WO1988002119A1 - Carrier latex for diagnostic reagent - Google Patents

Description

明 TO

発明の名称

診断試薬用担体ラテッ クス 技術分野

本発明は、 抗原 -抗体反応を利用した免疫血清学的診断ラ テ ッ クスに用いる こ と によ り 、 非特異的凝集反応を著し く低減 させる こ とのでき る診断試薬用の担体ラテッ クスに関する。 背景技術

抗原又は抗体などの血清学的活性物質を担体に感作させ、 血清中の抗体又は抗原を、 ラテッ クスの凝集反応と して検出す る免疫血清学的診断法は、 その簡便性と迅速性の故に、 臨床検 査の分野において多く の種類の抗原又ほ抗体の検出試薬に適用 されている。

この種の試薬において、 抗原又は抗体を感作させる担体と し ては例えばボ リ ス チ レ ン、 ス チ レ ン一ブタ ジエン共重合体ラ テ ッ クスなどの樹脂ラテッ クスが一般に使用されている。 これ らの樹脂ラテッ クスに要求される性能と しては、 安定なェマル ジ ョ ンを形成する こ と、 抗原又は抗体を感作させる段階でラ テッ クスが凝集しないこ と、 感作ざせた抗原又は抗体に対応す る抗体又は抗原を反応させ、 ラテッ クスの凝集を観察する際に 陰性血清と接触しても凝集しないこ と、 即ち非特異的凝集が起 こ らないこ と等が必須の条件とされる。

近年、 免疫血清学的検査の分野において抗原又は抗体などの. 微量物 Kを定性的だけではなく定量的に測定するこ とが重要な 課題となっている。 従来は感作ラテッ クスをガラス板上で検体 と混合し反応させ、 その粒子の凝集状態を肉眼で観察するこ と によつて検査目的物質を定性的に検出していたが、 この凝集状 態を肉 で観察するこ との代り に、 光学的測.定装置、 例え.'ば分 光光度計、 濁度計、 準弾性光散乱測定装置な'どを用いて測定す - る こ と によって定量的に検出しょう とする試みが多く なされて いる。 例えぱ感作ラテッ クス中の粒子が凝集する現象を利用し て上澄液の濁度の減少率を測定する方法及ぴ感作ラテックス中 の粒子の凝集による吸光度や散乱光の変化を測定する方法など が、 口られてレヽ る （ GROATICA CHE ICAACTA, 42 , 457 ( 1970 ) , Immunochemistry ,J_2 , 343 (1975 ) ,特開昭 53 - 24015号公報、 同 54-10949 号公報など） 。

これらの方法ほ感作ラテツクス中の粒子の免疫血清学的凝集 反応による反応系の吸光度、 散乱光強度などの光学的特性の変 ィ匕を測定する こ と によ っ て定量化しよ う と する ものであるが、 いずれの方法も凝集反応に よる反応系の光学的特性の変化が小 さ い ため に精度、 再現性な ど に問題があ っ た。 ま た、 感作ラ テ ッ クスの光学的特性の経時変化がしばしば起こ り 、 実用上支 障を生じる とい う問題もあっ た。

ラ テ ッ ク ス に抗原又は抗体を感作する方法には、 物理的な吸 着によ るものと化学的な結合によるものがある。 一般に用い ら れる物理的な吸着による方法では、 ラテッ クス と抗原又は抗体 との間に吸着解離平衡がある ために、 測定中又は保存中に感作 .された抗原又は抗体がラテッ クスから解離する と い う欠点があ る。 '

したがっ て、 本発明は、 従来から知られている診断試薬用担 体ラ テ ッ ク ス に存在する前述の問題点を解決し、 抗原 -抗体反 応を利用 した免疫血清学的ラ テ ッ ク ス診断試験に用いる非特異 的凝集反応の少ない診断試薬用担体ラテ ッ ク スを提供する こ と、 さ ら には特に吸光度や散乱光強度な どの光学的測定法に適 し た担体 ラ テ ッ ク ス を提供す る こ と を 目 的 と す る も の で あ る。 発明の開示

