TW201920057A - 製備掌性α鹵烷酸之方法 - Google Patents

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Abstract

本文所述係關於一種選擇性水解根據式I的α鹵烷酸之鏡像異構物之方法，其係使用具有去鹵酶活性之多肽，其包含如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列，以及該方法之用途。

Description

製備掌性α鹵烷酸之方法
本文所述係關於一種選擇性水解根據式I的α鹵烷酸之鏡像異構物之方法，其係使用具有去鹵酶活性之多肽，其包含如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列，以及該方法之用途。
眾所周知生物系統例如生物體中相同化學物質的鏡像異構物之作用有時有顯著的差異。舉例而言，在藥物中，藥物的鏡像異構物經常只有一種對於所欲生理效應有作用，而其他鏡像異構物較不具活性、無活性或有時相互抵消。
因此，存在僅得到所欲的鏡像異構物之不同方法。一種策略已知為掌性解析，此方法涉及製備外消旋形式之化合物，且使其分離成為不同的鏡像異構物。其他策略為非對稱性合成，亦即，使用多種技術來製備呈高鏡像異構物超越量之所欲的化合物。
以外消旋混合物存在之一類分子為α鹵烷酸。這些α鹵烷酸的R或S鏡像異構物可用於分析目的被分離例如經由如於US 5154738中所述之毛細管氣相層析法。用於合成目的，製備掌性α鹵烷酸之最實際方式係使用番木虌鹼鹽(strychnine)或馬前子鹼鹽(brucine salts)經由外消旋解析或藉由R-2-胺基丁 酸之立體選擇性溴化作用。然而，對於這些反應之掌性前體或試劑-例如[R-2-胺基丁酸]-不具成本效益。此外，反應難以在較大或甚至工業規模上進行。例如，R-2-胺基丁酸之立體選擇溴化作用係耗費時間、需要低溫(-10至5℃)且反應進程難以控管。此外，硝化氣體在反應期間形成，其代表職業安全問題。
因此，本發明之目的係設計一種替代的、更具成本效益、時間效率更高且更安全的方法，以實現及/或促進式I的α鹵烷酸之R和S鏡像異構物的分離。
本發明係藉由提供選擇性水解根據式I的α鹵烷酸之S-鏡像異構物之方法而達成此目的。
其中X為鹵素，及R為具1至6個碳原子之烷基鏈，其中該烷基鏈在碳原子γ或δ上可為直鏈或支鏈，該方法包含- 提供該α鹵烷酸的R-鏡像異構物及S-鏡像異構物之外消旋物，- 提供具有去鹵酶活性之多肽，其包含如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列，- 使該外消旋物反應1-8小時，其中 對於包含如SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性之多肽，pH係在9-10之範圍內且溫度係在15-35℃之範圍內，或對於包含如SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性之多肽，pH係在9-10之範圍內且溫度係在55-65℃之範圍內，- 且其中R-鏡像異構物之介於90.0與99.9%間的鏡像異構物超越量係在1-8小時之後達到。
此方法具有優點在於其為替代、較具成本效益和時間效率之方法，其係根據式I的α鹵烷酸之R和S鏡像異構物的不同反應行為，能夠及/或促進兩種鏡像異構物之分離，因為具有去鹵酶活性的多肽(包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中的任一者至少80%序列同一性的序列)在給定的反應條件下選擇性水解式I的α鹵烷酸之S鏡像異構物係非常有效，即達到高時空產率。藉由剩餘R-鏡像異構物的鏡像異構物超越率介於90與99%之間而顯示水解反應的選擇性。換言之，令人驚訝地發現，特定條件促進更具成本效益、時間效率和更安全的方法以衍生出R-鏡像異構物。
如上所述，具有去鹵酶活性之多肽(包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中的任一者至少80%序列同一性的序列)在給定條件下極有效率地將式I的α鹵烷酸之S鏡像異構物選擇地水解。在此反應期間，R-鏡像異構物係保持未改變，而S-鏡像異構物係在其立體異構性轉換下被水解。
在該方法之較佳具體實例中，具有去鹵酶活性之多肽係包含SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列，且 在根據式I的α鹵烷酸中X為氟。首次令人驚訝地發現在這些條件下及使用具有去鹵酶活性之多肽(包含SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列)，根據式I之含氟的α鹵烷酸之S-鏡像異構物亦被選擇地水解，其中R-鏡像異構物之介於90.0與99.9%間的鏡像異構物超越量係在1-8小時之後達到。
術語「包含」係被解釋為明定起始部分、步驟或成分之存在，但並未排除一或多個額外部分、步驟或成分之存在。
應瞭解的是當以單數形式提及單詞時，複數亦包括於本文中。因此，藉由不定冠詞「一(a)」或「一個(an)」對元件的引用不排除多於一個元件存在的可能性，除非上下文明確要求存在一個且僅一個元件。因此，不定冠詞「一」或「一個」通常表示「至少一個」。
本文中使用的名詞「鏡像異構物」係指彼此為不重疊(不相同)的鏡像之給定分子的二種立體異構物之一。化合物中的單一掌性原子或類似結構特徵係使得該化合物具有兩種可能不重疊的結構，各結構係為另一種的鏡像。
