JP2006158209A - バチルス・サチルス由来のエポキシドハイドロラーゼを発現する微生物およびそれを用いたエポキシドハイドロラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 微生物において工業化可能なレベルのエポキシドハイドロラーゼ（ＥＨ）を発現させる方法、およびＥＨを安定化させる方法を提供すること。
【解決手段】 本発明は、微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養する工程を含む、エポキシドハイドロラーゼの活性が高められた微生物の製造方法を提供する。１つの実施態様では、このエポキシドハイドロラーゼは、バチルス・サチルス由来である。本発明はまた、固定化エポキシドハイドロラーゼの製造方法を提供し、該方法は、エポキシド加水分解活性を有する微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養する工程、および得られた培養物を固定化および／または乾燥させる工程を含む。この方法により得られる固定化エポキシドハイドロラーゼは、保存性に優れかつ操作性が高い。
【選択図】 なし

Description

本発明は、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）由来のエポキシドハイドロラーゼに関する。より詳細には、バチルス・サチルス由来のエポキシドハイドロラーゼを発現する形質転換微生物および該微生物を用いたバチルス・サチルス由来のエポキシドハイドロラーゼの製造方法に関する。

加水分解酵素の一種であるエポキシドハイドロラーゼ（ＥＨ：EC 3.3.2.3）は、エポキシド（酸素を含む三員環）を加水分解して、１，２−ジオールを生成する。エポキシドは、その構造にひずみがあるため反応性が高い。例えば、生体内では、エポキシドがアルキル化剤として作用し得るため、ＤＮＡやタンパク質などの生体高分子がアルキル化されて、変異原性、発がん性、細胞毒性などを示す。ＥＨは、このような生体内で過度に酸化されて生じた有害なエポキシド化合物を、より反応性が低くかつ水溶性であるジオールへと変換することによって、エポキシド化合物の代謝あるいは体外への排泄を促進する。このように、ＥＨは、生体防御にかかわる機能を有している。

ＥＨは、微生物中にも存在することが知られており、その性質が検討されている（特許文献１、非特許文献１〜８）。これらの報告では、ＥＨはモノマー酵素が多く、中性〜弱アルカリ性領域に至適ｐＨを有するものが多い。一般的に、ＥＨは、酵素反応の至適温度が低く、酵素自体の安定性はあまり高くないようである。さらに、ＥＨの遺伝子がクローニングされている（特許文献１、非特許文献３、９〜１１）。

ところで、ＥＨをラセミ体のエポキシドに作用させて一方の鏡像体を立体選択的に加水分解させることができれば、光学活性な１，２−ジオールおよびエポキシドを得ることができる。これらの化合物はともにキラルビルディングブロックとして有用な化合物となり得る。そのため、例えば、糸状菌の一種であるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）によるスチレンオキシドの加水分解や、放線菌の一種であるロドコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）による脂肪族および芳香族エポキシドの加水分解により、光学活性なジオールあるいはエポキシドを得ることが試みられている（特許文献２）。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来ＥＨに関しては、Ｘ線結晶構造解析によって蛋白質の高次構造が解明されており、触媒部位の同定や部位特異的突然変異による立体選択性の向上も検討されている（特許文献２および非特許文献１２）。さらに、抗真菌薬合成を目指した応用検討も試みられている（非特許文献１３および１４）。これらの反応に用いられるＥＨは、それぞれアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）および大腸菌（Escherichia coli）を宿主とした遺伝子組換えによって大量生産されており、試薬として市販されている。しかし、その価格は非常に高価であり、工業的な使用には適切とはいえない。
国際公開第９９／２１９７２号パンフレット 国際公開第００／６８３９４号パンフレット モリッシー，シー．（Ｍｏｒｉｓｓｅａｕ，Ｃ．）ら，「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」，１９９９年，２６３巻，３８６頁 クロネンバーグ，エヌ．エイ．イー．（Ｋｒｏｎｅｎｂｕｒｇ，Ｎ．Ａ．Ｅ．）ら，「バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，１９９９年，２１巻，５１９頁 リンク，アール．（Ｒｉｎｋ，Ｒ．）ら，「ジャーナル・オブ・モレキュラー・カタリスト・ビー：エンザイム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍ．）」，２０００年，１０巻，５３９頁 クロウティル，ダブリュー．（Ｋｒｏｕｔｉｌ，Ｗ．）ら，「ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，１９９８年，６１巻，１４３頁 ミシッツ，エム．（Ｍｉｓｃｈｉｔｚ，Ｍ．）ら，「バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，１９９５年，１９巻，８９３頁 ファン デル ウェルフ，エム．ジェイ．（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｅｒｆ，Ｍ．Ｊ．）ら，「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」，１９９８年，１０８巻，５０５２頁 ナカムラ，ティー．（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．）ら，「アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，１９９４年，６０巻，４６３０頁 ミサワ，イー．（Ｍｉｓａｗａ，Ｅ．）ら，「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」，１９９８年，２５３巻，１７３頁 アランド，エム．（Ａｒａｎｄ，Ｍ．）ら，「バイオケミストリー・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）」，１９９９年，２４４巻，２７３頁 ヴィセル，エイチ．（Ｖｉｓｓｅｒ，Ｈ．）ら，「アプライド・マイクロバイアル・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，２０００年，５３巻，４１５頁 ヴィセル，エイチ．（Ｖｉｓｓｅｒ，Ｈ．）ら，「アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，１９９９年，６５巻，５１５９頁 ジニュー，ゼット．（Ｊｉｎｙｕ，Ｚ．）ら，「ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」，２０００年，８巻，１１１頁 モンフォート，エヌ．（Ｍｏｎｆｏｒｔ，Ｎ．）ら，「テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）」，２００４年，６０巻，６０１頁 モンフォート，エヌ．（Ｍｏｎｆｏｒｔ，Ｎ．）ら，「テトラヘドロン：アシンメトリー（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）」，２００２年，１３巻，２３９９頁

本発明は、微生物において工業化可能なレベルのＥＨを発現させる方法、およびＥＨを安定化させる方法を提供することを目的とする。

本発明は、微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養する工程を含む、エポキシドハイドロラーゼの活性が高められた微生物の製造方法を提供する。

１つの実施態様では、上記エポキシドハイドロラーゼは、バチルス・サチルス由来である。

他の実施態様では、上記微生物はバチルス属細菌である。

さらなる実施態様では、上記微生物は組換え微生物であって、該微生物において、上記エポキシドハイドロラーゼをコードする構造遺伝子の上流に、アミラーゼプロモーターまたはエポキシドハイドロラーゼプロモーターが挿入されている。

本発明はまた、微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養する工程を含む、微生物のエポキシドハイドロラーゼ活性を増強する方法を提供する。

本発明はさらに、微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養する工程、および得られた培養物からエポキシドハイドロラーゼを回収する工程を含む、エポキシドハイドロラーゼの製造方法を提供する。

本発明はまた、エポキシド加水分解活性を有する微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養する工程、および得られた培養物を固定化および／または乾燥させる工程を含む、固定化エポキシドハイドロラーゼの製造方法を提供する。

