UA128060C2 - Спосіб отримання хіральних альфа-галогеналканових кислот - Google Patents
Спосіб отримання хіральних альфа-галогеналканових кислот Download PDFInfo
- Publication number
- UA128060C2 UA128060C2 UAA202002596A UAA202002596A UA128060C2 UA 128060 C2 UA128060 C2 UA 128060C2 UA A202002596 A UAA202002596 A UA A202002596A UA A202002596 A UAA202002596 A UA A202002596A UA 128060 C2 UA128060 C2 UA 128060C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- sequence
- polypeptide
- alpha
- amino acid
- enantiomer
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 title description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 83
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 83
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 65
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 54
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 58
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 15
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 12
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 12
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical group [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 125000006431 methyl cyclopropyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000001649 bromium compounds Chemical group 0.000 claims 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 31
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 31
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 12
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- YAQLSKVCTLCIIE-UHFFFAOYSA-N 2-bromobutyric acid Chemical compound CCC(Br)C(O)=O YAQLSKVCTLCIIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- GCSPSGQVZXMPKU-UHFFFAOYSA-N 2-fluorobutanoic acid Chemical compound CCC(F)C(O)=O GCSPSGQVZXMPKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- NNFDHJQLIFECSR-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(Br)C(O)=O NNFDHJQLIFECSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZTPKMIMXLTOSK-UHFFFAOYSA-N 2-bromohexanoic acid Chemical compound CCCCC(Br)C(O)=O HZTPKMIMXLTOSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RVBUZBPJAGZHSQ-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobutanoic acid Chemical compound CCC(Cl)C(O)=O RVBUZBPJAGZHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000031709 bromination Effects 0.000 description 2
- 238000005893 bromination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000005695 dehalogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- QMGVPVSNSZLJIA-FVWCLLPLSA-N strychnine Chemical compound O([C@H]1CC(N([C@H]2[C@H]1[C@H]1C3)C=4C5=CC=CC=4)=O)CC=C1CN1[C@@H]3[C@]25CC1 QMGVPVSNSZLJIA-FVWCLLPLSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N (S)-2-hydroxybutyric acid Chemical compound CC[C@H](O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- DJXHAOJEKJPRBN-JDZGAICCSA-N 2-[(4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6,6-dimethyl-5,7-dihydro-1h-indol-4-one Chemical compound C=1C=2C(=O)CC(C)(C)CC=2NC=1C1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DJXHAOJEKJPRBN-JDZGAICCSA-N 0.000 description 1
- BPTDELCFYVYBRF-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-3-cyclopropylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(Br)CC1CC1 BPTDELCFYVYBRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052386 2-haloacid dehalogenase Proteins 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutyric acid Chemical compound OCCCC(O)=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000182988 Assa Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101100055841 Danio rerio apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- QMGVPVSNSZLJIA-UHFFFAOYSA-N Nux Vomica Natural products C1C2C3C4N(C=5C6=CC=CC=5)C(=O)CC3OCC=C2CN2C1C46CC2 QMGVPVSNSZLJIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001279009 Strychnos toxifera Species 0.000 description 1
- 108700023707 TUG1 Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000011914 asymmetric synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- RRKTZKIUPZVBMF-IBTVXLQLSA-N brucine Chemical class O([C@@H]1[C@H]([C@H]2C3)[C@@H]4N(C(C1)=O)C=1C=C(C(=CC=11)OC)OC)CC=C2CN2[C@@H]3[C@]41CC2 RRKTZKIUPZVBMF-IBTVXLQLSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000003965 capillary gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229910052909 inorganic silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N nitrous oxide Inorganic materials [O-][N+]#N GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- AXOXZJJMUVSZQY-BVDKBYOBSA-N sip 20 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C(C)O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)O)C(C)O)C1=CC=CC=C1 AXOXZJJMUVSZQY-BVDKBYOBSA-N 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005453 strychnine Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y308/00—Hydrolases acting on halide bonds (3.8)
- C12Y308/01—Hydrolases acting on halide bonds (3.8) in C-halide substances (3.8.1)
- C12Y308/01002—(S)-2-Haloacid dehalogenase (3.8.1.2)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Винахід стосується способу селективного гідролізу енантіомеру альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули I з використанням поліпептиду, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в SEQ ID NO: 1 та застосування зазначеного способу.
Description
(57) Реферат:
Винахід стосується способу селективного гідролізу енантіомеру альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули | з використанням поліпептиду, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 1 та застосування зазначеного способу.
Добре відомо, що іноді спостерігається помітна різниця в ефектах енантіомерів тієї ж хімічної речовини в таких біологічних системах, як організми. В лікарських засобах, наприклад, часто тільки один з енантіомерів лікарського засобу відповідає за потрібні фізіологічні ефекти, тоді як інший енантіомер є менш активним, неактивним або інколи протидіючим.
Таким чином, існують різні способи отримання тільки бажаного енантіомеру. Одна стратегія є відомою як хіральна роздільна здатність. Даний спосіб включає отримання сполуки у рацемічній формі та розділення її на різні енантіомери. Іншою стратегією є асиметричний синтез, тобто використання різних методик для отримання бажаної сполуки з високим енантіомерним надлишком.
Клас молекул, які існують як рацемічна суміш, представляє собою альфа-галогеналканові кислоти. К- або 5-енантіомер даних альфа-галогеналканових кислот може бути відокремлений в аналітичних цілях, наприклад, з використанням капілярної газової хроматографії, як описано в 05 5154738. Для синтетичних цілей, найбільш практичний шлях для отримання хіральних альфа-галогеналканових кислот полягає через рацемічне розділення з використанням стрихнінових або бруцинових солей, або за рахунок стереоселективного бромування
В-2-аміномасляних кислот. Однак, хіральні попередники або реагенти для даних реакцій - наприклад, (К-2-аміномасляна кислота)| - не є економічно ефективними. Крім того, реакції важко відслідковувати в більшому або навіть промисловому масштабі. Стерео селективне бромування
В-2-аміномасляної кислоти, наприклад, потребує багато часу, вимагає низьких температур (від - 10 до 5"С), та проходження реакції важко контролювати. Більше того, нітрозові гази утворюються під час реакції, що є проблемою для охорони праці.
Таким чином, метою даного винаходу було розробити альтернативний, більш економічно ефективний, більш ефективний за часом та більш безпечний спосіб, який дозволить та/або полегшить розділення К- та 5-енантіомерів альфа-галогеналканових кислот формули Ї.
Винахід досягає даної мети шляхом надання способу селективного гідролізу 5-енантіомеру альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І, о он х в якій Х представляє собою галоген та
Е представляє собою алкільний ланцюг від 1 до 6 атомів вуглецю, в якому такий зазначений алкільний ланцюг може бути лінійний або розгалужений на атомі вуглецю у або б, який включає - забезпечення рацемата із К-енантіомера та 5-енантіомера зазначеної альфа- галогеналканової кислота, - забезпечення поліпептид, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮО МО. 1 с 5БО ІЮ МО. 4, або послідовність з щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, - взаємодію рацемата протягом 1-8 годин, при цьому рН знаходиться в діапазоні від 9 до 10, та температура знаходиться в діапазоні від 15 до 35 "С для поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮ МО. 1, або послідовність з щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності або рН знаходиться в діапазоні від 9 до 10, та температура знаходиться в діапазоні від 55 до 65 "С для поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮ МО. 4, або послідовність з щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності, - та при цьому енантіомерний надлишок К-енантіомер від 90,0 до 99,9 95 досягається через 1-8 годин.
Даний спосіб має перевагу в тому, що він представляє собою альтернативний, більш економічно-ефективний та економічний за часом спосіб, який грунтується на різній реакційній поведінці К- та 5-енантіомерів альфа-галогеналканових кислот формули І, що дозволяє та/або полегшує розділення двох енантіомерів, оскільки поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО.1 або 5ЕО ІЮ МО 4, або послідовність з щонайменше 8095 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, дуже ефективно селективно гідролізує 5-енантіомер альфа-галогеналканових кислот формули І в даних реакційних умовах, тобто досягає високого просторово-часового виходу. Селективність реакції гідролізу є показаною через показник енантіомерного надлишку залишкового К-енантіомеру від 90 до 99 95. Іншими словами, неочікуваним було виявити, що зазначені умови сприяють більш економічно-ефективному, економічному за часом та безпечнішому способу отримання К-енантіомеру.
Як зазначено вище, поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО.1 або 5ЕБЕО ІЮ МО 4, або послідовність з щонайменше 8095 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, селективно гідролізує 5 енантіомер альфа-галогеналканових кислот формули І дуже ефективно в даних реакційних умовах. Під час даної реакції К-енантіомер залишається незмінним, тоді як з-енантіомер гідролізується при перетворенні його стереоізомерії.
В переважних варіантах здійснення зазначеного способу поліпептид, який має дегалогеназну активність, містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮ МО 4, або послідовність з щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності, та Х представляє собою фтор в альфа-галогеналкановій кислоті відповідно до формули |.
Несподівано вперше було встановлено, що в даних умовах та з використанням поліпептиду, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІО МО 4, або послідовність з щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності, також 5-енантіомер фтору, який містить альфа-галогеналканову кислоту відповідно до формули І був селективно гідролізований, при цьому енантіомерний надлишок К- енантіомера від 90,0 до 99,9 95 досягався через 1-8 годин.
Термін "який містить" слід інтерпретувати як уточнення присутності заявлених частин, стадій або компонентів, але не виключає наявності однієї або декількох додаткових частин, стадій або компонентів.
Зрозуміло, що, коли посилається на слово в однині, множина також є включеною в нього.
Таким чином, посилання на елемент в однині не виключає можливості наявності більше одного елемента, якщо контекст чітко не вимагає наявності одного та тільки одного з елементів. Таким чином, невизначена елемент в однині зазвичай означає "дцонайменше один".
Як використовується в даному документі термін "енантіомер" стосується одного з двох стереоізомерів наданої молекули, які є дзеркальними зображеннями один одного, які не є співставимими при накладанні (не ідентичні). Один хіральний атом або подібна структурна особливість в сполуці призводить до того, що сполука має дві можливі структури, які не є співставимими при накладанні, кожна з яких є дзеркальним зображенням іншої.
Як використовується в даному документі термін "рацемат" або "рацемічний субстрат" стосується суміші, яка має рівні кількості двох стереоізомерів хіральної молекули.
Як зазначається вище, у випадку поліпептида з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮО МО. 1, або послідовність з щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до ЗЕО ІЮ МО. 1, Х формули І вибирають із галогена, іншого ніж фтор та спосіб, описаний вище, здійснюється протягом 1-8 годин, при цьому рН знаходиться в діапазоні від 9 до 10, та температура знаходиться в діапазоні від 15 до 35 "С.
Використовуючи дані умови, несподівано було виявлено, що поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО. 1, або послідовність з щонайменше 80 95 ідентичністю послідовністю, достовірно досягав значення показника енантіомерного надлишку понад 99 95 (дивіться, фігура 3) та вихід продукту за один прохід за одиницю часу 16,6 Гпродукту Л! ГОД." (при концентрації субстрату 100 г/л).
Слід зазначити, що завдяки рацемічному субстрату максимальний вихід В-енантіомеру становить 50 95, таким чином, максимальний вихід, використовуючи концентрацію субстрату 100 г/л, становив би 50 г/л. Більше того, вихід продукту за один прохід за одиницю часу був би ще більшим, якщо застосовуються більш низькі концентрації субстрату - наприклад, 50 г/л.
Однак більш високі концентрації субстрату є переважними для виробничого процесу в промислових масштабах.
В переважних варіантах здійснення спосіб, описаний вище, у випадку поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в
ЗЕОІО МО. 1, або послідовність із щонайменше 8095 ідентичністю послідовності до неї, здійснюється протягом 4-6 годин, при цьому рН становить 9,5, та температура знаходиться в діапазоні від 20 до 30 "С. Використовуючи дані умови, повне перетворення, тобто, 90 95 е.н. може бути досягнуто через З год.
