WO1986004605A1 - Human granulocyte colony stimulating factor - Google Patents

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WO1986004605A1
WO1986004605A1 PCT/JP1986/000052 JP8600052W WO8604605A1 WO 1986004605 A1 WO1986004605 A1 WO 1986004605A1 JP 8600052 W JP8600052 W JP 8600052W WO 8604605 A1 WO8604605 A1 WO 8604605A1
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polypeptide
stimulating factor
ctg
granulocyte colony
human granulocyte
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PCT/JP1986/000052
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French (fr)
Inventor
Masayoshi Ono
Hitoshi Nomura
Masahiko Tamura
Masahiko Matsumoto
Tatsumi Yamazaki
Osami Yamamoto
Yuichi Hirata
Yasuo Sekimori
Masayuki Tsuchiya
Shigekazu Nagata
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Definitions

  • the present invention relates to a human granulocyte colony stimulating factor, and particularly to a specific stimulating factor required mainly for colony formation of human granulocyte cells, namely, a colony stimulating factor (hereinafter, “CSF”).
  • CSF colony stimulating factor
  • the present invention relates to an infection preventive agent comprising a polypeptide or glycoprotein as an active ingredient and CSF as active ingredients.
  • granulocyte neutrophil granulocyte
  • CSF This factor is normally widely distributed in cells, such as T cells, monocyte macrophages, fibroblasts, It is known that it is produced by endothelial cells and the like.
  • CSF has granulocytes.
  • ⁇ Acts on stem cells of monocyte macrophages, stimulates their proliferation and induces differentiation, and consists of granulocytes and monocyte macrophages in agar.
  • Granulocytes having the action of forming colonies-monocyte macrophage CSF (abbreviated as GH-CSF), mainly forming the colonies of monocyte macrophages Monocyte macrophage CSF (abbreviated as -CSF), pluripotent CSF acting on more undifferentiated pluripotent stem cells (abbreviated as fflUlti-CSF), or the present invention.
  • GH-CSF colonies-monocyte macrophage CSF
  • -CSF monocyte macrophage CSF
  • fflUlti-CSF pluripotent stem cells
  • the phagocytic killing of leukocytes is considered to have the strongest effect on the host's defense functions.
  • CHU-1 was established (CNH accession number “1 — 315”), and was used to isolate pure human CSF, which exhibits human neutrophil-promoting colony formation activity, from the culture supernatant of this cell line. It was the first successful (Japanese Patent Application No. 59-153273).
  • the present inventors examined the protective effect of the human G-CSF on the infection using an infected animal model, and found that the human G-CSF had a remarkable ability to mature neutrophils in vivo.
  • the present inventors have found that the cell line is effective as a therapeutic drug for infectious diseases from the fact that it exhibits an infection protective effect.
  • the method of isolating 3-CSF from the culture supernatant using the cell culture method is based on the fact that only low concentrations of G-CSF are produced, and that a small amount of G-CSF can be obtained from a large amount of culture.
  • a large amount of uniform G-.CSF has not yet been obtained, and therefore, large quantities of G-CSF are produced using replacement DNA technology. It was desired to do so.
  • the present invention provides a gene encoding a polypeptide having human G-CSF activity.
  • the present invention also provides a replacement vector incorporating the gene.
  • the present invention also provides a transformant obtained by transforming a host with the recombinant vector, and a polypeptide or glycoprotein produced by the transformant.
  • the present invention further provides an infection protective agent comprising human G-CSF as an active ingredient.
  • Figure 1 shows the sequence of the probe (IWQ), probe (A) and probe (LC).
  • Figure 2 shows the nucleotide sequence of the PHCS-1 insert.
  • Figure 3 (A) shows the nucleotide sequence of BRG4 cDNA insert.
  • FIGS. 3 (B) and (I) show the amino acid sequence of the human G-CSF precursor performed from PBRG4 CDNA.
  • Figure 3 (B) (I) shows the amino acid sequence of human mature G-CSF, which was derived from PBRG4 CDNA.
  • FIG. 4 (A) shows the nucleotide sequence of the cDNA insert of PBRV2.
  • FIG. 4 (B) (I>) shows the amino acid sequence of the human G-CSF precursor, which was performed from PBRV2 CDNA.
  • FIG. 4 shows the amino acid sequence of human mature G-CSF performed from PBRV2 CDNA.
  • FIG. 5 shows the restriction enzyme cleavage sites of human G-CSF CDNA derived from PBRG4 or f) BRV2.
  • Figure 6 shows part of the process for preparing a vector containing the tac promoter (+ VSE system).
  • Figure 7 shows the process for preparing a synthetic PL promoter-containing vector '' (+ VSE system).
  • Figure 8 shows the process for preparing the vector containing the trp promoter (+ VSE system).
  • Figure 9 shows part of the process for preparing a vector containing the tac promoter (-VSE system).
  • Figure 10 shows the process for preparing a vector containing a synthetic PL promoter. Indicates (— VSE series).
  • Figure 11 shows the process for preparing the vector containing the trp promoter (-VSE system).
  • Figure 12 shows the schematic structure of PHGA410.
  • Figure 13 shows the construction process of the recombinant vector for expression f) TN-G4.
  • Figures 14a and 14b show the process of construction of pHGG4-dhfr.
  • Figure 15 shows the schematic structure of PHGV2.
  • FIG. 16 shows the process for constructing the expression vector pTN-V2.
  • FIG. 17a and FIG. 17b show the process of constructing the expression vector PHGV2-dhfp.
  • the gene encoding a polypeptide having human G-CSF activity according to the present invention has a human G-CSF activity obtained as a 15-17S fraction by sucrose density gradient centrifugation.
  • ⁇ is a DNA (cDNA) that is complementary to messenger RNA (mRNA) that encodes the polypeptide
  • One of the series of cDNAs has the gene encoding the polypeptide I or II shown in FIG. 3 (B) or a part thereof, and is described in more detail in FIG. ) Of the base sequence from the ATG at the 32 to 34 nucleotide position to the CCC at the 650 to 652 nucleotide position from the terminal, from the ACC at the 122 to 124 position to the CCC at the 650 to 652 position.
  • the sequence or the sequence described in Figure 3 (A) or Having a part of This series of cDNAs is called CDNA (+ VSE).
  • the other series of cDNAs have the gene encoding the polypeptide I or II of FIG. 4 (B) or a part thereof, and more specifically, the nucleotide sequence of FIG. 4 (A).
  • 5 ' Sequence from ATG at nucleotide positions 31 to 33 to CCC at nucleotide positions 640 to 642, and ACC from CACC at positions 121 to 123 to CCC at positions 640 to 642 It has the sequence shown in FIG. 4 (A) or a part thereof.
  • This series of cDNAs is called cDNA (—VSE).
  • the gene of the present invention is prepared, for example, by preparing G-CSF-encoding mRNA from a mammalian cell or the like having the ability to produce a polypeptide having G-CSF activity, by a known method. It can be obtained by conversion to main-chain CDN A.
  • the above-mentioned mammalian cell as a source of mRNA is a human oral cancer-derived cell line CHU-2 (Colection).
  • CNC H Nationala Ie OeCutures DeHicroorganismes (CNC H) ⁇ ft I-483), but not only tumor cell lines, but also cells that can be isolated from mammals or other established cells It may be a cell line.
  • preparation of 1D RNA is already used in the cloning of several other physiologically active protein genes, such as liponucleases such as the panadmium complex. Perform surfactant treatment and fluorinating treatment in the presence of creatinine inhibitor (with Berger
  • RNA can be obtained by the affinity column method or the patch method used.
  • Poly (A + ) RNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
  • the mRNA obtained as described above encodes a polypeptide having G-CSF activity
  • the mRNA is translated into protein and the biological activity is determined. It may be examined or a method of identifying the protein using an anti-G-CSF antibody may be used.
  • the transfection is performed by injecting BiRNA into an oocyte of an African frog (Xenopus laevis) (Gurdon et al .;
  • the assay for G-CSF activity can be performed by applying a soft agar culture method using bone marrow cells. There is a review on these methods (Hetca If; “Hemopoietic Colonies", Springer-Ver Iag, Berl in, Heidei bepg, NY (1977) ⁇
  • double-stranded cDNA is synthesized from the single-stranded cDNA and exchanged with an appropriate vector DNA. Create a code. This transforms Escherichia coli and the like,
  • cDNA library DNA group (hereinafter, referred to as cDNA library)>.
  • double-stranded cDNA from mRNA for example, 3'-end of mRNA Oligos (dT) complementary to the poly A-chain at the site are treated with reverse transcriptase as a primer or correspond to a part of the amino acid sequence of G-CSF protein.
  • a synthetic oligonucleotide is synthesized and treated with reverse transcriptase as a primer to synthesize a cDNA complementary to the mRNA.
  • the double-stranded cDNA degrades the mRNA by alkaline treatment ⁇ After removal, the resulting single-stranded cDNA is treated with reverse transcriptase or DNA polymerase (for example, Klenow fragment), and the S1 nucleic acid is removed. It can be obtained by treating with rarease or the like, or directly by treating with RNase H and DNA polymerase (for example, E. coli polymerase I). (For example,
  • the double-stranded cDNA obtained in this manner is converted to a suitable vector, for example, PSC101, pOF41, Col E1, pMB9, pBR322, pBR327,
  • EK-type plasmid vector represented by PACYC1 or phage vector represented by gt, ⁇ c, ⁇ gt10, ⁇ gtWES, etc. and then E. coli (X1776; HB101: DH1 , C600 strain) can be obtained to obtain a cDNA library (for example, see “Molecular cloning” above).
  • a double-stranded cDNA to a vector, an appropriate chemically synthesized DNA fragment is added so that a ligable end can be added to the end, and the vector is cleaved in advance using a restriction enzyme! ) And TTP phage DNA ligase in the presence of ATP.
  • a vector previously cleaved with a restriction enzyme -Alternatively, after adding dG, dC- (or dA, dT-) to each of ONA and double-stranded cDNA, for example, by slowly cooling the solution containing both DNAs. (See Molecular cloning above).
  • Transformation of the host cell with the recombinant DNA thus obtained is carried out, for example, by the method described in detail by Hanahan when the host cell is Escherichia coli (J. Hol. Biol .: Vol. 557 (1983)). )), That is, by adding the recombinant DNA to a recombinant cell prepared in the presence of CaC 2 , HgC 2 or R () Cil.
  • the plus-minus method (Taniguchi et al .; Proc. Jpn. Acad. 55, Ser. B, p. 464 (1979)), the hybridizing-translation method (Nagata et al .: Nature_H, p. 316 (1980)), or the amino acids of the protein.
  • Colony or black hybridisation method using a synthetic nucleotide probe chemically synthesized based on an acid sequence (Wallace et al .; Nucleic Acids Res., T, 879 (1981)) ) May be used.
  • a fragment containing a gene encoding a polypeptide having the human G-CSF activity cloned in this way can be reincorporated into an appropriate vector DNA.
  • other prokaryotic or eukaryotic host cells can be transformed.
  • the gene can be expressed in each host cell. Can be expressed.
  • Prokaryotic host cells include, for example, Escherichia coli, Baci llus subt i Ms, Baci l lus theriuophi Ius, and the like.
  • the host cell may be transformed with a replicon derived from a species compatible with the host, ie, a plasmid containing the origin of replication and regulatory sequences. It is also desirable that the vector has a sequence that can impart phenotypic (phenotypic) selectivity to the transformed cells.
  • E. coli is a vector that uses it as a host.
  • PBR322 Bactet al .
  • PBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance, and it is possible to identify transformed cells by using either of these resistances.
  • Examples of promoters required for gene expression in prokaryotic hosts include the following: / 3 — Lactamase gene promoter (Chang et al .: Nature_ ⁇ vol. 615, p. 615 (1978)), lactose promoter
  • examples of host cells for eukaryotic microorganisms include Saccharorayces ce revisaiae, and plasmid YRp7 (Stinchcomb et al .; see Nature, Vol. 282, 39 (1979)). Can be used for transformation.
  • This plasmid has the TRP1 gene, which serves as a selection marker for yeast strains lacking the ability to produce tributaphan, and can be grown in the absence of tributaphan.
  • promoters that can be used for gene expression from which transformants can be selected include acid phosphatase gene promoters (Hiyanohara et al .: Proc. Natl. Acad. Sc). USA _ ⁇ _ volume 1 (1983)) and alcohol dehydrogenase gene promoter-(Valenzuela et al .; Nature 298, 347 (1982)).
  • Mammalian cell-derived hosts and cells include COS cells, Chinese hamster ovary (CH0) cells, C-127 cells, He cells, etc., and vectors that transform these cells.
  • COS cells Chinese hamster ovary (CH0) cells
  • C-127 cells C-127 cells
  • He cells etc.
  • vectors that transform these cells For example, pSV2-gpt (Mu II igan and Berg; Proc. Nat I.
  • vectors contain the origin of replication, selectable markers, a promoter located in front of the gene to be expressed, an RNA splice site polyadenylation signal, and the like.
  • Promoters such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, and simian virus 40 (SV40) may be used as promoters of gene expression in mammalian cells. .
  • SV40 simian virus 40
  • it can be easily carried out according to the method of Muligan et al. (Nature JU, p. 108, p. 1979).
  • the selectable markers include the phosphotransferase APH (3 ') I or I (neo) gene, the thymidine kinase (TK) gene, and the Escherichia coli xanthine-guanine phosphorylation. Positive transferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reducing enzyme (DHFR) gene and the like can be used.
  • the obtained transformant may be cultured. Further, the polypeptide can be separated and purified from the inside of the cell or from the culture solution by using a known means.
  • eukaryotic genes are known as human interferon genes, and are thought to exhibit polymorphysm (for example, Nishi et al .:) 810 (see ⁇ 6 !! 1 ._ ⁇ _, p. 153, 1985)), and in some cases, one or more amino acids may be replaced by this polymorphism.
  • the amino acid may not change at all even if the nucleotide sequence changes.
  • Polypeptides in which the above amino acids have been substituted with one or more amino acids may also have G-CSF activity.
  • a polypeptide obtained by converting a base sequence corresponding to the cysteine of the human interloicin 2 (U-2) gene into a base sequence corresponding to serine is used as an intermediate. It is also known to retain leukin 2 activity (Wang et al .; No
  • a gene encoding a polypeptide having the activity of human G-CSF of the present invention, a recombinant vector having the gene, a transformant having the gene, and a transformant having the gene The method for obtaining a polypeptide or glycoprotein having human G-CSF activity expressed in the body is briefly described below.
  • Uniform human CSF ⁇ protein purified from the culture supernatant of the tumor cell line CHU-2 ⁇ Protein ⁇ The amino acid sequence was determined from the terminus, followed by bromocyan degradation, tribsin treatment, etc. After fragmentation, the amino acid sequence of the fragment was also determined.
  • nucleotide probes A
  • probes LC
  • probes IWQ
  • the probe (A) is a mixed-type probe consisting of 14 consecutive nucleotides.
  • Prop (IWQ) has been used in the cloning of human kinin kinase genes (Takahashi et al .; Proc. Natl. Acad. Sc; USA, ⁇ Vol. 1931 Mitsuru (1985) ) 30 consecutive nucleotides using dextrin inosine.
  • the probe (LC) was synthesized from the amino acid sequence shown in Example 3 (i), the portion corresponding to positions 32 to 39 from the N-terminal, based on the nucleotide sequence shown in Figure 3. twenty four It is a probe consisting of individual nucleotides.
  • nucleotides can be carried out by applying the improved phosphotriester method to the solid phase method and is described in a review by Narang (Tetrahedron ⁇ Vol. 3-22 (1983)).
  • the probe used may be based on the amino acid sequence at a position other than the probe used in the present invention.
  • Double-stranded cDNA was obtained by adding Rase I.
  • a dC chain was added to the obtained double-stranded cDNA and spliced with a PBR322 vector having a dG chain added to the PstI cleavage site to transform Escherichia coli strain X1776, and a PBR322-based cDNA library was transformed.
  • the double-stranded cDNA was ligated to an Igt10 vector to construct a phage-based cDNA library (Example 7).
  • the nucleotide sequence of this clone was obtained by the Sidge method.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the obtained cDNA insert.
  • this cDNA insert consists of 308 base pairs including a probe (IWQ) and a probe (A), and has an amino acid sequence shown in Example 3 (iii). It was found that it had the ability to encode 83 amino acids, including glycerol, and a lead-reading frame.
  • the PBR322-derived plasmid containing 308 base pairs is abbreviated as pHCS-1 below.
  • a DNA fragment containing 308 base pairs obtained from pHCS-1 was radiolabeled by the nickel translation method (see above, Molecular cloning) and used as a probe; Purify the cDNA library with a plaque hybrid solution (with Benton).
  • this cDNA insert has one large open reading frame.
  • amino acid sequence encoded by this cDNA can be performed as shown in FIG. 3 (A).
  • this cDNA was found to be 32 to 34 nucleotides from the 5'-end. Starting from the ATG sequence at nucleotide position 1 and ending with the GCC sequence at positions 119 to 121, the signal peptide encoded by 90 base pairs and the ACC sequence from positions 122 to 124 from 650 to It was found to contain the nucleotide sequence corresponding to the mature G-CSF polypeptide encoded by 531 base pairs ending with the CCC sequence at position 652. Therefore, the polypeptide of amino acid K row I shown in FIG. 3 (B) is composed of 207 amino acids and has a molecular weight of 207.
  • polypeptide of amino acid sequence E was composed of 177 amino acids and had a molecular weight of 18986.74 daltons. (Example 9)
  • Escherichia coli E. coli
  • X1776 strain harboring PBR322 in which this cDNA (+ VSE) was inserted into the ECOR1 cleavage site, has been deposited at the Institute of Microbial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology ( FERH accession number BP-954).
  • FIG. 5 shows the restriction enzyme cleavage sites of the obtained gene.
  • a plasmid obtained by binding this cDNA to PBR327 [Soberon et al .; Gene j, p. 287 (1980)] at the EcoRI site is referred to as PBRG4. '
  • the PBRG4 thus obtained is treated with the restriction enzyme EcoRI, and a DNA fragment containing approximately 1500 base pairs of cDNA is subjected to the nickel translation method (see the above-mentioned Holecular cloning).
  • the cDNA library derived from igt10 was again screened by plaque hybridization assay (see Benton and Davis, supra). This At that time, two sheets of double-cellulosic paper with the phage DNA fixed at the time of the lap are prepared in advance, and the same plaque-hyperidizing method is performed using the above-mentioned probe (LC). And selected phages that would be positive in both props.
  • the clones considered to be full-length were selected, and the nucleotide sequence of the cDNA insert was determined using the dideoxy method. The result was as shown in FIG. 4 (A).
  • This CD has one large open reading frame, and the amino acid sequence coded plays as shown in Fig. 4 (A).
  • this cDNA was found to have an ATG sequence 31 to 33 nucleotides from the 5'-end. , Starting with a 90 bp signal peptide ending with the GCC sequence at positions 118-120 and starting with the ACC sequence at positions 121-123 and ending with a CCC sequence at positions 640-642. Mature G-coded by base pairs
  • the polypeptide of the amino acid sequence I shown in FIG. 4 (B) consists of 204 amino acids, and the molecular weight is
  • FIG. 5 shows the restriction enzyme cleavage sites of the obtained gene.
  • a plasmid obtained by binding this cDNA to PBR327 at an EcoRI site is referred to as PBRV2.
  • E. coli DH1, E. coli N4830 or E.coIi 105 were transformed. (Examples 11, 12, 13, and 18) The obtained transformant was first cultured in a Luria medium containing ampicillin, and then, if necessary, appropriately induced, followed by culture. It was expressed. (Examples 14 and 19)
  • the culture of the transformant is centrifuged to collect the cells, and then treated with lysozyme, and then freeze-thawed repeatedly to lyse the cells to obtain the supernatant, or the supernatant is obtained by centrifugation after treatment with guanidine hydrochloride.
  • the amino acid composition was determined using a Hitachi 835 amino acid automatic analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd.). The analysis was carried out by a special amino acid analysis method, and the N-terminal amino acid analysis was performed by Edman degradation using a gas-phase sequencer to obtain a high-performance liquid chromatograph and intrasphere. -Using an ODS column (Examples 17 and 20)
  • a recombinant vector (derived from BPV) when using C127 cells or ⁇ 3-3 cells as host animal cells and a recombinant vector (derived from dhfr) when using CH0 cells are performed using the + VSE system.
  • the construction of a recombinant vector for C127 cells and CH0 cells is abbreviated here, but see the examples for details.
  • PHGA410 plasmid (Example 21) (FIG. 12)
  • a Hindlinker was added to this DNA, followed by HindUI treatment and T4DHA ligase treatment, and then the rubidium chloride method (see above, Molecular cloning) was used.
  • the obtained plasmid is named PHGA410 (H). ( Figure 13)
  • pHGA410 H is treated with Sal I, then the ends are planted, and treated again with Hind to recover Hindm-Sal I fragment.
  • P (1> V-1 plasmid containing a transformant fragment of Papilloma virus was treated with HindlE and PvuE to separate the larger DNA fragment. This fragment is ligated with the fragment I.
  • the E. coli DHI strain is transformed with the fragment to obtain a plasmid having CSF-CDNA derived from PHGA410, PTN-G4 (FIG. 13) (Example 22).
  • PHGG4-dh a replacement vector for CH0 cells (+ VSE) was constructed using PHGA410 plasmid or pHGA410 (H) plasmid and pAdD26SVpA plasmid (Fig. 14a and b) (Example 24). .
  • the cDNA (—VSE) fragment obtained in ( 3 ) above was inserted into the vector pdKCR to obtain a PHGV2 plasmid (Example 27). This was partially digested with EcoRI, and the end was blunt-ended. ). The Hind IE linker was added to this DNA, followed by Hind DI treatment and T40NA ligase treatment, and then using the rubidium chloride method (see above, Molecular cloning), the E. coli DHI strain was used. Was transformed. The obtained plasmid is named pHGV2 (H). (Fig.
  • HGV2 H is treated with Sal I, then the end is blunt-ended and then treated again with Hind DI to recover Hind IE-Sal I fragment, while ⁇ papilloma virus
  • the pdBPV-1 plasmid containing the transforming fragment is treated with HindU and PvuII to separate the larger DNA fragment, and the Hindn-SalI fragment is ligated.
  • the E. coli DHI strain is transformed to obtain pTN-V2, a plasmid having the CSF-cDNA derived from pHGV2 (FIG. 16) (Example 28).
  • PHGV2-dhfr a recombinant vector (one VSE) for CHO cells, was constructed using PHGV2 plasmid or PHGV2 (H) plasmid and pAdD26SVf) A plasmid as in VSE (Fig. 17a and b) (Example 30).
  • PTN- (34 plasmid or pTN-V2 plasmid has been treated with BamHI.
  • C-127 cells grown in culture are transformed by the monocalcium phosphate method
  • the transformed cells are cultured to select clones having high CSF-producing ability
  • G-CSF glycoprotein is recovered from the culture of the transformed cells and purified. It was confirmed that the sample showed CSF activity, and the objective glycoprotein was confirmed by amino acid analysis and sugar content analysis of the sample.
  • the CSF sample used for the amino acid analysis was determined by the Erson-Morgan method for the determination of amino sugars, the neutral sugar determination by the ortho-sulfuric acid method, or the quantification of neutral sugars.
  • Sialic acid was quantified by the method of palvitool. The method is described in “Biochemistry Experiment Lecture Volume 4”, “Carbohydrate Chemistry (2nd volume)” (Tokyo Kagaku Dojin), 13 grasses. The results of weight% conversion from each quantitative value were obtained (the sugar content of 3-CSF was in the range of 1 to 20 (% by weight), depending on the host cell, expression vector, culture conditions, etc.). It was distributed.
  • the present invention also relates to an agent for preventing infection comprising human G-CSF as an active ingredient. Also provide.
  • Human G-CSF which is an active ingredient of the present invention, can be obtained by the above-described gene recombination technique, and is disclosed, for example, in the aforementioned patent application (Japanese Patent Application No. 59-153273). Obtained from human CSF-producing cells (CHU-1 or CHU-2), or by fusing G-C8F-producing cells with malignant tumor cells capable of self-proliferation according to the method described above. Predoma can also be obtained by culturing in the presence or absence of mitogen I.
  • the human G-CSF obtained by these methods is all included in the present invention.
  • the obtained human G-CSF-containing solution may be further purified and concentrated by known means, and then cryopreserved. It can be preserved by removing water by means such as lyophilization, freeze-drying, vacuum drying, etc.
  • the It can also be used as an injection by sterile filtration with a pore filter.
  • infectious protective agent of the present invention comprises a pharmaceutical carrier and an excipient necessary for taking a form as a pharmaceutical preparation suitable for human or veterinary medicine, and further comprises a stabilizing agent and an adsorbent. Inhibitors can be included.
  • the dose and frequency of administration of the human G-CS'F contained in the infectious protective agent of the present invention can be determined in consideration of the condition of the target disease patient, but is usually 0.1 per adult.
  • Formulations with human G-CSF of ⁇ 500 3 or preferably 5-100 ⁇ f can be administered once to once a week.
  • the present invention is not limited by the content of human G-CSF.
  • Infection protective agent containing human G-CSF of the present invention as an active ingredient is used
  • the target infectious bacteria that can be performed include various bacteria, and are not particularly limited. Among them, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Etc. Gram-positive cocci, Gram-negative facultative anaerobic bacteria including intestinal bacteria such as genus Escherichia, Serratia, Klebsiella, and hemophilus, Pseudomonas sp. Due to Gram-negative aerobic bacteria such as Genes, Gram-negative anaerobic bacteria such as Pacteroides, fungi such as Candida and Aspergillus, and intracellular parasites such as Listeria. (1) A protective effect against infection can be obtained against single infection or multiple infections caused by several bacteria.
  • CSA CSF activity
  • the number of colonies thus determined (a colony of 50 or more cells is defined as one colony) was counted, and the activity of forming one colony was defined as one unit (lln), and CSA was determined.
  • Serum H test sample 0.1 ⁇ , C3H / He (mes) mouse bone marrow cell suspension 0. (0.5-1 ⁇ 10 "nucleated cells), modified McCoy's 5A culture containing 0.45% agar 0.4 / s «is mixed, solidified in a 35 cm diameter tissue culture plastic dish, and cultured for 5 days at 37 ° C, 5% carbon dioxide, 95% air and 100% humidity. Then, the number of colonies formed (a colony of 50 or more cells is defined as 1 J lonely) is counted, and the activity of forming one colony is defined as 1 unit (Un), and GSA is defined as 1 unit. I asked.
  • the "modified McCoy's 5A culture solution used in the methods (a) and (b) and the human bone marrow non-adherent cell suspension used in (a) were prepared as follows.
  • Bone marrow fluid obtained by sternal puncture from healthy volunteers was added to RPHI 1640 culture solution. Diluted 5 times, layered on Ficol-Paque solution (Pharmacia), and centrifuged at 400X for 9 minutes for 30 minutes at 25 to collect the cell layer at the interface (specific gravity ⁇ 1.077). .
  • Human G-CSF was isolated and purified from the culture supernatant of human G-CSF-producing cell CHU-1 (CNCM accession number “I-315”) according to the method described in Example 2 below. —
  • the human G-CSF thus obtained had the following physicochemical properties.
  • Amino acid composition It has the amino acid composition shown in Table I below. -'
  • Tumors from an oral floor cancer patient with a marked increase in neutrophils were transplanted into nu nu mice. About 10 days after transplantation, a marked increase in tumor mass and an increase in neutrophils were observed. The tumors were aseptically excised after transplantation 12 days, minced into 1 ⁇ 2 m 3 corners, and cultured as follows this.
  • Rotary culture was performed at a rate of 0.5 ⁇ . ⁇ .
  • the culture was replaced with serum-free RPMI 1640, cultured for 4 days, and the culture supernatant was collected.
  • the solution was changed again to RPHI 1640 containing no serum, and the culture supernatant was collected after 4 days.
  • the sample was dissolved in 70% formic acid, and 200 equivalents of sublimated and purified procyanide were added thereto, followed by reaction at 37 ° C overnight.
  • the reaction product was freeze-dried, and fractionated by HPLC using a TSK G3000SW column (manufactured by Toyo Soda Co., Ltd.) to obtain four peaks.
  • the peaks were named as-, CN-2, CN-3, and CN-4 with very high molecular weight, and the amino acid sequence of CN-1 CN-2 with good yield was determined by an automatic gas-phase sequencer. (Applied Dubai Saiki System) under the same conditions as (i).
  • CN-1 was an peptide from the N-terminal of the G-CSF protein. Furthermore, CN-2 had the following amino acid sequence.
  • Tribosine degradation sample was dissolved in 0.1 M Tris-HCl buffer (PH7.4) containing 8 M urea, and 0.1 M Tris containing 0.1% 2-mercaptoethanol was dissolved. A 6 M hydrochloric acid buffer (PH7.4) was added to adjust the final concentration to 2 M urea. Next, TPCK-treated tribulin (trade name, manufactured by Sigma) was added so that the sample and the enzyme became 50: and reacted at 25 ° C for 4 hours.
  • nucleotide resin AP-d (manufactured by Yamasa Kyuyu Co., Ltd.) as a starting material is added to a column with a glass filter, and washing is repeated with methylene chloride. 4,4′-Dimethyloxytrityl group was eliminated with a methylene chloride solution containing acetic acid, and the column was washed several times with the following methylene chloride. After washing with anhydrous pyridine and replacing the solvent, the nucleotide dimer (OHTr) ApTp (NHR 3 ) (Nippon Seishin Co., Ltd .: NHR, trimethylammonium, DHTr is dimethyloxytrityl) Indicate) 20 «?
  • the nucleotide sequence of the obtained ligand was determined by the Maxam-Gilbert method (Meth. Enzym .__, 499, 1980). Was confirmed.
  • the cells were suspended in a RPMI 1640 culture medium 500% containing 10% fetal serum, and then suspended.
  • the cells were transferred to a glass roller (1580 ⁇ » 2 ) (manufactured by Belco) and subjected to spin culture at a speed of 0.5 rpm for 4 days.
  • the culture medium was removed from the roller port, and 100n of physiological saline containing 0.02% of EDTA heated in 37 was added in advance. After heating at 37 ° C for 2 minutes, pipette operation 1 Cells were detached.
  • the cell suspension obtained is centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to obtain a cell pellet.
  • the cells were resuspended in physiological saline 5 containing no EDTA and centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to obtain a cell pellet (wet weight: about 0.83).