本発明はさらに、上記の固定化エポキシドハイドロラーゼの製造方法によって製造される、エポキシドハイドロラーゼ剤を提供する。

本発明の方法によれば、ＥＨの高発現株を育種することができる。また、本発明によれば、高活性かつ高立体選択的なＥＨ活性を有する微生物が提供され、さらに、このような高いＥＨ活性を有する微生物を固定化することによって、保存性に優れかつ操作性が高い生体触媒として、反復使用が可能になる。

本発明のＥＨの活性が高められた微生物の製造方法によれば、微生物は、４〜２０w/v％の濃度のデンプン含有培地で培養することによって、より高いエポキシド加水分解活性を示すようになる。このような微生物は、当業者が通常用いる培地で培養した場合よりも、エポキシド加水分解活性が少なくとも１．５倍以上、例えば２倍〜数百倍まで増強され得る。これは、４〜２０w/v％の濃度のデンプン含有培地で培養した場合、微生物におけるＥＨの発現量が増加するためと思われる。例えば、以下で説明するような適切なプロモーター（例えば、アミラーゼプロモーター）が組み込まれている組換え微生物（形質転換体）では、このような操作が行われていない微生物と比べて数十倍〜数百倍もの活性を提示し得る。

培地中のデンプンの濃度は、８〜１２w/v％であってもよい。ここで、デンプン含有培地とは、当業者が微生物の培養に通常用いる培地よりも、デンプンを豊富に含有する培養培地をいう。培地に含有されるデンプンは、どのような由来のものであってもよい。培地中でのデンプンの糊化を防止する目的で、予め液化したデンプンを用いてもよい。デンプンの液化は、当業者に公知の方法（例えば、α−アミラーゼで処理する方法、酸加水分解）によって行われ得る。なお、培養温度は、通常約３０〜３７℃であり得る。

上記微生物の種および属は特に限定されない。微生物は、細菌であってもよく、酵母であってもよい。一般的に、多くのバチルス属細菌が高いエポキシド加水分解活性を有するため、本発明の１つの実施態様では、この微生物はバチルス（Bacillus）属細菌であり得る。

上記微生物は、野生株であってもよく、あるいは組換え微生物であってもよい。組換え微生物である場合、宿主の種および属は特に限定されず、当業者によって適宜選択され得る。例えば、バチルス（Bacillus）属細菌、大腸菌（E. coli）などが挙げられる。組換え微生物には、必要に応じて、適切なＥＨやプロモーターなどが組み込まれ得る。

本発明において、微生物で発現されるＥＨは、微生物が本来有するＥＨであってもよく、あるいは組換えによって挿入されたＥＨであってもよい。ＥＨの由来は特に限定されず、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）由来である。エポキシド加水分解活性を発揮し得るならば、ＥＨは改変体または誘導体であってもよい。ここで、「改変体」とは、天然のＥＨと、少なくとも７０、または少なくとも８０、あるいは少なくとも９０パーセントのアミノ酸配列相同性を有し、かつＥＨ活性を有するタンパク質をいう。例えば、天然のＥＨにおいて、１以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するタンパク質が挙げられる。「誘導体」とは、天然のＥＨと他のペプチドとの融合タンパク質をいう。融合される他のペプチドは、ＥＨの基本的な折りたたみおよびコンホメーション構造を妨害しない。

本発明においては、ＥＨをより大量に発現させる目的で、天然または組み込まれたＥＨをコードする構造遺伝子の上流に、ＥＨの発現に適切なプロモーターが組み込まれていてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーターあるいは任意の長さに調節されていてもよいＥＨプロモーターなどが挙げられる。さらに、プロモーター以外に、エンハンサー、ターミネーターなどの他の発現調節因子が組み込まれていてもよい。これらの発現調節因子が挿入された場合、これらの因子の作用をさらに増強するために、微生物の培養培地には発現調節因子に応じて適切な成分が添加され得る。

本発明のＥＨの製造方法によれば、上記のＥＨを有する微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養した後、得られた培養物からＥＨを回収することができる。この方法によれば、微生物中で発現しているＥＨの量が多いため、より効率的にＥＨを製造することができる。ＥＨの回収は、例えば、次のように行われ得る。培養液中の菌体を、ビードビーター処理または超音波処理などによって破砕し、次いで遠心分離などによって不溶物を除去して、ＥＨの粗酵素液が得られ得る。この粗酵素液から、さらにカラムクロマトグラフィーなどの当業者が通常用いる手段によって、ＥＨを精製または単離することができる。

上記の本発明の方法によって微生物において高発現されたＥＨは、菌体中に固定されてもよい（ＥＨ固定菌体）。ＥＨを菌体中に固定するための手段としては、例えば、固定化剤を用いて固定化する手段、乾燥させる手段、固定化した後乾燥させる手段が挙げられる。各手段によって得られるＥＨ固定菌体を、以下、それぞれ固定化菌体、乾燥菌体、固定化乾燥菌体という。

固定化菌体は、例えば、アクリルアミド、カラギーナン、アルギン酸カルシウムなどの固定化剤を用いる包括法によって調製され得る。固定化菌体は、ポリエチレンイミンとグルタルアルデヒドとの組み合わせまたはヘキサメチレンジアミンとグルタルアルデヒドとの組み合わせを用いてさらに架橋処理することによって、さらに安定化することもできる。

乾燥菌体は、菌体を含む培養液を、凍結乾燥、風乾、アセトン乾燥などによって乾燥させることによって調製され得る。乾燥菌体を調製する場合、安定性を向上させる目的で、培養液に２０w/v％となるようにグリセロールを添加して乾燥させてもよい。

固定化乾燥菌体は、当業者が通常用いる手段を用いて、固定化菌体を乾燥させることによって調製され得る。

このようにして調製されたＥＨ固定菌体は、エポキシドの加水分解反応における触媒、すなわちエポキシドハイドロラーゼ剤として使用され得る。従来のＥＨ剤は、酵素を粗精製または精製して製造された酵素剤であったが、本発明のＥＨ剤は、ＥＨを精製することなく非常に簡便に調製され得る。しかも、精製酵素と比較してＥＨの活性が長期間保持され得、さらに取り扱いも容易である。特に、固定化乾燥菌体は、室温での保存も可能であり、かつ反復使用が可能である。例えば、エポキシド加水分解反応に少なくとも１０回繰り返して使用しても、固定化乾燥菌体の活性の低下は認められない。

上記のエポキシド加水分解活性が増強された微生物、該微生物に由来するＥＨ、またはＥＨ剤をエポキシドのラセミ体に作用させることにより、例えば、以下に示すような反応が進行する。

上記の微生物、ＥＨ、またはＥＨ剤によって、エポキシドのラセミ体の一方の鏡像体のみが加水分解を受ける。そのため、加水分解によって光学活性なジオールが生じ、そして加水分解されなかった（酵素の作用を受けなかった）もう一方の鏡像体であるエポキシドが残存する。

この反応工程は、具体的には、適切な緩衝液または培地に微生物またはＥＨを添加し、さらにエポキシドのラセミ体を添加して、攪拌または振盪することによって行われる。この工程における反応液中の基質（エポキシド）濃度および菌体量またはＥＨ量は、適宜決定され得る。使用する微生物、ＥＨ、またはＥＨ剤は、単独で用いてもよく、あるいは数種の微生物または異なる起源のＥＨを混合して用いてもよい。また、通常、反応液の至適ｐＨは約６．５〜８．０であり、そして反応温度は約３０〜３７℃である。反応時間は特に制限されず、通常は少なくとも５分であり、３０分〜９６時間であってもよく、３〜７２時間であってもよく、あるいは６〜４８時間であってもよい。

