ル ト シ ノレ ト レ ロ ー ス （ な 一 D — マ ル ト ト リ オ シ ノレ α — D — グ ノレ コ ピ ラ ノ シ ド ） 、 及 び マ ノレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス （ ひ 一 D — マ ル ト テ ト ラ オ シ ル α — D — グ ノレ コ ピ ラ ノ シ ド） で あ る こ と を確認 し た。 こ れ ら の 化学式 は そ れぞれ以下の 通 り で あ る 。

— SO T —

II0/S6<If/X3«I ひ 9 S6 OAS. 以上の 結果力、 ら 、 本発明の 酵素 は グル コ ー ス 力く な 一 1 4 で結合 し た マ ル ト ト リ オ ー ス 以上の グ ル コ ー ス ポ リ マ 一 の 還元末端 ¾ 、 fe移 に よ り 一 1 , a - 1 で結合 さ せ る 活性を 有す る 酵 で あ る と 祐 · aw e れ る ま た 、 副反応 と し て、 糖転移酵素 に よ く 観察 さ れ る よ う に 、 水分子を 受容体 と し て加水分解反応 し 、 遼兀末端側 の結合 1 個 を 切断 し て ダ ル コ ー ス 1 分子を遊離す る こ と ち わ か つ た。 実施例 I 一 8 マ ゾレ ト オ リ ゴ糖混合物か ら の グ ル コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 、 マ ル ト オ リ ゴ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造 実施例 I 一 2 で得 ら れ た精製酵素 1 0 Un i t s / m 1 ·¾τ用 い 基質を可溶性 デ ン プ ン （ ナ 力 ラ イ テ ス ク 社製、 特級品） の α — ァ ミ ラ ー ゼ分解物 （ ヨ ウ 素デ ン プ ン 反応を 示 さ ず オ リ ゴ糖 に ま で分解 さ れ た も の ： な お こ こ に お い て用 い ら れ た な 一 ァ ミ ラ ー ゼ は、 S i gma 社製の A- 0213 ァ ス ぺ ル ギ ル ス • ォ リ ゼ 由来の も の ） と し 、 グル コ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス及 び各種の マ ル ト ォ リ ゴ シ ノレ ト レ ノ、 □ ー ス の製造 を試み た o 応液 は以下 に 示す条件下の H P L C 分析法 に.よ り 分析を仃 つ た 。

カ ラ ム B I ORAD A I Ν Ε X H P X- 42 A ( 7. 8 30 Omm ) 溶媒 水

流速 0 . 6 m 1 /m i n

温度 8 5 °C

UJ Έδ 示差屈折計

図 9 に そ の H P L C に よ る 分析チ ヤ ー ト を 示 し た （A) な お 対照 と し て 、 本酵素 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ を 添加 し な い 場 合 の H P L C チ ャ ー ト を 示 し た （B) 。 そ の 結果、 反 応生成物 の オ リ ゴ糖類 は 還元末端が α — 1 , α - 1 に 転 移 さ れ る た め 、 対照 の ア ミ ラ ー ゼ の み に よ る 生成物 よ り も 各 々 保持時 間 が短 い オ リ ゴ糖類 を 生 じ た 。 こ れ ら の 反 応物 の 例 と し て 、 実施例 I 一 7 の 場 合 と 同 様 に 3 糖、 4 糖、 及 び 5 糖 を そ れ ぞれ分取 し 、 — N M R、

1³ C — N M R に よ り 解析 を 行 っ た と こ ろ 、 い ず れ も 還元 末端 の グ ル コ ー ス 残基 1 個 力く ひ 一 1 , 一 1 で結 合 し た 構造 を 示 し 、 そ れ ぞ れ ダ ル コ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス （ a — D 一 マ ル ト シ ル α — D — グ ル コ ピ ラ ノ シ ド ） 、 マ ノレ ト シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス （ a — D — マ ゾレ ト ト リ オ シ ノレ a — D — グ ノレ コ ピ ラ ノ シ ド） 、 及 び マ ル ト ト リ オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス （ 一 D — マ ル ト テ ト ラ オ シ ノレ α — D — ダ ル コ ビ ラ ノ シ ド） で あ る こ と を 確認 し た 。 こ れ ら の 化学式 は そ れ ぞ れ以下 の 通 り で あ る 。

以下 の 実施例 1 1 — 1 〜 I I— 1 4 (比較例 I I一 1 〜 I I — 2 及 び参考例 11一 1 〜 1 1 — 4 を 含む ） に お い て用 い た 下 記 の 試薬或 い は 原 料 は 、 い ず れ も 下記 の 製造元か ら 入手 し た も の で あ る 。

a , α — ト レ ハ ロ ー ス ： S i gm a 社製

可溶性 デ ン プ ン ： ナ カ ラ イ テ ス ク 社製、 特級 品

K l e b s i e l l a n e umo n i a e 由 来 プ ノレ ラ ナ ー ゼ ： 禾ロ光純薬製、

165- 15651

パ イ ン デ ッ ク ス # 1 及 びパ イ ン デ ッ ク ス # 3 ： 松谷化学 製

マ ル ト ー ス （ G 2 ) ： 和光純薬製

マ ル ト ト リ オ ー ス （ G 3 ) 、 マ ル 卜 テ ト ラ オ ー ス （ G 4 ) 、 マ ノレ ト ペ ン 夕 オ ー ス （ G 5 ) 、 マ ゾレ ト へ キ サ オ ー ス ( G 6 ) 、 マ ル ト へ プ タ オ ー ス （ G 7 ) 、 及 び ア ミ ロ ー ス' D P — 1 7 : 林原バ イ オ ケ ミ カ ノレ製

ア ミ 口 べ ク チ ン ： ナ カ ラ イ テ ス ク 社製、 特級 品

イ ソ マ ル ト ー ス ： 和光純薬製

イ ソ マ ル ト ト リ オ ー ス ： 和光純薬製

イ ソ マ ル ト テ ト ラ オ ー ス ： 生化学工業製

イ ソ マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス ： 生化学工業製

パ ノ ー ス ： 東京化成工業製

実施例 Π— 1 古細菌 の ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖分解活性、 及 び デ ン プ ン 液化活性 の 測定

下記 の 第 1 1 表 に 示す菌株 に つ い て 活性 を 調べ た 。 方 0 一 法 と し て は 各菌株の 培養菌体 を超音波破砕処理、 遠心分 離を行 い、 そ の上清を粗酵素液 と し て、 こ れ に基質で あ る マ ゾレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス を最終的 に 1 O m M と な る よ う に 加 え、 6 0 °C p H 5 . 5 ( 5 0 m M酢酸ナ ト リ ゥ ム 緩衝液） で反応後、 1 0 0 °C で 5 分間加熱処理 し て反応を停止 さ せ た後、 生成 し た α — ト レ ハ ロ ー ス を、 以下 に 示す条件の H P L C 分析法 に よ り 測定 し た カ ラ ム ： TOSOH T S K- g e I A m i d e - 80 ( 4. 6 x 250 mm ) 溶媒 ： 7 2 . 5 % ァ セ ト ニ ト リ ル

流； is ： 1 . 0 m 1 / m i n

ππ. i¾. ： ¾ ίππ.

検 出器 ： 示差屈折計

ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖分解活性 は、 マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ロ ー ス 力、 ら 1 時『 に 1 m o 1 の α , α: — ト レ ロ ー ス を遊離す る 酵素活性を 1 Un i tと し て示 し た。 但 し 第 1 1 表 に お い て は菌体 g 当 り の活性 と し て示 し た。 ま た 、 マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ロ ー ス の 調製 は、 5 0 m M 酢 .酸 （ p H 5 . 5 ) を 含む 1 0 % マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス に S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株由 来 の精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを 1 0 Un i t s/m l と な る よ う に 添加 し て 6 0 °C で 2 4 h r 反応 さ せ た後、 上記条件の TSK-g e l Am i d e - 80 H P L C e o l uninに よ り 分取す る こ と に よ っ て行 っ た。 な お、 S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由来の精製 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼの活性 は、 マ ル ト ト リ オ ー ス を基質 と し て p H 5 . 5 、 6 0 °C で 1 時間 に 1 m o 1 の グノレ コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を生成す る 酵素活性を 1 Un i tと 定義す る 。 そ の H P L C チ ャ ー ト は 図 1 0 に 示す通 り で あ る 。 図 に示す よ う に、 H P L C チ ヤ 一 ト 上で は ァ ノ マ ー の な い , a — ト レ ハ ロ ー ス と 同一の 保持時間 を示す ピ ー ク と マ ル ト ト リ オ ー ス と 同一の保持時間を 示す ピ ー ク が現れ た。 な お、 は じ め の 生成物を T S K - g e 1 am i d e - 80 HPLC c o l umnに て分取 し 、 1 H — N M R、 13 C — N M R に よ り 解析の 結果、 α ， α — ト レ ハ ロ ー ス で あ る こ と を確認 し た。

ま た、 上記 と 同 じ 粗酵素液 （上清） を用 い て、 2 %可 溶性デ ン プ ン を含む 1 0 O m M齚酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液

( P H 5 . 5 ) 0 . 5 m lに該上清を適宜希釈 し て 0 . 5 m l加え、 6 0 °C に て反応を行 っ た。 経時的 に サ ン プ リ ン グを行 い、 こ の サ ン プル に 2 倍量の 1 N 塩酸を加 え て反 応を停止 し た。 次 い で 2 3 倍量の 0 . 0 1 % ヨ ウ 素を 含む 0 . 1 % ヨ ウ 化 カ リ ウ ム 溶液を加 え、 更 に 1 . 8 倍 量の水 を加 え た。 最後 に 6 2 0 n m の 吸光を 測定 し 、 そ の経時変化か ら 活性を 測定 し た。

反応後生成す る 糖 の 分析 は、 1 0 0 °C で 5 分間処理 し て反応を停止 さ せ た後、 以下 に 示す条件下 H P L C 分析 法 に よ り 測定 し た。

カ ラ ム ： B I 0-RAD AM I NEX HPX-42 A ( 7. 8 x 300 mm ) 溶媒 ： 水

JS ： 0 . 6 m 1 / m i n

温度 ： 8 5 °C

検 出器 ： 示差屈折計

デ ン プ ン 分解活性 は 、 デ ン プ ン - ヨ ウ 素複合体 の 青紫 色 に よ る 6 2 O n m の 吸光を 1 0 分 に 1 0 %弒少 さ せ る 酵素量を 1 U n i tと 定義 し た。 但 し 、 第 1 1 表 に お い て は 菌体 g 当 た り の 活性 と し て 示 し た。

第 11表

株 ^ ¾¾(Units/g-cell)

デンプン分解 トレハロース 活性 ォリゴ糖分解 活性

Suifolobus solfataricus ATCC 35091 13. 3 118. 0

DSM 5354 13. 3 116. 8

DSM 5833 8. 4 94. 9 KM1 13. 4 293. 2

Suifolobus acidocaldarius ATCC 33909 12. 5 161. 8

Suifolobus shibatae DSM 5389 11. 2 281. 2

S u i f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来の 粗酵素液 に よ る 反応生成物の AM1 NEX HPX - 2 A HPL C に よ る 分析結果 は 図 1 1 に 示す通 り で あ っ た 以上の結果、 S u 1 f o 1 o b u s 属 に属す る 菌株の 細胞抽 出液 は ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖を 分解 し 、 a , a — 卜 レ ノヽ 口 ー ス を遊離す る 活性及 び、 デ ン プ ン を加水分解 し て主 に単糖及 び 2 糖を遊離す る 活性を有す る こ と がわ か つ た o

実施例 I 1一 2 S u 1 f 0 0 b u s

s o 1 f a t a r i c u s K M 1 株 由 来の 本酵素 ァ ラ ー ゼ の精製

S u 1 f 0 1 0 b u s s 0 1 f a t a r 1 c u s K M 1 株を、 2 g Z リ ッ 卜 ル の 可溶性 デ ン プ ン 及 び 2 g ハ ッ ト ル の酵母ェ キ ス を 含む A m e r 1 c a n

T y p e C u l t u r e C 0 1 1 e c t i o n

( A T C C ) 発行 C a t a 1 o g u e o f

B a c t e r i a a n d P h a g e s 1 8 版

( 1 9 9 2 ) に記載の 培地番号 1 3 0 4 の 培地で 7.5 °C 3 日 間培養 し た。 遠心分離 に よ り 集菌 し 、 — 8 0 °C に て 保存 し た。 菌体の 収率 は 3 . 3 g ハ ッ ト ルで あ っ た。

上記の よ う に し て得 ら れた菌体 2 0 0 g を 5 m M の E D T A を含む 5 0 m M酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ P H 5 . 5 ) 4 0 0 m l に 懸濁 し 、 0 °C で 1 5 分間、 超音波 破砕処理 に よ り 溶菌 し 、 次 い で '；®心分離を行 い上清溶液 を得 た。 こ れ に硫安を 6 0 %飽和 と な る よ う に加 え た。

遠心分離 し て得 ら れ た沈澱を 1 M の 硫安、 5 m M の E D T A を含む 5 0 m M酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ P H 5 . 5 ) に溶解 し 、 同緩衝液に て平衡化 し た疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TO SOH TS K- g e 1 Ph e n y l - TOYOPE ARL 650 S 8 0 0 m 1 ) に通 し た。 カ ラ ム を 同緩 衝液 に て洗浄 し 、 次 に 6 0 0 m 1 の 1 M 〜 0 M硫安の線 状勾配で標的 ア ミ ラ ー ゼを溶離 し た 。 活性画分を 限外濾 過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き

1 0 m M ト リ ス 塩酸緩衝液 （ p H 7 . 5 ) に て洗浄、 脱

^πα し 7>» 0

次 に 同緩衝液 に て平衡化 し た イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TO SOH T SK- g e l DE AE— TOYOP EARL 650 S 3 0 0 m l ) に 通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 引 き 続 き 9 0 0 m 1 の 0 M 〜 0 . 3 M食塩の線状勾配で 標的 ア ミ ラ ー ゼを溶離 し た。 活性画分 を 限外濾過膜 （分 子量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 弓 I き 続 き 0 . 1 5 M の 食塩、 5 m M の E D T A を含む 5 O m M酢酸ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 （ P H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に脱塩濃縮液を ゲル濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： Ph a rma c i a H i L o a d 16/60 S u p e r d e x 200 p g ) に載せ 同緩衝液 に て標的 ァ ミ ラ ー ゼを溶出 し た。 活性画分を 限 外濾過膜 （分子量カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 2 5 m M ビ ス — ト リ ス 塩酸緩衝液 （ p H 6 . 3 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に こ の 脱塩濃縮液を、 同緩衝液 に て平衡化 し た ク ロ マ ト フ ォ ー カ シ ン グ （ カ ラ ム ： Ph a rma c i a Mo no P H R 5 / 20) に載せ、 1 0 % P o l y bu H e r 14 ( Ph a rma c i a 製、 塩 酸 に て P H 4 . 0 に 調製 し た も の ） で標的 ァ ミ ラ ー ゼを 溶出 し た o 活性画分を 限外濾過膜 （分子量 カ ッ ト

1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 弓 I さ 続 さ 1 0 m M酢酸ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 （ P H 6 . 8 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に こ の 脱塩濃縮液 に 4 分の 1 量の サ ン プ ルバ ッ フ ァ - ( 6 2 . 5 m M ト リ ス 酸緩衝液 ( P H 6 . 8 ) 、 1 0 % グ リ セ 口 一ル、 2 0 '0 S D S 、 0 . 0 1 2 5 % ブ 口 モ フ エ ノ 一ル ブル一 ) を加 え 、 1 0 % S D S ポ リ ァ ク リ ル ア ミ ド ゲ ル電気泳動 （ S D S - Ρ A G E ) (装

B I 0-RAD プ レ ツ プ セ ル モ デ ル 491 ) に て標的 ァ ゼを溶離 し た。 活性画分を分取 し 限外濾過膜 （分子量 力 ッ 卜 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 1 0 m M詐酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 ( P H 5 5 ) に て洗浄、 1¾：¾ し /乙 o 最終的 に ネ ィ テ ィ ブ ポ ア ク リ ル ァ ミ ドゲ ル、 S D S ポ リ ア ク リ ル ァ ミ ド、 ゲ ル 及び等電点電気泳動 に て単一 バ ン ド を示す精製酵素を た。

な お、 こ の精製 に お け る 活性測定 に は、 基質 と し て マ ル ト ト リ ォ シ ル 卜 レ ノヽ π ス を用 い、 そ の 他 の 方法 は実 施例 11一 1 に お い て示 し た T S Κ- g e 1 Am i d e - 80 Ο H P L C 分析法 と 同様 に し て 订 つ た。

各精製 ス テ ツ プ に お け る 総酵素活性、 総蛋 白量、 比活 性を以下の 第 1 2 表 に 示す。 や目:^ ί四 J 酸麦 十： 総蛋白量 比活性 籍制 ¾= し ii 1 L ϋ ノ (m g) (Uni t s/mg) /oノ 、Ταノ

3004 U 17000 3.45 1 ΠΠ

丄 u u 1

丄 p h p n u 1 1311 39.9 1

O 3 丄

ゲル濾過 2197 26.7 82.2 3.7 24

Mono P 1048 0.40 2640 1.8 765

SDS-PAGE 401 0.08 5053 0.1 1465

実施例 11— 3 S u l f o l o b u

s o 1 f a t a c u s D S M 5 8 3 3 株由 来の 本 酵素 ア ミ ラ ー ゼ の精製

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株 を 、 2 g リ ッ ト ル の 可溶性デ ン プ ン 及 び 2 g リ ッ ト ル の 酵母エ キ ス を 含む

A m e r i c a n T y p e C u l t u r e

C o l 1 e c t i o n ( A T C C ) 発行

C a t a l o g u e o f B a c t e r i a n d P h a g e s 1 8 版 （ 1 9 9 2 ) に 記載の 培地番号 1 3 0 4 の 培地で 7 5 °C 、 3 日 間培養 し た。 遠心分離 に よ り 集菌 し 、 — 8 0 °C に て保存 し た 。 菌体の収率 は 1 . 2 g リ ッ ト ルで あ っ た。

上記の よ う に し て得 ら れ た菌体 2 5 g を 5 m M の E D T A を含む 5 0 m M酢酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) 5 0 m l に 懸濁 し 、 0 °C で 1 5 分間、 超音波破 砕処理 に よ り 溶蘭 し 、 次 い で遠心分離を 行 い 上清溶液を 得 た 。

こ の 上清溶液 に 硫安を 1 M と な る よ う に 加え、 1 M の 硫安、 5 m M の E D T A を含む 5 O m M酢酸 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て平衡化 し た疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 （ カ ラ ム ： TQ S OH T SK- g e 1 P e n y l -TOYOPEARL 650 S 1 0 0 m l ) に 通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 次 い で 3 0 0 m 1 の 1 M〜 0 M硫安の線状勾配で標的 ァ ミ ラ ー ゼを溶離 し た。 活性画分を 限外濾過膜 （分子量 力 ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 弓 I き 続 き l O m M ト リ ス 塩酸緩衝液 （ p H 7 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に 同緩衝液に て平衡化 し た イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： T 0 S 0 H T S K- g e 1 DEAE-TOYOPEARL 650 S 1 0 0 m l ) に通 し た 。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 3 0 0 111 1 の 0 〜 0 . 3 M食塩の 線状勾配で標 的 ア ミ ラ ー ゼを溶離 し た。 活性画分を 限外濾過膜 （分子 量カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 弓 1 き 続 き 0 . 1 5 M の 食塩、 5 m M の E D T A を 含む 5 O m M酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ P H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に 脱塩濃縮液を ゲル濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： P h a rma c i a H i L o a d 16/60 S u p e r d e x 200 p g ) に載せ 同緩衝液 に て標的 ア ミ ラ ー ゼを溶 出 し た。 活性画分を 限 外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 2 5 m M ビ ス ー ト リ ス 一 イ ミ ノ ジ酢酸緩衝液 （ p H 7 . 1 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に こ の 脱塩濃縮液を 同緩衝液 に て平衡化 し た ク ロ マ ト フ オ ー カ シ ン グ （ カ ラ ム ： P h a rma c i a o n o P HR5/20 ) に載せ、 1 0 % P。 b u f f e r 1 ( P h a rma c i a 製、 ィ ミ ノ ジ 酢酸 に て P H 4 . 0 に 調製 し た も の ） で標的 ア ミ ラ ー ゼを 溶 出 し た。 活性画分 を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト

1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 弓 I き 続 き 2 5 m M ビ ス 一 ト リ ス ー イ ミ ノ ジ 酢酸緩衝液 （ p H 7 . 1 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に こ の 脱塩濃縮液を 、 同緩衝液 に て平衡化 し た ク ロ マ ト フ ォ ー カ シ ン グ （ カ ラ ム ： Ph a rma c i a Mo no P H R 5 / 20) に載せ、 1 0 % P o l y b u H e r 1 ( P a rma c i a 製、 ィ ミ ノ ジ酢酸 に て p H 4 . 0 に調製 し た も の） で標的 ア ミ ラ ー ゼを溶 出 し た。 活性画分を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 0 . 1 5 M の 食塩、 5 m M の E D T A を含む 5 O m M酢酸ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 ( P H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た 。

次 に 脱塩濃縮液を ゲ ル濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： T SK- g e l G 3000 SW HP L C) に載せ、 同緩衝液 に て標的 ア ミ ラ ー ゼを溶 出 し た 。 活性画分を 限外濾過膜 （分子量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て 濃縮 し 、 弓 1 き 続 き 5 m M の E D T A を含む 5 O m M酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

最終的 に ネ イ テ ィ ブ ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル、 S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲル、 及 び等電点電気泳動 に て単一 バ ン ド を 示す精製酵素を得 た。

な お、 こ の精製 に お け る 活性測定 に は 、 基質 と し て マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を 用 い、 そ の 他の方法 は実 施例 I 1— 1 に お い て示 し た T S K - g e 1 A m i d e - 8 Qの H P L C 分析法 と 同様 に し て行 っ た。

各精製 ス テ ッ プ に お け る 総酵素活性、 総蛋 白量、 比活 性を 以下の 第 1 3 表 に 示す。

第 1

精製画分 総 «活性 比活性 回収率

(Un i t s) (mg) (Un i t s/mg) (%) (倍) 菌体抽出液 3345 1394 2. 40 100 1

Pheny l 2112 266 1. 9 63 3. 3

DEAE 1365 129 10. 6 41 4. 4 ゲル濾過 651 1. 8 83. 5 19 35

Mono P 467 0. 76 612 14 255

Mono Pリク口マト 156 0. 12 1301 4. 1 542 ゲル濾過リク口マト 98 0. 01 13652 2. 9 5687 20 — 実施例 一 4 S u 1 f o l o b u s

a c d o c a 1 d a r u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由来の 本酵素 ァ ミ ラ ー ゼ の 精製

S u 1 f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 を、 2 g / リ ッ ト ル の 可溶性デ ン プ ン 及 び 2 g / リ ッ ト ル の 酵母エ キ ス を含む A m e r i c a n T y p e

C u l t u r e C o l l e c t 1 o n ( A T C C ) 発 行 C a t a 1 o g u e o f B a c t e r i a a n d P h a g e s 1 8 版 （ 1 9 9 2 ) に 記載の 培 地番号 1 3 0 4 の培地で 7 5 。C 、 3 日 間培養 し た。 遠心 分離 に よ り 集菌 し 、 一 8 0 °C に て保存 し た。 菌体の 収率 は 2 . 7 g Z リ ッ ト ノレ で あ っ た 。

上記の よ う に し て得 ら れた菌体 2 5 g を 5 m M の E D T A を 含む 5 0 m M酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) 5 0 m l に懸濁 し 、 0 °C で 1 5 分間、 超音波破枠処理 に よ り 溶菌 し 、 次 い で遠心分離を行 い上清溶液を得た。

こ の上清溶液 に 硫安を 1 M と な る よ う に 加え、 1 M の 硫安、 5 m M の E D T A を 含む 5 O m M酢酸ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 （ P H 5 . 5 ) に て平衡化 し た 疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TO SOH TSK-g e 1 Ph e n y l -T0Y0PEARL 650 S 1 0 0 m l ) に通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 3 0 0 111 1 の 1 ^1 〜 0 1^硫安の 線状勾配で標的 ァ ミ ラ ー ゼを溶離 し た。 活性画分を 限外濾過膜 （分子量 力 ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 弓 I き 続 き l O m M ト リ ス 塩酸緩衝液 （ p H 7 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に 同緩衝液 に て平衡化 し た イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 （ カ ラ ム ： TO SOH TS K- g e l D E A E - T 0 Y 0 P E A L 650 S 1 0 0 m 1 ) に通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 3 0 0 111 1 の 0 ?^〜 0 . 3 M食塩の線状勾配で標 的 ア ミ ラ ゼ ー を溶離 し た。 活性画分を 限外濾過膜 （分子 量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 0 . 1 5 M の 食塩、 5 m M の E D T A を含む 5 O m M酢酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液 （ P H 5 . 5 ) に て洗浄、 脱塩 し た。

次 に 脱塩濃縮液を ゲル濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： P a rma c i a H i L o a d 16/60 S u p e r d e x 20 fl p g ) に載せ 同緩衝液 に て標的 ァ ミ ラ ー ゼを 溶出 し た。 活性画分を限 外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 5 0 m M酢酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て 洗浄、 脱塩 し た。

次 に脱塩濃縮液 に 1 M と な る よ う 硫安を溶解 し 、 同緩 衝'液 に て平衡化 し た疎水 ク ロ マ 卜 グ ラ フ ィ 一 （カ ラ ム ： TO SOH T S K- g e 1 P h e n y 1 - 5 PW H P L C ) に 通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液に て洗浄 し 、 次 に 3 0 111 1 の 1 ^1〜 0 1^硫安の 線状勾配で標的 ァ ミ ラ ー ゼを溶離 し た。 活性画分を 限外 濾過膜 （分子量カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 2 5 m M ビ ス 一 ト リ ス ー ィ ミ ノ ジ齚酸緩衝液 （ p H 7 . 1 ) に て洗浄、 脱塩 し た。 次 に こ の 脱塩濃縮液を 、 同緩衝液 に て平衡化 し た ク ロ マ ト フ ォ 一 力 シ ン グ （ カ ラ ム ： Pha rma c i a Mono P H R 5 / 20) に 載せ、 1 0 % P o 1 y b u f { e r 74 ( Pha rma c i a 製、 ィ ミ ノ ジ 酢酸 に て p H 4 . 0 に調製 し た も の ） で標的 ア ミ ラ ー ゼを溶 出 し た。 活性画分を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ 卜 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 引 き 続 き 5 m Mの E D T A を 含む 5 O m M酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て洗浄、 flffi iffi し た。

最終的 に ネ イ テ ィ ブ ポ リ ア ク リ ノレ ア ミ ド ゲ ノレ 、 S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲ ル、 及 び等電点電気泳動 に て単一 バ ン ド を示す精製酵素を 得 た。

な お、 こ の 精製 に お け る 活性測定 に は、 基質 と し て.マ ル ト ト リ オ シ ゾレ ト レ ノヽ ロ ー ス を用 い 、 そ の他の 方法 は実 施例 1 1一 1 に お い て示 し た T S K - g e 1 A m i d e - 80の H P L C 分析法 と 同様 に し て行 っ た。

各精製 ス テ ッ プ に お け る 総酵素活性、 総蛋 白量、 比活 性を以下の 第 1 4 表 に 示す。

第 14表

精製画分 総瞧活性 比活性 回収率 精製度

(Units) (nig) (Un i t s/mg) (%) (倍） 囷体 fffl出液 4534 ϊοϋ o. a ί Ιϋϋ 1

Phenyl 2428 88.0 27.6 54 4.6

DEAE 927 9.20 101 20 17

ゲル濾過 600 1.10 546 13 92

Phenylリク口マト 392 0.16 244S 9.1 411

Mono P 120 0.04 3195 2.6 558 実施例 5 本酵素 ア ミ ラ ー ゼの諸性質の検討

実施例 1 1 一 2 で得 ら れ た精製酵素の酵素学的諸性質を 測定 し た。

( 1 ) 分子量

ゲル濃度 6 % の S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲル電気泳 動 に よ り 分子量測定を行 っ た。 マ ー カ ー タ ン パ ク 質 と し て分子量 2 0 0 , 0 0 0 : 1 1 6 , 3 0 0 : 9 7 ,

4 Ό 0 ; 6 6 , 3 0 0 ； 5 5 , 4 0 0 ； 3 6 , 5 0 0 ; 3 1 ， 0 0 0 ; 2 1 ， 5 0 0 ； 1 4 , 4 0 0 の も の を用 い た ο

そ の 結果、 該ア ミ ラ ー ゼの 分子量 は 6 1 , 0 0 0 で あ つ た ο

ァ ガ ロ ー ス ゲル等電点電気泳動の 結果、 等電点 は 4 . 8 で あ っ た。

( 3 ) 安定性

得 ら れ た精製酵素の 各温度、 各 p H に お け る 安定性を そ れぞれ図 1 2 、 図 1 3 に 示す。 酵素活性の 測定 は、 実 施例 11— 1 に お い て マ ゾレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス を用 い た 測定法 に 準 じ て行な い 、 p H 3 〜 5 の 間 は グ リ シ ン 塩酸系緩衝液を 、 p H 4 〜 6 の 間 は酢酸ナ ト リ ウ ム 系緩 衝液を 、 p H 5 〜 8 の 間 は燐酸ナ ト リ ウ ム 系緩衝液を、 p H 8 〜 9 の 間 は ト リ ス 塩酸系緩衝液を 、 p H 9 〜 1 0 の 間 は炭酸水素ナ ト リ ウ ム 系緩衝液を 、 ρ Η 1 1 〜

1 3 . 5 の 間 は K C 1 一 N a O H系緩衝液を そ れぞれ用 い た。

本酵素 は 8 5 °Cで 6 時間の 処理で安定で あ り 、 ま た p H 3 . 5 〜 1 0 . 0 の 室温 6 時間 の 処理で安定で あ つ た o

( 4 ) 反応性

得 ら れ た精製酵素の 各温度、 各 p H に お け る 反応性を そ れぞれ図 1 4 、 図 1 5 に 示す。 酵素活性の 測定 は、 実 施例 I 1— 1 に お い て マ ル ト ト リ オ シ ゾレ ト レ ノヽ ロ ー ス を用 い た 測定法 に 準 じ て行 な い 、 p H 2 〜 4 の 間 は ク ェ ン酸 ナ ト リ ウ ム 系緩衝液 （□ ) を 、 p H 4 〜 5 . 5 の 間 は酢 酸ナ ト リ ウ ム 系緩衝液 （參） を、 p H 5 〜 7 . 5 の 間 は 燐酸ナ ト リ ウ ム 系緩衝液 （△ ) を、 p H 8 〜 9 の 間 は ト リ ス 塩酸系緩衝液 （◊ ) を そ れぞれ用 い た。 本酵素 は 7 0 〜 8 5 °C付近 に 反応最適温度、 p H 4 . 5 〜 5 . 5 付近 に 反応最適 p H を有す る 。

( 5 ) 各種活性化剤、 阻害剤 の 影響

実施例 11— 1 の マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 分解活 性測定法 に お い て以下の 第 1 5 表 に 示す物質を基質 と 共 に 添加 し 、 そ れぞれ の 場合の 活性測定 を実施例 11一 1 と 同様 に 行 い 、 活性化又 は 阻害 の 有無を調べ た。 そ の 結果 銅 イ オ ン 、 ド デ シ ソレ硫酸ナ ト リ ウ ム （ S D S ) に よ っ て 阻害を受 け る こ と 力くわ 力、 つ た。 但 し 、 S D S に よ る 阻害 に つ い て は透析、 限外瀘過な ど の方法で S D S を 除去す る こ と に よ り 、 酵素活性が回復 し た。 糖関連酵素で は 力 ル シ ゥ ム イ オ ン に よ っ て活性ィヒ さ れ る 場合が多 く 認め ら れ る が、 本酵素で は カ ル シ ウ ム イ オ ン に よ っ て は活性化 さ れな い。

第 15表

活性化剤 Z阻割 無添加に対する

(m ) 相対活性 control (無添加） 100. I

CaC12 5 97.1

MgC12 5 93.5

MnC12 5 101.8

CuS04 5 0

CoCI2 5 97.1

FeS04 5 73.5

FeC13 5 38.0

AgN03 5 105.7

EDTA 5 106.3 メルカプトエタノール 5 141.7 ジチオスレィトール 5 116.2

SDS 5

グルコース 0.5 109.4 a, a— トレノヽロース 0.5 98.2 マルトテトラオース 0.5 108.5 マルトペン夕オース （).5 105.8 マルトへキサオース 0.5 123.8 マルトヘプ夕オース 0.5 129.2 ( 6 ) 基質特異性

本精製酵素 2 5 . 0 Un i t s/m l ( マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を基質 と し て作用 さ せ た と き の酵素活性） を以 下の 第 1 6 表 に 示す 1 O m M の 基質 （ ア ミ 口 べ ク チ ン 、 可溶性デ ン プ ン に つ い て は 2 . 8 % ) に作用 さ せ 、 分解 性及び分解生成物の 分析を 行 っ た。 各種マ ル ト オ リ ゴ糖 ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 、 ア ミ ロ ぺ ク チ ン 、 可溶性デ ン プ ン 、 各種 イ ソ マ ル ト オ リ ゴ糖、 及 びパ ノ ー ス に つ い て は単糖 + 2 糖の 生成活性を指標 と し て、 ま た、 各種 ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖、 ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 α — 1 ， a ー 1 転移体 （ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 の 還元末端側 の 、 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ ー ス 残基間 の 結合力 α — 1 , a 一 1 で あ る オ リ ゴ糖） に つ い て は α , a — ト レ ハ ロ ー ス の 生成活性を指標 と し て、 マ ル ト ー ス及 び α ， α — ト レ ハ ロ ー ス に つ い て は グ ル コ ー ス の生成活性を指標 と し て 実施例 i ί— 1 に示 し た T S Κ - g e 1 Am i d e - 80 HPL C に よ る 分 析法で分析を行 つ た。