  • the cells thus obtained were subjected to RNA extraction. Keep frozen at 80 ° C until operation
  • CHU-2 cells (wet-weight 3), which had been cryopreserved, were added to 20 ⁇ of a 6-guanidine solution (6-guanidine cyanide, 5 mM sodium citrate ( ⁇ 7 ⁇ Q). ), 0.1 ⁇ / 3 — mecaptoethanol, 0.5% sodium sarcosylsulfate)
  • RNA was obtained by adding 2.5 times the volume of ethanol and performing ethanol precipitation. (About 10.1fflg of total RNA was obtained from 3.83 wet cells.)
  • poly (A +) -RNA from total RNA was performed as follows. This method uses an affinity chromatography method that utilizes the incorporation of a poly A chain at the 3 'end of inRNA. It is a trigraph. Using oligo (dT) -cellulose (Type 7 from P-L Biochemical), total RNA was absorbed using an adsorption buffer (10mH tris-hydrochloric acid (PH7.5), 0.5 NaCi, 1mH EDTA, 0.1% SDS solution), ripened at 65 for 5 minutes, and then passed through an oligo (dT) -cellulose column filled with the surrounding solution, elution was performed with TE solution (Including 10 mM tris-hydrochloric acid (PH7.5) and niM EDTA.) The unadsorbed permeate was passed through the column again to perform the same elution operation, and the first eluate was used. Using such an operation, poly (+ A) -NA400 ⁇ 3 was obtained.
  • the mRKA prepared in this manner was used in the experimental technical book by Schleif and Wensink (Practical Methods in Molecular Biology,
  • sucrose density gradient of 5% to 25% is created in the tube for the SW40Ti rotor (manufactured by Bechman).
  • the sugar solution is
  • the G-CSF activity of each fraction was determined at weekly intervals using the oocyte line of the African frog (Xenopus laevis).
  • the mRNA of each fraction was prepared in an aqueous solution with a concentration of 1 ⁇ 3 / 3t, and injected at a rate of 50 ng of mRNA into one oocyte extracted from a toad frog (about 1 year old).
  • placed in microphone b data 1 hole Lee te flop rate Bok of 96 oocytes by 10, which respectively 100 J1 Bath medium (88mM NaCi, mM KCi, 2.4mH NaHC0 3, 0.82mM HgS0 .
  • Reaction buffer 500I9M KCi, 50inH HgC, 250mM Tris-HCl, ⁇ 8.3
  • 20 200mH dithylates 32 ⁇ ⁇ 12.5mH dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP each containing 12.5 mM)
  • 10 of ⁇ 3 ⁇ 4- "2 P- dCTP Cane catcher arm made, PB 10205
  • the double-stranded CDNA obtained as above is dissolved in 40 40 of TF solution, added with 8 ⁇ of dC-strand addition buffer described in 2), heated at 37 ⁇ for 2 minutes, and ⁇ Terminal Transferase (27 unit / u ⁇ ) was added and reacted at 37 ° C for 3 minutes.
  • the reaction solution was immediately cooled to 0 ° G, and the reaction was stopped by adding 0.5H EDTA. Then, the mixture was subjected to phenol-col form treatment and ethanol precipitation, and the resulting precipitate was collected. It was suspended in 10 ml of the solution.
  • oligo (dG) Strand-added PBR322 vector (Bethesdarisa-Chirapora Trees, 10 ng ⁇ i) 4 u St and the above dC-strand-added double-stranded cDNA22 in 75 ⁇ 0.1M NaCi The anneal was humidified at 65 ° G for 5 minutes, heated at 40 ° G for 2 hours, and then allowed to stand until it reached room temperature.
  • a recombinant cell was prepared from Escherichia coli strain X1776 using the method described in the experimental book of Haniatis et al. [Molecular cloning, Cold Spring Harbor, p. Transformants were used to obtain transformants (transformants).
  • the TE solution 10 in which the poly (A +)-RNA12SP was dissolved was placed in a reaction tube containing 10 jW gf of actinomycin D (manufactured by Sigma), and then the reagents were added according to the following procedure; reverse transcription buffer 20 i (250mH Bok Li scan - HCl (PH8.3), 40IBH HgCJl 2, 250mH KCi) 20 of 5 fflH dNTP (dATP, dGTP, dCTP, and dTTP Each contains 5 fflH), 20 5 of old Li rubber (dT) 12. 1 ⁇ ( 0.2 ⁇ ?
  • the cDNA obtained as above is dissolved in a 29 ⁇ ⁇ solution, and reagents are added under the following conditions to make a reaction solution; 25 J? Polymerase buffer (400 B1H Hepes (pH 7. 6); 16mM MgCJI 2; the 63 ⁇ j3 - main Rukapu Bok ethanolate Lumpur: 270IDH KCi); 10 / of 5 i »H dNTP;
  • the reaction was stopped by adding 0.5% EDTA and 1% of 20% SDS, and the mixture was subjected to phenol-close-mouth form treatment and ethanol precipitation. Dissolve the obtained DNA in 0.5 mM EDTA 20 & KI Enow buffer (500 mH Bok Li scan - HCl (pH8 ⁇ 0), 50mM HgCJ2 2) 3 of 5 mH dNTPs, and water 54 After preparation of I was added to the reaction solution, 1 ⁇ of DNA poly ra one Ze (Kle enow fragment) (manufactured by Takara Shuzo) was added, and the mixture was incubated at 30 for 15 minutes.
  • the reaction mixture was diluted by adding 70 ⁇ l of ⁇ solution, and the reaction was stopped by adding 5 ⁇ of 0.5 ⁇ EDTA and 20 of 20% SDS.
  • the reaction solution was treated with I-null-cloth-form and subjected to ethanol precipitation to obtain about 83 double-stranded cDNAs.
  • methylation have been double-stranded DN A about 1 ⁇ 2 g in ligase buffer. (250mH Application Benefits scan - HCl (PH7.5), 100inH HgCi 2) 1.5 ⁇ ⁇ pre-phosphate oxidized EcoRI linker one 0.5 ⁇ i (10mer.
  • EcoRI (10unit / ⁇ , i) 3.5 ⁇ i was added and reacted at 37 ° C for 2 hours.
  • 0.5 M EDTA 2.5ii JJ; 20% SDS 0.5 was added, followed by treatment with a phenol-close-mouth form, and DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • unreacted EcoRI linkers were removed by gel blotting or agarose gel electrophoresis using Urogel AcA34 (manufactured by LKB), and linker-added double-stranded CDNA was added to the DNA.
  • the above linker-added double-stranded cDNA was treated with EcoRI in advance of 2.4 ⁇ ; lgt10 vector (Vector Cloning Systems), ligase buffer (250mH tris- Hydrochloric acid, 100 ⁇ 1 ⁇ HgCi 2 )
  • colonies were transferred to 541 filter paper, then transferred to a cold medium containing chloramphenicol (250 ⁇ ), and left at 37 overnight.
  • Southern blotting was performed using the probe (A). The hybridization was performed at 49 ° C. for 1 hour using the above-described hybridization buffer, cooled slowly to 39, and then performed at 39 ° C. for 1 hour. After the completion of the reaction, the cellulosic cellulose filter was washed twice with 6 ⁇ SSC containing 0.1% SDS at room temperature for 30 minutes and then with 39 for 3 minutes. Was done.
  • the nucleotide sequence was determined by the didexy method, as shown in Fig. 2, it was a DNA consisting of 308 base pairs including the probe (IWQ) and probe (A) portions.
  • the PBR322-derived plasmid containing this insert was named PHCS-.
  • Example 9 DNA probe derived from pHCS-1; Screening of I phage-based library
  • a plaque hybridization was performed according to the method of Benton and Davis [Science 96, 180, (1977)].
  • the PHCS-1 obtained in Example 8 was treated with Sau3A and EcoRI to obtain a DNA fragment of about 600 base pairs, and the 0NA fragment was radiolabeled with a nickel translation according to a conventional method. .
  • the filter paper was treated with 0.1H NaOH, 1.5H NaCi for 20 seconds, followed by 0.5M tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 1.5M NaC for 20 seconds twice, and finally 120mH NaCi, 15mH sodium citrate. , 13mH
  • the paper was dried and heated at 80 ° C for 2 hours to fix the DNA. 42 ° C in a hybridization buffer containing 5X SSC, 5X Denhardt solution, 50mH phosphate buffer, 50% formamide, 0.25 ffl Z denatured DNA (salmon testis DNA), and 0.1% SDS C. Prehybridization was performed in C, and hybridization containing 4 ⁇ 10 5 cpm / of pHCS-1 probe radiolabeled with a nickel transfusion was performed. Dizesion buffer (5X SSC, 5X Denhardt solution, 20mH phosphate buffer (pH 6.0), 50% form Amide, 0.1% SDS, 10% dextran sulfate,
  • the 2-cellulosic paper was washed at room temperature with 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS for 20 minutes, and then at 44, for 30 minutes at 0.1 ⁇ SSC containing 0.1% SDS and at room temperature. After washing with 0.1X SSC for 10 minutes, detection by heat radiography was performed.
  • the plaque hybridization was performed according to the method of Benton and Davis used in Example 9 (see the above-mentioned literature). Transfer the phage onto agar medium on which phage plaques have been formed by placing two-cell cellulose paper (manufactured by S & S), denature the DNA with 0.5 M NaOH, and perform the following steps. We processed the complaint paper. 0.1M NaOH 1.5M NaCi for 20 seconds, then 0.5H Tris-HCl ( ⁇ (7.5), 1.5 ⁇ NaCJ! For 20 seconds twice, finally 120mH NaCi, 15mH Sodium, and 20 Byosho sense in 13mM KH 2 P0 4, mM EDTA ⁇ (pH7.2). Next, the paper was dried and ripened at 80 ⁇ for 2 hours to fix the DNA. In this way, two identical sheets of compost were made,
  • PBR64-derived DNA probe and probe (LC) were used for screening.
  • PBRG4 was treated with EcoRI to obtain a DHA fragment of about 1500 base pairs, and this DNA fragment was radiolabeled with a nickel translation by a conventional method.
  • the above paper was prepared from a hybrid containing 5 X SSC, 5 X Denhardt solution, 50 mM phosphate buffer, 50% formamide, 0.25 fflg / flig denatured DNA (salmon testes DNA), and 0.1% SDS.
  • probe In the case of probe (LC), the arrested paper was pretreated with 3X SSC containing 0.1% SDS at 65 for 2 hours, then 6X NET, X Denhardt solution, 100% Z denatured DHA ( (Testis DNA) Perform prehybridization in solution at 65 ° C for 2 hours Prehybridization buffer containing radiolabeled probe (LC) (SxlOD cpm Z) [6 X NET, 1 X
  • Dentiardt solution 100 ⁇ 3 // ⁇ denatured DNA ( ⁇ testis DNA)]] at 63 ° C overnight, and then filter the filter with two microcells at room temperature. After washing with 6 ⁇ SSC containing 0.1% SDS for 20 minutes and performing this washing three times, the plate was washed with 6 ⁇ SSC containing 0.1% SDS at 63 ° C. for 2 minutes.
  • the mixture was treated with 8 units of EcoRI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) in HgCi 2 , 100 mM NaCi, 7 mM 2-mercaptoethanol> for 2 hours at 37. 5 ⁇
  • alkaline phosphatase manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the DNA fragment was recovered.
  • a synthetic linker having the sequence of CGAATGACCCCCCTGGGCC and CAGGGGGGTGATTGG is composed of 50 mH Tris-HCi, 10 mM HgCi! 9 , 10 mH 2-mercaptoethanol, 1 mH the reaction mixture 40 u T 4 polynucleotidyl click Reochi
  • 0.2 tt of each of the phosphorylated oligonucleotides was dissolved in 20 Jl of i-TE (10 mM Tris-HCi, pHS.0, mH EDTA) containing 100 mM NaCi, and treated at 65 for 10 minutes. After annealing, annealing was performed by gradually cooling to room temperature.
  • i-TE 10 mM Tris-HCi, pHS.0, mH EDTA
  • the PBRG4603 containing the CDNA shown in FIG. 3 (A) obtained in Example 9 was reacted with 6 mM Tris-HCi, 6 mH HgCi 2 , 6 mH 2 —mercaptoethanol in a reaction solution of 200 ⁇ ⁇ . , Restriction enzyme Apa (Hew England Biolabs) 100 units, Dra I (Takara Shuzo) The mixture was treated with 50 units at 37 ° C for 3 hours, and about 590 bp Apa I-Ora I fragment of about 2 23 was recovered by 1.2% agarose gel electrophoresis.
  • Example 12 Construction and transformation of a recombinant vector for Escherichia coli (+ VSE) [Example using a vector containing a PL promoter] '
  • the remaining fragment of about 1,2 Kt) p was dissolved in a buffer (10 mM Tris-CH, 10 mM MgCi 2 , 6 mM KCi, mH DTT) 20 uJl, and the restriction enzyme Hbo I (New England Biolabs) was used. 20 units at 37 ° C overnight.
  • Synthetic linker TAAGGGAGAATTTCATCGAT and TGGTATGAATTTCTCTCTTAG were oxidized and annealed in the same manner as in (11) of Example 11 to obtain a synthetic SZD linker.
  • the transformant was cultured, the plasmid was separated from the culture of the ampicillin-resistant colony, and treated with the ophthalmic enzymes EcoRI, BamHI and SiRdI to find that the desired plasmid was obtained. confirmed.
  • IHH Tris-HCi 6 IBHHgCin, SOIBH NaCJl, a restriction enzyme Clae (New England Biolabs) was reacted at 37 for 2 hours, and then inactivated at 65 ° C for 10 minutes.
  • Example 13 Construction and transformation of a recombinant vector for Escherichia coli (+ VSE) [Example using vector containing trp promoter]
  • Synthetic linker-CGCGAATCGACCCCCCCTGGGCC and CAGGGGGGGTCATTCG was oxidized and annealed in the same manner as in Example 112.
  • Plasmid was obtained from ampicillin-resistant colonies in the same manner as in Example 11, and the desired transformants were obtained with the restriction enzymes Apal, Dral, NruI, and Pstl. I confirmed that I was there.
  • Example 11 Culture of the transformed strain (containing tac) obtained in Example 11 was carried out using luria containing ampicillin 25 ⁇ 3 ⁇ or 50.
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 2 to 4 hours at 2 mH in isopropyl-3-D-galactoside.
  • the culture 100 was centrifuged to collect the cells, and the cells were suspended in a mixed solution 5 ⁇ of 20mH Tris-HCi (pH 7.5) and 30mH NaCJl.
  • 0.2M phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.2H EDTA, and lysozyme were added so as to be ⁇ , 10 mM, and 0.2 ⁇ / ?, respectively, and left at 0 ° C. for 30 minutes.
  • freeze-thaw was repeated three times or sonication was performed to lyse the cells.
  • the obtained lysate is centrifuged to obtain a supernatant, or is finally converted to 6 M guanidine hydrochloride using 8 M guanidine hydrochloride, and then centrifuged at 30,000 pm for 5 hours. The supernatant was obtained.
  • n-propanol (Tokyo Kasei Co., Ltd.) Amino acid sequencing) and trifluroacetic acid, and the final filtration is adjusted to 30% and 0.1%, respectively, and left on ice for about 15 minutes, followed by 15,000 r.p. l The precipitate was removed by centrifugation for 10 minutes.
  • the resulting protein is treated with 2-mercaptoethanol, subjected to SDS-polyacrylamide gel (15.0%) electrophoresis (15 mV, 6 hours), and stained with Coomassie Blue. As a result, the desired G-CSF polypeptide was confirmed as a single band.
  • Example 16 Assay of G-CSF activity of expressed substance (+ VSE) 'The CSF sample obtained in Example 15 was assayed according to the aforementioned ⁇ Reference example> CSF activity measurement method (a). Table 1 shows the results.
  • Example 15 The CSF sample purified in Example 15 was hydrolyzed by a conventional method, and the amino acid composition of the protein portion was analyzed using a Hitachi 835 amino acid automatic analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd.). It was analyzed by the acid analysis method. The results are shown in Table 1-2.
  • the hydrolysis conditions are as follows.
  • Samples were prepared by dissolving 40% n-propanol and 0.1% triflic acid in solution (1.5 / s), then taking each and drying with dry nitrogen gas. After that, the reagent of (1) or (2) was added, the tube was sealed in a vacuum, and subjected to hydrolysis.
  • the measured values are the average of four times, the 24 hour value of 1 and the 24, 48, 72 hour value of 2. However, Thr, Ser, 1/2 Cys, Met, Val, Ie and Trp were calculated by the following methods [Biochemical experiment course, protein chemistry]! (See Tokyo Chemical Shujin Publishing)].
  • T hr, Ser, V 2 Cys, and Met show the time-dependent changes of 24, 48, and 72 hours in 2, and extrapolate to zero hours.
  • Val and I le are 72 hour values of 2.
  • T rp is the average of 24, 48, and 72 hour values of 2.
  • Table 1 2 (Amino acid analysis table)
  • the sample was decomposed by Edman using a gas-phase sequencer (manufactured by Applied Dubai Saisei Systems), and the resulting PTH 7
  • the acid was routinely analyzed using a high-performance liquid chromatograph (manufactured by Beckman Instruments) and a Urasphere-0DS column (manufactured by Beckman * Instrument).
  • Column (5 m, 4.6 diameter, 250 m) starting buffer (15 mH sodium acetate buffer PH4.5, containing 40% acetate 2 tol) Aqueous solution), then inject the sample (dissolved in the starting buffer solution of 20 ⁇ 11) and start. Isocratic elution with the buffer solution was used to perform the separation.
  • ⁇ / Min column temperature was kept at 40.
  • PTH amino acid was detected using the ultraviolet absorption of 269 / 3 ⁇ 43 and 320. Standard PTH amino acid (Sigma) 2 each The retention time was determined by separating n moi in the same system, and identification was performed based on the retention time of the test sample.
  • Example 12 was repeated using CDNA (—VSE), and it was confirmed that the obtained transformant was the target transformant (FIG. 10). 3) Example using trp port motor-containing vector
  • Example 13 was repeated using cDNA (—VSE), and it was confirmed that the intended transformant was obtained (FIG. 11).
  • Example 19 Assay of G-CSF activity of expressed substance (-VSE) Each of the transformants obtained in Example 18 was cultured by the method described in Example 14, and then the Escherichia coli thus cultured was described in Example 15 According to the method described above, G-CSF polypeptide was recovered and purified to obtain a human G-CSF polypeptide as a single band.
  • the sample was subjected to N-terminal anoic acid analysis according to the method described in Example 17-2). As a result, PTH-methionine and PTH-threinine were detected.
  • this DNA fragment corresponded to about 710 base pairs including a portion coding for the human G-CSF polypeptide.
  • Vector, pdKCR ⁇ Fukunaga; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 81, 50 ⁇ 6 (1984)) was treated with the restriction enzyme BamHI, followed by alkaline force phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • the vector te DNA obtained by de-phosphate was obtained T 4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
  • PHGA 410 is combined with CDNA fragment added in manufacturing) (Fig. 12) '.
  • this plasmid is responsible for the replication initiation region of the SV40 early gene promoter SV40, the egret / 3- part of the globin gene, the PBR322 replication initiation region, and the PBR322-derived / 3 - includes lactamase gene (Amp p), human WINCH G in promoter under flow of SV40 early gene - CSF Yadenko is connected. 7 ⁇
  • PHGA410 Plasmid 20 ⁇ 3 obtained in Example 21 was added to 5 ⁇ Tris-HCi (pH 7, 5), 7 mM HgCi 2 , 100 mH HaCJl, 7 mM 2 —mercaptoethanol. , 0.11% serum albumin (BSA), add the restriction enzyme EcoRI (10-15 units, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), react at 37 ° C for about 30 minutes, and react with EcoRI. Partial digestion was performed. Next, the DNA fragment was treated by phenol-chloroform (11) treatment twice, followed by ether treatment and ethanol precipitation.
  • EcoRI 10-15 units, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • This secretion fragment was dissolved in 50 liquids consisting of 50mH Tris-HCi, 5mM MgCi! 2 , 10mH DTT, 1mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, and E. coli DNA polymerase-Kl 5 ⁇ ow of enow fragment (Takara Shuzo) was added, and the mixture was incubated at 14 ° C for 2 hours to make a blunt end.
  • the recovered fragment 53 was dissolved again in a 50 ⁇ f reaction mixture consisting of 50 mM Tris to HCil (pH 7.6), 10 mM MgCi 2 , 10 mM DTT, and iilH ATP, and HindHI linker (Takara Shuzo) m and T 100 units of 4 DNA ligase (Takara Shuzo) were added, and the reaction was carried out overnight at 4.
  • the PHGA410 (H) (2Qgt) obtained in 1) above was combined with 10 mM Tris-HCJ1 ( ⁇ 7.5), 7 mM HgCi 2 , 175 mM NaCi, 0.2 iM EDTA 7 mH 2-mercaptoethanol, 0.01 was dissolved in a reaction mixture containing 50% serum albumin, and 20 units of the restriction enzyme Sail (Takara Shuzo) was added. The mixture was incubated at 37.G for 5 hours. Then, after phenol treatment and ethanol precipitation, the DNA polymerase Klenow fragment (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was incubated at 14 ° C for about 2 hours in the same manner as in the above reaction.
  • the DNA fragment precipitated with ethanol was treated with the restriction enzyme HindIII without recovering with agarose to obtain a plant end of about 2.7 kb.
  • the Hind I-Sail fragment was recovered by 1% agarose gel electrophoresis for 5 ⁇ 3, while plasmid pdBPV-1 containing bovine papilloma virus [bovine papi loma virus (BPV)] was recovered.
  • BPV bovine papi loma virus
  • This strain was transformed into the E. coli DHI strain by the rubidium chloride method described in "Molecular cloning", and the E. coli colony carrying a plasmid having the cDNA of G-CSF derived from PHGA410 was selected.
  • the plasmid is named PTN-G4 ( Figure 13).
  • Example 23 Transformation of C127 cells and its expression (+ VSE)
  • the PTN-G4 obtained in Example 22 is treated with the restriction enzyme BamHI before transforming into mouse cells. That is, pTN-G4 plus 20.
  • Mouse C127I cells contain 10% fetal calf serum (GIBC0)
  • NIH3T3 cells can be used as host cells in addition to the above-mentioned C127 I cells.
  • Example 21 10 mH the PHGA410 plasmid 20 obtained in Tris - HCJl (pH7.5), containing 7 mH HgCi 2, 175mH NaCJl, 0.2mH EOTA 0.7lH 2- mercapto Bok E data Roh, Lumpur 0.01% BSA solution The mixture was dissolved in 00 / ⁇ , and 20 units of restriction enzyme Sail (Takara Shuzo) was added. The mixture was reacted overnight, followed by phenol treatment, ether washing, and ethanol precipitation.
  • pAdD26SVpA plasmid (Kaufman, RGS Sharp, PA (1982) Hoi. Cell Bio I, j volume 1304-1319) was treated with EcoRI, and then zonated alkaline phosphatase ( BAP) treatment and dephosphorylation. That is, the reaction solution pAdD26SVpA 20 gf and EcoRI 20 units of 50 mH T ⁇ is- HC (pH7.5), 7 mH MgCi n, 100 IBM NaCi, 7 IBM 2 - mercapto preparative ethanolate Lumpur, 0.01% BSA 100jW i The mixture was reacted at 37 ° C for 10 hours.
  • PHGG4 plasmid was treated with Sail and partially digested with EcoRI without addition of EcoRI linker to recover a fragment of about 2.7 kb.
  • PHGG4-dhfr can also be prepared.
  • PHGG4-dhfII can be obtained by treating with the restriction enzymes Hind IE and Sail and ligating the Malawi-Sail fragment to the plan-ended EcoRI fragment of pAdD26SVpA. ( Figure 14b).
  • CH0 cells (strain dhfr ", obtained from Dr. L. Chasin of the University of Colombia) containing 9% calf serum in 9 c « diameter plates (Nunc) a Minimum essential medium ( ⁇ -HEM) , Adenosine, deoxyadenosine, and thymidine), and propagated by the phosphate-calcium method (Wigler et al., Cell 14, 725 (1978)). Converted.
  • ⁇ -HEM Minimum essential medium
  • TBS Trisis-Buffered Sine
  • ⁇ -HEM medium non-selective medium
  • the cells were incubated for 2 days, and the cells were split 1:10 in a selective medium (without adding nucleotides). Subsequently, the culture was continued while changing the medium with a selective medium every two days, and the resulting clumps (foci) were selected and transferred to a new plate. In the new plate, the cells were grown in the presence of 0.02 UH Metric Rexet (HTX) and grown again in the presence of HTX for cloning.
  • HTX 0.02 UH Metric Rexet
  • a replacement vector can be constructed by a method using a so-called polycis nick gene, and this can be used to transform CH0 cells.
  • pAdD26SVpA is treated with PstI, two fragments are collected, and these fragments are combined with a PBRG4-derived CSF cDNA fragment to obtain the adenovirus promoter, CSFcDNA, DHFR, and SV40 polysites.
  • a recombinant vector arranged in the beginning was constructed and inserted into CH0 cells.
  • Example 25 Assay of G-CSF activity of expressed substance (+ VSE) C127 cell and CH0 cell culture supernatant obtained in Example 23 and Example 24 were each adjusted to PH4 with drunk acid and equal volume. After addition of n-propanol, the resulting precipitate was removed by centrifugation, and passed through a column (1 ⁇ 2 CM) packed with C8 reversed phase carrier (Yamamura Chemical Co., Ltd.). Eluted with 50% n-propanol. After diluting the eluate twice with water, reverse concentration high-performance liquid chromatography using YHC-C8 column (Yamamura Chemical Co., Ltd.) containing 30--60% linear concentration containing 0.196 TFA A gradient of n-propanol was eluted.
  • C8 reversed phase carrier Yamamura Chemical Co., Ltd.
  • the fraction eluted at a position where the n-propanol concentration is around 40% is collected, freeze-dried, and 0.1 M glycine buffer (PH9) Dissolved in water.
  • PH9 0.1 M glycine buffer
  • Example 25 The crude CSF sample obtained in Example 25 was further purified according to the method of Example 3 (iii).
  • This purified CSF sample is hydrolyzed by a conventional method, and the amino acid composition of the protein portion is analyzed by a special amino acid analysis using a Hitachi 835 amino acid automatic analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd.). Analyzed by the method. The results are shown in Table-6.
  • water The decomposition conditions are as follows.
  • the samples were dissolved in a solution containing 40% n-propanol and 0.1% trifluroacetic acid, 0.1 was taken from each, dried with dry nitrogen gas, and the reagents 1 or 2 were added. And sealed in a vacuum tube for hydrolysis.
  • the measured values are the average of four times, the 24 hour value of 1 and the 24, 48, 72 hour value of 2.
  • Met, Va and II e and T rp were calculated by the following methods (see Biochemistry Laboratory Course, Protein Chemistry E (Tokyo Kagaku Shujin Publishing)) 0 T hr, Ser, V 9 Cys , Met take the time course of the 24, 48, and 72 hour values of 2 and extrapolate to zero time.
  • V a and I le are 72 hour values of 2.
  • T rp is the average of 24, 48, and 72 hour values of 2.
  • This DNA fragment corresponded to about 710 base pairs including a portion coding for the human G-CSF polypeptide.
  • the enzyme was lipophosphatase. (Takara Shuzo Co., Ltd.) at a vectored one DNA obtained we were to de-phosphate to obtain a T 4 0 nA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added PHGV 2 is combined with CDNA fragment ( Figure 15).
  • this plasmid contains the SV40 early gene, the SV40 replication initiation region, the egret / 3-part of the globin gene,
  • Example 27 Using the PH6V2 plasmid 2 ⁇ 3 obtained in Example 27 (FIG. 16), a plasmid named PHGV2 (H) was obtained by the method described in 1) of Example 22 (FIG. 16). ).
  • Example 29 Transformation of C127 cells and its expression (—VSE)
  • the pTN-V2 obtained in Example 28 is treated with restriction enzyme BamHI before transformation into mouse C127 cells.
  • mouse C1271 cells were transformed with the above-prepared DNA and expressed (see Example 23), and clones having high G-CSF-producing ability were selected. As a result, G-CSF production at the level of I fflgZii was observed.
  • NIH3T3 cells can be used as host cells in addition to the above-mentioned C1271 cells. '
  • PHGV2 plasmid was treated with Sail and partially digested with EcoRI without the addition of EcoRI linker to recover a fragment of about 2.7 kb. DNA polymerase-Treats the DNA fragment with the Kleiow fragment and plant ends o
  • PHGV2-dhfr can also be prepared.
  • PHGV2 (H) obtained in Example 28 was treated with the restriction enzymes, HindIII and SalI as described in Example 28-2), and the Hindi-Sail fragment was treated as described above.
  • PHGV2-dhfr can also be obtained by ligation to the blunt-ended EcoRI fragment of pAdD26SVpA (Fig. 17b) 2) Transformation and expression
  • CH0 cells were transformed and expressed according to the method described in 2) of Example 24. '
  • CH0 cells can also be transformed by co-transformation of CH0 cells with PHGV2 and pAdD26SVpA (003 ( ⁇ 1 : 01 ⁇ 31 ⁇ 00)).
  • a replacement vector can be constructed by a method using a so-called liposome nick gene, and this can be used to transform CH0 cells.
  • pAdD26SVpA is treated with PstI, By collecting the fragments and combining them with the CSF cDNA fragment derived from PBRV2, a recombinant vector arranged in the poly-A site of adenovirus promoter, CSF CDNA, DHFR and SV40 was transformed. It was constructed and put into CH0 cells and performed.
  • Example 31 Assay of G-CSF activity of expressed substance (1-VSE) From the culture supernatants of C127 cells and CH0 cells obtained in Examples 29 and 30, according to the method described in Example 25, Human G-CSF was obtained and its human G-CSF activity was assayed. The results are shown in Table 7.
  • Example 31 The crude CSF sample obtained in Example 31 was further purified according to the method of Example 2, (Hi). This purified CSF sample was subjected to amino acid composition analysis by the method described in Example 26-1). This result
  • Example 26-2 Using the purified CSF sample used in the above amino acid composition analysis, the same method and the same conditions as described in Example 26-2) were used. The sugar composition was analyzed. As a result of analysis, galactose, N-acetylgalactosamin and sialic acid were confirmed from the CSF of the present invention.
  • Endoxane (Shishinogi, trade name) 200fflg Z was injected intraperitoneally to an ICR mouse (male) 8-9 weeks old (body weight 35.3 soil 1.38 ⁇ f) and divided into three groups.
  • One group received a solvent containing human G-CSF (25000U mice or 50000UZ mice) (1% propanol in saline, 0.5% (W / V) mouse serum albumin), and another group received
  • the vehicle alone was subcutaneously administered four times, each at a time of 24 hours, at a dose of 0.
  • Pseudomonas aeruginosa GNB-139 (3.9 ⁇ 10 5 CFU mouse). Twenty-one hours after the infection, a solvent containing human G-CSF (25,000 UZ mouse or 50,000 UZ mouse) or the vehicle alone was again subcutaneously administered to the corresponding groups.