本発明者らは上述の目的を達成すベく鋭意研究を重ねた結 果、 表面にカルボキシル基を有しかつ芳香族ビニル化合物がグ ラ フ ト結合したエチレ ン · a , β 一エチレ ン性不飽和カルボン 酸 （塩） 共重合体粒子を含むラテックスがかかる 目的を達成す る こ とができ る こ とを見い出し、 本発明に到達した。

すなわち、 本発明は、 カルボキシル基を表面に有しかつ芳香 族ビ二ル化合物がグラフ 卜結合したエチレン · a -, ^3 — ェチレ ン性不飽和カルボン酸 （塩） 共重合体の粒子の懸濁液からなる 診断試薬用担体ラテツ-タスを提供するものである。 ，

前記エチ レ ン · 3 —エチレ ン性不飽'和カルボン酸およ - び/またはその塩共重合体はエチレ ン 6 5 〜 9 8重量％と , 3 —エチ レ ン性不飽和カルボン酸および/またはその塩 2 〜 3 5重量％との共重合体とするのが好ましい。

前記懸濁粒子表面の力ルボキシル基は 0 . 0 1 〜 0 . 3 ni e q/g (粒子） の範囲にするのがよい。

前記懸濁粒子の平均粒子径は 0 . 0 5 〜 1 μ πιと し、 前記ラ テッ クスの懸濁粒子の比重は 1 以上どするのが好適である。

前記ラテッ クスの固形分含有率ほ 5 〜 4 5重量％とするのが 奸ましい。 前記 α , 3 —エチレ ン性不飽和カルボン酸は、 アク リ ル酸、 メ タ ク リ ル酸、 ィ タ コ ン酸、 マ レイ ン酸、 およびフマル酸よ り なる群よ り選ばれた 1 種以上のカルボン酸およびノま たはこ れ らのナ ト リ ウム塩、 カ リ ウム塩、 マグネ シ ウム塩、 カルシ ウム 塩、 バ リ ウム塩、 および亜鉛塩よ り なる群よ り 選ばれた 1 種以 上の金属塩とするのが好ま しい。

前記グラ フ ト 結合させる芳香族ビニル化合物はスチ レ ン、 x —メ チルスチレ ン、 ビニル ト ルエン、 およびェチルスチレ ン よ り なる群よ り選ばれた 1 種以上と し、 そのグラ フ ト割合は前 記エチレ ン ♦· α , ；3 —エチレ ン性不飽和カルボ'ン酸およびノま たはその塩共重合体 1 0 0 重量部に対して 1 0 0 〜' 9 0 0 重量 部と し、 そのメ ル ト フ口一レー ト （ 1 9 0 t；、 2 . 1 6 K S荷 重で測定） は 5 0 〜 7 0 0 g/ 1 0 m i π とするのが好ま しい。 図面の簡単な説明

第 1 図は、 実施例 1 の試料番号 1 〜 5及び比較例 1 で得た 担体ラテ ツ クス に抗 A F P 抗体を感作させた感作ラテ ツ クスの凝 集反応に対する抗原濃度と散乱光強度との関係を示す。 発明の詳細な説明

次に、 本発明の診断試薬用担体ラテッ クスについて更に詳 細に説明する。

本発明の診断試薬用担体ラテツ クスは、 カルボキシル基を表 面に有しかつ芳香族ビュル化合物がグラ フ 卜結合したェチレ ン . α , ;3 —エチ レン性不飽和カルボン酸 （塩） 共重合体の粒 子の懸濁液であり、 さらに具体的にほ工チレン · α , —ェチ レン性不飽和カルボン酸 （塩） 共重合体の懸濁粒子に芳香族ビ ニル化合物をグラフ 卜結合させるこ と によって得られる。