な お、 第 1 6 表中で の 酵素活性 は、 各 々 単糖及 び 2 糖 を 1 時間 に l /z m o 1 遊離す る 酵素活性を l Un i t と し て 示 し た。

結果 は以下の 第 1 6 表及 び図 1 6 〜 1 9 に 示 し た通 り ， あ る 。 第 16表

生成オリゴ糖 単糖 + 2糖 生成速度

(Units/ml) マルトース （G2) グルコース 0. 19 マルトトリオース （G3) グルコース +G2 0. 30 マルトテトラオース （G4) グルコース +G2+G3 0. 31 マルトペン夕オース （G5) グルコース +G2+G3+G4 1. 79 マルトへキサオース （G6) グルコース- 1. 74 マルトへプタオース （G7) グルコース +G2+G5+G6 1. 80 了ミロース DP-17 グルコース +G2 2. 35 ァミロぺクチン グルコース +G2 0. 33 可溶性デンプン グルコース +G2 0. 55 a, α—トレノヽロース 分解せず 0 ダルコシルトレハロース グルコース + トレハロース 0. 04 マルトシルトレハロース G2+ トレハロース 3. 93 マルトトリオシルトレハロース G3+ トレハロース 25. 0 マルトテトラオシルトレハロース G4+ トレハロース 27. 3 マルトペン夕オシルトレハロース G5+ トレハロース 25. 5 ァミロース DP-17, α-1, α- 1転移体 トレハロース 4. 98 ィソマルトース 分解せず 0 ィソマルトトリオース 分解せず 0 イソマルトテトラオース 分解せず 0 ィソマルトペン夕オース 分解せず 0 パノース 分解せず 0 註 ： グ ノレ コ シ ゾレ ト レ ロ ー ス 、 マ ル ト シ ル ト レ ロ ー ス マ ノレ ト テ ト ラ オ シ ノレ ト レ ロ ー ス 、 マ ゾレ ト ペ ン 夕 オ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 及 び ァ ミ ロ ー ス DP-Π, a -1, α - l転移体 は い ずれ も 実施例 1 1 — 1 に お け る マ ノレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス の調製法 に準 じ て製造 し た も の で あ る 。

マ ゾレ ト ペ ン タ オ ー ス 、 ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 、 可溶 性デ ン プ ン か ら の 反応生成物 の A M 1 NEX HPX-42 A H P L C に よ る 分析結果 は、 そ れぞれ図 1 7 の A 、 B 、 じ に 、 ま た マ ノレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス 、 マ ノレ ト ペ ン 夕 オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス か ら の 反応生成物の TSK-g e l Am i d e - 80 H P L C に よ る 分析結果 は、 そ れぞれ図 1 8 、 図 1 9 に示す。

そ の 結果、 本精製酵素に 関 し て は、 還元末端側の ダル コ ー ス 残基が α — 1 ， 一 1 結合 し た マ ノレ ト ト リ オ シ ル ト レ ロ ー ス 等の ト レ ロ ー ス オ リ ゴ糖 に 、 極め て よ く 作用 し 、 、 な 一 ト レ ハ ロ ー ス と 重合度が 2 つ減少 し た 対応す る マ ル ト ォ リ ゴ糖を生成す る こ と が確認 さ れた。 ま た マ ル ト ー ス （ G 2 ) 〜 マ ル ト へ プ タ オ ー ス （ G 7 ) ア ミ ロ ー ス 、 可溶性デ ン プ ン か ら は、 主 と し て ダ ル コ 一 ス又 は マ ル ト ー ス を遊離す る こ と が確認 さ れた。 し か し な が ら α — 1 ， α — 1 結合で あ る α , α — ト レ ハ ロ ー ス に反応せず、 ま た、 すべての 結合が 一 1 , 6 結合であ る イ ソ マ ゾレ ト ー ス 、 イ ソ マ ゾレ ト ト リ オ ー ス 、 イ ソ マ ノレ ト テ ト ラ オ ー ス 及び イ ソ マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス 、 又は、 α — 1 , 6 結合を還元末端か ら 2 つ 目 に有す る パ ノ ー ス に対 し て も 反応 し な カヽ つ た 。

( 7 ) エ ン ド型 ァ ミ ラ ー ゼ活性

本精製酵素 2 0 0 じ n i t s / m 1 ( マ ノレ ト ト リ オ シ ル 卜 レ ノヽ ロ ー ス を基質 と し て作用 さ せ た と き の 酵素活性） に よ る 可溶性 デ ン プ ン に 作用 さ せ た 時の ヨ ウ 素発色 の 消失、 及 び単糖及 び 2 糖の 生成量か ら 求 め た デ ン プ ン 加水分解率 の経時変化を 、 実施例 H— 1 に 示 し た デ ン プ ン 分解活性 測定法、 及 び A M I N E X H P X - 4 2 A H P L C に よ る 分析法 に よ り 分析を 行 っ た

そ の 結果、 図 2 0 に 示 し た 様 に 、 本精製酵素 に 関 し て は ョ ゥ 素反応呈色度が 5 0 %消失 し た 時点で の加水分解 率 は 3 . 7 % と 低 く ヽ 従 つ て ェ ン ド型 ァ ミ ラ ー ゼ の 性質 を示す こ と が確認 さ れ た 。

( 8 ) 作用機作 の 検討

ゥ リ ジ ン ジ ホ ス ホ グ ル コ ー ス [ グ ル コ ー ス - 6 ― ³ H ] 及 び マ ル ト テ ト ラ ォ ー ス に グ リ コ ー ゲ ン シ ン タ ー ゼ （ ゥ サ ギ骨格筋 由来、 S i g m a 社製 G - を作用 さ せ、 非還 元 .末端 の グ ル コ ー ス 残基を ³ H で放射能 ラ ベ ル化 し た マ ル ト ペ ン タ ォ ー ス を 合成 さ せ、 分取精製 し た。 次 に こ の 放射能 ラ ベ ル 化 し た 1 0 m M の マ ル ト ペ ン 夕 ォ ー ス を基 質 と し 、 S u 1 f 0 1 o b u s

s 0 1 f a t a r i c u s K M 1 株 由来の 精製 卜 ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ 1 0 ϋ n i t s / m 1 ( マ ゾレ ト ト リ オ ー ス を基質 と し て作用 さ せ た と き の 酵素活性） を添加 し 、 6 0 。C 、 3 h r 作用 さ せ、 非還元末端の グル コ ー ス残基を ³ H で 放射能 ラ ベ ル化 し た マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を 合 成 さ せ、 分取精製 し た。 （な お、 こ の 生成物 に ダル コ ア ミ ラ 一 ゼ （ Rh i z o p u s由 来、 生化学工業製） を作用 さ せ、 グ ル コ ー ス と α ， a - ト レ ノヽ ロ ー ス に 完全 に分解 さ せ た こ れ ら を薄層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に て分取 し 、 そ れぞれ 液体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー で放射能を測定 し た と こ ろ 、 a , α — ト レ ハ ロ ー ス 画分 に放射活性 は見 ら れず グル コ ー ス 画分 に放射活性が認め ら れ、 よ っ て、 非還元 末端の グ ル コ ー ス残基が放射能 ラ ベ ルィヒ さ れて い る こ と を確認 し た。 ）

以上の よ う に調製 し た非還元末端の グル コ ー ス残基を 3 Η で放射能 ラ ベ ル化 し た マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス 、 及び非 還元末端の グ ル コ ー ス残基を ³ Η で放射能 ラ ベ ル化 し た マ ノレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス を 基質 と し て 、 こ れ ら に 実施例 I I一 2 で得 ら れ た精製酵素を そ れぞれ 5 0 Un i t s /m l 及 び 5 Un i t s/m l 作用 さ せ、 反応前、 及び 6 0 °C、 0 , 5 、 1 及 び 3 時間後 に サ ン プ リ ン グを行 っ た。 こ の 反応物を薄層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ K i e s e l g e l 60 メ ル ク 社製、 溶媒 ： プ タ ノ ー ノレ ー エ タ ノ ー ル 一 水 = 5 ： 5 ： 3 ) で展開 し た。 得 ら れ た各糖 に相 当 す る と こ ろ を分取 し 、 液体 シ ン チ レ ー シ ヨ ン カ ウ ン タ ー で放射能を測定 し た。 そ の 結果を そ れぞれ図 2 1 、 及 び図 2 2 に示す。

図 2 1 、 2 2 よ り 明 ら かな よ う に、 マ ル ト ペ ン タ ォ ー ス を基質 と し た場合、 加水分解産物で あ る グ ル コ ー ス 、 マ ル ト ー ス 画分 に は放射活性 は 見 ら れず、 マ ル ト テ ト ラ オ ー ス 、 マ ル ト ト リ オ ー ス 画分 に 放射活性が認め ら れ た ま た マ ル ト ト リ オ シ ゾレ ト レ ノヽ ロ ー ス を基質 と し た場合、 加水分解産物で あ る a , a — ト レ ハ ロ ー ス 画分 に は放射 活性 は 見 ら れず、 マ ル ト ト リ オ ー ス 画分 に放射活性が認 め ら れ た。

よ っ て、 本精製酵素 の 作用 機作 は ェ ン ド型 に 作用 す る ア ミ ラ ー ゼ活性 と 共 に 、 還元末端側 か ら 主 に単糖、 2 糖 を 生成す る 活性を有す る も の で あ る こ と がわ か つ た。

な お、 実施例 11— 3 、 4 で得 た S u 1 f 0 1 o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株、 及び S u l f o l o b u s a c i d o c a 1 d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来の各精製酵素 に つ い て も 同様 の 方法 に よ り 酵素学的諸性質を調べ、 そ の結果を前記 し た 第 2 表 に 示 し た。

比較例 11— 1 脖臓 α — ア ミ ラ ー ゼ に よ る 各種オ リ ゴ糖 の 分解性 と 分解生成物 の 分析

ブ タ 脬臓由 来 α — ア ミ ラ ー ゼ は 、 マ ル ト ォ リ ゴ糖を還 元末端か ら 2 糖 ま た は 3 糖単位で加水分解す る こ と が知 ら れて い る （澱粉 · 関連糖質酵素実験法 P 13 5 、 中村道 徳、 貝沼圭二、 学会 出版セ ン タ ー ） 。 そ こ で、 本発明 の 新規 ァ ミ ラ ー ゼの比較例 と し て ブ タ 膝臓由 来 0! — ァ ミ ラ ー ゼ （ S i gma 社製、 A- 55) 1 Un i t s/m l (デ ン プ ン を基 質 と し て、 p H 6 . 9 、 2 0 °C に お い て 3 分間 に 1 m g の マ ル ト ー ス に相 当 す る 還元糖を生成す る 酵素量を 1 Un i tと す る ） を 以下の 第 1 7 表 に 示す 1 O m M の基質 に PH6. 9 、 20 °C に て作用 さ せ、 分解性及 び分解生成物の 分析を 行 っ た。 酵素活性 は 2 糖 + 3 糖の 生成活性を指標 と し て、 実施例 11— 1 に 示 し た TSK- g e l Am i d e- 80 HPL C 分析法で分析を行 っ た。 ·

な お、 第 1 7 表 中 で の 酵素活性 は、 各オ リ ゴ糖を 1 時 間 に 1 m o 1 遊離す る 酵素活性を 1 Un i tと し て示 し

結果 は以下の 第 7 表及 び図 2 3 、 2 4 に 示 し た通 り こ"あ O ₀

第 17表

ォリゴ糖 2糖 + 3糖 生成速度

(Uni ts/ml) マルトトリオース （G3) 分解せず 0 マルトテトラオース （G4) グルコース +G2+G3 0. 49 マルトペン夕オース （G5) G2+G3 6. 12 マルトへキサオース （G6) G2+G3+G4 4. 44 マルトヘプ夕オース （G7) G2+G3+G4+G5 4. 45 ダルコシルトレハロース 分解せず 0 マルトシルトレハロース 分解せず 0 マルトトリオシルトレハロース G2+ ダルコシルトレハロース 0. 03 マルトテトラオシルトレハロース G3+ ダルコシルトレハロース 2. 57 マルトペン夕オシルトレハロース G マルトシルトレハロース 4. 36 註 ： ダ ル コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 、 マ ノレ ト シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス マ ノレ ト テ ト ラ オ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス 及 び マ ノレ ト ペ ン 夕 オ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス は 、 い ず れ も 実施例 11— 1 に お け る マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス の 調製法 に 準 じ て製造 し た も の で あ る 。

マ ノレ ト ペ ン 夕 オ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 力、 ら の 反応生成物 の TSK-g e l Am i d e - 80 HPL C に よ る 分析結果 を 図 2 4 に 示す そ の 結果、 脖臓 ァ ミ ラ ー ゼ は マ ル ト テ ト ラ オ ー ス ( G 4 ) 〜 マ ゾレ ト ヘ プ 夕 オ ー ス （ G 7 ) 力ヽ ら マ ノレ ト ー ス あ る い は マ ル ト ト リ オ ー ス と 重合度 力く 2 つ ま た は 3 つ 減 少 し た 対応す る マ ル ト オ リ ゴ糖 を 生成す る が、 還元末端 側 の グ ル コ ー ス 残基 力く α — 1 ， a - 1 結合 し た ダ ル コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 、 マ ル ト オ リ ゴ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス 等 の ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖 力、 ら は " ， a - ト レ ノヽ ロ ー ス を 遊離 し な い 上、 反 応性が低 い こ と が確認 さ れ た。

実施例 11— 6 可溶性 デ ン プ ン 、 及 び各種 デ ン プ ン 分解 物 力ヽ ら の α , α — ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造

実施例 11— 2 で 得 ら れ た 本精製酵素 1 5 0 Un i t s/m U 及 び S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来 の 精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ 1 O Un i t s/m lを 用 い 、 基質 を 、 可溶性 デ ン プ ン （ ナ カ ラ イ テ ス ク 社製、 特級 品） ； デ ン プ ン 分解物 と し て 、 K l e b s i e l l a

pn e umo n i a e 由 来 の プ ル ラ ナ ー ゼ （和光純薬製） 2 5 Un i t s/m lで 4 0 °C、 l h r の 条件 の 下で予 め 6 結合を分解 し て お い た 可溶性デ ン プ ン ； ま た別の デ ン プ ン 分解物 と し て、 B a c i l l u s amy l o l i c h e f a c i e n s由 来の a - ァ ミ ラ 一 ゼ ( ベ — リ ン ガ ー マ ン ノヽ ィ ム 社製） 1 2 . 5 Un i t s m 1で 3 0 °c 、 2 . 5 h r の 条件の下で予 め部分分 解 し て お い た可溶性デ ン プ ン ； パ イ ン デ ッ ク ス # 1 ； パ イ ン デ ッ ク ス # 3 ( と も に 松谷化学製） ； G 3 〜 G 7 マ ル ト ォ リ ゴ糖各単独 ； 及 び ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 ( い ず れ も 林原バ ィ ォ ケ ミ カ ル製） と し て、 そ れぞれ最終濃度 1 0 % 、 6 0 。C 、 p H 5 . 5 の 条件下で約 l O O h r 反 応 さ せ、 用 い た酵素の 相乗作用 を利用 し た α , α — ト レ ノヽ 口 一 ス の 製造を δϊ た 。

反応液 は基質を可溶性デ ン プ ン と し た場合を例 と し て 実施例 I I - 1 に示 し た A Μ 1 Ν Ε X H P X 42 A HP L C 分析法 に よ る 分析 ¾ 行 つ た。

ま た、 未反応の 基質を グル コ ア ミ ラ ー ゼに て分解後、 実施例 に示 し た T S K - g e 1 Am i d e - 80 H P L C 分析法 に よ る 分析を行い、 生成 し た な ， α — ト レ ハ ロ ー ス の 収率 を調べ た。

な お 、 本発明 の 新規 ア ミ ラ ー ゼ の 活性 は 、 実施例 1 1 —

1 と 同様 に、 マ ノレ ト ト リ オ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス か ら 1 時間 に 1 m 0 1 の α , α — ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 酵素活 性を 1 ϋ n i tと し て示 し た。

S u 1 f o 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 由 の精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 活性 は 、 マ ル ト ト リ オ ー ス を 基質 と し て p H 5 . 5 、 6 0 °Cで 1 時 間 に 1 / m o 1 の グ ゾレ コ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス を 生成す る 酵素 活性 を 1 ϋ n i tと し て 示 し た 。

プ ル ラ ナ ー ゼ の 活性 は ， プ ル ラ ン を 基質 と し て p H 6 . 0 、 3 0 。Cで 1 分 間 に 1 m 0 1 の マ ノレ ト ト リ オ 一 ス を 生成す る 酵素活性 を 1 Un i tと し て 示 し た 。

そ の 結果 は 以下 の 第 1 8 表 に 示 し た 。

第 18表

a, a―

トレノ、ロース 収率 (%) 可溶性デンプン 37. 0 プルラナーゼ処理デンプン 62. 1 アミラーゼ処理デンプン 42. 2 パインデックス #1 49. 9 パインデックス #3 40. 4

マルトトリオース （G3) 36. 4 マルトテトラオース （G4) 47. 8 マルトペン夕オース （G5) 60. 0

マルトへキサオース （G6) 61. 8

マルトヘプ夕オース （G7) 67. 1

ァミ ロース DP— 17 83. 5 可溶性デ ン プ ン か ら の 反応生成物の AM 1 N E X H PX 42 A H P L C に よ る 分析結果 は 図 2 5 に 示す。

そ の結果、 可溶性 デ ン プ ン を 基質 と し た 場合、

3 7 . 0 % の 収率 に て ， α — ト レ ハ ロ ー ス を生成 し た ま た各種デ ン プ ン 分解物で は プ ル ラ ナ ー ゼ に て 一 1 , 6 結合を加水分解 し た可溶性 デ ン プ ン を基質 と し た場合 6 2 . 1 %、 全て の 結合力く a — 1 ， 4 結合で あ る 各種マ ル ト オ リ ゴ糖、 及 び ア ミ ロ ー ス D Ρ — 1 7 で は そ れぞ れ 3 6 . 4 〜 6 7 . 1 %、 及 び 8 3 . 5 % で あ っ た。 こ れ ら の結果 は、 α — 1 ， 4 結合の 直鎖が長 い基質を用 い る ほ ど最終製品の α ， a — ト レ ハ ロ ー ス の 収率が高 い こ と を示 し て い る 。

実施例 1 1 — 7 可溶性デ ン プ ン か ら の各種酵素濃度 に お け る な ， α — ト レ ハ ロ ー ス の 製造

実施例 1 1 一 2 で得 ら れ た本精製酵素、 及 び

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来の精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを用 い、 基質を K l e s i e l l a p n e um o n i a e 由来の プル ラ ナ 一 ゼ （和光純薬 製） 2 5 U n i t s /m lで 4 0 °C、 l h r の 条件下で前処理 し た可溶性デ ン プ ン と し 、 該基質 （最終濃度 1 0 % ) に 第 1 9 表 に 示 し た 濃度の 酵素を そ れぞれ添加 し て 6 0 °C、 p H 5 . 5 に て約 1 0 0 h r 反応 さ せ て、 こ れ ら 酵素の 相乗作用 を利用 し た α , α — ト レ ハ ロ ー ス の 製造を試み た。 反応液 は未反応の 基質を ダ ル コ ア ミ ラ ー ゼ に て分解 後、 実施例 11— 1 に 示 し た T S K - g e 1 Am i d e-80 HPL C 分析 法 に よ り 分析を行 い、 生成 し た α , α — ト レ ハ 口-一 ス の 収率を調べ た。

な お、 本発明 の 新規 ア ミ ラ ー ゼの 活性 は 、 実施例 11一 1 と 同様 に、 マ ノレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス カ、 ら 1 時間 に l // m o l の α ， α — ト レ ハ ロ ー ス を 遊離す る 酵素活 性を 1 Un i tと し て示 し た。

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株由 来の 精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 活性 は 、 マ ル ト ト リ オ ー ス を基質 と し て p H 5 . 5 、 6 0 °C で 1 時間 に 1 m o 1 の グ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を生成す る 酵素 活性を 1 ϋ n i tと し て示 し た。

プ ル ラ ナ ー ゼ の 活性 は ， プ ル ラ ン を 基 質 と し て p H 6 . 0 、 3 0 。C で 1 分間 に 1 m 0 1 の マ ノレ ト ト リ オ一 ス を生成す る 酵素活性を 1 Un i tと し て示 し た。

そ の 結果 は以下の 第 1 9 表 に示 し た。

第 19表

a, a— ト レノヽ口ース収率 （％)

ァミ ^ーゼし トランスフェラ- -ゼ (ϋηί t ς /m Π

If* 1丄 1 5 10 L U

Π】 n】 t ς /m 1 )

1.5 7.8 28.0 9.6 8.8 9.1

15 10.0 45.3 34.3 33.6 35.2

150 8.6 51.8 59.3 62.1 65.1

450 1.6 45.1 58.9 61.1 64.2

700 1.3 19.0 39.3 44.5 46.8

2000 1.1 12.9 31.5 40.3 42.1 表の結果 よ り 、 ， a — ト レ ハ ロ ー ス の収率 は 、 卜 ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ 2 O Un i t s/m l、 ア ミ ラ ー ゼ 1 5 0 Un i t s/ m 1の と き 最大 と な り 、 6 5 . 1 % に達 し た こ と がわ か る 比較例 11一 2 他の 生物起源の ァ ミ ラ ー ゼを用 い た α , a - ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造

本発明 の 新規ァ ミ ラ ー ゼの比較 と し て、 B a e i l l u s s u b t i 1 i s Ba c i l l u s l i c h e n i i o rm i s及 ひ As p e r g i l 1 u s o r y z a e由 来の ア ミ ラ ー ゼ （そ れ ぞれ、 生化学工業製

100200、 S i gma 製 A - 3403 、 及 び A - 02 Π ： いずれ も 6 0 °C に て活性を有す る ） を用 い、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u S K M 1 株由来の精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ と の併用 に お い て、 基質を K l e b s i e l l a n e umo n i a e 由 来の プル ラ ナ ー ゼ (和光純薬製） 2 5 ϋ n i t s / m 1で 4 0 °C 、 1 h r の 条件下 で前処理 し た可溶性デ ン プ ン （最終濃度 1 0 % ) と し て 該基質 に 、 第 2 0 表 に 示 し た 濃度 の 酵素 を そ れぞれ添加 し 、 6 0 °C 、 H 5 . 5 に て約 l O O h r 反応 さ せ、 こ れ ら 酵素の 相乗作用 を利用 し た α — ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造を試み た 。 反応液 は 未反応の 基質を グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ に て分解後、 実施例 1 1 — 1 に 示 し た T S Κ _ g e 1 A in i d e - 80 H P L C分析法 に よ り 分析を 行 い 、 生成 し た α , a ― ト レ ノヽ ロ ー ス の 収率を調べ た。

な お、 ァ ミ ラ ー ゼの 酵素活性 は 、 実施例 1 I - 1 と 同様 の 条件 に て反応 さ せ て、 デ ン プ ン - ヨ ウ 素複合体の青紫 色 に よ る 6 2 0 1 111 の 吸光 を 1 0 分間 に 1 0 %減少 さ せ る 酵素量を 1 Un i tと し て示 し た。

S u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由来 の精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 活性 は 、 マ ル ト ト リ オ 一 ス を基質 と し て p H 5 . 5 、 6 0 °C で 1 時間 に 丄 / m 0 1 の グ ノレ コ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス を生成す る 酵素 活性を 1 ϋ n と し て示 し た。

プ ル ラ ナ ー ゼの 活性 は， プル ラ ン を基質 と し て p H 6 . 0 、 3 0 °C で 1 分間 に 1 m 0 1 の マ ル ト ト リ オ 一 ス を生成す る 酵素活性を 1 Un i tと し て示 し た。

そ の 結果 は以下の 第 2 0 表 に 示 し た。 第 20 表

トランスフヱ , α- 卜レ ラーゼ濃度 a- アミラーゼ a- アミラーゼ濃度 ハロース収率

(Units/ml) 起源 (lini t s/nil) (%)

0 Bacillus subt 111 s 1. 0 28. 9 0 10. 0 27. 7 5 Bacillus 11 cheni i ormi s 10. 0 26. 4 0 10. 0 26. 8 5 Aspe rgi 1 lus oryzae 1. 0 23. 2 0 1. 0 23. 1 表の 結果 よ り 、 他の 生物起源の ア ミ ラ ー ゼを用 い て も , α — ト レ ノヽ ロ ー ス を生成す る こ と は で き る 力く、 い ず れ も 収率 は、 本発明の 新規酵素を用 い た場合 よ り も '低 い こ と 力くわ か っ た。

実施例 11一 8 ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 か ら の 各種酵素 濃度 に お け る α , 一 ト レ ハ ロ ー ス の 製造

実施例 11一 2 で得 ら れた本精製酵素、 及 び

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来 の 精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを用 い 、 基質を ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 (林原バ イ オ ケ ミ カ ル製） （最 終濃度 1 0 % ) と し て、 該基質 に、 第 2 1 表 に示 し た濃 度の酵素を そ れぞれ添加 し 、 6 0 °C、 p H 5 . 5 に て約 l O O h r 反応 さ せ、 こ れ ら 酵素の 相乗作用 を利用 し た a , α — 卜 レ ノ、 ロ ー ス の 製 i§を試み た。 反応 は禾反圯、 の 基質を グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ に て分解後、 実施例 1 1一 1 に 示 し た T S K - g e l A m i d e - 80 H P L C 分析法 に よ り 分析を行 い 生成 し た ， a ― ト レ ノヽ ロ ー ス の 収率を調べ た。

な お、 本発明 の新規 ァ ミ ラ ー ゼ活性 は、 実施例 1 1一 1 と 同様 に 、 マ ノレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス か ら 1 時間 に

1 m 0 1 の a , a — ト レ ハ ロ ー ス を 遊離す る 酵素活性 を 1 U n i tと し て示 し た。

S u 1 f 0 1 0 b u s s o l i a t a r i c u s K M 1 株由来 の 精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 活性 は、 マ ル ト ト リ オ一ス を基質 と し て P H 5 . 5 、 6 0 °C で 1 時間 に 1 m 0 1 の グ ノレ コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を生成す る 酵素 活性を 1 ϋ n と し て示 し た o

そ の結果 は以下の 第 2 1 表 に示 し た。

第 21表

a, a―トレハロース収率 (%)

アミラーゼ トランスフヱラーゼ (Units/ml)

].1 5 10 20

(Units/ml)

1. 5 11.9 46.8 52. 1 48.4 40.4

15 25. 6 77· 9 79. 1 81.8 11.

150 10. 1 62. 1 76. 9 83.4 81.9

200 2.8 47.9 73.2 76. 1 79.2

700 1.2 11.0 49. 1 61.8 68.4

2000 0. 6 9.2 27. 5 36.1 48.7 表の結果 よ り 、 直鎖状の α — 1 , 4 結合か ら な る ア ミ ロ ー ス D P 一 1 7 を基質 と し た場合 に は α , α — ト レ ロ ー ス の 収率 は 、 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー セ 1 0 U n i t s/m l、 ア ミ ラ ー ゼ 1 5 0 U n i t s /m l の と き 最大 と な り 、 8 3 . 4 % に達 し た こ と 力 わ か る 。

実施例 1 1 一 9 各種可溶性デ ン プ ン 濃度 に お け る な ， a 一 ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造

実施例 1 1 一 2 で得 ら れ た 本精製酵素、 及 び

S u l f o l o b u s s o l f a t a r l c u s K M 1 株 由来の精製 ト ラ ン ス フ エ ラ ー セ を 用 い、 基質を 可溶性デ ン プ ン と し 、 該基質の 最終濃度 5 % 、 1 0 % 、 2 0 % . 及び 3 0 % の も の に 、 第 2 2 表 に 示 し た濃度の 酵素を そ れぞれ添加 し 、 6 0 。C 、 P H 5 . 5 に て 約 l O O h r 反応 さ せ、 こ れ ら の 酵素の 相乗作用 を利用 し た α ， cr 一 ト レ ロ ー ス の 製造を s¾み た 。 こ の 際、 反 応途中、 O h r か ら 9 6 h r の 間、 O h r も 含め て 1 2 h r 毎 に 合計 9 回、 5 Un i t s /m l と な る よ う プル ラ ナ ー ゼ K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 由 来 an » 禾 D光純薬製） を添加 し 、 4 0 °C 、 1 h r の 条件下で処理 し た

反応液 は未反応の 基質を グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ に て分解後 実施例 1 I — 1 に示 し た T S K - g e 1 Am i d e - 80 H P L C 分析法 に よ り 分析を行 い、 生成 し た α , α — 卜 レ ハ ロ ー ス の 収率 ¾ 調べ た。 な お、 本発明 の 新規 ァ ミ ラ ー ゼの 活性 は、 実施例 11一 1 と 同様 に、 マ ノレ ト ト リ オ シ ゾレ ト レ ノヽ ロ ー ス カヽ ら 1 時間 に 1 i m o l の α , <2 — ト レ ロ ー ス を 遊離す る 酵素活 性 を 1 Un i tと し て示 し た。

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株由 来 の 精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 活性 は 、 マ ル ト ト リ オ ー ス を基質 と し て p H 5 . 5 6 0 °C で 1 時間 に 1 m 0 1 の グ ル コ シ ノレ ト レ ロ ー ス を生成す る 酵素 活性を 1 ϋ n i t と し て示 し た。

プル ラ ナ ー ゼ の 活性 は， プ ル ラ ン を基質 と し て p H 6 0 3 0 °C で 1 分間 に 1 m 0 1 の マ ノレ ト ト リ オ ー ス を 生成す る 酵素活性を 1 Un i tと し て示 し た。

そ の 結果 は以下の 第 2 2 表 に 示 し た。

第 22 表

可溶性デンプン トランスフエ アミラーゼ a, a- トレ

ラーゼ 體 ハロース収率 (%) (Units/ml) (Units/ml) _ (%)

2 50 76.6

5 150 74.4

10 10 150 11,

20 150 112

20 10 150 75.1

20 150 75.0

30 10 150 71.4

20 150 71.9 表の 結果 よ り 、 基質の可溶性デ ン プ ン の 濃度を 5 〜 3 0 % と 変化 さ せ た 場合で も 、 ア ミ ラ ー ゼ及 び ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ濃度を最適条件の 下で使用 す る こ と に よ り 、 a , α — ト レ ハ ロ ー ス の 収率 を 、 い ずれ も 7 0 %以上 と す る こ と 力くで き る こ と 力くわ 力、 る 。

実施例 1 1 _ 1 0 各種 プル ラ ナ ー ゼ処理を 含む可溶性デ ン プ ン か ら の ， α — ト レ ハ ロ ー ス の 製造

実施例 I i一 2 で得 ら れた本精製酵素、 及 び

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株由 来の精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを用 い、 基質を 可溶性デ ン プ ン （最終濃度 1 0 % ) と し て、 該基質 に 第 2 3 表 に 示 し た濃度の 酵素を そ れぞれ添加 し 、 6 0 °C、 p H 5 . 5 に て約 1 2 O h r 反応 さ せ、 こ れ ら 酵素の相 乗作用 を利用 し た α , α — ト レ ハ ロ ー ス Ο 製造を試み た こ の 際、 反応途中 2 4 h r 後 に 1 回 （ a ) 、 4 8 h r 後 に 1 回 （ b ) 、 7 2 h r 後 に 1 回 （ c ) 、 9 6 h r 後 に 1 回 （ d ) 、 2 4 h r か ら 9 6 h r の 間、 2 4 h r 毎 に 合計 4 回 （ e ) 、 O h r カヽ ら 9 6 h r の 間、 O h r も 含 め て 1 2 h r 毎 に 合計 9 回 （ f ) 、 及 び O h r 力、 ら 1 2 h r の 反応初期段階 に 、 O h r も 含 め て 3 h r 毎 に 合計 5 回、 そ の 後 は 2 4 h r か ら 9 6 h r の 間、 1 2 h r 毎 に 合計 7 回 （ g ) の 条件の下で表中 に 示 し た濃度 と な る よ う に プ ノレ ラ ^ ゼ K l e b s i e l l a n e umo n i a e 由 来品 ) を添加 し 、 いずれの 場合に も 添加後 4 0 °C、 l h r の 条 件の 下で プ ル ラ ナ ー ゼ処理を し た。

反応液 は未反応の 基質を ダ ル コ ア ミ ラ ー ゼ に て分解後 実施例 示 し た T S K- g e 1 Am i d e - 80 H P L C 分析法 に よ り 分析を行 い 、 生成 し た α , α — ト レ ハ ロ ー ス の 収率 を 調べ た。

な お 、 本発明 の新規 ァ ミ ラ ー ゼ の 活性 は、 実施例 1 1一 1 と 同様 に 、 マ ル ト ト リ ォ シ ル ト レ /、 ロ ー ス 力、 ら 1 時間 に 1 μ m 0 1 の a , a 一 ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 酵素活 性を 1 U n i tと し て示 し た 。

S u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s Κ Μ 1 株由 来の 精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 活性 は 、 マ ル 卜 卜 ' J オ ー ス を基質 と し て P H 5 . 5 、 6 0 °C で 1 時間 に 1 m 0 1 の グル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を生成す る 酵素 活性を 1 ϋη i tと し て示 し た

プル ラ ナ ー ゼの 活性 は， プル ラ ン を基質 と し て p H 6 . 0 、 3 0 °C で 1 分間 に 1 /z m o l の マ ル ト ト リ オ一 ス を生成す る 酵素活性を 1 U n i t と し て示 し た。

の 結果 は 以下の 第 2 3 表 に 示 し た。

第 23表

a， ひ一トレハロース収率 （％)