次いで、上記の酵素反応液から目的の光学活性な化合物が回収され得る。ここで、目的の光学活性な化合物とは、光学活性なエポキシドまたは光学活性なジオールである。上記の酵素を作用させる工程においては、上記の微生物またはＥＨによってエポキシドのラセミ体の一方の鏡像体のみが立体選択的に（立体保持で）加水分解される。そのため、酵素反応液中には加水分解によって生じた光学活性なジオールと加水分解されなかった光学活性なエポキシドとが存在し得るので、目的に応じて、エポキシドまたはジオールを当業者が通常用いる適切な手段によって回収する。具体的には、酵素反応液に適切な有機溶媒を加えてエポキシドおよびジオールを有機層に抽出し、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどに供することによって、これらを分離してそれぞれ回収できる。

あるいは、目的の光学活性な化合物として、光学活性なジオールのみを得ることができる。この場合、ラセミ体に上記の微生物、ＥＨ、またはＥＨ剤を作用させた後、得られた酵素反応液を酸処理する。この酸処理工程では、酵素の作用を受けなかった残留エポキシドを酸性条件下で立体反転を伴って加水分解させる。この酸処理で生成したジオールは、立体反転により、先の酵素作用により生じたジオールと同一の絶対配置を有する。したがって、以下の反応式に示すように、酵素反応液を酸処理することによって、エポキシドのラセミ体から、光学活性なジオールが得られる。

ここで、酸処理に用いられる酸は、無機酸であり得、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸などが挙げられる。反応液中の酸の濃度は、特に限定されないが、通常約０．１Ｍであり得る。次いで、生成した光学活性なジオールは、例えば、上記酸処理反応液にアルカリ性溶液を添加して中和した後、上述のように適切な有機溶媒で抽出することによって回収することができる。

（調製例１）２−ベンジルオキシメチル−２−メチルオキシラン（エポキシド１）の調製

氷浴で冷却した１Ｌの四つ口フラスコに水素化ナトリウム（１２．２１ｇ，３０５ｍｍｏｌ、ヘキサン洗浄）および無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）を入れ、マグネチックスターラーで攪拌しながら、無水ＤＭＦ（９０ｍｌ）に溶解したベンジルアルコール（３０．０ｇ，２７７ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応混合物を１．５時間攪拌（氷冷〜室温）した後に、再度氷冷し、ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解した３−クロロ−２−メチルプロペン（３０．１４ｇ，３３３ｍｍｏｌ）を滴下した。室温にて１６時間攪拌後、氷冷しながら水をゆっくりと添加した。ヘキサンを加えて攪拌後、有機層を回収して、有機層を水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮して、４５．３ｇの（２−メチルアリロキシメチル）−ベンゼンを得た（無色透明液体、収率１００．８％）。

次いで、３００Ｌの四つ口フラスコに、得られた（２−メチルアリロキシメチル）−ベンゼン（４０．０ｇ，２４７ｍｍｏｌ）を入れ、アセトニトリル（２０ｍｌ）およびメタノール（１００ｍｌ）に溶解させた。さらに、炭酸水素カリウム（７．４１ｇ，７４ ｍｍｏｌ）を過酸化水素水（３０％水溶液、５６ｇ，４９４ｍｍｏｌ）に溶解して滴下した。途中、二層に分離したため、アセトニトリルを加えた。室温で攪拌しながらＴＬＣで反応の進行を追跡した。なお、ＴＬＣの分析条件は、展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１０：１、および、Ｒｆ値：（２−メチルアリロキシメチル）−ベンゼン＝０．６；エポキシド＝０．３であった。途中で反応が停止したため、さらに過酸化水素水（７０ｇ，６２１ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加した。５日間攪拌を続け、原料がほぼ消失したことをＴＬＣにて確認し、減圧濃縮にて有機溶媒を留去した。ヘキサンを加えて有機層を回収し、チオ硫酸ナトリウム水溶液、水、次いで飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮して、３９．７６ｇの２−ベンジルオキシメチル−２−メチルオキシラン（エポキシド１）を得た（無色透明液体、収率９０．３％）。

^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：１．４０（３Ｈ，ｓ，２−Ｍｅ），２．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ４．８，１−Ｈ），２．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ４．８，１−Ｈ），３．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ１０．８，３−Ｈ），３．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ１０．８，３−Ｈ），４．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ１２．０，ＯＣＨＨＰｈ），４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ１２．０，ＯＣＨＨＰｈ），７．３４（５Ｈ，ｓ，Ｐｈ）。

なお、得られたエポキシド１のＨＰＬＣ分析条件は、以下のとおりである：
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ．（250mm×4.6mmI.D.、ダイセル製）
カラム温度：１８℃
溶離液：ヘキサン／ジグライム＝９８／２
流量：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
保持時間：Ｒ体＝２１．７分、Ｓ体＝２５．５分。

（調製例２）２−ベンジルオキシ−２−メチルプロパン−１，２−ジオール（ジオール１ｂ）の調製
５０ｍｌの三つ口フラスコにＴＨＦ（５ｍｌ）とエポキシド１（１．０ｇ，５．６ｍｍｏｌ）とを入れ、マグネチックスターラーで攪拌しながら水（１ｍｌ）を少しずつ添加した。続いて濃硫酸（７．５μｌ，Ｈ^＋として５ｍｏｌ％）を加えて６日間室温で攪拌した。ＴＬＣにて反応の進行を追跡した。なお、ＴＬＣの分析条件は、展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２：１、および、Ｒｆ値：エポキシド＝０．７；ジオール＝０．１であった。炭酸水素ナトリウム水溶液で中和後、酢酸エチルを加えて有機層を回収した。その後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後に減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１〜１：１）で精製を行って、５５９ｍｇの３−ベンジルオキシ−２−メチルプロパン−１，２−ジオール（ジオール１ｂ）を得た（無色透明液体、収率５０．９％）。

なお、エポキシド１および得られたジオール１ｂのＨＰＬＣ分析条件は、以下のとおりである：
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ．（250mm×4.6mmI.D.、ダイセル製）
カラム温度：１８℃
溶離液：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．７５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
保持時間：エポキシド１＝６．０分、Ｒ−ジオール１ｂ＝１３．６分、Ｓ−ジオール１ｂ＝１４．８分。

（調製例３）２−（４−メトキシフェノキシメチル）−２−メチルオキシラン（エポキシド２）の調製

１Ｌの四つ口フラスコにｐ−メトキシフェノール（３６．６ｇ，２９５ｍｍｏｌ）を入れ、ＤＭＦに溶解させた。さらに炭酸カリウム４４．８ｇ，３２４ｍｍｏｌを加えて攪拌を続けたところ、無色透明から赤紫色に変色した。続いてＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解した３−クロロ−２−メチルプロペン（３２．０４ｇ，３５４ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１日間攪拌した。ヘキサンを加えて有機層を回収し、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、水、および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧濃縮して、３４．３ｇの１−メトキシ−４−（２−メチルアリロキシ）ベンゼンを得た（無色透明針状結晶、融点約３７℃、収率６５．３％）。