如本文中使用，術語「外消旋物」或「外消旋基質」係指具有等量之掌性分子的二種立體異構物之混合物。
如本文中使用，在具有去鹵酶活性之多肽(包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO.1至少80%序列同一性的序列)之情況下，式I的X係選自非為氟之鹵素，且上述方法係進行1-8小時，其中pH係在9-10之範圍內且溫度係在15-35℃之範圍內。
使用這些條件，令人驚訝地發現具有去鹵酶活性之多肽(包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或具有至少80%序列同一性的序列)可靠地達到99%以上的鏡像異構物超越率值(參照圖3)及16,6g產物L-1 h-1(在100g/l之 基質濃度時)之時空產率。
應注意的是，由於外消旋基質，R-鏡像異構物之最大產率為50%，因此使用100g/l基質濃度之最大產率會是50g/l。此外，若較低基質濃度-例如50g/l-被使用時，時空產率會甚至更高。然而，較高基質濃度對於以工業規模為主的生產方法係有利的。
在較佳的具體實例中，在具有去鹵酶活性之多肽(包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或具有與其至少80%序列同一性的序列)之情況下，上述方法係進行4-6小時，其中pH係為9.5且溫度係在20-30℃之範圍內。使用這些條件，可在3小時後達到完全轉換(即90% ee)。
在此反應之特別較佳的具體實例中，溫度為25℃。
pH較佳係在9-10之範圍內且最佳在9.5。
反應溫度25℃及pH 9.5係在1小時後達到完全轉換，即90% ee。因此，這些條件導致特別高的時空產率。在具有去鹵酶活性之多肽(包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或具有與其至少80%序列同一性的序列)之情況下，提供做為新鮮發酵之生物質(即多肽係包含於全細胞中)，所達到的時空產率為50g產物L-1 h-1。
如上所述，在具有去鹵酶活性之多肽(包含SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與其至少80%序列同一性的序列)之情況下，上述方法係進行1-8小時，其中pH係為9-10且溫度係在55-65℃之範圍內，及R-鏡像異構物之介於90.0與99.9%間的鏡像異構物超越量係在1-8小時之後達到。在一較佳的具體實例中，在具有去鹵酶活性之多肽(包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或具有與其至少80%序列同一性的序列)之情況下，上述方法係進行4-6小時，其中pH係為9.5且溫度係在59-61℃之範圍內。
在此反應之一特別較佳的具體實例中，溫度為60℃。
pH較佳係在9-10之範圍且最佳為9.5。
在本文中所述具有去鹵酶活性之多肽的較佳具體實例中，該多肽具有與SEQ ID NO 1之至少80%的序列同一性，更佳至少85%的序列同一性、更佳至少90%的序列同一性，更佳至少95%的序列同一性，更佳至少95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性及最佳100%的序列同一性，或該多肽具有與SEQ ID NO 4之至少80%的序列同一性，更佳至少85%的序列同一性、更佳至少90%的序列同一性，更佳至少95%的序列同一性，更佳至少95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性及最佳100%的序列同一性。
包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 4所示胺基酸序列之具有去鹵酶活性的多肽也可經由核酸序列定特徵。
因此，在包含SEQ ID NO.1所示胺基酸序列之具有去鹵酶活性的多肽之情況下，提供之多肽係選自下列之群組：a)包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之多肽，b)分離的密碼子最適化之核酸片段，其包含具有與SEQ ID NO.2至少80%序列同一性之核苷酸序列，c)分離的核酸片段，其包含與SEQ ID NO.2互補的序列，d)分離的核酸片段，其包含與b)之該分離的核酸片段或c)之該互補者特異性地雜交之序列，e)分離的核酸片段，其包含具有與SEQ ID NO.3至少80%序列同一性之核苷酸序列，f)分離的核酸片段，其包含與SEQ ID NO.3互補的序列，g)分離的核酸片段，其包含與e)之該分離的核酸片段或f)之該互補 者特異性地雜交之序列，因此，在具有去鹵酶活性之多肽(包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列)之情況下，多肽可由不同核酸序列編碼，此為遺傳密碼簡併性之原因。