  • the protective effect was examined according to the number of surviving mice up to 10 days after infection.
  • ICR mice male weighing 7 weeks (weight 34.7 ⁇ 1 ⁇ 243) were treated with endoxane (manufactured by Shisai-Nogi Co., Ltd., trade name) 200 ⁇ NO ⁇ intraperitoneally and divided into two groups.
  • a group containing human G-CSF 50,000 UZ mice) containing a solvent (1% n-propanol in physiological saline, 10% (W / V) peripheral mouse serum), and another group containing only the solvent.
  • Four subcutaneous doses of 0.1 ⁇ every 24 hours, 4 o'clock after the fourth dose In the meantime, each group will be restored
  • Tests 2, 2 and 3 above were performed on the human G-CSF obtained from CHU-1 described in Reference Example 2.
  • Example 26 Test 1 The same CHO used in the amino acid composition analysis of Example 26 Test 1 described above was performed on the purified human cell-derived G-CSF sample (+ VSE).
  • Table 17 shows the results. Table 1 17 Effects on pseudomonas aeruginosa
  • Example 34 using the same purified human G-CSF sample derived from C127 cells used in the amino acid composition analysis of Example 32, the infection-protecting effect of Test 1 was examined. Similar results were obtained.
  • Example 2 The freeze-dried preparation of human G-CSF obtained in Example 2 was dissolved in a solubilizer for injection and dispensed so as to have a desired number of dosage units to obtain an injection.
  • a freeze-dried preparation of human G-CSF polypeptide from Escherichia coli obtained in Example 15 was dissolved in a solubilizer for injection and dispensed to obtain a desired number of dosage units to obtain an injection.

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Description

明 細 書 ヒ 卜顆粒球 コ ロ ニ ー刺激因子 〔技 術 分 野〕
本発明は ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子に関し、 特に主とし て ヒ 卜顆粒球系細胞のコ ロニー形成をさせるために必要な、 特異的な刺激因子、 すなわちコ ロニー刺激因子 （以下 「 CSF 」 と略記する） 活性を有するポリ ペプチドをコー ドする遣伝子、 該遺伝子を組み込んだ組換えベク タ ー、 該ベクターを含む形 質転換体並びに該形質転換体から産生された CSF 活性を有す るポリ ペプチドまたは糖蛋白質、 及び CSF を有効成分とする 感染防禦剤に関する。
〔背 景 技 術〕
2雇軟寒天培養法で、 上層に標的細胞と して骨髄細胞を、 下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養する と 、 上層の細胞 の一部が増殖分化し、 好中球系顆粒球 （以下 「顆粒球
( granulocyte) J と称す。 ） や単球マク ロ フ ァ ージからなる コ ロニーが形成されることから、 生体内にゴロニー形成を促 進する因子が存在するこ とが知られていた （ Pluznik と Sach ; J. Cel I . COBP. Physiol . , 巻 319頁 （ 1965 ) , Brad ley と Hetcal f ： Aust. J. Exp. Biol . Hed. Sci .，i4巻 287頁
( 1966))。
CSF と総称されるこの因子は、 正常に広く生体内分布する 細胞、 た とえば、 T細胞、 単球マクロ フ ァージ、 繊維芽細胞、 内皮細胞などよ り産生されるこ とが知 られている。 CSF には 顆粒球 ♦ 単球マク ロ フ ァ ージの幹細胞に作用 して、 その増殖 を刺激 し分化を誘導して、 钦寒天中で顆粒球や単球マク ロ フ ァ ー ジか ら成るコ ロ ニーを形成させる作用 をもつ 顆粒球 — 単球マク ロ フ ァ ージ CSF ( GH- CSF と略記する。 ） 、 主と し て単球マク ロ フ ァ ージのコ ロニーを形成させる作用をもつ単 球マク ロ フ ァ ージ CSF ( - CSF と略記する。 ） 、 よ り未分 化な多能性幹細胞に作用する多能性 CSF (fflUlti - CSF と略記 する。 ） 、 あるいは本発明の如き、 主 と し て 顆粒球系 コ ロ 二一を形成させる作用をもつ顆粒球 CS卩 （ G - CSF と略記す る。 ） などのサブクラスが存在 し、 それぞれのサブクラスに よ っ て標的細胞の分化段階も異なるこ とが考えられる様にな つ てきた [ Asano ί 代謝— Metabolism and Disease, 22 ' 249頁 ( 1985 ) , Yunis等 ； " Growth and Maturation
Factors ，， ， ed i ted by Gurof f , John Wi ley S Sons, NY, 1巻， 209頁 ( 1983 ) ] 。
ヒ 卜 CSF に関 してはこれまで ヒ 卜正常組織由来の CSF ゃ ヒ 卜腫瘍細胞由来の CSF について多数報告されている （例えば . Stanley 等 Fed. Proc. 35 2272 (1975) , Bu fgess等 B I ood 49 573 (1977) , Shah等 Blood 50 811 (1977) , , Fojo 等 Biochem, 17 3109 ( 1978), OKabe 等 Cancer Res 38 3910 (1978), Asano 等 Blood 49 845 ( 1977), Golde等 Blood 57 1321
(1981) , Wu等」. Bioに C em 254 6226 (1979) , Dipersio等
Blood 56 717 ( 1980) などを参照。 ） 。
しかしながらこれ等の ヒ 卜 CSF は完全に純化されたもので はなく 従っ て ヒ 卜 CSF の医薬 と し ての有用性ま たは有効性に ついて は未だ不明のま まである。
近年、 感染症頜域に於ける化学療法剤の進歩によ り 、 従来 の特定の病原性を有する強毒物質産生菌は治療可能となり 、 —方、 医療の進歩と髙齢化と ともに 、 生体防禦能の低下した 宿主 （ coinproiiiised host) の増加によ り 、 病原性は弱いが薬 剤および消毒剤に耐性な病原菌による感染 （ 日和見感染） が 臨床に於いて新たな問題を引きおこ している。 この日和見感 染症では、 薬剤抵抗性の髙ぃ細菌や、 有用な抗生物質の少な い真菌に よ り発症し 、 その治療に は従来の化学療法剤に加え 宿主の防禦能を賦活するよ う な薬剤の使用が望まれているが 現在まで有効な薬剤は見出されていない。
感染の初期に'は宿主のもつ防禦機能のう ち 白血球の貪食殺 菌作用が最も強く 影響する と考えられている事から好中球や マク ロ フ ァ ージの増殖、 分化成熟を高めるこ とによ り宿主の 感染防禦能を亢進するこ とができれば有効な感染治療薬 とな り得る可能性が示唆される。
従 っ て純粋な ヒ 卜 CSF の大量生産の研究が活発に行われて いるが現在 ま で成功 し たもの はない 。 こ の ' う な状況に 於 いて本発明者等は口腔底癌患者の腫瘍細胞か ら極め て 髙ぃ ヒ 卜 G - CSF 産生能を有し、 かつ良好な増殖能を示す細胞株
CHU - 1 を樹立し、 （ C.N. H.受託番号 「 1 — 315 」 ） 、 こ の細胞株の培養上清から ヒ 卜好中球の コ ロ ニー形成促進活性 を示す純粋な ヒ 卜 CSF の単離に初めて成功 した （特願昭 59 -- 153273号 ） 。 本発明者等は感染動物モデルを用いてこの ヒ 卜 G - CSF の 感染防禦効果を調べたところ、 ヒ 卜 G - CSF が in vivo に於 いて顕著な好中球の成熟能を有し、 従っ て感染防禦効果を示 したことから感染症治療薬と して有効であることを見出した 次いで本発明者等は同じ く ヒ 卜口腔底癌由来の細胞株 CHU
- 2を樹立し （ 1<. ^受託番号 1 ー 483)、 この細胞株の培 養上清からも CHU — 1 由来のものと全く周一の G - CSF を単 離した。
しかしながら、 このように細胞培養法を用いて、 その培養 上清から（3 - CSF を単離する方法は、 G - CSF が低濃度しか 産生されないこと、 大量の培養液から微量の G - CSF を得る には複雑な精製過程を必要とするなどの難点をかかえ未だ大 量の均一な G -.CSF を得るには至っていない。 従って、 耝換 え DNA 技術を甩いて G - CSF を大量に製造するこ とが渴望さ れていた。
〔発明の開示）
本発明は、 ヒ 卜 G - CSF 活性を有するポリ ペプチドをコ一 ドする遣伝子を提供するものである。
本発明はまた、 該遺伝子を組み込んだ耝換 'えベクタ ーを提 供する。
本発明はまた、 該耝換えベク タ ーで宿主を形質転換した形 質転換休および該形質転換体によ っ て産生されるポリ ぺプチ ドまたは糖蛋白質を提供する。
本発明は更に ヒ 卜 G - CSF を有効成分とする感染防禦剤を も提供するものである。 〔 図面の簡単な説明 〕
図 1 はプロ ーブ （ IWQ)、 プロ ーブ（A) およびプロ ーブ （ LC) の配列を示す。
図 2 は PHCS— 1 イ ンサー トの塩基配列を示す。
図 3 (A) は !) BRG4 の CDNAイ ンサー トの塩基配列を示す。
図 3 (B) ( I ) は PBRG4 CDNAから演ぇき した ヒ 卜 G - CSF 前駆体のアミ ノ 酸配列を示す。
図 3 (B) ( I ) は PBRG4 CDNAから演ぇき した ヒ 卜成熟 G - CSF のアミ ノ酸配列を示す。
図 4 (A) は PBRV2の cDNAイ ンサー トの塩基配列を示す。
図 4 (B) ( I 〉 は PBRV2 CDNAから演ぇき し た ヒ 卜 G - CSF 前駆体のア ミ ノ酸配列を示す。
図 4. (B) ( I ) は PBRV2 CDNAから演ぇき した ヒ 卜成熟 G - CSF のアミ ノ酸配列を示す。
図 5 は PBRG4 ま た は f)BRV2 由来 ヒ 卜 G - CSF CDNAの制限酵 素切断部位を示す。
図 6 は tac プロ モー タ ー含有ベク タ ーの調製プロ セスの一 部を示す （ + VSE 系） 。
図 7 は合成 P L プロモー タ ー含有べク タ一''の調製プロ セス を示す （ + VSE 系） 。
図 8 は trp プロ モータ ー含有ベク タ ーの調製プロセスを示 す （ + VSE 系） 。
図 9 は tac プロモータ ー含有ベク タ ーの調製プロセスの一 部を示す （ - VSE 系 ） 。
図 10は合成 P L プロモー タ ー含有べク タ ーの調製プロセス を示す （ — VSE 系） 。
図 11は trp プロ モータ 一含有ベク タ ーの調製プロセスを示 す （ - VSE 系） 。
図 12は PHGA410 の概略構造を示す。
図 13は発現用組換えべクタ 一 f)TN - G4の構築プロ セスを示 す。
図 14a および図 14b は pHGG4 - dhf rの構築プロ セスを示す 図 15は PHGV2の概略構造を示す。
図 16は発現用耝換えベクタ ー pTN- V2の構築プロ セスを示 す。
図 17a および図 17b は発現用耝換えベク タ ー PHGV2 - dhfp の構築プロ セスを示す。
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明に よる ヒ 卜 G - CSF 活性を有するポリ ペプチ ドをコ ー ドする遺伝子はシ ョ 糖密度勾配遠心法によ り 15〜17S 画分 と して得られる、 ヒ 卜 G - CSF 活性を有するポ リ ペプチ ドを コ ー ドするメ ッ センジ ャ ー RNA (mRNA)に相補的な DNA (cDNA) である α
本発明者等は 2系列のこのような CDNAを得'た。
そのう ちの 1 つの系列の cDNAは図 3 (B) のポ リ ペプチ ド I 又は IIをコ ー ドする遣伝子あるいはその一部を有するもので あり 、 さ ら に詳細に は図 3 (A) の塩基配列の 5 ' —末端から 32〜 34ヌ ク レオチ ド位の ATG から 650〜 652 ヌ ク レオチ ド位 の CCC までの配列、 122〜124 位の ACC から 650〜652 位の CCC までの配列または図 3 (A) に記載された配列あるいはそ の一部を有するものである。 この系列の CDNAを CDNA ( +VSE) と称する。
他の系列の CDNAは図 4 (B) のポ リ ペプチ ド I又は IIをコ ー ドする遺伝子あるいはその一部を有するものであ り 、 さ ら に 詳細には図 4 (A) の塩基配列の 5 ' —未端から 31〜33ヌ ク レ 才チ ド位の ATG から 640〜 642ヌ ク レオチ ド位の CCC までの 配列、 121〜123 位の ACC から 640〜642 位の CCC までの配 列 ま たは図 4 (A) に記載された配列あるいはその一部を有す るものである。 この系列の CDNAを cDNA (— VSE)と称する。
本発明の遣伝子は例えば G - CSF 活性を有するポリ ぺプチ ドを産生する能力を有する哺乳動物細胞等から G - CSF をコ - ドする mRNAを調製 した後、 既知の方法によ り 2本鎖 CDN Aに 変換するこ とによ っ て得られる。
前記、 mRNAの供給源となる哺乳動物細胞は本発明において は、 ヒ 卜口腔底癌由来の細胞株 CHU-2 ( Col lection
Nat i ona I e Oe Cu I tures De H i c roorgan i smes (C. N. C. H)^ ft 番号 I — 483)であるが、 腫瘍細胞株にかぎらず、 哺乳動物か ら分離できる細胞、 あるいは樹立した他の細胞株でもよい。 又、 1DRNAの調製はすでに他のいくつかの生理''活性タ ンパクの 遺伝子を ク ロ ー ン化する際、 用 い ら れた 方法 、 例 え ば 、 パ ナジ ゥム複合体等の リ ポヌ ク レア ーゼ イ ン ヒ ビ タ ー存在下 に界面活性剤処理、 フ I ノ ール処理を行う （ Bergerと
Bi rkenmeier ； Biochemistry jj巻 5143頁 ( 1979 ) を参照） か、 グァニジンチ才シアナ一 卜処理後、 CsCI密度勾配遠心を 行う （ Chi rgwin等 ； B i ochem i st ry 18巻 5294頁 （ 1979 ) を参 δ 照） こ と に よ っ て、 全 RNA を得た後、 才 リ ゴ （ dT ) — セル口 一スゃセフ ァ ロ ース 2Bを担体とするポ リ U—セフ ァ ロ ース等 を用いた ァフ ィ 二テ ィ ーカ ラム法あるいはパッ チ法によ り ポ リ （ A+ ) RNA ( inRNA) を得るこ とができる。 またシ ョ 糖密 度勾配遠心法等によ りポ リ （ A+ ) RNA を更に分画するこ と もできる。 上記の如く して得られた mRNAが、 G - CSF 活性を もつポ リ ペプチ ドをコ ー ドするものであるこ とを確認するた めに は、 mRNAをタ ンパク質に翻訳させ、 生理活性を調べるか、 抗 G - CSF 抗体を用いてそのタ ンパクを同定する等の方法を 行えばよい。 例えば、 アフ リ カ ッメ ガエル （ Xenopus laevis) の卵母細胞に BiRNAを注入 して翻訳させた り （ Gurdon等 ；
Nature, 巻 177頁 （ 1972 ) を参照） 、 あるいはゥサギ網 状赤血球 （ Reticulocyte) 系や小麦胚芽 （ Wheat germ) 系を 利用 した翻訳反^が行われている （ Sctileif と Wens ink ； .、 " Practical Methods in Molecular Biology" ， Springer- Verlag, NY, (1981)) 。 G - CSF 活性の検定は骨髄細胞を用 いた軟寒天培養法を適用 して実施できる。 それらの手法につ いて は総説がある ( Hetca I f ； " Hemopoietic Colonies" , Spr i nger - Ver I ag, Berl in, Heidei bepg, NY ( 1977) α
前述の如き方法で得た mRNAを铸型に して 1 本鎖 cDNAを合成 した後、 この 1 本鎖 CDNAから 2本鎖 CDNAを合成し、 適当なベ ク タ一 DNA との耝換えプラス ミ ドを作成する。 これで大腸菌 ( Escherichia col i ) などを形質転換 して、 形質転換株の
DNA 群 （ 以下、 cDN Aライプラ リ ー と称する。 〉 を得る。
mRNAから 2本鎖 CDNAを得るには、 例えば mRNAの 3 ' —末端 にあるポ リ A—鎖に相補的なオ リ ゴ （ dT) をプライマー と し て逆転写酵素で処理するか、 ま た は G - CSF タ ンパクのア ミ ノ酸配列の一部に相応する才 リ ゴヌ ク レオチ ドを合成し 、 こ れをプライマー と して逆転写酵素で処理 し て mRNAに相補的な cDNAを合成する。 2本鎖 CDNAは、 アルカ リ 処理で mR Aを分解 ♦ 除去した後、 得られた 1 本鎖 CDNAを逆転写酵素又は DNA ポ リ メ ラ一ゼ （例えば Klenow断片等） 処理後 S 1 ヌ ク レア一ゼ 等で処理 して得るか、 あるいは、 直接 RNase H および DNA ポ リ メ ラーゼ （例えば、 大腸菌の ポ リ メ ラーゼ I等） 等で 処理するこ と によ つ ても得るこ とができる （ 例えば、
Maniatis等 ； Molecular cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory ( 1982 ) および Gub I erと Ho f f man ； Gene 25^ 263 頁（ 1983)を参照。 ） 。
このよ う に して得られた 2本鎖 CDNAを適当なべク，タ ー、 例 えば、 PSC101, pOF41 , Col E1 , pMB9, pBR322, pBR327,
PACYC1などに代表される EK型プラスミ ドベク タ ーや、 ；i gt, λ c , λ gt10, λ gtWES などに代表さ れる フ ァ ー ジベク タ ー などに組み込んだ後、 大腸菌 （ X1776 ； HB101 ： DH1 , C600 株など ） 等を形質転換して cDNAライブラ リ ー'を得るこ とがで きる （例えば、 前出 "Molecular cloning " を参照） 。
2本鎖 cDNAをべク タ 一 と連結させるに は、 末端に連結 可能な末端をつけるべく 、 適当な化学合成 DNA 断片を追加 し、 予め制限酵素を用いて開裂させたベク タ ー！) と ATP 存在下 に T4フ ァ ージ DN A リ ガーゼで処理するこ とによ り行う こ とが できる。 あるいは、 予め制限酵素を用いて開裂させたベク タ - ONA と 2本鎖 CDNAのそれぞれに dG, dC—鎖 （ あるいは dA, dT—鎖 ） を付加 した後、 例えば両 DNA を含む溶液を徐冷する こ とに よ つ ても行う こ とができる （ 前記 Molecular cloning を参照） 。
こう して得られた組換え DNA 体による宿主钿胞の形質転換 は、 例えば宿主細胞が大腸菌の場合 Hanahan が詳細に記述 し ている如き方法 （ J.Hol. Biol. ：— 巻 557頁（1983)) 、 す なわち、 CaC 2 や HgC 2 又は R()Cil を共存させて調製し たコ ンビテン 卜細胞に該耝換え DN A 体を加えるこ とによ り実 施するこ とができる。
目的とする遣伝子を保有する翱胞を検索するには、 イ ンタ 一フ エ ロ ン CDNAのク ロ ーン化で用い られたプラス—マイ ナス 法 ( Taniguchi 等 ； Proc. Jpn. Acad. 55 巻 Ser. B, 464頁 (1979)) や、 ハイプリ ダイゼーシ ヨ ン - 卜ランス レーシ ヨ ン ア ツ セィ法 （ Nagata等 ： Nature_H巻 316頁（1980)) など、 又は該タ ンパク質のアミ ノ酸配列をも とに して化学合成した 才 リ ゴヌ ク レオチ ドプロ ーブを用いた コ ロ ニーあるいはブラ ークハイプリ ダイゼーシ ヨ ン法 （ Wal lace 等 ； Nucleic Acids Res. , t巻 879頁（1981)) などを用いればよい。
このよう に してク ロ ーン化された ヒ 卜 G - CSF 活性を有す るポリ ペプチ ドをコ ー ドする遣伝子を含む断片は適当なべク タ ー DNA に再び組み込むこ とによ り 、 他の原核生物または真 核生物の宿主細胞を形質転換させるこ とができる。 更に これ らのベク タ ーに適当なプロモー タ ー及び形質発現に係る配列 を導入するこ とに よ り 、 それぞれの宿主細胞に於いて遺伝子 を発現させるこ とが可能である。
原核生物宿主綑胞と して は、 例えば Escherichia col i , Baci l lus subt i Ms, Baci l lus theriuoph i I us等が挙げられる， 目的の遺伝子をこれ等の宿主細胞内で形質発現させるには、 宿主と適合 し得る種由来の レブリ コ ン、 すなわち複製起源お よび調節配列を含んでいるプラスミ ドベク タ ーで宿主細胞を 形質転換させればよい。 ま たベク タ ーは形質転換細胞に表現 形質 （表現型 ） の選択性を付与するこ とができる配列をもつ ものが望ま しい。
例えば、 E. col i は、 それを宿主とするベク タ ーである
PBR322を用いて形質転換するこ とができる （ Bol iver 等 ； Gene 2巻 95頁（ 1975 )を参照 ） 。 PBR322はアン ピシ リ ンおよび テ 卜 ラサイ ク リ ン耐性の遺伝子を含んでお り 、 どち らかの耐 性を利用するこ とによ っ て形質転換細胞を同定するこ とがで きる。 原核生物宿主の遺伝子発現に必要なプロ モータ ー と し て は、 /3 — ラク タマーゼ遺伝子のプロモー タ ー （ Chang 等 ： Nature_ ^巻 615頁（ 1978)) 、 ゃラク 卜 ースプロ モータ ー
( Goeddel 等 ：
Figure imgf000013_0001
544頁（ 1979)を参照。 ） および ト リ プ 卜 フ ァ ンプロ モー タ ー （ Goeddel 等 ：" Nucleic Acid Res. ) L巻 4057頁（ 1980)を参照） 等があげられ、 どのプロ モ 一タ ーも本発明の ヒ 卜 G - CSF 活性をもつポリ ペプチ ドの産 生に使用するこ とができる。
真核生物のう ち、 真核微生物の宿主細胞と して は、 例えば Saccharorayces ce rev i s i aeなどが挙げられ、 プラスミ ド YRp7 ( Stinchcomb等 ； Nature 282巻 39頁（ 1979)などを参照） 等 に よ っ て形質転換するこ とができる。 このプラスミ ドは、 卜 リ ブ 卜 フ ァ ンを生産する能力を欠く酵母株に対する選択マー カ ー となる TRP1遺伝子を有 し、 卜 リ ブ 卜 フ ァ ンの非存在下で 発育させるこ とによ っ て形質転換体を選択するこ とができる 遣伝子発現に利用可能なプロ モータ ー と して は、 酸性ホスフ ァ タ ーゼ遺伝子プロモータ ー （ Hiyanohara等 ： Proc. Natl. Acad. Scに USA_^_巻 1頁（1983)) やアルコ ールデ ヒ ドロゲ ナーゼ遣伝子プロモータ - ( Valenzuela等 ； Nature 298巻 , 347 頁（ 1982)) などが挙げられる。
哺乳動物細胞由来の宿主,細胞と しては、 COS 細胞、 チヤ ィ ニーズ ハムスタ ー卵巣 （ CH0)細胞、 C - 127細胞、 He 細 胞などが挙げられ、 これ等の細胞を形質転換させるベク タ ー と し ては、 pSV2— gpt (Mu I.I i gan と Berg ; Proc. Nat I .