В особливо переважному варіанті здійснення, дана температура реакції становить 25 "С. рН переважно знаходиться в діапазоні від 9 до 10, та найбільш переважно становить 9,5. бо При температурі реакції 25 "С та рН 9,5 досягалось повне перетворення, тобто, 90 95 е.н.
через 1 год. Таким чином, дані умови призводить до особливо високого виходу продукту за один прохід за одиницю часу. У випадку поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕБЕО ІЮО МО. 1, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до неї, надається у вигляді свіжо ферментованої біомаси (тобто, поліпептид міститься в цільних клітинах) вихід продукту, який досягається, за один прохід за одиницю часу становив 50 Гпродукт Л"! ГОД."
Як зазначається вище, у випадку поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕБЕО ІЮО МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до неї, спосіб, описаний вище, здійснюється протягом 1-8 годин, при цьому рН знаходиться в діапазоні від 9 до 10, та температура знаходиться в діапазоні від 55 до 65 "С, та енантіомерний надлишок К-енантіомеру від 90,0 до 99,9 95 досягається через 1-8 годин. В переважному варіанті здійснення, спосіб, описаний вище, у випадку поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до неї, здійснюється протягом 4-бгодин, при цьому рН становить 9,5, та температура знаходиться в діапазоні від 59-61 70.
В особливо переважному варіанті здійснення цього, температура реакції становить 60 "С. рН переважно знаходиться в діапазоні 9-10, та найбільш переважно становить 9,5.
В переважному варіанті здійснення поліпептиду з дегалогеназною активністю, описаного в даному документі, зазначений поліпептид має щонайменше 80 95 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 85 95 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 9095 ідентичність послідовності більш переважно щонайменше 9595 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 95 95, 9695, 97 95, 9895, 9995, та найбільш переважно 100 95 ідентичність послідовності до ЗЕО ІЮ МО 1 або зазначений поліпептид має щонайменше 80 95 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 85 95 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 9095 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 95 95 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 95 95, 9695, 9795, 98965, 9995, та найбільш переважно 10095 ідентичність послідовності до
ЗЕО ІЮ МО 4.
Поліпептиди з дегалогеназною активністю, які містять амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО 1 або 5ЕО ІО МО 4, можуть також бути охарактеризовані через їх послідовності нуклеїнових кислот.
Таким чином, у випадку поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО. 1, передбачуваний поліпептид вибирають із групи, яка включає: а) поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮ МО. 1, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності,
Ю) виділений кодон, оптимізований фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить нуклеотидну послідовність зі щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до ЗЕО ІЮО МО. 2 с) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить послідовність комплементарну до
ЗЕО ІЮ МО. 2, а) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить послідовність, яка специфічно гібридизує до зазначеного виділеного фрагменту нуклеїнової кислоти із Б) або зазначеного комплементарного із с), е) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить нуклеотидну послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до 5ЕО ІЮ МО. З
І) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить послідовність комплементарну до
ЗЕО ІЮ МО. з, 9) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить послідовність, яка специфічно гіобридизує до зазначеного виділеного фрагменту нуклеїнової кислоти із е) або зазначеного комплементарного із Її).
Таким чином, у випадку поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО. 1, поліпептид може бути кодованим різними послідовностями нуклеїнових кислот. Це являє собою результат виродження генетичного коду.
Як результат даного виродження генетичного коду, амінокислоти можуть бути кодовані одним або декількома кодони. В різних організмах кодони, які кодують амінокислоту, використовуються з різною частотою. Адаптація кодонів кодуючої послідовності нуклеїнових кислот до частоти їх використання в організмі, в яку слід інтегрувати послідовність, яка може 60 бути інтегрована, може сприяти збільшенню кількості трансльованого протеїну та/або стабільності відповідної МРНК у конкретні клітини. Частота використання кодонів в клітинах- господарях або господарях, які викликають зацікавленість, може бути визначена кваліфікованим фахівцем у даній галузі, дослідивши якомога більше кодуючих послідовностей нуклеїнових кислот організму, який викликає зацікавленість, можливо, з точки зору частоти, з якою певні кодони використовуються для кодування певної амінокислоти. Частота використання кодонів певних організмів є відомою кваліфікованому фахівцю в даній галузі (дивіться пЕруЛлимли.Кагивза.огр/содоп/) та може бути визначена простим та швидким способом, використовуючи спеціально розроблені алгоритми, реалізовані в комп'ютерних програмах (наприклад, Огоїе еї аї., 2005, Мисівїс Асід5 Кезеагсп 33, ММ526-М/531; дої: 10.1093/паг/дкіЗ376).
Інструменти, які використовують такі алгоритми, є загальнодоступними та надаються безкоштовно як веб-інтерфейси, зокрема, на Ууопа Уміде Умеб від різних установ, наприклад,
Європейського інституту біоінформатики (ЕМВІ-ЕВІ) та інших (наприклад, пЕр://млуму. |саї.ае; пор//дсиа.зсповаї.ае/; пЕру/ммли.Кагива.ог.|р/содоп/; пЕруЛлимли. епівІеспоп.сот/епд/сшапа!цувів.пІті; пЕр://ммли.ері.ас.ик/ГооїІ5/5/етрозв раскКігапзед/). Адаптація кодонів кодуючої послідовності нуклеїнових кислот до частоти їх використання в організмі, в якому послідовність є призначеною для експресії, може бути здійснена методом мутагенезу іп міго або, переважно, за способом синтезу де помо (новоутворення) генної послідовності. Способи синтезу де помо послідовності нуклеїнових кислот є відомими кваліфікованому фахівцю в даній галузі. Синтез де помо може бути здійснений, наприклад, спочатку синтезуючи індивідуальні олігонуклеотиди нуклеїнової кислоти, гібридизуючи їх з олігонуклеотидами, комплементарними до них, таким чином, що вони утворюють подвійну ланцюг ДНК, та потім лігуючи індивідуальні дволанцюгові олігонуклеотиди таким чином, отримуючи бажану послідовність нуклеїнової кислоти. Синтез де помо послідовностей нуклеїнових кислот, включаючи адаптацію частоти, 3 якою кодони використовуються до певного цільового організму, також може бути наданий компаніям, що пропонують дану послугу (наприклад, Еигоїїп5 МУМО).
Виділені фрагменти нуклеїнової кислоти, які містять нуклеотидну послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до 5ЕО ІЮ МО. 2 або 5ЕО ІЮО МО 3, переважно мають щонайменше 85 95 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 90 95 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 95 95 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95, та найбільш переважно 100 95 ідентичність послідовності до 5ЕО ІЮ МО. 2 або 5ЕО ІО МО 3, відповідно.
У випадку поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮ МО. 4, передбачуваний поліпептид вибирають із групи, яка включає: а) поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮ МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності,
Юр) виділений кодон, оптимізований фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить нуклеотидну послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до ЗЕО ІЮ МО. 5, с) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить послідовність комплементарну до
ЗЕО ІЮО МО. 5, а) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить послідовність, яка специфічно гібридизує до зазначеного виділеного фрагмента нуклеїнової кислоти із Б) або зазначеного комплементарного із с), е) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить нуклеотидну послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до 5ЕО ІЮ МО. 6,
У виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить послідовність, комплементарну до
ЗЕО ІЮО МО. 6, 9) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, який містить послідовність, яка специфічно гіоридизує до зазначеного виділеного фрагмента нуклеїнової кислоти із е) або зазначеного комплементарного із Її).
Крім того, поліпептид з дегалогеназною активністю - в даному документі поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮ МО. 4 - може бути кодованим щодо різних послідовностей нуклеїнових кислот. Знову, це являє собою результат виродження генетичного коду як пояснюється вище.
Знову, виділені фрагменти нуклеїнової кислоти, які містять нуклеотидну послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до 5ЕО ІЮ МО. 5 або 5ЕО ІО МО 6, переважно мають щонайменше 85 95 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 90 95 ідентичність послідовності, більш переважно щонайменше 95 95 ідентичність послідовності, 60 більш переважно щонайменше 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 965, та найбільш переважно 100 95 ідентичність послідовності до 5ХЕО ІЮ МО. 5 або 5ЕО ІО МО 6, відповідно.
Як використовується в даному документі, термін "гідроліз" означає ферментативно каталізоване гідролітичне розщеплення вуглецево-галогенного зв'язку, в якому галоген заміщується гідроксильною групою. Деякі ферменти каталізують гідролітичну дегалогенізацію 2-галогеналканових кислот з отриманням відповідної 2-гідроксіалканової кислоти.
Як використовується в даному документі, термін "селективний гідроліз" стосується того, що деякі ферменти (тобто поліпептиди), які каталізують гідроліз, проявляють стереоселективну активність. Іншими словами, завдяки селективному гідролізу енантіомерний надлишок або
В- або 5- енантіомеру генерується в залежності від переваги ферменту.
Як використовується в даному документі, термін "енантіомерний надлишок" або "е.н.- значення" стосується вимірювання чистоти хіральних речовин. Він відображає ступінь, в якій зразок містить один енантіомер у більшій кількості, ніж інший. Рацемічна суміш має е.н. 0 Об, тоді як окремий повністю чистий енантіомер має е.н. 100 95. Зразок із 70 95 одного енантіомеру та 30 95 іншого має е.н. 40 95 (70 90 - 30 Об).
Способи визначення є відомими в даній галузі. Е.н.-значення може, наприклад, бути визначене, використовуючи прилади газової хроматографії, обладнані хіральною колоною.
Таким чином, поліпептиди, описані в даному документі, показують стереоселективну активність при каталізуванні реакції гідролізу. Дана стереоселективна активність може бути виражена як е.н.--значення. Як зазначено вище, поліпептиди, які мають дегалогеназну активність, які містять амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮО МО. 1 або
ЗЕО ІО МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до однієї з двох зазначених послідовностей, демонструють стереоселективну активність, досягаючи дуже високі е.н. значення.
Надійне твердження прийнятності наданого ферменту для даної реакції може бути зроблене, використовуючи параметри: перетворення субстрату, утворення продукту, енантіомерний надлишок (е.н.) та вихід продукта за один прохід за одиницю часу (5). Як використовується в даному документі термін "вихід продукта за один прохід за одиницю часу" стосується кількості продукта, який утворюється із заданої концентрації субстрату в конкретному обсязі за визначений час.
Зо В деяких випадках виходи продукта за один прохід за одиницю часу значення, наведені в даному документі, також є представленими по відношенню до конкретної кількості клітинного екстракту або цільних клітин, які використовуються в даній реакції (дивіться приклади З та 5).
Як використовується в даному документі, термін "ген" означає ДНК-послідовність, яка складається з нуклеотидів, який містить ділянку (транскрибовану ділянку), яка є
З5 транскрибованою в молекулу РНК (наприклад, безпосередньо в мРНК без інтронових послідовностей) в клітину, функціонально зв'язану з регуляторними ділянками, здатними до регулювання експресії поліпептиду. Ген може, таким чином, містити декілька функціонально зв'язаних послідовностей, таких як нетрансльовані регуляторні ділянки (наприклад, промотор, енхансер, репресор), 5 лідерна послідовність, яка містить, наприклад, послідовності, які беруть участь в ініціації трансляції, (протеїн) кодуюча ділянка (КДНК або геномна ДНК), та 3' не- трансльована послідовність, яка містить, наприклад, сайти термінації транскрипції.
Як використовується в даному документі, термін "експресія гена" або "генна експресія" стосується процесу, в якому ділянка ДНК (кодуюча ділянка), яка є функціонально зв'язаною з відповідними регуляторними ділянками, зокрема промотором, є транскрибованою в молекулу
МРНК. Молекула мРНК потім додатково обробляється (за посттранскрипційними процесами) всередині клітини, наприклад, за рахунок ініціювання трансляції та трансляції в амінокислотний ланцюг (поліпептид), та термінації трансляції за допомогою стоп-кодонів трансляції.
Як використовується в даному документі, термін "немутантний тип" (також написаний як "дикий тип" або "немутований тип"), стосується типової форми ферменту або гена, як це найчастіше зустрічається в природі.