プルラ アミラーゼ トランス プルラナーゼ濃度 （Units/ml) ナーゼ 濃度 フェラーゼ

処理方法 0 1 1 2 5 10 25

(ϋηί ts/ml) (Uni ts/ml)

(a) 150 in 62 9 67 6 71 7

(b) 150 10 49.4 60.0 62.2 66.0 11.0

(c) 150 10 49.6 59.1 63.2 66.4 70.0

(d) 150 10 49.2 59.3 62.9 67.0 70.0

(e) 150 10 57.8 69.9 72.6 74.1

(f ) 150 10 74.0 76.6 77.4 67.6

150 20 74.4 U.0 18.2 67； 0

(g) 150 10 75.7 76.5 80.9 61.9

150 20 75.9 11.9 11.0 11.5

表の 結果 よ り 、 反応途中 に プル ラ ナ ー ゼ処理を導入す る こ と に よ り 収率を 向上 さ せ る こ と がで き 、 し か も 、 複 数回 に わ た っ て該処理を す る 方法 、 或 い は反応初期段階 で複数回 に わ た つ て該処理を す る 方法 に お い て 、 α , a

- ト レ ハ ロ ー ス の 収率を一段 と 向上 さ せ る こ と がで き る こ と か' わ か っ た 。 ト ラ ン ス フ ェ ラ 一 ゼ 1 0 Un i t s /m 1、 ァ ミ ラ ー ゼ 1 5 0 Un i t s/m l、 プゾレ ラ ナ 一 ゼ処理方法 （ g ) プル ラ ナ ー ゼ 5 Un i t s/m lの 条件下で a , 一 卜 レ ノヽ ロ ー ス の収率 は最大 と な り 、 8 0 . 9 % に た o 実施例 11一 1 各種 ァ ロ ー ス D P 7 濃度及 び 各種反応温度 に お け る a , a ― ト _レ ハ _ロ ー— ス の 製造

実施例 11一 2 で得 ら れ た 本精製酵素、 及 び

S u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来の 精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ 一 ゼを、 そ れぞれ 3 2 0 Un i t s Z g 一 基質、 及 び 2 0 Un i t s / g 一 基質 と な る よ う に 添加 し 、 基質 を ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 と し て 第 2 4 及 び 2 5 表 に 示 し た基質濃度及 び反応温度 に お い て、 そ れぞれ約 1 0 0 h r 反応 さ せ、 こ れ ら 酵素の 相乗 作用 を利用 し た α , a - ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造を試み た。

反応液 は未反応の 基質を グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ に て分解後 実施例 1 1 一 1 に 示 し た T S K- g e 1 Am i d e - 80 HPLC 分析法 に よ り 分析を行 い、 生成 し た α , α — ト レ ノヽ ロ ー ス の収率 及 び反応速度を調べ た

な お、 本発明 の新規 ァ ミ ラ ー ゼ の 活性 は、 実施例 11一 1 と 同様 に、 マ ゾレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス か ら 1 時間 に 1 /z m o l の ， a 一 ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 酵素活 性を 1 Un i tと し て示 し た。

S u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来 の 精製 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ の 活性 は 、 マ ル ト ト リ オ ー ス を基質 と し て P H 5 . 5 、 6 0 °C で 1 時間 に 1 m 0 1 の グ ル コ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス を生成す る 酵素 活性を 1 ϋ n i tと し て示 し た。

そ の 結果 は以下の 第 2 4 及 び 2 5 表 に 示 し た。 な お、 第 2 4 表中 の 反応速度 は、 1 時間 に 1 /z m o 1 の 0L ， - ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 速度を 1 Un i t と し て 示 し た

第 24表

R応速度 (Units Zml)

反応温度 基質濃度 (%)

CO 1 0 20 30 40

40 1. 1 1. 8 4 . 8 6. 2

50 3. 2 8. 1 7 . 7 12. 3

60 6. 8 16. 2 23 . 8 23. 1

70 12. 0 29. 3 32 • 3 55. 6

80 13. 3 30. 8 66 . 9 88， 0

反応収率 （％)

反応温度 基質濃度 （％)

(°C) 1 0 20 30 40

40 42. 7 50. 3 42. , 6 28. 8

50 71. 0 70. 2 64. . 6 35. 2

60 74. 6 72. 5 66. , 2 65. 8

70 75. 1 75. 0 65, , 4 70. 7

80 69. 3 68. 2 68. . 4 70. 9 表の結果 よ り 、 反応温度を 4 0 〜 8 0 °C に上げ る と 温 度依存的 に反応速度 は増加す る こ と 力くわ 力、 つ た。 ま た、 低温 ( 4 0 〜 5 0 °C ) で は基質濃度 を高濃度 （ 3 0 〜 4 0 % ) と す る と 不溶化 し 、 収率が著 し く 低下す る が、 问 imi に す る と 基質が溶解 し 、 収率 も 高 く 維持で き た。 収 率 は 7 5 . 1 % に 達 し た。

本実施例 の 結果か ら 、 耐熱性の 高 い 本発明 の ア ミ ラ ー ゼを用 い る こ と に よ り 、 高温、 高濃度仕込を可能 と し 、 経済的 に も 、 ハ ン ド リ ン グ の 容易 さ の 観点か ら も 有利 な a , α — 卜 レ ノヽ ロ ー ス の 製造法を提供 し 得 る こ と が理解 さ れ る

実施例 1卜 1 2 各種可溶性デ ン プ ン 濃度及び各種反応 温度 に お け る 、 耐熱性 プル ラ ナ ー ゼを用 い た α , —. ト レ ハ ロ ー ス の 製造

施例 11 — 2 で得 ら れた本精製酵素、

5 u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s Κ Μ 1 株 由 来の 精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ、 及 び市販耐熱 性 プル ラ ナ ー ゼ （デ ブ ラ ン チ ン グ ェ ン ザ ィ ム ァ マ ノ

( Ba c i 11 u s S P. 由 来品 、 天野製薬社製） ； な お、 疎水 ク 口 マ ト グ ラ フ ィ ー TO S 0 H T S K- g e 1 Ph e ny l -T0Y0PE ARL

650 Sに よ り 、 混在す る グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ活性及 び α: — ァ

5. ラ ― ゼ活性を 除去 し た） を 、 そ れぞれ 1 2 8 0 Un i t s

Z i 一 基質、 8 0 ϋ n i t s / I — 基質、 及 び 3 2 Un i t s / m l と な る よ う に 添加 し 、 基質を可溶性デ ン プ ン と し て、 第 2 6 及 び 2 7 表 に示 し た基質濃度及 び反応温度 に お い て、 そ れ ぞれ約 1 0 0 h r 反応 さ せ、 こ れ ら 酵素の相乗 作用 を利用 し た な ， a 一 ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造を試み た。

反応液 は未反応の 基質を グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ に て分解後 実施例 11一 1 に 示 し た T S K- g e 1 Am i d e - 80 HPL C 分析法 に よ り 分析を行い 、 生成 し た ， 一 ト レ ハ ロ ー ス の 収率 及 び反応速度を調べ た 0

な お、 本発明 の 新規ァ ミ ラ ー ゼ の 活性 は 、 実施例 11一 1 と 同様 に 、 マ ゾレ ト ト リ ォ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス カヽ ら 1 時間 に l i m o l の ， a ― ト レ ノヽ ロ ー ス を遊離す る 酵素活 性を l Un i tと し て示 し o

S u 1 f o 1 0 b u s s o 1 f a t a r i c u s K M 1 株 由来の精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 活性 は 、 マ ル ト ト リ オ ー ス を基質 と し て p H 5 . 5 6 0 °C で 1 時間 に 1 m 0 1 の ダ ル コ シ ノレ ト レ ー ス を生成す る '酵素 活性を 1 Un i tと し て示 し た 。

プ ル ラ ナ ー ゼ の 活性 は プル ラ ン を基質 と し て P H 5 . 5 6 0 °C で 1 分間 に 1 β m. 0 1 の マ ゾレ ト ト リ オ ー ス を 生成す る 酵素活性を 1 ϋ n i tと し て示 し た o

そ の 結果 は 以 下 の 第 2 6 及 び 2 7 表 に 示 し た。

な お、 第 2 6 表 中 の 反応速度 は、 1 時間 に 1 /z m 0 1 の α , α — ト レ ス を遊離す る 速度 を 1 ϋ n i tと し て 示 し た。 第 26表

反応速度 （Units /ml)

反応温度

C°C) 10 20 30

40 15. 8 22. 8 22. 2

5 n 26. 0 50. 8 57 5

60 36. 5 58. 4 96. 4

第 27表

反応収率 （％)

反 度 基質鍵 (%)

10 20 Q n

40 53. 1 8. 9 6. 2

50 70. 9 56. 1 58. 6

60 74. 1 72. 6 71. 7

な お、 耐熱性 プル ラ ナ ー ゼを添加 し な い以外 は基質濃 度 1 0 %、 反応温度 6 0 °C に お い て、 上記の 条件下で反 応 さ せ た と こ ろ 、 反応収率 は 3 5 . 0 % で あ っ た。

表 の 結果 よ り 、 耐熱性 プル ラ ナ 一 ゼ は反応 に あ た り 一 度添加す る の み で収率向上効果が得 ら れ、 反応温度を 4 0 6 0 °C に 上 げ る と 温度依存的 に 反応速度 は増加す る こ と がわ 力、 つ た。 ま た 、 低温 （ 4 0 5 0 °C ) で は基 質濃度を高濃度 （ 2 0 3 0 % ) と す る と 不溶化 し 、 収 率が著 し く 低下す る が、 高温 （ 6 0 °C ) に す る と 基質が 溶解 し 、 収率 も 高 く 維持で き た。 収率 は、 7 4 % に 達 し た。

実施例 1 1 3 ィ ゼ処理を含む可溶性デ ン プ ン カヽ ら の 0! ， a 一 卜 レ ノヽ □ ス の 製造

実施例 1 I - 2 で得 ソら れ た 本精製酵素、 及 び

S u 1 f 0 1 0 b u s s o 1 f a t a r i C U S

K M 1 株 由 来の精製 ト ラ ン スラ フ ェ ラ 一セ を用 い、 基質を 可溶性デ ン プ ン (最終濃度 1 0 % ) と し て、 該基質 に そ れぞれ 1 2 8 0 U n i t s / g - 基質、 及 び 8 0 U n i t s / 一 基質 と な る よ う に添加 し 、 6 0 °C、 P H 5 . 0 に て約 1 0 0 h r 反応 さ せ 、 こ れ り 酵素の相乗作用 を利用 し た a , a — ト レ ハ D 一ス の 製造を試み た 。 こ の 際、 0 h r か ら 1 2 h r の反応初期段階 に 、 0 h r も 含め て 3 h r 毎 に 合計 5 回、 そ の 後 は 2 4 h r か ら 9 6 h r の 間、 2 4 h r 毎 に 合計 3 回 の 条件の 下で イ ソ ア ミ ラ ー ゼ ( P s e u d o m a n a s a m y 1 0 d e r a m 0 s a 由 来品、 生化学工業） を 第 2 8 表 に示 し た濃度 と な る よ う に添加 し 、 いずれの場 合 'に も 添加後 4 0 °C、 1 h r の 条件の 下で ィ ソ ァ ミ ラ ー ゼ処理を し た。

反応液 は未反応の基質を グル コ ア ミ ラ ー ゼに て分解後 実施例 1 1 一 1 に示 し た T S Κ - g e 1 A m i d e - 8 0 H P L C 分析法 に よ り 分析を行 い、 生成 し た α ， ひ 一 ト レ ハ ロ ー ス の収率 を調べ た

な お 、 本発明の新規 ア ミ ラ ー ゼ の活性 は、 実施例 I I 一 1 と 同 にヽ マ ル ト ト リ ォ シ ノレ 卜 レ ノヽ ロ ー ス か ら 1 時間 に 1 / m 0 1 の a , a 一 卜 レ ハ ロ ー ス を 遊離す る 酵素活 性を 1 U n i tと し て示 し た。

S u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株由 来の 精製 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼの 活性 は 、 マ ル 卜 卜 U オ ー ス を基質 と し て p H 5 . 5 、 6 0 °C で 1 時間 に 1 m 0 1 の グ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を生成す る 酵素 活性を 1 U n i ί と し て示 し た o

ィ ソ ア ミ ラ ー ゼの 活性 は 、 1 %可溶性 モ チ ゴ メ デ ン プ ン 0 . 5 m I に 0 . 5 M酢酸緩衝液 p H 3 . 5 を 0 . 1 m 1 、 酵素液 0 . 1 m 1 を混合 し て 4 0 °C で反応 さ せ、 ァ ミ 口 一ス ー ョ ゥ 素複合体の 青紫色 に よ る 6 1 O n m の 吸光度 を 1 c m幅の セ ノレ で測定 し （濺粉、 関連糖質酵素実 験法、 中村道徳 、 貝沼圭二、 学会出版セ ン タ ー刊、 1 9 8 9 年 ) 、 1 時間 に 0 増加 さ せ る 酵素量を 1 Un i tと 定義 し た。

そ の 結果 は以下の 第 2 8 表 に 示 し た。

第 28表

イソアミラーゼ 反応収率

(ϋη ί t s /ml) (%)

0 35. 0

500 75. 7

1000 73. 7

2000 71. 0 55 —

表の 結果 よ り 、 プル ラ ナ ー ゼ ^ K l e b s i e l l a

n e umo n i a e 由 来品 ) の 場合 と 同様 に 、 反応途中 に イ ソ ァ ミ ラ ー ゼ処理を導入す る こ と に よ り 収率を 向上 さ せ る こ と 力くで き 、 α , α — ト レ ハ ロ ー ス の 収率 は、 7 5 . 7 % に達 し た。

実施例 1 1 — 1 4 S u 1 f 0 1 0 b u s

s 0 1 f a t a i c u s K M 1 株 由 来枝切 り 酵素処 理を 含む可溶性デ ン プ ン か ら の a , - ト レ ハ ロ ー ス の 製造

実施例 11一 2 で得 ら れた本精製酵素、

S u 1 f 0 1 0 D u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来の精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ、 及 び

S u 1 f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株の 枝切 り 酵素 （参考例 1 1一 3 の方法 に準 じ て菌 体抽 出液 よ り 分離精製 し た も の ） を、 そ れぞれ 1 2 8 0 Un i t s Z g 一 基質、 8 0 Un i t s / g 一 基質、 及び下表中 に示す濃度 と な る よ う に添加 し 、 基質を可溶性デ ン プ ン (最終濃度 1 0 % ) と し て、 6 0 °C 、 p H 5 . 5 と し て 約 1 0 0 h r 反応 さ せ、 こ れ ら 酵素の 相乗作用 を利用 し ナ： a , a 一 ト レ ハ ロ ー ス の 製造を試み た。

反応液 は未反応の 基質を グル コ ア ミ ラ ー ゼ に て分解後 実施例 Π — 1 に示 し た T S K - g e 1 Am i d e - 80 HPL C 分析法 に よ り 分析を行 い、 生成 し た α — ト レ ノヽ ロ ー ス の収率 ¾r調べ た な お、 本発明 の 新規 ァ ミ ラ ー ゼの 活性 は、 実施例 1 1一 1 と 同様 に 、 マ ゾレ ト ト リ オ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス カヽ ら 1 時間 に 1 μ m 0 1 a 、 a - ト レ ハ ロ ー ス を 遊離す る 酵素活 性 を 1 U n i tと し て示 し た 0

S u 1 f o 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s Κ Μ 1 株由 来 の 精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 活性 は 、 マ ル 卜 ト リ オ ー ス を基質 と し て p H 5 . ' 5 、 6 0 °C で 1 時間 に 1 m o 1 の グ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を 生成す る 酵素 性 ¾r 1 U i tと し て示 し た。

S u 1 f o 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株由来 の 精製枝切 り 酵素の 活性 は、 1 %可溶性モ チ ゴ メ デ ン プ ン 0 . 5 m I に 0 . 5 M酢酸緩衝液 p H 5 . 0 を 0 . 1 m 1 、 酵素液 0 . 1 m l を混合 し て 6 0 °C で反応 さ せ、 ア ミ ロ ー ス ー ヨ ウ 素複合体の青紫色 に よ る 6 1 0 n m の 吸光度を 1 c m幅の セ ル で測定 し 、 1 時間 に 0 . 1 増加 さ せ る 酵素量を 1 ϋ n i t と 定義 し た。

そ の ； Pf は以下の 第 2 9 表 に 示 し た。

第 29表 枝切り酵素翻 反応収率

(Units /ml) (%)

0 35. 0

3 69. 8

6 69. 5

12 68. 0

24 67. 8 表の 結果 よ り 、 耐熱性プル ラ ナ ー ゼ （デ ブ ラ ン チ ン グ ェ ン ザ ィ ム ァ マ ノ 、 Ba c i l l u s s p. 由 来品 ） の 場合 と 同様 に、 S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来の 枝切 り 酵素 は反応 に あ た り 一度添加す る の み で収率を 向上 さ せ る こ と がで き 、 ， α — ト レ ノヽ ロ ー ス の収率 は、 6 9 . 8 % に達 し た。 参考例 1 1 一 1 各種 ァ ロ ー ス D P — 1 7 濃度及 び各 種反応温度 に お け る ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ に よ る 転移オ リ ゴ糖の 製造

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株由来の精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを 、 2 0 Un i t s / g 一 基質 と な る よ う に添加 し 、 基質を ア ミ ロ ー ス D P 一 1 7 と し て、 第 3 0 及 び 3 1 表 に 示 し た基質濃度及び 反応温度 に お い て、 そ れぞれ約 1 0 0 h r 反応 さ せ、 還 元末端側の グ ル コ ー ス 残基力く α — 1 ， α — 1 結合 し た対 応の ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 を生成 さ せ た。

生成 し た還元末端側 の グ ル コ ー ス 残基力く α — 1 , a — 1 結合 し た対応の ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖 は、 ジ ニ ト ロ サ リ チ ル酸法 （緞粉 · 関連糖質酵素実験法、 中村道徳 · 貝 沼圭二、 学会 出版セ ン タ ー 刊、 1 9 8 9 年） に よ り そ の

3S兀末端量を 測定 し 、 そ の 減少量 よ り 収率及 び反応速度 を調べ た o

S u 1 f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株由来の 精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 活性 は、 マ ル ト ト リ オ 一 ス を基質 と し て p H 5 . 5 、 6 0 °C で 1 時間 ίこ 1 // m 0 1 の ダ ル コ シ ノレ ト レ ハ ロ ー ス を生成す る 酵素 活性を 1 U n i tと し て示 し た。

そ の 結果 は以下の 第 3 0 及 び 3 1 表 に示 し た。

な お、 第 3 0 表中 の 反応速度 は、 1 時間 に l ;z m o l の α ， a - ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 速度を 1 U n i tと し て 示 し た。 59 —

第 30表

反応速度 (Units /ml)

CO 1 0 20 30 40

A n n o

o 2. 9 3 c

. 0 A o

50 3. 0 5. 5 8 . 6 8. 1

60 1. 7 6. 5 10 • 3 16. 7

70 4. 0 7. 0 12 . 0 19. 8

O A

o U o . b 9. 4 15 o

. o Z U. 4

反応収率 (%)

反応 基質驗 (%)

O 1 0 20 30 40

40 70. 7 74. 5 63. , 4 37. 6

50 76. 0 72. 8 70, . 5 46. 7

60 71. 6 75. 1 75, . 3 55. 1

70 71. 6 70. 4 76, . 6 72. 6

80 65. 6 64. 8 72, . 7 72. 5 表の 結果 よ り 、 反応温度を 4 0 〜 8 0 °C に上 げ る と 温 度依存的 に反応速度 は増加す る こ と がわ か っ た。 ま た、 低温 （ 4 0 〜 5 0 °C ) で は基質濃度を高濃度 （特 に 4 0 % ) と す る と 不溶化 し 、 収率が著 し く 低下す る が、 高温 に す る と 基質が溶解 し 、 収率 も 高 く 維持で き た。 モ ル収 率 は 7 6 . 6 % に達 し た 。

参考例 11一 2 ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 の 水 に 対す る 溶 解度の 測定

ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 を 5 、 1 0 、 2 0 、 3 0 、 4 0 % (w/v 0 i ) 溶液 と な る よ う に 加熱溶解 し た後、 3 5 4 0 、 5 0 、 6 0 、 7 0 、 8 0 °C の 高温槽 に 入れ、 経時 的 に サ ン プ リ ン グ し 、 生 じ た不溶物 を 濾過 し て得 ら れ た 上清溶液中 の ア ミ ロ ー ス D P — 1 7 濃度を求 め、 平衡 と な っ た 濃度を飽和点 と し て溶解度 を求め た。

そ の 結果 は以下の 第 3 2 表 に 示 し た。 第 32表

溶解度

(°C) (% (w/vol) )

35 3

40 13, 0

50 18. 9

60 27. 6

70 32. 3

80 35. 3 参考例 3 S u 1 f o l o b u s

s o 1 f a t a r i c u s K M 1 株 由 来枝切 り 酵素の 精製

S u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株を、 2 g Z リ ツ ト ル の 可溶姓デ ン プ ン 及 び 2 g / リ ツ ト ル の 酵母エ キ ス を 含む

A m e r i c a n T y p e C u l t u r e

C o 1 1 e c t i o n ( A T C C ) 発行

C a t a 1 o g u e 0 f B a c t e r i a a n d P h a e s 1 8 版 （ 1 9 9 2 ) に 記載の培地番号 1 3 0 4 の 培地で 7 5 °C、 3 日 間培養 し た。 遠心分離 に よ り 集菌 し、 一 8 0 °C に て保存 し た。 菌体の 収率 は

3 . 3 g / リ ツ ト ルで あ つ た。

上記の よ う に し て得 ら れ た 菌体 8 2 g を 5 m M の E D

T A を含む 5 0 m M酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ P H 5 . 5 )

4 0 0 m l に 懸獨 さ せ、 0 °C で 1 5 分間、 超音波破砕処 理 に よ り 溶 し 、 次 い で遠心分離を行 い上清溶液を 得た。

こ の上清溶液 に 硫安を 1 M と な る よ う に加 え、 1 M の 硫安、 0 m M の E D T A を 含む 5 O m M酢酸ナ ト リ ゥ ム 緩衝液 （ P H 5 . 5 ) に て平衡化 し た疎水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ 力 ラ ム ： T 0 S 0 H T S K- e 1 Ph e ny 1 -TOYOPEARL

650 S 8 0 0 m 1 ) に通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗 净 し 、 素通 り 画分中 に標的枝切 り 酵素を 回収 し た。 上清 溶液中 に含 ま れて い る ァ ミ ラ ー ゼ、 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ、 及 び グル コ ア ミ ラ ー ゼ は カ ラ ム 充填剤 P h e n y 1 - T 0 Y 0 P E A R L 650 S に 保持、 吸着 さ れ る の で、 標的枝切 り 酵素 と は分 離 さ れ た。 活性画分を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト

1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 弓 1 き 続 き 1 0 m M ト リ ス 塩酸 緩衝液 （ p H 7 . 5 ) に て洗浄 し 、 脱塩 し た。

次 い で 同緩衝液 に て平衡化 し た イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TO SOH TSK- g e l DATE- T0Y0PEARL 650 S 3 0 0 m l ) に 通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 引 き 続 き 9 0 0 m 1 の 0 M 〜 0 . 3 M食塩の 線状勾配で 標的枝切 り 酵素を溶出 し た。 活性画分 を 限外濾過膜 （分 子量 カ ッ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 次 い で 0 . 1 5 M の 食塩、 5 m M の E D T A を含む 5 O m M酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) に て洗浄 し 、 脱塩 し た。

こ の 脱塩濃縮液を ゲル濾過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： Ph a rma c i a H i L o a d 16/60 S u p e r d e x 200p g) に載せ、 同緩衝液 に て標的枝切 り 酵素を溶出 し た。 活性画分を 限 外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 弓 I き 続 き 2 5 m M ビ ス ー ト リ ス — イ ミ ノ ジ 酢酸緩衝液 （ p H 7 . 1 ) に て洗浄 し 、 脱塩 し た。

こ の 脱塩濃縮液を 同緩衝液 に て平衡化 し た ク ロ マ ト フ オ ー カ シ ン グ （ カ ラ ム ： Ph a rma c i a Mo no P H R 5 / 20 ) に載 せ、 1 0 % P o 1 y b u i { e r 1 ( Ph a rma c i a 製、 イ ミ ノ ジ 酢酸 に て p H 4 . 0 に調整 し た も の ） で標的枝切 り 酵素 を溶 出 し た。 活性画分を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 弓 I き 続 き 1 0 m M ト リ ス 塩酸 緩衝液 （ p H 7 . 5 ) に て洗浄 し 、 脱塩 し た。

こ の 脱塩濃縮液を 同緩衝液 に て平衡化 し た イ オ ン 交換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ カ ラ ム ： TO SOH T S K- g e 1 DATE 5 PW HPL C ) に通 し た。 カ ラ ム を 同緩衝液 に て洗浄 し 、 次 い で 3 0 111 1 の 0 ^〜 0 . 3 M食塩の線状勾配で標的枝切 り 酵素を溶 出 し た。 活性画分を 限外濾過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し 、 標的枝切 り 酵素の部分精製 品 （液状品） を得 た。

な お、 上記の精製法 に お け る 標的枝切 り 酵素の 検 出 は . 基質 と し て 5 %可溶性デ ン プ ン を用 い、

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s

K M 1 株由 来の 精製ア ミ ラ ー ゼ及び精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの そ れぞれ 2 Un i t s m l及び 3 2 Un i t s Z m lを被検 液 と 共 に添加 し 、 p H 5 . 5 、 6 0 °C に て反応 さ せ、 被 検液の 無添加の 場合 と の比較 に お い て a ， a — ト レ ハ ロ ー ス生成量が増加す る 活性を指標 と し て行 っ た。

上記の精製法 に よ っ て得 ら れた S u 1 f o 1 o b u s s o 1 f a t a r i c u s K M 1 株 由 来の 部分精製枝 切 り 酵素の 活性 は、 1 %可溶性モ チ ゴ メ デ ン プ ン 0 . 5 m l に 0 . 5 M齚酸緩衝液 p H 5 . 0 を 0 . 1 m l 、 酵 素液 0 . 1 m l を混合 し て 6 0 °C で反応 さ せ、 ア ミ ロ ー ス 一 ヨ ウ 素複合体の青紫色 に よ る 6 1 O n m の 吸光度を 1 c m幅の セ ル で測定 し 、 1 時間 に 0 . 1 増加 さ せ る 酵素 量を 1 ϋ n i tと 疋我 し た o

以上の 精製操作 に よ り 部分精製 さ れ た 枝切 り 酵素の比 活性 は 4 9 5 Un i t s Z m gで あ っ た。

参考例 1 I一 4 S u 1 f o 1 o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来枝切 り 酵素の 諸性質の 検討

参考例 11一 3 で得 ら れ た 部分精製枝切 り 酵素の 酵素学 的諸性質を測定 し た。

( 1 ) 作用及 び基質特異性

以下の 第 3 3 表 に示す 質及 び各活性測定法を 用 い て、 各基質 に対す る 反応性及 び作用 を調べ た。

ジ ニ ト ロ サ リ チ ル酸法 源粉 · 関連糖質酵素実験法、 中村道徳 · 貝沼圭二、 学 出版セ ン タ ー 刊、 1 9 8 9 年） は、 — 1 , 6 結合の加水分解反応 に よ る 還元末端量の 増加 を定量す る 方法で あ る

ヨ ウ 素呈色法 は参考例 一 3 と 同様 に 行 い 、 α — 1 , 6 結合の加水分解反応 に よ る 直鎖状 ァ ミ ロ ー ス の 増加 を、 ア ミ ロ ー ス 一 ヨ ウ 素複合体の 青紫色 に よ る 6 1 0 n m の 吸光度増加 に よ っ て定量す る 方法で あ る 。

液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ に よ る 分解生成物の 分析

( H P L C 法 ) は、 実施例 11— 1 に 示 し た B i 0 - R a d AMI N

E X HPX-42 A H P L C 分析法 に よ り 行 い 、 生 じ る オ リ ゴ 糖を調べ た。 第 33表

活性測定法

ジニトロ ヨウ素呈色法 HPLC法

サリチル酸法

プルラン マルトトリオース 可溶性澱粉 + +

ァミロぺクチン + +

モチゴメデンプン + + 上記 の 結果 か ら 明 ら か な よ う に 、 本枝切 り 酵素 は 、 1 ) プ ル ラ ン 及 び各種 デ ン プ ン よ り 、 還元末端 を 生 じ さ せ 、 2 ) 各種 デ ン プ ン の ヨ ウ 素呈色度 を増加 さ せ、 ま た 、 3 ) プ ル ラ ン よ り マ ゾレ ト ト リ オ ー ス を 生 じ さ せ う る 。 更 に ま た 、 4 ) 実施例 11一 1 4 に 示 し た よ う に 、 可溶性 デ ン プ ン.を 基質 と し て 用 い 、 S u 1 f o 1 o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来 の 精製 ア ミ ラ ー ゼ及 び精製 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ と 共 に 反応 さ せ た 場合、 本枝切 り 酵素 を 添加 し な い 場 合 に 比べ て著 し く a ， a - ト レ ハ ロ ー ス 生成量 を 增加 さ せ る 。 よ っ て 、 こ れ ら の 事 実 力ヽ ら 本酵素 は デ ン プ ン ゃ プ ル ラ ン の ひ 一 1 ， 6 結 合 を 加水分解す る こ と が理解 さ れ る 。 ( 2 ) 安定性

得 ら れた部分精製酵素 の 各温度で の 3 時間処理 に お け る 安定性を第 3 4 表 に 示す。

第 3 4表

処理温度 活性残存率

(°C) (%)

5 0 1 0 9. 1

6 0 7 3. 3

6 5 6. 1

7 0 0 本酵素 は 6 0 °Cで 3 時間 の 処理で 7 3 . 3 % の 残存活 性が あ つ た。

( 3 ) 反応性

得 ら れた部分精製酵素の各 P H及 び各温度 に お け る 反 応性を 、 そ れぞれ第 3 5 及 び 3 6 表 に 示す。 測定 は、 p H 3 〜 5 の 間 は グ リ シ ン塩酸系緩衝液を、 p H 4 〜 5 . 5 の 間 は齚酸ナ ト リ ウ ム 系緩衝液を 、 p H 5 〜

7 . 5 の 間 は燐酸ナ ト リ ウ ム 系緩衝液 を そ れぞれ用 い た O 5/3

167 一 第 3 5表

反応 p H 相対活性

(%)

2 7 1 8 3 1 2 1 7 3 7 3 3 1 4 1 7 4 0 5 1 1 0 0 0 5 5 5 3 7 5 6 3 7 5 6 0 2 2 2 6 9 1 6 7 4 5 7 7 0 2 第 3 6表

反応温度 相対活性

(%)

4 0 5 3. 8

5 0 8 7. 0

6 0 9 7. 6

6 5 0 0. 0

7 0 5 1. 4 本酵素 は 6 0 〜 6 5 °C付近 に反応最適温度、 p H 4 . 0

〜 5 5 付近 に 反応最適 P H を有す る 。

( 4 ) 等電ハ占、、

ク ロ マ ト フ ォ ー カ ー シ ン グ に よ り 分離 さ れ た 枝切 り 酵 素画分の P H 測定の 結果、 等電点 は 4 . 4 で あ っ た。

( 5 ) 各種活性化剤及 び阻害剤の影響

以下の 第 3 7 表 に示す物質を基質 と 共 に 添加 し 、 そ れ ぞ れの 場合の 活性測定 を参考例 I 1一 3 と 同様 に行 い 、 活 性化又 は阻害 の 有無を調べ た。 そ の 結果、 銅 イ オ ン に よ り 阻害を受 け る こ と がわ か っ た。 糖関連酵素で は カ ル シ ゥ ム イ オ ン に よ っ て活性化 さ れ る 場合が多 く 認め ら れ る が、 本酵素 は カ ノレ シ ゥ ム イ オ ン に よ っ て は活性化 さ れな い _a

第 37表

活性化剤 Z阻翻 mm. ( (mM) 無添加に対する相対活性 c o n t r o l (無添加） 5 1 00. 0

C a C 12 5 1 05. 7

Mg C 12 5 82. 9

Mn C 12 5 9 1. 2

C u S 04 5 0. 0

C o C 12 5 87. 2

F e S04 5 74. 1

F e C 1 3 5 39. 0

メルカプトエタノール 5 1 04. 1

ジチオスレィトール 5 1 06. 0 実施例 I 一 9 S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株由来の新規 ト ラ ン ス フ ェ ー ゼの 部分 ァ ミ ノ 酸配列 の 決定

実施例 I 一 2 で得 ら れ た精製酵素の 部分 ア ミ ノ 酸配列 の 決定 は岩松 (生化学 6 3 、 1 3 9 ( 1 9 9 1 ) ) ら の方法 に よ り 行 っ た。 す な わ ち 、 精製 さ れ た新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼを、 泳動用 緩衝液 ( 1 0 % グ リ セ ロ ー ゾレ、 2 . 5 % S D S 、 2 % 2 - メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル、 6 2 m M ト リ ス塩酸緩衝液 （ P H 6 . 8 ) ) に懸漏 し 、 S D S ポ リ ァ ク リ ル ァ ミ ド電気泳動 に供 し た。 泳動後、 当該 酵 を ゲ ル よ り ポ リ ビニ リ デ ン ジ フ ロ リ ド （ P V D F ) 膜 （ P r 0 B 1 0 t 、 （ ァ ブ ラ ィ ド、 バ イ オ シ ス テ ム ズ 社） ） に、 ェ レ ク 卜 ロ フ ロ ッ ァ ィ ン グ （ザ ノレ ト ブ ロ ッ ト I I s 型 （ザル ト リ ウ ス社） ） を 1 6 O m A で 1 時間行 つ た。