次いで、０．５Ｌの四つ口フラスコに、得られた１−メトキシ−４−（２−メチルアリロキシ）ベンゼン（３１．０ｇ，１７４ｍｍｏｌ）を入れ、アセトニトリル（１００ｍｌ）およびメタノール（６０ｍｌ）を加えて溶解させた。次いで、炭酸水素カリウム（５．２２ｇ，５２ｍｍｏｌ）を水（１０ｍｌ）に溶解し、過酸化水素水（３０％水溶液、５９．２ｇ，５２２ｍｍｏｌ）と混合し、これを上記の溶液に滴下した。途中、ＴＬＣで反応の進行をモニターした。なお、ＴＬＣの分析条件は、展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１０：１、および、Ｒｆ値：１−メトキシ−４−（２−メチルアリロキシ）ベンゼン＝０．２５；エポキシド＝０．５であった。反応を促進させるために過酸化水素（１００ｇ，８８１ｍｍｏｌ）および炭酸水素カリウム（１．７３ｇ，１７．３ｍｍｏｌ）を分割添加しながら攪拌を続けた。８日後に減圧濃縮にて有機溶媒を留去し、ヘキサンを加えて有機層を回収し、洗浄および乾燥した後、減圧濃縮して、２４．８ｇの２−（４−メトキシフェノキシメチル）−２−メチルオキシラン（エポキシド２）を得た（淡黄色固体、収率７３．３％）。

^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：１．４７（３Ｈ，ｓ，２−Ｍｅ），２．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ５．６，１−Ｈ），２．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ５．２，１−Ｈ），３．７６（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ１０．８，３−Ｈ），３．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ１０．８，３−Ｈ），７．３４（５Ｈ，ｓ，Ｐｈ）。

（調製例４）３−（４−メトキシフェノキシ）−２−メチルプロパン−１，２−ジオール（ジオール２ｂ）の調製
エポキシド１の代わりに上記調製例３で得られたエポキシド２用いたこと以外は、上記調製例２と同様に操作を行って、７６５ｍｇの３−（４−メトキシフェノキシ）−２−メチルプロパン−１，２−ジオール（ジオール２ｂ）を得た（白色結晶、収率７０．０％）。

なお、エポキシド２および得られたジオール２ｂのＨＰＬＣ分析条件は、以下のとおりである：
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ
カラム温度：４０℃
溶離液：ヘキサン／イソプロパノール＝９９／１〜９１／９
流量：１ｍｌ／分
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
保持時間：エポキシド２＝４．６および５．３分、ジオール２ｂ＝２２．０および２３．７分。

（調製例５）２−メチル−２−フェネチルオキシラン（エポキシド３）の調製

氷浴で冷却した３００Ｌの三つ口フラスコに水素化ナトリウム（２．４ｇ，６０ｍｍｏｌ）、無水ＴＨＦ（２５ｍｌ）、および無水ＤＭＳＯ（１０ｍｌ）を入れ、マグネチックスターラーで攪拌した。次いでＤＭＳＯ（９０ｍｌ）に溶解したトリメチススルホキソニウムヨージド（１３．２ｇ，６０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した（水素ガスが発生した）。滴下終了後、約５０分攪拌した後に、ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）に溶解した４−フェニル−２−ブタノン（７．４１ｇ，５０ｍｍｏｌ）を滴下した。約５時間攪拌後（氷冷→室温）、ゆっくりと水を添加した。石油エーテルを加えて有機層を回収し、水および飽和食塩水で洗浄後、炭酸ナトリウムで乾燥させた。減圧濃縮し、６．９ｇの２−メチル−２−フェネチルオキシラン（エポキシド３）を得た（無色透明液体、収率８５．１％）。

（調製例６）２−メチル−４−フェニルブタン−１，２−ジオール（ジオール３ｂ）の調製
１００ｍｌのナスフラスコにＴＨＦ（６ｍｌ）およびエポキシド３（１．０ｇ，６．２ｍｍｏｌ）を入れ、マグネチックスターラーで攪拌しながら水を少しずつ添加した。水を２ｍｌ添加したところで白濁が見られたため、濃硫酸（８．３μｌ，Ｈ^＋で５ｍｏｌ％）を加えて４時間室温で攪拌した。炭酸ナトリウム水溶液で中和した後、減圧濃縮し、酢酸エチルを加えて有機層を回収した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、炭酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して、１．０１ｇの２−メチル−４−フェニルブタン−１，２−ジオール（ジオール３ｂ）を得た（無色透明液体、収率９０．９％）。

ＴＬＣの分析条件
展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝５：１
Ｒｆ値：エポキシド３＝０．８、ジオール３ｂ＝０．０９
ＨＰＬＣの分析条件
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ
カラム温度：４０℃
溶離液：ヘキサン／イソプロパノール＝９５／５〜８３／１７（３０分）
流量：１．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
保持時間：エポキシド３＝４．８および５．５分、ジオール３ｂ＝２２．４および２６．０分。

（実験例１）B. subtilis 168株を用いたエポキシド加水分解反応の検討
Bacillus subtilisは、高いエポキシド加水分解活性を有する株が多い。そこで、ゲノム解読株であり、B. subtilisのモデル株であるB. subtilis 168株を用いて、３種類のエポキシド１〜３の加水分解能を以下のように評価した。

ＬＢ培地（ペプトン：１０ｇ／Ｌ、酵母エキス：５ｇ／Ｌ、NaCl：５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）にて終夜培養したB. subtilis 168株（B. subtilis JCM10629；独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室から購入）を約１５倍濃縮し、ｐＨ６〜９の種々の緩衝液（ｐＨ６：酢酸緩衝液、ｐＨ７：リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８および９：トリス塩酸緩衝液）に再懸濁した。菌液１００μｌを２ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れた。次いで、２μｌのエポキシド１〜３を添加して３０℃で激しく攪拌した（基質濃度１．７％）。４８時間経過後、酢酸エチル２５０μｌを添加して反応を停止させ、さらに３０分攪拌した。酢酸エチル層を回収し、ＨＰＬＣ分析を行った。結果を表１に示す。

表中のＥ値（エナンチオ比）は、Ｓｈｉらの方法（Ｃｈｅｎ，Ｃ−Ｓ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８２年，１０４巻，７２９４頁）に従って、基質（エポキシド）および生成物（ジオール）のＥｅ（エナンチオマー過剰率）から、または変換率および生成物のＥｅから、以下の計算式に従って算出した。

エポキシド１〜３はいずれにおいても、B. subtilis 168株により、立体選択的に加水分解された。エポキシド１および２を基質とした場合には、反応開始から６時間後には、残存するエポキシドの光学純度はほぼ１００％に達した。特に、エポキシド１は、これまでで最も高いＥ値（２１１）を与えたことから、B. subtilis168株は、反応性、立体選択性ともにすぐれたＥＨ活性を有していることが明らかになった。エポキシド１および２を用いて、異なるｐＨの緩衝液中で反応させた結果、ｐＨ８の場合に加水分解が高かった。なお、並行して行ったコントロール実験では、ｐＨ６では非酵素的な加水分解が認められた。