Як використовується в даному документі, термін "поліпептид" стосується будь-якого пептиду, поліпептиду, олігопептиду або протеїну. Поліпептид складається із послідовних амінокислот, які є зв'язаними пептидними зв'язками. Полімер може бути лінійним або або розгалуженим, він може містити модифіковані амінокислоті, та він може бути перерваний неамінокислотами. Поліпептид може бути людським, нелюдським та штучним або хімічним міметиком відповідної амінокислоти, яка зустрічається в природі, а також амінокислотними полімерами, які зустрічаються в природі, та амінокислотними полімерами, які не зустрічаються в природі. Термін також охоплює амінокислотний полімер, який був модифікований або природними процесами, або шляхом хімічних модифікацій; наприклад, шляхом утворення 60 дисульфідних зв'язків, глікозилювання, ліпідування, ацетилювання, ацилювання,
фосфорилювання, або будь-яких інших маніпуляцій, таких як кон'югація з компонентом, який мітить, таким як, але не обмежується цим, флуоресцентні маркери, частинки, біотин, кульки, протеїни, радіоактивні мітки, хемілюмінесцентні мітки, біолюмінесцентні мітки тощо.
Як використовується в даному документі, термін "ідентичність послідовності" двох споріднених нуклеотидних або амінокислотних послідовностей, виражений у відсотках, стосується кількості положень в двох оптимально вирівняних послідовностей, які мають ідентичні залишки (х 100), поділених на кількість положень, які порівнюються. Пропуск, тобто, положення у вирівнюванні, де залишок присутній в одній послідовності, але відсутній в іншій, розглядається як положення з не-ідентичними залишками. "Оптимальне вирівнювання" двох послідовностей знаходять шляхом вирівнювання двох послідовностей по всій довжині. Іншими словами, якщо дві ідентичні послідовності є вирівняними, значення ідентичності послідовності буде становити 100 95.
Вирівняні послідовності нуклеотидних або амінокислотних залишків зазвичай є представленими у вигляді рядків у матриці. Пропуски є вставленими між залишками таким чином, що ідентичні або подібні характери вирівнюються в послідовних стовпцях.
Для того, щоб визначити ідентичності послідовності, може застосовуватись алгоритм глобального вирівнювання Нідлмана та Вунша (Меедієтап апОа МУйпеси, 1970, 0) Мої! Віо 48(3):443-53) Європейського пакету відкритого програмного забезпечення з молекулярної біології (ЕМВО55, Кісе еї аї!., 2000, Тгепав іп Сепеїіс5 16(6): 276-- 277; дивіться, наприклад, пОру/Лимли.ебрі.ас.ик/етбровзв/аїїдп/іпаєх.піт!), використовуючи параметри за замовчуванням (штраф за відкриття пропуску - 10 (для нуклеотидів) / 10 (для протеїнів) та штраф за продовження пропуску - 0,5 (для нуклеотидів) / 0,5 (для протеїнів)). Для нуклеотидів матриця заміщень за замовчуванням, яка використовується, представляє собою ЕОМАРШІЇ ЇЇ, та для протеїнів матриця заміщень за замовчуванням представляє собою ЕВ ОБОМб62.
Термін "молекула нуклеїнової кислоти" є призначеним для позначення будь-якої одно- або дволанцюжкової молекули нуклеїнової кислоти, яка містить ДНК (кКДНК та/або геномна ДНК),
РНК (переважно мРНК), ПНК, ЛНК та/або морфоліно.
Термін "вектор", як використовується в даному документі, стосується молекулярного носія, який використовується для перенесення чужорідного генетичного матеріалу в іншу клітину.
Вектор сам по собі, як правило, представляє собою послідовність ДНК, яка складається із вставки (послідовності, яка викликає зацікавленість) та більшої послідовності, яка служить як "скелет" вектора. Призначення вектора для передачі генетичної інформації до іншої клітини, як правило, полягає у виділенні, розмноженні або експресуванні вставки в цільову клітину.
Термін "плазміда", як використовується в даному документі, стосується плазмідних векторів, тобто кільцевої послідовності ДНК, яка є здатною до автономної реплікації у відповідному господарі через походження реплікації ("ОКІ")М. Крім того, плазміда може містити вибірковий маркер для вказування успіху трансформації або інших процедур, призначених для введення чужорідної ДНК в клітину та сайт множинного клонування, який включає в себе декілька консенсусних сайтів з рестриктазним ферментом, щоб надати можливість введення вставки.
Плазмідні вектори, які називаються клонуючими або донорними векторами, використовуються для полегшення клонування та ампліфікування послідовності, яка викликає зацікавленість.
Плазмідні вектори, які називаються експресійними або акцепторними векторами, є спеціально призначеними для експресії гена, який викликає зацікавленість, у визначеній клітині-мішені. Такі плазмідні вектори, як правило, демонструють експресійну касету, яка складається із промотора, а рибосомального сайта зв'язування, трансгенної та термінаторної послідовності. Для контроля експресії дані плазміди містять репресор, який локалізується на плазмідному скелеті.
Експресійні плазміди можуть представляти собою човникові плазміни, які містять елементи, які дозволяють розмноження та селекцію в різних клітинах-господарях.
Як використовується в даному документі, термін "специфічно гібридизувати" або "селективно гібридизувати" стосується реакції відповідної послідовності нуклеїнової кислоти в розчині гібридизації, який містить 0,5 М буфер натрію фосфату, з рН 7,2, який містить 7 95 505, 1 мМ ЕДТО та 100 мг/мл ДНК сперми лосося, при 65 "С протягом 16 годин та промивання двічі при 65 "С протягом двадцяти хвилин у промивному розчині, який містить 9,5 х 550 та 0,1 96
ОБ.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в
ЗЕОІО МО.1 або 5ЕО ІЮО МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, є представленим у вигляді клітинного лізату та/або міститься всередині цільних клітин. бо Як використовується в даному документі, термін "цільні клітини" стосується того факту, що поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО. 1 або 5ЕО ІО МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, є представленим в клітинах, в яких експресується, тобто, що клітинні стінки зазначених клітин не були цілеспрямовано порушені.
Зазначені цільні клітини можуть представляти собою, наприклад, свіжу біомасу, яка утворюється в процесі ферментації. Альтернативно, цільні клітини можуть бути заморожені перед використанням.
Іншими словами, несподівано було виявлено, що навіть незважаючи на те, що фермент, тобто поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО. 1 або 5ЕО ІО МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, яка експресується (рекомбінантними) цільними клітинами, є присутнім тільки всередині клітині, біодоступність субстрату є достатньою так, що фермент може взаємодіяти із субстратом всередині клітини.
Було встановлено, що клітини Б.соїї, які використовуються для ферментативного синтеза, продукували бажаний фермент в постійній пропорції від загального вмісту протеїну. Іншими словами, надана кількість загального клітинного протеїну (наприклад, 5 г) завжди містить однакову кількість концентрації розчинного ферменту. З цієї причини, також, цільні клітини можуть використовуватися в експериментах замість клітинного лізату.
Застосування цільних клітин має перевагу в тому, що використовуються не дорогі способи та способи, які не вимагають багато часу, для надання клітинного екстракту.
В одному варіанті здійснення, зазначені цільні клітини представляють собою клітини Е. СоїїЇ, вибрані з групи Ме1655, МУ3110, УМ101, ВІ 210Е3З, ОНбЗальфа.
Більше того, вибрані Е.соїї переважно містять плазміду 5ЕО ІЮО МО. 7 та експресують фермент, який складається із БЕО ІЮ МО. 1 з плазміди.
Альтернативно, вибрані Е.соїї містять плазміду 5ЕО ІЮ МО. 8 та експресують фермент, який складається із ЗЕО ІЮ МО. 4 з плазміди.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в
Зо ЗЕОІО МО.1 або 5ЕО ІЮО МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, додають на початку реакції до рацемату зазначеної альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І, або зазначений поліпептид з дегалогеназною активністю додають на початку та в різні моменти часу протягом реакції до рацемату зазначеної альфа-галогеналканової кислоти.
Неочікувано, але різні профілі дозування не впливають на ефективність процесу. Таким чином, кваліфікований фахівець в даній галузі може вибрати профіль дозування найбільш прийнятний для відповідного процесу. Дана властивість заявлених ферментів пропонує максимальну гнучкість для використання ферменту в заданому процесі продукування.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, поліпептид з дегалогеназною активністю поліпептид, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕБО ІЮ МО. 1 або 5ЕБЕО ІЮ МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, додають на початку та в різні моменти часу протягом реакції до рацемату зазначеної альфа-галогеналканової кислоти, при цьому концентрація поліпептиду, який додається, є однаковою в кожній точці часу.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в
ЗЕОІО МО.1 або 5ЕО ІЮО МО. 4, або послідовність із щонайменше 8095 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, додають на початку та в різні моменти часу протягом реакції до рацемату зазначеної альфа-галогеналканової кислоти, при цьому концентрація поліпептиду, який додається, є різною в різні точки часу.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, рацемат додають до поліпептиду, при цьому поліпептид з дегалогеназною активністю має дегалогеназну активність, та містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮ МО. 1 або 5ЕО ІО МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, або зазначений поліпептид з дегалогеназною активністю додають до рацемату.
У випадку, коли рацемат зазначеної альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І! додають до поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО. 1 або 5ЕО ІЮО МО. 4, або послідовність із 60 щонайменше 8095 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей,
переважно весь рацемат зазначеної альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І, додають на початку реакції, при цьому значення рН рацемату є оптимізованим для реакційних умов перед додаванням.
Неочікувано, але це не впливає на ефективність процесу, незалежно від того, чи рацемат зазначеної альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І, тобто субстрат додають до поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО. 1 або 5ЕО ІО МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, або чи зазначений поліпептид з дегалогеназною активністю додають до рацемату зазначеної альфа- галогеналканової кислоти відповідно до формули І.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, будь-який з двох поліпептидів з дегалогеназною активністю, як описується в даному документі, є представленим у вигляді цільних клітин при рН 9,5, та рацемат зазначеної альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І додають до поліпептиду, при цьому рацемат зазначеної альфа- галогеналканової кислоти відповідно до формули І також надається при рН 9,5, та рН 9,5 підтримується постійним протягом реакції за рахунок титрування прийнятною основою.
Прийнятна основа може, наприклад, бути вибраною з групи, яка складається із водного КОН або Ммаон.
В деяких варіантах здійснення способу, описаного в даному документі, концентрація рацемату зазначеної альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І становить від 80 до 200 г/л, переважно від 90 до 150 г/л, найбільш переважно вона становить 100 г/л. Іншими словами, концентрацію рацемату альфа-галогеналканової кислоти переважно вибирають в такий спосіб, що може бути досягнуто повне перетворення.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в
ЗЕОІЮО МО. 1 або 5ЕБО ІЮ МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, є представленим у вигляді активних цільних клітин, та біомаса зазначений активних цільних клітин має концентрацію від 15 до 200 г/л, переважно від 25 до 100 г/л.
В деяких варіантах здійснення способу, описаного в даному документі, співвідношення рацемату альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І до біомаси цільних клітин, які містять поліпептид, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО. 1 або 5ЕО ІЮО МО. 4, або послідовність із щонайменше 8095 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, становить від 2:1 до 15:1, переважно від 3:1 до 10:1, найбільш переважно 4:1.
Оскільки поліпептид, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО І МО. 1 або 5ЕО ІЮ МО. 4, або послідовність із щонайменше 8095 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, інгібується більш високою концентрацією субстрату, співвідношення субстрату - тобто альфа- галогеналканової кислота відповідно до формули І - до ферменту - тобто поліпептиду, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в
ЗБЕО ІО МО. 1 або 5БО ІЮО МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, міститься в цільних клітинах, та як наслідок, представлений у вигляді біомаси - то зростає при більш низькій концентрації субстратів.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, галоген Х зазначеної альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І вибирають із групи, яка складається із броміду та хлориду.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, фрагмент ГЕ зазначеної альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули | представляє собою алкільний ланцюг від 1 до 6 атомів вуглецю, при цьому такий зазначений алкільний ланцюг являє собою атоми вуглецю гама або дельта, та при цьому атоми вуглецю, які слідують за розгалуженням на атомах вуглецю у або б, є циклічними.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, фрагмент ГЕ зазначеної альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І вибирають із групи, яка складається із етилу, бутилу, 2-метил-пропілу та метил-циклопропілу.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, значення рн підтримується постійним за рахунок титрування прийнятною основою, такою як калію гідроксид або натрію гідроксид. 60 Оскільки було встановлено, що реакційні умови можуть бути легко масштабовані,
можливими є об'єми реакцій від 1 мл до декількох 1000 літрів.