転写後、 当該酵素の 転写 さ れた部分の膜を切 り と り 、 約 3 0 0 1 還元用 緩衝液 （ 6 Μ グ ァ ニ ジ ン 塩酸、 0 . 5 Μ ト リ ス 塩酸緩衝液 （ ρ Η 3 . 5 ) 、 0 . 3 % E D T Α、 2 %ァ セ ト ニ ト リ ル） に 浸 し 、 こ れ に l m g の ジ チ オ ス レ ィ ト ー ソレ を 加 え 、 ア ル ゴ ン 下 で 6 0 °C Z約 1 時間の還元を行 っ た。 こ れ に 2 . 4 m g モ ノ ョ ー ド酔 酸を 0 . 5 N水酸ィヒ ナ ト リ ウ ム 液 1 0 1 に溶か し た も の を加え、 遮光下で 2 0 分間撹拌 し た。 P V D F 膜を取 り 出 し、 2 % ァ セ ト ニ ト リ ル で十分洗浄 し た後、 0 . 1 % S D S 中で 5 分間撹拌 し た。 次 に 、 P V D F 膜を水で 軽 く 洗浄後、 0 . 5 % ポ リ ビ 二 ノレ ピ ロ リ ド ン — 4 0 、 l O O m M酢酸 に 浸 し 3 0 分放置 し た。 こ の 後 P V D F 膜を水で軽 く 洗浄 し 、 約 1 m m四方 に 切断 し た。 こ れを 消化用 緩衝液 （ 8 % ァ セ ト 二 ト リ ノレ 、 9 0 m M ト リ ス 塩 酸緩衝液 （ P H 9 . 0 ) ) に 浸 し 、

A c h r o m o b a c t e r P r o t e a s e

I (和光純薬社） を 1 p m o 1 カロえ 、 室温で 1 5 時間消 化 し た。 こ の 消化物を C 8 カ ラ ム （ 曰 本 ミ リ ポ ア リ ミ テ ッ ド、社、 - B 0 n d a s h e r e 5 C 8 、 3 0 0 A 2 . 1 x 1 5 0 m m ) を用 い た逆相 H P L C に よ り 分離 し 、 1 0 数種の ペ プチ ド断片を得た。 ぺ プチ ド の 溶出溶 媒 と し て は、 A 溶媒 （ 0 . 0 5 % ト リ フ ゾレオ 口 酢酸） 、 B 溶媒 （ 0 . 0 2 % ト リ フ ル ォ ロ 酢酸を 含む 2 - プ ロ パ ノ ー ノレ Zァ セ ト ニ ト リ ル 7 ： 3 ) を 用 い、 B 溶媒 に 関 し 2 〜 5 0 %の 直線濃度勾配で 0 . 2 5 m 1 /分の 流速 で 4 0 分間溶 出 さ せ た。 得 ら れた ぺ プチ ド断片 に つ い て 気相べ プチ ド シ ー ケ ン サ ー (ア プ ラ イ ド バ ィ オ シ ス テ ム 社 モ デル 4 7 0 型） を用 い た 自 動エ ド マ ン分解法 に よ り ア ミ ノ 酸配列 を決定 し た。

ま た A c h r o m o b a c t e r P r o t e a s e I で消化 さ れ た べ プチ ド断片を更 に A s p - N に よ り 2 次消化 し 、 得 ら れ たぺ プチ ド断片 に つ い て上記の 条件で 同様 に 分離 し ァ ミ ノ 酸配列 を決定 し た そ の 結果、 部分 ア ミ ノ 酸配列 は下記 の 通 り で あ っ た Ac h r omo b a c t e r p r o t e a s e 肖 ィじ ぺ "7 チ ド フ ラ ク メ—ン ―ト

AP-1 ： Val He Arg Glu Ala Lys (配列番号 9 )

AP-2 ： He Ser He Arg Gin Lys (配列番号 10)

AP- 3 : He He Tyr Val Glu (配列番号 11)

AP-4 ： Met Leu Tyr Val Lys , (配列番号 12)

AP— 5 ： lie Leu Ser 11 e Asn Glu Lys (配列番号 13)

AP-6 ： Val Val He Leu Thr Glu Lys (配列番号 14)

AP— 7 ： Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg Val Lys (配列番号 15)

AP- 8 ： Met He lie Gly Thr Tyr Arg Leu Gin Leu Asn Lys (配列番号 16)

AP— 9 ： Val Ala Val Leu Phe Ser Pro He Val (配列番号 17)

AP- 10 : lie Asn lie Asp Glu Leu lie He Gin Ser Lys (配列番号 18)

AP— 11 ： Glu Leu Gly Val Ser His Leu Tyr Leu Ser Pro He (配列番号 19)

As - N j肖 ィ匕 ぺ プ チ ド フ ラ グ メ ン ト

DN- 1 ： Asp Glu Val Phe Arg Glu Ser (配列番号 20)

DN— 2 ： Asp Tyr Phe Lys (配列番号 20

DN- 3 ： Asp Gly Leu Tyr Asn Pro Lys (配列番号 22)

DN- 4 ： Asp He Asn Gly lie Arg Glu Cys (配列番号 23)

DN- 5 ： Asp Phe Glu Asn Phe Glu Lys (配列番号 24)

DN— 6 ： Asp Leu Leu Arg Pro Asn lie (配列番号 25)

DN- 7 ： Asp He He Glu Asn (配列番号 26)

DN— 8 ： Asp Asn He Glu Tyr Arg Gly (配列番号 27) 実施例 I 一 1 0 S u l f o l o b u s s o 1 f a t a r c u s K M 1 株染色体 D N A の 調製

S u 1 f o 1 0 b u s s 0 1 f a t a r 1 c u s K M 1 株の 菌体 は実施例 I — 2 の 方法 に 従 っ て得 た o こ の 菌体の 1 g に 2 5 % ス ク ロ ― ス ヽ 1 m g / m 1 リ ゾチ一 ム 、 1 m M E D T A 、 1 5 0 m M N a C 1 を 含む 5 0 m M の ト リ ス 塩酸緩衝液 （ P H 8 . 0 ) 1 0 m 1 ¾r 加 え懸濁 し 、 室温 に て 3 0 分放置 し た 。 こ れ に 1 0 % S D S 0 . 5 m 1 、 及 び 1 0 m g / m 1 プ ロ テ イ ナ一 ゼ K (和光純薬社製 ) 0 . 2 m 1 を加 え 、 5 0 °C で 2 時 間放置 し た。 次 に こ の 溶液を フ ニ ノ ー ル ク ロ CJ ホ ノレ ム で抽 出 し 、 水相 を と り こ れ を エ タ ノ ー ル沈殿 さ せ た。 沈 殿 し て き た D N A を滅菌 し た ガ ラ ス 棒で巻 き と り 、 こ れ を 7 0 % エ タ ノ ー ルで洗浄 し た後、 減圧乾燥 し た。 最終 的 に 1 . 5 m g の 染色体 D N A が得 ら れ た。

実施例 I 一 1 1 部分 ァ ミ ノ 酸配列 に 基づ く D N A プ ロ

— ブの 作成お よ び P C R 法 に よ る プ ロ ー ブの確認

実施例 I — 9 に よ り 決定 さ れた S u 1 f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由 来新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 部分 ァ ミ ノ 酸配列 の情報 を も と に オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド D N A プ ラ イ マ ー を D N A 合成装置 （ ァ ブ ラ ィ ドバ イ ォ シ ス テ ム ズ社製モ デル 3 8 1 ) に よ っ て作成 し た。 そ の 配列 は下記の通 り で あ つ た DN- アミノ酸配列 N末端 AspGluValPheArgGluSer C末端

DNAプライマー 5' TTCACGAAAAAC CTCATC 3' (配列番号 28) 驢配列 C T TG T T

DN-8

アミノ酸配列 N末端 AspAsnlleGluTyrArgGly C末端

DNAプライマー 5' GATAACATAGAATACAGAGG 3* (配列番号 29) 塩基配列 T T G T G こ の D N A プ ラ イ マ ー を各 々 l O O p m o 1 お よ び実 施例 I — 1 0 で調製 さ れた S u 1 f o 1 o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株の 染色体 D N A

l O O n g を用 い て P C R 法を実施 し た。 P C R 装置 は パ ー キ ン エ ル マ 一社製、 G e n e A m p P C R シ ス テ

ム モ デル 9 6 0 0 を用 い、 1 サ イ ク ルを 9 4 °C で 3 0 秒、 5 0 °C で 1 分お よ び 7 2 °C で 2 分で行 い 、 サ イ ク ル数

3 0 回 お よ び総液量 1 0 0 1 で実施 し た。

得 ら れ た反応液 1 0 μ 1 を 1 % ァ ガ ロ ー ス 電気泳動 に よ り 分析 し た。 そ の 結果約 1 . 2 k b の 長 さ を持つ D N

A 断片が特異的 に 増幅 さ れ た 。

こ の P C R 産物の 末端を平滑化 し 、 P U C 1 1 8 の

H i n c 1 1部位 に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し た。 こ の プ ラ ス ミ ド の揷入断片の D N A 配列 を ア プ ラ イ ド · バ イ オ シ ス テ ム ズ社製、 D N A シ ー ク ェ ン サ Z G E N E S C A N モ デル 3 7 3 A を 用 い て決定 し た。 そ の 結果、 実施例 I - 9 で得 ら れた ァ ミ ノ 酸配列 に 相当 す る D N A 配列が見 い だ さ れ た。

実施例 I — 1 2 S u 1 f 0 1 0 b u s

s o l f a t a 1 c u s K M 1 株 由 来新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ遺伝子の ク ロ ー ニ ン グ

実施例 I — 1 0 で調製 さ れ た S u 1 f 0 1 0 b u s s 0 1 f a t a r i c u s K M 1 株 の 染色体 D N A 1 0 0 μ g を制限酵素 S a u 3 A l で部分消化 し た。 反 応液を ス ク 口 ー ス 密度勾配を 用 い て超遠心で 5 〜 1 0 k b の D N A 断片を 分離精製 し た。 一方、 プ ラ ス ミ ドベ ク タ 一 p U C 1 1 8 を B a m H I で消化 し 、 ア ル 力 リ ホ ス フ ァ タ 一ゼ に よ り 末端 を 脱 リ ン 酸化 し た も の と 、 上記 5 〜 ： L 0 k b の長 さ を 持つ S u 1 f o 1 0 b u s s o 1 f a t a r i c u s K M 1 株 の 染色体 D N A 断 片を T 4 D N A リ ガー ゼ に よ り 連結 （ ラ ィ ゲー シ ョ ン ） し た。 こ の 挿入断片を 含む P U C 1 1 8 プ ラ ス ミ ドべ ク タ ー を 含ん だ混合液を用 い て、 E . c 0 1 i J M 1 0 9 細胞 を形質転換 し た 。 こ れを 5 0 // g / m 1 ア ン ピ シ リ ン を 含む し B 寒天 プ レ ー ト 培地 に 蒔 き コ □ 二一を形 成 さ せ、 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を作成 し た

こ の D N A ラ イ ブ ラ リ ー に お け る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ遺伝子を 含む組換え プ ラ ス ミ ド の ス ク リ ー ニ ン グ は P C R 法 に よ り 以下の よ う に 行 っ た。 ま ず、 コ ロ ニ ー を か き 取 り T E 緩衝液 に懸濁 し た。 こ れを 1 0 0 °C に て 5 分間処理 し 菌体を 破砕 し 、 実施例 I - 1 1 に記載の方法で P C R 法を実施 し た。

次 い で得 ら れ た P C R 反応液 1 0 μ 1 を 1 % ァ ガ ロ ー ス 電気泳動 に よ り 分析 し 、 約 1 . 2 k b の 長 さ を 持つ D N A 断片が増幅 さ れて く る ク ロ ー ン を 陽性 ク ロ ー ン と し た。

そ の 結果、 6 0 0 個 の 形質転換体か ら 1 個 の 陽性 ク ロ ー ン を 得 た。 そ こ か ら 抽 出 さ れた プ ラ ス ミ ドを解析 し た と こ ろ 約 8 k b の 挿入断片を有 し て い た。 こ の プ ラ ス ミ ド を 「 ρ Κ Τ 1 」 と 称 し た。

更 に 挿入断片 を制限酵素 S a u 3 A I で部分消化 し 、 上記の方法 と 同様 に P C R 法を実施 し て、 挿入断片を縮 小ィヒ し た。 そ の 結果約 3 . 8 k b お よ び約 4 . 5 k b の 挿入断片を有す る プ ラ ス ミ ド を保持す る 形質転換体を得 た。 こ れ ら の プ ラ ス ミ ドを そ れぞれ 「 p K T 2 1 」 、 「 ρ Κ Τ 1 1 」 と 称 し た。

こ れ ら の プ ラ ス ミ ド の 挿入断片の制限酵素地図 は 図 2 6 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。

な お、 以上の 実施例で使用 さ れた制 限酵素 と し て は、 全て市販品 （宝酒造株式会社 よ り 購入） を利用 し た。 実施例 I 一 1 3 S u 1 f o 1 o b u s

s o 1 f a a 1 c u s K M 1 株由 来新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ遺伝子の D N A配列 の 決定

実施例 I — 1 2 で得 ら れ た プ ラ ス ミ ド p K T l 1 、 p K T 2 1 中 の 挿入断片 の 共通部分 の D N A塩基配列 を 決定 し た。

ま ず、 こ の プ ラ ス ミ ド D N A を宝酒造社製、 キ ロ シ ー ク エ ン ス 用 デ レ ー シ ョ ン キ ッ ト を用 い て 、 デ レ ー シ ヨ ン プ ラ ス ミ ド を作成 し た。 次 い で こ の プ ラ ス ミ ド の 挿入断 片の D N A配列 を パ一キ ン ェ ル マ ー ジ ャ パ ン社製、 P R I S M , S e q u e n a s e D y e P r i m e r S e q u e n c i n g ャ ッ 卜 、 T a q D y e

D e o x y TM T e r m i n a t o r C y c 1 e S e q u e n c i n g K i t お よ び ア プ ラ イ ド バ ィ ォ シ ス テ ム ズ社製、 D N A シ ー ク ェ ン サノ G E N E S C A N モ デ ル 3 7 3 A を用 い て決定 し た。

共通配列 中 の S p h I - P K T 2 1 の 末端間 (図 2 6 の A , Β 間 ) の 塩基配列 お よ びそ こ か ら 推定 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 は配列番号 1 お よ び 2 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た こ の ア ミ ノ 酸配列 中 に 実施例 I 一 9 で得 ら れた 部分 ァ ミ ノ 酸配列 に相 当 す る 配列が全て認 め ら れ た。 こ の ア ミ ノ 酸配列 は長 さ 力 7 2 8 個 で、 推定分子量 8 2 k D a の タ ン パ ク 質を コ ー ド し て い る も の と 考え ら れた。 こ の 分 子量 は S u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 由来新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼの 精製酵素を S D S — P A G E に か け る こ と に よ っ て得 ら れ た分子量の 値 に ほ ぼ一致 し た。

実施例 I 一 1 4 形質転換体 に お け る 新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ の 発現

実施例 I 一 1 2 で得 ら れ た p K T 2 1 に つ い て S p h I お よ び X b a I で切断 し 、 同酵素で切断 し た p U C l 1 9 (宝酒造社製） に連結 し た も の を p K T 2 2 と し た。 図 2 7 に そ の 手段を示 し た。 P K T 2 2 に挿入 さ れ た新 規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ遺伝子を含む断片中、 マ ル チ ク ロ 一 二 ン グサ イ ト を 除 く 塩基配列 は、 配列番号 1 の塩基番 号 1 〜 2 5 7 8 の 配列 で あ っ た。

こ の プ ラ ス ミ ドを含む形質転換体の新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ活性を 次の よ う に調べた。 ま ず、 形質転換体を 1 0 0 g Z m l の ア ン ピ シ リ ン を含む L B 培地で 3 7 で、 1 晚培養 し た。 遠心分離 に よ り 集菌 し 、 一 8 0 °C に て保存 し た。 菌体の 収率 は 1 0 g Z リ ッ ト ルで あ っ た。

上記の よ う に し て得 ら れた菌体 1 0 g を 5 m Mの E D T A を含む 5 0 m M酢酸 ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 5 . 5 ) 4 0 m 1 に 懸濁 し 、 0 °Cで 3 分間、 超音波破砕処理 に よ り 溶菌 し 、 次 い で遠心分離を行い上清溶液を得た。 こ れ を 7 5 °Cで 3 0 分間熱処理 し 、 再度遠心を行い、 限外濾 過膜 （分子量 カ ツ ト 1 3 0 0 0 ) に て濃縮 し て、 粗酵素 液 （ 6 Uni t/ml ) と し て、 基質で あ る マ ル ト ト リ オ ー ス を最終的 に 1 0 % と な る よ う に加 え た。 p H 5 . 5 ( 5 0 m M 酢酸ナ ト リ ウ ム ） で 、 6 0 °C で 2 4 時間反 応 さ せ た 後、 1 0 0 °C で 5 分間加熱処理 し て反応を停止 さ せ た。 生成 し た ダ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を 実施例 I 一 1 に お け る の と 同様の H P L C 分析法 に よ り 測定 し た。

H P L C 分析の 結果 は 図 2 8 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た 主反応物 は H P L C チ ヤ 一 ト 上で は ァ ノ マ ー の な い一本 の ピ ー ク と し て、 未反応基質 よ り や や遅れて現れ た。 ま た 、 こ の 主生成物を TSK- ge l am i d e- 80 HPLC c o l umnに て 分取 し 、 1 H — N M R 、 U C — N M R に よ り 解析の結果 グノレ コ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス であ る こ と を確認 し た。

こ の 結果、 形質転換体 は S u 1 f o 1 o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株由来の 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ活性を有す る こ と がわ か っ た。 ま た J M 1 ひ 9 に p U C 1 1 9 の み を入れ た形質転換体か ら は新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ活性 は検出 さ れな か っ た。

実施例 1 — 1 5 S u l f o l o b u _s _

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来の 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼの 部分 ア ミ ノ 酸配列 の 決定

実施例 I 一 4 で得 ら れ た新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの部 分ァ ミ ノ 酸配列の決定 は 実施例 I 一 9 に記載 さ れ る 方法 に 従 っ て行 っ た。 以下 に 決定 さ れ た部分ア ミ ノ 酸配列を 示す。 Achromobacter protease—消化ぺプチドフラグメント

AP-6 ： Arg Asn Pro Glu Ala Tyr Thr Lys (配列 I番号 30)

AP-8 ： Asp His Vai Phe Gin Glu Ser His Ser (配列 I番号 31)

AP- 10 ： lie Thr Leu Asn Ala Thr Ser Thr (配列 1番号32)

AP- 12 : lie He lie Val Glu Lys 翻 1番号33)

AP- 13 ： Leu Gin Gin Tyr Met Pro Ala Val Tyr Ala Lys (配列 1番号34)

AP- 14 ： Asn Met Leu Glu Ser (配列 I番号 35)

AP - 16 ： Lys He Ser Pro Asp Gin Phe His Val Phe Asn Gin Lys (：配列 1番号36)

AP- 18 ： Gin Leu Ala Glu Asp Phe Leu Lys (配列 1番号37)

AP— 19 ： Lys He Leu Gly Phe Gin Glu Glu Leu Lys 翻 1番号38)

AP-20 : lie Ser Val Leu Ser Glu Phe Pro Glu Glu (配列 1番号39)

AP— 23 ： Leu Lys Leu Glu Glu Gly Ala lie Tyr (配列 I番号 40)

AP-28 ： Glu Val Gin lie Asn Glu Leu Pro (配列 I番号 41)

Asp-N 消化べプチドフラグメント

DN-1 ： Asp His Ser Arg He (配列番号 42)

DN-5 ： Asp Leu Arg Tyr Tyr Lys (配列番号 43)

DN-6 ： Asp Val Tyr Arg Thr Tyr Ala Asn Gin lie Val Lys Glu (； （配列番号44) 実施例 I 一 1 6 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来 の 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ の ク ロ ー ニ ン グ

S u 1 f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 の 染色体 D N A は実施例 I 一 4 の方法 に 従 っ て得 た菌体 よ り 実施例 I 一 1 0 の 方法 に 従 っ て得 た。 上記染色体 D N A を S a u 3 A I で部分消化 し た後、 E M B L 3 B a m H I 切断 ア ー ム （ S T R A T A G E N E 社製） に 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り 連結 （ ラ イ ゲ ー シ ヨ ン ） し た ッ ケ ー ジ ン グ は S T R A T A G E N E 社製

G i g a p a c k l l G o l d を用 い て行 っ た。 上記 ラ イ ブ ラ リ ー を大腸菌 L E 3 9 2 に 3 7 °C 1 5 分間感染 さ せ た後、 N Z Y寒天 プ レ ー ト 培地 に 播種 し 、 3 7 て で 約 8 か ら 1 2 時間程度培養 し て、 プ ラ ー ク を形成 さ せ た 約 2 時間、 4 °Cで保存 し た後、 ナ イ ロ ン メ ン ブ レ ン （ ァ マ シ ャ ム社製， H y b o n d N + ) へ D N A を 吸着 さ せ た。 2 x S S P E で軽 く 洗浄 し た後、 8 0 °Cで 2 時間 ベ ー キ ン グを行 っ た。 プ ロ ー ブ は実施例 I 一 1 4 で得 ら れた P K T 2 2 の E c o R I — X b a I 断片 （配列番号 1 の 8 2 4 番 よ り 2 5 7 8 番へ対応す る ） を用 い、 ア マ シ ャ ム 社製 メ ガ プ ラ イ ム D N A標識 シ ス テ ム を用 い て ³² P で標識 し た。

イ ブ リ ダ イ セ ー シ ョ ン の 条件 は 6 X S S P E

0 . 5 % S D S で 6 0 °Cオ ナ イ 卜 で お こ な っ た。 洗浄 は 2 x S S P E 0 . 5 % S D S で、 室温 1 0 分、 2 回行 っ た。

約 5 0 0 0 ク ロ ー ン か ら ス ク リ ー ニ ン グ を 開始 し て 8 個の陽性 ク ロ ー ン を得 た。 こ の ク ロ ー ン よ り 約 7 . 6 k b p の B a m H I 断片を得て、 こ れを p U C 1 1 8 の上 記サ イ ト へ揮入 し た。 こ の プ ラ ス ミ ド を 「 p 0 9 T 3 」 と 称す る 。 さ ら に上記 ク ロ ー ン の 挿入断片 を S a u 3 A I で部分消化 し 、 得 ら れ た約 6 . 7 k b p の 断片 を p U C 1 1 8 の B a m H I サ イ 卜 へ挿入 し た。 こ の プ ラ ス ミ ド を 「 p 0 9 T 2 」 と 称す る 。 こ の プ ラ ス ミ ド よ り 約 3 . 8 k b p の X b a l 断片 に つ い て p U C 1 1 8 の上 記サ イ ト へ挿入 し た。 こ の プ ラ ス ミ ド を 「 ρ 0 9 Τ 1 」 と 称す る 。 こ の プ ラ ス ミ ド の 挿入断片 の 制限酵素地図を 図 2 9 に 示す。 ま た そ の 作成方法を 図 3 0 に 示す。 上記 Ρ 0 9 T 1 に つ い て新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを コ 一 ド し て い る 領域を 中心 に実施例 I 一 1 3 の 方法 に従 っ て塩基 配列 の 決定を行 っ た。 決定 さ れ た塩基配列 お よ び そ こ さ ら 推定 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 は配列番号 3 お よ び 4 に示 さ れ る 通 り で あ る 。 こ の ア ミ ノ 酸配列 中 に実施例 I 一 1 5 で得 ら れた部分 ァ ミ ノ 酸配列 に相当 す る 配列が全て認め ら れた。 こ の ア ミ ノ 酸配列 は長 さ が 6 8 0 個で、 推定分 子量 8 0 . l k D a の タ ン パ ク 質を コ ー ド し て い る も の と 考え ら れた。 こ の 分子量 は S u 1 f o 1 o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株由 来新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ の精製酵素を S D S — P A G E に か け る こ と に よ っ て得 ら れ た分子量の値 に ほ ぼ一致 し た。 ま た プ ラ ス ミ ド P 0 9 T 1 を含む形質転換 体 に つ い て実施例 I 一 1 4 の方法に 従 っ て新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ活性を確認 し た。

実施例 1 — 1 7 S u 1 f o 1 0 b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株由来の新規 ト ラ ン ス フ エ ー ゼ遺伝子 と 他の 生物種の 染色体 D N A と の ハ ィ ブ リ ダィ ゼ ー シ ョ ン 試験

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株、 S u l f o l o b u s

s h i b a t a e D S M 5 3 8 9 株、 E . c o l i J M 1 0 9 株の 染色体 D N A を実施例 I — 1 0 に 準 じ た 方法で得て、 こ れを制限酵素 P s t I お よ び E c 0 R I で消化 し た。

こ の 消化物を 1 % ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動 に て分離 し ア マ シ ャ ム ジ ヤ ノ、。 ン社製、 H y b o n d — N に サザ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ し た 。 こ の メ ン ブ レ ン に実施例 I — 1 2 で 得 ら れた P K T 2 1 の 約 2 . 6 k b p の S p h l 、

X b a I 断片 （配列番号 1 に 示 さ れ る 配列 に 対応、 図 2 6 に お け る A 〜 B 間の 範囲 に対応） を、 ベ ー リ ン ガ 一マ ン ハ イ ム 社製、 D I G シ ス テ ム キ ッ ト に よ っ て標識 し 、 こ れ を 用 い て ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ョ ン を 行 っ た 。

条件 は ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン ： 5 X S S C 、 4 0 °C 2 時間、 洗浄 ： 2 x S S C ( 0 . 1 % S D S を含む） 、 4 0 °C、 5 分、 2 回 0 . l x S S C ( 0 . 1 % S D S を含む） 、 4 0 °C、 5 分、 2 回で あ っ た。

そ の結果、 S iD h I 、 X b a l 断片 は 、 S u l f o l o b u s s o 1 f a t a r 1 c u s D S M 5 8 3 3 株 に つ い て は 約 5 . 9 k b p の 断片 と S u l f o l o b u s s h i b a t a e D S M 5 3 8 9 株 に つ い て は 約 5 . 0 k b p お よ び 約 0 . 8 k b p の 断片 と そ れ ぞ れハ イ ブ リ ツ ド を 形成 し た 。 一方 ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ノレ で あ る E . c 0 1 i J M 1 0 9 株 に つ い て は 、 ハ イ プ リ ッ ド の 形成 は観察 さ れ な か つ た 。

さ り に S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 D S M 5 3 5 4 株、 D S M 5 8 3 3 株、 A T C C 3 5 0 9 1 株， A T C C 3 5 0 9 2 株、 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 A T C C 4 9 4 2 6 株、 S u l f o l o b u s

s h i b a t a e D S M 5 3 8 9 株、

A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株 E . c o l i J M 1 0 9 株 の 染色体 D N A を 実施例 I 一 1 0 方法 に 準 じ て得、 制 限酵素 H i n d I I I 、 X b a I 、 E c o R V で 消化 し た 。

こ の 消化物 を 1 % ァ ガ ロ ー ス ゲ ル電気泳動 に て 分離 し ア マ シ ャ ム ジ ヤ ノ、⁰ ン 社、 H y b o n d — N + に ブ ロ ッ テ ィ ン グ し た 。 こ の メ ン ブ レ ン に 配列番号 1 の 1 8 8 0 番 よ り 2 2 5 7 番 の 領域 （ 3 7 8 b p ) を P C R に て増幅 し 、 実施例 I — 1 6 の 方法 に 従 っ て 32 で標識 し 、 こ れ を 用 い て ハ イ プ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 行 っ た 。

条件 は ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン ： 6 X S S P E 、 0 . 5 % S D S で 6 0 。C、 オ ー バ ー ナ イ ト で 、 洗浄 ： 2 x S S P E 、 0 . 1 % S D S で室温、 1 0 分、 2 回行 つ た 。

そ の 結果、 S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 D S M 5 3 5 4 株、 D S M 5 8 3 3 株、 A T C C 3 5 0 9 1 株， A T C C 3 5 0 9 2 株、 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 A T C C 4 9 4 2 6 株、 S u 1 f o 1 o b u s

s h i b a t a e D S M 5 3 8 9 株、

A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株 に つ い て 、 そ れ ぞ れ約 4 . 4 k b p 、 3 . 7 k b p 、 3 . 7 k b p 、 0 . 8 k b p 、 3 . 9 k b p 、 0 . 8 k b p 、 0 . 8 k b p 、 4 . 4 k b p 、 2 . I k b p の 部位でハ イ ブ リ ツ ド を 形成す る こ と が判 明 し た 。 —方 J M 1 0 9 の ゲ ノ ム D N A に つ い て は 結合が観察 さ れ な カヽ つ た 。

ま た 配列番号 1 、 2 、 3 お よ び 4 の 範囲 に 含 ま れ る ァ ミ ノ 酸配列 、 塩基配列 と 相 同 性 を 有す る 配列 が存在 し な い こ と を 、 ア ミ ノ 酸配列 デ ー タ 一 バ ン ク （ S w i s s p r 0 t 、 及 び N B R F — P D B ) 、 塩基配列 デ ー タ ー バ ン ク （ E M B L ) 力、 ら 、 配列解析 ソ フ ト ジ ヱ ネ テ ィ ッ ク ス （ ソ フ ト ウ ェ ア ー 開発） を 用 い て確認 し た。 よ つ て こ の新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ遺伝子 は

S u 1 f 0 1 0 b a 1 e s 目 に 属す る 古細菌 に特異的 に 高度 に保存 さ れて い る こ と がわ か つ た 。

実施例 I 一 1 8 S— u 1 f 0 1 0 b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 お よ び

S u 1 f o 1 o b u s

a c i d o c a l d a r i u s u A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来の新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 塩基配列、 ア ミ ノ 酸 配列 の比較

配列番号 2 の K M 1 株 由 来の新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ の ア ミ ノ 酸配列 と 配列番号 4 の A 丁 C C 3 3 9 0 9 株由 来の 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ の ア ミ ノ 酸配列 と を、 ま た配列 番号 1 の K M 1 株由来の新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの塩基 配列 と 配列番号 3 の A T C C 3 3 9 0 9 株由来の 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼの塩基配列 と を配列解析 ソ フ ト ， ジ ヱ ネ テ ィ ッ ク ス （ ソ フ 卜 ゥ エ ア ー 開発） を用 い て ギ ャ ッ プ を考慮 し た解析を行 っ た o ァ ミ ノ 酸配列 に つ い て の 結果 を 図 3 1 に 、 塩基配列 に つ い て の 結果 を 図 3 2 に 示 し た そ れぞれの 図中上段 に A T C C 3 3 9 0 9 株の配列 を、 下段 に K M 1 株の配列 を示 し 、 中段の ( * ) は両者で一 致す る 配列を、 ま た し ) は両者で性質の 似 た ア ミ ノ 酸 配列 で あ る こ と を示す。 相 同性 は ア ミ ノ 酸配列 レ ベ ル で 4 9 %、 塩基配列 レ べ ノレで 5 7 % で あ つ た。 実施例 I 一 1 9 形質転換体 由 来組換え新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを 用 い た マ リレ ト オ リ ゴ糖混合物か ら の ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖の 製造

可溶性デ ン プ ン （ ナ カ ラ イ テ ス ク 社製、 特級品） の a — ア ミ ラ ー ゼ分解物で あ つ て ョ ゥ 素デ ン プ ン 反応を示 さ ずオ リ ゴ糖 に ま で分解 さ れ た も の （ α — ア ミ ラ ー ゼ は、 S i gma 社製の A- 0273 ァ ス ペ ル ギ ル ス · ォ リ ゼ由 来の も の を用 い た） を基質 と し た。

実施例 I 一 1 4 で得 た粗酵素液、 お よ び上記基質を用 い て、 実施例 I 一 1 4 の 反応条件 に 従 い グル コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス お よ び各種の マ ル ト オ リ ゴ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造を試み た o 反応液 の 分析 は以下に示す条件の H P L c 分析法 に よ り 行 っ た。

カ ラ ム ： B I OR AD AMI Ν Ε X HP X- 42 A ( 7. 8 x 300 mm ) 溶媒 ： 水

流速 ： 0 . 6 m 1 / m i n

温度 ： 8 5 。C

1¾ UU 55 . 示差屈折計

図 3 3 (A) に H P L C に よ る 分析の 結果 を （B) に 組換 え新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼを添加 し な い場合の H P L C 分析の 結果を示 し た。 そ の 結果、 反応生成物の オ リ ゴ糖 類 は対照の ァ ラ ー ゼの み に よ る 生成物 よ り も 各 々 保持 時間が短か つ た o ま た、 基質マ ル ト ト リ オ ー ス （ G 3 ) マ ゾレ ト テ ト ラ ォ ー ス （ G 4 ) お よ び マ ゾレ ト ペ ン 夕 オ ー ス ( G 5 ) ( い ずれ も 林原バ イ オ ケ ミ カ ル社製） か ら の主 生成物で あ る 3 糖、 4 糖 お よ び 5 糖を TSK-g e l a m i d e - 80

H P L C c o l umnに て分取 し 、 1 H — N M R 、 13 C - N M R に よ り 解析を行 っ た。 そ の 結果、 い ずれ も 還元末端の グ ル コ ー ス残基 1 個が α - 1 α - l で結合 し た構造を示 し 、 そ れぞれ グノレ コ シ ノレ ト レ ロ ー ス （ - D - マ ル ト シ ル な - D - グノレ コ ピ ラ ノ シ ド ） 、 マ ノレ ト シ ノレ ト レ ロ ー ス （ α - D - マ ノレ ト ト リ オ シ ル な - D - ダ ル コ ピ ラ ノ シ ド ） お よ び マ ノレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ロ ー ス （ α - D - マ ル ト テ ト ラ オ シ ノレ a - D - ダル コ ピ ラ ノ シ ド） で あ る こ と が確認 さ れ た 。