次いで、ＬＢ培地にて終夜培養したB. subtilis 168株を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に再懸濁した。菌液（１０ｍｌ）をポリプロピレンチューブ（１５ｍｌ容）に入れ、エポキシド１および２を各０．２ｇ添加し（基質終濃度２％）、３０℃で振盪した。途中、０．２ｍｌずつサンプリングを行い、反応の経過をＨＰＬＣによってモニターした（図１）。エポキシドの光学純度が９９％を越えた時点もしくは、変換率が５０％に到達した時点（エポキシド１：９時間、エポキシド２：６時間）で、酢酸エチルを加えて残存エポキシドおよび生成ジオールを抽出した（３ｍｌ×５回）。シリカゲルクロマトグラフィーによって、ジオールとエポキシドとを分離し（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１→３：１→１：１）、それぞれの質量を測定して、収量を算出した（表２）。

表２から、B. subtilis 168株を利用して、光学活性なジオールおよびエポキシドを定量的に生成し得ることがわかった。

（実験例２）B. subtilis 168株由来ＥＨ遺伝子のクローニング
B. subtilis 168株は、ゲノム解読が終了し、その情報が一般公開されている（クンスト，エフ．（Ｋｕｎｓｔ，Ｆ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９７年、３９０巻、２４９頁）。B. subtilis 168株のゲノムデータベースにアクセスし、エポキシドハイドロラーゼをキーワードにして検索を行った（http://bacillus.genome.jp/bsorf-bin/BSORF_data_view.pl?ACCESSION=BG12888）。ＥＨに似た遺伝子（ＥＨ様タンパク質、ｙｆｈＭ、８５８ｂｐ）が見出されたので、このＥＨ様遺伝子およびその前後領域の塩基配列情報を取得した。取得した配列は、ＥＨのＤＮＡ配列（配列番号１）、ＥＨのアミノ酸配列（配列番号２）、ＥＨ様遺伝子の前後を含む長い遺伝子配列（ＥＨ−Ｌｏｎｇ：配列番号３）、およびＥＨ様遺伝子の前後を含む短い遺伝子配列（ＥＨ−Ｓｈｏｒｔ：配列番号４）であった。これらのＤＮＡ配列をもとにプライマーを設計した。プライマー設計の際には、以下の２点を改良した：本来のＥＨ遺伝子の開始コドンはＧＴＧであるが、より一般的な開始コドンであるＡＴＧへと変更したこと；およびＮ−末端から３残基目のアミノ酸（グリシン）をコードするコドンのＧＧＡに相当するｔＲＮＡが大腸菌内では少ないため、多く存在するコドンであるＧＧＴに変更したこと。

B. subtilis 168株からゲノムＤＮＡ調製キット（Genとるくん^TM酵母用；タカラバイオ株式会社）を用いて調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥＨＮ１（配列番号５）またはＥＨＮ２（配列番号６）とＥＨＣ２（配列番号７）とをプライマーとして用いて、ＰＣＲによって２種類のＥＨ構造遺伝子を増幅させた。これらのＥＨ遺伝子をEcoRIおよびSalIで処理し、同時に、pBluescript SK（Stratagene社）も同じ制限酵素で処理した。ＥＨ遺伝子とベクターとをライゲートした後に、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は、青白セレクションによって選択した。なお、青白セレクション用寒天プレートには、ＬＢ培地に０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル-チオ-β-D-ガラクトピラノシド）と４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）とを添加したものを用いた。青白セレクションによって得られた白いコロニーをピックアップし、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で液体培養後、１．５ｍｌの培養液から核酸抽出装置（Automatic Nucreic Acid Extracter MFX-2000；東洋紡績株式会社）を用いてプラスミドを抽出した。プラスミドの大きさをアガロースゲル電気泳動で確認し、サイズの増加が確認できたコロニーを１つずつ選んでシーケンス解析を行った。アガロースゲル電気泳動により、理論どおりの大きさの断片（８６０ｂｐ付近）を確認した。次いで、これらの遺伝子をEcoRIおよびSalI部位でpBluescript II SK(-)（コピー数：約２００）に連結し、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルを形質転換した。目的プラスミドの存在を確認するために、プラスミドを抽出して電気泳動で大きさを確認した。プライマーＥＨＮ１を用いた場合の９株中８株、およびＥＨＮ２では１０株中１株においてプラスミドサイズの拡大が確認された。プラスミドサイズの増加は、目的の遺伝子が挿入されたことを示唆している。これらのうち各１株（以下、それぞれＥＨＮ１発現株およびＥＨＮ２発現株という）を選んでＤＮＡ塩基配列を解析し、正しくクローニングされていることを確認した。また、宿主であるE. coli JM109株にはＥＨ活性が認められなかったが、ＥＨＮ１またはＥＨＮ２発現株にはＥＨ活性が認められた。両者の活性は同程度であった。この結果より、ゲノム情報からクローニングしたＥＨ様遺伝子が、ＥＨ活性を有するタンパク質をコードすることを確認した。

（実験例３）野生株および組換え株におけるＥＨ活性
（３−Ａ）ｔａｃプロモーターを有する形質転換体の作成
上記pBluescript II SK(-)を用いたタンパク質発現系は、大腸菌の中で弱い部類に分類されるｌａｃプロモーターを利用しているが、より強力なｔａｃプロモーターを有する形質転換体を作成した。ｔａｃプロモーターを有する一般的な発現ベクターであるｐＫＫ２２３−３（コピー数：５０）を用いて、上記でクローニングしたＥＨ遺伝子をEcoRI部位でｐＫＫ２２３−３に連結し、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルを形質転換した。ＥＨ遺伝子の方向は、ＥＨ遺伝子の内部にある制限酵素部位を用いて切断し、得られたＤＮＡ断片のサイズを調べることによって確認し、順方向に挿入された株を選択した。

（３−Ｂ）ＥＨプロモーターを有する形質転換体（大腸菌）の作成
B. subtilis 168株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、上下流領域を含むＥＨ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲに用いたプライマーは、EHNlongBam（配列番号８）またはEHNshortBam（配列番号９）とCBam（配列番号１０）との組み合わせであった。クローニングにより、プロモーター領域（Ｐ_ｅｈ：０．２〜１．２ｋｂ）およびターミネーター領域（Ｔ_ｅｈ：０．２ｋｂ）を含む２種のＥＨ遺伝子を得た。これらの遺伝子の構造を図２に示す。クローニングした遺伝子をBamHI部位でpBluescript SK(-)に連結し、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルを形質転換した。形質転換して得られたクローンからプラスミドを抽出し、電気泳動によってサイズを確認したところ、２．５ｋｂの遺伝子（ＥＨ−Ｌｏｎｇ）および１．３ｋｂの遺伝子（ＥＨ−Ｓｈｏｒｔ）がそれぞれ１個（ＥＨ−ＬｏｎｇおよびＥＨ−Ｓｈｏｒｔ）および２個（ＥＨ−Ｌｏｎｇ×２およびＥＨ−Ｓｈｏｒｔ×２）挿入した株が得られた（図３）。なお、遺伝子の挿入方向は未確認である。

（３−Ｃ）ＥＨプロモーターを有する形質転換体（枯草菌）の作成
ＥＨは枯草菌が生産する酵素であることから、枯草菌自体のタンパク質発現系を利用することにより、転写・翻訳に関するシステムのミスマッチが解消され、高い発現量が達成できると推測できる。そこで、枯草菌タンパク質発現系を構築した。