こ こ で、 ェチレ .ン · α ， 3 —.'ェチ レ.ン性不飽和カルボン酸 (塩） 共重合体ほ通常ェチレン 6 5 ないし 9 8重量％、 好ま し - く は 8 0 ないし 9 8重量％と α , /3 —エチレ ン性不飽和力ルポ ン酸 （塩） 2 ないし 3 5重量％、 好ま しぐは 2 ないし 2 0重量 %と の共重合体である。

α , 3 -エチレ ン性不飽和カルボン酸 （塩） と しては、 α ， β 一エチレ ン性不飽和カルボン酸、 その塩あるいはそれらの混 合成分か らなる ものであ り 、 例えばアク リ ル酸、 メ タ ク リ ル 酸、 ィ タ コ ン酸、 マ レイ ン酸、 フマル酸などの x , ;3 —ェチレ ン性不飽和カルボン酸、 これらのナ ト リ ウム塩、 カ リ ウム塩、 マグネ シウム塩、 カルシウム塩、 ノ リ ウム塩、 亜鉛塩などの金 属塩などを例示する こ とができ るが、 メ タ ク リ ル酸ま たはその 塩が好ま しい。 該共重合体はェチ レ ン · α , y3 —ヱチ レ ン性不 飽和カルボン酸共重合体の中和物ま たは部分中和物であっ ても よい。

ま た、 芳香族ビニル化合物をグラ フ ト結合させる前の該共重 合体のメ ル ト フローレー ト （ 1 9 0 ° (： 、 2 . 1 6 K g の荷重で 測定） は通常 5 0 なレ、 し 7 0 0 g/ 1 0 min 、 好ま し く は 1 0 0 なレヽ し 6 0 0 g/ 1 0 rain の範囲である。

ま た、 芳香族ビニル化合物をグラ フ ト結合させる前のェチ レ ン . < , - エチ レ ン性不飽和カ ルボ ン酸 （塩） 共童合体懸濁 液中の該共'重合体の粒子の平均粒子径は通常 0 . 0 3 ない し . 1 m , 好 ま し く は 0 . 0 4 ない し 0 . 8 μ πι の範囲であ る。

ま た、 本発明の診断試薬用担体ラテ ッ クスの懸濁液粒子を構 成する芳香族ビュル化合物のグラ フ ト割合は該ェチ レ ン ♦ , /3 -エチ レ ン性不飽和カルボン酸 （塩） 共重合体 1 0 0 重量部 に対して通常 1 0 0 ない し 9 0 0 重量部、 好ま し く は 2 0 0 な い し 8 0 0重量部の範囲である。 芳香族ビニル化合物と して ほ、 例えばス チ レ ン、 α — メ チルス チ レ ン、 ビニル ト ルエン、 ェチルスチ レ ンなどを挙げる こ とができ る。 また、 本発明の診断試薬用担体ラテッ クスの懸濁粒子の平均 粒子径は通常 0 . 0 5 〜 1 m、 好ま し く は 0 . 1 なレヽ し 0 . 3 mであり、 その粒子径分布が狭いものが好ま しい。 ま た、 該診断試薬用担体ラテツ クスの固形分含有率は通常 5 ない し 4 5重量％、 好ま し く は 1 0 ないし 3 5重量％の範囲であ る。

また.、 該担体ラテツクスは一般にその後の感作操作あるいは 感作ラテッ クスの分離に遠心分離操作を行う こ とが多いため、 該担体ラテツ クスの懸濁粒子の比重は通常 1 以上、 好ま しく は 1 . 0 ないし 1 . 1 の範面である。 .