Acad. Sci . USA； 巻 2072頁（1.981)を参照） 等がある。 これ 等のベク タ ーは複製起源、 選択マーカ ー、 発現させよう とす る還伝子の前に位置するプロ モー タ ー、 RNA スプライ ス部位 ポリ アデニル化シグナルなどを含んでいる。
哺乳動物細胞における遣伝子発現のプロ モー タ ー と して は レ ト ロ ウイルス、 ポリ オ一マウィルス、 アデノ ウイルス、 シ ミ アンウ ィ ルス 40 ( SV40) などのプロ モー タ ーを用いればよ い。 例えば SV40のプロモー タ ーを使用する場合は、 Mul l igan 等の方法 （ NatureJU巻 108頁（ 1979)) に従えば容易に実施 するこ とがでさる。
複製起源と して は、 SV40、 ポ リ オ一マウィルス、 アデノ ウ ィ ルス、 牛パピロ ーマウ ィルス （ BPV)等の由来のものを用い るこ とができ、 選択マー カ ー と して は、 ホスホ 卜 ラ ンスフ エ ラーゼ APH ( 3' ) Iあるいは I ( neo)遺伝子、 チミ ジンキナ ーゼ （ TK ) 遣伝子、 大腸菌キサンチン—グァニンホスホ リ ポ シル 卜 ランスフ ェ ラーゼ （ Ecogpt) 遺伝子、 ジ ヒ ドロ葉酸還 元酵素 （ DHFR) 遺伝子等を用いるこ とができる。
以上の如き宿主一ベク タ ー系を用いて ヒ 卜 G - CSF 活性を 有するポ リ ペプチ ドを得るに は、 上記ベク タ ーの適当な部位 に該遣伝子を組み込んだ耝換え 体に よ り宿主細胞を形質 転換させた後、 得られた形質転換体を培養すればよい。 さ ら に細胞内また は培養液から該ポリ ペプチ ドを分離 ♦ 精製する に は、 公知の手段を用いて行う こ とができる。
一般に真核生物の遺伝子は ヒ 卜 イ ン タ ーフ ェ ロ ン遣伝子等 で知 られているよ.う に、 多形現象 （ polymorphysm) を示す と 考えられ、 （ 例えば Nishi 等 ： 」， 810(^6!!1._^_巻 153頁 (1985)を参照 ） 、 この多形現象に よ っ て 1 個ま たはそれ以上 のア ミ ノ酸が置換される場合もあれば、 塩基配列の変化はあ つ ても ア ミ ノ酸は全く 変わ らない場合もある。
ま た例えば図 3 (B) アミ ノ酸配列の中の 1 個ま たはそれ以 上のアミ ノ酸を欠く か又は付加されたポ リ べ'プチ ド、 あるい は 1 個ま たはそれ以上のアミ ノ酸が 1 個ま たはそれ以上のァ ミ ノ酸で置換されたポ リ ペプチ ドでも G - CSF 活性を有する こ とがある。 例えば、 ヒ 卜 イ ンタ ー ロ イキン 2 ( U— 2 ) 遣 伝子のシスティ ンに相当する塩基配列をセ リ ンに相当する塩 基配列に変換して得られたポリ ペプチ ドがイ ンタ ー ロイキン 2活性を保持するこ ともすでに公知 とな っ ている （ Wang等 ； ノ
Science, 巻 1431頁（1984)) 。 それゆえ、 それ等天然に存 在するかあるいは人工合成されたポ リ ペプチ ドが ヒ 卜 G - C8F 活性を有する限りそれ等のポ リ ペプチ ドをコ ー ドする遺 伝子は全て本発明に含まれる。
本発明の ヒ 卜 G - CSF 活性をもつポリ ペプチ ドをコ ー ドす る遣伝子、 該遺伝子を有する耝換えべク タ一及びこれを有す る形質転換体、 さ ら にこの形質転換体において発現された ヒ 卜 G - CSF 活性を有するポリ ペプチ ドまた は糖蛋白質を得る 方法について簡単に説明すると以下の通りである。
(1) プロ ーブの調製
腫瘼細胞株 CHU-2 の培養上清から精製して得られた均一 ヒ 卜 CSF ♦ タ ンパクについて Ν 末端よ り アミ ノ 酸配列を決定 し さ ら にブロムシアン分解、 卜 リ ブシン処理などによ り断片化 した後その断片についてもア ミ ノ酸配列を決定 した。
〔実施例 3 ( i) , (i i ), ( ϋί ) )
そのアミ ノ酸配列中から図 1 に示される配列に対応する 3 種類のヌ ク レオチ ドプロ ーブ（A) 、 プロ ーブ （ LC) およびプ ロ ープ （ IWQ)を合成した。 （実施例 4 ) プロ ーブ（A) は連続 した 14個のヌ ク レオチ ドからなる混合型プ口''一ブである。 プロ 一プ （ IWQ)は、 ヒ 卜 コ レシス 卜 キニン遛伝子のク ロ ー ン化で用い られた如き （ Takahashi 等 ； Proc. Natl . Acad. Scに， USA, ^巻 1931貢（ 1985)) デ才キシイ ノ シンを使用 し た 30個の連続したヌ ク レオチ ドである。 プロ ーブ （ LC) は実 施例 3 ( i ) に示したアミ ノ酸配列の N末端から 32〜 39番に相 当する部分を、 図 3 に示 した塩基配列を基に して合成した 24 個のヌ ク レオチ ドからなるプロ ーブである。
ヌ ク レオチ ドの化学合成は改良型ホスホ 卜 リ エステル法を 固相法に適用 して行う こ とができ、 Narangの総説に記述され ている （ Tetrahedron ^巻 3-22頁（ 1983) ) 。
使用するプロ ーブは、 本発明で用いたプロ ーブ以外の位置 のアミ ノ酸配列に基づく ものであ っ てもよい。
(2) cDNAライブラ リ ーの構築
CHU-2 钿胞にグァニジンチオシアナ一 卜溶液を加えてホモ ジナイズ し、 CsCI密度勾配遠心法に よ り全 RNA を得る。
この全 RNA から才 リ ゴ （ dT) セルロ ースカ ラムによ り ポリ ( A+ ) RNA を選別 した後、 逆転写酵素によ り 1 本鎖 CDNAを 合成し、 RNase H および E. col iDNAポ リ メ ラーゼ Iを加えて •2本鎖 cDNAを得た 。 得られた 2本鎖の cDNAに dC鎖を付加 し、 Pst I切断部位に dG鎖を付加 した PBR322ベク タ 一 とつなぎ合 せて 、 大腸菌 X1776 株を形質転換させ、 PBR322系 CDNAライブ ラ リ ーを構築 した 。 （実施例 5 , 6 )
同様に、 EC0RI リ ンカ一を用いて 、 2本鎖 cDNAを ； I gt10ベ ク タ 一 と連結し 、 ス フ ァ ージ系 CDNAライブラ リ ーを構築した (実施伢 7 ) "
(3) スク リ ーニング
PBR322系 CDNAライブラ リ ー由来の組換え体をヮ ッ 卜マ ン
541 逋紙に固定 し、 "2Pで放射標識したプロ ーブ （ IWQ)を用 いて 、 コ ロ ニーハイプリ ダイゼーシ ヨ ンを行っ た結果、 1 個 のク ロ ーンが選別できた。 このク ロ ーンを、 サザンブロ ッ テ イ ング法 （ Southern； J. Hoi . Biol . 98巻 503頁（ 1975 ) ) を 用いて更に詳細に検討 した ところ、 プロ ーブ（A) とも Λイブ リ ダィズした。
このク ロ ーンの塩基配列をジデ才キシ法 （ Sanger ;
Science 巻 1205頁（1981 ) ) によ っ て決定 した 。
得られた CDNAイ ンサー トの塩基配列を図 2に示す。 図 2に 示される如く 、 この cDNAイ ンザ - 卜 はプロ ーブ （ IWQ)および プロ ーブ（A) を含む 308塩基対からな り 、 実施例 3 ( iii ) に 示した ア ミ ノ酸配列を含む 83個のア ミ ノ酸をコ ー ドする才ー プン リ ーディ ングフ レームを有しているこ とがわかっ た。 この 308塩基対を含む PBR322由来のプラスミ ドを以下 pHCS-1 と略記する。 （実施例 8 〉
pHCS-1から得られる 308塩基対を含む DNA 断片をニッ ク 卜 ランス レーシ ヨ ン法 （前出、 Molecular cloning を参照 ） に て放射標識 し、 これをプロ ーブと して ； l gt10由来の cDNAライ ブラ リ ーをプラー クハイプリ ダイゼーシ ヨ ン （ Bentonと
Davis ； Science 巻 180頁（ 1977)) に よ りスク リ ーニン グして 5個のク ロ ーンを得、 cDNAを含むと思われるク ロ ーン についてその塩基配列を前述と同様の方法で決定 した 。 （ 図 3 (A)) -'
図 3 (A) に示される如く 、 この cDNAイ ンサー ト は一つの大 きなオープン リ ーディ ングフ レームを有する。
この cDN Aによ っ てコ ー ドされるアミ ノ酸配列は図 3 (A) に 示された如 く 演えきできる。
実施例 3 (i) に示されている G - CSF タ ンパクの N末端ァ ミ ノ酸配列 との比較に よ り 、 本 CDNAは 5'—末端から 32〜 34ヌ 1 ク レオチ ド位の ATG 配列から始ま り 、 119〜121 位の GCC 配 列で終わる 90塩基対によ っ てコ ー ドされるシグナルペプチ ド および 122〜124 位の ACC 配列から始ま り 650〜652 位の CCC 配列で終わる 531塩基対によ っ て コ ー ドされる成熟 G - CSF ポリ ペプチ ドに相当する塩基配列を含んでいるこ とがわ かっ た。 従っ て図 3 (B) に示されたアミ ノ酸 K列 Iのポリ べ プチ ドは 207個のア ミ ノ酸からな り 、 その分子量は
22292.67 ダル ト ン と計算された。 同様にアミ ノ酸配列 Eの ポ リ ペプチ ドは 177個のアミ ノ酸からなり 、 その分子量は 18986.74 ダル ト ンであ っ た 。 （実施例 9 )
但し タ ンパク質の開始部位に関 しては、 32〜 34位あるいは 68〜70位の 了6 も同様に考え得る。 ECOR1 切断部位にこの cDNA ( + VSE)を挿入 し た、 PBR322を保持するェシエ リ ヒ ア · コ リ （ E.col i) X1776 株は、 工業技術院微生物工業技術研究 所に寄託されている （ FERH寄託番号 BP-954 ) 。
図 5に は、 得られた遺伝子の制限酵素切断部位を示した。 ま た、 この cDNAを PBR327 [ Soberon 等 ； Gene j巻 287頁 ( 1980) ] と EcoRI部位で結合したプラス ミ ドを PBRG4 と称す る。 '
このよう に して得られた PBRG4 を、 制限酵素 EcoRIで処理 し て得られる約 1500塩基対の CDNAを含む DNA 断片をニッ ク 卜 ランス レーシ ヨ ン法 （前出の Holecular cloning を参照 ） に て放射標識し 、 これをプロ ーブと して 、 再び i gt10由来の cDNAライブラ リ ーをプラー クハイプリ ダイゼーシ ヨ ン （前出 Bentonと Davis の文献参照） によ り スク リ ーニング した。 こ の際、 周時に ス フ ァ ージ DN A を固定 した二 卜 ロ セルロ ース濂 紙を 2枚作成しておき、 先に述べたプロ ーブ （ LC) にて同様 のプラー クハイプリ ダイゼー シ ヨ ンを行い、 両プロ ープでポ ジティ ブとなるフ ァ ージを選別 した。 完全長と思われるク ロ ーンを選別 し、 ジデォキシ法を用いて cDNAイ ンサー トの塩基 配列を決定 した ところ図 4 (A) に示される如くであ っ た 。
この CD は一つの大きなオープン リ ーディ ングフ レームを 有し、 コ ー ドされるアミ ノ酸配列は図 4 (A) に示された如 く 演え き 3 -& o
実施例 3 (i ) に示されている G - CSF タ ンパクの N末端ァ ミ ノ酸配列 との比較によ り 、 本 CDNAは 5'—末端から 31〜 33ヌ ク レオチ ド位の ATG 配列から始ま り 、 118〜 120 位の GCC 配 列で終わる 90塩基対に よ っ て コ ー ドされるシグナルペプチ ド および 121〜 123 位の ACC 配列から始ま り 640〜642 位の CCC 配列で終る 522塩基対に よ っ て コ ー ドされる成熟 G -
CSF ポ リ ペプチ ドに相当する塩基配列を含んでいるこ とがわ かっ た。 従っ て図 4 (B) に示された アミ ノ酸配列 I のポ リ ぺ プチ ドは 204個のア ミ ノ酸からな り 、 その分子量は
21977.35 ダル ト ン と計算された 。 周様に アミ ノ酸配列 E の ポリ ペプチ ドは 174個のア ミ ノ酸からな り 、 その分子量は 18671.42 ダル ト ンであ っ た。 （ 実施例 10)
但し タ ンパク質の開始部位に関 しては、 31〜33位以外に 58 〜 60位あるいは 67〜 69位の ATG も同様に考え得る。
EcoRI 切断部位に本 CDNA ( — VSE)を挿入した PBR327を保持 するェシ エ リ ヒ ア ♦ コ リ （ E. col i )X1776株は工業技術院微生 物工業技術研究所に寄託さ れている （ FERH寄託番号 BP-955 ) 図 5に は、 得られた遣伝子の制限酵素切断部位を示 した 。 ま た、 この CDNAを PBR327と EcoRI部位で結合 したプラス ミ ドを PBRV2 と称する。
(4) 大腸菌用耝換えベク タ ーの構築
(A) + VSE 系耝換えべク タ一
かく し て得られた PBRG4 プラス ミ ド （ 実施例 9 ) から G -
CSF ポ リ ぺプチ ドの CDNA断片を制限酵素に よ り切り 出 して来、 て 、 これと
① tac プロ モー タ ーを含有する PKK223-3 ( フ アルマシア 社製） から調製した断片と アニー リ ング した合成 リ ンカ 一を連結 （ ライゲーシ ヨ ン ） し耝換えベク タ ーを構築す るか （実施例 11) ( 図 6 ) 、
② P L プロ f - タ ーを含む pPL- lambda ( フ アルマシア社 製 ） から調製 し た 3種の断片と アニー リ ングした合成 リ ンカ ーを連結し、 再調製 し て耝換えベク タ ーを構築する か （ 実施例 12) ( 図 7 ) 、
あるいは
③ trp プロ モータ一含有 P0YIプラスミ ド'から調製した断 片と アニー リ ング した合成 リ ンカ一を連結して耝換え ベ ク タ ーを構築する （実施例 13) ( 図 8 〉 。
(Β) — VSE 系組換えベク タ ー
PBRV2 プラス ミ ド （実施例 10) を用いて周様に 3種の耝換 えべクタ -を構築する （ 実施例 18) ( 図 9 , 図 10, 図 11) 。 《5) 大腸菌を宿主とする形質転換体の調製と培養、 発現。 次に上記 + VSE 系および一 VSE 系についての各々 3種の組 換えべク タ 一を用いて前出の Mol ecu l ar c loni ng に記載され ている塩化カルシウム法又は塩化ルビジウム法で、 夫々
E. Col i DH1株、 E. col i N4830株或いは E · co I i 105株を形質 転換 した 。 （実施例 11 , 12, 13および 18) 得られた形質転換 株をアン ピシ リ ン含有ルリ ア （ Luria)培地で まず培養し次い で必要に応じて、 適宜誘導をかけ、 培養を行い形質発現せ し めた。 （ 実施例 14および 19)
(6) 大腸菌からの G - CSF ポリ ペプチ ドの回収精製と
アミ ノ 酸分析
形質転換株の培養液を遠心にかけ集菌 した後リ ゾチーム処 理を し、 凍結—融解をく り かえ し溶菌さ せて上清を得るか、 塩酸グァニジン処理後遠心で上澄液を得る。
これを in trogel ACA54カ ラム（ LKB社製） でゲル癍過し、 活 性画分を限外濂過器で濃縮 した 。
次に 、 n プロパノ ールを含む 卜 リ フル才 ロ酢酸水溶液を添 加 し 、 氷中放置、 遠心分離し 、 逆相 C 18カ ラムに吸着、 溶出 操作を施す。 溶出後各画分の活性を調べ、 活'性ピークを集め 再度上記と周様の精製操作を行っ た後凍結乾燥 した。 この凍 結乾燥粉末を溶解し、 高速分子ふるいク ロマ トグラ フ ィ ーに かけるこ とによ り取得したポ リ ペプチ ドを SDS—ポリ アク リ ルアミ ドゲル電気泳動にかけ目 的とする G - CSF ポ リ ぺプチ ドを示す単一のパン ドを確認 した 。 （実施例 15および 19) こ の様に し て得られたポリ ペプチ ドは ヒ 卜 G - CSF 活性を示し た。 （ 実施例 16および 19〉 更に、 得られた G ·· CSF ポリ ぺプ チ ドのアミ ノ酸分析はア ミ ノ酸組成を 日立 835アミ ノ酸自動 分析装置 （ 日立製作所製） を使用 し、 特殊ア ミ ノ酸分析法に よ っ て分析 した。 又、 N末端ア ミ ノ酸分析は気相式シー クェ ンサーを用いて エ ドマン分解し 、 高速液体ク ロマ 卜グラ フ ィ 一及び、 intrasphere - ODS カ ラムを用いて行っ た。 （実施 例 17および 20)
(7) 動物細胞用耝換えベク タ ーの構築
宿主動物細胞と して C127細胞、 ΝΙΗ3Γ3細胞を使用する場合 の組換えべク タ 一 (BPV由来） および CH0 細胞を使用する場合 の耝換えベクタ ー （ dhfr由来 〉 の構築を + VSE 系、 — VSE 系 について各々行っ た。 ここでは C127細胞および CH0 細胞用耝 換えベク タ ーの構築について略記するが詳 し く は実施例を参 照されたい。
(A) + VSE 系耝換えベク タ ーの構築
上記 (3)で得られた CDNA ( + VSE)断片をベク タ ー pdKGR に 組み込み PHGA410 プラス ミ ド と した後 （実施例 21) ( 図 12) これを EcoRIで部分消化 し、 末端をプラン 卜エン ド （ blunt end)にする。 この DNA に H i nd ϋ リ ンカ 一を付'加 し 、 次いで H i ndUI処理を し T4DHA リ ガ一ゼ処理した後これで塩化ルビジ ゥム法 （ 前出 Molecular cloning 参照） を用。い、 E.col i DHI 株を形質転換した。 得られたプラスミ ドを PHGA410(H)と命名 する。 （ 図 13)
pHGA410(H)を Sal Iで処理し 、 次いで末端をプラン 卜 ェン ド化 した後再び Hind 処理し Hindm— Sal I断片を回収する 一方、 ゥ シ乳頭腫ウ イ ルスの形質転換断片を有する P( 1>V-1 プラスミ ドを Hi ndlE , Pvu Eで処理 し大きいほうの DNA 断片 を分離し、 これと先の Hind ID— Sal I断片を結合する。 これ を用いて E.col i DHI株を形質転換し PHGA410 由来の CSF- CDNAを有するプラス ミ ド、 PTN- G4を得る （ 図 13) (実施例 22) 。
一方、 PHGA410 プラスミ ドか pHGA410(H)ブラスミ ド と pAdD26SVpAプラス ミ ドを用いて CH0 細胞用耝換えベクタ ー ( + VSE)である PHGG4 - dh を構築した （ 図 14a および b) (実施例 24) 。
(B) - VSE 系耝換えベク タ ーの構築
上記（3)で得られた cDNA ( — VSE)断片をベクタ ー pdKCR に組 み込み PHGV2 プラスミ ドと した後 （実施例 27) これを EcoRI で部分消化 し、 末端をブラン 卜 エン ド （ unt end)にする。 この DNA に Hind IE リ ンカ一を付加 し、 次いで H i nd DI処理を し T40NA リ ガ -ゼ処理 した後、 これで塩化ルビジウム法 （ 前出 Molecular cloning 参照 ） を用い、 E.col i DHI株を形質転換 した。 得られたプラス ミ ドを pHGV2(H)と命名する。 （ 図 16) i)HGV2(H)を Sal Iで処理 し 、 次いで末端を 'ブラン トエン ド 化 し た後再び Hind DI処理 し Hind IE— Sal I断片を回収する一 方、 ゥ 乳頭腫ウィルスの形質転換断片を有する pdBPV-1 プ ラス ミ ドを HindU , Pvu IIで処理 し大きい方の DNA 断片を分 離し、 これと先の Hindn— Sal I断片 を結合する。 これを用 いて E.col i DHI株を形質転換し pHGV2 由来の CSF- cDNAを有 するプラスミ ド、 pTN- V2を得る （ 図 16) (実施例 28) 。 + VSE と同様に PHGV2 プラスミ ドか PHGV2(H)ブラスミ ド と pAdD26SVf)Aプラス ミ ドを用いて CHO 細胞用耝換えベク タ ー ( 一 VSE)である PHGV2 - dhf rを構築した （ 図 17a および b) ( 実施例 30) 。
(8) 動物細胞による形質発現
こ こではマウス C127細胞による形質発現を例に してその概 要を説明する。 詳し く は各実施例を見られたい。
PTN - (34プラス ミ ド ま たは pTN - V2プラスミ ドを BamH Iで 処理 してお く 。 これを用いて培養増殖させておいた C一 127 細胞を リ ン酸一カルシウム法で形質転換する。 形質転換細胞 は培養され CSF 生産能の高いク ロ ー ンが選別される。 形質発 現 G - CSF の糖蛋白質はこの形質転換細胞の培養液から回収 精製され、. ヒ 卜 - （3 - CSF 活性を示すこ とが確認.された 。 又 試料のア ミ ノ 酸分析及び糖含有量分析に よ り 目 的糖蛋白質の 確認もなされた 。
尚、 糖含有分析に関 して は、 ア ミ ノ酸分析に用いた CSF 試 料を エルソ ン— モルガン法に よるア ミ ノ糖定量、 オルシ ノ ー ル硫酸法による中性糖の定量あるいはチ才パルビツール法に よるシアル酸の定量をそれぞれ実施 した 。 定 '躉方法は生化学 実験講座第 4巻 「糖質の化学 （ 下巻 ） 」 （東京化学同人 ） の 13草に記載されている。 各定量値から重量％を換算し た結果 宿主細胞、 発現ベク タ ー及び培養条件等の違いに よ り 、 得ら れた （3 - CSF の糖含量は 1 〜 20 ( 重量％ ) の範囲に分布して いた。
本発明はま た、 ヒ 卜 G - CSF を有効成分とする感染防禦剤 をも提供する。
本発明の有効成分である ヒ 卜 G - CSF は前述した遣伝子組 換えの手法に よ っ て得るこ とができる他、 例えば前述の特許 出願 （特願昭 59— 153273号） に開示された方法に従っ て ヒ 卜 CSF 産生細胞（CHU-1ま た は CHU-2)から得るか、 或いは G - C8 F 産生細胞と自己増殖能を有する悪性腫瘍細胞とを細胞融合 し て得られるハイ プ リ ドーマをマイ 卜 ジ I ンの存在ま たは非 存在下で培養するこ とによ っ て得るこ ともできる。
これ等の方法で得た ヒ 卜 G - CSF は全て本発明に含ま れる , 得られた ヒ 卜 G - CSF 含有液は必要に よ り公知の手段でさ ら に精製、 濃縮 した後凍結保存とするかま たは凍結乾燥、 真 空乾燥等の手段に よ り水分を除去して保存するこ とができる また所望に.よ り ヒ 卜 G - CSF を適当な緩衝液に溶解した後、 ミ リ ポアフ ィルタ 一等で無菌濂過して注射剤とするこ ともで さる。
さ ら に本発明の感染防禦剤は ヒ 卜 また は動物医薬用 に適し た医薬製剤 と しての形態を とるために必要な製薬担体ゃ賦形 剤を、 さ らに は安定化剤、 吸着防止剤を含むこ とができる。
本発明の感染防禦剤に含ま れる ヒ 卜 G - CS'F の投与量、 投 与回数は対象の疾患患者の病状を配慮 し て 決め る こ と がで きるが、 通常成人一人当た り 0.1〜 500 3好ま し く は 5〜 100 §f の ヒ 卜 G - CSF を有する製剤を 1 週間に 1 〜 了 回投 与するこ とができる。 しかし本発明は ヒ 卜 G - CSF の含有量 によ っ て限定されるあのではない。
本発明の ヒ 卜 G - CSF を有効成分と する感染防禦剤が使用 され得る対象感染菌と し て は種々の菌を挙げるこ とができ、 特に限定されるものではないが、 なかでもスタ フ イ ロ コ ッ カ ス属、 ス 卜 レブ 卜 コ ッ カ ス属などのグラム陽性球菌、 ェシ ェ リ シァ属、 セラチア属、 ク レプシ ヱ ラ属などの腸内細菌やへ モフ ィ ルスなどを含むグラム陰性通性嫌気性菌、 シ ユ ー ドモ ナス属、 アルカ リ ゲネス属などのグラム陰性好気性菌、 パク テ ロ イデスなどのグラム陰性嫌気性菌、 キ ャ ンディ ダ属、 ァ スペルギルス属などの真菌およびリ ステ リ ア菌のような細胞 内寄生菌等に よる単独感染又はい く つかの菌による複合感染 に対 して髙ぃ感染防禦効果が得られる。
〔 実 施 例 〕
以下実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、 その前に CSF 活性の測定法および CHU-1 からの ヒ 卜 G · CSF の単離お よびその理化学旳性質について参考例で説明 してお く 。
〈参考例 1 〉 CSF 活性の測定方法
本発明において用い られた CSF 活性 （以下 CSA と略す ） の 測定方法は次の とお り である。
「CSA の測定方法」
(a) ヒ 卜骨髄細胞を用いる場合 ： -'
Brad ley T. . , Metca I f D.等の方法（Aust. J. exp. Biol . med. Scに U巻 287〜 300 頁， 1966年） に準じ て単層钦寒天 培養法によ り行っ た 。 すなわちゥシ胎児血清 0.2Αώ、 被検検 体 0.1/)ώ、 ヒ 卜骨髄非付着性細胞浮遊液 0.1 ( 1 〜 2 x 105 有核細胞） 、 改変 HcCoy's 5A培養液 0.2^、 寒天を
0.75 %含む改変 HcCoy's 5A培養液 0.4/?ώを混合して直径 35 < 6 編の組織培養プラスチッ クディ ッ シ ュ に入れて固ま らせたの ち、 37で、 5 %炭酸ガス / "95%空気、 100%湿度の条件で培 養を行い、 10日後に形成されたコ ロニー数 （ 50個以上の細胞 からなる集落を 1 コ ロ ニー とする ） を数え、 1 個のコ ロ ニー を形成する活性を 1 単位 （ lln ） と して CSA を求めた。
(b) マウス骨髄細胞を用いる場合 ：
ゥマ血清 H 被検検体 0.1^、 C3H/He ( メ ス ） マウス の骨髄細胞浮遊液 0. ΐΑώ (0.5〜 1 Χ 10" 有核細胞 ） 、 寒天を 0.75 %含む改変 McCoy's 5A培養液 0.4/s«を混合 し直径 35卿 の組織培養用プラスチッ クディ ッ シュ に入れて固ま らせたの ち、 37°C、 5 %炭酸ガス Z95%空気、 100%湿度の条件下に て 5 日間培養し、 形成されたコ ロニー数 （ 50個以上の細胞か らなる集落を 1 J ロ ニー と する ） を数え、 1 個のコ ロ ニーを 形成する活性を 1 単位 （ Un ） と して GSA を求めた 。
尚、 上記（a) , (b) の方法において用いた 「改変 McCoy's 5A培養液および（a) で用いた ヒ 卜骨髄非付着性細胞浮遊液は 次の如 く して作成した。
「改変 McCoy's 5A培養液 （ 2倍濃度） 」
McCoy's 5A培養液（GiBCO社製 ） 12g、 ア ミ ノ酸ビタ ミ ン培地 （ 日水製薬社製 ） 2.55 3、 重炭酸ナ ト リ ウム 2.18 3、 ペニシ リ ンお カ リ ウム 50000単位を 2回蒸留水 に 溶解後、 0.22 mのミ リ ポアフ ィルタ 一にて濾過滅菌を行 つ た。
「 ヒ 卜骨髄非付着性細胞浮遊液」
健常人胸骨せん刺によ り得た骨髄液を RPHI 1640 培養液に て 5倍に希积 し 、 Ficol - Paque 液 （ フ ア ルマ シ ア社製） に 重層 し、 400X 9、 30分、 25 にて遠心を行い、 界面の細胞 層 （ 比重 < 1.077 ) を回収する。 この細胞を洗净後、 20%ゥ シ胎児血清を含む RPHI 1640 培養液にて 5 X 106 Cel I/; ^の 濃度に調整 し 、 25oa2 の耝檨培養用プラスチッ ク フラスコ に 入れ、 炭酸ガス培養器にて 30分間イ ンキ ュ ベー 卜 したのち 、 上清の非付着性細胞を回収 し 、 再度 25οι 2 プラスチッ ク フラ スコ に入れ、 2時間 30分イ ンキ ュ ベー 卜 したのち 、 上清の非 付着性細胞を集めて用いた。
〈参考例 2 〉 ヒ 卜 G - CSF の単鹺
ヒ 卜 G - CSF 産生細胞 CHU-1 ( CNCM受託番号 「 I ― 315」 ） の培養上清から以下の実施例 2に記載の方法に よ っ て ヒ 卜 G - CSF を単離精製 した。—
このよう に し 得られた ヒ 卜 G - CSF は以下の理化学的性 質を有していた。
) 分 子 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム—ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動法による測定で 約 19, 000土 1 , 000。
I ) 等 電 点 以下の表一 ェ に示す三''つの等電点 （ A ,
Β , C ) のう ち少な く とも 1 つを有す る。 I
等 電 点 （ p I )
4 M尿素存在下の値 尿素 不 存 在 下 の 値
A 5.7士 0.1 5.5士 0.1
B
Figure imgf000030_0001
5.8土 0.1
C 6.3土 0.1 6.1土 0.1
I ) 紫外部吸収 ： 280raBに極大吸収を有 し、 250ΠΗに極 小値をちつ 。
IV ) N末端から 21残基目迄のアミ ノ酸配列が次の如 く で ある。
H 2 N— T fir— P ro— し en— (3 I y— P ro— A I a—
(10)
- S er- Ser- Leu - P ro- G in- ( S er) - P he—
(20)
L eu— Leu - L ys- X - L eu- G lu- X - Val- V ) アミ ノ酸組成 ： 以下の表一 Iに示すア ミ ノ酸組成を 有する。 -'
I 実測値 アミ ノ酸残基の予測数 アミ ノ酸
{ n RIO 1 ) ( ) 内はその整数値
Asp (Asp+ Asn) 3 .54 4. 3 ( 4)
Thr 4 .58 5. 5 ( 6)
Ser 10 .64 12. 9 (13)
Glu (G 1 u+ G 1 n) 22 .31 27. 0 (27)
Pro 8 .30 10. 1 (10)
Gly 10 .60 1.2. 8 (13)
1 a 14 • 85 18. 0 (18)
1/2 Cys 2 59 3. 1 ( 3)
Va I 6 16 7. 5 ( -7)
Met 2 .26 2. 7 ( 3)
11 e 3 29 4. 0 ( 4)
Leu 27 24 33. 0 (33)
Ty r 2 .60 3. 1 ( 3)
Phe 5 .08 6. 1 ( 6)
Lys 3 • 68 4. 5 ( )
His 3 .93 4. 8 ( 5)
Trp 1 .61 1. 9 ( 2)
Arg 4 .29 5. 2 ( 5)
計 （166) 算出分子量（166残基と して糖は算定 していない） 17961 実施例 1 「 CHU-2 J の樹立
著明な好中球の増多が認め られた口腔底癌患者の腫瘈を nu nuマウスに移植 し た。 この腫瘼は移植約 10日後に著明な腫 瘼の増大と好中球の増多が認められた。 この腫瘍を移植 12日 後に無菌的に摘出 し、 1 〜 2 m3 角に細切 し、 これを以下の 如く培養した 。
上記細切 した腫.瘍塊 10〜15片を 50a2のプラスチッ ク遠心管 に入れ、 の 卜 リ ブシン溶液 （ 卜 リ ブシン 0.25 %、 E0TA 0.02 %含む） を加え、 37での温浴中で 10分間振とう したの ち上清を捨て、 再度、 周 卜 リ ブシン溶液 5 を加え、 37でで 15分間攪拌 しながら 卜 リ ブシン消化を行っ た。 上清の細胞浮 遊液を回収 し、 ゥシ胎児血清を 加えて 卜 リ ブシンの作用 を止めたのち水中に保存した。
以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収 し 、 前回の分と合 わせて 1, 500r. p, m. 10分間の遠心によ り細胞ペ レツ 卜 を得た（ この細胞ペ レツ 卜 をゥシ胎児血清を 10%含む F - 10に て 2 回 洗浄 したのち 、 25 2 のプラスチッ ク培養フラスコ に細胞濂 度 5 X 106 偭 Zフラスコ になるよう に して植え込んだ。 ゥシ 胎児血清を 10%含有する F - 10培養液を用い'、 炭酸ガスイ ン キ ュベー タ一 （炭酸ガス濃度 5 %、 湿度 100% ) 中にて一晩 イ ンキュ ベー ト したのち、 上清を非付着細胞と共に除去 し、 新しい培養液を加えて培養を継続した。 培養開始後 6 0 目 に 細胞がい っ ぱいに増殖 したので、 この時点で培養液を新 しい ものに替えた。 翌日、 この培養液を捨て、 RPHI 1640 で 5 倍 希釈した抗マウス赤血球抗体 （ Cappel社製 ） 2 と同 じ く PHI 1640 で 2.5倍希釈 したモルモッ 卜補体 （棰東製薬社製） 2 を加え 37°C、 20分間イ ンキ ュベー ト した。 イ ンキ ュベー シ ヨ ン終了後ゥシ胎児血清を 10%含む F - 10にて 2回洗浄 し nu/nuマウス由来のフ イ ブロブラス 卜を除去し、 引き続きゥ シ胎児血清を 10%含む F - 10培養液を加えて、 さ ら に 2 日間 培養を行っ た後細胞の一部を取り出 し、 限界希积法によ り ク ロ ーニングを行っ た。