まず、B. subtilis 168株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、上下流領域を含むＥＨ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲに用いたプライマーは、EHNlongBam（配列番号８）またはEHNshortBam（配列番号９）とEco-EH-terR（配列番号１１）との組み合わせであった。得られた遺伝子をそれぞれBamHIおよびEcoRIで処理した後、同制限酵素で予め処理したｐＵＢ１１０（ATCCより入手）にライゲートして（１６℃、２〜１６時間）図４に示すプラスミドを構築し、コンピテントセル法によってB. subtilis MT-2（中性プロテアーゼ欠損宿主：立命館大学理工学部化学生物工学科久保幹教授より分譲）を形質転換し、ＥＨ−Ｌｏｎｇ株およびＥＨ−Ｓｈｏｒｔ株を得た。

（３−Ｄ）ＥＨ活性の測定
上記（Ａ）〜（Ｃ）で得られた大腸菌および枯草菌の形質転換体を用いて、以下のようにＥＨ活性を測定した。B. subtilis 168株の野生株または形質転換体をＬＢ培地（ペプトン：１０ｇ／Ｌ、酵母エキス：５ｇ／Ｌ、NaCl：５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）で培養した後、遠心分離によって回収し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁し、１００μｌを２ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れた。このチューブに２μｌのエポキシド１を添加して３０℃で激しく３０分間攪拌した。次いで、酢酸エチル２５０μｌを添加して反応を停止させ、さらに３０分間攪拌した。酢酸エチル層を回収し、ＨＰＬＣ分析を行った。予め作成した検量線から生成物および残存基質の量を算出し、培養液１ｍｌ当たり１時間に加水分解される基質量をＥＨ活性とした。結果を表３に示す。

枯草菌宿主内でＥＨプロモーターを機能させた場合には、大腸菌内よりも高い活性を示した。また、活性値はＥＨ−ＬｏｎｇとＥＨ−Ｓｈｏｒｔとは大きく異なっていた。大腸菌を宿主とした場合には、ＥＨ−Ｌｏｎｇの活性がＥＨ−Ｓｈｏｒｔに比べて高かったのに対して、枯草菌宿主の場合は発現量が逆転していた。発現宿主およびプロモーターの違いによる立体選択性の変化は認められなかった（データは示さず）。

（実験例４）種々のプロモーターを有する形質転換体の作成
（４−Ａ）アミラーゼプロモーターを有する形質転換体（枯草菌）の作成
枯草菌は菌体外に大量のタンパク質を分泌生産することが知られており、食経験によって安全性も周知であるため、タンパク質大量発現システムとして開発が進められてきた。しかし、成功例は菌体外に分泌される酵素についてのみであり、菌体内酵素の発現システムとしては、枯草菌はほとんど利用されていない。唯一、アミラーゼ高生産菌として知られるBacillus amyloliquefaciens NBRC 15535由来のアミラーゼプロモーターの下流に、マルトースホスホリラーゼの構造遺伝子を連結し、ｐＵＢ１１０を用いて枯草菌内で発現させることにより、２５０倍以上の発現量が達成されたとの報告がある（イノウエ，ワイ．（Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．）ら、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」、２００２年、６６巻、２５９４頁）。そこで、B. amyloliquefaciensのアミラーゼ遺伝子（アクセッションＮｏ．Ｊ０１５４２）のプロモーター配列およびターミネーター配列をＤＤＢＪから取得した（http://srs.ddbj.nig.ac.jp/cgi-bin/wgetz?-id+2XtAQ1OFfGs+-e+[DDBJRELEASE:'BACAAM']）。

まず、B. amyloliquefaciens NBRC15535株（独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NBRC）から購入）のゲノムＤＮＡを鋳型として、Xba-PamyF（配列番号１２）およびBam-PamyR（配列番号１３）をプライマーとして用いて、アミラーゼ遺伝子の上流域（プロモーターを含む２４９ｂｐ）をＰＣＲによって増幅させ、アミラーゼプロモーター部位（Ｐ_ａｍｙ）を取得した。その際、５’−末端にXbaI部位、３’−末端にBamHI部位を連結させた。また、B. subtilis 168株のゲノムＤＮＡを鋳型として、EH-5Bam（配列番号１４）とEHC3（配列番号１５：ターミネーターなし）またはEco-EH-terR（配列番号８：ターミネーターあり）とをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行い、ＥＨ遺伝子（ターミネーターなしおよびあり）を増幅させた。この際、５’−末端にBamHI部位、３’−末端にEcoRI部位を連結させた。これらのＰ_ａｍｙとＥＨ遺伝子とをそれぞれBamHIで処理してBamHI部位で連結した。この複合遺伝子をXbaI部位およびEcoRI部位でｐＵＢ１１０にライゲートし（１６℃、終夜）、それぞれＥＨ発現プラスミドｐＵＢ−Ｐ_ａｍｙ−ＥＨおよびｐＵＢ−Ｐ_ａｍｙ−ＥＨ−Ｔ_ｅｈを構築した。これらを用いてコンピテントセル法によってB. subtilis MT-2を形質転換して、それぞれB. subtilis MT-2／ｐＵＢ−Ｐ_ａｍｙ−ＥＨ（以下、Ｐａｍｙ−１２株という：図５参照）およびB. subtilis MT-2／ｐＵＢ−Ｐ_ａｍｙ−ＥＨ−Ｔ_ｅｈ（以下、Ａｍｙ−５株という）を作成した。

また、B. amylolichefaciens NBRC15535株のゲノムＤＮＡを鋳型として、Eco-Tamy3F（配列番号１６）およびAcc-Tamy223R（配列番号１７）をプライマーとして用いて、アミラーゼ遺伝子のターミネーター領域（２９３ｂｐ）をＰＣＲによって増幅させ、アミラーゼターミネーター部位（Ｔ_ａｍｙ）を取得した。ｐＵＢ−Ｐ_ａｍｙ−ＥＨの下流に、EcoRIおよびAccI部位でＴ_ａｍｙを挿入してｐＵＢ−Ｐ_ａｍｙ−ＥＨ−Ｔ_ａｍｙを構築した（図６）。構築したｐＵＢ−Ｐ_ａｍｙ−ＥＨ−Ｔ_ａｍｙをB. subtilis MT-2に組込み、B. subtilis MT-2／ｐＵＢ−Ｐ_ａｍｙ−ＥＨ−Ｔ_ａｍｙ（以下、Ｔａｍｙ−２株という）を得た。

（実施例１）デンプン含有培地で培養した微生物のＥＨ活性
B. subtilis 168株野生株または上記実験例３で得られたアミラーゼプロモーターを含む形質転換体を、デンプン含有培地（ポリペプトンＳ：５０ｇ／Ｌ、アミラーゼ処理したデンプン：１２０ｇ／Ｌ、(NH₄)₂HPO₄：１０ｇ／Ｌ、CaCl₂・2H₂O：２ｇ／Ｌ、MgSO₄・7H₂O：２ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー：１０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）で４日間培養した。培養後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２〜２０倍に希釈し、１００μｌを２ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れた。このチューブに２μｌのエポキシド１を添加して３０℃で激しく３０分間攪拌した。次いで、酢酸エチル２５０μｌを添加して反応を停止させ、さらに３０分間攪拌した。酢酸エチル層を回収し、ＨＰＬＣ分析を行った。予め作成した検量線から生成物および残存基質の量を算出し、培養液１ｍｌ当たり１時間に加水分解される基質量をＥＨ活性とした。結果を表４に示す。