本発明の診断試'薬用担体ラテッ クスの懸濁粒子ほ抗原又ほ抗 - 体などの免疫血清竽的活性物賞を化学的に結合し得る力ルボキ シル基を表面に有しており、 その量ほ該懸濁粒子表面の力ルポ キシル基が通常 0 . 0 1 なぃし 0 . 3 m e q/g (粒子） 、 好まし く は 0 . 0 2 ないし 0 . 1 m e q/g (粒子） の範囲である。 カル ボキシル基含有量が少なく なる と非特異的凝集を起こ し易く な り、 カルボキシル基の含有率が多く なる と、 凝集反応性が低下 し感度が低下する という傾向がある。 なお、 該担体ラテッ クス の懸濁液粒子表面に存在するガルボキシル基の含有量はジョ ン ヘン によって開発された測定方法によって求めるこ とができる ( Journal of Colloid and Interface Science , 4_9 , 425 (1974)〕 。

次に、 本発明の診断試薬用担体ラテッ クスの製法について説 明する。

例えば、 該エチレ ン · . ^ —エチ レ ン性不飽和カルボン酸

(塩） 共重合体の懸濁液と該懸濁液中の固形分 1 0 0 重量部に 対して 1 0 0〜 9 0 0 重量部の範囲の芳香族ビニル化合物を舍 む 5 0〜 1 0 0 °Cの水中に、 過硫酸塩水溶液を加え、 1 〜 6時 間でグラ フ ト重合する方法を挙げる こ とができ る。 過硫酸塩と しでは、 ί列えば:過硫酸アンモニゥム、 過硫酸ナ ト リ ウ ^、 過硫 酸カ リ ウムを挙げる こ とができ、 その使用量は芳香族ビュル化 合物に対して、 0 . 1 〜 5重量％が好ま しい。 重合温度は ⁵ 0 〜 ： I 0 0 が好ま し く 、 特に 7 0〜 9 0 でが好ま しい。 重合終 了後に必要に応じて脱单量体のための減圧蒸留も し く は濃度調 整のための希釈又は濃縮を行う こ と ができ る。

本発明の診断薬用担体ラテッ クスに抗原又は抗体な どの免疫 血清学的活性物質を化学的に結合 （感作） させる方法と しては 従来から知られている方法を採用する こ とができ る。 発明を実施するための最良の形態

以下に実施例によ り、 具体的に説明するが、 本発明は、 下 記実施例に限定されるものでほない。 なお、 ラテッ クスに抗体 を感作させる方法及び感作ラテッタスの凝集感度の測定は以下 の方法によ り行った。 ·

(1) ラテッ クス感作法

抗 ラテッ クス試薬の調製

樹脂ラテ ッ クスを リ ン酸緩衝液に懸濁させ、 固形分濃度 5 %の懸濁液を 0 . 2 5 m J2調製する。 この懸濁液に抗 AFP ゥ サギ血清より調製した IgG .分画 1 m g、 .'水溶性カルボジィ ミ ド

5 m g を加え、 P H 5 に し、 氷冷下 1 時間攪拌し、 IgG -をラ . テッ クス表面に化学結合させる。 次に、 グリ シンを加え、 P H 8 に し、 遠心分離処理 （ 20， 000 rpm 、 3 0分間） 後、 上澄液 を と り 、 七 ト 血清アルブミ ン 3 重量％を含むグリ シン緩衝液 ( P H 8 . 2 ) に再分散させ、 固形分濃度 0 . 1 %の感作ラ テッ クス とする。

(2)凝集感度の測定法

上記感作ラテッ クス 5 ひ μ ^ をゥシ血清アルブミ ン 1 重量 %を含むダリ シン緩衝液 ( Ρ Η 8 . 2 ) 1 5 0 μ で希釈し、 所定の濃度の AFP を含む試料 1 0 ^ を加え攪拌混合したの ち、 室温で 3 0 分間反応させる。 光散乱測定装置でこ の混合液 の散乱強度を測定し、 A F P 濃度と散乱強度と の関係を得る。 実施例 1