В одному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, зазначений поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО. 1 або 5ЕО ІО МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, представляє собою галогенкислотну дегалогеназу.
В переважному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, поліпептид з дегалогеназною активністю складається послідовності зЗЕО ІЮ МО 1 та взаємодіє з рацемічним субстратом, вибраним з групи, яка складається із 2-хлормасляної кислоти, 2-бром-гексанової кислоти, 2-бром-4-метилпентанової кислоти та 2-бром-3-циклопропіл-пропанової кислоти.
В альтернативному переважному варіанті здійснення способу, описаного в даному документі, поліпептид з дегалогеназною активністю складається із послідовності ЕО ІЮО МО 4 та взаємодіє з рацемічним субстратом, вибраним з групи, яка складається із 2-хлормасляної кислота, 2-фтор-масляної кислота, 2-бром-гексанової кислота та 2-бром-4-метил пентанової кислота.
Після селективного гідролізу 5-енантіомеру вибраної альфа-галогеналканової кислоти, К- енантіомер та гідролізований енантіомер є присутніми у вигляді суміші. Для деяких застосувань, корисним є отримувати тільки очищений К-енантіомер. Як наслідок, суміш із К-енантіомеру та гідролізованого енантіомеру вибраної альфа-галогеналканової кислота відповідно до формули додатково обробляється.
Наступний аспект, який є описаним в даному документі, стосується застосування способу, описаного в даному документі, для селективного гідролізу 5-енантіомеру зазначеної альфа- галогеналканової кислоти, при цьому енантіомерний надлишок К-енантіомеру становить від 90,0 та 99,9.
Несподівано було виявлено, що використовуючи поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО 1 або 5ЕО ІЮ МО. 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей, для контактування з рацематом, який містить К-енантіомер та 5-енантіомер альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І, при цьому Х представляє собою
Зо галоген, увипадку 5ЕО ІЮ МО 1, галоген не являє собою фтор, та К представляє собою алкільний ланцюг, який містить аж до 6 атомів вуглецю, де такий зазначений алкільний ланцюг може бути лінійним або розгалуженим на атомах вуглецю у або б, протягом 1-8 годин, при цьому рН знаходиться в діапазоні від 9 до 10, та температура знаходиться в діапазоні від 15 до
З5"С для поліпептиду, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в
ЗЕО ІО МО. 1, або рН знаходиться в діапазоні від У до 10, та температура знаходиться в діапазоні від 55 до 65 "С для поліпептиду, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮО Мо. 4, зазначений поліпептид буде здійснювати селективний гідроліз
З-енантіомеру зазначеної альфа-галогеналканової кислоти, при цьому енантіомерний надлишок К-енантіомеру становить від 90,0 та 99,9.
Даний результат був несподіваним, оскільки такі високі показники енантіомерного надлишку є дуже незвичними, особливо, оскільки поліпептид з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮ МО. 1 або 5ЕО ІЮ МО 4, досягає значень енантіомерного надлишку від 90 до 99 за дуже короткий час реакції 1-8 годин.
Як наслідок, несподівано було виявлено, що за допомогою використання поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕ
ІО МО. 1 або 5ЕО ІО МО 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до зазначених послідовностей з описаними умовами, дозволяє альтернативний, більш безпечний та більш економічно ефективний та економний за часом спосіб, що дозволяє та/або полегшує розділення К- та 5-енантіомерів альфа-галогеналканових кислот формули І, який грунтується на різній реакційній поведінці двох енантіомерів з поліпептидом, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕБЕО ІЮ МО. 1 або 5ЕБЕО ІЮ МО 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до будь-якої із зазначених послідовностей.
Інший аспект, який є описаним в даному документі, стосується способу селективного гідролізу енантіомеру альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули ЇЇ, о он
Е в якій
КЕ представляє собою алкільний ланцюг від 1 до б атомів вуглецю, при цьому даний зазначений алкільний ланцюг може бути лінійним або розгалуженим на атомах вуглецю у або 56, використовуючи поліпептид, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕО ІЮ МО 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності.
Несподівано було виявлено, що поліпептид, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО 4, або послідовність із щонайменше 8095 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності, селективно гідролізує 5-енантіомер альфа-галогеналканових кислот формули ІЇ, тобто який містить атом фтору, дуже ефективно та з високим енантіомерним надлишком.
Переважно, описаний вище спосіб застосування поліпептиду, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕБЕО ІЮ МО 4, здійснюється при температурі 55-65 "С тапри рН ог 9,5.
Таким чином, у випадку поліпептиду, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО 4, або послідовність із щонайменше 80 95 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності, на додаток до названих вище альфа-галогеналканових кислот, також особливо переважною є 2-фтормасляна кислота.
Інший аспект, який є описаним в даному документі, стосується застосування поліпептиду, який має дегалогеназну активність, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в ЗЕБЕО ІЮ МО 4, або послідовність із щонайменше 8095 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності, для селективного гідролізу 5-енантіомеру альфа-галогеналканової кислоти формули ЇЇ, при цьому енантіомерний надлишок К-енантіомеру становить від 90,0 до 99,9.
В переважному варіанті здійснення спосіб здійснюється наступним чином: поліпептид з дегалогеназною активністю, який складається із амінокислотної послідовності, як представлено в ЗЕО ІЮО МО. 1, додають до 2-бромбутанової кислоти при кімнатній температурі при рН 9,5.
Реакції дозволяють проходити протягом 4-6 год., при цьому значення рН підтримується постійним за рахунок титрування З М розчином калію гідроксиду.
Зо В особливо переважному варіанті здійснення, спосіб здійснюється наступним чином: 10 мг/мл загального клітинного протеїну, як клітинного екстракту, який містить поліпептид з дегалогеназною активністю, який складається із амінокислотної послідовності, як представлено в ЗЕО ІО МО. 1, додають до 100 г/л 2-бромбутанової кислота при кімнатній температурі, рН 9,5 та в реакційному об'ємі б л. Реакції дозволяють проходити протягом 4-6 год., при цьому значення рН підтримується постійним за рахунок титрування З М розчином калію гідроксиду.
В іншому переважному варіанті здійснення, спосіб здійснюється наступним чином: поліпептид, який складається із амінокислотної послідовності, як представлено в ЗЕО ІЮ МО. 4, додають до 2-бромбутанової кислоти при температурі 55 "С, рН 9,5. Реакції дозволяють проходити протягом 4-6 год., при цьому значення рН підтримується постійним за рахунок титрування З М розчином калію гідроксиду.
В ще більш особливо переважному варіанті здійснення, спосіб здійснюється наступним чином: 10 мг/мл загального клітинного протеїну, як клітинного екстракту, який містить поліпептид з дегалогеназною активністю, який складається із амінокислотної послідовності, як представлено в 5ЕОІЮО МО. 4, додають до 2-фтормасляної кислота при температурі 55 С, рн 9,5.
Фігури
Фіг. 1 демонструє реакцію, яка здійснюється в оптимізованих умовах стосовно значення рн, тобто 9,5, та температурі, тобто 257 Сб. В даному випадку 100 г/л 2-броммасляної кислоти використовувалися як субстрат, 20 мМ гліцину були присутніми та 2 г/л клітинного лізату, тобто використовувалася Е. сої МО1655, що містить плазміду РКАвтТа-НАОН-РР-АУ), для експресії дегалогеназного ферменту. Клітинний лізат додавали З рази, щогодини.
Фіг. 2 демонструє, що оптимальний рН реакції із фігури 1 становить від рН 8 до рН 10.
Фіг. З демонструє, що замість використання (стерильного) клітинного лізату також цільних клітин, які експресують заявлений фермент, можуть використовуватися для конверсійної реакції.
Фіг. 4 демонструє, що ефективність конверсійної реакції підтримується, якщо забезпечується субстрат, та фермент додають до субстрата.
Фіг. 5 демонструє, що ефективність конверсійної реакції підтримується, якщо фермент є представленим у вигляді ферментативного бульйону, та додають субстрат. 60 Приклади
Приклад 1: Скринінг активності вибраної галогенокислотної дегалогенази
Відмінна галогенокислотна дегалогеназа з Р. ршіда А), Р. ршіда 109 та 5. їоКодаїї 7 (допез еї а!., 1992 () Сеп Містобріо!. 1992 Арг:138(4):675-83, Каугазакі єї аї., 1994 Віовзсі Віоїєснпо! Віоспет. 1994 дап;58(1):160-3 та Васпаз-Оайпей оеї а), 2009 Аррі Віоспет ВіоїесппоІї. 2009
Мом;159(2):382-93) була клонована в Е. соїї МО1655 та над-експресована за рахунок обробки
ІРТО. 50 г/л 2-броммасляної кислоти використовували, як субстрат, та 2 х 1,6 г/л клітинного лізату додавали на початку реакції та через 3,5 год., при цьому рН становив 9, та температура була встановленою до 37 "С.
Активність та стереоселективність - тобто переважний гідроліз 5-енантіомеру - була продемонстрована для всіх трьох ферментів за допомогою аналітичних методів, використовуючи газову хроматографію з ферментом з Р. ршіда А (ЗЕО ІЮ МО 1), показуючи найбільш високу селективність, яка досягає значення е.н. понад 90 95.
Приклад 2: Вплив рН на результат реакції.
Для перевірки оптимального діапазону рН реакційних умов були встановлені на: - 100 г/л 2-броммасляної кислоти (субстрату), - 1,5 г/л клітинного лізату Е.соїї, що експресує Р. ришйда А), галогенокислотну дегалогеназу (ЗЕО І МО 1) (6 разів, кожну годину) - 20 мМ гліцину - температура: 2570 - РН: підтримується постійним при 8,0, 9,0, 10,0
Як показано на фігурі 2 найкращі результати досягаються з рН від 9 до 10.
Приклад 3: Подальша оптимізація селективної дегалогенізації для утворення високого енантіомерного надлишку, використовуючи галогенокислотну дегалогеназу від Р. ршйда А)/, тобто поліпептид, який має дегалогеназну активність, який складається із БЕО ІЮ МО. 1.
В першому випадку, 100г/л рацемічної 2-броммасляної кислота в 10 мМ гліцину використовували як субстрат. Реакцію здійснювали при 25 "С, хоча оптимальна температура для ферментативної активності становила 37 "С, оскільки субстрат був більш стабільним при 25 "С, ніж при 37 "С, та як наслідок, запобігався автогідроліз (дані не показані).
Фермент надавали у вигляді клітинного лізату та додавали або весь на початку реакції або
Зо кожну годину з концентрацією 2 мг/мл. рН підтримували постійним при 9,5 за рахунок титрування З М розчином КОН до завершення реакції через приблизно 4 годин. Згодом, рн доводили до рН 1,5 концентрованою Но5оО), та клітинний дебріс відфільтровували через целіт.
Екстракцію здійснювали МТВЕ, та промивання для видалення залишків 2-гідроксимасляної кислоти здійснювали водним розчином Си5Ох. Нарешті, концентрування проводили у вакуумі.
Несподівано було виявлено, що реакція достовірно досягала значення показника енантіомерного надлишку понад 99 95 (дані не показані).
Дані високі показники енантіомерних надлишків, тобто той факт, що після реакції присутніми є тільки К-енантіомер альфа-галогеналканової кислоти та гідроксильований продукт колишнього 5З-енантіомера альфа-галогеналканової кислоти, роблять процес привабливим для використання у великих промислових масштабах.
Приклад 4: Перетворення цілими клітинами.