アミラーゼプロモーターを有する株では、いずれもＥＨ活性が非常に高かったが、ターミネーターの有無によってＥＨ活性に違いが認められた。ＥＨターミネーターの挿入によって、Ａｍｙ−５株ではＥＨ活性がＰａｍｙ−１２株の約１．５倍になり、アミラーゼターミネーターが挿入されているＴａｍｙ−２株では、さらにＥＨ活性が高かった。また、デンプン含有培地で培養した微生物では、アミラーゼプロモーターを有する株だけでなく、野生株であるB. subtilis 168株やＥＨプロモーターを有する株でも、ＬＢ培地で培養した場合と比べて１０倍以上のＥＨ活性の上昇が認められた。このことから、デンプン含有培地がアミラーゼプロモーターだけでなく、ＥＨプロモーターにも同様に作用し、ＥＨ活性を上昇させたと推測される。

そこで、他の野生株についても、デンプン含有培地で培養した後、ＥＨ活性を測定した。結果を表５に示す。

デンプン含有培地で培養することにより、バクテリアおよび酵母のいずれの菌種についてもＥＨ活性が上昇していた。特に、バクテリアではBacillus subtilis IAM 1186株が７．２倍、酵母ではCandida colliculosa JCM 2199株が９．３倍もの活性を示した。

（実施例２）乾燥菌体の調製
Ａｍｙ−５株をデンプン含有培地で４日間培養後、遠心分離によって集菌した。回収した菌体を、−２０℃にて凍結乾燥後３日間保存、２０v/v％グリセロール添加後に−２０℃にて凍結乾燥して３日間保存、あるいは室温にて風乾燥した。次いで、各乾燥菌体に乾燥前の培養液の２０倍容量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）を加えて再懸濁し、１００μｌを２ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れた。２μｌのエポキシド１を添加して３０℃で激しく攪拌した。３０分経過後、酢酸エチル２５０μｌを添加して反応を停止させ、さらに３０分攪拌した。酢酸エチル層を回収し、ＨＰＬＣ分析を行った。結果を表６に示す。

菌体を凍結させると活性が半減したが、２０％のグリセロール共存下で凍結した場合はほとんど失活しなかった。グリセロールの添加は、菌体での保管においても、ＥＨ活性の維持に効果的と思われる。一方、風乾燥菌体では、活性が約１／２に低下した。

（実施例３）固定化菌体の調製−１
菌体の固定化法として一般的な手法である包括法を採用し、代表的な包括剤である、カラギーナンおよびアルギン酸カルシウムを用いて、デンプン含有培地で培養したＡｍｙ−５株の固定化を行った。

κ−カラギーナン（４％）を１００℃にて溶解させ、カラギーナン水溶液（約３ｍｌ）と菌液（培養液の２倍濃度相当、１ｍｌ）とをすばやく混合した。室温で放置することにより固化させ、すりつぶして反応に供した。

最終濃度の２倍濃度のアルギン酸ナトリウム水溶液（１ｍｌ）と菌液（培養液の２倍濃度相当、１ｍｌ）とを混合し、０．４５ｍｍのシリンジを用いて塩化カルシウム水溶液（０．１３Ｍ）中に滴下した。１時間以上攪拌し、ゲル化した菌体ビーズを回収して反応に供した。

固定化菌体の活性評価には、カラギーナン固定化菌体は、培養液相当濃度の触媒として使用した。アルギン酸カルシウム固定化菌体は、１％アルギン酸ナトリウム（１ｍｌ）と菌液（１ｍｌ）とから約０．７ｇの固定化菌体が得られたことから、約１．４倍に濃縮されたものとして反応に使用した。各固定化菌体の２０倍容量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）を加えて再懸濁し、１００μｌを２ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れた。２μｌのエポキシド１を添加して３０℃で激しく攪拌した。３０分経過後、酢酸エチル２５０μｌを添加して反応を停止させ、さらに３０分攪拌した。酢酸エチル層を回収し、ＨＰＬＣ分析を行った。

カラギーナン固定化菌体ではＥＨ活性は半減していたが、アルギン酸カルシウムで固定化した場合には、固定化による悪影響は無く、ほぼ完全な活性を保持していた。また、各固定化菌体を触媒として用いた際に、立体選択性の変化は認められなかった。基質濃度を高めるためにヘプタン中で反応を試みたが、活性向上は認められなかった。

（実施例４）固定化菌体の調製−２
アルギン酸を構成する２種の糖（マンヌロン酸およびグルロン酸）の成分比によって、水溶液の濃度やゲル化のしやすさが異なる（グルロン酸が多いとゲル化しやすい）ことが知られている。そこで、組成の異なるアルギン酸ナトリウムを用いてＰａｍｙ−５株を固定化し、最適なアルギン酸の選択を選択した。さらに、アルギン酸ナトリウム濃度を最適化した。

まず、マンヌロン酸（Ｍ）およびグルロン酸（Ｇ）の成分比が異なる３種類のアルギン酸ナトリウム、すなわち、キミカアルギンＩ−７、キミカアルギンＩＬ−６Ｇ（これらはいずれも株式会社キミカ製）、およびＭＡＮＵＣＯＬ ＭＶ（ISP：International Specialty Products製）を用いて固定化した。ＥＨ活性を上記実施例３に記載と同様の操作によって測定した。その結果、マンヌロン酸含量の多いＭＡＮＵＣＯＬ ＭＶで高活性を示した（表７）。また、ＭＡＮＵＣＯＬ ＭＶの濃度は、０．９〜１．０％が最適であった（表８）。

（実施例５）固定化菌体の架橋処理
架橋剤として、ポリエチレンイミンとグルタルアルデヒドとの組み合わせ、および１，６−ヘキサメチレンジアミンとグルタルアルデヒドとの組み合わせを用いて、固定化菌体の架橋処理を行った。

上記実施例３において調製した１％アルギン酸カルシウム固定化菌体（Ａｍｙ−５株）を２％ポリエチレンイミン水溶液（分子量６０，０００〜８０，０００、塩酸で中和）に５分間浸漬した。菌体を回収し、０．５％グルタルアルデヒド水溶液に浸漬し、マグネチックスターラーにてゆっくりと３０分間攪拌した。ろ過によって固定化菌体を回収し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）にて３回洗浄し、余分な水分をろ紙に吸収させた。使用するまで４℃で保存した。

同様に、上記実施例３において調製した１％アルギン酸カルシウム固定化菌体（Ａｍｙ−５株）を１％１，６−ヘキサメチレンジアミン水溶液（塩酸で中和）に１０分間浸漬した。菌体を回収し、１％グルタルアルデヒド水溶液に浸漬して、マグネチックスターラーにてゆっくりと３０分間攪拌した。ろ過によって回収した固定化菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）にて３回洗浄し、余分な水分をろ紙に吸収させた。使用するまで４℃で保存した。