得られた 11個のク ロ ーンについて CSF 活性を調べた ところ、 他のものよ り も約 10倍高い活性を示すク ロ ーン（CHU-2) が得 られた 。
実施伢 2 CSF の単離
上述の如 く して樹立された細胞が完全に密に増殖 した 150 CM 2 の培養フラスコ 2本よ り細胞を回収 し 、 これをゥシ胎児 血清を 10%含有する F - 10培養液 500 に浮遊したのち、 1580ca2 のガラス製ロ ーラーポ 卜ル（Belco社製） に移 し、
0.5 ρ.ιの速度で回転培養を行 っ た 。 細胞がロ ーラーポ 卜 ルの内壁に完全に密に増殖 した時点で培養液を血清を含まな い RPMI 1640 に交換し、 4 日間培養 し たのち培養上清を回収 し、 ゥシ胎児血清を 10%含有する F - 10を加'えて培養を続行 する。 3 日 間培養したのち再び血清を含ま ない RPHI 1640に 液替を行い、 4 曰後に培養上清を回収 した。 以下周様の操作 をく り返すこ とによ り 、 毎週 1 ポ 卜ルよ り 500 /^ずつの血清 を含まない培養上清が得られ、 しかもこの方法によ りかなり 長期簡にわた つ て細胞を維持し、 培養上清を回収するこ とが 可能であ っ た。 得られた培養上清 5 ί を 1 バッ チと し 、 これに 0.01 %ッ ィ ーン 20を添加後 Hol low Fiber DC - および Am icon PH-10 ( ア ミ コ ン社製） を用いた限外濾過法に よ り約 1000倍に濃縮 したのち、 これを以下の順序で精製した 。
( ί ) 直径 4.6αη、 長さ 90 の U rogel AcA5 lカ ラム （ LKB 社製 ） を用い、 0.15 M N a C ί および 0.01 %ッ ィ ー ン 20 ( 半幷化学ネ土製） を含む 0.01 Μ 卜 リ ス塩酸 緩衝液 （ ΡΗ7.4)を用いて前記濃縮した培養上清 5 を 流速約 /時間でゲル攄過し た。 尚カ ラムはあ らか じめゥシ血清アルブミ ン （分子量 67, 000 ) 、 才ポアル プミ ン （ 分子量 45, 000 ) 、 チ 卜 ク ロ ーム C (分子量 12, 400 ) にてキ ャ リ ブレーシ ョ ンを行 っ た 。 ゲル嫿遏 . 終 7後各フラクシ ョ ンよ り ずつを採取し、 10倍 に希釈 した後、 前述 した 「 CSA の測定方法（b) 」 によ り活性を示す画分を調べた。 この結果、 先ず V e =
400 〜 700 //ώの画分がマ ク ロ フ ァ ージ優位の CSA を示 し、 V e = 800〜 1200/^の画分が顆粒球優位の CSA を 示すこ とがわかっ たので、 後者の画分を集め PH - 10 ( アミ コ ン社製 ） を用いる限外濾過器'によ っ て約 に濃縮した。
( i ί) 上記濃縮画分に η —プロパノ ール （東京化成社製、 ア ミ ノ 酸配列決定用 ） を 30%含む 0.1 % 卜 リ フル才ロ 酢酸水溶液を添加 し、 水中に 15分程度放置 したのち、 15， 000 Γ, p. m.10分の遠心に よ り 沈殿を除去 した。 次い で先の n —プロパノ ールおよび 卜 リ フル才 ロ齚酸を含 む水溶液で平衡化 した 〃 Bondapak C18カラム （ Waters 社製、 セミ分取用、 8鲰 X 30a ) に吸着後、 30〜 60% の直線 ¾度勾配の n —プロパノ ールを含む 0.1% 卜 リ フル才 ロ 酔酸水溶液で順次溶出 し た 。 高速液体ク ロ マ 卜装置は 日立 685 - 50型を、 検出は日立 638 - 41型 検出器 （ いずれも 日立製作所製） を用い、 220 と 280 ΠΛの吸収を同時に測定 した。 溶出後、 各画分よ り 10 / ί を分取 100倍希釈したのち、 前述の 「 CSA の測 定法（b) 」 によ り活性を示す画分を調べた。 この結果、 n —プロパノ ール 40%にて溶出される ピー ク に活性が 認められたので、 この ピー クを集め再度同じ条件で再 ク ロマ 卜 を行い上記と同様に して CSA を調べた ところ、 やはり n —プロパノ ール 40%の位置の ピー ク に活性が 認められたので、 この ピー クを集め （ 4 フラクシ ョ ン = 4 ） 凍結乾燥した 。
( iii ) 上記凍結乾燥粉末を n —プロパノ ールを 40%含む 0.1% 卜 リ フル才ロ酌酸水溶液 200 ]! に溶解 し、 TSK - G 3000SWカ ラム （ 東洋曹達社製、 7.5躕 X 60c/» ) を用いた髙速液体ク ロマ トグラフ ィ ー' { HPLC) にかけ た。 溶出は周水溶液に よ り 分の流速で行い、 フラクシ ョ ンコ レク タ ー FRAC - 100 ( フ アルマシア社 製〉 によ り 0.4 ずつ分取 した 。 分取し た各画分につ いて CSA を前記と同様に して調べた結果、 保持時間が 37〜 38分の画分 （ 分子量約 2万に相当 ） に活性が認め られたので、 この画分を回収 し、 更に分析用 U Bondapak C18 カ ラム （4.6鯽 x 30o» ) による精製を 施したのち、 メ イ ンピー クを回収 し凍結乾燥 した。 得 られた標品について前述の 「 CSA の測定方法（a) 」 に よ っ て検定 した ところ ヒ 卜 G - CSF 活性を有するこ と を siめ 。 実施例 3 ア ミ ノ酸配列の決定
(i ) N末端アミ ノ酸配列の決定 試料を気相式シー クェンサ一 （ アプライ ドバイ 才システム 社製） を用いてエ ドマン （ Edman)分解 し、 得られた PTH アミ ノ 酸を高速液体ク ロマ トグラフ ィ ー装置 （ ベッ クマン ♦ イ ン ス 卜ルメ ンッ社製） および Ultrasphere - 0D8 カラム （ べッ クマン · イ ンス トルメ ンッ社製） を用いて常法によ り分析し た。 カラム （ 5 ^ m、 直径 4. &m、 長さ 250卿 ） を開始緩衝 液 （ 15mM酢酸ナ 卜 リ ウム緩衝液 PH4.5 、 40%ァセ 卜二 卜 リ ル を含む水溶液） にて平衡化 したのち、 検体 の開始緩 衝液にて溶解 ） を注入して開始緩衝液によるイソ クラテ ィ ッ ク溶出によ り分離を行っ た。 流速は 分、 カ ラム温度 は 40で に保持した。 PTH アミ ノ酸の検出は 269ίΜΙと 320ίΜιの 紫外部吸収を利用 した。 あ らかじめ標準 ΡΤΗ -アミ ノ酸 （ シグ マ社製） 各 2 n moil を同一の系で分離 して保持時間を決定 し 被検検体の保持時間から同定を行っ た。 この結果、 N末端か ら 40残基目 までのアミ ノ酸配列は次の如 く 決定された。 H N - T r- P ro- L eu- G ly- P ro- A la- S er-
(10)
S er — L eu— P ro— G I n— S er— P he— L eu— L eu— (20)
L ys - C ys- L eu- G lu- G ln- V al - A rg - L ys
(30)
l ie - G ln- G ly- A sp- G ly- A la- A la- L eu G In — G lu— し ys - L en - C ys— A la - T hr— T yr
(40)
L ys-
(i i) ブロ ムシアン分解
試料を 70%ギ酸に溶かし、 昇華精製し たプロ ムシアン 200 当量を加えて 、 37°Cで一夜反応させた 。 次に反応物を凍結乾 燥後、 TSK G3000SW カ ラム （ 東洋曹達社製） を用いた HPLCで 画分 し 4つの ピー クを得た。 ピー クを分子量の大きい頗に - , CN - 2 , CN - 3 , CN - 4 と命名 し 、 収率のよい CN - 1 CN - 2 についてア ミ ノ酸配列を自動気相式シー クェンサ一 ( アプライ ドバイ 才システム社製） を用いて （ i ) と同様の条 件で分析した 。
その結果、 CN - 1 は G - CSF タ ンパクの N 未端からのぺプ チ ドであるこ とがわかっ た。 さ ら に CN - 2 は以下のア ミ ノ 酸 配列を有していた 。
P ΓΟ- A la- P he- A la- S er- A !a- P he- G I n-
A rg- A rg- A la- G ly- G I y- V a I - L eu- V a I - A !a- S er- H is- L eu- G I n一 ( iii ) 卜 リ ブシン分解 試料を 8 M尿素を含む 0.1M 卜 リ ス塩酸緩衝液 （ PH7.4)に 溶か し 、 0.1% 2 — メ ルカプ 卜 エタ ノ ールを含む 0.1 M 卜 リ 6 ス塩酸緩衝液（PH7.4) を加えて最終的に 2 Mの尿素となるよ う に調製 した。 次いで試料と酵素が 50： となるよう に TPCK 処理 卜 リ ブシン （ シグマ社製商品名 ） を加え、 25°Cで 4 時間 反応させた後、 さ ら に周量の TPCK処理 卜 リ ブシンを加えて、 再度 25°Cで 16時間反応させた。 反応後、 反応物を C 8 カラム ( 山村化学社製） を用いた高速逆相カラムク ロマ 卜グラフ ィ 一 に付した。 溶出は 0.1% TFAを含む n —プロパノ ールを用 い、 n —プロパノ ール濃度を 5 6〜 6096に直線的に上げて行 つ た。 280 /¾3の紫外部吸収を測定 して得られた ピー クのう ち 、 メ イ ンピー クについて （i) と周条件下に自動気相式シー クェ ンサー （ アプライ ドバイ 才システム社製） を用いてアミ ノ酸 配列を分析した。 その結果、 メ イ ンピー ク は（i i)の CN— 2 断 片の一部を含む以下の配列を有するペプチ ドであるこ とがわ かっ た。
G In- L eu- A sp- V al - A la- A sp- P he- A la-
T hr- T hr- I le- T rp- G In- G In- M et- G lu- G lu - L eu - G ly- M et - A la- P PO- A la- L eu- G In- P ro - T hr- G In- G iy- A la - M et - P ro - A la— P he— A la— S e卜 -'
実施例 4 DNA プロ ーブの作成
(i) プロ ーブ （ IWQ)の合成
実施例 3 ( iii ) で得られた アミ ノ酸配列の中から I le— T rp- G In- G In - M et - G I u- G lu- L eu— G ly— M etで 示される 10個のアミ ノ酸の配列に基づいて、 30個の連続する ヌ ク レオチ ドを得た （ 図 1 ) 。 図 1 の S列に於いて 、 柄えば 5'—末端から 9位のヌ ク レオチ ドは d Aおよび dGを等量含む混 合物であるこ とを示す。 原料のヌ ク レオチ ドは主にダイマー を使用 し、 必要に応じて随時モノ ヌ ク レオチ ドも使用 した。 グラスフ ィ ルタ ー付きカ ラムに出発原料のヌ ク レオチ ド樹脂 AP- d (G) ( ャマサ齧油社製 ） 20«gを入れ塩化メ チ レンにて 洗浄を橾り返 した後、 3 %卜 リ ク 口 口 酢酸を含む塩化メ チレ ン溶液にて、 4 , 4'一ジメ 卜キシ 卜 リ チル基を脱離せ しめ、 次いで の塩化メ チレンでカ ラムを数回洗净 した。 無水ピ リ ジンで洗净して溶媒を置換したのちヌ ク レオチ ドダイマー ( OHTr) ApTp(NHR3 ) ( 日本ゼ才 ン社製 ： NHR, は 卜 リ エチ ルアンモニゥム、 DHTrはジメ 卜 キシ ト リ チルを示す ） 20«？と 0.2 ^の ピ リ ジンを加えて真空ポンプにて カ ラム内を真空乾 燥した。 次いで、 2 , 4 , 6— 卜 リ メ チルベンゼンスルホ二 ル— 3— ニ ト ロ 卜 リ アゾ リ ド （ MSNT、 和光純薬社製 ） 20s¾と 無水ピ リ ジン 0.2ϋώを加えた後、 カ ラム内を窒素ガスで置換 して、 室温下に 45分間時々振とう させるこ とに よ っ てヌ ク レ 才チ ド樹脂 とダイ マ ー を縮合さ せ た 。 反応終了後 、 ピ リ ジ ンにて カラムを洗净し、 次いで未反応の 0Η基を過剰の無水酢 酸 — 4— ジメ チルァ ミ ノ ピ リ ジ ン に て ァ セチル化 し た 後、 再びカラムをピ リ ジンで洗浄 した 。 以下同様に、
( DHTr) Ip(NHR3 ) , ( OMTr) GpGp(NHR3 ) ,
( DHTr) Ip(NH 3 ) , ( DHTr) CpTp(NHR3 ) と
( DHTr) TpTp(NHR3 ) の等量混合物、 （ DHTr) ApAp(NH 3 ) と （ DHTr) ApGp(NHR3 ) の等量混合物、 （ DMTr) ApGp(NH 3 ) と （ DHTr) Gp6p(NHR3 ) の等量混合物、 （ DHTr) GpAp (NHR3 ) ( DHTr) TpGp(NH 3 ) ， ( DHTr) ApAp(NHR3 ) と
( DMTr) GpAp(NHR3 ) の等量混合物、 （ DHTr) CpAp(NHR3 ) ( DHTr) ApAp(NHR3 ) と （ DHTr) ApGp(NHR3 ) との等量混合 物、 （ DHTr) 6pCp(NHR3 ) , ( DHTr) TpGp(NHR ) ,
( DMTr) Ip(NHR3 ) , ( DHTr) ApTp(NHR3 )
[ ( DHTr) Ip(NH 3 ) はャマサ醬油社製、 その他は全て 日本 ゼオン社製 ] の順で、 前述の操作を裸り返すこ とによ っ て縮 合させた。 最終段階の反応終了後、 ァセチル化するこ とな し に、 ピ リ ジン、 塩化メ チレン、 エーテルの頭で樹脂を洗浄し た後、 乾燥させた。 乾燥させた樹脂を 1 Mテ 卜ラメ チルグァ 二ジンおよび 1 M α — ピコ リ ンアル ドキシムを含むジ才キサ ン ΐ Λώ、 ピ リ ジン 0.5^、 水 の混合液 1.7 ^に懸濁 し た後、 一夜室温にて放置した後、 100〜200 ί まで減圧濂 縮 した 。 この濃縮液に少量 （ 2〜 3 滴） の ピ リ ジンを加えた 後、 濃アンモニア水 2〜 3 ^を加え 55でで 6時間加温 した。 次いで酢酸ェチルを加えて抽出分離し 、 得られた水層を減圧 濃縮 した後、 50mH卜 リ エチルアンモニゥム酢酸溶液（PH7.0) に溶解せ しめて C - 18カ ラム （1.0x 15ca、 Waters社製） を用 いた カ ラムク ロマ トグラフ ィ ーに付した 。 溶出は、 50mM卜 リ ェチルアンモニゥム酢酸溶液（PH 7, 0) 中 10%〜 30%の直線濃 度勾配のァセ 卜二 卜 リ ルで行い、 ァセ 卜二 卜 リ ル濂度が 25% 付近の位置で溶出される ピーク画分を減圧濃縮 した。
この濃縮液に 80%酢酸を加えて室温下に 30分間放置した後 齚酸ェチルを加えて抽出 ♦ 分離し得られた水層を減圧下に濃 縮した。 得られた濃縮液は、 C 18カ ラム （ センシ ユ ー科学社 製、 SSC - 0DS - 272 、 6 X 200M ) を用いた高速液体ク ロマ 卜グラフ ィ 一に付し て 、 さ ら に精製 し た 。 溶出は 50raH卜 リ エチルアンモニゥム酢酸溶液（PH7.0) 中 10%〜 20%の直線 濃度勾配のァセ 卜 二 卜 リ ルを用いて行い、 10A260 units 以 上の収量で合成 DNA が得られた。
得られた才リ ゴヌ ク レオチ ドは Maxam - Gi lbert 法（Meth. Enzym._ _巻 499頁（ 1980)によ り塩基配列を調べた結果、 図 1 に示された配列を有しているこ とが確認された。
( i i) プロ ーブ（A) の合成
実施例 3 ( iii ) で得られたアミ ノ酸配列の中から M et— P ro— A la— P he— A laで示される 5個のア ミ ノ酸の配列に 基づいて 14個の連続するヌ クレオチ ドを得た 。 （ 図 1 ) . 合成は、 プロ ーブ （ IWQ)と同様な方法で行いヌ ク レオチ ド 樹脂 AP - d (T) ( ャマサ醬油社製 ） に （ DHTr) CpAp(NHR3 )
( DHTr) 6p6p(NHRo ； ( DMTr) CpAp(NHR3
( DHTr) CpTp(NHR3 , ( DMTP) CpGp(NHR3 およぴ
( DHTr) CpCp(NHR3 の等量混合物 ； （ DHTr ApGp(NH 3 )
( DHTr) TpGp(NHR3 , ( DMTr) GpGp(NHR3 ' および
( DHTr) CpGp(NHR^ の等量混合物 ； （ DHTr ApAp(NH 3 )
( DHTr) CpAp(NHR3 と （ DHTr) CpGp(NHR3 の等量混合物 ( DHTr) Gp(NHR3 ) ( いずれも日本ゼオン社製） の順に縮合 させて約 10A26() units の合成 DNA を得た 。 得られた才 リ ゴ ヌ ク レオチ ドの塩基配列を Haxam - Gi lbert 法に よ り調べた と ころ図 1 に示された塩基配列を有 しているこ とが確認され ( iii ) プロ ーブ （ LC) の合成
アプライ ドバイ 才システム社の DNA 合成機 380Aによ り 、 自 動合成を行っ た。 この方法は Caruthers 等の記載した原理 ( J, An. Chem. Soc, ,— [ϋ巻 3185頁（1981 ) ) に基づいてお り ホスホアミ ダイ 卜 法と称されている。
5'のジメ 卜キシ 卜 リ チル基 （ DHTr〉 を脱保護した dG - S ( Sは支持休） にテ 卜 ラゾールで予め活性化 した （ DHTr) - (JTのホスホアミダイ 卜体を縮合させた後、 未反応の水酸基を ァセチル化し、 次いで水存在下で ヨ ウ素酸化を行っ て リ ン酸 体に導いた。 DHTr基を脱保護し 、 以後同様に縮合を繰り返し て図 1 に示される如き配列の 24個のヌ ク レオチ ドを合成した 得られたヌ ク レオチドを支持体から開裂せしめ脱保護した後 C18 カ ラム （ センシ ユ ー科学社製 SSC- 0DS - 272)を用いた 逆相系高速液体ク ロマ トグラフ ィ ーにて精製 した。
実施例 5 CHU-2 細胞の培養と mRNAの精製
1) CHU-2 細胞の培養と細胞の回収
樹立された CHU-2 細胞を 150cin2 の培養フラスコ 2本に完 全に密に増殖させた後、 これをゥシ胎児血清を 10%含有する RPMI 1640 培養液 500««に浮遊させたのち、 1580α»2 のガラ ス製ロ ーラーポ 卜ル （ Belco 社製） に移し、 0.5r.p.m.の速 度で 4日 間回転培養を行っ た。 細胞がロ ーラーポ 卜ルの内壁 に完全に密に増殖した時点で、 ロ ーラーポ 卜ルから培養液を 除き、 あ らかじめ 37 に加温 した EDTAを 0.02 %含む生理食 塩水 100n«を加え、 37°Cで 2分間加温後、 ピペ ッ ト操作にて 1 細胞をはく 離せ しめた。 得られた細胞懸濁液を 1500 r. p. m. 10分間の遠心にて細胞ペ レ ツ 卜 を得る。 細胞を EDTAを含ま な い生理食塩水 5 に再び懸濁 し、 1500 r. p. m.10分間遠心にて 細胞ペ レツ 卜 を得た （ 湿重量約 0.83 ) 、 このよう に して得 ら れた細胞は RNA 抽出操作を行う ま で一 80°Cにて凍結保存す
2) mRNAの精製
上記の如 く して得られた CHU-2 細胞からの mRNAの単離は本 質的に " Molecular cloning " [ Haniatis等， Cold Spring Harbor, l^—頁（ 1982 ) ] に記載されているよ う に して実施し た。 凍結保存されていた CHU-2 細胞 （ 湿-重量 3 ） に 20«ώ の 6 Μグ ァニ ジン溶液 （ 6 Μグァニ ジ ンチ才シアナ一 卜 、 5 mMクェン酸ナ ト リ ウム （ρΗ7· Q) 、 0· 1Μ / 3 — メ ルカプ 卜 ェ タ ノ ール、 0.5 %ザルコ シル硫酸ナ 卜 リ ウ ム ） に懸濁 し 、
Vortexミ キサーにて 2〜 3分よ く 混合 し た後、 18Gの注射針 を装てん し た 20 容の注射器を用いて 10回吸入排出を繰り返 した 。 ベ ッ クマン社製 SW40T iロ ー タ 一 に合うポ リ ア ロマー製 の遠心チュ ーブに 6 の 5.7M CsCil - 0.1H EDTA, (pH7.5) を先に加えておき、 チュ ーブが満たされるよ う に上述の細胞 が壊れて粘稠にな っ たグァニジン溶液約 6 を重層 し た。 こ のよう に して調製された遠心チュ ーブ 4本を 30,000(\ ρ.πι.、 20 で 15時間遠心 し た後、 得られたペ レツ 卜 を少量の 70%ェ タ ノ ールを用いて 3回洗浄 した。
各々のチ ュ ーブから得られたペ レ ツ 卜 を合 して 550 Jl の 水に溶解せ しめ NaCil 濃度が 0, 2Mとなるよう に調製 したの ち、 フ エ ノ ールー ク ロ ロホルム （ 1 ： 1 ) 処理、 ク ロ 口 ホル ム処理後、 2.5倍容量のエタ ノ ールを加えてエタ ノ ール沈殿 を行い全 RNA を得た。 （ 湿細胞 3.83よ り全 RNA 約 10.1fflgを 得た。 ）
全 RNA からポリ （ A + ) - RNA の精製は以下の如 く行っ た この方法は inRNAが 3'末端にポリ A鎖を付加 しているこ とを利 用 したァ フ ィ 二ティ ーク ロマ 卜グラフ ィ ーである。 オ リ ゴ ( dT) -セルロ ース（P- L Biochemical 社製 Type7)を用い、 吸着は全 RNA を吸着緩衝液 （ 10mH卜 リ ス -塩酸（PH7.5) 、 0.5 NaCi 、 1 mH EDTA 、 0.1%SDS 溶液を含む。 ） に溶 解し、 65でで 5分間加熟した後、 周溶液にて充てんされたォ リ ゴ （ dT〉 — セルロ ースカ ラムに通過させて行い、 溶出は TE 溶液 （ 10mM卜 リ ス—塩酸（PH7.5) 、 niM EDTA を含む。 ） で 行っ た 。 未吸着通過液は再び周カ ラムに通 して同様に溶出操 作を行い、 1 回目の溶出液と混合 し た 。 このよ う な操作を用 いて、 ポ リ （ +A ) - NA 400 ^ 3を得た。
このよう に して調整 した mRKAを Schleif と Wensink の実験 技術書 （ Practical Methods in Molecular Biology,
Spr i nger - Ver I ag , NewYork, He i derberg, Berl in, (1981)) 中に記載されている方法と周様の操作で、 シ ョ 糖密度勾配遠 心法によ りサイズ画分した。
すなわち、 SW40Tiロ ー タ ー （ Bechman 社製） 用チュ ーブに 5 %〜25%のシ ョ 糖密度勾配を作る。 シ ョ 糖溶液は
NaCi 、 10IBH卜 リ ス—塩酸、 （PH7.5) 、 1mH EDTA, 0.5% SDS の溶液にそれぞれ 5 %、 25%の割合いで RNase フ リ ーの 5 シ ョ 糖 （ Schwarz ZHann社製 ） を含んでいる。
上記で述べた如き方法で調製 した mRNA ( ポリ （ A + ) - RNA) 800 §f を 200 〜 500〃 の ΤΕ溶液に溶解せ しめ、 65 で 5分間加熟後急冷した後、 シ ョ 糖密度勾配液の上にの 5 せる。 30000r. p, m. に て 20時間遠心後 0.5 ずつの分画を集 め 260raaの吸光度を測 り 、 周様に行っ た標準 RNA ( 28S , 18S , 5 Sの リ ボソ ーム RNA)の位置に基いて 、 分画された
RNA のサイズを決める と周時に各分画の G - CSF 活性をァフ リ カ ツメ ガエル （ Xenopus laevis) の卵母細胞系を用いて調 10 ベた。 すなわち各分画の mRNAを 1 β 3 / 3t の濃度の水溶液 に調製 し 、 ッメ ガエル （ 生後約 1 年） から取り 出 し た卵母細 胞 1 個に 50ngの mRNAの割合いで注入 した後、 96穴のマイ ク ロ タ イ タ ープ レー 卜 の 1 穴に卵母細胞を 10個ずつ入れ、 それぞ れ 100 J1 のバース培地 （ 88mM NaCi 、 mM KCi 、 2.4mH NaHC03 、 0.82mM HgS04 .、 0, 33mM Ca ( N03 ) 2 , 0.41 mM CaCil 2 、 7.5mH卜 リ ス - 塩酸（ ρΗΛ 6) 、 ぺニシ リ ン ΙΟ^Ζ ϋ 、 ス ト レプ ト マイ シン硫酸 ) 中で 48時間 室温で培養 した後上清を回収 し、 濃縮 ♦ 精製 し て G - CSF 活 性を測定する。
20 この結果 、 15〜 17S画分に G - CSF 活性が認め られた 。
実施例 6 CDNAの合成（PBR系 cDNAライ プラ リ ーの構築） 前述の方法で得られたポ リ （ A + ) - RNA から Land等の方 法 [ Nucleic Acids Res, 巻 2251頁（ 1981 ) ] に基づき、
Gublerと Hoffman の方法 [ Gene, 巻 263頁（1983) ] を加味 25 して CDNAを得た 。 1) 1 本鎖 CDNAの合成
エ ツ ペン ドルフ社製 容チュ ーブに以下の如 く の頤序 で試薬を入れる。 の反応緩衝液 （ 500I9M KCi 、 50inH HgC 、 250mM卜 リ ス -塩酸、 ρΗ8.3)、 20 の 200mH ジ チ才ス レイ ト ール、 32^ί の 12.5mH dNTP ( dATP, dGTP, dCTP, dTTPを各々 12.5mM含む） 、 10 の <¾— "2P— dCTP ( アマシ ャ ム製、 PB 10205) 、 Zl Si の才 リ ゴ （ dT) 12.18 (P- L Bioctiemicals社製、 500 g= ) 、 20 のポリ ( A + ) - RNA (2.1〃 §f Z ) 、 蒸留水 Jl の計 400 χ ί の反応液を 65°Cで 5分間加熟後、 42で 5分間加温する この反応液に逆転写酵素 （宝酒造製） 120単位を加え、 さ ら に 42で、 2時間反応させた後、 RNase イ ン ヒ ビタ ー
( Bet esda Research LaboratoM es社製） 2 S , 20 ^ ϋ の ΤΕ溶液、 16 ζί の 100I11H ピロ リ ン酸ナ リ ゥム、 48単位 （ 4 ϋ ) の逆転写酵素を追加 して、 今度は 46Ό 2時間反応せ し めた 。 0.5Μ EDTA 8 ^ ί 、 10% SDS 8 ^5 を加えて反応 を停止させた後、 フ I ノ ール— ク ロ 口 ホルム処理、 エタ ノ ー ル沈殿 （ 2回 ） を行い一本鎖 CDNAを得た。
2) 本鎖 CDNAへの dC- 鎖付加 -'
上記で得られた一本鎖 CDNAを の蒸留水に溶解後、 60 ί の dC - 鎖付加緩衝液（400ΙΠΜ力 コ ジル酸カ リ ウム ： 50mH卜 リ ス -塩酸（PH6.9) ； 4 mMジチ才ス レイ 卜 一ル ： 1 mM
CoCi! 2 ； mH dCTP)に加え、 37°Cで 5分間加温 し た。 この 反応液に タ ー ミ ナル 卜 ランスフ I ラーゼ （ SZun^Z ^ Jl , P-L BiocheiBicals社製） 3 ϋ を加えて 37°Cで 2.5分間反応 4 し fc後、 フ エ ノ ールー ク ロ ロ ホルム処理 （ 1 回 ） 、 及びエタ ノ ール沈殿 （ 2回 ） 行い、 100mM NaCi を含む TE溶液 40^ ί に溶解せ しめた 。
3) 2本鎖 CDNAの合成
上記 40^ の DNA 溶液に 4 J? の才 リ ゴ （ dG) 1 .18 (200 ^ / i , P-L Biochemicals社製〉 を加え 65°C 5分間、 続い て 42 で 30分間加温 し た後、 反応液を に保っ た。 この反 応液に緩衝液 80χ ϋ (100mH卜 リ ス—塩酸 ΡΗ7.5 、 20mH
MgCi 、 50mH ( NH4 ) 2 30,, 、 500mH KCi ) 、 4 Αί ί の 4 mM dNTP ( dATP, dCTP, dGTP, dTTPを各々 4 mMを含む） 、 60 μΛ の 1 mHi3 - NAD 、 及び 210〃 の蒸留水、 20 Jl の
E. col i DNAポ リ メ ラーゼ I ( 宝酒造社製〉 、 15 の E. col i DNA リ ガ—ゼ （宝酒造社製） 、 15 の E. col'i RNase H
(宝酒造社製 ） を加え 12 にて 1 時間反応させた後、 さ ら に 4 i の 4 mM dNT を追加 し 、 25°Cで 1 時間反応 し て 、 フ エ ノ ールー ク ロ ロ ホルム処理、 エタ ノ ール沈殿 （ 1 回 ） を行つ て 、 約 8 2 の 2本鎖 CDNAを得た。 この 2本鎖 CDNAを TE溶液 に溶解せ しめ 1 · 2%ァガロ ースゲル電気泳動を行い、 約 560 塩基対 （ bp) 〜 2 キ ロ塩基対（Kbp) の大きさ'に相当する部分 をワ ッ トマン DE81 ( ワ ッ トマ ン社製） に吸着させ溶出回収し た と ころ、 約 0.2 3 が回収された。
4) 2本鎖 CDNAへの dC - 鎖付加
上記の如 く 得られた 2本鎖 CDNAを 40 ϋ の TF.溶液に溶解し 2 )の項で述べた dC - 鎖付加緩衝液 8 ί を加え 37 ^で 2分間 加温 し た後、 1 ί のタ ー ミ ナル 卜 ラ ンス フ ェ ラーゼ （ 27 unit/ u ϋ ) を加えて 37°Cで 3分間反応せ しめた。 反応液を 直ちに 0 °Gに冷却 し 0.5H EDTA ί を加えて反応を停止 した後、 フ ； Ε ノ ール— ク ロ 口ホルム処理、 エタ ノ ール沈殿を 行い、 得られた沈殿を ΤΕ溶液 10 ί に懸濁 した。
5) pBR 系 cDNAライブラ リ ーの構築
市販の オ リ ゴ ( dG〉 鎖付加 PBR322ベク タ 一 ( ベセスダリ サ -チラポラ ト リ ーズ社製、 10ng ^ i ) 4 u St と上記 dC - 鎖 付加 2本鎖 CDNA2 ί を 75χζ の 0.1M NaCi を含む TE溶液 の中でァニールさせた。 ァニールは 65°G、 5分加湿した後 40 °Gにて 2時闥加温、 その後、 室温になるまで放置して行っ た。
一方、 Haniat i sらの実験書 [ Molecular cloning, Cold Spring Harbor, 249頁（ 1982) ] に記載されている方法等を用 いて大腸菌 X1776 株からコ ンビテン 卜細胞耷調製し、 上記ァ ニールされたプラスミ ドによ り形質転換を行い、 卜 ランスフ オ ーマン 卜 （形質転換体 〉 が得られた 。
実施例 7 cDNA合成 （ ス ファ ージ系ライプラ リ ーの構築〉
1) 1 本鎖 CD Aの合成
実施例 5で述べた方法に従 っ て 3.83 の凍結保存 CHU-2 細 胞から 2回才 リ ゴ （ dT) セルロ ースカ ラムに''よる精製を経て 400 3のポ リ （ A + ) - RNA を得た。
このポリ （ A + ) - RNA 12 SP を溶解 した TE溶液 10 を 10jW gf のァクチノマイ シン D ( シグマ社製） を含む反応チュ ープに入れた後、 以下の賜序で試薬類を加えた ； 20 i の逆 転写緩衝液 （ 250mH 卜 リ ス—塩酸（PH8.3) 、 40IBH HgCJl 2 、 250mH KCi ) 20 の 5 fflH dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTPを 各々 5 fflH含む ） 、 20 5 の才 リ ゴ （ dT) 12.1 δ (0.2 Ζ ？ / P-L Biochemicals社製 〉 、 I z の 1 Mジチ才ス レイ ト ール 2 ί の 30υη ノ ^ Jl の RNase ( プロ メ ガパイ 才テク社） 、 10 ί の逆転写酵素 （ 10ιιη / χ ί 生化学工業社製） 、 1 S の α — [ 32p]dATP ( 10 Ciアマシ ャ ム社製） 、 16 ί の 水で計 100 の液量の反応液になる。 反応液を 42 で 2 時 間保っ た後、 5 X ί の 0.5Η EDTA及び 1 ί の 20% SDSを加 えて反応を停止した。 フ エ ノ ールー ク ロ ロ ホルム（100 ί ) 処理、 エタ ノ ール沈殿 （ 2 回 ） を行っ て約 4 SP の 1 本鎖 CDNAを得た。
2) 2本鎖 CDNAの合成
上記の如 く得られた cDNAを 29ji ϋ の ΤΕ溶液に溶解し以下の 顕序で試薬類を加えて反応液 と し ； 25 J? のポ リ メ ラ ーゼ 緩衝液（400B1H Hepes (pH7.6) ； 16mM MgCJI 2 ； 63ΙΒΗの j3 — メ ルカプ 卜 エタ ノ ール ： 270IDH KCi ) ； 10/ の 5 i»H dNTP ；
1.0 ζ の 15mHi3 - NAD ： 1· 0 ί の α - [ 32 ρ ] dATP ( 10 u St ) ； 0.2〃 J! E. coに I DNAリ ガーゼ （ 60unは/ ]! 宝酒造社製 ） ； 5· 0^ の E. col i DNAポ リ メ ラーゼ I ( New England Biolabs 社， 10unは Ζ ϋ ) ； 0. の RNaseH
( 60un ノ // ί 宝酒造社製 ） ； 28.7 の蒸留水。
反応液を 14^0で 1 時間イ ンキ ュ ベー ト し た後、 室温にもど して、 さ らに 1 時間イ ンキ ュ ベー ト した 。 次いで 5 ί の