アイオノ マー · デイ スパージ ョ ンの製造

メ タク リ ル酸 1 0 重量％を含むエチ レ ン — メ タ ク リ ル酸共重 合体 1 0 0 g を ト ルエン 3 3 0 g及びイ ソ ブロ ビルアルコール 2 2 0 s からなる混合物中で 7 5 t に加熱する こ と によ り 溶解 した。 こ の溶液をホモ ミ キサー中で水酸化ナ ト リ ウム 0 . 7 8 g を含む蒸留水 2 5 0 S に加え、 1 0 〜 2 0 -分間攪拌を行'つ た。 この懸濁液から減圧下 ト ルエン及びイ ソプロピルアルコ一 - ルを除去し、 固形分濃度を 3 0 %に調整した。 第 1 表に示すよ う に、 油層の重合体濃度及び ト ルエン と ィ ソ ブロ ビルアルコー ルの重量比を変え る こ と に よ り 、 粒子径の異なるデイ スパー ジ ョ ンを得た。

試 料 名 A B C 油層の組成 1 0 0 •8 0 1 0 0

エチ レ ン、 メ タク リ ル酸共重合体（g) 3 3 0 3 3 0 3 8 5

ト ルエン （ g ) 2 2 0 2 2 0 1 6 5

イ ソプロ ビルァルコール（g)

水層の組成

水酸化ナ 卜 リ ウム （g) 0 . 7 8 0 . 6 2 0 . 7 8 蒸留水（S) 2 5 0 2 5 0 2 5 0 1 平均粒子径 0 . 1 6 0 , 1 0 0 . 2 4

ァィオノ マー . デイスパージ ョ ンのスチ レ ングラフ ト重合 第 2表に示した組成の前記アイ オノ マ一 ♦ デイ スパージ ョ ン、 スチ レ ン、 蒸留水か ら なる混合物を 8 0 で に加熱し、 過流 酸カ リ ウ ムを含む蒸留水 5 0 sを加え、 8 0 °Cで 2時間攪拌し 重合を行っ た。 得られた重合体粒子ラ テ ッ ク スか ら減圧蒸留で 未反応ス チ レ ンを除去した。 得られた重合体粒子の平均粒子径 及び表面カルボキシル基の量を第 2表に示す。

第 2 表 実 施 例 1

■■試 料 ¾· ■ 万 1 2 " ' 3 4 5 原料ディスパージョ ン A A B C

原料ディスパージ a ン （g) 6 7 1 0 0 - 1 0 0 1 0 0 スチレン （g) 8 0 7 0 7 0 7 0 蒸留水 （g) 1 0 3 8 0 8 0 8 0 過硫酸力リ ゥム （S) 0. 4 0. 3 5 0 · 3 5 0. 3 5 平均粒子径 0. 1 9 0. 1 7 0. 1 2 0， 2 6 表面の力ルボキシル基の量 0 , 0 4 0. 0 8 0. 0 7 0. 0 5

(meq/g) ό ο

O C con i

比較例 1

スチ レ ン ♦ メ タ ク リ ル酸共重合体粒子ラテ ッ クスの製造

蒸留水 1 5 0 S を撹拌しながら 8 0 で に した。 次にスチレ ン 9 8 g及びメ タク リ ル酸 2 さからなる混合物及び過硫酸カ リ ゥ ム 0 . 5 gを含む蒸留水 5 0 g を同時に 1 0時間かけて連続的 に添加した。 添加終了後、 さ ら に 2時間攪拌し重合を完結させ た。 得られた重合体粒子ラテッ クスから減圧蒸留で未反応単量 体を除去した。 得られた重合体粒子の平均粒子径は 0 . 2 0 μ m , 表面の カ ルボキ シノレ基の量は 0 . 0 6 meq/g で あ つ た。 - ' ' ' .. 実施例 1 及び比較例 1 で得られた担体ラテ ッ クス に前述の - ( 1 ) ラ テ ッ ク ス感作法の方法に従っ て抗 AFP 抗体を感作さ せ、 感作ラテッ クスを得、 前述の （ 2 ) 凝集感度の測定法の方 法で凝集感度を測定した。 結果を第 1 図に示す。