架橋処理直後、１０日後、および３１日後に、各固定化菌体の２０倍容量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）を加えて再懸濁し、１００μｌを２ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れた。２μｌのエポキシド１を添加して３０℃で激しく攪拌した。３０分経過後、酢酸エチル２５０μｌを添加して反応を停止させ、さらに３０分攪拌した。酢酸エチル層を回収し、ＨＰＬＣ分析を行った。結果を表９に示す。

架橋処理の直後に活性を測定したところ、架橋菌体では活性の低下が認められた。塩基としてポレチレンイミンを用いた場合には７１％にまで低下し、架橋密度の高いヘキサメチレンジアミンを使用した架橋処理では活性が半減した。１カ月間４℃で保管した後に再度活性を測定すると、架橋しない菌体では保存前の４６％にまで低下したが、架橋処理した菌体では活性の保持率が高かった（８９および９６％）。この結果から、高濃度のグルタルアルデヒドで架橋した菌体では、架橋直後に失活するが、安定性が向上し長期保存可能であることが明らかとなった。

（実施例６）固定化菌体の乾燥処理
上記実施例３および実施例５にて調製したＡｍｙ−５株のアルギン酸カルシウム固定化菌体および架橋菌体を、濃縮機を用いて１時間乾燥させた。これらの乾燥菌体について、上記実施例２と同様の操作によってＥＨ活性を測定した。結果を表１０に示す。

固定化菌体の場合は乾燥処理による活性の喪失はわずかであり、９割以上の活性を維持していた。さらに、乾燥固定化菌体を室温で放置し、１カ月ごとに残存活性を測定したところ、少しずつ活性が低下する傾向が見られた。アルギン酸カルシウム固定化菌体（架橋処理なし）は、湿潤菌体では１カ月後に活性が半分以下にまで低下したが、乾燥処理することにより２カ月後も８０％の活性を保持することができた。このことから、室温での半年〜１年程度の保存が可能であると推測される。以上の実験から、アルギン酸カルシウム固定化、架橋処理、および乾燥処理を組み合わせることがＡｍｙ−５株の長期保存に有効であることがわかった。

（実施例７）固定化菌体の反復使用
乾燥させた固定化菌体を量りとり、１００μｌの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８）で１時間膨潤させた。余分な水分をピペットで吸引除去した後、再度同じ緩衝液（１００μｌ）を加え、エポキシド１を２〜５μｌ加えて、３０℃で反応させた。１時間後、水層のみを吸引除去してＨＰＬＣ分析に供した。残った固定化菌体に、再度緩衝液および基質を加え、２回目以降の反応を１０回まで行った。結果を図８に示す。

図８に示すように、少なくとも１０回の繰り返し使用による大幅な活性損失は認められなかった。また、架橋の有無や、架橋剤の種類による顕著な違いも認められなかった。１０回使用した後も、反応時間を延長することによって変換率が５０％に到達することを確認した（データは示さず）。

（実施例８）固定化菌体の基質特異性
上記実施例５で調製したＡｍｙ−５のアルギン酸カルシウム固定化菌体を用いて、エポキシド１〜４に対するＥＨ活性を検討した。なお、エポキシド４は、以下のように調製した。

２−メチル−２−フェノキシメチルオキシラン（エポキシド４）の調製

氷浴で冷却した１Ｌの三つ口フラスコに水素化ナトリウム（７．５３ｇ，１８８ｍｍｏｌ、ヘキサン洗浄）、および無水ＴＨＦ（３０ｍｌ）を入れ、マグネチックスターラーで攪拌しながら無水ＤＭＳＯ（２００ｍｌ）に溶解したトリメチルスルホキソニウムヨージド（３９．６ｇ，１８０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。滴下終了後、室温で約３０分攪拌した後に、ＤＭＳＯ（１００ｍｌ）に溶解した１−フェノキシ−２−プロパノン（２４．５７ｇ，１６４ｍｍｏｌ）を滴下した。室温にて約５時間攪拌後、氷冷しながら塩化アンモニウム水溶液をゆっくりと添加した。有機成分をヘキサンで抽出し、水および飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。減圧濃縮し、１０．６３ｇの２−メチル−２−フェノキシメチルオキシラン（エポキシド４）を得た（無色透明液体、収率３９．５％）。結果を表１１に示す。

野性株および遊離菌体と比べて、立体選択性に変化は認められなかった。

本発明によれば、高活性かつ高立体選択的なＥＨを高発現する微生物が提供される。また、この微生物を固定化することにより、保存性に優れかつ操作性の高い生体触媒として、反復使用が可能になる。したがって、本発明の微生物を有機合成試薬として使用して、ラセミ体のエポキシドから光学活性な化合物を工業的に製造できる。こうして得られる光学活性な化合物は、キラルビルディングブロックとして有用な化合物となり得る。さらに、エポキシド環の一つの炭素原子に二つの置換基を有する２，２−二置換のエポキシドを立体選択的に加水分解すると、化学的合成が非常に困難である光学活性３級アルコールを作ることができ、これは様々な化合物へと誘導することができる。したがって、本発明の微生物は、医薬品や農薬の製造に非常に有用である。

B. subtilis 168株によるエポキシドの加水分解反応におけるエポキシドおよびジオールのEeの経時変化を示すグラフである。 ＥＨ遺伝子のＥＨプロモーターおよびＥＨターミネーターを含む遺伝子構造の模式図である。 ＥＨ−Ｌｏｎｇ遺伝子およびＥＨ−Ｓｈｏｒｔ遺伝子をpBluescript SK(-)に挿入して構築したプラスミドの構造を示す模式図である。 ＥＨ−Ｌｏｎｇ遺伝子およびＥＨ−Ｓｈｏｒｔ遺伝子をｐＵＢ１１０に挿入して構築したプラスミドの構造を示す模式図である。 アミラーゼプロモーターを有するＥＨ発現ベクター（ｐＵＢ−Ｐ_ａｍｙ−ＥＨ）の構築を示す模式図である。 アミラーゼターミネーターを有するＥＨ発現ベクター（ｐＵＢ−Ｐ_ａｍｙ−ＥＨ−Ｔ_ａｍｙ）の構築を示す模式図である。 Ａｍｙ−５株の固定化菌体の繰り返し使用回数とジオール収率との関係を示すグラフである。

Claims (8)

1. 微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養する工程を含む、エポキシドハイドロラーゼの活性が高められた微生物の製造方法。
2. 前記エポキシドハイドロラーゼが、バチルス・サチルス由来である、請求項１に記載の方法。
3. 前記微生物がバチルス属細菌である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記微生物が組換え微生物であって、該微生物において、前記エポキシドハイドロラーゼをコードする構造遺伝子の上流に、アミラーゼプロモーターまたはエポキシドハイドロラーゼプロモーターが挿入されている、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養する工程を含む、微生物のエポキシドハイドロラーゼ活性を増強する方法。
6. 微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養する工程、および得られた培養物からエポキシドハイドロラーゼを回収する工程を含む、エポキシドハイドロラーゼの製造方法。
7. エポキシド加水分解活性を有する微生物を４％から２０％の濃度のデンプンを含む培地中で培養する工程、および得られた培養物を固定化および／または乾燥させる工程を含む、固定化エポキシドハイドロラーゼの製造方法。
8. 請求項７に記載の方法によって製造される、エポキシドハイドロラーゼ剤。

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