0.5Μ EDTAと 1 ^ の 20% SDSを加えて反応を停止させ、 フ ェ ノ ール— ク ロ 口 ホルム処理、 エタ ノ ール沈殿を行っ た 。 得 られた DNA を 0.5mM EDTA 20 & に溶解せ しめ、 3 ϋ の K I enow緩衝液（500mH卜 リ ス -塩酸（ pH8 · 0 ) 、 50mM HgCJ2 2 ) 3 の 5 mH dNTP 、 及び水 4 ί を加えて反応液を調製 し た後、 1 ί の DNA ポリ メ ラ一ゼ （ Kl enow断片） （宝酒造社 製） を加えて 30で 15分イ ンキュベー ト した。
この反応液に 70ίζ ί の ΤΕ溶液を加えて希釈し、 さ ら に 5 ί の 0.5Η EDTA, ί の 20% SDSを加えて反応を停止し た。 反応液をフ I ノ ール— ク ロ 口 ホルム処理し 、 エタ ノ ール 沈殿を行っ て約 8 3 の 2本鎖 CDNAを得た。
3) 2本鎖 CDNAのメ チル化
2)の項で合成した 2本鎖 CDNAの水溶液 30 i 、 メ チル化緩 衝液（SOOmH卜 リ ス—塩酸（PH8.0) 、 50IBH EDTA)40^ ί 、 SAH 溶液（800^ M S—アデノ シルー し一メ チルメ チ才ニン
( SAH), 50mM ]3 - メルカプ 卜 ェタ ノ一ル） 20χ J1 、 水 100 ί を加えた混合液に EcoRI メ チラーゼ （ New England
Biolabs 社、 ZOuintZ ^ J! ) 15 を加えて全反応液を 200 St と し、 2 時間イ ンキュ ベー ト し た。 フ エ ノ ール処理 エーテル処理を行っ た後、 エタ ノ ール沈殿を行っ て DNA を回 収 した。
4) EcoRI リ ンカ 一の付加
上記メ チル化された 2本鎖 DN A 約 1 · 2 g に リ ガーゼ緩衝 液（250mHト リ ス—塩酸 （ PH7.5)、 100inH HgCi 2 ) 1.5^ ί . あらかじめ リ ン酸酸化された EcoRI リ ンカ 一 0.5^ i (10mer. 宝酒造社製） 、 1.5 ζ ϋ の 10mH ATP、 lOOmM ジチオス レィ 卜 ール 1.5〃 ί 、 2 S の Hn 0 を加え、 反応液を 15 ί と し て T4 ONA リ ガーゼ （3.4u / JJ 、 宝酒造社製） 0.7χ/ ί 加 えて 4 で一晩反応させた後、 65 にて 10分間加熟 し リ ガ一 ゼを失活させた。 この反応液をさ ら に 100IBH 卜 リ ス—塩酸 ( H 7.5) 、 5 ιηΗ HgCJ! 2 、 50IBM NaCi 、 100χ 3 / ^のゼ ラチンの濃度で全液量が 50^ になるよ う に調製し た後、
EcoRI ( 10unit/ μ, i ) 3.5^ i 加え、 37°C、 2時間反応さ せた。 次いで 0.5Mの EDTA 2.5ii JJ ； 20% SDS 0.5 を加 えた後フ ヱ ノ ール— ク ロ 口 ホルム処理を行いエタ ノ ール沈殿 によ り DNA を回収した 。 この後 U rogel AcA34 ( LKB 社製） のゲル逋過法あるいはァガ ロ ースゲル電気泳動法にて未反応 の EcoRI リ ンカ 一 を除去し、 リ ンカ一付加 2本鎖 CDNA約 0.5
〜 0.7 §f を回収した 。
5) 2本鎖 cDNAと ； I gt10ベク タ ーの結合
上記の リ ンカ 一付加 2本鎖 CDNAを 2.4^ の予じめ EcoRI 処理 した ； l gt10ベク タ ー （ ベク タ ー ク ロ ーニングシステム 社 ） 、 リ ガ一ゼ緩衝液（250mH卜 リ ス—塩酸、 100Π1Μ HgCi 2 )
、 蒸留水 6.5^ ί を加えて、 42°G、 15分間処理した 後 10mM ATP 1 ^ 、 0.1 Μジチオス レィ 卜 ール 1 ί 、
T4 ONA リ ガーゼ 0.5jW i を加え全量を 15 と した後、 12 でで一晩反応させた。
6) イ ン ビ 卜 ロパッ ケ一ジング
上記 5)で得られた耝換え体 D A の約 1/ 3 をイ ン ビ 卜 ロバ ッ ケージングキッ 卜 （ プロ メ ガ パイ 才テク社 ） を用いてパ ッ ケージング し 、 フ ァ ージプラークを得た 。 実施例 8 プローブ（IWQ) による pBR 系ライプラリ ー のスク リ ーニング
コ ロニーの成育した寒天培地上にワ ッ トマン 541濾紙をの せ 37 で 2時間放置した。 以下、 Taubと Thompsonの方法
[ Anal . Biochen.J i巻 222頁（1982)〗 に準じて ¾紙を処理 した。
すなねち、 541濾紙にコ ロニーを移した後、 ク ロラムフ エ 二コール（250 ノ ί ) を含んだ寒 培地に移し、 さらに 37でで一晩放置した。
541¾紙を取り出した後、 室温下で 0.5Ν NaOH溶液を浸し た逮紙上に 3分間放置し、 これを 2回く り返した。 以下周様 な操作を 0.5M 卜 リ ス一塩酸 （ PH8 〉 溶液を用いて 3分間、 2回行ない、 さ らに 4で下に 0.05 M 卜 リ ス一塩酸 ( H8 ) 溶液で 3分、
Figure imgf000052_0001
のリゾチーム液（0.05 Μ 卜 リ ス—塩 酸 （ ΡΗ8 ) 、 25%ショ糖を含む） で 10分間、 次いで 37Χί下に X SSC (0.15Η NaCi および 0.015クェン酸ナ ト リ ウム〉 溶 液で 2分間、 200 Z 3ノ^プロテアーゼ k を含む 1 X SSC 溶 液で 30分、 再び室温下に 1 X SSC 溶液で 2分間、 95%ェタノ ール溶液で 2分間、 2回行った後、 541逮^を乾燥させた。 得られた乾燥 541攄紙を室温下にフ ヱ ノ ール ： クロ 口ホルム イソアミルアルコール （ 25： 24： 1 、 100B1H 卜 リ ス—塩酸 ( pH8.5)、 100BM NaCJ! 、 10mHEDTAで平衡化したもの） 溶液 に 30分藺浸した。 以下同様の操作を 5 X SSC 溶液で 3分間、 3 回次いで 9596エタ ノール溶液で 3分藺、 2回行っ た後、 濂 紙を乾燥させた。 プロ ーブ （ IWQ)を常法 （ Molecular cloning を参照 ） に従 つ て 32 Pを用いて放射標識し た後、 Wal lace 等の方法
( Nucleic Acids Res. 巻 879頁（1981)) に従っ てコ ロニー ハイブリ ダィゼ一シ ヨ ンを行っ た 。 6 X NET [ 0.9H NaCi 0.09 M 卜 リ ス —塩酸 （ PH7.5)、 6 mH EDTA ] 、 5 X
Denhardt溶液、 0.1% SDS、 0.1fflg/ 変性 DNA ( 仔牛胸腺 DNA)を含むハイプ リ ダイゼーシ ヨ ン緩衝液中で 65で、 4時間 プレハイブリ ダィゼーシ ヨ ン 行っ た後、 放射標識化 したプ ロ ーブ （ IWQ)1 X 10° cpm を含む前記ハイブリ ダィゼ— シ ヨ ン緩衝液を用いて 56°Cで一夜ハイプ リ ダイゼーシ ヨ ンを 行っ た。 反応終了後 541濾羝を室温下に 0.1% SDSを含む 6 X SSC 溶液で 30分、 2回および 56°C、 1.5分間洗净 した後、 才ー ト ラジオグラフ ィ ーを行っ た 。 ·
シグナルの出た ク ロ ー ンよ りプラスミ ドを分離 した後、 プ ロ ープ（IWQ) を用いてサザンプロ ッ テ ィ ングを行 っ た 。 ハイ プ リ ダイゼー シ ヨ ンおよびォー 卜 ラジオグラフ ィ 一 は前述と 同一の条件で行な っ た。
同様にプロ ーブ（A) を用いてサザンブロ ッ テイ ングを行つ た。 ハイプ リ ダイゼーシ ヨ ンは前述のハイ ア'リ ダィゼーシ ョ ン緩衝液を用い、 49°Cで 1 時間行い、 39で まで徐冷後さ ら に 39°Cで 1 時間行な っ た。 反応終了後、 二 卜 ロ セルロ ースフ ィ ルタ ーを 0.1% SDSを含む 6 X SSC で室温下に 30分で 2回洗 净 し、 次いで 39でで 3分間洗净 した後、 才ー 卜 ラジオグラ フ ィ ーを行な っ た。
この結果、 1 個のク ロ ーンがポジティ ブなもの と して得ら れ、 ジデ才キシ法によ り塩基配列を決定 した と ころ図 2に示 し た如 く 、 プロ -プ（IWQ) 及びプロ ーブ（A) 部分を含む 308 塩基対よ りなる DNA であるこ とが判明 し 、 このイ ンサー 卜を 含む PBR322由来プラスミ ドを PHCS - と命名 した。
実施例 9 pHCS-1由来 DNA プロ ーブに よる； Iフ ァ ージ 系ライプラ リ ーのスク リ ーニング
Bentonと Davis の方法 [ Science 96 巻、 180頁、 （ 1977)] に準じてプラー クハイブリ ダィゼ一シ ヨ ンを行っ た。 実施例 8で得られた PHCS-1を Sau3A および EcoR Iで処理して約 600 塩基対の DNA 断片を得、 この 0NA 断片を常法に従いニ ッ ク 卜 ランス レーシ ヨ ンによ り放射標識 した。 フ ァ ージプラー クの 生じた寒天培地上に二 卜 ロ セルロ ース濂紙 （ S & S社〉 をの せて フ ァ ージを移し、 0.5H NaOHにて DNA を変性させ、 以下 の順序で濾紙を処理した。 0.1H NaOH、 1.5H NaCi で 20秒 続いて 0.5M 卜 リ ス一塩酸 （ pH7.5)、 1.5M NaC で 20秒 2 回、 最後に 120mH NaCi 、 15mHクェン酸ソ ーダ、 13mH
KH2 P04 、 1 fflH EOTA 、 pH7.2 で 20秒処理 した。
次いで嫿紙を乾燥し、 80°Cで 2時間加熱し て DNA を固定 し た。 5 X SSC 、 5 X Denhardt溶液、 50mHリ ン酸緩衝液、 50% ホルム アミ ド、 0.25 ffl Z の変性 DNA (鮭精巣 DNA)、 及び 0.1% SDSを含むハイブリ ダィゼーシ ヨ ン緩衝液中で 42°Cに て一晚プ レハイ プ リ ダイ ゼ ー シ ヨ ンを行い 、 ニ ッ ク 卜 ラ ン ス レーシ ヨ ンによ り放射標識化した pHCS-1プロ ープ 4 X 105 cpm / を含むハイブリ ダィゼーシ ヨ ン緩衝液 （ 5 X SSC 、 5 X Denhardt溶液、 20mHリ ン酸緩衝液（pH6.0 ) 、 50%ホルム ア ミ ド、 0.1% SDS、 10 %デキス ト ラ ン硫酸、
Figure imgf000055_0001
の変性 DNA ( 娃精巣 DNA)の混合液 ） で 42X:にて 20時間ハイブ リ ダィゼーシ ヨ ンを行っ た。
二 卜 ロセルロ ース逋紙を室温下に 0.1% SDSを含む 2 X SSC で 20分間洗净 し 、 次いで 44でで、 0,1% SDSを含む 0.1 X SSC で 30分間、 さ ら に室温下で 0.1X SSC で 10分間洗浄し た後、 才ー 卜 ラジオグラフ ィ ーで検出 し た。
その結果、 5個のポジティブなク ロ ーン （ G1〜5)が得られ た。 そこで、 得られた ク ロ 一ンのう ち完全長 cDNAを含む と思 われるク ロ ー ンの DN A 塩基'配列をジデォキシ法にて調べた と ころ図 3 (A) に示される如き塩基配列が得られた。 そこでこ の cDNAを； I gt10ベク タ ーよ り切 り だ し、 pBR327 [ Soberon 等 Genej巻 287頁（1980) ] と EcoRェ 部位で結合させ、 プラスミ ドと して大量調製した。 このプラスミ ドを PBRG4 と称する。 実施例 10 PBRG4 由来 DNA プロ ーブおよびプロ ーブ
( LC) に よる ； ί フ ァ ージ系ライプラ リ ーの スク リ ーニング
実施例 9で用いた Bentonと Davis の方法 （前出の文献を参 照） に準じてプラークハイ プ リ ダイゼーシ ョ'ンを行っ た 。 フ ァ ージプラー クの生じた寒天培地上に二 卜 ロセルロ ース逋紙 ( S & S社製） をのせて フ ァ ー ジを移 し 、 0.5M NaOHにて DNA を変性させ、 以下の順序で逋紙を処理 した。 0.1M NaOH 1.5M NaCi で 20秒、 続いて 0.5H 卜 リ ス—塩酸 （ ρΗ7·5)、 1.5Η NaCJ! で 20秒 2回、 最後に 120mH NaCi 、 15mHクェン 酸ソーダ、 13mM KH2 P04 、 mM EDTA Λ ( pH7.2)で 20秒処 理した。 次いで逋紙を乾燥 し、 80Όで 2時間加熟して DNA を 固定 し た。 このよ う に し て同一の逋紙を 2枚作製し、
PBR64 由来 DNA プロ ーブとプロ ーブ （ LC) によるスク リ ー二 ングにそれぞれ供 した。
PBRG4 由来 DNA プロ ーブによる場合は、 PBRG4 を EcoRIで 処理して約 1500塩基対の DHA 断片を得、 この DNA 断片を常法 に従っ てニッ ク 卜 ランス レーシ ヨ ンによ り放射標識した 。 上 記嫿紙を 5 XSSC 、 5 X Denhardt溶液、 50mHリ ン酸緩衝液、 50%ホルムアミ ド、 0.25 fflg/fligの変性 DNA (鮭精巣 DNA)、. 及び 0.1% SDSを含むハイプリ ダイゼ一シ ヨ ン緩衝液中で 42 X；にて一晩、 プ レハイブリ ダィゼーシ ヨ ンを行い、 上記の放 射標識した約 1500塩基対の DNA プロ ーブ （約 1 X 108 cpm / ) を含むプレハイブリ ダィゼーシ ヨ ン緩衝液 [ 5 X SSC 、 5 X Denhardt溶液、 20mHリ ン酸緩衝液 （ pH6.0)、 50%ホルム アミ ド、 0.1% SDS、 10%デキス ト ラン硫酸、 0.1 ^ノ ^の 変性 DNA ( 鮭精巣 DNA)の混合液 ] で 42で にて 20時間ハイプリ ダイゼーシ ヨ ンを行っ た。 二 卜 ロセルロ ース逋紙を室温下に 0.1% SDSを含む 2 X SSC で 20分間洗净 し 、 '次いで 44°Cで、 0.1 % SDSを含む 0.1X SSC で 30分間、 さ らに室温下で 0.1 % SSCで 10分間洗浄 した後、 才 - 卜ラジオグラフ ィ ーで検出
U ο
プロ ーブ （ LC) の場合は、 逮紙を 0.1% SDSを含む 3 X SSC で、 65で にて 2時間前処理 し た後、 6 X NET 、 X Denhardt溶液、 100 3 Z の変性 DHA ( 鲑精巣 DNA)を含む 溶液中、 65°Cで 2時間、 プ レハイプ リ ダイ ゼーシ ヨ ンを行つ 放射標識し たプロ ーブ （ LC) ( S x lOD cpm Z ) を含む プレハイプリ ダイゼーシヨ ン緩衝液 [ 6 X NET 、 1 X
Dentiardt溶液、 100^ 3 / /^変性 DNA ( 鲑精巣 DN A ) ] で 63°C にて一晩ハイプ リ ダイゼーシ ヨ ンを行っ た後、 二 卜 ロ セル口 一ス瀘紙を室温下に 、 0.1% SDSを含む 6 X SSC で 20分間洗 浄し 、 この洗浄を 3回行っ た後、 0.1% SDSを含む 6 X SSC にて 、 63°Cで 2分間洗净 し た 。
濾紙を乾燥 した後才ー 卜 ラジオグラフ ィ ーで検出 した 。
このよ う に し て行っ たスク リ ーニ ングに於いて、 2つのプ ロ ーブの両方にポジティ ブなク ロ ー ンを選別 し、 そのう ち完 全長の CDNAを含むと思われるク ロ ー ンの塩基配列をジデ才キ シ法にて調べた と ころ、 図 4 (A) に示される如き塩基配列が 得られた 。 そこでこの CDNAを ； I gt10ベク タ 一 よ り 切 り だ し 、 PBR327と EcoRI部位で結合させ、 プラスミ ド pBRV2 を得た 。
実施例 " 大腸菌用耝換えベク タ ー （ + VSE)の構築
および形質転換 [ tac プロ モー タ ー含有 ベク タ ーを用いた例 ]
1) 耝換えべ ク タ 一の構築
① ベク タ ーの調製
tac プロ モータ ー含有ベク タ ー PKK223 - 3 ( フ アルマシア 社製） 5 3を 30 ϋ の反応液（40mM Tris- HCi 、 7 mM
HgCi 2 、 100ΠΙΜ NaCi 、 7 mM 2— メ ルカプ トエタ ノ ール 〉 中、 EcoRI (宝酒造社製） 8単位で 37で 、 2時間処理 した。 5 ε 次いで、 アルカ リ ホスフ ァ タ ーゼ （宝酒造社製） 3 ^ を 加え 60°C、 30分間処理し 、 常法に従いフ I ノ ール処理 3回、 エーテル処理及びエタ ノ ール沈殿を行っ て DNA 断片を回収し た。
この DNA を 50mM Tris - HCi 、 5 mH MgCi 2 、 10mH DTT、
1 mHの dATP, dCTP, dGTP, dTTPからなる 50 の混合液に溶 解 し、 大腸菌 DNA ポ リ メ ラー ゼ I - Kl enow断片 （宝酒造社製） 3 ί を加えて 14 、 2時間反応せ しめ、 末端をプラン 卜ェ ン ド （ blunt end)に した。
② 合成リ ンカ 一の調製
合成リ ンカ一、 C G A A T G A C C C C C C T G G G C C 及び C A G G G G G G T G A T T G Gの配列を有する才 リ ゴ ヌ ク レオチ ド 3 ^ 3 を' 50mH Tris - HCi 、 10mM HgCi! 9 、 10 mH 2 —メルカプ 卜 エタ ノ ール、 1 mH ΑΓΡからなる反応液 40 u ϋ 中で Τ 4 ポリ ヌ ク レオチ ドキナ一ゼ 4単位存在下、 37で、 60分間反応せ しめ、 リ ン酸化 した。
次いで該リ ン酸化才 リ ゴヌ ク レオチ ドを夫々 0.2 §t を 100mM NaCi を含 i?TE(10mH Tris - HCi 、 pHS.0 、 mH EDTA) 20 Jl に溶解 し 、 65で、 10分間処理じ'た後、 室温まで 徐冷するこ と に よ り アニー リ ングを行っ た 。
③ G - CSF の CDNAの断片の調製
実施例 9で得た図 3 (A) で示す CDNAを含有する PBRG4 60 3 を 6 mM Tris - HCi , 6 mH HgCi 2 , 6 mH 2 — メルカプ 卜 エタ ノ ールからなる反応液 200^ ϋ 中、 制限酵素 Apa ェ ( Hew England Biolabs 社製 ） 100単位、 Dra I (宝酒造社 製） 50単位で 37°C、 3 時間処理し、 1.2%ァガロ ースゲル電 気泳動に て約 590bp の Apa I - Ora I 断片約 2 χ 3 を回収し た。
④ 上記各断片の連結
①， ②， ③各断片を夫々約 0.1 3 と り 、 20 ]! の連結反 応液（66ΙΒΗ Tr i s - HCi 、 6.6mH HgCi 9 、 10mH DTT、 1 mH ATP)に溶解 し T 4 DNA リ ガーゼ 175単位を加えて 4 で一晩 反応し組換えベク タ ーを得た （ 図 6 〉 。
2) 形 質 転 換
上記④で得られた耝換えベク タ ーを含む反応液 20χζ ί を用 いて塩化ルビジウム法 〔前出 T. Hani at is等（Ho I ecu lar cloning) 252 頁（1982)参照） によ り E.col i 川 105株を形質転 換し た。 得られた形質転換株はアンピシ リ ン耐性のコ ロニー 培養液よ りプラスミ ドを分離し、 制限酵素 BamH I , Acc I , Apa I で処理した ところ目 的の形質転換株であるこ とが確認 できた 。
実施伢 12 大腸菌用耝換えベク タ ー （ + VSE)の構築 および形質転換 [ PLプロモータ ー含有べク タ ーを使用 した例 ] '
1) 耝換えべク タ 一の構築
① ベク タ ーの調製
PLプロ モータ 一を含むベク タ ー pPL - lambda ( フ ア ルマシ ァ社製） 100^ 3 を制限酵素 BafflH I 、 50単位で反応液（ 10mH Tris - HCi 、 pH7.6 、 7 »H HgCi 2 、 100«H NaCi 、 10BH DTT) i 中、 37で、 一晩処理した。 5 o これから、 1 %ァガロ ースゲル電気泳動にて、 約 4 Kbp の 断片約 49^ 3 と約 1.2KDP の断片約 11 Sf を回収 した。
上記の断片のう ち、 まず約 4 Kbp の方を前記の TE緩衝液 100 ί に溶解し 、 アルカ リ ホス フ ァ タ ーゼ （宝酒造社製） 5 5 と 60 、 60分間反応せ しめ脱 リ ン酸化した。
残り の約 1,2Kt)p の断片の方は緩衝液（10mH Tris - CH 、 10mH MgCi 2 、 6 mH KCi , mH DTT) 20 u Jl .に溶解し 、 制 限酵素 Hbo I ( New England Biolabs 社製 ） 20単位で 37°C、 一晩処理し た。
次いで、 4 %ポリ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動によ り約
200 bp の BamHI - Hbo ϋ断片約 0.9 gt と約 310bp の Mbo 辽 - BamHI断片約 1.9 z §f を回収した 。
② 合成リ ンカ 一の調製
合成リ ンカ一 TA A G G A G A A T T C A T C G A Tおよ ぴ T G G A T G A A T T C T C C T T A Gを実施例 11の②と 同様に して リ ン酸化しアニー リ ングし、 合成 S Z D リ ンカ一 を得た。
③ 発現用ベク タ ーの調製
上記①で調製 した約 4 Kbp 断片 0.1 及' 'び 0 , P L 頜域 を有する BamH I Hbo ϋ断片、 t L j 領域を有する Mbo K - BamHI断片夫々 0.05 3 と ァニール した合成 S D リ ンカ ― 0.1 §? を40 ！ の反応液（66mM Tris - HCi , 6.6mH HgCJi 2 、 10mM DTT、 1 mH ATP) 中、 T 4 DNA リ ガー if (宝 酒造社製） 175単位存在下 12°C、 一晩反応せ しめた 。 この反 応液 20 i を用い、 E. col i N99CI + 株 （ フ ァルマシ ァ社製） を CaCil 2 法 （ 前出の " Molecular cloning " 参照 ） にて形 質転換した。
該形質転換株を培養し 、 そのアンピシ リ ン耐性のコ ロニー の培養液よ りプラスミ ドを分離 し て 、 制眼酵素 EcoRI , BamH I , SiRd I で処理した ところ目的のプラスミ ドであるこ とが確認された。
次に、 このプラスミ ドを 2 W Sf と り 、 20χ ϋ の緩衝液
(10IHH Tris - HCi 、 6 IBH HgCi n 、 SOIBH NaCJl ) 中、 制限酵 素 Cla ェ （ New England Biolabs 社製） を 37で、 2 時間反応 させた後 65°C 10分間で失活させた。
更にその反応液 1 & を 20 ί ί の前記連結反応液及び Τ 4 DNA リ ガーゼ （宝酒造社製） 175単位を用いて 12°C、 一晚反 応 した後、 上記と同様に して E. col i N99c l + 株 （ フ アルマ シァ社製） を再び形質転換 した 。 アンピシ リ ン耐性コ ロニニ 培養液からプラス ミ ドを分離 し EcoRI , BamH I で処理 し、 目 的のプラスミ ドを確認 した 。
④ G - CSF 発現用耝換えベク タ ー及び形質転換体の調製
③で得られた発現用プラスミ ドを制限酵素 Cla I で処理し 末端をプラン 卜 エン ドに した後実施例 11と同様に して G - CSF の CDNA断片を組み込み組換えベク タ ーを-得た。 これを用 い、 前出の Molecular cloning に記載されている CaCJ! 2 法 にて E. COl i N4830株 （ フ アルマシア社製） を形質転換 した 。 なお、 目 的の形質転換体の確認も実施例 11と同様に行っ た ( 図 7 ) 。 実施例 13 大腸菌用耝換えベク タ ー （ + VSE)の構築と 形質転換 [ trp プロ モー タ ー含有ベク タ ー を用いた例 ]
1) 耝換えべク タ 一の構築
① ベク タ ーの調製
PBR322の Cla ェ 部位に 卜 リ ブ 卜 フ ァ ンプロモ一 タ ーを含む 約 330bp の Hpa I -- Taq I 断片を挿入 し作製 した pOY1プラス ミ ド 10/ を 10mH Tri s - HCi 、 6 mH HgCi 2 、 50mH NaCi の反応液 30^ 中、 制限酵素 Cla I 7単位 Pvu I 8単位 で 37°C 3 時間処理 した。
次いで、 アルカ リ ホスフ ァ タ ーゼ （宝酒造社製） 2 Λ を 加え 60で 、 1 時間反応せ しめた。
これから 1 %ァガロ ースゲル電気泳動によ り約 2.6Kbp の 断片を約 3 回収 した。
② 合成リ ンカ 一の調製
合成リ ンカ - C G C G A A T G A C C C C C C T G G G C C及び C A G G G G G G T C A T T C Gを実施例 11の② と同 様に し て リ ン酸化 し、 アニー リ ング した。
③ 耝換えべク タ 一の調製
上記①で調製したベク タ ーの断片約 1 3、 及び②の合成 リ ンカ一約 1 3 と、 実施例 11の③で調製 した G - CSF の CDNA断片約 1 3 を前記の連結反応液 20 JI 中、 T 4 DNA リ ガーゼ （宝酒造社製） 175単位と 12でで ー晚反応せ しめ耝換 えベク タ ーを得た （ 図 8 ) 。 2) 形 質 転 換
上記③の反応液 20 ]! を前出 「 Moiecular cloning 」 の塩 化ルビジウム法で E. col i DHI株に形質転換した 。
実施例 11と同様に してアンピシ リ ン耐性のコ ロニーからプ ラス ミ ドを と り 、 制限酵素 A pal ， D ral , N ru I , P st l で目的とする形質転換体が得られているこ とを確認した 。
実施例 14 形質耘換株の培養
1) 実施例 11で得た形質転換株（tac含有） の培養 、 ァンピシ リ ン 25^ 3 Ζϋώ又は 50 を含むルリ ア
( Luria)培地 100/^に、 37°C、 一晩培養した該形質転換株の 培養液 1 ^を加え 37°Cで 2〜 3 時間培養する。
次いで、 イ ソプロ ピル一 3 — D — チ才ガラク 卜シ ド 2 mHに して 37°C、 2〜 4 時間培養 した。
2) 実施例 12で得た形質転換株 （ Ρ ^ 含有 ） の培養
アン ピシ リ ン 25 3 / 又は 50 / ζ?ώを含むルリ ア培地
100 に 28 一晩培養 した該形質転換株の培養液 を加え 28 で約 4時間培養した。
その後、 これを 42°Cに し 2〜 4時間培養を行っ た。
3) 実施例 13で得た形質転換株（trp含有 ） の'培養
0.5%グルコ ース、 0.5%カザミ ノ 酸（Difco社製） 、 アン ピシ リ ン 25 §f ^又は 50 Sf Z を含む M 9培地 100 /^に 37 一晩培養し た該形質転換株の培養液 1 を加えて 37 で 4〜 6時間培養する。 次いで、 3 — 3 — イ ン ドールアク リ ル 酸（IAA)
Figure imgf000063_0001
§f を加えて 37°Cで 4〜 8 時間培養 した。 実施例 15 大腸菌からの G - CSF ポ リ ペプチ ドの 回収 ♦ 精製
1) 回 収
実施例 14で培養した形質転換株、 夫々 について以下の回収 操作を行っ た。
培養液 100 を遠心分離にかけて菌体を集め、 20mH Tris - HCi ( pH7.5)、 30mH NaCJl 混合液 5 ^に懸濁させた。
次いで、 各々 Ί ΐηΜ, 10mM, 0· 2«?/ になるよう に 0.2M フ エ 二ルメ チルスルホニルフルオライ ド、 0.2H EDTA、 リ ゾ チームを加え、 0 °Cで 30分間放置した。
次に凍結—融解を 3 回く り かえ し或いは更に超音波処理を 行っ て溶菌させた。 得られた溶菌液を遠心分離にて上清を得 るか、 或いは 8 M塩酸グァニジンを用いて 、 最終的に 6 M塩 酸グァニジンに した後、 30, 000 p.m.、 5時間の遠心分離を 行い、 その上澄液を取得した 。
2) 精 製
(i) 1)で得た上澄液を直径 4.6Cffl、 長さ 90αηの IHtrogel ACA54 カ ラム（LKB社製） にて、 0.15M NaCJ! および 0.01 %ツイ一ン 20 (半井化学社製 ）''を含む 0.01 M 卜 リ ス -塩酸緩衝液 （ PH 7.4)を用いて流速約 50/ ^ 時 間でゲル濂過 した。
次いで、 前述した 「CSA の測定方法（b) J によ り活 性を示す画分を と り PM- 10 ( ア ミ コ ン社製） を用いる 限外逋遏器によ っ て約 5 ffl2に濃縮した 。
(i i) 上記濃縮画分に n—プロパノ ール （東京化成社製、 ア ミ ノ 酸配列決定用 ） と 卜 リ フル才 ロ 酢酸を加え最終 濾度がそれぞれ 30%および 0.1% となるよう に調製し、 氷中に 15分程度放置 したのち、 15， 000r. p. l 10分の遠 心に よ り沈殿を除去した 。 次いで先の n —プロパノ ー ルおよび 卜 リ フル才 ロ S酸を含む水溶液で平衡化 した Bondapak C18カ ラム （ Waters社製、 セミ分取用、 8 im X 30C/B ) に吸着後、 30〜 60%の直線濃度勾配の n — プロパノ ールを含む 0.1 % 卜 リ フル才ロ酢酸水溶液で 順次溶出 した 。 高速液体ク ロマ 卜装置は日立 685 - 50 型を、 検出は 日立 638 - 41型検出器 （ いずれも 日立製 作所製） を用い、 220raaと 280raiの吸収を同時に測定 した 。 溶出後、 各画分よ り 10^ ί を分取 100倍希釈し たのち、 前述の 「 CSA の測定方法（b) 」 に よ り活性を 示す画分を調べた 。 この結果、 π —プロパノ ール 40% にて溶出される ピー ク に活性が認め られたので、 この ピー クを集め再度同 じ条件で再ク ロマ 卜を行い上記と 周様に して CSA を調べた と ころ、 やは り n —プロパノ ール 40%の位置の ピー ク に活性が認められたので、 こ の ピー クを集め （ 4 フラクシ ョ ン - i ) 凍結乾燥 し た 。
) 上記凍結乾燥粉末を n —プロパノ ールを 40%含む 0.1% 卜 リ フル才 ロ 齚酸水溶液 200 に溶解 し、 TSK - G3000SW カ ラム （東洋曹達社製、 7.5m X eO ) を用いた高速液体ク ロマ トグラフ ィ ー （ HPLC〉 にかけ た。 溶出は同水溶液に よ り 0.4^/分の流速で行い、 フラクシ ョ ンコ レク タ ー FRAC - 100 ( フ アルマシア社 製） によ り 0.4 ずつ分取 した。 分取 した各画分につ いて CSA を前記と周様に して調べ活性画分を回収し 、 更に分析用 Bondapak C18カラム（4.6™ x 30 ） によ る精製を施 したのち、 メ イ ンピークを回収 し凍結乾燥 し た 。
得られたタ ンパク質を 2— メ ルカプ 卜 エタ ノ ールで 処理 して SDS - ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル（ 15.0 % ) 電 気泳動 （ 15mV、 6時間 ） にかけ、 クマシ一ブルーで染 色 した と ころ目的とする G - CSF ポ リ ペプチ ドが単一 のバン ド と して確認できた 。
実施例 16 発現物質の G - CSF 活性の検定 （ +VSE) '実施例 15で得た CSF 試料を前述の 〈参考例〉 CSF 活性の測 定方法（a) に従っ て検定 し た 。 この結果を表一 1 に示す。
ヒ 卜好中球コ ロニー 数 Zdish
精 製 ヒ 卜 G - CSF ( 20ng) 73
実施例 15で得た CSF 試料 （ 50ng) 68
ブ ラ ン ク 0 実施例 17 ア ミ ノ 酸分析 （ + VSE)
1) アミ ノ酸組成の分析
実施例 15で精製した CSF 試料を常法によ り加水分解し、 そ のタ ンパク部分のア ミ ノ酸組成を 日立 835ア ミ ノ酸自動分析 装置 （ 日立製作所社製 ） を用いて特殊アミ ノ酸分析法に よ り 分析 した 。 この結果を表一 2に示 した 。 尚、 加水分解条件は 次の如く である。
① 6 N HC 、 110 、 24時間、 真空中
② 4 N メ タ ンスルホン酸 + 0,2% 3 _ ( 2—アミ ノ エ チル ） イ ン ドール、 110°C、 24時間、 48時間、 72時間、 真 空中
試料は、 40% n—プロパノ ールと 0 · 1 % 卜 リ フル才ロ醉酸 を含む溶液（1.5/s に溶か し た後、 各々 を と り '、 乾燥 窒素ガスによ り乾燥させた後、 ①又は②の試薬を加えて真空 封管 し 、 加水分解に供した 。
表中、 実測値は①の 24時間値と②の 24, 48, 72時間値の合 計 4回の平均値である。 但 し 、 T hr, S er, 1/2 Cys, Met, Val, I I eおよび T rpは以下の方法で算出 した 〔生化 学実験講座、 タ ンパク質化学 ]！ ( 東京化学周人出版 ） を参 照 〕 。
。 T hr, S er, V 2 Cys, Metは②の 24, 48, 72時間値 の経時変化を と り 、 零時間に補外。