第 1 図から実施例 1 の試料番号 1 〜 5 で得たラテ ッ クスを使 用した感作ラテッ クスは AFP 濃度によっ て散乱光強度が大き く 変化している こ とがわかる。 こ れに対して比較例 1 のラテッ ク スを使用した感作ラテッ クスは AFP 濃度による散乱光強度の変 ィ匕が小さいこ とがわかる。 産業上の利用可能性

本発明の診断試薬甩担体ラテ ッ ク スを用いて調製ざれた診断 試薬用担体ラテッ ク ス、 即ち感作ラテ ッ クスは非特異的凝集が 少なくかつ特異的凝集の感度が高く、 特に光学的測定法による 診断システム に最適である。

Claims

請求の範囲

( 1 ) カルボキシル基を表面に有しかつ芳香族ビニル化合物が グラ フ 卜結合したエチ レ ン ♦ な， /3 —エチ レ ン性不飽和カルボ ン酸およびノまたはその塩共重合体の粒子の懸濁液からなる診 断試薬用担体ラテッ クス。

( 2 ) 前記エチ レ ン · a , /3 -エチ レ ン性不飽和カルボン酸お よび/ま た はその塩共重合体はエチ レ ン 6 5 〜 9 8重量％ と a , β —エチレ ン性不飽和カルボン酸およびノま たはその塩 2〜 3 5重量％との共重合体である請求の範囲第 1 項に記載の 診断試薬用担体ラテ ックス。 '， ' ' .

( 3 ) 前記懸濁粒子表面のカルボキシル基は 0 . 0 1 〜 0 . 3 - m e q / g (粒子） の範囲である請求の範囲第 1 項に記載の診断試 薬用担体ラテ ッ クス。

( ) 前記懸濁粒子の平均粒子径は 0 . 0 5〜 1 μ mである請 求の範囲第 1 項に記載の診断試薬用担体ラテ ッ クス。

( 5 ) 前記ラテッ クスの固形分含有率は 5〜 4 5重量％である 請求の範囲第 1 項に記載の診断試薬用担体ラテ ッ クス。

( 6 ) 前記ラテツ クスの懸濁粒子の比重は 1 以上である請求の 範囲第 5項に記載の診断試薬用担体ラテ ッ クス。

( 7 ) 前記な， /3 —エチレ ン性不飽和カルボン酸およびノまた は塩ほ、 アク リ ル酸、 メ タク リ ル酸、 ィタ コン酸、 マレイ ン 酸、 およびフマル酸より なる群より選ばれた 1 種以上の力ルボ ン酸および Zまたはこれらのナ ト リ ウム塩、 カ リ ウム塩、 マグ ネシゥム塩、 カルシウム塩、 ノ リ ウム塩、 および亜鉛塩よ り な る群よ り選ばれた 1種以上の金属塩である請求の範囲第 2項に 記載の診断試薬用担体ラテックス。

( 8 ) 前記芳香族ビニル化合物をグラフ ト結合させる前の共重 合体のメ ルト フローレ一ト （ 1 9 0 、 2 . 1 6 K s荷重で測 定） は 5 0 〜 7 0 0 g/ 1 0 m i n である請求の範囲第 1 項に記載 - の診断試薬用担体ラテッ クス。

( 9 ) ·前記グラ フ ド結合させる芳香族ビニル化合物はス 'チレ - ン、 α —メ チルスチレ ン、 ビニル トルエン、 およびェチルスチ レ ンより なる群よ り選ばれた 1種以上である請求の範囲第 1 項 に記載の診断試薬用担体ラテッ クス。

( 1 0 ) 前記芳香族ビニル化合物のグラフ 卜割合ほ前記ェチ レ ン * α， -エチレン性不飽和カルボン酸および/またはその 塩共重合体 1 0 0重量部に対して 1 0 0 〜 9 0 0重量部である 請求の範囲第 S項に記載の診断試薬用担体ラテッ クス。