Неочікувано, було встановлено, що замість отримання клітинного лізату, цільні клітини можуть використовуватися для перетворення. Це має перевагу в тому, що стадія отримання (стерильного) клітинного лізату, яка займає багато часу, може бути пропущена.
В першому випадку, рацемічна 2-броммасляна кислота вв концентрації 100 г/л використовували як субстрат. Параметри реакції встановлювали наступними 150 мл, 25 "С, 500 об./хв., 20 мМ гліциновий буфер та рН 9,5. рН підтримували постійним, використовуючи З М
КОН. Реакційну ємність отримували із сумішшю субстрату, та реакцію починали з додаванням ферменту, тобто додаванням цільних клітин Е. соїї Мо1655, які експресують фермент дегалогенази від Р. ршіда Ау, тобто поліпептиду, який має дегалогеназну активність, який складається із БЕО ІЮО МО. 1. Клітини додавали як або на початку реакції або по-стадійно через 1, 2, та З години, в концентрації 8,3 г/л, відповідно (дивіться, фігура 3). Кінцева концентрація цільних клітин, які містять фермент, становила або 25 г/л, або 50 г/л. Реакція завершувалась через 4 години. Результати, представлені на фігурі З та в таблиці нижче, демонструють, що в ідеалі реакція здійснюється протягом більше, ніж 1 години, наприклад, протягом 4 годин.
11111 25упбомаси.///// | 77777777777173111717111111Ї111111111117898сСс2С (о 25г/лбіомаси(подача)ї/// | -:( 3 7777777 |Ї77777777777179011сСсСсС2СС
Згодом реакцію повторювали, але біомаса, яка складається із клітин Е соїї Мо1655, які експресують фермент дегалогенази від Р. ршіда Ау, тобто поліпептид, який має дегалогеназну активність, який складається із 5ЕО ІЮО МО. 1, додавали до реакційної ємності перед додаванням субстрату. Результати є представленими на фігурі 4 та в таблиці нижче. Дані результати демонструють, що можливим є спочатку надати фермент у вигляді біомаси, яка містить цільні клітини, та додати субстрат до зазначеної біомаси.
Крім того, конверсію здійснювали, використовуючи ферментативний бульйон. Знову Е. сої
МО1655, яка містить плазміду РКАВтТа-НАЮН-РР-АУ використовували для експресії ферменту дегалогенази, тобто поліпептида, який має дегалогеназну активність, який складається із ЗХЕО
ІО МО. 1. Продукування ферменту здійснювалося шляхом ферментації Е. соїї в мінімальному середовищі, використовуючи стандартний протокол. Після експресії гена було досягнуто концентрацію клітин 100 г/л. Згодом проводили біотрансформацію з необробленим ферментативним бульйоном. Ферментативний бульйон охолоджували до 25 "С, та рН доводили до 9,5 шляхом додавання З М КОН. Дегалогеназну реакцію почали шляхом додавання субстратної суміші, яка містить 100 г/л 2-броммасляної кислоти, 0,5 об. (0б./06.) гліцинового буферу при рН 9,5 та 2 об. (об./06.) 5 М КОН. Реакція досягала повного перетворення, тобто 90 95 е.н. через 1 год. (дивіться фігуру 5).
З отриманої в результаті суміші гідроксимасляної кислоти та К-2-броммасляної кислота може бути отримано приблизно 3095 чистої В-2-броммасляної кислоти, використовуючи стандартні методики, такі як підкислення та екстракція.
Приклад 5: Дослідження подальших субстратів
На додаток до 2-броммасляної кислота були досліджені додаткові субстрати, та результати є представленими нижче масляна масляна гексанова циклопропіл- кислота кислота кислота пропанова кислота кислота
Зо Приклад 6: Масштабування.
Необхідною умовою збільшення масштабу реакції до 2000 літрів було встановлення того, що ферменти можуть використовуватися як такі, що містяться в цільних клітинах, які були представленими як біомаса без необхідності отримання клітинного лізату. Як наслідок, потребуючий багато часу процес та дорогі стадії отримання, такі як фільтрування клітинного лізату, які не є економічно доцільними у великих масштабах, можуть бути пропущені. Крім того, виявлено, що реакція може розпочинатися або за рахунок додавання субстрату (рацемату) або біомаси, яка містить фермент в цільних клітинах, означаючи, що обладнання може використовуватись з максимальною гнучкістю. З метою подальшої адаптації процесу, КОН, який використовується для рН титрування (дивіться вище), було замінено на 50 95 Маон, розчинник для екстрагування продукту було замінено з МТВЕ на МІВК, та СизО4, який використовувався для видалення побічних продуктів, було замінено на Сасі2, дозволяючи більш легке та більш дешеве видалення відходів.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Вауек АКкКеЕіепдеве11І5сватє «120» СПОСІБ ОТРИМАННЯ ХІРАЛЬНИХ АЛЬФА-ГАЛОГЕНАЛКАНОВИХ КИСЛОТ «130» ВвтТ5173006 «1605 8 «1705 РасбепсІп уегвіоп 3.5 «2105 1 «2115 227 «212» РЕТ «213» Рвемпдоштопав Рибіда АгІ1 «4005 1
Меє Ггув АвБп о І1е сіп сіу І1е Маї Ррпе Авр Гей Тук б1у ТПг Геч Туг 1 5 10 15
Авр Уа1 Нів бек Уаі Уаі біп Аї1а Сув бі бі Уа1 Тук Рго сбіу сіп 20 25 30 б1у Авр Аї1а Іїе бек Агд Гей Тгр Агуд біп пув біп Гей біц Тукє Тс
ТЕр гейш Акуд бек Гец Меє б1у Агкуд Тук Уаі Авп Рпе сій пув Аїа ТЕПг
Зо 50 55 бо бі Авр Аза Гей Агуд Рпе ТПг Сув ТПг Нів Гей сіу Гец бек Іецй Авр 65 70 75 80 35 Авр бій ТБбг Нів біп Агуд Гей бек Авр Аїа Туг Гей Нів Гей Тібг Рго 85 90 95
Ту Аїа Авр ТПг Аза Авр Аїа Уаі1і Агуд Акд їец їу5 Азїа Азї1а сС1Уу Іецй 100 105 110 40
Рго Гец сіу І1е І1е бек Авп біу бек Нів Сув Бек Іїе бій сіп Уаї 115 120 125
Уаї ТпПг Авп Бек біц Меє Азп Тгр Аїа Рпе Авр сіп Гец І1е бек Уаї 130 135 140 бі Авр Уаії сіп Уаі Рпе Ппув Рго Авр Бек Агуд Уа1 Тукг бек Іецй А1а 145 150 155 160 сі пув Акуд Меє с1у Рібе Рго Пув бій АБп І1е Гей Рібе Уаї бек 5ег 165 170 175
Ап Аза Тгр Авр Аза бек Азїа Аза бБег Авп Рпе б1у Рпе Рго Уа1ї Сув 180 185 190
ТЕр Іїе Авп Агуд біп Авп о біу Аза Рібе Авр біц ІТец АвБр Аїа Гув Рго 195 200 205
ТПЕ Нів Уаі1 Уаі1 Агд Авп Тїец Аза сіц Мес бБег Авп Тгр Іецп Уаіїі Авп 210 215 220 зек Геч Авр 225 «2105 2 «2115» 684 «2125 ДНК «213» Рвемпдоштопав Рибіда АгІ1
Зо «4005 2 аєдаадааса єЄсадддсає єдЕЧдЧЕсеєЧас сеЕСсаєсддба сдссдсаєда сдсасасадс бо
ЧдЕСсСЯдЕєЄсаад сочдєсдєсдаада адеЕсєвасссо дудєсєсааддсу аєдсдасьсс ссуєсеЕсдвєда 120 сдЕсадааас адссддааса сасдЕддаєсуд суаєЕєсСсеЕвда Едоддасускта єдЕСВасевс 180 чадааадсда сеЕдаддаєдс дЕБгасудссвес ассеЕдрасдс ассеЕдддЕсь дессссеЕсдас. 240 дасдааассс аєсаасудЕсс дадсдаєсдсс баєсеЕссасс Єдассссдвра содсадасаса 300 чдссдаєдсад ЄЕСУдєЄсоЯдЕЕ аааадссдса дудсЕсассас Єддодадаєсає садсааєддс 360 адеЕсаєєдса дсаєсдааса ддаєддєаасс аасеЕсудааа Єдааседддс ЕсСЕСдаєсад. 420 сЕдаєєєсєсду ЕсудаадаєдеЕ ссаддеЕдесЕес ааасссдавєє сеЕСЧдсуєЄдса Ессасєддсу 480 чадааасдса ЄддодсЕсЕеЕсСс дааддадаас абссеєсессу Едадееєсудаа ЕдссЕдодадає 540 дсадєссадсвд ссессаасеЕс гддасЕсссу дЕсЕдсвдда Ссаассодсса даасддсдсу 600 сЕєдасдаас соддаєдссаа ассдасссає дЕддсасдса аєсеЕддсада ааєдадсаає 660
ЄдасЕєдеда асадесссудда ссаа 684 «2105 З «2115» 684 «2125» ДНК «213» Рвемпдоштопав Рибіда АгІ1 «4005 З аєдаааааса Єссааддває сЯєсєеєссоаає ссдсасддса сдссссасдда сдедсаєсєссс бо дЕддЕдсаад сссдЕдаада ддЕссаєссду ддссааддсо асдставєссс єсудссессда 120 сддсаааадс ааєсодддааса сассрддссс аддадссеса Едддссуєта судєдаасес 180 чадааадсаа сададдаєдс сЕгдсдссЕес асседсасдс аєсеЕдддссЕ дссдсеЕсдає 240 чаєдааассс ассадсдссеЕ садедаєдсс басеЕсдсасс сассссеса гдссдабаса 300 чдсЕдасдссд ЕЕСудссЯєсЕ дааадседсу ддсссассдс баддсаєсає Ессаааєдує 360
ЕсеЕСаєєдсеЕ сдаєсдадса адесдеєдассі аасеєссдааа Єдаасьдддс дЕссдаєсад 420 сЕдаєсадсу ЕсудаддаєдЕ дсаадеЕдЕеЕєсс ааассеєдаєса дссдсдЕСта бадссердсс 480 чадаадсдса ЄддЧдЧсЕсЕеЕсСс аааддаааас асссесссссу ЕЕссСдЕСааа сдсууаєсдддає 540 чдсдадеЕдсад ссадсаасеє где ссссу дЕсСЕдссддда Єсааєссдудса даасуддсдсу 600 сеЕєдаєдадс соддаєдсааа дссдасасас дЕСсСудєсдсудва аєсеЕсдссда аагдеЕсдаас 660
Єдаседдеєса аєссоасеєсда ЕсСаа 684 «2105 4 «2115» 201 «2125 РЕТ «213» 5ч1то1орив СоКодаїї 7 «4005 4
Меє І1ї1е І1ї1е гейш Аза Рібе Авр Іїе Рбе сіу ТПг Уаії Іец Авр ТПг 5ег