。 Val, I leは②の 72時間値。
。 T rpは②の 24, 48, 72時間値の平均値。 表 一 2 ( アミ ノ酸分析表）
Figure imgf000068_0001
2) N末端アミ ノ酸分析
試料を気相式シークェンサ一 （ アプライ ドバイ 才システム 社製） を用いてエ ドマン （ Edman)分解し 、 得られた PTHアミ 7 ノ 酸を高速液体ク ロマ トグラフ ィ ー装置 （ ベ ッ クマン · イ ン ス 卜ルメ ンッ社製 〉 および U rasphere - 0DS カ ラム （ べッ クマン * イ ンス 卜ルメ ンッ社製） を用いて常法によ り分析し た。 カ ラム ( 5 m、 直径 4.6卿 、 長さ 250m ) を開始緩衝 液 （ 15mH酢酸ナ 卜 リ ウム緩衝液 PH4.5 、 40%ァセ 卜 二 卜 リ ル を含む水溶液） にて平衡化 したのち 、 検体 （ 20^ 11 の開始緩 衝液に て溶解） を注入 し て開始.緩衝液に よるイソ クラテ ィ ツ ク溶出によ り分離を行っ た。 流速は 1.4/^/分、 カラム温度 は 40でに保持 した。 PTHアミ ノ酸の検出は 269/¾3と 320 の 紫外部吸収を利用 した。 あ らかじめ標準 PTHアミ ノ酸 （ シグ マ社製） 各 2 n moi を同一の系で分離 して保持時間を決定 し 被検検体の保持時間から同定を行っ た。
その結果、 PTH - メ チ才ニンおよび PTH - ス レ才ニンが検 出された。
実施例 18 大腸菌用組換えべク タ 一 ( - VSE)の構築と 形質転換
1) tacプ口 モー タ ー含有ベク タ ーを用いた例
実施例 11③における 「実施例 9で得た図 3 (A) で示す CDNA を含有する 」 のかわ り に 「実施例 10で'得た図 4 (A) で 示す CDNAを含有する PBRV2 」 を用いる他は、 実施例 11と全く 同様の操作を行い、 得られた形質転換株が目的とする形質転 換株であるこ とを確認 した （ 図 9 ) 。
2) PLプロモータ ー含有ベク タ ーを用いた例
CDNA ( — VSE)を用いて実施例 12を操り返し 、 得られた形質 転換体が目 的の形質転換体であるこ とを確認 した （ 図 10〉 。 3) trpプ口 モー タ ー含有ベク タ ーを用いた例
CDNA ( — VSE)を用いて実施例 13を繰り返し、 目 的とする形 質転換体が得られているこ とを確認 した （ 図 11 ) 。
実施例 19 発現物質の G - CSF 活性の検定 （ - VSE) 実施例 18で得た形質転換株を各々 、 実施例 14に記載の方法 で培養し 、 次いで該培養した大腸菌から実施例 15に記載の方 法によ っ て 、 G - CSF ポ リ ペプチ ドを回収 し精製して単一の パン ド と して ヒ 卜 G - CSF ポ リ ペプチ ドを得た。
かく して得られた CSF 試料を前述の 〈参考例 〉 CSF 活性の 測定方法（a) に従っ て検定 し た 。 この結果を表一 3 に示す。 表 — 3
Figure imgf000070_0001
実施例 20 アミ ノ酸分析 （ ― VSE)
1) ア ミ ノ 酸組成の分析
実施例 19で精製した CSF 試料のアミ ノ酸組成分析を実施例 17の 1)に記載の方法に よ り行っ た。 得ら れた結果を表— 4 に 示す。 表 一 4 ( アミ ノ酸分析表 ）
Figure imgf000071_0001
2) N末端ァミ ノ酸分析
試料を実施例 17の 2)に記載の方法に従っ て、 N末端ァ ノ 酸分析に付した。 その結果、 PTH - メ チォニンおよび PTH - ス レ才ニンが検 出された。
実施例 21 PHGA410 ベク タ 一の調製
(動物細胞用、 + VSE 系）
実施例 9で得られた図 3 (M で示される CDNAの EcoRI断片 を制限酵素 D ral にて 37°Cで 2時間で処理した後、 DNA ポリ メ ラ一ゼ Iの Klenow断片 （宝酒造社製 ） で処理し、 末端を平 滑末端と した。 の B gl ll リ ンカ 一 （ 8 iiier ； 宝酒造社 製） を ATP を用いて リ ン酸化 した後、 上記で得られた約 1 3の DNA 断片混合物と結合させた。 次いで制賬酵素 B gl E で処理 して ァガロ ースゲル電気泳動を行い、 最も大きい DKA 断片だけを回収 した。
この DNA 断片を図 5に示すよう に ヒ 卜 G - CSF ポリ ぺプチ ドをコ ー ドする部分を含む約 710塩基対に相当 していた 。 ベ ク タ - pdKCR { Fukunaga ； Proc. Natl . Acad. Sc i . USA； 81巻 50δ6頁（1984)) を制限酵素 BamH Iで処理 した後、 アル力 リ フ ォ スフ ァ タ ーゼ （宝酒造社製 ） で脱 リ ン酸 して得られた ベク タ ー DNA を T 4 DNA リ ガーゼ （宝酒造社製） を加えて CDNA断片と結合させ pHGA 410を得た （ 図 12) '。 図 12に示され るごと く このプラスミ ドは、 SV40初期遣伝子のプロモー タ ー SV40の複製開始領域、 ゥサギ /3 —グロ ビン遺伝子の一部、 PBR322の複製開始領域および PBR322由来の /3 — ラクタマーゼ 遺伝子 （ Ampp ) を含み、 SV40初期遺伝子のプロモータ ー下 流に ヒ 卜 G - CSF 遣伝子が接続されている。 7 ί 実施例 22 C127細胞用耝換えべク タ -の構築 （ + VSE) 1) HGA410 (Η) の構築
実施例 21で得られた （ 図 12) PHGA410 プラスミ ド 20 ^ 3を 5Ο ΙΗ Tris - HCi ( pH7, 5)、 7 mM HgCi 2 、 100mH HaCJl 、 7 mM 2 —メ ルカ プ 卜 エ タ ノ ール、 0,01 %ゥシ血清アルプ ミ ン （ BSA)の反応液に溶解 し 、 制限酵素 EcoRI ( 宝酒造社製 10〜15単位 ） を加えて約 30分 37°Cに て反応させ、 EcoRI によ る部分消化を行っ た。 次いでフ エ ノ ールー ク ロ ロ ホルム （ 1 1 ) 処理を 2回行いエーテル処理、 エタ ノ ール沈殿を行っ て DNA 断片を処理 した 。
この隱 断片を 50mH Tris - HCi 、 5 mM MgCi! 2 、 10mH DTT 、 1 mMの dATP, dCTP, dGTP, dTTPからなる 50 の液に 溶解 し E. col i DNAポ リ メ ラ ーゼ -- Kl enow断片 （宝酒造社製） 5 μ. ί を加えて 14°C 2時間イ ンキュ ベー ト しブラン 卜 エン ド ( blunt end)に し た 。
これから 0.8%ァガ ロ ースゲル電気泳動に よ り約 5.8kbの 断片 6 , を回収 した 。
回収 した 断片 5 3を再び 50mM Tris ~ HCil ( pH7.6) 10mM MgCi 2 、 10mH DTT、 iilH ATPから なる反応液 50 §f 中 に溶解 し、 Hind HI リ ンカ 一 （ 宝酒造社製 ） m 及び T4 DNA リ ガ一 t (宝酒造社製） 100単位を加えて、 4で にて一 晩反応 した 。
次いで、 フ ： E ノ ール処理、 エーテル処理、 エタ ノ ール沈殿 後、 10mM Tris- HCi ( ρΗ7·5)、 7 πιΗ MgCJl 9 、 60mH NaCJl の溶液 30^ に溶解 し 、 制限酵素 HindH 10単位存在下 3時間 37 でイ ンキ ュ ベ - 卜 した 。 再び T 4 DNA リ ガ -ゼに よ り処 理 した後、 この DHA を塩化ルビジウ ム法 （ 前記の
「Holecular cloning 」 参照 ） に よ り E.col i DHI株に形質転 換し、 アンピシ リ ン耐性 （ Amp' ) のコ ロ ニーを得て 、 pHGA 410 プラス ミ ドの EcoR I部位が H i Mに置きかわ っ たプラス ミ ドを保持する菌を選択した。 このよう に して得られたプラ スミ ドを PHGA410 (H) と命名する （ 図 13) 。
2) 発現用組換えベク タ ー pTN- G4の構築
上記 1)で得ら れた PHGA410 (H) ( 2Q gt ) を 10mM Tris - HCJ1 ( ρΗ7·5)、 7 mM HgCi 2 、 175mM NaCi 、 0.2iM EDTA 7 mH 2— メルカプ ト エタ ノ ール、 0.01 %ゥシ血清アルブ ミ ンからなる反応液 50 ]! に溶解 し、 制限酵素 S ai l ( 宝酒 造社製 〉 20単位を加え、 37。Gにて 5時間イ ンキ ュベ一 卜 した , 次いで フ エ ノ ール処理、 エタ ノ ール沈殿後、 DNA ポ リ メ ラ ー ゼ Klenow断片 （ 宝酒造社製 ） にて前出の反応と周様に 14°C約 2時間イ ンキ ュ べ一 卜 し、 プラン 卜 エン ドに した 。 これを、 ァガ ロ ースで回収するこ とな く エタ ノ ール沈殿 した DNA 断片 を制限酵素 H ind ΠΙにて処理 して 、 約 2,7kbの H ind I - S ai l断片を 1 %ァガロ ースゲル電気泳動にて 5 ^ 3回収し た。 一方、 ゥシ乳頭腫ウ ィ ルス [ bovine papi l loma virus ( BPV) ] を有するプラスミ ド pdBPV - 1 ( Sarver, n. ,
SByrne, J. C S Howl ey , P. H. (1982) Proc. Nat I . Acad.
Sci, USA_H_巻 7147 - 7151 ; Dr. Howley よ り入手） を Hagata らの方法の如く ( Fukunaga, Sokawa, Nagata, ( 1984) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81 巻 5086 - 5090) を H ind II及び P vulで処理して 8, 4kbの DNA 断片を得ておく 。 この 8.4kb の DNA 断片と上記の約 2.7kbの Hindi! — S al I DNA 断片を常 法に従っ て Τ Λ DNA リ ガーゼによ り処理し、 前出の
「 Molecular cloning 」 に記載された塩化ルビジウム法によ り E. col i DHI株に形質転換し、 PHGA410 由来 G - CSF の cDNA を有するプラスミ ドを保持する E.col iコ ロニーを選別 したこ のプラスミ ドを PTN - G4と命名する （ 図 13) 。
実施例 23 C127細胞の形質転換及びその発現 （ + VSE) 実施例 22で得た PTN - G4をマウス 細胞に形質転換する 前に制限酵素 BamHIで処理する。 即ち pTN - G4プラスミ ド 20 .
3を 10mH Tris - HC ( ρΗδ.Ο), 7 mM MgC 2 、 100mH NaCil 、 2 mM 2 — メ ルカプ 卜 エタ ノ ール、 0.01 % BSA 100 Si に溶解せ しめ BamH I ( 宝酒造社製 〉 20単位で処理し 、 フ エ ノ ール処理、 エー テル処理、 エタ ノ ール沈殿を行っ た。
マウス C127I細胞は 10%牛胎児血清 （ GIBC0)を含む
Du I becco' s minimal essent i a I培地中で増殖させる。 径 5 のプ レー 卜 に増殖した C127I細胞に、 プ レー 卜当た り上記調 製 DNA を 10 の割 り合いで リ ン酸— カルシウム法（Haynes, J & Weiss瞧 n, C ( 1983) Nucleic Acid Res' 11 巻 687 - 706 参照 ） にて形質転換を行い、 グ リ セ ロ ール処理の後、 12 時間 37ででイ ンキ ュベー 卜 した 。
次に、 この細胞を 3 枚の新 しい径 5 sプ レー 卜 に移し、 1 週間 2回の割り合いで培地交換を した 。 16日 目 に Foci (集塊） を形成 した部分をそれぞれ新 しいプ レー 卜 に移 し、 上述の培 地で継代培養し、 G - CSF 生産能の高いク ロ 一ンを選別 した。 その結果〜 の レベルの G - CSF 生産がみられた 。 尚、 宿主細胞には上記の C127 I細胞のほか NIH3T3細胞も用 いるこ とができる。
実施伢 24 CH0細胞に よる G - CSF の発現 （ + VSE) 1) HGG4- dhfrの構築
実施例 21で得た PHGA410 プラスミ ド 20 を 10mH Tris - HCJl ( pH7.5)、 7 mH HgCi 2 、 175mH NaCJl 、 0.2mH EOTA 0.7lH 2—メルカプ 卜ェタ ノ、ール 0.01 % BSA を含む溶液 00/ ί に溶解し、 制限酵素 S ai l (宝酒造社製） 20単位を 加え —晩反応した後、 フ エ ノ ール処理、 エーテル洗浄、 エタ ノ ール沈殿を行っ た 。
次に、 得られた DNA 沈殿を 50mM Tris - HCi 、 5 mH
HgCi 2 0mH DTT 、 1 の（JATP, dCTP,- d6TP, TTP からな る反応液 100// に溶解し、 E.col i DNAポリ メ ラーゼー Klenow断片 （宝酒造社製 10 £ ) を加えて 14°C、 2 時間反応 させ、 フ I ノ ール処理、 エーテル洗浄、 エタ ノ ール沈殿を行 つ た。
この DNA に EcoR I リ ンカ一を付加する。 即ち上記 DNA を 50 U ί の 50mH Tris - HCJ1 ( ρΗ7.4)、 10ϋΐΗ DTT、 0.5mHスペル ミ ジン、 2 mH ATP、 2. SfflHへキサミ ン塩化コバル ト 、 20 §f からなる反応液に溶解 し、 EcoR I リ ンカ 一 (宝酒造 社製 ） を加え、 200単位の T 4 DNA リ ガーゼ （宝酒造社製） を加え 4 、 12〜16時間反応した。 フ エ ノール処理、 エーテ ル洗净、 エタ ノ ール沈殿を常法に従っ て行っ た後、 該 DNA を EcoRIで部分消化し、 1 %ァガ ロ ースゲル電気泳動で約 2.7 kbのフ ラグメ ン ト を 3 Sf 回収 した 。
一方、 pAdD26SVpAプラスミ ド （ Kaufman, R.G. S Sharp, P. A. ( 1982 ) Hoi . Cel l B i o I， j巻 1304〜 1319 ) を EcoRI にて 処理し、 ゾ クテ リ アアルカ リ フ ォ スフ ァ タ ーゼ （ BAP)処理し て脱リ ン酸を行う 。 即ち 、 pAdD26SVpA 20 gf と EcoRI 20単 位を反応液 50mH T卩 is- HC ( pH7.5)、 7 mH MgCi n 、 100 IBM NaCi 、 7 IBM 2 — メルカプ ト エタ ノ ール、 0.01 % BSA 100jW i に加え、 37°C 10時間反応させ、 続いて上記反応液に BAP 5単位を加え、 68°Cにて 30分間反応した 。 その後フ エ ノ ール処理を し、 電気泳動にて pAdD26SVpAの EcoRI断片を回収 し た （ 〜 5 3 ) 。
上記 した約 2.7kbの断片と pAdD26SVpAの断片のそれぞれ 0.5^ §f ずつをァニール した 。 このプラスミ ドを E. col i OHI 株に塩化ルビジウム法によ り形質転換して PHGG4- dhfrのプ ラス ミ ドを保持するコ ロ ニーを選択する。 得られたプラス ミ ドを PHGG4 - dhfrと命名 した （ 図 14a)。
なお、 上記の別法と して、 PHGG4 プラスミ ドを S ai l処理 し 、 EcoRI リ ンカ 一を付加するこ とな し に EcoRIで部分消化 し約 2.7kbの断片を回収 し、 E.col i DNAポ リ'メ ラ一ゼ—
Klenow断片で該 DNA 断片を処理 し末端をブラン 卜エン ド化す る。
一方前述と同じ方法で pAdD26SVpAのブラン トエン ド化 した EcoRI断片を調製し、 両者を T 4 DNA リ ガ一ゼ処理 して
PHGG4 - dhf rを調製するこ ともできる。
また実施例 22で得られた PHGA410 (H) を実施例 22の 2)で記 載した如く 、 制限酵素 Hind IEおよび S ai l にて処理し 、 Hindu — S ai l 断片を上記 pAdD26SVpAのプラ ン 卜 エン ド化 し た EcoRI 断片に連結 しても PHGG4 - d hf Γを得るこ とができる ( 図 14b)。
2) 形質転換と発現
CH0細胞 （ dhfr" 株、 コ ロ ン ビア大学 Dr. L. Chasin よ り入 手） を 9 c«径のプレー ト （ Nunc社製 ） 中 10%仔牛血清を含む a最小必須培地 （ α — HEM 、 アデノ シン、 デ才キシァ.デノ シ ン、 チミ ジン添加 ） で培養増殖し 、 これを リ ン酸一 カルシゥ ム法 （ Wigler等、 Cel l 14巻 725頁 （ 1978) )によ っ て形質転 換 した 。
郎ち 1)で調製 した PHGG4- dhf rプラスミ ド 1 にキ ヤ リ ァ一DNA ( 仔牛胸腺 DNA)を適量加えて、 TE溶液 375 ί に ·? 解し 1 Η CaCil 2 125 ί を加える。 3〜 5分水上で冷や し 500 u i の 2 X HBS ( 50mH Hepes、 280mH NaCi 、 1.5mHリ ン酸緩衝液） を加え再び氷冷後、 上記の CH0細胞培養液 1 と混合 し、 プレー 卜 に移 し 、 C02 イ ンキュベー タ 一中で 9 時 間培養 し た。
以下洗净、 20%グリ セロ ール含有 TBS ( Tr'i s - Buffered Sal ine) 添加、 再び洗净 と した後非選択培地 （ 前出 α — HEM 培地、 ヌ ク レオチ ド添加 ） を添加 して 2 日間イ ンキュベー ト し選択培地 （ ヌ ク レオチ ド無添加 ） で 1 : 10に細胞を分割 し た。 次いで 2 日毎に選択培地にて培地交換を行いなが ら培養 を続行し生 じ た集塊 （ foci ) を選別 して新しいプ レー 卜 に移 した 。 新 しいプ レー 卜 では 0.02 U H メ 卜 卜 レキセ一 卜 （ HTX)存 在下で増殖し再び HTX 存在下で増殖させて ク ロ ー二 ングを行っ た。
なお CH0細胞の形質転換は CH0細胞に対 し PHGG4 と
pAdD26SV{)Aを同時形質転換（Cotransformation)するこ と によ つ ても行う こ とができる （ Scahi l l 等、 Proc. Natl . Acad. Sci . USA_1L_巻 4654 - 4658 ( 1983) 参照） 。
又いわゆるポリ シス 卜 口ニッ ク遺伝子を用いる方法で耝換 えベク タ ーを構築 し、 これを用いて CH0細胞を形質転換する こ とができる。 例えば pAdD26SVpAを P st I処理し、 2つの断 片を回収 し これら と PBRG4 由来の CSFcDNA 断片を結合するこ とによ り 、 アデノ ウ イ ルスプロ モー タ ー、 CSFcDNA 、 DHFR、 SV40のポ リ 八部位の照.序に配列 し た耝換えべク ダーを構築し CH0 細胞にいれて実施した 。
実施例 25 発現物質の G - CSF 活性の検定 （ + VSE) 実施例 23及び実施例 24で得られた C127細胞及び CH0細胞の 培養上清を夫々 醉酸によ り PH4 に調製 し、 等容量の n — プロパノ ールを加えた後、 生 じた沈殿を遠心除去し 、 C 8逆 相系担体 （ 山村化学社製） を充填 した才ープ 'ンカラム （ 1 Φ 2 CM ) に通 し 、 50% n —プロパノ ールで溶出させた 。 溶出 液を水で 2倍に希釈し た後、 YHC - C8カ ラム （ 山村化学社製） を用いた逆相髙速液体ク ロマ トグラフ ィ ーにて 0.196 TFA を 含む 30〜 60%の直線濃度勾配の n —プロパノ ールを溶出させ た 。 n —プロパノ ール濃度が 40%付近の位置で溶出される画 分を分取した後、 凍結乾燥 し 、 0.1Mグ リ シン緩衝液 （ PH9 ) に溶解せ しめた。 このよ うな過程を経るこ と に よ っ て 、 ヒ 卜 G - CSF は C127及び CH0細胞上清から約 20倍に濃縮された 。
コ ン ト ロ ールと して、 前述の方法に従っ て ヒ 卜 G - CSF CD Aを含まないプラスミ ドで細胞を形質転換 した後その培養 上清を濂縮 した。 得られた標品について 〈参考例〉 に記載さ れた 「 ヒ 卜 G - CSF の測定方法（a) 」 に基づいた方法にて ヒ 卜 G - CSF 活性を検定 した。 尚、 発現効率が十分に髙ぃ場合 には培養上清を直接検定に供してもよい。 ここでは濃縮した 例について結果を示した。 その結果は表一 5の通りであ っ た
表 一 5 ヒ 卜 G - CSF 活性の検定 ヒ 卜好中球コ ロ ニ ー数 / dish 精 製 ヒ 卜 G - CSF ( 20ng) 96 pdBPV-1 で形質転換された 0 C127細胞の培養液 （ 20倍濂度）
PdBPV-1 で形質転換された 0
BPV 3T3 細胞の培養液 （ 20倍濃度）
PTN6 で形質転換された C-127 82 細胞の培養液 （ 20倍濃度 ）
PTNG4 で形質転換された 3T3 85 細胞の培養液 （ 20倍濃度 ）
pAdD26SVpAで形質転換された 0 dhf r CH0 細胞の培養液 （ 20倍濃度）
PH6G4 - dhfrで形質転換された 110
CH0 細胞の培養液 （ 20倍濃度） 実施例 26 アミ ノ酸分析および糖分析' （ + VSE) 1) ア ミ ノ 酸組成の分析
実施例 25で得た粗 CSF 試料を更に実施例 2の （ iii ) の方法 に したが っ て精製 した 。 この精製 CSF 試料を常法によ り加水 分解 し 、 そのタ ンパク部分のア ミ ノ酸組成を日立 835ァミ ノ 酸自動分析装置 （ 日立製作所社製 ） を用いて特殊ア ミ ノ酸分 析法によ り分析 した 。 この結果を表— 6に示 した。 尚、 加水 分解条件は次の如く である。
① 6 N HCi 、 110 24時間、 真空中
② メ タンスルホン酸 + 0.2% 3 — ( 2 —アミ ノエ チル） イン ドール、 110°C、 24時間、 48時間、 72時間、 真空中
試料は、 40% n —プロパノ ールと 0, 1% ト リ フル才ロ酢酸 を含む溶液 に溶かした後、 各々 0.1 をとり 、 乾燥 窒素ガスにより乾燥させた後、 ①又は②の試薬を加えて真空 封管し、 加水分解に供した。
表中、 実測値は①の 24時間値と②の 24, 48, 72時間値の合 計 4回の平均値である。 但し、 T hr, S ep, V2 C ys，
M et, V aし I I eおよび T rpは以下の方法で算出した 〔生化 学実験講座、 タ ンパク質化学 E (東京化学周人出版〉 を参照〕 0 T hr, S er, V9 C ys, M etは②の 24， 48, 72時間値 の経時変化をと り 、 零時間に補外。
。 V aし I leは②の 72時間値。
。 T rpは②の 24, 48, 72時間値の平均値。
表 一 6 ( ア ミ ノ酸分析表 〉
Figure imgf000083_0001
2) 糖組成分析
上記ア ミ ノ酸組成分析で用いた精製 CSF 試料 200ng に内部 標準と してイ ノ シ ト ール 25n HIOJ! を加えた後、 1.5 NHCi を S 2 含むメ タ ノ ール溶液（500^ ) を加えて窒素ガス置換 した封 管中、 90でで 4 時間反応させた 。 開管後炭酸銀 （ Ag2 CO, ) を加えて中和 した後、 無水酢酸 50 ζ ϋ を加え振とう後、 室温 にて暗所に一晩放置 した。 上層をサンプルチュ ーブに と り 、 窒素ガスにて乾燥した。 沈殿にメ タ ノ ールを加え洗净後軽く 遠沈し、 上層を同じサンプルチュ ーブに加え乾燥 した。 これ に 50jW の TMS 化試薬 （ ピ リ ジン ： へキサメ チルジシラザン 卜 リ メ チルク ロ ロ シラン = 5 ： 1 ： 1 に混合したもの ） を加 え 40°Cで 20分反応させた後、 Deep Freezerに保存した。 尚、 スタ ンダー ド と してガラク 卜 ース （ Gal )、 N — ァセチルガラ ク 卜サミ ン （ Gal NAc), シアル酸などを各 50n mo 及びイ ノ シ ト ール 25n moi を合わせ周様の操作を行っ た。
このサンプルについて以下に示す条件でガスク ロマ 卜分析 を行 た。
〔 分析条件〕
カ ラ ム 2 % 0V - 17 VINport HP 60〜 80メ ッ シ ュ 、 37ΪΙ、 カ ラス
110°C〜 250 °Cまで 4でノ分の昇温 キ ヤ リ ヤーガス 最初は 1.2〜 1.ら a
(窒素圧 ） 終了時は 2〜 2.5Kf Zcffl2
感 度 103 M Ω レンジ 0.1〜 0, 4V
圧 水素ガス 0.8 / on2
空 気 0.8KSF/c/n2
サ ン プ ル 量 2.5〜 3.0 JI
分析の結果、 本発明の CSF からガラク 卜 ース、 N — ァセチ 33 ルガラク 卜 サミ ンおよびシアル酸が確認さ れた 。
実施例 27 PHGV2ベク タ ーの調製
( 動物細胞用 、 — VSE 系 〉
実施例 10で得られた図 4 (A) で示される CDNAの EcoRI断片 を制限酵素 D ra I に て 37°Cで 2時間で処理 した後、 DNA ポ リ メ ラーゼ Iの Klenow断片 （宝酒造社製 ） で処理し、 末端を平 滑末端と し た。 の B gl l リ ンカ 一 （ 8 mer ； 宝酒造社 製） を ATP を用いて リ ン酸化 した後、 上記で得られた約 Ί 3の DNA 断片混合物 と結合さ せた 。 次いで制限酵素 B g I 1 で処理 してァガロ ースゲル電気泳動を行い、 最も大きい DNA 断片だけを回収 した 。
この DNA 断片は図 5に示すよ う に ヒ 卜 G - CSF ポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする部分を含む約 710塩基対に相当 し ていた 。 ベ '、 ク タ - pdKCR ( Fukunaga^ ； Proc, Nat I . Acad. Scに USA ； 巻 5086頁（1984)) を制限酵素 BamH Iで処理 し た後 、 アル力 リ フ ォ スフ ァ タ ーゼ （宝酒造社製 ） で脱 リ ン酸 して得ら れた ベク タ 一 DNA を T 4 0NA リ ガーゼ （ 宝酒造社製） を加えて CDNA断片 と結合させ pHGV 2を得た （ 図 15) 。 図 15に示される ごと く このプラス ミ ドは、 SV40初期遺伝子の'プ口 モー タ ー 、 SV40の複製開始領域、 ゥサギ /3 — グロ ビン遺伝子の一部、
PBR322の複製開始領域および PBR322由来の jS — ラク タマ ーゼ 遺伝子（Amp「 ） を含み、 SV40初期遺伝子のプロ モー タ -下流 に ヒ 卜 G - CSF 遺伝子が接続さ れている。 実施例 28 C127細胞用耝換えベ クタ ーの構築 （ 一 VSE)
1) pHGV2(H)の構築
実施例 27で得られた （ 図 15) PH6V2 プラスミ ド 2θ ί 3を用 いて、 実施例 22の 1)に記載した方法に よ っ て PHGV2(H)と命名 するプラスミ ドを得た （ 図 16) 。
2) 発現用組換えベク タ ー PTN - V2の構築
上記 1)で得られた PHGV2(H) 20^ 3を用いて 、 実施例 22の 2)に記載した方法によ っ て PHGV2 由来 G - CSF の cDNAを有 するプラスミ ドを保持する E. COMコ ロニーを選別 した。 この プラスミ ドを pTN - V2と命名する （ 図 16) 。
実施例 29 C127細胞の形質転換及びその発現 （ — VSE) 実施例 28で得た pTN - V2をマウス C127細胞に形質転換する 前に制限,酵素 BamH Iで処理する。
次いでマウス C1271細胞を上記調製 DNA で形質転換して発 現させ （実施例 23参照） G - CSF 生産能の高いク ロ ーンを選 別 した 。 その結果〜 I fflgZii の レベルの G - CSF 生産がみら れた。
尚、 宿主細胞に は上記の C1271細胞のほか NIH3T3細胞も用 いるこ とがでぎる。 '
実施例 30 CH0細胞に よる G - CSF の発現 （ - VSE)
1) pHGV2-(lhfrの構築
実施例 27で得た PHGV2 プラスミ ド 3から実施例 24の 1) に記載し fc方法に よ っ て得られる約 2.7kbの断片と
pAdD26S\/pAの断片のそれぞれ 0.5 3ずつをァニールした。 このプラスミ ドを E. col i DHI株に塩化ルビジウム法に よ り形 質転換して pHGVZ - dhfrのプラス ミ ドを保持するコ ロ ニーを 選択する。 得られたプラスミ ドを PHGV2 - dhfrと命名 した ( 図 a)。
なお、 上記の別法と して 、 PHGV2 プラスミ ドを S ai l 処理 し、 EcoRI リ ンカ一を付加するこ とな し に EcoRI で部分消化 し約 2.7kbの断片を回収し 、 E. col i DNAポ リ メ ラーゼ— Klei ow断片で該 DNA 断片を処理 し末端をプラン 卜 ェ ン ド化す る o
一方前述と同じ方法で pAdD26SVpAのブラン 卜エン ド化 した EcoRI 断片を調製 し、 両者を T 4 0NA リ ガーゼ処理 して
PHGV2 - dhfrを調製するこ ともできる。
ま た実施例 28で得られた PHGV2 (H)を実施例 28の 2 )で記載 し た如 く制限酵素、 H i nd Πおよび S a.l I に て処理 し 、 Hindi — S ai l 断片を上記 pAdD26SVpAのブラン 卜 エン ド化 した EcoR I 断片に連結 し ても PHGV2 - dhfrを得るこ とができる （ 図 17b) 2) 形質転換と発現
上記 1)で調製 した PHGV2 - dhfrプラスミ ドを用いて 、 実施 例 24の 2)に記載の方法に よ っ て CH0細胞を形質転換 して発現 させた 。 '
なお CH0細胞の形質転換は CH0細胞に対 し PHGV2 と pAdD26SVpAを同時形質転換（00 3(^1:01^31^ 00)するこ とに よ つ ても行う こ とがで.きる。
又いわゆるポ リ シス 卜 口 ニッ ク遣伝子を用いる方法で耝換 えベク タ ーを構築し 、 これを用いて CH0細胞を形質転換する こ とができる。 例えば pAdD26SVpAを P st I処理 し、 2つの断 片を回収 し これら と PBRV2 由来の CSF cDNA断片を結合するこ とに よ り 、 アデノ ウイ ルスプロモー タ ー、 CSF CDNA、 DHFR, SV40のポリ A部位の願序に配列 し た耝換えベク タ ーを構築し CH0 細胞にいれて実施した。
実施例 31 発現物質の G - CSF 活性の検定 （ 一 VSE) 実施例 29及び実施例 30で得られた C127細胞及び CH0細胞の 培養上清から、 実施例 25に記載の方法に よ っ て ヒ 卜 G - CSF を得、 その ヒ 卜 G - CSF 活性を検定 した 。 その結果は表一 7 の通りであ っ た。
表 一 Ί ヒ 卜 G - CSF 活性の検定 ヒ 卜好 Φ拔コ □ ニ ー数 Zdish 精 製 ヒ 卜 G - CSF { 20ng) OA ο pdBPV-1 で形質転換された
0
C127細胞の培養液 （ 20倍濃度 ）
PdBPV-1 で形質転換された 0
BPV 3T3 細胞の培養液 （ 20倍濃度 〉
PTN-V2で形質転換された C-127 107 細胞の培養液 （ 20倍濃度 ）
PTN-V2で形質転換された 3T3 103 細胞の培養液 （ 20倍濃度 ）
pAdD26SVpAで形質転換された 0 d f r CH0 細胞の培養液 （ 20倍濃度）
PHGV2 - dhfrで形質転換された 111
CH0 細胞の培養液 （ 20倍濃度 ） 実施例 32 アミ ノ酸分析および糖分析，（ 一 VSE) 1) ァ ミ ノ 酸組成の分析
実施例 31で得た粗 CSF 試料を更に実施例 2の （ Hi ) の方法 に し たが っ て精製 し た。 この精-製 CSF 試料を実施例 26の 1)に 記載の方法に よ っ て ア ミ ノ酸組成分析に付 し た 。 この結果を
3¾ ~ 8 k. ]\ ^ σ 表 一 8 ( アミ ノ酸分析表 ）
Figure imgf000090_0001
2) 糖組成分析
上記アミ ノ酸組成分析で用いた精製 CSF 試料を用いて 、 実 施例 26の 2)に記載したの と周 じ方法および周 じ分析条件によ つ て糖組成を分析 した。 分析の結果、 本発明の CSF からガラ ク 卜 ース、 N — ァセチルガラク 卜サミ ンおよびシアル酸が確 認された。
実施例 33 ヒ 卜 G - CSF の感染防禦効果
〈試験方法〉
1 · Pseudomonas aerug i nosa感染に対する防禦効果