実施例 I — 2 0 形質転換体由来組換え新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ を 用 い た グ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス お よ び マ ノレ ト ォ リ ゴ シ ゾレ ト レ ノヽ ロ ー ス の製造

基質を 1 0 O m Mの マ ル ト ト リ オ ー ス （ G 3 ) 〜 マ ル ト ヘ プ 夕 オ ー ス （ G 7 ) ( い ずれ も 林原 ノ ィ ォ ケ ミ カ ル 社製） と し 、 実施例 I 一 1 4 で得 ら れ た粗酵素液を凍結 乾燥 し た後、 5 O m M酢酸ナ ト リ ウ ム 溶液 （ p H 5 . 5 ) に 懸濁 し 、 濃縮酵素 と し た。 こ の 濃縮酵素 1 2 . 7 Un i t /m l (マ ル ト ト リ オ ー ス を基質 と し て作用 さ せ た と き の 酵素活性） を そ れぞれの 基質 に作用 さ せ、 対応す る α - 1 , α - l 転移体を生成 さ せ た。 各生成物の 分析法 は実 施例 I 一 1 の方法 に従 っ て行 い、 そ の 収率お よ び酵素活 性を調べた。 結果 は第 3 8 表 に示 さ れ る 通 り であ っ た。 88 — な お、 第 3 8 表中で の 酵素活性 は、 マ ル ト オ リ ゴ糖を 1 時間 に 1 m o l の 対応す る - 1 転移体 に変 換す る 酵素活性を 1 Un i tと し て示 し た。 第 38 表 酵素活性 収 率

(Uni t/ml)

マルトトリオース （G3) 12. 7 40. 8 マルトテトラオース （G4) 72. 5 69. 8 マルトペン夕オース （G5) 03. 5 65. 3 マルトへキサオース （G6) 87. 3 66. 5 マルトヘプ夕オース （G7) 60. 2 67. 9

実施例 1 1 5 S u 1 f o l o b u s

s o 1 f a a 1 c u s K M 1 株 由来の 新規 ア ミ ラ ー ゼの 部分 ァ ミ ノ 酸配列 の 決定

実施例 I 1一 2 で得 ら れ た精製酵素の 部分 ァ ミ ノ 酸配列 の 決定 は岩松 ら （生化学 6 3 、 1 3 9 ( 1 9 9 1 ) ) の方法 に よ り 、 ま た N 末端 ァ ミ ノ 酸配列 の 決定 は

M a t s u d a i r a T ( J . B i o l . C h e m. 262, 10035 - 10038 (1987) ) の 方法 に よ り 行 っ た

ま ず精製 さ れた新規 ァ ミ ラ ー で を 、 泳動用 緩衝液 ( 1 0 % グ リ セ ロ ー ル 、 2 . 5 % S D S 、 2 % 2 — メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ノレ、 6 2 m M ト リ ス塩酸緩衝液 （ Ρ Η

6 . 8 ) ) に 懸濁 し 、 S D S ポ リ 了 ク リ ル ア ミ ド電気泳 動 に供 し た。 泳動後、 当該酵素 ヮ ル よ り ポ リ ビ ニ リ デ ン ジ フ ロ リ ド （ P V D F ) 膜 （ P r 0 B 1 0 t 、 ァ ブ ラ ィ ドノ < ィ ォ シ ス テ ム ズ社製 ) に、 1 6 0 m A で 1 時間ェ レ ク ト ロ ブ ロ ッ テ ィ ン グ （ザル ト ブ π ッ 卜 1 I s 型、 ザ ル ト リ ウ ス 社製） す る こ と に よ り 転写を行 つ ナ： 。

転写 し た後、 当該酵素の転写 さ れ た部分の 膜を切 り と り 、 約 3 0 0 1 還兀用 緩衝液 （ 6 M グ ァ 二 ジ ン 塩酸、 0 . 5 M ト リ ス 塩酸緩衝液 ( H 3 . 5 ) 、 0 . 3 % E D T A、 2 %ァ セ ト 二 ト リ ル） に 浸 し 、 こ れ に 1 m g の ジ チ オ ス レ ィ ト ー ルを加え 、 ア ル ゴ ン 下で 6 0 °C Z約 1 時間の還元を行 つ 7 o れ に 2 . 4 m g モ ノ ョ ー ド酢 酸を 0 . 5 N水酸化ナ ト リ ゥ ム 液 1 0 β 1 に 溶か し た も の を加え、 遮光下で 2 0 分間攪拌 し た。 P V D F 膜を取 り 出 し 、 2 % ァ セ ト ニ ト リ ル で十分洗浄 し た後、 0 . 1 % S D S 中で 5 分間攪拌 し た 。 次 い で、 P V D F 膜を水 で軽 く 洗浄 し た後、 0 . 5 % ポ リ ビニ ル ピ ロ リ ド ン

- 4 0 を含む 1 0 O m M酢酸 に 浸 し 3 0 分間放置 し た。 こ の 後 P V D F 膜を水で軽 く 洗浄 し 、 約 l m m四方 に切 断 し た。 N末端 ア ミ ノ 酸配列 に つ い て は こ の 切断 し た膜 を 直接気相 シ ー ク ェ ン サ 一 で分析 し た。 部分 ア ミ ノ 酸配 列 に つ い て は こ の 切断 し た 膜を 消化用 緩衝液 （ 8 % ァ セ ト ニ ト リ ル、 9 0 m M ト リ ス 塩酸緩衝液 （ p H 9 . 0 ) ) に ^: し 、 A c h r o m o b a c t e r

P r o t e a s e I (和光純薬工業社製） を

1 p m o 1 加え、 室温で 1 5 時間か け て消化 し た。 こ の 消化物を C 8 カ ラ ム （ 日 本 ミ リ ポ ア リ ミ テ ツ ド社製、 z - B o n d a s h e r e 5 C 8 3 0 0 A 2 . 1 X 1 5 0 m m ) を用 い た逆相 H P L C に よ り 分離 し 、 1 0 数種の ぺ プ チ ド断片 を得 た。 ぺ プ チ ドの 溶出溶媒 と し て は、 A溶媒 （ 0 . 0 5 % ト リ フ ルォ ロ 齚酸） お よ び B 溶媒 （ 0 . 0 2 % ト リ フ ルォ ロ 酢酸 を 含む 2 — プ ノ ー ル Zァ セ ト ニ ト リ ゾレ 7 ： 3 ) を 用 い、 溶出 は B 溶 媒 に 関 し 2 5 0 %の 直線濃度勾配で 0 . 2 5 m l //分 の 流速で 4 0 分間溶出 さ せ る こ と に よ り 行 っ た。 得 ら れ た べ プチ ド断片 に つ い て の ァ ミ ノ 酸配列 の 決定 は 、 気相 ペ プ チ ド シ ー ケ ン サ ー （ ア プ ラ イ ィ ォ シ ス テ ム ズ社 91 - 製、 モ デル 4 7 0 型） を用 い た 自 動エ ド マ ン 分解法 に よ り 行 っ た。

決定 さ れ た N 末端 ァ ミ ノ 酸配列 お よ び部分 ァ ミ ノ 酸配 列 は下記の 通 り で あ っ た。

N末端アミノ酸配列

Thr Phe Ala Tyr Lys lie Asp Gly Asn Glu (配列番号 45) 部分アミノ配列

P-6 ： Leu Gly Pro Tyr Piie Ser Gin (配列番号 46) P- 7 ： Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly (配列番号 47) P— 10 ： Tyr Asn Arg He Val lie Ala Glu Ser Asp Leu (配列番号 48)

Asn Asp Pro Arg Val Val Asn Pro

実施例 I I— 1 6 S u l f o l o b u s

s 0 1 f a a i c u s K M 1 株染色体 D N A の調

S u l f o l o b u s s o l f a t a r 1 c u s

K M 1 株を、 2 g Z リ ッ ト ル の可溶性デ ン プ ン お よ び 2 g / リ ッ ト ル の酵母エ キ ス を含む A m e c a n

T y p e C u l t u r e C o i l e c t 1 0 n

( A T C C ) 発行 C a t a l o g u e o f

B a c t e r i a a n d P h a g e s 1 8 版，

1 9 9 2 に記載の 培地番号 1 3 0 4 の 培地で、 7 5 °C で 3 日 間培養 し た。 遠心分離 に よ り 集菌 し 、 一 8 0 °C に て 保存 し た。 菌体の 収率 は 3 . 3 g Z リ ツ ト ルで あ っ た。

こ の 菌体 l g に 2 5 % ス ク ロ ー ス 、 1 m g / m 1 リ ゾ チ ー ム 、 I m M E D T A お よ び 1 5 0 m M N a C 1 を含 む 5 O m Mの ト リ ス 塩酸緩衝液 （ P H 8 . 0 ) 1 0 m 1 を加 え て懸濁 し 、 室温 に て 3 0 分間放置 し プし れ に 1 0 % S D S 0 . 5 m l お よ び 1 0 m g Z m 1 プ ロ テ ィ ナ ー ゼ K (和光純薬工業社製） 0 . 2 m 1 を加え、 3 7 °Cで 2 時間放置 し た。 次 に こ の 溶液を フ エ ノ ー ル ク ロ ロ ホ ノレ ム で抽 出 し 、 ェ タ ノ ー ル沈澱 さ せ た。 沈濺 し た D N A を滅菌 し た ガ ラ ス 棒で巻 き と り 、 こ れ を 7 0 % ェ 夕 ノ ー ルで洗浄 し た後、 減圧乾燥 し た。 最終 的 に 1 . 5 m g の 染色体 D N A が得 ら れ た。

実施例 11一 1 7 S u l f 0 1 0 b u s

s o 1 f a a 1 c u s K M 1 株 由来新規 ア ミ ラ ー ゼ遺伝子の 活性染色法 に よ る 発現 ク ロ ー ニ ン グ

実施例 11一 1 6 で調製 さ れ た S u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 の 染色体 D N A 1 0 0 /z g を制限酵素 S a u 3 A I で部分消化 し た 。 反 応液を シ ョ 糖密度勾配遠心分離法を 用 い て分画 し、 5 〜 1 0 k b の D N A 断片を分離精製 し た。 一方 ブ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー P U C 1 1 8 (宝酒造社製） を B a m H I で消 化 し 、 ァ ノレ カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ に よ り 末端を脱 リ ン 酸化 し 精製 し た も の と 、 上記 5 〜 1 0 k b の 染色体 D N A 断 片を T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り 連結 （ ラ ィ ゲ ー シ ョ ン ） し た。 こ の 挿入断片を含ん だ p U C 1 1 8 プ ラ ス ミ ド ベ ク タ 一を含ん だ混合液を用 い て、 大腸菌 J M 1 0 9 細胞 (宝酒造社 ) を形質転換 し た。 こ れを 5 0 g / m l ア ン ピ シ リ ン を含む L B 寒天 プ レ ー ト 培地 に 播種 し コ ロ 二 — を形成記かののさし o せ て、 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を作成 し た。

S u 1 f 0 l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株由来新規ァ ミ ラ ー ゼ遺伝子を 含む組換え プ ラ ス ミ ド を有す る 形質転換体の ス ク リ 一二 ン グ は活性染色法 に よ り 行 つ た

ま ず 、 得 れた形質転換体を 濾紙 に レ プ リ カ し 、 L B 寒天培地上 に て H CT 二一を形成 さ せ、 こ の 濾紙を 1 m g Z m 1 リ ゾチ ー ム （生化学工業社製） 、 1 m M E D T A を含む 5 0 m M ト リ ス 塩酸緩衝液 （ P H 7 . 5 ) 溶液 に浸 し 3 0 分間放置 し た。 次 い で 1 % T r i t 0 η - X

1 0 0 溶液 に 3 0 分間浸 し て、 溶菌 さ せ、 6 0 。Cで ί 時 間熱処理 し て、 宿主 由来の酵素を失活 さ せ た。 こ の処理 した 濾紙を 0 . 2 %可溶性デ ン プ ン を 含む寒天プ レ ー ト に の せ て 6 0 °C に て一晚反応を行 っ た。 反応 さ せ た プ レ ー ト を 3 ゥ の 蒸気下 に 置 い て デ ン プ ン を発色 さ せ、 ハ 口 一を形成 た コ ロ ニ一を陽性 ク ロ ー ン と し た。 そ の結 果、 6 0 0 個 の 形質転換体か ら 5 個 の 陽性 ク ロ ー ン を た。 そ こ ら プ ラ ス ミ ド を抽 出 し た と こ ろ 最 も 入断 片の短 い も は約 4 . 3 k b の 挿入断片を有 し て い た。

そ こ で こ 揷八断片を更 に制限酵素 B a m H I で消化 し 、 更 に上 の方法 と 同様 に し て、 挿入断片を縮小化 し た。 そ の 結 3 . 5 k b の挿入断片を有す る ブ ラ ス ミ ド を保持す る 形質転換体を得 た。 こ の プ ラ ス ミ ドを 「 p K A 1 」 と 称 し た。

こ の プ ラ ス ミ ドの 挿入断片の 制限酵素地図 は 図 3 4 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。

実施例 11— 1 8 S u l f o l o b u s

_s 0 1 f _a t a r i_ c u s_ K M 1 株 由 来新規ァ ミ ラ ー ゼ遺伝子の D N A配列 の決定

実施例 11— 1 7 で得 ら れ た プ ラ ス ミ ド p K A l 中 の 挿 入断片 の (後記す る P K A 2 に対応す る 領域 の ） D N A 塩基配列 を決定 し た。

ま ず、 こ の プ ラ ス ミ ド D N A を宝酒造社製、 キ ロ シ ー ク エ ン ス 用 テ レ ー シ ョ ン キ ッ ト を 用 い て 、 デ レ ー シ ヨ ン プ ラ ス ミ ド を作成 し た。 次 い で こ の プ ラ ス ミ ド の 挿入断 片 の D N A配列を パ 一 キ ン ェ ル マ ー ジ ャ パ ン 社製、 P R I S M , S e q u e n a s e D y e P r i m e r S e q u e n c i n g ャ ッ 卜 ヽ T a q

D y e D e o x y T T e r m i n a t o r

C y c 1 e S e q u e n c i n g k i t お よ び ァ プ ラ イ ド ノ ィ ォ シ ス テ ム ズ社製、 D N A シ ー ク ェ ン サ / G E N E S C A N モ デ ル 3 7 3 A を 用 い て決定 し た 塩基 il列 お よ び そ れ力、 ら 推定 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 は配 列番号 5 お よ び 6 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た 。

こ の ァ ミ ノ 酸配列 中 に実施例 11一 1 5 で得 ら れ た部分 ア ミ ノ 酸配列全て が認め ら れた。 こ の ア ミ ノ 酸配列 は長 さ が 5 5 8 個で、 推定分子量 6 4 . 4 k D a の タ ン パ ク 質を コ ー ド し て い る も の と 考え ら れ た。 こ の分子量 は S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株由来 ア ミ ラ ー ゼ の精製酵素の S D S — P A G E に よ る 分子量の 測定値 6 1 . 0 k D a に ほ ぼ一致 し た。 実施例 11一 1 9 形質転換体 に お け る 組換え新規 ァ ミ ラ ー ゼ の 発現

実施例 1 1一 1 7 で得 ら れた p K A 1 に つ い て制限酵素 P s t I で部分消ィ匕 し た も の を p K A 2 と し た。 図 3 5 は そ の制限酵素地図を示 し た も の で あ る 。 p K A 2 を含 む形質転換体の活性 は次の よ う に し て調べた。 ま ず上記 形質転換体を 1 0 0 μ g / m 1 の ア ン ピ シ リ ン を含む L B 培地で 3 7 °C で一晚培養 し た。 遠心分離に よ り 集菌 し た菌体を l g あ た り 4 m l の p H 5 . 5 ( 5 0 m M酢酸 ナ ト リ ウ ム緩衝液） へ懸濁 し 、 超音波破砕処理お よ び遠 心分離を行な い、 そ の上清を 7 0 °C で 1 時間熱処理 し 、 宿主の ア ミ ラ ー ゼを失活 さ せ た。 遠心分離に よ り 沈澱物 を 除去 し 、 限外濾過膜 （分子量 カ ッ ト 1 3 ， 0 0 0 ) で 濃縮 し た も の を粗酵素液 と し て、 以下の 実験 に用 い た。 ( 1 ) 基質特異性

前記粗酵素液 3 5 . 2 ϋ n i t s /m 1 ( こ こ で 1 ϋ n i t と は、 マ ル ト ト リ オ シ ノレ 卜 レ ハ ロ ー ス を基質 と し て作用 さ せ た と き の酵素活性で、 反応条件 は実施例 I 1一 1 に 従 い、 1 時間 に マ ノレ ト ト リ オ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス か ら α , a - ト レ ノヽ ロ ー ス を 1 μ 0 1 生成す る 活性 と し て定義 し た） を 以下の 第 3 9 表 に 示す 1 0 m M の基質 （ ァ ミ 口 ぺ ク チ ン 可溶性デ ン プ ン に つ い て は 3 . 0 % ) に 作用 さ せ、 分解 性及 び分解生成物の 分析を 行 つ た 。 各種 マ ル ト オ リ ゴ糖 ァ ミ 口 ー ス D P - 1 7 、 ア ミ 口 ぺ ク チ ン 、 可溶性デ ン プ ン 、 各種イ ソ マ ル ト オ リ ゴ糖、 及 びパ ノ ー ス に つ い て は 単糖 + 2 糖の 生成活性を 指標 と し て、 ま た、 各種 ト レ ハ ロ ー ス 才 リ ゴ糖、 ァ ミ ロ ー ス D P - 1 7 a - 1 , α — 1 転移体 ( ァ ミ ロ ー ス D P - 1 7 の 還元末端側 の 、 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ ー ス残基間の結合が α - 1 , α - 1 で あ る ォ リ ゴ糖 ) に つ い て は な ， α — ト レ ノヽ ロ ー ス の生成 活性を指標 と し て、 マ ル ト ー ス及 び α , a — ト レ ノヽ ロ ー ス に つ い て は グ ル コ ー ス の 生成活性を 指標 と し て実施例 に 示 し た T S K - g e l A m i d e - 8 0 H P L C に よ る 分析法で 分析を行 っ た

な お、 表中 で の 酵素活性 は、 各 々 単糖及 び 2 糖を 1 時 間 に 1 m 0 1 遊離す る 酵素活性を 1 U n i tと し て示 し た ロ は以下の 第 3 9 表 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た 。

97

第 39表 賊オリゴ糖 単糖 + 2糖生成速度

(Uni ts/ml) マルトース （G2) グルコース 0. 15 マルトトリオース （G3) グルコース +G2 0. 27 マルトテトラオース （G4) グルコース +G2+G3 0. 26 マルトペン夕オース （G5) グルコース +G2+G3+G4 2. 12 ァミロース DP-Π グルコース +G2 2. 45 ァミロぺクチン グルコース +G2 0. 20 可溶性デンプン グルコース +G2 0. 35 a, α— トレノヽロース 分解せず 0 グルコシルトレハロース グルコース + トレハロース 0. 01 マルトシルトレハロース G2+ トレハロース 4. 52 マルトトリオシルトレハロース G3+ トレハロース 35. 21 アミロース DP-Πα-Ι, α_1転移体 トレノヽロース 4. 92 イソマルトース 分解せず 0 イソマルトトリオース 分解せず 0 イソマルトテトラオース 分解せず 0 ィソマルトペン夕オース 分解せず 0 パノース 分解せず 0 98 — マ ル 卜 卜 リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス か ら の 反応生成物 の 実 施例 1 1— 1 の 条件 に 従 っ て 行 っ た TSK- g e l Am i d e-80 HPL C に よ る 分析結果 は 図 3 6 ( A ) に 示 さ れ る 通 り で あ つ た 。 ま た 、 可溶性 デ ン プ ン か ら の 反応生成物 を 、 以下 の 条件 で行 っ た A M 1 N E X H P X - 42 A H P L C に よ る 分析結果 は 図 3 6 ( B ) に 示 さ れ る 通 り で あ っ た 。

カ ラ ム ： AM 1 NEX HPX-42 A (？. 8 X 300mm )

溶媒 ： 水

流； iS ： 0 . o m l /ffl i n

n. os. ： 8 5 レ

検 出 器 ： 示差屈 折計 以上 の 結果 よ り 、 本酵素 に 関 し て は 還元末端側 の グ ル コ ー ス 残基が な 一 1 , α — 1 結合 し た マ ノレ ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 等 の ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖 に 、 極 め て よ く 作用 し 、 a , α — ト レ ノヽ ロ ー ス と 重合度力く 2 つ 減少 し た 対応す る マ ル ト ォ リ ゴ糖 を 生成す る こ と が確認 さ れ た 。 ま た マ ル ト ー ス （ G 2 ) 〜 マ ノレ ト ペ ン 夕 オ ー ス （ G 5 ) ア ミ ロ ー ス 、 可溶性 デ ン プ ン カ、 ら は 、 主 と し て ダ ル コ 一 ス ま た は マ ル ト ー ス を遊離 す る こ と が確認 さ れ た 。 し か し な が ら な ， α — ト レ ハ ロ ー ス 、 イ ソ マ ル ト ー ス 、 イ ソ マ ゾレ ト ト リ オ ー ス 、 イ ソ マ ル ト テ ト ラ オ ー ス 、 イ ソ マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス 、 お よ びノ、 ° ノ ー ス に 対 し て は い ずれ も 反 じ、 し な か つ た 。 ( 2 ) エ ン ド型 ア ミ ラ ー ゼ活性

前記粗酵素液 1 5 0 Un i t/ml (活性単位 は上記 （ 1 ) と 同様） を可溶性デ ン プ ン に作用 さ せ た。 実施例 11一 1 に 示 し た デ ン プ ン 分解活性測定法 と 同様の 条件で ョ ゥ 素 発色の 消失を測定 し 、 ま た上記 （ 1 ) に 示 し た基質特異 性を決定す る 際の 条件の H P L C 分析法の 条件 に 従 っ て 単糖、 お よ び 2 糖の生成量 を 測定 し た 。 こ れ ら か ら デ ン プ ン 加水分解率を求め た。

そ の経時変化 は 図 3 7 に 示 さ れ る 通 り であ っ た。 図力、 ら 、 ヨ ウ 素反応呈色度が 5 0 %消失 し た 時点での デ ン プ ン の加水分解率 は 4 . 5 % と 低 く 、 従 っ て本粗酵素 は ェ ン ド型 ァ ミ ラ 一 ゼの性質を 示す こ と が確認 さ れた。

( 3 ) 作用機作の 検討

ゥ リ ジ ン ジ ホ ス ホ グ ゾレ コ ー ス [ グ ル コ ー ス - 6 - ³ H ] 、 お よ び マ ル ト テ ト ラ オ ー ス に グ リ コ ー ゲ ン シ ン 夕 ー ゼ

( ゥ サギ骨格筋 由来、 Si gma 社製 G- 2259) を作用 さ せ、 非還元末端の グ ル コ ー ス残基を 。 H で放射能 ラ ベ ル し た マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス を 合成 し 、 こ れを 分取精製 し た。

次 に こ の 放射能 ラ ベ ル し た 1 O m Mの マ ル ト ペ ン タ ォ 一 ス を基質 と し 、 前記実施例 I — 2 0 で得 ら れ た組換え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ （ 1 0 Un i t/ml ： 活性単位 は実 施例 I — 1 に 従 っ た） を添加 し 、 6 0 °C、 3 時間作用 さ せ、 非還元末端の グル コ ー ス残基を ³ H で放射能 ラ ベ ル し た マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を 合成 し 、 こ れを分 取精製 し た 。 な お、 こ の 生成物 に ダ ル コ ア ミ ラ ー ゼ

( R h i z 0 p u s由 来、 生化学工業社製） を 作用 さ せ、 ダ ル コ ー ス と ， α — ト レ ハ ロ ー ス に 完全 に 分解 し た 。 こ れ ら を 薄相 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に て 分取 し そ れ ぞ れ液体 シ ン チ レ ー シ ヨ ン カ ウ ン 夕 一 で放射能 を 測定 し た と こ ろ 、 α - ト レ ハ ロ ー ス 画 分 に 放射活性 は 見 ら れず、 グ ル コ 一 ス 画分 に 放射活性 が 回 収 さ れ、 非還元末端 の グ ル コ ー ス 残基が放射能 ラ ベ ル さ れ て い る 事 を 確認 し た 。

以上 の よ う に 調製 し た 、 非還元末端 の グ ル コ ー ス 残基 力く ^ύ Η で放射能 ラ ベ ル さ れ た マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス 、 お よ び非還元末端 の グ ル コ ー ス 残基が ¹³ Η で放射能 ラ ベ ル さ れ た マ ノレ 卜 ト リ オ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス を 基質 と し て 、 こ れ に 上記粗酵素液 を そ れ ぞ れ 3 0 Un i t s/m l 及 び 1 0 Un i t s/m l作用 さ せ た 。 反応前、 お よ び 6 0 °C 、 3 時 間後 に 反応物 を サ ン プ リ ン グ し た。 こ の 反 応物 を 薄相 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ K i e s e l g e l 60メ ル ク 社製、 溶媒 ； ブ 夕 ノ ー ル ： エ タ ノ ー ル ： 水 = 5 ： 5 ： 3 ) で展 開 し た 。 得 ら れ .た 各糖 に 相 当 す る と こ ろ を 分取 し 液体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー で放射能 を 測定 し た と こ ろ 、 マ ル ト ペ ン 夕 オ ー ス を 基質 と し た 場 合、 加水分解産物 で あ る ダ ル コ 一 ス 、 マ ル ト ー ス 画分 に は 放射活性 は 見 ら れず、 マ ル ト テ ト ラ オ ー ス 、 マ ル ト ト リ オ ー ス 画分 に 放射活性が 回収 さ れ た 。 ま た マ ノレ ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス を 基質 と し た 場合、 加水分解産物 で あ る な ， α — ト レ ハ ロ ー ス 画分 に は放射活性 は見 ら れず、 マ ル ト ト リ オ ー ス 画分 に 放射活 性が回収 さ れ た。

以上の 結果 よ り 、 本組換え新規 ァ ミ ラ ー ゼの作用 機作 は エ ン ド型 に作用 す る ア ミ ラ ー ゼ活性 と 共 に 、 還元末端 側 か ら 主 に 単糖、 2 糖を生成す る 活性 を有す る こ と が確

Dl れ /w

な お、 以上の 実施例 で用 い た試薬の 入手先 は、 そ れぞ れ ， α — ト レ ロ ー ス ： S i gma 社、 マ ノレ ト ー ス （ G 2 ) ： 和光純薬社、 マ ル ト ト リ オ ー ス 〜 マ ル ト ペ ン タ オ ー ス ( G 3 〜 G 5 ) ： 林原 < ィ ォ ケ ミ カ ル社、 ー ス D P 1 7 ： 林 原 ノ、 ィ オ ケ ミ カ ノレ社、 イ ソ マ ゾレ ト ー ス ： 和光 純薬社、 イ ソ マ ル ト ト リ オ ー ス ： 和光純薬社、 イ ソ マ ル ト テ ト ラ オ ー ス ： 生化学工業社、 イ ソ マ ル ト ペ ン タ ォ ー ス ： 生化学工業社、 パ ノ ー ス ： 東京化成社、 ア ミ ロ ぺ ク チ ン ： ナ カ ラ イ テ ス ク 社 で あ る 。

実施例 11一 2 0 S u 1 f 0 1 0 b u s _

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由来新規 ァ ミ ラ ー ゼの 部分 ァ ミ ノ 酸配列 の 決定

実施例 11一 4 で得 た精製酵素の 部分 ァ ミ ノ 酸配列 の決 定 は実施例 11— 1 5 に 記載 さ れ る 方法 に 従 っ て行 っ た。 部分 ァ ミ ノ 酸配列 は下記の通 り で あ っ た。 AP-9 Leu Asp Tyr Leu Lys (配列番号 49)

AP— 10 Lys Arg Glu He Pro Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Gin Pro Leu Gly Val His

(配列番号 50)

AP- 11 Lys Asp Va! Phe Val Tyr Asp Gly Lys (配列番号 51)

AP - 12 His lie Leu Gin Glu He Ala Glu Lys (配列番号 52)

AP- 16 Lys Leu Trp Ala Pro Tyr Val Asn Ser Val (配列番号 53)

AP— 17 Met Phe Ser Phe Gly Gly Asn (配列番号 50

AP- 18 Asp Tyr Try Tyr Gin Asp Phe Gly Arg lie Glu Asp lie Gh (配列番号 55)

AP— 21 Lys lie Asp Ala Gin Trp Val (配列番号 56) 実施例 I 1一 2 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株

新規 ァ ー ゼ 部分 ア ミ ノ 酸配列 に基づ く D N A プ 口 一 ブ の—作成

実施例 11一 2 0 に よ り 決定 さ れ た部分ア ミ ノ 酸配列の 情報 を基 に オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド D N A プ ラ イ マ ー を D N A 合成装置 （ ア プ ラ イ ドバ イ ォ シ ス テ ム ズ社モ デ ル 3 8 1 ) に よ っ て作成 し た。 そ の 配列 は下記の通 り で あ っ た。

AP-10

アミノ酸配列 N末端 Pro Ala Ser Arg Tyr Gin Pro C末端

DNAプライマー 5' AGCTAGTAGATATCAACC 3' (配列番号 57) 配列 A G C C G

AP-11

(相補鎖） アミノ酸配列 N末端 Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly Lys C末端

DNAプライマー 5' TTTTCCATCATAAACAAAAACATC3'

(配列番号 58) 塩基配列 C A G T G T

C こ の プ ラ イ マ ー を各々 1 0 0 p m o 1 お よ び実施例 11 一 4 の方法 に 従 っ て得 た蘭体 よ り 実施例 11一 1 6 の方法 に 従 っ て調製 さ れ た S u 1 f o 1 o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 の 染色体 D N A 約 1 0 0 n _g を 用 い て P C R を行 っ た。

P C R 装置 はパ ー キ ン エ ノレ マ 一 社製 G e n e A m p

P C R シ ス テ ム モ デ ル 9 6 0 0 を 用 い 、 1 サ イ ク ル

9 4 °C 3 0 秒、 5 4 °C 3 0 秒、 7 2 °C 3 0 秒で行 い サ イ ク ノレ数 3 0 回 お よ び 総 液量 1 0 0 β 1 で 実施 し た 。 約

8 3 0 b p の 増幅断片を p T 7 B l u e

T - V e c t o r ( N o v a g e n 社製） へサ ブ ク ロ ー ニ ン グ し た。 こ の プ ラ ス ミ ド の 挿入断片の 塩基配列 を 決 定 し た と こ ろ 実施例 I 1一 2 0 で得 ら れ た ァ ミ ノ 酸配列 に 相 当 す る 配列 が見 い だ さ れ た。

実施例 11一 2 2 S u 1 f 0 1 0 b u_ s

a c i d o c a 1 d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来新規 ァ ミ ラ ー ゼ遺伝子の ク ロ ー ニ ン グ

S u 1 f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 の 染色体 D N A は実施例 11一 4 の 方法 に 従 っ て得 た菌体 よ り 、 実施例 11一 1 6 の 方法 に 従 っ て得 た。 上記染色体 D N A を制限酵素 S a u 3 A I で部分消化 し た後， E M B L 3 B a m H I 切断 ア ー ム （ S T R A T A G E N E 社製） に T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り 連結 （ ラ イ ゲ ー シ ヨ ン ） し た。 パ ッ ケ ー ジ ン グ は S T R A T A G E N E 社製， G i g a p a c k l l G o l d を用 い て行 っ た 上記 ラ イ ブ ラ リ 一 を大腸菌 L E 3 9 2 に 3 7 °C 1 5 分感 染 さ せ た 後、 N Z Y寒天 プ レ ー ト 培地 に 播種 し 、 3 7 °C で約 8 か ら 1 2 時間程度培養 し て、 プ ラ ー ク を形成 さ せ た 。 約 2 時間、 4 °Cで保存 し た後、 ナ イ ロ ン メ ン ブ レ ン ( ア マ シ ャ ム 社製、 H y b o n d N + ) へ D N A を 吸 着 さ せ た。 2 X S S P E で軽 く 洗浄 し た後 8 0 °C 2 時間 ベ ー キ ン グを行 っ た。 プ ロ ー ブ は実施例 11一 2 1 の P C R 断片を用 い、 ア マ シ ャ ム社製 メ ガ プ ラ イ ム D N A標 識 シ ス テ ム を用 い て ³² P で標識 し た。

ノヽ イ ブ リ ダ イ セ ー シ ヨ ン の 条件 は 6 X S S P E 、

0 . 5 % S D S で 6 5 °Cオ ー バ ー ナ イ ト で行 っ た。 洗浄 は 2 x S S P E 、 0 . 1 % S D S で、 室温 1 0 分、 2 回 行 っ た。

約 8 0 0 0 ク ロ ー ン か ら ス ク リ ー ニ ン グ を 開始 し て 1 7 個 の 陽性 ク ロ ー ン を 得 た。 こ の ク ロ ー ン よ り 約 5 . 4 k b p の B a m H I 断片を 得て、 こ れを p U C l 1 8 の上記サ イ ト へ挿入 し た。 得 ら れた ブ ラ ミ ド を P 0 9 A 2 と 命名 し た。 こ の プ ラ ス ミ ド D N A を さ ら に 制限酵素 S a c I で消化 し た も の を p 0 9 A l と す る 。 P 0 9 A 1 の 挿入断片の 制限酵素地図を 図 3 8 に、 ま た P 0 9 A 1 の作成方法を 図 3 9 に記す。 上記 P 0 9 A 1 に つ い て P h a r m a c i a 社製， d o u b 1 e - s t r a n d N e s t e d D e l a t i o n