Зо 1 2 10 15
ТпПгЕ Уа1ї Іїе сіп сбіц Ррбе Агд Авп о Гув біп їец біц Тук ТПг Тер Гей 20 25 30
Тем ТПг І1е Меє с1у Ппув Тук Уа1і! сій Рбе сій сій І1е ТПг Ппув Пе 35 40 45
ТПЕ гей Агуд Туг Іїе Гец Гуз Уа1 Акуд сбіу біц біц бек Гув Рпе Авр 50 З бо бі бій Гей Авп о Гпув Тер пуб Авп Гей пув Аїа Тук біц Авр Тс Гу 65 70 75 80
Тук Гей пув сій І1їе бек біц Іїе Аїа сіц Уа! Туг Аза Іецй бек Авп 85 90 95 бі1у век І1їе АвБп бі Уа1і Ппув сбіп Нів Гей бій Агуд Авп біу ТІецй Іей 100 105 110
Агуд Тук Рпе Гуз б1у І1е Рпе бек Аїа сій бек Уаії Ппув сій Тук Тув 115 120 125
Ркго бек Рго пуб Маї Тук Ппув Тук Рпе Гей Авр бБег Іїе с1іу Аїа Гув 130 135 140 бі Аза Рпе Гей Уа1і бек бек Авп Аза Рпе Авр Уаі! І1їе сС1у А1їа Гув 145 150 155 160
Авп о Азїа сіу Месє Агд бек І1їе Рбе Уаі АвБп Агуд Ппув Авп о ТПг Іїе Уаї 165 170 175
Авр Рго Іїе сіу біу пув Рго Авр Уаі І1е Маії АвБп Авр Рібе Гпув сі 180 185 190
Тем Тук віп Тер І1їе Іей Агуд Тук Гув 195 200 «2105 15
Зо «211» 606 «2125 ДНК «213» 5БМш1то1орив боКодаїї 7 «4005 55 асдчаєсаьеєс гддссеЕсСсдЧа сарссеєсодЧдеЕ асеЕдсасесу абасаєссас сдєсаєссад бо чааєеєєсєсдса асааасаасе ддадеавасе сододсєсдсеЕда сддаєсаєдду сааасгасуєд 120 чааєєєдадд аааєсассаа ааєсасуєва сустасаєсс єдааадесесу Едудєсдаадаа 180
Єсдаадесвд асдаадаасе даасааасуд аадаассеєда аадсдраєда адасассааа 240 бассеєсааад адаєсеєсоуда ааєсдссдаа дДдЕсСтаєдсдс єдЕсаааєду дадсаєтаас 300 даадєдааас адсаєссодда асдєаасддд ЕСсасеЕссодЕ асеЕссааадуд сасстьєстесс 360 чдсадааадсд Єгааададса сааассчдадс ссдааадедеЕ аєаадвасеє ЕсЕддаєадс 420 аєєсддєдсда аадаадссєє сеЕєдудбассоі адсаасдсає єсдаєдедає сддсдссаад 480 ааєдсеЕддва ЄдсусЕсСсає сЕЕбдЕсЕсааєс сусаадааса ссаєсдєссда Есссаєсддсес 540 чддаааассад асдеЕдаєсдє сааєдасесєес ааададседЕеЕ аєдадеддає ЕсЕССЯстає 600 аааєсаа боб «2105 6 «211» 606 «212» ДНК «213» 5БМш1то1орив боКодаїї 7 «4005 6 аєчаєсаєєс гадсаєєєда гаєсеЕссодда асадесссссдд асасаєсстас ддасааєсссаа бо чадеЕєсадда агаадсааєсе ададеаєаса бддЕсасеса сааєааєдду дааастаєдеу 120 чааєєєдадд аааєаасааа даєсасесва адаєсасаєсе баааддєсаауд аддсдаадад 180 адсаааєєвд аєдаддадсє аааєаадсдд аадааєсеєвса аадсесваєда адасастааа 240 баєссааадчу ааасаєсьєда дасадссдад дЕсграсудсудє баєссаасдуд дЕСсСасааає 300 чаддЕсааас аасаєсеєсада дсдсааєдує СЕДдДЕсСаадає аєсесаадду сагаєєстаде 360 чдсадааадед Єгааадааса бааассьсса ссргааадсає асааасаєес сссадасесу 420 асаддадсва аадаадсаєсе сегадеесса ссаааєдсає єЕдасуєсає аддадстааа 480 аасдсдддеа Єдчаддадеає аєєсудєааає аддаадааса саагадессда Есссабсадде 540 дасааассвуд аєдеЕсасадс аааєдасьсс ааачадесає асддааєддає сеЕсдсдаває 600 аадеда боб «2105 17 «211» 4515 «212» ДНК «213» рКкКАВІа-НАРН-РР-А) плазміда «4005 7
Ебадааааас єсаєсдадса Єсаааєсдааа ссдсааєссса сссасаєсад даєссаєсаає бо
Зо ассаваєсєеєсє єдааааадсс ЯдЕЕЕССдсаа Єдааддадаа аасесассда ддсадессса 120 баддаєддса адаєсссдудЕ аєсддессудс дасеЕссдасе суєссаасає саасасаасс 180 баєєаавсеєс сссеЕсуєЄєсаа аааєааддеЕс аєсаадесдад аааєсассає дадсдасдасєс о 240
ЄдааєссоддЕ дадааєдудса ааадеЕстаєд сасеЕссеееєс садасесусєе саасаддсса 300 чдссаєстасудс ЄсдЕсаєсаа аассасесдс ассаассааа ссдеЕсаєсеса Ессдоєдаєсу 360 сдссєдадсу адасдаааса содсдаєсдсЕ дЕсаааадда сааєсасааа саддааєсда 420 аєдсаассудд сдсаддааса сеЕдссадсус аєсаасааса ЕЕсЕСасссуд ааєсаддаєба 480 гЕСЕЄСсСваає ассеЕддааєдд сЕдЕЕсЕеЕсСсс дооддаєсоса дЕддЕдадса ассаєсдсаєс 540 аєсаддадеа сододаєсаааає дсЕєдаєдус суддаададдс аєаааєсссу Есадссадеє 600 бадеЕСсСЕдасс аєсеЕсаєссдд баасаєсаєс доудсаасдсвта ссЕЕсдссає дЕсЕссадааа 660 саасесЕддс дсаєсодддсЕ Есссарасаа Єсдабадаєс дссодсасссд асрдсссдасо 720 аєсаєсдсда дсссаєстає асссасаєсаа ассадсаєсс агдеЕєддаає СЕааєссодсод 780 ссгададсаа дасдеЕсеєссс дЕєдаасаєд дсеЕсаєааса ссссеЕсдсає баседеєесає 840
ЧдЕаадсадас адсеЕстаєсу єссаєдасса аааєсссева асдедадеЕсе ЕсуусеЕсСсасят 900 чадсдеЕсада ссссдрадаа аадаєсааад дасссссьвуд адаврссєсе єсеЕСЕдсдсу 960 бааєсьдсьд сЕсдсаааса аааааассас судстассадс дадасоЯдЕСЕдЕ Есддссодаєс 1020 аачдадссасс аасЕсЕсЕеЕс ссдааддраа седдссЕсад сададсдсад абассаааса 1080 сЕДЕССЕЕСсСЕ адеЕдЕадссу бадеваддсес ассасеєссаа даасеЕстьдра дсассдсста 1140 сабгассєсдс ЕсЕДСсСсааєс сЕдеЕвассад ЕддсЕдсвдс садеЕддсдає аадссдєдеЕс 1200
Єгассодддесє ддасссаада сдаєадеЕсас суддасааддс дсадсоддесу дасєдаасодд 1260 чаддЕссдЕд сасасадссс адсеЕсддадс даасдассва сассдаассуд адасассвас 1320 адсдеЕдадсе аєбдадааадс дссасдсеЕс ссдаадддад аааддсддас аддсаєссод 1380 баадсддсад дадссддааса ддададсдса сдадддадсє Єссаддддда аасудсссддеЕ 1440 аєсеЕєвсаєад ЄссЕдЕСсСудду ЕЄЕсСддссасс Єсесдасеєєда дсдеЕСЯчавьєє єсооєсдчаєдсе 1500 сдЕсаддадду дсуддадсста єддааааасу ссадсаасдс ддссЕсЕста соудеЕЕсстодд 1560
ССЕБЕСЕДССУ дссЄсЕСЕдсЕ сасаврдеєеєсе ЕсссеЕдсуєЕ ассссседає єсеЕдеЕДЧдава 1620 ассдбаєсас содссЕссдад Єдадсєдаєба ссдсєсдссуд садссдаасу ассдадсдса 1680 чдсдадеЕсадеЕ дадсдаддаа дсоддаададс дссеЕдаєдсу дравсвЕссеєс сестгасдсаєс 1740 бдєдсоддває сЕСсасассдс ааєддбедсас ссссадсаса аєседссссу асдссдсавба 1800
ЧдЕсаадссад басасасесс дсраєсудста сдеЕдаседудд Єсаєддседс дссссдасас 1860 ссдссаасас ссудсЕдасдс дссседасду дсЕбєдЕСЕдс Есссууддсаєс судсеЕвгасада 1920 саадсєдеЕда ссодєссеЕссдуд дадсєдсаєд Єдессададдс Есссассуєс ассассдааа 1980 сдсдсдаддс адсєсдсуддба аадсесаєса дсдєддЕсСЯдЕ даадсдаєсеєс асадаєуєсе 2040 дссЕдеЕЕєсає ссдсдеЕссад сЕСдЕєЄЧдадеі СЕСЕССадаа дсдЕсВаавде ссддСсСЕЕСтУЯ 2100 асааадсддд ссаєдеЕсаад дасоадЕЕсЕеЕс сссЕдЕсвду Єсасєдаєдс сеЕссудєдеЕаа 2160 чададаєєсес єдесЕеЕСаєдоауд ддаєааєдава ссдаєдааас дадададдає дсеЕСасддавба 2220 сддаєсассуд аєдаєдааса Єдсссуддесва сеЕддаасдєс деЕдадддсаа асаасєддсуд 2280 чЕаєддаєдс доасоддддасса дадаааааєс асссадддеЕс ааєдссадсу сєсаєдадсесс 2340 сдаадеддсуд адсссдаєсє Ессссаєсдуд Єдаєдесуддс дабаєаддсд ссадсаассу 2400 сассєдсддс дссоддєдаєд ссодддссасда ЕдсдеЕссуддс дсададдаєс дадаєссаєє 2460 басдєєдаса ссаєсудааєсуд деЕдсаааасс ЕсСЕСЧдсудЕа Єддсаєдава дсдсссддаа 2520
Зо чдачадесаає ЕсадаодсдудєЄ дааєдедааа ссадсаасудє СбСабасдаєде содсададсає 2580 чдссоддЕдЕсСЕ сеЕсаєсадас се Есссоус дЕддєдаасс аддссадсса сдЕсеЕСтддсу 2640 аааасдсддд ааааадсддда адсддсдаєд дсддадседа аєсасаєсьсс саассдсуєд 2700 дсасаасаас Єддсдуддсаа асадеЕсЧєвда сеЕдаєєддсуд Егдссассєс садесвєддсес 2760 сЕдсасдсдс сдЕсудсааає ЕдЕСЯдсдудсу аєсаааєсьіс дсудссдаєса асеЕдддеЕдсс 2820 адсдєддєда єдссдаєсоддс адаасдаадс ддсодєсдаад ссеЕдсааадс дасддеЕдсас 2880 ааєсєєсьсд сдсаасдсдє садеддасьд ассаєсаасоі аєссдседда Єдассаддає 2940 чдссаєєдсьд Єддаадседс сеєдсасеаає дЕсСсСсдддсуає басессесвда ЕдДдЕСЕСЕДЧас, 3000 садасассса Есаасадбає вавєєвеєсьсс саєдаадасу дсасудсддасе доддсдєддад 3060 саєссддеЕсу саєсдддеса ссадсаааєс дсодсЕдЕвад сдуддсссаєєе аадеЕеєсьдеЕс 3120
Єсоддсодсдєс гдсдЕсСсддс Еддссддсає ааасаєстєса сесдсаасса ааєсссадссу 3180 асадсддаас доаодааддсда сеєддадедсс аєдеЕсСсддеЕє ЄЕСаасааас саєдсаааєд 3240 сЕдДдааєдаду дсаєсдеєсс сассдсдаєд сеЕддЕєдсса асдаєсадає ддсдсеєддас 3300 чдсааєдсдсд ссаєсассда дЕСсСодддасвд соудсуєєдоаєд соодасаєєсес доасадеЕдодда 3360 басдасдава ссдаадасад сеєсаєдеЕсає аєсссудссує баассассає сааасаддає 3420 вЕЄСсСдссвдс сддоддсааас садсудєддас сусЕсдседс аасеЕсесьса дддссаддсу 3480 дЕдчаадддса аєсадссдЕс дсссудєсеЕса ссддЕдаааа дааааассас ссеЕддссвєда 3540 чаааєсаєаа аааасеєсасє єдсеЕеєєдеЕДда дсоодаєааса аєсаєагваєад арссааєстде 3600 чадсддаєаа сааєсеєсаса саєстадааа ЄааєсеЕсєдеЕє саасеесаау ааддадаєає 3660 саєаєдаада асасеєсаддуд саєсЧчЕЧЕеЕЄЕ дассеєсстаєуд дсасуседва єдасудбасас 3720 адсдЕСсСЯдєЕєсС аадсдеЕдЕеЕда адаадеесас сссддеЕсаад дсдаєдсдає ЕсСсссЯаєєвуа 3780