8〜 9週令 （体重 35.3土 1.38 §f ) の ICR 系マウス （雄） にエン ドキサン （ シ才ノ ギ社製、 商品名 ） 200fflg Z を腹腔 内投 4した後 3群に分け、 その 2群に ヒ 卜 G - CSF ( 25000U マウス又は 50000UZマウス ） を含む溶媒 （ 生理食塩水中 1 %プロパノ ール、 0.5% ( W/V)マウス血清アルブミ ン ） を、 そ し て別の 1 群には溶媒のみを、 それぞれ 24時間毎に 0.Ί ずつ 4回皮下投与した。 4回目 の投与後 3時間 して各 々の群にシ ユ ー ドモナス ァエルギ ノ 一ザ （ Pseudomonas aeruginosa) GNB - 139 ( 3.9x 105 CFU ノマウス ） を皮下投 与して感染させた 。 感染後 21時間 してさ ら にもう一度 ヒ 卜 G - CSF ( 25000UZマウス又は 50000UZマウス ） を含む溶媒又 は溶媒のみをそれぞれ対応する群に皮下投与した。
感染後 10日 目 ま での生存マウス数によ り感¾防禦効果を調 ベた 。
〔 菌液の調製〕
ハー 卜 イ ンフ ュ ージ ョ ン液体培地（Dif co社製、 商品名 ） を 用いて 37°Cで一夜 Pseudomonas aeruginosa GNB - 139 を振と う培養する。 培養液を生理食塩水に懸濁させて調製 した 。 2 . Candida 感染に対する防禦効果
8週令 （体重 40.5土 1.60 9- ) の ICR 系マウス （雄 ） に ェ ン ドキサン （ シオノ ギ社製、 商品名 ） 200fflg/ ^を腹腔内投 与した後 2 群に分け 1 群に ヒ 卜 G - CSF ( 50000UZマゥス ） を含む溶媒 （生理食塩水中 1 96プロパノ ール、 10% ( W/V)同 種マウス血清） を、 別の 1 群に は溶媒のみをそれぞれ 24時間 毎に 0.1/agずつ 4 回皮下.投与した 。 4 回目の投与後 4 時間 し て各々の群にキャ ンディ ダアルビカ ンス （ Candida albicans) U - 50 - 1 ( 白血病患者尿分離株、 東北大細菌学教室分与 ） 5.6X 105 CFUZマウスを静脈内投与 して感染させた。 感染 後 10日 目 までの生存マウス数に よ り感染防禦効果を調べた。 〔菌液の調製〕
酵母エキス含有サブロー液体培地 （ 2 %デキス 卜 ロ ース (純正化学社製） 10% 卜 リ ブ 卜ケースペプ ト ン（BBL社製 ： 商 品名 ） 、 5 %酵母抽出物（D if co社製 ： 商品名 ） 、 PH5.6)を用 いて 37 で一夜 Candida albicans U - 50 - 1 を振と う培養す る。 培養液を生理食塩水で 2 回洗浄 した後、 生理食塩水に懸 濁させて調製した。
3 . 細胞内寄生菌 Usteria感染に対する防'禦効果
7週令 （体重 34.7 ± 1· 24 3 〉 の ICR 系マウス （雄〉 にェ ン ドキサン （ シ才ノ ギ社製 ： 商品名 ） 200 ^ノ ^を腹腔内投 与した後 2群に分け 1 群に ヒ 卜 G - CSF ( 50000UZマウス ） を含む溶媒 （ 生理食塩水中 1 % n —プロパノ ール、 10% ( W/ V)周種マウス血清 ） を、 別の Ί 群には溶媒のみをそれぞれ 24 時間毎に 0.1^ずつ 4 回皮下投与 した。 4 回目 の投与後 4 時 間 して各々の群に リ ステ リ ア ♦ モノ サイ 卜 ジ I ネス
( Li steria monocytogenes) 46 (東北大細菌学教室分与） 1.0X 107 CFUZマウスを静脈内投与 して感染させた 。 感染 後 12曰 目 までの生存マウス数に よ り感染防禦効果を調べた。
〔菌液の調製 〕
ブ レイ ンハー 卜 イ ンフ ュ ージ ョ ン液体培地（Di fco社製、 商 品名 ） を用いて 37でで一夜 Li steria monocytogenes 46 を振 とう培養する。 培養液を生理食塩水に懸濁させて調製した 。
〈結 果〉
① 天然型 ヒ 卜 G - CSF の感染防禦効果
参考例 2 に記載 し た CHU - 1 から得られた ヒ 卜 G - CSF に ついて上記試験 Ί , 2および 3を行っ た。
得られた結果を表— 9 、 表一 10および表 11に示す。
表 _ 9 シ ュ モナス ァエルギノ ーザに対する効果
群 CSF 濃度（11 マウス /日 ） '生存数 Z総数 溶 媒 0 0 / 11
CSF を含
25000 6 / 10 む溶媒
CSF を含
50000 8 / 11 む溶媒 表 一 10 カ ンジダ アルビカ ンスに対する感染防禦効果
Figure imgf000094_0001
11 リ ステ リ ア モノ サイ 卜 ジ ェ ネスに対する感染防禦効果
Figure imgf000094_0002
② 遺伝子耝換え体から得られた ヒ 卜 G - CSF の感染防禦 効果
i ) 実施例 15で得た大腸菌からの G - CSF ( + VSE)ポ リ ペプチ ドについて上記試験 1 、 試験 2 および試験 3 を行っ た その結果を表一 12, 13, 14に示す。 一 12
シ ユ ー ドモナス ァエルギ ノ ーザに対する効果
Figure imgf000095_0001
13 カ ンジダ アルピ カ ンスに対する感染防禦効果 群 C3F 濃度（U/マウス /曰 ） 生存数 /総数 溶 媒 0 0 / 0
CSF を含
50000 10/ 10 む溶媒 表 一 14 リ ステ リ ア ノサイ 卜 ジ ェネスに対する感染防禦効果
Figure imgf000096_0001
i i ) 実施例 19で得た大腸菌からの G - CSF ( ― VSE)ポ リ ぺ プチ ドについて上記試験 1 を行っ た 5。
その結果を表一 15に示す。
シ ユ ー ドモナス ァエルギノ 一ザに対する効果
Figure imgf000096_0002
iii ) 実施例 26のア ミ ノ酸組成分析に用いたの と周 じ CHO 細胞由来の精製ヒ 卜 G - CSF 試料 （ + VSE)について上記試験 1 を行っ た。
その結果を表— 16に示す。
16 シ ユ ー ドモナス ァエルギノ ーザに対する効果
Figure imgf000097_0001
同様に して前記実施例 26のア ミ ノ截耝成分析に用いたの と 同 じ C127細胞由来の精製ヒ 卜 G - CSF 試料を用いて上記試験 1 の感染防禦効果を調べた と ころ、 ほぼ同様の結果が得られ た。 '
IV) 実施例 32のアミ ノ酸組成分析に用いたの と同 じ CHO 細胞由来の精製 ヒ 卜 G - CSF 試料 （ 一 VSE)について上記試験 1 を行っ た 。
その結果を表一 17に示す。 表 一 17 シユ ー ドモナス ァエルギノ ーザに対する効果
Figure imgf000098_0001
同様に して前記実施例 32のア ミ ノ酸組成分析に用いたの と 同 じ C127細胞由来の精製 ヒ 卜 G - CSF 試料を用い.て上記試験 1 の感染防禦効果を調べた ところ、 ほぼ同様の結果を得た 。 実施例 34
実施例 2 で得られた ヒ 卜 G - CSF 凍結乾燥標品を注射剤用 溶解剤に溶解 して所望の投与単位数になるよ う分注 して注射 剤 と した。
実施例 35 '
実施例 15で得られた大腸菌からの ヒ 卜 G - CSF ポリ ぺプチ ド凍結乾燥標品を注射剤用溶解剤に溶解して所望の投与単位 数になるよう分注して注射剤と した 。

Claims

37 請 求 の 範 囲
(1) ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子。
(2) シ ョ 糖密度勾配遠心法に よ り 15〜 17S画分と して得ら れる、 ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポリ べ プチ ドをコ ー ドするメ ッ センジ ヤ ー RNA に相補的な DNA であるこ とを特徴とする請求の範囲第 1 項記載の遺伝子
(3) ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子が以下に示されるポリ ペプチ ド配 列 ま た はその一部をコ ー ドするものである請求の範囲第 1 項記載の遣伝子。
M et .A la G ly P ro A I a T hr G In S er P ro M et し ys し eu et A la し eu G In し eu し en し eu T rp H i s S er A la し eu T rp T r V al G In G I u A la T hr P ro し en G ly P ro A la S er S er し eu P ro G In S er P he し eu し eu し ys C ys し eu G lu G In V al A rg し ys I le G In G ly A sp G ly A la A la し eu G In G lu し ys
L eu ( V al S er Glu C ys A la T hr T yr し ys し eu C ys H is P ro G !u G In し eu
V a I L eu し eu G ly H i s S er し eu G ly l ie P ro T rp A la P ro し eu S er S er
C ys P ro S er G In A I a し eu G In し eu A la G ly C ys L eu S er G In し eu H is S er G ly し eu P he し eu T yr G In G ly し eu し eu G In A la L eu G lu G ly I le S er P ro G lu し eu G ly P O T hr し eu A sp T hr し eu G In し eu A sp Val A la A sp P he A la T hp T hr I le T rp G In G In M et G lu G lu し eu G ly M et A la P ro A la し eu G In P ro T hp G In G ly A la et P ro A la P he A la S er A la P he G In A rg A rg A la G ly G ly Val し eu V al A la S er H is し eu G In S er P he し eu G lu V al S er T yr A rg Val し eu A rg H is し eu A la G In P ro
( ただ し m は 0ま た は 1 を表わす ）
(4) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ一ドする遺伝子が以下に示されるポ リ ぺプチ ド配 列ま たはその一部をコ ー ドする ¾のである請求の範囲第 1 項記載の遺伝子。
T p P ro し eu G ly P ro A la S er S er し eu P ro G In S er P he L eu L eu し ys C ys し eu G lu G In Val A rg L ys I le G In G ly A sp G ly A la A I a し eu G I n G lu し ys L eu (Val S er Glu)^ G ys A la T hr T yr し ys し eu C ys H is P ro G lu G lu し eu V a I し eu L eu G ly H is S er し eu G ly l ie P ro T rp A la P ro L eu S er S er C ys P ro S er G in A la L eu G In L eu A la G ly C ys L eu S er G in し eu H is S er G ly L eu P he L eu T y r G In G ly L eu L eu G I n A la L eu G lu G ly I I e S er P ro G lu L eu G ly P ro T hr L eu A sp T hr L eu G In L eu A sp V al A la A sp P he A la T hr T hr I I e T rp G in G in Met G lu G lu L eu G ly et A la P ro A la L eu G in P ro T hr G In G ly A la Met P ro A la P he A la S ep A la P he G in A rg A rg A la G ly G ly V a I L eu V a I A la S er H is し eu G In S er P he L eu G lu V a I S er T yr A rg V a I し eu A rg H is し eu A la G in P ro ( ただ し in は 0または 1 を表わす ）
(5) ヒ 卜顆粒球コ ロ ニ ー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ一ドする遣伝子が以下に示される塩基配列また は その一部を有するものである請求の範囲'第 1 項記載の遣 伝子。
ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG ATG GCC CTG CAG CTG CT6 CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA
GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC
GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG
CTG (GTG AGT GAG) TGT GCC ACC TAC
AAG CTG TGC CAC ecc GAG GAG CTG
GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC
ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC
TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG
GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT
AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG
CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC
TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC iTG
GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC
GAC TTT GCC -、 ACC ACC ATC TGG CAG
CAG AT6 GAA GAA CTG GGA ATG GCC
CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT
GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT
I 1し し ft tj し laし し ϋ b ϋ Pし A Λ 0
u A U u b 1し
CTG GTT GCC TCC CAT CTG ' CAG AGC
TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT
CTA C6C CAC CTT GCC CAG CCC
( ただし m は 0 ま た は 1 を表わす ）
(6) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子が以下に示さ れる塩基配列 ま たは その一部を有するものである請求の範囲第 1 項記載の遭 伝子。
ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC
CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG
TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC
CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG
GAG AAG CTG (GTG AGT GAG)m TGT GCC
ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG
GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT
CTG GGC ATC CCC TGG 6CT CCC CTG
AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG
CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA
CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC
CAG GGG CTC CTG " CAG GCC CTG GAA
GGG AT'C. TCC CCC GAG TTG GGT CCC
ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC
GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC AFC
TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA
ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC
CAG GGT GCC ATG CC6 GCC ' TTC GCC
TOT ττπ CAG CGC CGG GCA GGA
GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG
CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC
CGC 6TT CTA CGC CAC CTT GCC CAG
CCC { ただし 111 は 0または 1 を表わす）
(7) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポリ べプチ ドをコ ー ドする遣伝子が図 3 (A) に示される塩基配列ま た はその一部を有するものである請求の範囲第 1 項記載 の遺伝子。
(8) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポリ べプチ ドをコ ー ドする遣伝子が図 4 (A) に示される塩基配列ま たはその一部を有するあのである請求の範囲第 1 項記載 の遣伝子。
(9) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子が微生物又はウ ィ ルス由来の レブ リ コ ンに接続されたものである請求の範囲第 1 項〜第 8 項のいずれかに記載の還伝子。
(10) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子 ¾含む組換えベク タ ー。
(11) 遣伝子がシ ョ 糖密度勾配遠心法に よ り 15〜17S画分と し て得られる、 ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有す るポリ ペプチ ドをコ ー ドするメ ッ センジ ャ ー RNA に相補 的な DN A であるこ とを特徴 とする請求の範囲第 10項記載 の耝換えべク タ ー 。
(12) ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子活性を有'するポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする遣伝子が請求の範囲第 3項に記載のポ リ ペプチ ド配列 ま たはその一部をコ ー ドするものである請 求の範囲第 10項記載の耝換えべク タ一。
(13) ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする遣伝子が請求の範囲第 4項に記載のポ リ ペプチ ド配列ま たはその一部をコ ー ドするものである諝 求の範囲第 10項記載の組換えベク タ ー。
(14) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ べプチ ドをコ ー ドする遺伝子が請求の範囲第 5 項に記載の塩基 配列ま たはその一部を有するものである請求の範囲第 10 項記載の耝換えべクタ一。
(15) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポリ べプチ ドをコ ー ドする遺伝子が請求の範囲第 6項に記載の塩基 配列ま たはその一部を有するものである請求の範囲第 10 項記載の耝換えべク タ一。
(16) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポリ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子が図 3 (A) に示される塩基配列ま たはその一部を有するものである請求の範囲第 10項記載 の耝換えベク タ ー。
(17) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子が図 4 (A) に示される塩基配列ま た はその一部を有するものである請求の範囲第 10項記載 の耝換えベク タ ー 。
(18) 大腸菌に使用するための請求の範囲第 10項〜第 17項の いずれかに記載の耝換えベク タ ー。 '
(19) 動物細胞に使用するための請求の範囲第 10項〜第 17項 のいずれかに記載の耝換えべク タ一。
(20) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポリ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子を含む耝換えベクタ ーを含有する 形質転換体。
(21) シ ョ 糖密度勾配遠心法に よ り 15〜17S画分と し て得ら れる、 ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ ぺ プチ ドをコ ー ドするメ ッ センジ ー RNA に相補的な DNA であるこ とを特徴とする請求の範囲第 20項記載の形質転 換体。
(22) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポリ ぺプチ ドをコ ー ドする遣伝子が請求の範囲第 3項に記載のポリ ペプチ ド配列またはその一部をコ ー ドするものである請 求の範囲第 20項記載の形質転換体。
(23) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子が請求の範囲第 4項に記載のポ リ ペプチ ド配列またはその一部をコ ー ドするものである請 求の範囲第 20項記載の形質転換体。
(24) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ,リ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子が請求の範囲第 5項に記載の塩基 配列ま た はその一部を有するものである請求の範囲第 20 項記載の形質転換体。
(25) ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ド する遣伝子が請求の範囲第 6項に記載の塩基 配列ま たはその一部を有するものである請求の範囲 第 20項記載の形質転換体。
(26) ヒ 卜顆粒球コ ロニ—刺激因子活性を有するポリ ぺプチ ドをコ ー ドする遣伝子が図 3 (Α) に示さ れる塩基配列ま た はその一部を するものである請求の範囲第 20項記載 の形質転換体。
(27) ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ 105 ドをコ一ドする遺伝子が図 4 (A) に示される塩基配列ま たはその一部を有するものである請求の範囲第 20項記載 の形質転換体。
(28) 大腸菌用組換えべク タ 一に よ つ て形質転換された請求 の範囲第 20項〜第 27項のいずれかに記載の大腸菌形質転 換体。
(29) 動 換えべク タ ーによ っ て形質転換された請 求の範囲第 20項〜第 27項のいずれかに記載の大腸菌形質 転換体。
6 y β Θ 3 s I l.
(30) 下記のアミ ノ酸配列ま た Θ 3 u p s Γ Γ Iはその一部で表わされるポ リ ペプチド
(Met)n 丁 hr P ro し eu G I y P ro A la S er S er し eu P ro G I n S er P he し eu し eu し ys C ys し eu G lu G in V al A rg し ys I le G In G ly A sp G I y A la A la し eu G In G lu し ys し eu ( V a I S er Glu) C ys A la T hr T yr し ys し eu C ys H is P ro G lu G lu し eu V し eu し eu G ly H is S er し eu G ly I P ro T rp' A la P ro し eu S er S er C P ro S er G In A la し eu G In し eu A G ly C ys し eu S er G In し eu H is S G ly し eu P he し eu T yr G In G ly し し eu G In A la し eu G lu G ly I le S P ro G lu し eu G ly P ro T hr し eu A T hr し eu G In し eu A sp V al A la A sp P he A la 丁 hr T hr I le T rp G In G In et G lu G lu し eu G ly M et A la P ro A la し eu G In P ro T hr G In G ly A la M et P ro A la P he A la S er A la P he G In A rg A rg A la G ly G ly V al し eu V al A la S er H is し eu G In S er P he し eu G lu V al S er T yr A rg V al し eu A rg H is し eu A la G In P ro ( 但 し f 1 m oは 〇又は 1 を表わ し、 ίΐ は 0又 は 1 を表わす ） 6
(31) ポリ ペプチ ドが ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子活性を有 するこ とを特徴とする請求の範囲第 30項記載のポ リ ぺプ チ ド。 - '
(32) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子を含む耝換えべクタ —を含有する 形質転換体から産生された ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子 活性を有するポ リ ペプチ ド含有物。
(33) 図 3 (B) ( I ) に示されるア ミ ノ酸配列の一部で表わ される ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子活性'を有するポ リ ぺ プチ ド。
(34) 図 4 (B) ( I ) に示されるア ミ ノ酸配列の一部で表わ される ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子活性を有するポ リ ぺ プチ ド。
(35) 下記のア ミ ノ酸配列ま たはその一部で表わされるポリ ペプチ ド と糖鎖部分を有 し ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子 活性を有する糖蛋白質。
T hr P ro L eu G I y P ro A la S er S er L eu P ro G In S er P he し eu し eu し ys C ys し eu G lu G In V a! A rg し ys I le G I n G !y A sp G I y A I a A la し eu G In G lu し ys L eu ( V a I S er C ys A la T r T yr し ys し eu C ys H is P ro G lu G I u L eu V al し eu L eu G ly H is S er し eu G I y I le P ro T rp A la P ro し eu S C ys P 「o S sr G In A la し eu G I n し eu A la G ly C ys し eu S er G In し eu H is S er G I y L eu P he し eu T yr G In G ly L eu し eu G in A la し eu G lu G I y I le S er P ro G I u L eu G ly P ro T hr し eu A sp T hr し eu G In し eu A sp V a I A I a A sp P he A I a T hr T r I le T rp G I n G In et G lu G lu し eu G ly et A la " P ro A la し eu G In P ro 丁 hr G In G ly A la et P ro A la P he A la S er A I a P he G In A rg A rg A la G ly G !y V al し eu V a I A I a S er H is し eu G I n S er P he し eu G iu V al S er T yr A rg V a I し eu A rg H is し eu A la G In P ro ( 但し lii は 0又は 1 を表わす ）
(36) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ 08
ドをコ ー ドする遣伝子を含む動物細胞用組換えベク タ ー に よ っ て形質転換された動物細胞形質転換体から産生さ れた ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有する糖蛋白質 含有物質。
(37) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子を有効成分とする感染防 禦剤。
(38) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子が好中球コ ロ ニー刺激因 子であるこ とを特徴とする、請求の範囲第 37項記載の感染 防禦剤。
(39) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子が ヒ 卜顆粒球コ ロニー剌 激因子産生細胞の培養上清から得られるこ とを特徴とす る請求の範囲第 37項記載の感染防禦剤。
(40) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子が次の理化学的性質を有 するものであるこ とを特徴とする請求の範囲第 39項記載 の感染防禦剤。
「理化学的性質」
) 分 子 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム— ポ リ ア ク リ ルアミ ドゲル電気泳動法に よる測定で 約 19, 000土 1, 000。 '
互 ） 等 電 点 以下の表一 Iに示す三つの等電点 （ A ,
B , C ) のう ち少なく とも 1 つを有す る。 109
Figure imgf000111_0001
IE ) 紫外部吸収 ： 280ΠΗに極大吸収を有 し 、 250/Miに極 小値をもつ 。
IV ) N末端から 21残基目迄のア ミ ノ酸配列が次の如 く である。 - H n N - T hr- P Γ0- L eu- G ly- P ro— A la—
(10)
S er-- S er - L eu - P ro- G In- ( S er ) - P e-
(20)
し eu—. L eu - し ys— X — L eu - G I u - X - V a I -
(41) ヒ 卜顆粒球コ ロニー刺激因子活性を有するポ リ ぺプチ ドをコ ー ド する遺伝子を含む組換えベ ク タ ーを含有する 形質転換体か ら産生 された ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子 活性を有するポ リ ペプチ ド ま た は糖蛋白質を有効成分と する請求の範囲第 37項に記載の感染防禦剤。
(42) ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子が請求の範囲第 30項に記 載のポ リ ペプチ ド である請求の範囲第 37項に記載の感染 防禦剤。 Ίΐο .
(43) ヒ 卜顆粒球コ ロ ニー刺激因子が請求の範囲第 35項に記 載の糖蛋白質である請求の範囲第 37項に記載の感染防禦 剤。
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