K i t を用 い て デ レ ー シ ヨ ン プ ラ ス ミ ドを作成 し た。 実 施例 H— 1 8 の方法 に 従 っ て新規 ァ ミ ラ ー ゼの構造遺伝 子の 領域を 中心 に D N A配列 を決定 し た。 こ れ ら の D N A配列 お よ び そ こ か ら 推定 さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 は配列番 号 7 お よ び配列番号 8 に そ れぞれ示 さ れ る 通 り で あ っ た こ の ァ ミ ノ 酸配列 中 に 実施例 11一 2 0 で得 ら れ た部分 ア ミ ノ 酸配列 に相 当 す る 配列が全て認め ら れ た。 こ の ァ ミ ノ 酸配列 は長 さ が 5 5 6 個 で、 推定分子量 6 4 . 4 k D a の タ ン パ ク 質を コ ー ド し て い る も の と 考え ら れた。 こ の 分子量 は 3 11 1 0 1 0 1) 11 5

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来新規 ア ミ ラ ー ゼの 精製酵素を S D S — P A G E に か け る こ と に よ っ て得 ら れた分子量の 値 に ほ ぼ一致 し た。 ま た プ ラ ス ミ ド P 0 9 A 1 を含む形質転換体 に つ い て実 施例 11一 1 9 の 方法 に 従 っ て新規 ァ ミ ラ ー ゼ活性 を確認 し た。

実施例 11一 2 3 K M 1 株 と A T C C 3 3 9 0 9 株の 上 記酵素の ア ミ ノ 酸配列、 塩基配列 の相同性 に つ い て

配列番号 6 の K M 1 株由来の新規 ァ ミ ラ ー ゼの ァ ミ ノ 酸配列 と 、 配列番号 8 の A T C C 3 3 9 0 9 株由 来の 新規 ァ ミ ラ ー ゼの ァ ミ ノ 酸配列 と を、 ま た配列番号 5 の K M 1 株 由 来の新規 ア ミ ラ ー ゼの塩基配列 と 、 配列番号 7 の A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来の 新規 ァ ミ ラ ー ゼの 塩基 配列 と を、 配列解析 ソ フ ト 、 ジ ヱ ネ テ ィ ッ ク ス （ ソ フ ト ウ ェ ア ー 開発） を用 い てギ ャ ッ プを考慮 し て そ れぞれ解 折 し た。 ア ミ ノ 酸配列 に つ い て の 結果を 図 4 0 に 、 塩基 配列 に つ い て の 結果 を 図 4 1 に 示す。 そ れ ぞれの 図中下 段 に K M 1 株の 配列 を、 上段 に A T C C 3 3 9 0 9 株の 配列結果を示 し 、 中段の （ * ) は両者で一致す る 配列 を ま た 中段の （ . ） は両者で性質の 似た ア ミ ノ 酸を示す。 相同性 は ア ミ ノ 酸 レ ベ ルで約 5 9 % . 塩基配列 レ ベ ルで 6 4 % で あ っ た。

実施例 11一 2 4 S u 1 f 0 1 0 b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株 お よ び

S u J f_ o 1 o b u s a_ c _i _ d_ o c a 1 d a r i u s

A T C C 3 3 9 0 9 株 由 来新規 ァ ミ ラ ー ゼ遺伝子の 他の 生物種の 染色体 D N A と の ハ イ プ リ ダ イ ゼ 一 シ ョ ン 試験

S u 1 f 0 1 o b u s s o l f a t a r i c u s

D S M 5 8 3 3 株、 S u l f o l o b u s

s h i b a t a e D S M 5 3 8 9 株、

A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M

1 6 5 1 株、 E . c o 1 i J M 1 0 9 株の 染色体 D N A を実施例 11— 1 6 の方法 に準 じ て制限酵素 H i n d I I I で消化 し た

こ の 消化物を 1 % ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動 に て分離 し ア マ シ ャ ム ジ ャ パ ン社製、 H y b 0 n d — N に サ ザ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ し た 。 こ の メ ン ブ レ ン に プ ラ ス ミ ド p K A 1 の約 1 . 9 k b p の P s t I 断片 （配列番号 5 の 1 番 力、 ら 1 8 4 5 番 ま で の 配列 に対応す る ） を べ ー リ ン ガ ー マ ン ィ ム 社製 D I G シ ス テ ム キ ッ ト に よ っ て標識 し こ れ を用 い て ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ョ ン を 行 っ た 。

条件 は ィ ブ リ ダィ ゼ ー シ ヨ ン ： 5 X S S C 4 0 °C

3 時間、 洗浄 ： 2 X S S C ( 0 . 1 % S D S を 含 む） 、 4 0 °C 5 分、 2 回 0 . l x S S C ( 0 . 1 % S D S を含む ) 、 4 0 °C 5 分、 2 回で あ っ た。 そ の結果、 P s t I 断片 は、 S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株 に つ い て は約 1 3 . O k b p の 断片 と 、 S u l f o l o b u s s h i b a t a e D S M 5 3 8 9 株 に つ い て は約 9 . 8 k b p の 断片 と 、 A c i d i a n u s

b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株 に つ い て は約 1 . 9 k b p の 断片 と ハ イ ブ リ ッ ド を形成 し た。 一方、 ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ルで あ る E . c 0 1 i J M 1 0 9 株 に つ い て は、 ハ イ プ リ ッ ド の 形成 は観察 さ れ な 力、 つ た。

ま た S u l f o l o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 D S M 5 3 5 4 株、 D S M 5 8 3 3 株、 A T C C 3 5 0 9 1 株、 A T C C 3 5 0 9 2 株、 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 A T C C 4 9 4 2 6 株、 S u l f o l o b u s

s h i b a t a e D S M 5 3 8 9 株、

A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株、 E . c o l i J M 1 0 9 株の 染色体 D N A を 実施例 I I一 1 6 の 方法 に 従 っ て得、 制限酵素 X b a I , H i n d i I I ， E c o R V で消化 し た。 こ の 消化物を 1 % ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動 に て分離 し 、 ア マ シ ャ ム社 製、 H v b o n d N + に サザ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ し た。 こ の メ ン プ レ ン に配列番号 7 番の 1 3 9 3 番 よ り 2 1 2 1 番の 領域 （実施例 11一 2 2 で得 ら れた P 0 9 A 1 よ り 制限酵素 E c 0 T 22 I と E c 0 R V で消化 し 、 ゲルか ら 回収 し た） を プ ロ ー ブ と し て実施例 H— 2 2 の方法 に従 い ³² P に よ っ て標識 し 、 こ れを 用 い てハ イ ブ リ ダ ィ ゼー シ ヨ ン を 行 っ た。 条件 は ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン 6 X S S P E 、 0 . 5 % S D S 、 6 0 °C でオ ー バ ー ナ イ ト で行 つ た。 洗浄 は 2 x S S P E 、 0 . 1 % S D S で室温 1 0 分、 2 回行 っ た。 そ の結果 S u 1 f o 1 o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株、 D S M 5 3 5 4 株、 D S M 5 8 3 3 株、 A T C C 3 5 0 9 1 株、

A T C C 3 5 0 9 2 株 S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 A T C C 4 9 4 2 6 株 S u l f o l o b u s

s h i b a t a e D S M 5 3 8 9 株

A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株の 染色体 D N A は そ れぞれ約 3 . 6 k b p , 1 . 0 k b p , 0 . 9 k b p 、 0 . 9 k b p 、 1 . 0 k b p 、 0 . 9 k b p 、 0 . 9 k b p 、 1 . 4 k b p 、 0 . 9 k b p の部位でハ イ ブ リ ッ ド を形成 し た。 一方 E . c 0 1 i J M 1 0 9 株 の 染色体 D N A と は ノヽ イ ブ リ ツ ド を形成 し な か っ た。 ま た配列番号 5 、 6 、 7 、 お よ び 8 の 範囲内 に 含 ま れ る ア ミ ノ 酸配列、 塩基配列 と 相 同性を有す る 配列が存在 し な い こ と を ァ ミ ノ 酸デ ー タ ー バ ン ク （ S w i s s p r o t ， 及 び N B R F — P D B 塩基配歹¹ J デ 一 夕 一 バ ン ク ( E M B L ) か ら 、 配列解析 ソ フ ト 、 ジ ヱ ネ テ ィ ッ ク ス ( ソ フ ト ウ ェ ア ー 開発） を 用 い て確認 し た。 よ っ て こ の 新規 ア ミ ラ ー ゼ遺伝子 は

S u 1 f 0 1 0 b a 1 e s 目 に 属す る 古細菌 に特異的 に 高度 に 保存 さ れ て い る こ と が わ か っ た 。

実 施 例 1 1 1 一 1 組換 え新規 ァ ミ ラ ー ゼお よ び組換 え新 規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ を用 い た α — ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造

実施例 1 I一 1 9 で得 ら れ た 粗精製組換え新規 ァ ミ ラ ー ゼお よ び実施例 I 一 2 0 で得 ら れ た 濃縮組換え新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ並 び に 1 0 %可溶性デ ン プ ン （ ナ カ ラ イ テ ス ク 社製、 特級品） を用 い 、 プル ラ ナ ー ゼを補助的 に 添加 し て、 a ， 一 卜 レ ハ ロ ー ス の製造を試み た。 反応 は以下の よ う に行 っ た。

ま ず 1 0 %可溶性デ ン プ ン を 0 , 5 〜 5 0 Un i t Z m lの プ ル ラ ナ ー ゼ ( K 1 e b s i e l l a p n e u m o n i a e 由 来 ： 和光純薬社製） で、 4 0 °C で 1 時間処理 し た 後、 上記組換え 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ （ 1 0 ϋ n i t /m 1 ) と 、 上記組換え新規 ア ミ ラ ー ゼ （ 1 5 0 ϋ η i t /m 1 ) と を添加 し 、 P H 5 . 5 、 6 0 °C で 1 0 0 時間反応 さ せ た。 次 い で反応液を 1 0 0 °C で 5 分間加熱処理 し て反応 を停止 し 、 未反応の基質を ダル コ ア ミ ラ ー ゼ に て分解 し た。 そ の 後、 実施例 1 1 一 1 に 示す条件の H P L C 分析法 に よ り 測定 し た。 TSK-g e 1 Am i d e - 80 HPL C に よ る 分析結果 は 図 4 2 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。

こ こ で 、 組換え新規 ア ミ ラ ー ゼ の 酵素活性 は 1 時間 に 1 μ 0 1 の a a - ト レ ロ ー ス を マ ル ト ト リ オ シ ル ト レ ハ ロ ー ス か ら 遊離す る 活性を 1 Un i tと し て示 し た。 組換え 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ の 酵素活性 は マ ル ト ト リ オ ー ス を 1 時間 に 1 // m o 1 の グ ノレ コ シ ノレ ト レ ロ ー ス に変換す る 活性を l li n i tと し て示 し た。 プ ル ラ ナ ー ゼの 酵素活性の 定義 は、 p H 6 . 0 3 0 °C で 1 分間 に プル ラ ン カヽ ら 1 / mo l の マ ル ト ト リ オ ー ス を生成す る 酵素量 を 1 ϋ n i tと し て示 し た。

プ ノレ ラ ナ ー ゼ の 添加量 5 0 Un i t/m l の 際 a , a - ト レ ロ ー ス の収率 は 6 7 % で あ っ た。 こ の 値 は、 組換え新 規 ア ミ ラ ー ゼ が 、 S u 1 f o 1 o b u s

s o l f a t a r i c u s K M 1 株由 来精製新規 ア ミ ラ ー ゼを上記条件で作用 さ せ た場合 と ほ ぼ同様の 収率を 与え る こ と を示 し て い る 。

産業上の 利用可能性

本発明 の新規 な 精製法に 基づ く 酵素製造法に よ り 得 ら れ る マ ル ト オ リ ゴ糖等の 糖 に 作用 し て ダ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 及 び マ ル ト オ リ ゴ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス な ど の ト レ ハ 口 ー ス ォ リ ゴ糖等を生成す る 能力 を 有す る 新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼを用 い る こ と に よ り 、 マ ノレ ト オ リ ゴ糖等 の 原 料を 用 い て効率的で、 かつ 高収率 に ダ ル コ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 及 び マ ル ト オ リ ゴ シ ル ト レ ハ ロ ー ス な ど の ト レ ノヽ 口 ー ス ォ リ ゴ糖等を製造す る 新規な 方法を提供す る こ と が で き る 。

本発明の新規 ア ミ ラ ー ゼを 、 本発明の 新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ と 組み 合わせ て用 い る こ と に よ り 、 デ ン プ ン 、 デ ン プ ン 分解物、 及 び マ ル ト ォ リ ゴ糖等 の糖質原料か ら 効率的 に 、 かつ 高収率 に α , α — ト レ ハ ロ ー ス を製造す る 新規 な 方法を提供す る こ と がで き る 。

配 列 表

配列番号： 1

配列の長さ ： 2578

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

起源

生物： Su 1 f 01 obus solfataricus

株名： KM1

GCATGCCATT AAAAGATGTA ACATTTTACA CTCCAGACGG TAAGGAGGTT GATGAGAAAG 60 CATGGAATTC CCCAACGCAA ACTGTTATTT TCGTGTTAGA GGGGAGCGTA ATGGATGAGA 120 TTAACATCTA TGGAGAGAGA ATTGCGGATG ATTCATTCTT GATAATTCTT AACGCAAATC 180 CCAATAACGT AAAAGTGAAG TTCCCAAAGG GTAAATGGGA ACTAGTTGTT GGTTCTTATT 240 TGAGAGAGAT AAAACCAGAA GAAAGAATTG TAGAAGGTGA GAAGGAATTG GAAATTGAGG 300 GAAGAACAGC ATTAGTTTAT AGGAGGACAG AACT ATG ATA ATA GGC ACA TAT AGG 355

Met He lie Gly Thr Tyr Arg

1 5

CTG CAA CTC AAT AAG AAA TTC ACT TTT TAC GAT ATA ATA GAA AAT TTG 403 Leu Gin Leu Asn Lys Lys Phe Thr Phe Tyr Asp 11 e lie Glu Asn Leu

10 15 20 OS! SH OH iLi njg 3 ] J usy dsv siq ujg naq siq 911 naq ί ig siq dsy a ] i ]

3V1 9VD VIV IVV 1V9 3VV OVD VI3 VVV VIV Dll V9D OVV IV9 VIV 113 sei OEi szi on jq dsy na n | g dsy n]g ns] 3 ] [ OJJ Π3] a | j 3 [ \ si dsy dsy dsy

6Ci 3DV 1V9 Dii 9V9 3V9 9V9 113 ViV V33 D13 OIV VIV DVV 3VD 1V3

SII 0Π SOI jil S!H dsy sqj Hi usy 』 ιίχ siq jas usy siq d JSS siq

169 3VI 3V3 IVO IU 1VI OVV 丄 VI 3V1 VVV IDV IVV OVV 991 19V OVV VU

001 S6 06 naq dsy na 3jy 丄 usy iqi SIH S!H \n V J3W ^S!H usy OJJ 9 DID 1V9 DIV 110 V9V DDI IVV V IVO 1V3 V19 DD9 DIV DVD IVV V33

S8 08 Si

\n 311 ui9 an an nig ijg 3jy as siq nig siq A

S6S 319 VIV IV9 VV3 VIV 31V WD VU 1D9 VDV IDV OVV 139 VV3 DVV 113

01 S9 09

n slq 9iu 3 nig n|g i|g n njg usy 3] i J3§ i V13 VVV IU 391 900 9VD VV3 VOD VD9 VU VV3 9V9 IVV 11V WD IDV

SS OS Οί' s!H dsy Λ !U v "丄 S!H iqi "S ^ID ^0Jd 2jy slq n3

6 IVD IVD V19 VIO 1V9 3V1 03D DVD I3V 39V 99D V33 V9V 139 OVV UD

S£ OS

3]I old 』3S ti Π3] sin J3S 1^ΕΛ ^!O O si] m iLi dsy ί VIV V33 131 V13 IVX V13 3V3 VDI V19 V39 VII VV9 VVV IU 1V1 IV9

- iz -8II0/S6dT/XDd ひ 9H7S60A AGA GGG CTT ATA TTA CCT ATA AAT GAT GAA GGA GTT GAA TTC TTG AAA 835

Arg Gly Leu lie Leu Pro lie Asn Asp Glu Gly Val Glu Phe Leu Lys

155 160 165

AGG ATT AAT TGC TTT GAT AAT TCA TGT TTA AAG AAA GAG GAT ATA AAG 883

Arg lie Asn Cys Phe Asp Asn Se r Cys Leu Lys Lys Glu Asp lie Lys

Π0 175 180

AAA TTA CTA TTA ATA CAA TAT TAT CAG CTA ACT TAC TGG AAG AAA GGT 931

Lys Leu Leu Leu He Gin Tyr Tyr Gin Leu Thr Tyr Trp Lys Lys Gly

185 190 195

TAT CCA AAC TAT AGG AGA TTT TTC GCA GTA AAT GAT TTG ATA GCT GTT 979 Tyr Pro Asn Tyr Arg Arg Phe Pbe Ala Va 1 Asn Asp Leu 11 e Ala Val 200 205 210 215

AGG GTA GAA TTG GAT GAA GTA TTT AGA GAG TCC CAT GAG ATA ATT GCT 1027 Arg Val Glu Leu Asp Glu Val Phe Arg Glu Se r His Glu lie lie Ala

220 225 230

AAG CTA CCA GTT GAC GGT TTA AGA ATT GAC CAC ATA GAT GGA CTA TAT 1075 Lys Leu Pro Va I Asp Gly Leu Arg lie Asp His lie Asp Gly Leu Tyr

235 240 245

AAC CCT AAG GAG TAT TTA GAT AAG CTA AGA CAG TTA GTA GGA AAT GAT 1123 Asn Pro Lys Glu Tyr Leu Asp Lys し en Arg Gin Leu Val Gly Asn Asp

250 255 260

AAG ATA ATA TAC GTA GAG AAG ATA TTG TCA ATC AAC GAG AAA TTA AGA 1171 Lys 11 e 11 e Tyr Va! Glu Lys 11 ε Leu Se r lie Asn Glu Lys Leu Arg

265 270 275 S6E

s BIV m an V o^jd ^J «19 3JV an i!3 siq

SSSI DVV 139 311 3IV V3D V33 91V 3VX VV3 m DID V9V 9IV 01V VD9 DVV

06E S8S

n]3 dsy si] nai si jg n ] g si dsy s nig gjy 8)1 i|3 usy 3u iOSI VV9 1V3 VVV VII DVV V93 OVD OVV IVD 3D1 VV3 D3V VIV V09 3VV UV sic oie S9E 09C dsv "IS "丄 ^η3Ί "丄 ^JU ³ュ V "1 si siq s δ]γ naq aqj

6SH IVD 9V9 IVI V33 VU IVI I3V 09V 3V1 VVV VVV DIV V39 V13 111

SSE OSE SU

dsy A ⁿ³1 "丄 dsy ιί usy A usy naq naq siq J 3§ naq 3 jy njg

ΠΗ IVO V19 ¥11 IVl 1V9 3V1 IVV 11D DVV DID Vll DVV 30V VU V9V VV9

o m

911 dsy ί ]9 s 9ijj naq ujg usy 5]V A i>H s siq J3S u|9 9] 1 £9£I IIV DVD 1D3 VVV 111 VII OVD IVV V3D 1ID Vll VVV VVV 13V VV3 VIV a 11 ns n J g dsy 31 \ usy 311 s A] 3 iy ^10 3!I m usy nio ji丄 m SIEI VIV VU 9V3 OVD VIV IVV 3iV VVV D3V V99 IIV 311 IVV 0V9 IVI 111

on soe

s jqi naq 1113 njQ iig J3g 0 dsy A naq ngq 13}¾ usy A i9H OVV 10V Vll OVD DVD 19D 19V V90 IVD VI9 VII V13 DIV IVV 119

082 iil usy ng aqj dsy "丄 ^JU ュ U ί 1 dsy I ΒΛ si (Ιιχ dsy dsy 6121 3V1 3VV 911 311 IV9 IVI V9D 13V 13V D9D IVD VXD VVV ODl IVD 1V9

— 9 τ s —

68II0/S6df/X3d Z 9P£/S6 OAV SES S2S

s!H Λ sil V O 2JV 3!I 311 }3H s!H usy siq 311 v

6E6I 1V3 V13 OVV 130 VVO VDV VIV 31D DVV UV OIV 3V3 3VV 9VV UV VDV

SIS 015 SOS i>!9 siq usy dsy m 3 i l J9S 9 !U r>3]

Ϊ68Ι DV9 3VV IVV IV9 voo OVD 3V1 19V V99 913 113 V3V VVO V 丄丄山

OOS 06

2iV "丄 usy si dsy 31 j usy naq dsy s!H dJl 81 V9V IVI DV9 1V9 DVV VVV IVO UV IVV V33 99V Vli DXI IV9 IV3 D91

S

811 \n V "19 丄 ni9 s ] OJJ 3|I "ID

S6il 3VI VIV VI9 D9V OVD OVD D91 OVD OVV V33 VIV 9V9 131 VIO VID V31

0 09

\H V n|9 J3S aid s iqi dsy S!H 】U "s na iUl VIV VDV 1D9 V3V 119 DVD VV9 19V 311 VVV 13V IV3 IV3 13V DDI 113

os S o i usy "s 311 m usv j a§ n3i usy 3^ usy sjH m 6691 13V 31V VD1 VIV 30V IVV V13 V9V 39Y VXD DVV m 3VV 1V3 111

0 S dsy siq 91 [ J 3§ 】3s m n3i dsy J as ilD Ι¾Λ nio usy IS9I OVD VVV 31V 3DV Vli IDV DII VOV VIO 3V9 DOV m 110 9V0 3VV

0

nai J as 3 ] i naq Sjy usy "丄 311 m t>H 】U 〗U dsy Mi) Hi ijg £091 ID 331 UV VII V3V IVV 3V1 31V 3U 313 33V 13V 1V3 IVI 3D9

- Z T 2 -

68Ϊ Ϊ 0/S6df/I3J ひ 9 £/S6 OAV ACA ACG TGG GAA AAT CCT AAT ATA GAG TAT GAA AAG AAG GTT CTG GGT 1987 Thr Thr Trp Glu Asn Pro Asn lie Glu Tyr Glu Lys Lys Val Leu Gly

540 545 550

TTC ATA GAT GAA GTG TTC GAG AAC AGT AAT TTT AGA AAT GAT TTT GAA 2035 Phe He Asp Glu Val Phe Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Asp Phe Glu

555 560 565

AAT TTT GAA AAG AAA ATA GTT TAT TTC GGT TAT ATG AAA TCA TTA ATC 2083 Asn Phe Glu Lys Lys 11 e Val Tyr Phe Gly Tyr Met Lys Ser Leu lie

570 575 580

GCA ACG ACA CTT AGG TTC CTT TCG CCC GGT GTA CCA GAT ATT TAT CAA 2131 Ala Thr Thr Leu Arg Phe Leu Ser Pro Gly Val Pro Asp He Tyr Gin

585 590 595

GGA ACT GAA GTT TGG AGA TTC TTA CTT ACA GAC CCA GAT AAC AGA ATG 2179 Gly Thr Glu Val Trp Arg Phe Leu Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Met 600 605 610 615

CCG GTG GAT TTC AAG AAA CTA AAG GAA TTA TTA AAT AAT TTG ACT GAA 2227 Pro Val Asp Piie Lys Lys Leu Lys Glu Leu Leu Asn Asn Leu Thr Glu

620 625 630

AAG AAC TTA GAA CTC TCA GAT CCA AGA GTC AAA ATG TTA TAT GTT AAG 2275 Lys Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg Va 1 Lys Me t Leu Tyr Va 1 Lys

635 640 645

AAA TTG CTA CAG CTT AGA AGA GAG TAC TCA CTA AAC GAT TAT AAA CCA 2323 Lys Leu Leu Gin Leu Arg Arg Glu Tyr Ser Leu Asn Asp Tyr Lys Pro

650 655 660 TTG CCC TTT GGC TTC CAA AGG GGA AAA GTA GCT GTC CTT TTC TCA CCA 2371

Leu Pro Phe Gly Phe Gin Arg Gly Lys Val Ala Val Leu Phe Ser Pro

665 670 675

ATA GTG ACT AGG GAG GTT AAA GAG AAA ATT AGT ATA AGG CAA AAA AGC 2419 lie Val Thr Arg Glu Val Lys Glu Lys He Ser lie Arg Gin Lys Ser

680 685 690 695

GTT GAT TGG ATC AGA AAT GAG GAA ATT AGT AGT GGA GAA TAC AAT TTA 2467

Val Asp Trp He Arg Asn Glu Glu lie Ser Ser Gly Glu Tyr Asn Lei

700 705 710

AGT GAG TTG ATT GGG AAG CAT AAA GTC GTT ATA TTA ACT GAA AAA AGG 2515

Ser Glu Leu He Gly Lys His Lys Val Val lie Leu Thr Glu Lys Arg

715 720 125

GAG TGAACTACCT ACATAGATTT ATTCTTGAAC TACTCTGGTC AGAAATGTAT 2568 Glu

TACGCAGATC 25Π 配列番号： 2

配列の長さ ： 728

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

起源

生物： Sulfolobus solfataricus 株名： KMl

配列

Met lie lie Gl Thr Ty r Arg Leu Gin Leu Asn Lys Lys Phe Thr Phe

1 5 10 15

Tyr Asp lie lie Glu Asn Leu Asp Ty r Phe Lys Glu Leu Gly Va 1 Ser

20 25 30

His Leu Tyr Leu Ser Pro lie Leu Lys Ala Arg Pro Gly Ser Thr His

35 40 45

Gl Tyr Asp Va 1 Va 1 Asp His Ser Glu lie Asn Glu Glu Leu Gly Gly

50 55 60

u 1 u Glu Gly Cy s Phe Lys Leu Va 1 Lys Glu Ala Lys Ser Arg Gly Leu 65 70 75 80

Glu lie He Gin Asp He Val Pro Asn His Met Ala Val His His Thr

85 90 95

Asn Trp Arg Leu Met Asp Leu Leu Lys Ser Trp Lys Asn Ser Lys Tyr

100 105 110

Tyr Asn Tyr Phe Asp His Tyr Asp Asp Asp Lys lie lie Leu Pro 11 e

115 120 125

Leu Glu Asp Glu Leu Asp Thr Va I lie Asp Lys Gly Leu lie Lys Leu

130 135 140

Gin Lys Asp Asn lie Glu Tyr Arg Gly Leu lie Leu Pro lie Asn Asp 145 150 155 160

Glu Gly Va I Glu Phe Leu Lys Arg lie Asn Cys Phe Asp Asn Ser Cys

165 170 175 Leu Lys Lys Glu Asp lie Lys Lys Leu Leu Leu lie Gin Tyr Tyr Gin

180 185 190

Leu Thr Tyr Trp Lys Lys Gly Tyr Pro Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala

195 200 205

Va 1 Asn Asp Leu lie Ala Va 1 Arg Va 1 Glu Leu Asp Glu Va 1 Phe Arg

210 215 220

Glu Ser His Glu 11 e lie Ala Lys Leu Pro Va 1 Asp Gl Leu Arg 11 e 225 230 235 240

Asp His 11 e Asp Gly Leu Tyr Asn Pro Lys Glu Tyr Leu Asp Lys Leu

245 250 255

Arg Gin Leu Va 1 Gly Asn Asp Lys lie lie Tyr Va 1 Glu Lys lie Leu

260 265 270

Ser 11 e Asn Glu Lys Leu Arg Asp Asp Trp Lys Va 1 Asp Gly Thr Thr

275 280 285

■Gly Tyr Asp Phe Leu Asn Tyr Va 1 Asn Me t Leu Leu Va I Asp Gly Ser

290 295 300

Gly Glu Glu Glu Leu Thr Lys Phe Tyr Glu Asn Phe He Gly Arg Lys 305 310 315 320

11 e Asn lie Asp Glu Leu lie lie Gin Ser Lys Lys Leu Va 1 Ala Asn

325 330 335

Gin Leu Phe Lys Gly Asp 11 e Glu Arg Leu Ser Lys Leu Leu Asn Va 1

340 345 350

Asn Tyr Asp Tyr Leu Va 1 Asp Phe Leu Ala Cys Met Lys Lys Tyr Arg

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配列の長さ ： 3467

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA 生物： Su 1 ί 01 obus acidocaiaarius

株名： ATCC 33909株

配列

GCTAATAAAC TGAACAATGA GGACGGAATG AATGAAAATT ATAGCTGGAA TTGTGGAGTA 60 GAAGGAGAAA CTAACGATTC TAATATTCTT TATTGTAGAG AAAAACAAAG AAGAAATTTT 120 GTAATAACAT TATTTGTTAG CCAAGGTATA CCAATGATCT TAGGGGGAGA CGAAATAGGA 180 AGAACACAAA AAGGCAACAA TAATGCTTTT TGTCAGGATA ATGAGACAAG TTGGTATGAT 240 TGGAACCTTG ATGAAAATCG TGTAAGGTTT CATGATTTTG TGAGGAGACT TACCAATTTT 300 TATAAAGCTC ATCCGATATT TAGGAGGGCT AGATATTTTC AGGGTAAGAA GTTACACGGT 360 TCCCCATTAA AGGATGTGAC GTGGCTAAAA CCTGACGGCA ATGAAGTTGA TGATTCAGTG 420 TGGAAATCTC CAACAAATCA TATTATTTAT ATATTAGAGG GAAGTGCTAT CGATGAAATA 480 AATTATAATG GAGAAAGGAT AGCTGACGAC ACTTTTCTAA TTATTTTGAA TGGAGCAAGT 540 ACTAATCTTA AGATAAAAGT ACCTCATGGA AAATGGGAGT TAGTGTTACA TCCTTATCCA 600 CATGAGCCAT CTAACGATAA AAAGATAATA GAAAACAACA AAGAAGTAGA AATAGATGGA 660 AAGACTGCAC TAATTTACAG GAGGATAGAG TTCCAGTGAT ATCAGCAACC TACAGATTAC 720 AGTTAAATAA GAATTTTAAT TTTGGTGACG TAATCGATAA CCTATGGTAT TTTAAGGATT 780 TAGGAGTTTC CCATCTCTAC CTCTCTCCTG TCTTA ATG GCT TCG CCA GGA AGT AAC 836

Met Ala Ser Pro Gly Ser Asn

1 5

CAT GGG TAC GAT GTA ATA GAT CAT TCA AGG ATA AAC GAT GAA CTT GGA 884

His Gly T r Asp Va 1 lie Asp His Ser Arg lie Asn Asp Glu Leu Gly

10 15 20

GGA GAG AAA GAA TAC AGG AGA TTA ATA GAG ACA GCT CAT ACT ATT GGA 932

Gly Glu Lys Glu Ty r Arg Arg Leu lie Glu Thr Ala His Thr lie Gly

25 30 35

TTA GGT ATT ATA CAG GAC ATA GTA CCA AAT CAC ATG GCT GTA AAT TCT 980

Leu Gly lie lie Gin Asp lie Va 1 Pro Asn His Me t Ala Val Asn Ser

40 45 50 55

CTA AAT TGG CGA CTA ATG GAT GTA TTA AAA ATG GGT AAA AAG AGT AAA 1028

Leu Asn Trp Arg Leu Met Asp Val Leu Lys Met Gly Lys Lys Ser Lys

60 65 70

TAT TAT ACG TAC TTT GAC TTT TTC CCA GAA GAT GAT AAG ATA CGA TTA 1076

Tyr Ty r Thr Ty r Phe Asp Phe Phe Pro Glu Asp Asp Lys lie Arg Leu

75 80 85

CCC ATA TTA GGA GAA GAT TTA GAT ACA GTG ATA AGT AAA GGT TTA TTA 1124

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90 95 100

AAG ATA GTA AAA GAT GGA GAT GAA TAT TTC CTA GAA TAT TTC AAA TGG 1Π2

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105 110 115 usy aijd usy J3S ^lLl usy dsy Jil il3 Jqi

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265 270 275

CTA TTT AGT TAT GAA GTT AAA AGA TTA GCA TCA CAA CTA GGA ATT AGC 1700 Leu Phe Ser Tyr Glu Val Lys Arg Leu Ala Ser Gin Leu Gl He Ser

280 285 290 295

TAC GAT ATA TTG AGA GAT TAC CTT TCT TGT ATA GAT GTG TAC AGA ACT 1748 Tyr Asp lie Leu Arg Asp Tyr Leu Ser Cys lie Asp Val Tyr Arg Thr

300 305 310

TAT GCT AAT CAG ATT GTA AAA GAG TGT GAT AAG ACC AAT GAG ATA GAG 1796 Tyr Ala Asn Gin lie Val Lys Glu Cys Asp Lys Thr Asn Glu He Glu

315 320 325

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330 335 340

ATG CCA GCA GTA TAC GCT AAA GCT TAT GAA GAT ACT TTC CTC TTT AGA 1892 Met Pro Ala Val Tyr Ala Lys Ala Tyr Glu Asp Thr Phe Leu Phe Arg

345 350 355

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360 365 370 375 y r

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505 510 515

AGA AGG ATA GGG ATG ATT AAG AGC TTA TCC TTG GTC GCA TTA AAA ATT 2420

Arg Arg 11 e Gly Met lie Lys Ser Leu Ser Leu Va I Ala Leu Lys lie

520 525 530 535

ATG TCA GCC GGT ATA CCT GAT TTT TAT CAG GGA ACA GAA ATA TGG CGA 2468

Met Ser Ala Gly He Pro Asp Phe Tyr Gin Gly Thr Glu He Trp Arg

540 545 550

TAT TTA CTT ACA GAT CCA GAT AAC AGA GTC CCA GTG GAT TTT AAG AAA 2516 Tyr Leu Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Va 1 Pro Va 1 Asp Phe Lys Lys

555 560 565

TTA CAC GAA ATA TTA GAA AAA TCC AAA AAA TTT GAA AAA AAT ATG TTA 2564 Leu His Glu lie Leu Glu Lys Ser Lys Lys Phe Glu Lys Asn Met Leu