ЄдоасдеЕсада аасадссдда асасасдєдуд ЕСЄдсЯєсЕсСсСЕ Єдаєдддасу сгаєсдеЕсаас 3840 бЕсдадааад счдасєдадда ЕдсдЕсасус СЕсСассвєдна сдсасссуддуч ЕСЕДЕСССЕЮ 3900 часдасдааа сссаєсаасу ЕсЕдадсдає дсстаєсьсс асседасесс дсасддсадає 3960 асадссдаєд садеЕсєсдєсу деЕсаааадсс дсаддсеЕсас саседдддає саєсадсаає 4020 часадесаєє дсадсаєєда асаддєддра ассаасєсдуд аааєдаассу ддассеЕссддає 4080 садсєдаєстЕ сддєсєсдаада єдсссаддед Єссааасссу асссеЕсдсудЕє дсаєссасву 4140 чдсоддадааас дсаєдуддессЕ Ессдааддад аасаєссеєсе ЕсдеЕДдадесс даасдсеЕєдуа 4200 чаєдсдЕСсад сЕдссЕСЕВаа сЕЕєдодДЕС ссододеЕеЕсдсЕеЕ ддаєсааєсу ссадааєдудє 4260 чдсЯдЕєсдасуд ааседдаєдс сааассддасс саєдесддбрас дсааєссддс адаааєдадс 4320 ааєєддсевд ЄдаасадесеЕ ддасеаасес дадсассасс ассассасса сєдадаєссу 4380 дсЕдссааса аадсссдааа ддаадсєдад ЕсдодседссЯ ссассудседа дсаасаасста 4440 чдсаєаасссс ЕЕддддудссЕсС гааасдоадеЕсС ЄЕЧДадудуєє ЄЕЕсЕдДСсСсдаа аддаддаасяе 4500 агаєссоадає аасес 4515 «2105 8 «211» 4437 «212» ДНК «213» рКкКАВІіа-НА0Н-вектор з галогенокислотною дегалогеназою з
Ззи1то1орив СоКкодаїї 7
Зо «4005 8
Ебадааааас єсаєсдадса Єсаааєсдааа ссдсааєссса сссасаєсад даєссаєсаає бо ассаваєєвсє Єдааааадсс дЯдЕЕЕєссдсаа Сддааддадаа аасесассда ддсадеєсса 120 баддаєддса адаєсссдудЕ аєсддессудс дасеЕссдасе суєссаасає саасасаасс 180 баєєаавсеєс сссеЕсуєЄєсаа аааєааддеЕє аєсаадєсдад аааєсассає дадсдасдасєс о 240
ЄдааєссудЧдЕ дадааєддса ааадесеєсаєд сасєєсєсьссс садасьсдес саасаддсса 300 чдссаєстасудс ЄсдЕсаєсаа аассасесус аєсаассааа ссдесаєсеса Ессдоєдаєсу 360 сдссеєдадсу адасудаааса сдсдаєсусЕ дЕсаааадда саастасааа саддааєсда 420 аєдсаассудд сдсаддааса сеЕдссадсус аєсаасааса ЕЕсЕСасссуд ааєсаддаєба 480 гЕСЕЄСсСваає ассеЕддааєудд сЕдЕЕсЕеЕсСсс додддаєсодса дЕддЕдадса ассаєдсаєс 540 аєсаддадса сдодаєбаааасє дсесдасдудс сддаададдс асаааєрєсссу ЄсадссадеЕсє 600 бадеЕСсСЕдасс аєсеЕсаєссд баасаєсаєе ддсаасуста ссЕсвдссає дЕсСЕСсСадааа 6б6Оо саасессддс дсаєсдуддсе Есссарасаа Есдасадаєсе дссдсассвд аєеєдсссдас.о 720 аєсаєсдсда дсссаєстває асссасаєсаа аєсадсаєсс аєдеЕсодддаає Есааєсодсоод 780 ссгададсаа дасдеЕсеЕссс дЕєдаасаєд дсеЕсаєааса ссссеЕсудсбає сасеЕдеєеєсає 840
ЧдЕаадсадас адсеЕстаєсу єссаєдасса аааєсссева асдедадеЕсе ЕсуусеЕсСсасят 900 дадсдЕсада ссссубадаа аадаєсааад дассеЕссеЕсуд адасєссЕсьс сеЕсстдсдсуа 960 бааєсьдсьд сЕсСдсаааса аааааассас судстассадс дадасоЯдЕСЕдЕ Есддссодаєс 1020 аададсвасс аасеЕсСЕсЕеЕсеЕ ссдааддєаа сЕддсЕссад сададсдсад агассаааса 1080 сЕДЕССЕЕСсСЕ адеЕдЕадссу бадеваддсес ассасеєссаа даасеЕстьдра дсассдсста 1140 сабвассєсдс ЕсЕДСсСсааєс сеЕдеЕвассад ЕддсЕдсвдс садесддсдає аадесдеЕдес 1200
СгассодддЕє ддасесаада сдабадссас сддаєааддс дсадсддессу дассдаасоад 1260 чаддЕссдЕд сасасадссс адсеЕсддадс даасдассва сассдаассуд адасассвас 1320 адсдєдадсеЕ агдадааадс дссасдессЕесС ссдаадддад аааддсддас аддсаєссодд 1380 баадсддсад дассддааса ддададсдса судадддадсе Ессадддудада аасдсстЕддЕ 1440 аєсеЕєвсавад ЄссЕдЕСсСудду ЕЄЕСсСддссасс Єссдасеєєда дсдеЕСЯчавьрєє сеЕдЕЧЧаєсддсе 1500 сдЕсададдд дсододадсста бддааааасу ссадсаасудс ддссЕсееЕса суддЕсСсстдуа 1560
ССЕБЕСЕДССУ дссЄсЕСЕдсЕеЕ сасардеєєсе ЕсссеЕдсуєЕ ассссседає єсЕдеЕддава 1620 ассдбаєсас содсссЕсдад Єдадсєдавра ссдсєсдссуд садссдаасу ассдадсдса 1680 чдсдадеЕсадеЕ дадсдаддаа дсоддаададс дссеєдаєдсуд деавєєеєсьс сьсасудсаєс 1740 бдєдсоддває сЕСсасассдс ааєддбедсас ссссадсаса аєседссссу асдссдсавба 1800 дЕсаадссад басасасеєсс дсваєсдсста сдєдасьддд Єсаєддссдс дссссдасас 1860 ссдссаасас ссудсЕдасдс дссседасду дсЕбєдЕСЕдс Есссууддсаєс судсеЕвгасада 1920 саадседеЕда ссуєсеЕссдуд дадседсаєд ЕдеЕсададде ЕсЕСассудєс ассассддааа 1980 сдсдсдаддс адсєсдсуддба аадсесаєса дсдєддЕсСЯдЕ даадсдаєсеєс асадаєуєсе 2040 дссЕдеЕЕєсає ссдсдеЕссад сеЕСдЕсЄЧдадеі сЕСЕССадаа дсдЕсВаавде ссддСсСЕЕСтУЯ 2100 агбааадсдад ссаєдесєаад чдсодеЕсеЕеЕс ЕссЕдЕсЕсду єсаседаєдс сессдеЕдесаа 2160 чададаєєсес єдесЕеЕСаєдоауд ддаєааєдава ссдаєдааас дадададдає дсеЕСасддавба 2220 сддадєвассуд асєдаєдааса єдсссудЕса сєддаасучєЕ дсдадддсаа асаасєддсдд 2280 чЕаєддаєдс доасоддддасса дадаааааєс асссадддеЕс ааєдссадсу сєсаєдадсесс 2340 сдаадеддсуд адсссдаєсє Ессссаєсууд ЄдаєдеЕсуддс дагаєаддсд ссадсаассу 2400
Зо сассєдЕддс дссуддедаєд ссддссасда ЄдсдЕсСсддс дсададдаєс дадаєссаєе 2460 басдєєдаса ссаєсудааєсуд деЕдсаааасс СЕссдсддЕа Єддсаєдаєса дсдсссддаа 2520 чададеЕсаає Єсаддуєдає дааєдеЕдааа ссадсаасудє басасчдаєдЕеЕ сдсададтає 2580 чдссоддЕдЕсСЕ сеЕсаєсадас се Есссоус дЕддєдаасс аддссадсса сдЕсеЕСтддсу 2640 аааасдсддд ааааадсддда адсддсдаєд дсддадседа аєсасаєсьсс саассдсуаєуа 2700 дсасаасаас гддсодддсаа асадессдеЕєд сеєдаєсддсд Єсдссассес садестеддсесс 2760 сЕдсасдсдс сдЕсудсааає єдЕСЯдсддсуд аєсаааєсєс дсдссдаєса асеЕдддеЕдсс 2820 адсдєЕдадєда ЄдессдаєсддЕ адаасдаадс додсудєсдаад ссеЕдсааадс ддасоддеЕдсас 2880 ааєсєсєсьсд сдсаасдсдє садеддасьд аєсаєтсаасе аєссдссдда Едассаддає 2940 чдссаєєдсьд Єддаадседс сеєдсасеаає дЕсСсСсдддсуає басессесвда ЕдДдЕСЕСЕДЧас, 3000 садасассса Ссаасадсає бгасєеєссссс саєдаадасуд дсасдсдасе ддасдеддач 3060 саєссддеЕсу саєсдддеса ссадсаааєс дсодсЕдЕвад сдуддсссаєєе аадеЕеєсьдеЕс 3120
Есддсдсдєс Єдсуєссддс ЕддсеЕдодсає ааасгаєсьса сЕСудсааєса ааєссадссу 3180 асадсддаас доаодааддсда сеєддадедсс аєдеЕсСсддЕє сЕСсСаасааас саєсдсаааєд 3240 сЕдДдааєдаду дсаєсдеєсс сассдсдаєд сеЕддЕєдсса асдаєсадає ддсдсеєддас 3300 чдсааєдсдсд ссаєсассда дЕСсСодддасвд соудсуєєдаєд соодасасьсс доагадесдодада 3360 басдасдаба ссдаадасад сссаєдсває ассссдссує Саассассає сааасаддає 3420 вЕЄСсСдссвдс сддоддсааас садсдєддас сдссгдседс аасеЕсесьса дддссаддсу 3480 чЧЕдаадддса аєсадссдсЕ дсссудєссса сеЕддсдаааа дааааассас ссеЕддсеЕєда 3540 чаааєсаєаа аааасеєсасє єдсеєеєсудсда дсоддаєааса аєєсаєаанау асеЕсааєєтєдеЕ 3600 чадсддаєаа сааєсеєсаса саєстадааа СааєсеЕсдеЕє саасеесаауд ааддадаєває 3660 саєаєдаєса СЕСЕдЧдсСсЕЕ Едасаєссве доасаседнас ЕЄсдаєбасаєс бассдетраєс 3720 саддааєесс дсаасаааса аседдадеає асеєддседс Едасдаєсає дддсааасас 3780 чЧЕддааєєсвд аддаааєсас сааааєтасуд Єгасдссаєа ЕссЕдааадеі ЕсудсддЕДдаа 3840 чааєсдааде ЄЕдасудаада асеєдаасааа гддаадаасс Єдааадсдна Єдаадасасс 3900 ааасассеєва аададаєсєєсс ддаааєєдсс даадесесаєд сдсЕдЕсааа Едододадтаєе 3960 аасдаадєсда аасадсаєеєс ддаасдсєаає дддЕсасеЕсс ддрасьєсаа аддсаєстєсс 4020
Ессдсадааа дсдЕсааада дсасааассуд адсссдааад Єдсаєсаадса ссеЕсСсСєддає 4080 адсаєєсдудєд сдааадаадс сЕЕсСЕсддна сссадсаасу саєєсдчаєдеЕ даєсдддсудсеЕ 4140 аадааєдсьд деаєдсдеєєсс саєсеЕсвдеЕс аассдсаада асассасвдеЕ сдаєсстаєс 4200 часддаааас садасуєдає сдеЕсааєдас сЕСааададс Єдсаєдадеуд даєссеЕссддс 4260 басааасаас Есдадсасса ссассассас сасєдадаєс сддсеЕдссаа сааадсссда 4320 ааддаадсвд адсЕддсеЕдс Едссассдсс дадсааєсаас бадсаєаасс ссЕсддддсес 4380
Есєааасддд ЄСЕЕЧЧадудУ ЕЕЕЕссодсвд аааддаддаа срагаєссоду аєаваєес 4437
Claims (4)
1. Спосіб селективного гідролізу 5-енантіомеру альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І:
о в. тр он ХХ і Зо в якій Х являє собою бромід або хлорид, та Е являє собою алкільний ланцюг від 1 до 6 атомів вуглецю, при цьому зазначений алкільний ланцюг є лінійним або розгалуженим на атомах вуглецю у або б, який включає: - забезпечення рацемату К-енантіомеру та 5-енантіомеру зазначеної альфа-галогеналканової кислоти, - забезпечення поліпептиду, який має дегалогеназну активність, містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 1, - взаємодію рацемату протягом 1-8 годин, при цьому рН знаходиться в діапазоні від 9 до 10 та температура знаходиться в діапазоні від 15 до 35 "С для поліпептиду з дегалогеназною активністю, який містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 1, та де енантіомерний надлишок К-енантіомеру альфа-галогеналканової кислоти від 90,0 до 99,9 905 досягається через 1-8 годин, та де концентрація рацемату зазначеної альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І становить від 80 до 200 г/л, та поліпептид з дегалогеназною активністю міститься всередині цільних клітин.
2. Спосіб за п. 1, в якому співвідношення рацемату альфа-галогеналканової кислоти відповідно до формули І і біомаси з цільних клітин, яка містить поліпептид, який має дегалогеназну активність, містить амінокислотну послідовність, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 1, або послідовність із щонайменше 90 95 ідентичністю послідовності до зазначеної послідовності становить від 2:1 до 15:1, переважно від 3:1 до 10:1, найбільш переважно 4:1.
З. Спосіб за п. 1 або 2, в якому фрагмент К зазначеної альфа-галогеналканової кислоти формули !/ вибирають із групи, яка складається із етилу, бутилу, 2-метилпропілу та метилциклопропілу.
4. Спосіб за п. 1, в якому даний зазначений алкільний ланцюг є розгалуженим на атомах вуглецю у або б, та при цьому атоми вуглецю після розгалуження на атомах вуглецю у або б є циклічними. Конверсія з кпітинним лізатом - р ї ко їз Ж роя орннннннннниннинронннннннннннннннннннннно ОЖ ФоОо пня В В шк ж нн В Й : І о з 2 З « р. « чі . -Е Час годі я сетее ПОДаТКОВа ОСНОВа /- «ее ВвнАаНтТоМерний надлишок
Фіг. 1 і Вллив рН фо ї ХК мм КК КАК ку юю КК : 38 репо КА ДАК Как реетесчня РО яд бони фо их ша і і БІ 3 тре фея ТТ КТ і З В тт Пе ДУХ і а 5 то І ха 25 і Час год і мес ДН ВУ сер серій
Фіг. 2
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17193736.0A EP3461900A1 (en) | 2017-09-28 | 2017-09-28 | Method for the preparation of chiral alpha haloalkanoic acids |
| PCT/EP2018/075752 WO2019063463A2 (en) | 2017-09-28 | 2018-09-24 | PROCESS FOR PREPARING CHIRAL ALPHA HALOALCANOIC ACIDS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA128060C2 true UA128060C2 (uk) | 2024-03-27 |
Family
ID=60083756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA202002596A UA128060C2 (uk) | 2017-09-28 | 2018-09-24 | Спосіб отримання хіральних альфа-галогеналканових кислот |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11053518B2 (uk) |
| EP (3) | EP3461900A1 (uk) |
| JP (2) | JP2020536523A (uk) |
| KR (2) | KR20200060388A (uk) |
| CN (1) | CN111094578A (uk) |
| AR (1) | AR113146A1 (uk) |
| AU (1) | AU2018340299B2 (uk) |
| BR (1) | BR112020006680A2 (uk) |
| CA (1) | CA3076687A1 (uk) |
| CL (2) | CL2020000802A1 (uk) |
| CO (1) | CO2020003870A2 (uk) |
| IL (1) | IL273513B1 (uk) |
| JO (1) | JOP20200066A1 (uk) |
| MX (1) | MX2020003729A (uk) |
| PE (1) | PE20201413A1 (uk) |
| SG (1) | SG11202002476UA (uk) |
| TW (1) | TWI799450B (uk) |
| UA (1) | UA128060C2 (uk) |
| UY (1) | UY37908A (uk) |
| WO (1) | WO2019063463A2 (uk) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5931690A (ja) * | 1982-08-11 | 1984-02-20 | Unitika Ltd | 光学活性乳酸の製造方法 |
| ATE87329T1 (de) * | 1984-10-25 | 1993-04-15 | Ici Plc | Enzyme. |
| US5154738A (en) | 1989-09-12 | 1992-10-13 | Advanced Separation Technologies, Inc. | Chiral separation media |
| JPH04325096A (ja) * | 1991-04-25 | 1992-11-13 | Maruzen Petrochem Co Ltd | （Ｒ）−２−ハロプロピオン酸および（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪酸の製造法 |
| CN103509778B (zh) * | 2012-06-28 | 2016-04-13 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种卤代酸脱卤酶的提取纯化方法 |
| CN107022556B (zh) * | 2017-03-29 | 2019-10-29 | 中山大学 | 一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法 |
-
2017
- 2017-09-28 EP EP17193736.0A patent/EP3461900A1/en not_active Withdrawn
-
2018
- 2018-08-24 JO JOP/2020/0066A patent/JOP20200066A1/ar unknown
- 2018-09-24 AU AU2018340299A patent/AU2018340299B2/en active Active
- 2018-09-24 JP JP2020518058A patent/JP2020536523A/ja active Pending
- 2018-09-24 UA UAA202002596A patent/UA128060C2/uk unknown
- 2018-09-24 CN CN201880062738.7A patent/CN111094578A/zh active Pending
- 2018-09-24 KR KR1020207008606A patent/KR20200060388A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-09-24 BR BR112020006680-0A patent/BR112020006680A2/pt unknown
- 2018-09-24 PE PE2020000456A patent/PE20201413A1/es unknown
- 2018-09-24 SG SG11202002476UA patent/SG11202002476UA/en unknown
- 2018-09-24 US US16/650,311 patent/US11053518B2/en active Active
- 2018-09-24 KR KR1020237028235A patent/KR20230128132A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-09-24 EP EP20192655.7A patent/EP3786300A1/en active Pending
- 2018-09-24 CA CA3076687A patent/CA3076687A1/en active Pending
- 2018-09-24 EP EP18769741.2A patent/EP3688178A2/en active Pending
- 2018-09-24 IL IL273513A patent/IL273513B1/en unknown
- 2018-09-24 MX MX2020003729A patent/MX2020003729A/es unknown
- 2018-09-24 WO PCT/EP2018/075752 patent/WO2019063463A2/en unknown
- 2018-09-26 TW TW107133740A patent/TWI799450B/zh active
- 2018-09-28 AR ARP180102794A patent/AR113146A1/es unknown
- 2018-09-28 UY UY0001037908A patent/UY37908A/es not_active Application Discontinuation
-
2020
- 2020-03-27 CL CL2020000802A patent/CL2020000802A1/es unknown
- 2020-03-30 CO CONC2020/0003870A patent/CO2020003870A2/es unknown
-
2021
- 2021-08-04 CL CL2021002058A patent/CL2021002058A1/es unknown
-
2023
- 2023-04-24 JP JP2023071092A patent/JP2023093674A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112020006680A2 (pt) | 2020-10-06 |
| TW201920057A (zh) | 2019-06-01 |
| EP3461900A1 (en) | 2019-04-03 |
| RU2020114761A3 (uk) | 2022-04-01 |
| CO2020003870A2 (es) | 2020-04-24 |
| UY37908A (es) | 2019-04-30 |
| WO2019063463A2 (en) | 2019-04-04 |
| JP2023093674A (ja) | 2023-07-04 |
| AU2018340299B2 (en) | 2023-10-19 |
| EP3786300A1 (en) | 2021-03-03 |
| AR113146A1 (es) | 2020-01-29 |
| PE20201413A1 (es) | 2020-12-07 |
| KR20230128132A (ko) | 2023-09-01 |
| JP2020536523A (ja) | 2020-12-17 |
| US20200277633A1 (en) | 2020-09-03 |
| JOP20200066A1 (ar) | 2020-04-27 |
| TWI799450B (zh) | 2023-04-21 |
| AU2018340299A1 (en) | 2020-03-19 |
| RU2020114761A (ru) | 2021-10-28 |
| US11053518B2 (en) | 2021-07-06 |
| IL273513A (en) | 2020-05-31 |
| CL2021002058A1 (es) | 2022-02-25 |
| SG11202002476UA (en) | 2020-04-29 |
| CL2020000802A1 (es) | 2020-09-21 |
| WO2019063463A3 (en) | 2019-05-02 |
| MX2020003729A (es) | 2020-08-03 |
| EP3688178A2 (en) | 2020-08-05 |
| IL273513B1 (en) | 2024-05-01 |
| CN111094578A (zh) | 2020-05-01 |
| CA3076687A1 (en) | 2019-04-04 |
| KR20200060388A (ko) | 2020-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20170073713A1 (en) | Transaminase and uses thereof | |
| JP5903298B2 (ja) | Ｎ−サクシニル−ｄｌ−アミノ酸に対する向上されたｄ体選択性を有する改変型ｄ−サクシニラーゼ | |
| UA128060C2 (uk) | Спосіб отримання хіральних альфа-галогеналканових кислот | |
| CN101636497B (zh) | 改良型卤代醇环氧酶 | |
| CN111918969A (zh) | 新型水解酶和利用该酶的(1s,2s)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷羧酸的制造方法 | |
| JP7461652B2 (ja) | 化合物ライブラリー及び化合物ライブラリーの製造方法 | |
| US20200370080A1 (en) | Enantionselective enzymatic sulfoxidation of chiral arylsulfides | |
| JP5175845B2 (ja) | 光学活性１，２−ジオール類の製造に用いられる不斉酸化酵素 | |
| JP5119783B2 (ja) | Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子 | |
| JP3701292B2 (ja) | 翻訳効率制御活性を有するヌクレオチド配列及びその利用 | |
| JP2012090537A (ja) | 改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ | |
| US11236345B2 (en) | Methods of modulating nucleic acid stability and protein expression | |
| KR20220008755A (ko) | 이산화탄소와 개미산만으로 성장 가능한 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 유용물질을 제조하는 방법 | |
| JP2012228221A (ja) | 改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ | |
| CN118076731A (en) | Systems, compositions and methods involving retrotransposons and functional fragments thereof | |
| KR100755727B1 (ko) | β-갈락토시다제 유래의 융합 단편 펩타이드 및 이를 융합파트너로 이용하는 재조합 단백질의 제조방법 | |
| JPWO2008129873A1 (ja) | Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ、これをコードするＤＮＡ及び（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法並びに（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法 | |
| EA013412B1 (ru) | Новый ген sms 27 | |
| JP2015139426A (ja) | 新規β−アミノ酸の製造方法 | |
| JP2006158209A (ja) | バチルス・サチルス由来のエポキシドハイドロラーゼを発現する微生物およびそれを用いたエポキシドハイドロラーゼの製造方法 | |
| JP2011004738A (ja) | 改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ | |
| JP2007204421A (ja) | ビカルタミドおよびそのアナログの製造方法 |