570 575 580

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585 590 595

TTA TCC CTA AGA AAA CAG TTG GCT GAG GAT TTT TTA AAG GGC GAG TAT 2660 Leu Ser Leu Arg Lys Gin Leu Ala Glu Asp Phe Leu Lys Gly Glu Tyr

600 605 610 615

AAG GGA TTA GAT CTA GAA GAA GGA CTA TGT GGG TTT ATT AGG TTT AAC 2708 Lys Gly Leu Asp Leu Glu Glu Gly Leu Cys Gly Phe lie Arg Phe Asn

620 625 630 AAA ATT TTG GTA ATA ATA AAA ACC AAG GGA AGT GTT AAT TAC AAA CTG 2756 Ly s lie Leu Val lie lie Lys Thr Lys Gly Ser Val Asn Ty r Lys Leu

635 640 645

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650 655 660

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665 6Ϊ0 675

ATG TAAGTTATAA TAATCCGATT TTTATGTGAC AAGATTTACG CTTACGAAAA 2905 Met

680

GGACTGTTAA ATCAACTTTT ATGTGAATTA TGAAACGTAA ATTATAAGTT TCCTGAGGAT 2965 AAACATATAT ATCTCTATCT CTCATTGATA TCACATGAGT ATTAGATTAA GGGGAAGTAA 3025 TTCTTACGGA CATTCAGGCT GGTTTACAGT ATACTGTAGA ATATGTAATA GGAAAATAAG 3085 AATAGGAACG GACTTAGTCT ACAAATGCCC TAAATGTGAA AAGAAGTATA ACGCATTCTT 3145 CTGTGAAGCA GATGCTAGGG GATTAAAGAA AAAGTGCCCA TACTGTGGTA CTGAACTTGT 3205 CAGTGCAATT TAAGACTCAA ATAGAAGGTA AAAATATTTT TATACTGAAT AATGAGTTGT 3265 TTTACGCTGA TACGGATATA GTTATTCGAA ATCAAGATTT TATTAAGAAA CTCACCTTTA 3325 CACAATATAA TAAGATTGCC TATATTGACA TGGACATAGA AACGACAGAA TTTAAGATAT 3385 TAAGATTAGT AGTGTGTAAA ACTAGAATAA ATATTTATGT TTGCAACGTA ATTGGTAAAT 3445 TGAAAGAAAC TAATTTTGAA AA 3467 配列番号： 4

配列の長さ ： 680

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質 生物： Sulfolobus acidocaldarius

株名： ATCC 33909株

配列

Met Ala Ser Pro Gly Ser Asn His Gly Tyr Asp Val lie Asp His Ser

1 5 10 15

Arg lie Asn Asp Glu Leu Gly Gly Glu Lys Glu Tyr Arg Arg Leu lie

20 25 30

Glu Thr Ala His Thr lie Gly Leu Gly lie He Gin Asp lie Val Pro

35 40 45

Asn His Me t Ala Va 1 Asn Ser Leu Asn Trp Arg Leu Met Asp Va 1 Leu

50 55 60

Lys Met Gly Lys Lys Ser Lys Tyr Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Phe Pro 65 70 75 80

Glu Asp Asp Lys 11 e Arg Leu Pro lie Leu Gly Glu Asp Leu Asp Thr

85 90 95

Va 1 11 e Ser Lys Gly Leu Leu Lys lie Val Lys Asp Gly Asp Glu Tyr

100 105 110 Phe Leu Glu Ty r Phe Lys Trp Lys Leu Pro Leu Thr Glu Va 1 Gly Asn

115 120 125

Asp lie Ty r Asp Thr Leu Gin Lys Gin Asn Ty r Thr Leu Met Ser Trp

130 135 140

Lys Asn Pro Pro Ser Tyr Arg Arg Phe Phe Asp Va 1 Asn Thr Leu 11 e 145 150 155 160

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210 215 220

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Asn Leu Leu Phe Asn Phe Asn Gin Glu lie Met Asp Ser lie Tyr Glu

245 250 255

Asn Phe Thr Ala Glu Lys He Ser He Ser Glu Ser He Lys Lys lie

260 265 270

Lys Ala Gin lie 11 e Asp Glu Leu Phe Ser Tyr Glu Va 1 Lys Arg Leu

275 280 285

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530 535 540

Gin Gly Thr Glu 11 e Trp Arg Ty〖 Leu Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg 545 550 555 560

Val Pro Va 1 Asp Phe Lys Lys Leu His Glu lie Leu Glu Lys Ser Lys

565 570 575

Lys Phe Glu Lys Asn Me t Leu Glu Ser Met Asp Asp Gly Arg lie Lys

580 585 590

Met Ty r Leu Thr Ty r Lys Leu Leu Ser Leu Arg Lys Gin Leu Ala Glu

595 600 605

•As Phe Leu Lys Gly Glu Ty r Lys Gly Leu Asp Leu Glu Glu Gly Leu

610 615 620

Cys Gly Phe He Arg Phe Asn Lys He Leu Val lie He Lys Thr Lys 625 630 635 640

Gly Ser Va 1 Asn Ty r Lys Leu Lys Leu Glu Glu Gly Ala lie Ty r Thr

645 650 655

Asp Val Leu Thr Gly G Glu He Lys Lys Glu Val Gin He Asn Glu

660 665 670

Leu Pro Arg lie Leu Va 1 Arg Me t

675 680 配列番号： 5

配列の長さ： 2691

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

起源

生物： Sulfolobus solfataricus

株名： KMl

配列

CTGCAGTAAC TAGCGCTATC GAAGACGTTA TAAAGAGAAG GATAAATAGA GTTCCAGTGA 60 GTCTAGAAGA CCTTTTTGAA TAAGGACTTT AATATCATTT AAATTTATTT TTTGGAACAT 120 GCAGAGGTAA ACCCATGAAT GTCATTTTCG ACGTATTAAA CGAGATCCAT GGGTTTTTTG 180 GTGCATTGTG GGCGGGAGCA GCTCTACTTA ACTACTTAGT TAAGCCTCAA GATAAGAGGC 240 AATTTGAGAG AATAGGGAAA TTCTTCATGA TAAACTCAGT CATTACAGTA ATAACTGGGA 300 TAATAATTTT CGCCTACATT TACCTAGCCC CTTATCAAGG GAATTTATTT CTAGTAGCGG 360 CAATTCTACG TTCAAGCCTT GACATTAGGT TAAGGGCCTT ACTAAACTTA ATAGGAGGAG 420 CGTTTGGGTT ATTGGCTTTT GGGGCAGGGA TAGTTATAAG CAATAGGATA AGGCTTATGG 480 TACGTGTTAA GGAAGGTGAC GCTACAATCC TAGAGTTGAG GAATAGTATT GCCAATTTAT 540 CTAAAATTAG TTTAATCTTC TTATTACTTT CCTTAGCCAT GATGATACTT GCTGGTTCCA 600 TAGCACAAGT TATAAGTTAG AGTTGAAAGA AAAATTTA ATG ACG TTT GCT TAT AAA 656

Met Thr P e Ala Tyr Lys 0 1 5 ATA GAT GGA AAT GAG GTA ATC TTT ACC TTA TGG GCA CCT TAT CAA AAG 704 11 e Asp Gly Asn Glu Val He Phe Thr Leu Trp Ala Pro Tyr Gin Lys

10 15 20

AGC GTT AAA CTA AAG GTT CTA GAG AAG GGA CTT TAC GAA ATG GAA AGA ?52 Ser Val Lys Leu Lys Va 1 Leu Glu Lys Gly Leu Tyr Glu Met Glu Arg

25 30 35

GAT GAA AAA GGT TAC TTC ACC ATT ACC TTA AAC AAC GTA AAG GTT AGA 800 Asp Glu Lys Gly Tyr Phe Thr lie Thr Leu Asn Asn Val Lys Va 1 Arg

40 45 50

GAT AGG TAT AAA TAC GTT TTA GAT GAT GCT AGT GAA ATA CCA GAT CCA 848 Asp Arg Tyr Lys Tyr Val Leu Asp Asp Ala Ser Glu lie Pro Asp Pro

55 60 65

GCA TCC AGA TAC CAA CCA GAA GGT GTA CAT GGG CCT TCA CAA ATT ATA 896 Ala Ser Arg Tyr Gin Pro Glu Gly Val His Gly Pro Ser Gin He lie 70 75 80 85

CAA GAA AGT AAA GAG TTC AAC AAC GAG ACT TTT CTG AAG AAA GAG GAC 944 Gin Glu Ser Lys Glu Phe Asn Asn Glu Thr Phe Leu Lys Lys Glu Asp

90 95 100

TTG ATA ATT TAT GAA ATA CAC GTG GGG ACT TTC ACT CCA GAG GGA ACG 992 Leu lie lie Tyr Glu He His Val Gly Thr Phe Thr Pro Glu Gly Thr

105 110 115

TTT GAG GGA GTG ATA AGG AAA CTT GAC TAC TTA AAG GAT TTG GGA ATT 1040 Phe Glu Gly Val 11 e Arg Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Asp Leu G I y lie

120 125 130 092 SS2 05Z

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配列の長さ ： 558

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質 生物： Sul folobus solfataricus 株名： KMl

配列

Thr Phe Ala Tyr Lys He Asp Gly Asn Glu Val He Phe Thr Leu Trp

1 5 10 15

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115 120 125

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130 135 140

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II0/S6df/I3d ひ 9 / S60AV 配列番号： Ί

配列の長さ： 3600

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic MA

起源： Sul folobus acidocaldarius

株名： ATCC33909

配列

ATTCGTTTTG AGTCACTCGG CGTAGGTCTG TAGTCTTTCT TGGCGAGGGC TAATAAGTTG 60 AGATAATGCT TGCCAAGAAT CGAAGAAGGC GTCCTGCCCT GCATGAAATC GATTACCTCG 120 GCACTAACTC CGAGCTCCGC GAGTTTAGTA GTCACGAATT TGCGTACATA TTTCGGCGCT 180

ATCCCTTTCT CATGCAATAA ATTCTTCGCG TAGTTGTACG TTATATCAGT CTTAGCTATA 240

GACGAAATGT GAAAGACATA GAACACTTTC TTTGGCCCTC TAGTCCAGTT GAGCGTGTAT 300

ACGTAGAAGC CGTCCTCTTT CACGTTGTTC TTCTCGTCAT ACTCATTGAG AACCTTTACA 360

GCCTCCCTAA GCCTTATACC GCTCTCAAGG AGGAGCTTGA AGACTAGCTC TACCTCAATA 420

CCTCTAACAG CCTCCAACCA CCTCCCTATC TCGTCAGCTC CTGGAACCTT AAGATCAACA 480

CCAGACTTTT TCGTTTTCAG CTTTTTCCAT GCCTCAAGAT CCCCTTTCCA CTTGTAGAAC 540

TTCTTCCAGG CTAGGATAGA GTTCTTAGCA TTACTAGGGG GCTTCTTCAG ATAATTGATA 600

TACTGCCTGC AAGTTTCCTC ACTGGCCATT TTCAAACAAT ATTCATAAAA TTCAATTAAT 660

TCCTTTTCCG TGAGACCATT TTTGCCCTCC CTAGAAGTAA GGGAGTTTAG GGCAAATCCC 720

TTACTCTCTT CATCATTTGA AAGAGGGGTT TTAGGGGATT CCTCCCCTAA CCAGGGCTTT 780

GGCCCCTGGG ACCAGGGTTC GAGTCCCTGC CCGGCTACCT TTGAAAGGTT AGGGGGATAC 840

ACCCTAATAC CCCACTTCTA TCTTACAATT TCAGGTAAGT CTTTACTAGG TCAACTAAAG 900 58 08 Si

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120 125 130 135

GGA ATT GAA CTG ATG CCT GTG GCA CAA TTT CCA GGG AAT AGA GAT TGG 1628 Gly lie Glu Leu Met Pro Val Ala Gin Phe Pro Gly Asn Arg Asp Trp

140 145 150

GGA TAC GAT GGT GTT TTT CTA TAC GCA GTT CAA AAT ACT TAT GGC GGA 1676 Gly Tyr Asp Gly Val Pbe Leu Tyr Ala Val Gin Asn Thr Tyr Gly Gly

155 160 165

CCA TGG GAA TTG GCT AAG CTA GTA AAC GAG GCA CAT AAA AGG GGA ATA 1724 Pro Trp Glu Leu Ala Lys Leu Val Asn Glu Ala His Lys Arg Gly He

170 175 180

GCC GTA ATT TTG GAT GTT GTA TAT AAT CAT ATA GGT CCT GAG GGA AAT 1772 Ala Val lie Leu Asp Val Val Tyr Asn His He Gly Pro Glu Gly Asn

185 190 195

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475 480 485

AAT TGT AAA AGG GTA AAG GAA GT.T AGG AGA GAA GGG AAC TGT ATT ACT 2684

Asn Cys Lys Arg Va i Lys Glu Va I Arg Arg Glu Gly Asn Cys 11 e Thr

490 495 500

TTG ATC ATG GAA AAA ATA GGA ATA ATT GCA TCG TTT GAT GAT ATT GTA 2732

Leu 11 e Met Glu Lys lie Gly 11 e 11 e Ala Se r Phe Asp Asp 11 e Va I

505 510 515

ATT AAT TCT AAA ATT ACA GGT AAT TTA CTT ATA GGC ATA GGA TTT CCG 2780 lie Asn Ser Lys lie Thr Gly Asn Leu Leu lie Gly 11 e Gly Phe Pro

520 525 530 535

AAA AAA TTG AAA AAA GAT GAA TTA ATT AAG GTT AAC AGA GGT GTT GGG 2828 Lys Lys Leu Lys Lys Asp Glu Leu lie Lys Va 1 Asn Arg Gly Va I Gly

540 545 550

GTA TAT CAA TTA GAA TGAAAGATCG ACCATTAAAG CCTGGTGAAC CTTATCCTTT 2883 Val Tyr Gin Leu Glu

555

AGGGGCAACT TGGATAGAGG AAGAAGATGG AGTTAATTTT GTACTATTCT CTGAGAACGC 2943

CACAAAAGTA GAACTGTTAA CGTACTCTCA GACTAGACAA GATGAGCCAA AGGAAATAAT 3003

AGAACTTAGA CAGAGAACCG GAGATCTCTG GCATGTTTTT GTACCTGGTT TAAGACCAGG 3063

TCAGTTGTAT GGGTACAGGG TGTATGGTCC ATATAAACCA GAGGAAGGGT TAAGGTTTAA 3123

TCCTAATAAA GTACTGATAG ATCCTTATGC AAAAGCTATA AACGGATTAT TACTATGGGA 3183

TGATTCGGTC TTTGGATATA AAATTGGAGA TCAGAACCAG GATCTCAGTT TCGATGAGAG 3243 AAAAGACGAT AAATTTATAC CTAAAGGGGT CATAATAAAT CCTTATTTTG ATTGGGAGGA 3303

CGAGCATTTC TTCTTTAGAA GAAAGATACC TTTTAAGGAT AGTATAATTT ATGAGACACA 3363

TATAAAAGGA ATAACTAAAT TAAGGCAAGA TTTACCGGAG AACGTTAGAG GCACTTTTTT 3423

GGGTTTAGCA TCAGATACTA TGATTGATTA CCTAAAAGAT TTAGGAATTA CAACCGTTGA 3483

GATAATGCCT ATTCAGCAAT TTGTAGATGA GAGATTCATT GTCGATAAAG GGTTAAAGAA 3543

CTACTGGGGT TACAATCCGA TAAATTATTT CTCTCCTGAA TGTAGATACT CAAGCTC 3600 配列番号： 8

配列の長さ ： 556

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

· Suliolobus acidocaldarius

株名： ATCC33909

配列

Met Phe Ser Phe Gly Gly Asn He Glu Lys Asn Lys G!y He Phe Lys

1 5 10 15

Leu Trp Ala Pro Tyr Va 1 Asn Ser Va 1 Lys Leu Lys Leu Ser Lys Lys

20 25 30

Leu He Pro Met Glu Lys Asn Asp Glu Gly Phe Phe Glu Val Glu lie

35 40 45

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275 280 285

Asp Pro Lys 11 e Val Lys Asp Asp Cys G 1 y Tyr Lys lie Asp Ala Gin

290 295 300

Trp Val Asp Asp Phe His His Ala Val His Ala Phe lie Thr Lys Glu 305 310 31S 320

Lys Asp Tyr Tyr Tyr Gin Asp Phe Gly Arg lie Glu Asp lie Glu Lys

325 330 335

Thr Phe Lys Asp Val Pbe Val Tyr Asp Gly Lys Tyr Ser Arg Tyr Arg

340 345 350

Gly Arg Thr His Gly Ala Pro Val Gly Asp Leu Pro Pro Arg Lys Phe

355 360 365

Val Val Phe He Gin Asn His Asp Gin Val Gly Asn Arg Gly Asn Gly

370 375 380

Glu Arg Leu Ser lie Leu Thr Asp Lys Thr Thr Tyr Leu Met Ala Ala 385 390 395 400

Thr Leu Tyr lie Leu Ser Pro Tyr He Pro Leu lie Phe Met Gly Glu

405 410 415

Glu Tyr Tyr Glu Thr Asn Pro Phe Phe Phe Phe Ser Asp Phe Ser Asp

420 425 430

Pro Val Leu lie Lys Gly Val Arg Glu Gly Arg Leu Lys Glu Asn Asn

435 440 445 Gin Met lie Asp Pro Gin Se r Glu Glu Ala Phe Leu Lys Se r Lys Leu

450 455 460

Ser Trp Lys 11 e Asp Glu Glu Va 1 Leu Asp Tyr Tyr Lys Gin Leu 11 e

465 470 4?5 480

Asn lie Arg Lys Arg Tyr Asn Asn Cys Lys Arg Val Lys Gh Val Arg

485 490 495

Arg Glu Gly Asn Cys He Thr Leu He Met Glu Lys He Gly He lie

500 505 510

Ala Ser Phe Asp Asp lie Val lie Asn Ser Lys lie Thr G 1 y Asn Leu

515 520 525

Leu lie Gly 11 e Gly Phe Pro Lys Lys Leu Lys Lys Asp Glu Leu 11 e

530 535 540

Lys Val Asn Arg Giy Val Gly Val Tyr Gin Leu Glu

545 550 555 配列番号： 9

配列の長さ ： 6

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sulfolobus sol {atari cus 株名： KM1

配列

Va 1 11 e Arg Glu Ala Lys

1 5 配列番号： 1 0

配列の長さ ： 6

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 起源

生物： Sul folobus solfataricus 株名： KM1

配列

lie Se r lie Arg Gin Lys

1 5 配列番号： 1 1

配列の長さ ： 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状 配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sul folobus s o 1 f a t a τ i c u s 株名： KM1

配列

He He Tyr Yal Glu

1 5 配列番号： 1 2

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sulfolobus solfataricus 株名： KM1

配列

Met Leu Tyr Yal Lys

1 5 配列番号： 1 3

配列の長さ ： 7

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sul folobus sol f atari cus 株名： KM1

配列

11 e Leu Se r lie Asn Glu Ly s 1 5 配列番号： 1 4

配列の長さ ： 7

配列の型：アミノ酸

^の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 起源

生物： Sulfolobus solfataricus 株名： KM1 配列

Val Val He Leu Thr Glu Lys

1 5 配列番号： 15

配列の長さ ： 10

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sul folobus soliataricus

株名： KM1

配列

Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg Val Lys 1 5 10 配列番号： i 6

配列の長さ ： 12

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Su 1 f 01 obus so 1 f a t a r i cus

株名： KM1

配列

Me t lie 11 e Gly Thr Tyr Arg Leu Gin Leu Asn Lys 1 5 10 配列番号： 17

配列の長さ ： 9

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sul folobus solfataricus

株名： KM1

配列

Val Ala Val Leu Phe Ser Pro lie Val

1 5 9 配列番号： 18

配列の長さ： 11

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sul folobus sol f ataricus

株名： KM1

配列

lie Asn lie Asp Glu Leu lie 11 e Gin Ser Lys 1 5 10 配列番号： 19

配列の長さ： 12

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sulfolobus solfataricus

株名： KM1 配列

Glu Leu Gly Val Ser His Leu Tyr Leu Ser Pro lie 1 5 10 配列番号： 20

配列の長さ ： 7

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

起源

生物： SulfoloDus solfataricus

株名： KM1

配列

Asp Glu Val Phe Arg Glu Ser

1 5 配列番号： 21

配列の長さ ： 4

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sul folobus so 1 f a t a r i cus 株名： KM1

配列

Asp Ty r Phe Lys

1 配列番号： 22

配列の長さ ： 7

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sul folobus solfataricus 株名： KM1

配列

Asp Gly Leu Tyr Asn Pro Lys 1 5 配列番号： 23

配列の長さ ： 8

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメン卜型：中間部フラグメント 生物： Sul f 0 lobus so 1 f a t a r i cus 株名： KM1

配列

Asp 11 e Asn Gly lie Arg Glu Cys 1 5 配列番号： 24

配列の長さ ： 7

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の,：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sul fo lobus solfataricus 株名： KM1 配列

Asp Phe Glu Asn Phe Glu Lys 1 5 配列番号： 25

配列の長さ： 7

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 起源

生物： Sul folobus soli ataricus 株名： KM1

配列

Asp Leu Leu Arg Pro Asn lie 1 5 配列番号： 26

配列の長さ ： 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源

生物： Sul folobus solfataricus 株名： KM1

配列

Asp lie lie G 1 u Asn

1 δ 配列番号： 27

配列の長さ ： 7

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sul f 0 lobus solfataricus 株名： KM1

配列

Asp Asn 11 e Glu Tyr Arg Gly 1 5 配列番号： 2 8

配列の長さ： 1 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 D N A

配列

YTCWCKRAAW ACYTCATC 18 配列番号： 2 9

配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 D N A

配列

GATAAYATWG ARTAYAGRGG 20 配列番号： 3 0

配列の長さ ： 8

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の ：ぺプチド フラグメント型：中間部フラグメント M■ ' Sulfolobus acidocaldarius 株名： ATCC33909

配列

Arg Asn Pro G I u Ala Tyr Thr Ly s 1 5 配列番号： 31

配列の長さ ： 9

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 起源： Sulfolobus acidocaldarius 株名： ATCC33909

配列

Asp His Val Phe Gin Glu Ser His Ser 1 5 配列番号： 32

配列の長さ： 8

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 起源： Su I f 01 obus ac i doca I da r i us 株名： ATCC33909

配列

lie T r Leu Asn Ala Thr Se r Tbr 1 5 配列番号： 33

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント ΐ^Μ： Sulfolobus acidocaldarius 株名： ATCC 33909

配列

He He He Val Glu Lys

1 5 配列番号： 34

配列の長さ ： 11

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

)E£源： Su 1 f 01 obus ac i doca 1 da r i us

株名： ATCC33909

配列

Leu Gin Gin Tyr Met Pro Ala Val Tyr Ala Lys 1 5 10 配列番号： 35

配列の長さ ： 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

起源： Sulfolobus acidocaldarius

株名： ATCC33909

配列 Asn Met Leu Glu Ser

1 5 配列番号： 36

配列の長さ ： 13

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

'. Sul folobus acidocaldarius

株名： ATCC33909

配列

Lys lie Ser Pro Asp Gin Phe His Val P e Asn Gin Lys 1 5 10 配列番号： 37

配列の長さ ： 8

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

起源： Sul folobus acidocaldarius 株名： ATCC33909

配列

Gin Leu Ala G 1 u Asp Phe Leu Ly s

1 5 配列番号： 38

配列の長さ： 10

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の ：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

： Su 1 f 01 obus acidocaldarius 株名： ATCC33909

配列

Lys lie Leu Gly Phe Gin Glu GIu Leu Lys 1 5 10 配列番号： 39

配列の長さ ： 10

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド フラグメント型：中間部フラグメント 源： Suliolobus acidocaldarius 株名： ATCC33909

配列

He Ser Val Leu Ser Glu Phe Pro Glu Glu 1 5 10

配列番号： 40

配列の長さ： 9

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の TO：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

¾ ： Sulfolobus acidocaldarius 株名： ATCC33909

配列

Leu Lys Leu Glu Glu Gly Ala lie Tyr 1 5 配列番号： 41

配列の長さ： 8

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 起源： Sui folobus acidocaldarius 株名： ATCC33909 配列

Glu Va 1 Gin lie Asn Glu Leu Pro 1 5 配列番号： 42

配列の長さ ： 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 源： Sul folobus acidocaldarius 株名： ATCC33909 配列

Asp His Se r Arg lie

1 5 配列番号： 43

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の,：ペプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 源： Sulfolobus acidocaldarius 株名： ATCC 33909 配列

Asp Leu Arg Ty r Ty r Lys

1 5 配列番号： 44

配列の長さ： 14

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 源： Sulfolobus acidocaldarius 株名： ATCC33909 配列 Asp Val Tyr Arg Thr Tyr Ala Asn Gin He Val Lys Glu Cys 1 5 10 配列番号： 45

配列の長さ： 10

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型： N端フラグメント 生物： Sulfolobus solfata〖icus

株名： KM1

配列

Thr Phe Ala Tyr Lys lie Asp Gly Asn Glu

1 5 10 配列番号： 46

配列の長さ ： Ί

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sulfolobus so 1 fatar i cus 株名： KM1

配列

Leu Gly Pro Tyr Phe Ser Gin 1 5

配列番号： 47

配列の長さ ： 7

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の ：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sulfolobus solfataricus 株名： KM1

列

Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly 1 5 配列番号： 48

配歹の長さ ： 19

配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 生物： Sulfolobus solfataricus

株名： KM1

配列

Ty r Asn Ar lie Va 1 lie Ala Glu Se r Asp Leu Asn Asp Pro Arg Va I

1 5 10 15

Va 1 Asn Pro 配列番号： 49

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

起源、： Sulfolobus acidocaldarius

株名： ATCC33909

配列

Leu Asp Ty r Leu Lys

1 5 配列番号： 50

配列の長さ ： 17

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

起源： Sulfolobus acidocaldarius

株名： ATCC33909

配列

Lys Arg Glu lie Pro Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Gin Pro Leu Gly Val 1 5 10 15

His

Π 配列番号： 51

配列の長さ ： 9

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

起源： Sulfolobus acidocaldarius

株名： ATCC33909 配列

Lys Asp Va 1 Phe Va 1 Tyr Asp Gly Lys 1 5 配列番号： 52

配列の長さ ： 9

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 起源： Sul folobus acidocaldarius 株名： ATCC33909

配列

His lie Leu Gin Glu lie Ala Glu Lys 1 5 配列番号： 53

配列の長さ： 10

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 起源： Sulfolobus acidocaldarius 株名： ATCC33909

配列

Lys Leu Tip Ala Pro Ty r Va 1 Asn Ser Va 1 1 5 10 配列番号： 54

配列の長さ ： 7

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント 起源： Sul iolobus acidocaldarius 株名： ATCC33909

配列

Met Phe Ser Phe Gly Gly Asn

.1 5 配列番号： 55

配列の長さ ： 14

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状 配列の種類：ぺプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

· ' sul folobus acidocaldarius

株名： ATCC 33909

配列

Asp Tyr Try Ty r Gin Asp Phe Gly Arg lie Glu Asp 11 e Glu 1 5 10 配列番号： 56

配列の長さ ： 7

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

フラグメント型：中間部フラグメント

起源： Sul folobus acidocaldarius

株名： ATCC33909

Lys lie Asp Ala Gin Trp Va 1

1 5 配列番号： 57

配列の長さ： 18

配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA

配列

AGCWAGKAGM TAYCARCC 18 配列番号： 58

配列の長さ ： 24

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 合成 DNA

配列

YTTHCCATCR TAWACRAAWA CATC 24

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の グル コ ー ス 残基が — 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の 糖を基質 と し 、 そ の還元末端の ひ — 1 ， 4 結合を α — 1 ， α — 1 結合 に 転移 さ せ る 作用 を有す る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ。

2 . すべて の グ ル コ ー ス 残基力く α — 1 , 4 結合で あ る マ ル ト オ リ ゴ糖 を基質 と し 、 そ の 還元末端の α — 1 , 4 結合を — 1 ， α — 1 結合 に 転移 さ せ る 作用 を有す る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ 。

3 . S D S ポ リ ア ク リ ノレ ア ミ ドゲル電気泳動法 に よ る 分子量が約 7 4 0 0 0 〜 7 6 0 0 0 で あ る 、 請求項 1 ま た は 2 に記載の 酵素。

4 . 下記の理化学的性質を有す る 、 請求項 1 〜 3 の いずれか一項 に記載の酵素。

( 1 ) 至適 ρ Η : 4 . 5 〜 6 . 0

( 2 ) 至適温度 ： 6 0 〜 8 0 °C

( 3 ) 安定 p H : 4 . 5 〜 ： L 0 . 0

( 4 ) 温度安定性 ： 8 0 °Cで 6 時間の 処理 に よ り 9 0 %以上残存

5 . 等電点電気泳動法 に よ る 等電点が 5 . 3 〜

6 . 3 で あ る 、 請求項 1 〜 4 の い ずれか一項 に記載の 酵

6 5 m M C u S O で 1 0 0 %阻害 さ れ る 求項 1 〜 5 の いずれか一項 に記載の 酵素。

7 . S u 1 f o l o b a 1 e s 目 の古細菌か ら 得 ら れ る 、 請求項 1 〜 6 の い ずれか一項に 記載の 酵素。

8 . S u 1 f 0 1 o b u s 属 に 属す る 細菌か ら 得 ら れ る 、 請求項 7 に記載の酵素。

9 . A c i d i a n u s 属 に 属す る 細菌か ら 得 ら れ る 、 請求項 7 に記載の酵素。

1 0 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る 細菌力く S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 （ F E R M B P — 4 6 2 6 ) で あ る 、 請求項 8 に記載の酵素。

1 1 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る 細菌が ¾ u l i o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株で あ る 、 請求項 8 に記載の酵素。

1 2 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る 細菌が S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株で あ る 、 請求項 8 に記載の 酵素

.

1 3 . A c i d i a n u s 属 に 属す る 細菌が

A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株で あ る 、 請求項 9 に記載の 酵素。

1 4 . 請求項 1 〜 1 3 の い ずれか一項 に記載の ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ産生能を有す る 細菌を培地 に培養 し 、 培 養物 よ り 、 マ ル ト オ リ ゴ糖を基質 と し て ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖を生成す る 活性を指標 と す る 活性測定法に基づ い て、 該 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを単離精製す る こ と を特徴 と す る 請求項 1 〜 1 3 の い ずれか一項 に記載の ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ の製造法。

1 5 . S u l f o l o b a l e s 目 の古細菌 を培養 す る 、 請求項 1 4 に記載の 製造法。

1 6 . S u 1 f 0 1 o b u s 属 に 属す る 細菌 を培養 す る 、 請求項 1 5 に 記載の製造法。

1 7 . A c i d i a n u s 属 に 属す る 細菌を培養す る 、 請求項 1 5 に記載の 製造法。

1 8 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 （ F E R M B P — 4 6 2 6 ) を培養す る 、 請 求項 1 6 に記載の製造法。

1 9 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株を培養す る 、 請求項 1 6 に記載の製 造法。

.

2 0 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る

S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株を培養す る 、 請求項 1 6 に記載 の 製造法。

2 1 . A c i d i a n u s 属 に 属す る

A c i d i a n u s b r i e r l e y i D S M 1 6 5 1 株を培養す る 、 請求項 1 7 に記載の製造法。

2 2 . 請求項 1 〜 1 3 の い ずれか一項 に記載の酵素 を用 い、 少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の グル コ ー ス 残基が 一 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の糖を基質 と し て 作用 さ せ、 少な く と も 還元末端側 の 3 糖が グル コ ー ス単 位で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の結合が α — 1 ， α — 1 結合で、 該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グル コ ー ス 間 の 結合力く 一 1 ， 4 結合で あ る 糖 を製造す る こ と を特徴 と す る 末端の 2 糖が α — 1 ， a - 1 結合で あ る 糖の 製造法。

2 3 . マ ル ト オ リ ゴ糖各単独 ま た は そ れ ら の 混合物 を基質 と し て用 い る 、 請求項 2 2 に 記載の 製造法。

2 4 . グ ノレ コ シ ル ト レ ノヽ ロ ー ス 、 マ ル ト オ リ ゴ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 等の ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖を製造す る 、 請 求項 2 3 に記載の 製造法。

2 5 . 少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の糖が グル コ ー ス 単位で構成 さ れ る 3 糖以上の 糖を基質 と し 、 還元 末端側か ら 加水分解 し て主 に単糖及 びノ又 は 2 糖を遊離 す.る 活性を有す る 新規 ァ ミ ラ ー ゼ。

2 6 . 少な く と も 還元末端側 の 3 糖が グ ル コ ー ス 単 位で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グル コ ー ス 間の結合力く な 一 1 ， α — 1 結合で、 該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グル コ ー ス 間 の 結合力く α — 1 ， 4 結合で あ る 3 糖以上 の糖を基質 と し 、 2 つ 目 と 3 つ 目 の グル コ ー ス 間 の cr 一 1 ， 4 結合を加水分解 し 、 a , α; — ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 主要な 活性を有す る 請求項 2 5 に記載の 新規 ア ミ ラ ー ゼ。

2 7 . 基質の 分子鎖中 の α — 1 , 4 結合を エ ン ド型 で加水分解す る 活性を 合わせ持つ 、 請求項 2 5 或 い は 2 6 に記載の新規 ア ミ ラ ー ゼ。

2 8 . グ ル コ シ ノレ ト レ ノヽ ロ ー ス 、 マ ノレ ト オ リ ゴ シ ル ト レ ハ ロ ー ス 等の ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖を基質 と し 、 還 元末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ゾレ コ ー ス 間の 一 1 , 4 結合を加水分解 し 、 a , α — ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 活 性を有す る 、 請求項 2 5 、 2 6 或 い は 2 7 に記載の新規 ア ミ ラ ー ゼ。

2 9 . S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動法に よ る 分子量が約 6 1 , 0 0 0 〜 6 4 ， 0 0 0 で あ る 、 請 求項 2 5 〜 2 8 の い ずれか一項 に記載の酵素。

3 0 . 下記の理化学的性質を有す る 、 請求項 2 5 〜 2 9 の い ずれか一項 に記載の 酵素。

( 1 ) 至適 ρ Η : 4 . 5 〜 5 . 5

C 2 ) 至適温度 ： 6 0 〜 8 5 °C

( 3 ) 安定 p H : 4 . 0 〜 1 0 . 0

( 4 ) 温度安定性 ： 8 0 °C で 6 時間の 処理 に よ り 1 0 0 %残存

3 1 . 等電点電気泳動法 に よ る 等電点が 4 . 3 〜 5 . 4 で あ る 、 請求項 2 5 〜 3 0 の い ずれか一項 に記載 の酵素。

3 2 . 5 m M C u S 0 4 で 1 0 0 %阻害 さ れ る 、 請求項 2 5 〜 3 1 の い ずれか一項 に記載の酵素。

3 3 . S u l f o l o b a l e s 目 に属す る 古細菌 か ら 得 ら れ る 、 請求項 2 5 〜 3 2 の い ずれか一項 に記載 の 酵素。

3 4 . S u 1 f 0 1 o b u s 属 に 属す る 古細菌か ら 得 ら れ る 、 請求項 3 3 に 記載の 酵素。

3 5 . S u 1 f 0 1 o b u s 属 に属す る 古細菌力 i u l i o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 （ F E R M B P — 4 6 2 6 ) 或い は そ の変異 株で あ る 、 請求項 3 4 に 記載の酵素。

3 6 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る 古細菌力く S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株或 い は そ の変異株で あ る 、 請求項 3 4 に記載の酵素。

3 7 . S u 1 f 0 1 o b u s 属 に属す る 古細菌力く S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A. T C C 3 3 9 0 9 株或 い は そ の 変異株で あ る 、 請求 項 3 4 に記載の酵素。

3 8 . 請求項 2 5 〜 3 7 の い ずれか一項 に記載の ァ ミ ラ ー ゼを産生す る 能力 を有す る 細菌 を培地 に培養 し 、 培養物 よ り 、 ト レ ハ ロ ー ス オ リ ゴ糖を基質 と し て a , 一 ト レ ハ ロ ー ス を生成す る 活性を指標 と す る 活性測定法 に基づ い て、 該ア ミ ラ ー ゼを単離精製す る こ と を特徴 と す る 請求項 2 5 〜 3 7 の いずれか一項 に記載の ァ ミ ラ ー ゼ の製造法。

3 9 . S u l f o l o b a l e s 目 の古細菌 を培養 す る 、 請求項 3 8 に 記載の ァ ミ ラ ー ゼの 製造法。

4 0 . S u 1 f o l o b u s 属 に 属す る 細菌を培養 す る 、 請求項 3 9 に 記載の ァ ミ ラ ー ゼの製造法。

4 1 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 （ F E R M B P — 4 6 2 6 ) を培養す る 、 請 求項 4 0 に記載の ァ ミ ラ ー ゼの 製造法。

4 2 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る

S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s D S M 5 8 3 3 株を培養す る 、 請求項 4 0 に記載の ァ ミ ラ ー ゼ の製造法。

4 3 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る

S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株を培養す る 、 請求項 4 0 に記載 の.ア ミ ラ ー ゼの製造法。

4 4 . 請求項 2 5 〜 3 7 の い ずれか一項に記載の新 規 ア ミ ラ ー ゼ と 、 少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の グ ル コ ー ス残基力く α — 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の 糖を基 質 と し て そ の 還元末端の な 一 1 ， 4 結合を α — 1 , a - 1 結合 に転移 さ せ る 作用 を有す る ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ と を組み 合わせ て用 い る こ と を特徴 と す る α ， α: — ト レ ハ ロ ー ス の製造法。

4 5 . 該ア ミ ラ ー ゼ及び該 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼを

6 0 〜 8 0 °C で作用 さ せ る 、 請求項 4 4 に記載の 0： ， a - ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

4 6 . 該ア ミ ラ ー ゼ及 び該 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの反 応液中 の 濃度が そ れぞれ 1 . 5 ϋ n i t s /m 1及 び 0 . 1 ϋ n i t /m l 以上で あ る 、 請求項 4 4 或 い は 4 5 に記載の a ， a 一 ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

4 7 . 該 ア ミ ラ ー ゼ及び該 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼの 反 応液中 の 濃度がそ れぞれ 1. 5 Un i t s/m l及 び 1 Un i t/m l 以上で あ り 、 かつ ァ ミ ラ ー ゼ対 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 濃 度比が 0 . 0 7 5 〜 1 0 0 で あ る 、 請求項 4 4 或 い は 4 5 に 記載の α — ト レ ハ ロ ー ス の製造法。

4 8 . 該ア ミ ラ ー ゼ及 び該 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの反 応液中の 濃度がそ れぞれ 1 5 Un i t s/m l及 び 1 Un i t /in 1 以 上で あ り 、 かつ ア ミ ラ ー ゼ対 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 濃度 比が ¾ 〜 4 0 で あ る 、 請求項 4 7 に 記載の な ， α — ト レ ハ. ロ ー ス の製造法。

4 9 . 少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の ダ ル コ 一 ス 残基が α — 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の 糖を基質 と し て用 い る 、 請求項 4 4 〜 4 8 の い ずれか一項 に記載の α α 一 ト レ ハ ロ ー ス の製造法。

5 0 . デ ン プ ン 又 は デ ン プ ン 分解物を基質 と し て用 い る 、 請求項 4 4 〜 4 8 の いずれか一項 に記載の ， 一 ト レ ハ ロ ー ス の製造法。

5 1 . デ ン プ ン 分解物が酸分解或 い は酵素分解 に よ つ て製造 さ れ る デ ン プ ン分解物で あ る 、 請求項 5 0 に記 載の α — ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

5 2 . デ ン プ ン 分解物が枝切 り 酵素を用 い て得 ら れ る も の で る 、 請求項 5 1 に 記載の α ， a - ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

5 3 . 枝切 り 酵素が プル ラ ナ ー ゼ或い は イ ソ ア ミ ラ ー ゼで あ る 、 請求項 5 2 に記載の a , a - ト レ ハ ロ ー ス の製造法。

5 4 . すべて の グル コ ー ス残基力く な 一 1 , 4 結合で あ る マ ル ト ォ リ ゴ糖を各単独又 は そ れ ら の 混合物 と し て 基質 に用 い る 、 請求項第 4 4 〜 4 8 の い ずれか一項 に記 載の α , α — ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

5 5 . 更 に 枝切 り 酵素を組み合わせ て用 い る 、 請求 項 4 4 或い は 4 5 に記載の な ， な 一 ト レ ハ ロ ー ス の製造

. 5 6 . 枝切 り 酵素力く プル ラ ナ ー ゼ或 い は イ ソ ア ミ ラ ー ゼで あ る 、 請求項 5 5 に記載の ， - ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

5 7 . a , α — ト レ ハ ロ ー ス の 製造の い ずれかの 段 階で プル ラ ナ ー ゼ或 い は イ ソ ァ ミ ラ ー ゼを 1 回以上組み 合わせ て用 い る 、 請求項 5 6 に 記載の — ト レ ノヽ ロ ー ス の製造法。

5 8 . a 、 α — ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造の 初期段階で プ ル ラ ナ ー ゼ或 い は ィ ソ ァ ミ ラ ー ゼを 1 回以上組み 合わせ て用 い る 、 請求項 5 7 に記載の a ， a — ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

5 9 . デ ン プ ン 又 は デ ン プ ン 分解物を基質 と し て用 い る 、 請求項 5 5 〜 5 8 の い ずれか一項 に 記載の a , a 一 ト レ ハ ロ ー ス の製造法。 -

6 0 . デ ン プ ン 分解物が酸分解或 い は酵素分解 に よ つ て製造 さ れ る デ ン プ ン 分解物で あ る 、 請求項 5 9 に記 載の a , a — ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

6 1 . デ ン プ ン 分解物が枝切 り 酵素を用 い て得 ら れ る も の で あ る 、 請求項 6 0 に 記載の a , a: — ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

6 2 . 枝切 り 酵素が プル ラ ナ ー ゼ或 い は イ ソ ア ミ ラ ー ゼで あ る 、 請求項 6 1 に記載の ひ ， a - ト レ ハ ロ ー ス の製造法。

6 3 . 該 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ と し て、

S.u 1 f 0 1 o b a 1 e s 目 に 属す る 古細菌 由来の酵素 を用 い る 、 請求項 4 4 〜 6 2 の い ずれか一項 に記載の α a - ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

6 4 . 該 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ と し て、

S u 1 f 0 1 0 b u s 属 に 属す る 古細菌 か ら 得 ら れ る 酵 素を用 い る 、 請求項 6 3 に記載の ， な 一 ト レハ ロ ー ス の製造法。

6 5 . 該 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ と し て、

A c i d i a n u s 属 に 属す る 古細菌か ら 得 ら れ る 酵素 を 用 い る 、 δ · ^項 6 3 に記載の a , 一 ト レ ノヽ ロ ー ス の 製造法 ο

6 6 . 該 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ と し て、

S u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s K M 1 株 （ F E R M B P - 4 6 2 .6 ) 或い は そ の 変異 株力、 ら 得 ら れ る 酵素を用 い る 、 請求項 6 4 に記載の α , α — ト レ ノ、 ロ ー ス の 製造法。

6 7 . 該 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ と し て、

S u 1 f 0 1 0 b u s s o l f a t a r i c u s D S Μ 5 8 3 3 株或 い は そ の 変異株か ら 得 ら れ る 酵素 を用 い る 、 請求項 6 4 に 記載の a , α — ト レ ロ ー ス の 製造法 O

6 8 . 該 ト ラ ン ス フ ェ フ ゼ と し て、

S u 1 f 0 1 0 b u s a c 1 d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株或 い は そ の変異株か ら 得 ら れ る 酵 を用 い る 、 請求項 6 4 に記載の な ， α — ト レ ロ ー ス の 製造法。

6 9 . 該 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ と し て、

A c i d i a n u s b r i e r 1 e y i D S M 1 6 5 1 株或 い は そ の変異株か ら 得 ら れ る 酵素を用 い る 請求項 6 5 に記載の , ー ト レ ハ ロ ー ス の 製造法。

7 0 a*求 - 項 記載の新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼを コ ー ドす る D N A配列 を含ん で な る 、 D N A断片。

7 1 . 前記新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 至適温度が 6 0 〜 8 0 °Cで あ る 、 請求項 7 0 記載の D N A断片。

7 2 . 図 2 6 に示 さ れ る 制 限酵素地図で表 さ れ る 、 請求項 7 0 ま た は 7 1 記載の D N A 断片。

7 3 . 図 2 9 に 示 さ れ る 制限酵素地図で表 さ れ る 、 請求項 7 0 ま た は 7 1 記載の D N A 断片。

7 4 . 配列番号 2 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 ま た は そ の 等価配列 を コ ー ドす る D N A配列 を 含ん で な る 、 D N A 断片。

7 5 . 配列番号 1 に 示 さ れ る 塩基配列の 3 3 5 番か ら 2 5 1 8 番 ま での塩基配列 を含ん で な る 、 請求項 7 4 記載の D N A断片。

7 6 . 配列番号 1 に 示 さ れ る 塩基配列 の 1 番か ら

2 5 7 8 番 ま での塩基配列 を含ん で な る 、 請求項 7 4 記 載の D N A 断片。

7 7 . 配列番号 4 に 示 さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 ま た は そ の.等価配列 を コ ー ドす る D N A配列 を含んで な る 、 D N A 断片。

7 8 . 配列番号 3 に 示 さ れ る 塩基配列 の 8 1 6 番か ら 2 8 5 5 番 ま で の塩基配列 を含ん で な る 、 請求項 7 7 記載の D N A 断片。

7 9 . 配列番号 3 に 示 さ れ る 塩基配列の 1 番か ら

3 4 6 7 番 ま で の塩基配列 を含ん で な る 、 請求項 7 7 記 載の D N A 断片。

8 0 . S u l f o l o b a l e s 目 に属す る 古細菌 由来で あ る 、 請求項 7 0 〜 7 9 の い ずれか一項記載の D N A 断片。

8 1 . S u l f o l o b u s 属 に 属す る 古細菌 由来 で あ る 、 請求項 8 0 に記載の D N A 断片。

8 2 . S u l f o l o b u s

s o 1 f a t a r i c u s K M 1 株 由 来で あ る 、 請求 項 8 1 に記載の D N A 断片。

8 3 . S u l f o l o b u s

a c i d o c a l d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由来で あ る 、 請求項 8 1 に記載の D N A 断片。

8 4 . 配列番号 1 に示 さ れ る 塩基配列 の 3 3 5 番か ら 2 5 1 8 番 ま で の塩基配列、 ま た は そ の相補体 に、 4 0 。C、 5 x S S C の イ オ ン 強度下でハ イ ブ リ ッ ドを形 成 し 、 かつ 少 な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の ダル コ 一 ス残基が α - 1 ， 4 結合で あ る 三糖以上の 糖を基質 と し そ.の 還元末端の - 1 , 4 結合を な - 1 , α - l 結合に 転移 さ せ る 作用 を有す る 新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼを コ 一 ドす る D N A 断片、 お よ び該 D N A 断片 に よ り コ ー ド さ れ る ア ミ ノ 酸配列 を コ ー ドす る D N A 断片。

8 5 . 配列番号 1 に 示 さ れ る 塩基配列の 1 8 8 0 番 か ら 2 2 5 7 番 ま での塩基配列、 ま た は そ の相補体 に、 6 0 。C、 6 x S S P E の イ オ ン 強度下でノヽ イ ブ リ ツ ドを 形成 し 、 かつ少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の ダル コ ー ス残基が - 1 ， 4 結合で あ る 三糖以上の糖を基質 と し 、 そ の還元末端の α - 1 ， 4 結合を α - 1 ， α - l 結 合に転移 さ せ る 作用 を有す る 新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼを コ ー ドす る D N A 断片、 お よ び該 D N A 断片 に よ り コ ー ド さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 を コ ー ドす る D N A 断片。

8 6 . 配列番号 2 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 ま た は そ の 等価配列 を含ん で な る 、 ポ リ ペ プチ ド。

8 7 . 配列番号 4 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 ま た は そ の等価配列 を含ん で な る 、 ポ リ ペ プチ ド。

8 8 . 少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の ダ ル コ 一 ス残基が α - 1 ， 4 結合で あ る 三糖以上の糖を基質 と し そ の還元末端の α - 1 ， 4 結合を α - l 結合 に 転移 さ せ る 作用 を有す る 、 請求項 8 6 ま た は 8 7 に 記載 め ポ リ ペ プチ ド。

8 9 . 前記作用 の 至適温度が 6 0 〜 8 0 °Cで あ る 、 請求項 8 6 〜 8 8 の い ずれか一項記載の ポ リ べ プチ ド。

9 0 . 請求項 7 0 〜 8 5 の い ずれか一項記載の D N A 断片を含ん で な る 、 組換え D N A分子。

9 1 . 請求項 7 0 〜 8 5 の い ずれか一項記載の D N A 断片が プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー に組み込 ま れて な る 、 請求項 9 0 記載の組換え D N A分子。

9 2 . プ ラ ス ミ ド p K T 2 2 で あ る 、 請求項 9 0 ま た は 9 1 記載の組換え D N A分子。

9 3 . プ ラ ス ミ ド p 9 T 0 1 で あ る 、 請求項 9 0 ま た は 9 1 記載の 組換え D N A 分子。

9 4 . 請求項 9 0 〜 9 3 の い ずれか一項記載の組換 え D N A 分子 に よ っ て形質転換 さ れ た 、 宿主細胞。

9 5 . 宿主細胞力く E s c h e r i c h i a 属 ま た は B a c i 1 l u s 属 に 属す る 微生物で あ る 、 請求項 9 4 に 記載の 宿主細胞。

9 6 . 宿主細胞力く E s c h e r i c h i a

c o 1 i J M 1 0 9 株で あ る 、 請求項 9 5 に記載の 宿 主細胞。

9 7 . 少な く と も 還元末端か ら 3 つ以上の ダル コ 一 ス残基が な - 1 ， 4 結合で あ る 三糖以上の 糖 を基質 と し そ の還元末端の 4 結合を α - 1 結合 に 転移 さ せ る 作用 を有す る 組換え新規 ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ の 製造法で あ っ て、

請求項 9 4 〜 9 6 の い ずれか一項記載の 宿主細胞を培 養 し 、 そ の培養物 中 に 前記組換え新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ.を生成 さ せ、 こ れを採取す る こ と を含ん で な る 、 方法

9 8 . 請求項 7 0 ~ 8 5 の い ずれか一項記載の D N A 断片 に よ り コ 一 ド さ れ る 組換え新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ、 ま た は請求項 8 6 〜 8 9 の い ずれか一項記載の ポ リ べ プチ ドを含ん で な る 組換え新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼの 製造法で あ っ て、

請求項 9 4 〜 9 6 の いずれか一項記載の 宿主細胞を培 養 し 、 そ の 培養物中 に前記組換え新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼを生成 さ せ、 こ れを採取す る こ と を含ん で な る 、 方法

9 9 . 少な く と も 還元末端側 の 三糖が グル コ ー ス単 位で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グル コ ー ス 間の結合が α - 1 ， α - l 結合で、 該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間の 結合力く c - 1 ， 4 結合で あ る ト レ ハ ロ ー ス ォ リ ゴ糖 の 製造法で あ っ て、

請求項 9 7 ま た は 9 8 で得 ら れ た組換え新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼを、 少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の ダ ル コ ー ス残基が - 1 ， 4 結合で あ る 三糖以上の 糖 と 接触 さ せ る こ と を含ん で な る 、 方法。

1 0 0 . 請求項 2 5 記載の新規 ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ド す る D N A配列を含ん で な る 、 D N A断片。

1 0 1 . 請求項 2 6 記載の新規ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ド す る D N A配列を含ん でな る 、 請求項 1 0 0 記載の D Ν Α 断片。

1 0 2 . 糖鎖中 の な - 1 ， 4 結合を エ ン ド型で加水 分解す る 活性を有す る 新規ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ドす る D N A配列 を含ん で な る 、 請求項 1 0 0 ま た は 1 0 1 記 載の D N A 断片。

1 0 3 . 前記新規 ア ミ ラ ー ゼが、 ト レ ノヽ ロ ー ス オ リ ゴ糖を基質 と し 、 還元末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の ダル コ ー ス 間 の 4 結合を加水分解 し 、 ， ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 活性を有す る も の で あ る 、 請求項 1 0 0 〜 1 0 2 の い ずれか一項記載の D N A 断片。

1 0 4 . ( 1 ) 糖鎖中 の - 1 ， 4 ダル コ シ ド結合 を ェ ン ド型で加水分解す る 活性、

( 2 ) 少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の糖が ダ ル コ ー ス単位で構成 さ れ、 かつ そ の 結合が α - 1 ， 4 結合で あ る 3 糖以上の 糖を基質 と し 、 還元末端側 か ら 加水分解 し て主 に単糖お よ び Ζま た は 2 糖を遊離す る 活性、 お よ び

( 3 ) 少な く と も 還元末端側 の 3 糖が グル コ ー ス単位 で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グル コ ー ス 間 の結合が α - 1 , a - 1 結合で あ り 、 かつ該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グル コ ー ス 間 の 結合力く α - 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の糖を基質 と し 、 2 つ 目 と 3 つ 目 の ダル コ ー ス 間の 4 結合を加水分解 し 、 α - ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 主要な活性

を有す る 新規ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ドす る D N A 配列 を含ん で な る 、 D Ν Α 断片。

.1 0 5 . 前記新規 ァ ミ ラ ー ゼの 至適温度が 6 0 〜 8 5 °C で あ る 、 請求項 1 0 0 〜 1 0 4 の い ずれか一項記 載の D N A 断片。

1 0 6 . 図 3 4 に 示 さ れ る 制限酵素地図で表 さ れ る 請求項 1 0 0 〜 1 0 5 の い ずれか一項記載の D N A 断片

1 0 7 . 図 3 8 に 示 さ れ る 制限酵素地図で表 さ れ る 請求項 1 0 0 〜 1 0 5 の い ずれか一項記載の D N A 断片

1 0 8 . 配列番号 6 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列、 ま た は そ の 等価配列を コ ー ドす る D N A配列 を含ん で な る 、 D N A断片。

1 0 9 . 配列番号 5 に示 さ れ る 塩基配列 の 6 4 2 番 か ら 2 3 1 5 番 ま での塩基配列 を 含ん で な る 、 請求項 1 0 8 記載の D N A 断片。

1 1 0 . 配列番号 5 に示 さ れ る 塩基配列 の 6 3 9 番 か ら 2 3 1 5 番 ま での塩基配列 を含ん で な る 、 請求項

1 0 8 記載の D N A断片。

1 1 1 . 配列番号 5 に示 さ れ る 塩基配列 の 1 番か ら

2 6 9 1 番 ま での塩基配列を含ん で な る 、 請求項 1 0 8 載の D N A 断片。

1 1 2 . 配列番号 8 に示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列、 ま た は そ の 等価配列を コ ー ドす る D N A配列 を含ん で な る 、 D N A 断片。

1 1 3 . 配列番号 7 に示 さ れ る 塩基配列 の 1 1 7 6 番か ら 2 8 4 3 番 ま で の 塩基配列 を 含んで な る 、 請求項 1. 1 2 記載の D N A 断片。

1 1 4 . 配列番号 7 に 示 さ れ る 塩基配列 の 1 番か ら

3 6 0 0 番 ま で の 塩基配列 を 含ん で な る 、 請求項 1 1 2 記載の D N A 断片。

1 1 5 . S u l f o l o b a l e s 目 に 属す る 古钿 菌 由 来で あ る 、 請求項 1 0 0 〜 1 1 4 の い ずれか一項記 載の D N A断片。

1 1 6 . S u 1 f 0 1 0 b u s 属 に 属す る 古細菌 由 来で あ る 、 求項 1 1 5 記載の D N Α 断片。

1 1 7 . S u 1 f o 1 o b u s

s o 1 f a t a r i c u s K M 1 株由 来で あ る 、 請求 項 1 1 6 記載の D N A 断片。

1 1 8 . S u 1 f o 1 o b u s

a c i d o c a 1 d a r i u s A T C C 3 3 9 0 9 株 由来で あ る 、 請求項 1 1 6 記載の D N A 断片。

1 1 9 . 配列番号 5 に 示 さ れ る 塩基配列 の 6 3 9 番 ま た は 6 4 2 番カ、 ら 2 3 1 5 番 ま での塩基配列、 ま た は そ の相補体 に 、 4 0 。C、 5 x S S C の イ オ ン 強度下でハ ィ ブ リ ッ ド を形成 し 、 かつ 少 な く と も 遠 兀 木 端か ら 3 つ 以上の 糖が グノレ コ ー ス 単位で構成 さ れた 3 糖以上の 糖を 基質 と し 、 ¾兀末端側か ら 加水分解 し て、 主 に単糖お よ び Zま た は 2 糖を遊離す る 活性を有す る 新規ァ ミ ラ ー ゼ を コ ー ドす る D N A 断片、 お よ び該 D N A 断片 に よ り コ ー ド さ れ る ア ミ ノ 酸配列を コ ー ドす る D N A 断片。

1 2 0 . 配列番号 5 に 示 さ れ る 塩基配列の 6 3 9 番 ま た は 6 4 2 番カ、 ら 2 3 1 5 番 ま で の塩基配列、 ま た は そ の相補体 に 、 4 0 。C、 5 X S S C の イ オ ン 強度下でハ イ ブ リ ッ ド を形成 し 、 かつ 、 少な く と も 遠兀末端側 の 3 糖が グ ル コ ー ス単位で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グル コ ー ス 間 の結合が α - 1 ， α - 1 結合で あ り 力、っ該末端側の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グル コ ー ス 間の結合が - 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の糖を基質 と し 、 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間の α - 1 , 4 結合を加水分解 し a , α - ト レ ハ ロ ー ス を 遊離す る 主要 な 活性を有す る 新 規 ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ドす る D N A 断片、 お よ び該 D N A 断片 に よ り コ ー ド さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 を コ ー ドす る D N Α 断片。

1 2 1 . 配列番号 7 に 示 さ れ る .塩基配列 の 1 3 9 3 番か ら 2 1 2 1 番 ま で の 塩基配列、 ま た は そ の 相補体 に 6 0 。C 、 6 x S S P E の イ オ ン 強度下でハ イ ブ リ ツ ド を 形成 し 、 かつ 少な く と も 還元末端力、 ら 3 つ 以上の 糖が グ ル コ ー ス単位で構成 さ れ た 3 糖以上の 糖を基質 と し 、 還 元末端側か ら 加水分解 し て、 主 に単糖 お よ び /ま た は 2 糖を遊離す る 活性を有す る 新規 ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ドす る D N A 断片、 お よ び該 D N A 断片 に よ り コ ー ド さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 を コ ー ドす る D N A 断片。

1 2 2 . 配列番号 7 に 示 さ れ る 塩基配列 の 1 3 9 3 番か ら 2 1 2 1 番 ま で の塩基配列、 ま た は そ の相補体 に 6. 0 °C 、 6 x S S P E の イ オ ン 強度下でハ イ ブ リ ツ ド を 形成 し 、 かつ 少な く と も 還元末端側 の 3 糖が グル コ ー ス 単位で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の ダ ル コ 一 ス 間 の 結合が α - 1 ， a - 1 結合で あ り 、 かつ該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グル コ ー ス 間の結合力く α - 1 ， 4 結 合で あ る 3 糖以上の 糖を基質 と し 、 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間の な - 1 , 4 結合を加水分解 し 、 α , ト レ ノヽ ロ ー ス を遊離す る 主要な 活性を有す る 新規 ァ ミ ラ ー ゼを コ 一 ドす る D Ν Α 断片、 お よ び該 D Ν Α 断片 に よ り コ ー ド さ れ る ア ミ ノ 酸配列 を コ ー ドす る D N A 断片。

1 2 3 . 配列番号 6 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 ま た は そ の 等価配列 を 含ん で な る 、 ポ リ べ プチ ド、 o

1 2 4 . 配列番号 8 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 ま た は そ の 等価配列を 含ん で な る 、 ポ リ ぺプチ ト'、 o

1 2 5 . そ の Ν 末端 に 更 に M e t を有 し て な る 、 請 求項 1 2 3 に記載の ポ リ ペ プチ ド。

1 2 6 . 少な く と も 還元末端側 の三糖力く グル コ ー ス 単位で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ 一 ス 間 の結合が α - 1 , α - 1 結合で、 該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の ダル コ ー ス 間 の 結合力く α - 1 , 4 結合であ る 3 糖以上の 糖を基質 と し 、 2 つ 目 と 3 つ 目 の グル コ ー ス 間の α - 1 ， 4 結合を加水分解 し 、 a , - ト レ ノヽ ロ ー ス を遊離す る 作用 を有す る 、 請求項 1 2 3 〜 1 2 5 の い ずれか一項記載の ポ リ ペ プチ ド。

. 1 2 7 . ( 1 ：) 糖鎮中 の α - 1 , 4 グル コ シ ド結合 を ェ ン ド型で加水分解す る 活性、

( 2 ) 少な く と も 還元末端カヽ ら 3 っ 以上の 糖が グ ル コ ー ス 単位で構成 さ れ、 かつ そ の 結合力く α - 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の 糖を基質 と し 、 還元末端側か ら 加水分解 し て単糖お よ び Ζま た は 2 糖を遊離す る 活性、 お よ び

( 3 ) 少な く と も 還元末端側 の 3 糖が グル コ ー ス単位 で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グル コ ー ス 間 の 結合が α - 1 ， α - l 結合で あ り 、 かつ該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の 結合力く α - 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の 糖を基質 と し 、 2 つ 目 と 3 つ 目 の ダ ル コ ー ス 間の 4 結合を加水分解 し 、 α , ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 主要 な 活性

を 有す る 、 請求項 1 2 3 〜 1 2 5 の い ずれか一項記載の ポ リ ペ プチ ド。

1 2 8 . 作用 の 至適温度が 6 0 〜 8 5 °Cで あ る 、 請 求項 1 2 3 〜 1 2 7 の い ずれか一項記載の ポ リ べ プ チ ド

1 2 9 . 請求項 1 0 0 〜 1 2 2 の いずれか一項記載 の D N A断片を含ん で な る 、 組換え D N A分子。

1 3 0 . 請求項 1 0 0 〜 1 2 2 の い ずれか一項記載 の D N A 断片が プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー に組み込 ま れて な る 請求項 1 2 9 記載の組換え D N A分子。

1 3 1 . プ ラ ス ミ ド p K A 2 で あ る 、 請求項 1 2 9 ま た は 1 3 0 記載の 組換え D N A分子。

1 3 2 , プ ラ ス ミ ド P 0 9 A 1 で あ る 、 請求項

1 2 9 ま た は 1 3 0 記載の組換え D N A分子。

1 3 3 . 請求項 1 2 9 〜 1 3 2 の い ずれか一項記載 の組換え D N A分子 に よ っ て形質転換 さ れた 、 宿主細胞

1 3 4 . 宿主細胞力く E s c h e r i c h i a 属 ま た は B a c i 1 1 u s 属 に 属す る 微生物で あ る 、 請求項

1 3 3 記載の 宿主細胞。

1 3 5 . 宿主細胞力 E s c h e r i c h i a c o 1 i J M 1 0 9 株で あ る 、 請求項 1 3 4 記載の宿 主細胞。

1 3 6 . 組換え新規 ア ミ ラ ー ゼの 製造法であ っ て、 該組換え新規 ア ミ ラ ー ゼが

少な く と も 還元末端側 の 3 糖が グ ル コ ー ス 単位で構成 さ れ、 該末端側 の 1 つ 目 と 2 つ 目 の グ ル コ ー ス 間の 結合 力く α - 1 ， α - l 結合で あ り 、 かつ 該末端側 の 2 つ 目 と 3 つ 目 の グル コ ー ス 間 の 結合力く α - 1 ， 4 結合で あ る 3 糖以上の 糖を基質 と し 、 2 つ 目 と 3 つ 目 の グ ル コ ー ス 間 の α - 1 ， 4 結合を加水分解 し 、 ひ ， ト レ ハ ロ ー ス を遊離す る 主要な 活性

を有す る も の で あ り 、

請求項 1 3 3 〜 1 3 5 の い ずれか一項記載の宿主細胞 を培養 し 、 そ の培養物中 に前記組換え新規ア ミ ラ ー ゼを 生成 さ せ、 こ れを採取す る こ と を含ん で な る 、 方法。

1 3 7 . 請求項 1 0 0 〜 1 2 2 の い ずれか一項記載 の. D N A 断片 に よ り コ ー ド さ れ る 組換え新規 ァ ミ ラ ー ゼ ま た は請求項 1 2 3 ~ 1 2 8 の い ずれか一項記載の ポ リ ぺ プチ ドを 含ん で な る 組換え新規 ァ ミ ラ ー ゼの 製造法で の つ 、

請求項 1 3 3 〜 1 3 5 の い ずれか一項記載の宿主細胞 を培養 し 、 そ の培養物中 に前記組換え新規ア ミ ラ ー ゼを 生成 さ せ、 こ れを採取す る こ と を含ん で な る 、 方法。

1 3 8 . , α - ト レ ノヽ ロ ー ス の製造法で あ っ て、 請求項 1 〜 1 3 の い ずれか一項記載の新規 ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ ま た は請求項 9 7 も し く は 9 8 で得 ら れ た組換 え新規 ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ、 お よ び

請求項 1 3 6 ま た は 1 3 7 で得 ら れ た組換え新規 ア ミ ラ ー ゼ と を 、

少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の グル コ ー ス 残基が a - 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の糖 と 接触 さ せ る 工程を 含ん で な る 、 方法。

1 3 9 . a , a - ト レ ハ ロ ー ス の 製造法であ っ て、 請求項 9 7 ま た は 9 8 で得 ら れ た組換え新規 ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ、 お よ び

請求項 2 5 〜 3 7 の い ずれか一項記載の新規 ァ ミ ラ ー ゼ ま た は請求項 1 3 6 も し く は 1 3 7 で得 ら れた組換え 新規 ァ ミ ラ ー ゼ と を、

少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の グル コ ー ス 残基が a - 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の糖 と 接触 さ せ る 工程を 含.ん で な る 、 方法。

1 4 0 . 少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の グル コ ー ス残基が a - 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の 糖がデ ン プ ン ま た は デ ン プ ン 分解物で あ る 、 請求項 1 3 8 ま た は

1 3 9 記載の方法。

1 4 1 . デ ン プ ン 分解物が、 デ ン プ ン を酸分解、 ま た は酵素分解す る こ と に よ っ て に製造 さ れた も の で あ る 請求項 1 4 0 記載の方法。

1 4 2 . デ ン プ ン 分解物が、 デ ン プ ン の 枝切 り 酵素 に よ る 分解産物で あ る 、 請求項 1 4 0 記載の 方法。

1 4 3 . 枝切 り 酵素が プル ラ ナ ー ゼま た は イ ソ ア ミ ラ ー ゼで あ る 、 請求項 1 4 2 記載の方法。

1 4 4 . 少な く と も 還元末端か ら 3 つ 以上の ダル コ ー ス 残基力く - 1 , 4 結合で あ る 3 糖以上の 糖が、 全て の グル コ ー ス 残基が _α - 1 , 4 結合で あ る マ ル ト オ リ ゴ 糖の単独 ま た は混合物で あ る 、 請求項 1 3 8 ま た は 1 3 9 記載の 方法。

1 4 5 . 5 0 〜 8 5 °Cの 温度で実施 さ れ る 、 請求項 1 3 8 〜 1 4 4 の い ずれか一項記載の方法。

1Z44

反応後

FIG. IB ル ト ト リ オース

33.5Σ3 グルコ シル ト レハロース