由於遺傳密碼之此種簡併性，胺基酸可由一或多個密碼子所編碼。在不同生物體中，編碼胺基酸之密碼子係以不同頻率使用。使編碼核酸序列適應其於生物體(其中該被表現的序列係被整合)中的使用頻率，可有助於在特定細胞中轉譯蛋白質增加的量及/或所討論mRNA的穩定性。熟習該項技術者可藉由檢測儘可能多的所討論的生物體之編碼核酸序列，就特定密碼子用於編碼特定胺基酸之頻率方面上，測定在所討論的宿主細胞或宿主中密碼子的使用頻率。特定生物體的密碼子之使用頻率為熟習該項技術者知悉(參見http：//www.kazusa.or.jp/codon/)且可以簡單及快速方式使用專門開發的演算法實施於電腦程式中測定(例如Grote et al.,2005,Nucleic Acids Research 33,W526-W531；doi：10.1093/nar/gki376)。使用這類演算法之工具為公眾可取得且免費提供特別是作為網頁介面，於來自多個機構的全球網頁(World Wide Web)，例如European Bioinformatics Institute(EMBL-EBI)及其他(舉例而言，http：//www.jcat.de；http：//gcua.schoedl.de/；http：//www.kazusa.or.jp/codon/；http：//www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html；http：//www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)上。使編碼核酸序列適應其於生物體(其中該序列欲被表現)中的使用頻率可藉由活體外致突變或較佳地藉由基因序列的重新合成而進行。用於核酸序列重新合成的方法係為熟習該項技術者所知悉，重新合成可經由例如最初合成個別核酸寡核苷酸、使其等和與其互補的寡核苷酸雜交進行，以使得它們形成DNA雙股且接著將個別雙股寡核苷酸接合，因而得到所欲的核酸序列。核酸序列的重新合成包括使密碼子用於特定目標生物體頻率適應也可由提供此服務之公司 (例如Eurofins MWG)獲得。
包含與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO 3至少80%序列同一性的核苷酸序列之分離的核酸片段，較佳地分別具有與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO 3至少85%序列同一性、更佳地至少90%序列同一性、更佳地至少95%序列同一性、更佳地至少95%、96%、97%、98%、99%、最佳地100%序列同一性。
在包含SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列之具有去鹵酶活性的多肽之情況下，所提供的多肽係選自下列之群組：a)包含SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之多肽，b)分離的密碼子最適化之核酸片段，其包含具有與SEQ ID NO.5至少80%序列同一性之核苷酸序列，c)分離的核酸片段，其包含與SEQ ID NO.5互補的序列，d)分離的核酸片段，其包含與b)之該分離的核酸片段或c)之該互補者特異性地雜交之序列，e)分離的核酸片段，其包含具有與SEQ ID NO.6至少80%序列同一性之核苷酸序列，f)分離的核酸片段，其包含與SEQ ID NO.6互補的序列，g)分離的核酸片段，其包含與e)之該分離的核酸片段或f)之該互補者特異性地雜交之序列，另外，具有去鹵酶活性之多肽-於本文中包含SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列之多肽-可藉由不同核酸序列所編碼。再者，此為如上所解釋之遺傳密碼的簡併性之結果。
此外，包含與SEQ ID NO.5或SEQ ID NO 6至少80%序列同一性的 核苷酸序列之分離的核酸片段，較佳地分別具有與SEQ ID NO.5或SEQ ID NO 6至少85%序列同一性、更佳地至少90%序列同一性、更佳地至少95%序列同一性、更佳地至少95%、96%、97%、98%、99%、最佳地100%序列同一性。
如本文中所使用，術語「水解」係為碳-鹵素鍵結經酶催化的水解裂解，其中鹵素係被羥基取代。一些酶催化2-鹵烷酸之水解去鹵化作用，以產生對應的2-羥基烷酸。
如本文中所使用，術語「選擇性地水解」係指催化水解的一些酶(即多肽)顯現立體選擇活性。換言之，經由選擇性水解，R-或S-鏡像異構物之鏡像異構物超越量係視酶的偏好性而產生。
如本文中所使用，術語「鏡像異構物超越量」或「ee-值」係指掌性物質純度之測量。其反映出樣本含有一種鏡像異構物之量高於另一者的量之程度。外消旋混合物具有0%的ee，而單一完全純的鏡像異構物具有100%的ee。具有70%一種鏡像異構物及30%另一種鏡像異構物之樣本具有40%的ee(70%-30%)。
用於測定ee-值的方法為此技術中已知的。其可例如使用裝配有掌性管柱的氣相層析裝置而測定。
因此，本文所述多肽顯示當催化水解反應時之立體選擇活性。此立體選擇活性可以ee值表現。如上所述，具有去鹵酶之多肽(包含如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示胺基酸序列或具有與該等序列任一者至少80%序列同一性之序列)顯示達到非常高的ee值之立體選擇活性。
可使用以下參數可靠地確立給定酶對於給定反應的合適性：基質轉換、產物形成、鏡像異構物超越量(ee)及時空產率(STY)。如本文中所使用，術語「時空產率」係指於明定時間內由特定體積之給定基質濃度所產生的產 物量。
在一些情況中，本文給予的時空產率值也相對於給定反應中使用的細胞萃取物或全細胞的特定量而設定(參見實例3及5)。
如本文中所使用，術語「基因」係表示由包含一可操作地連接至可以調節多肽表現的調節區域之區域(轉錄區域)之核苷酸組成之DNA序列，其於細胞中被轉錄為RNA分子(例如直接成為無內插子序列之mRNA)。一基因可因此包含數個可操作連接的序列，例如未轉譯的調節區域(例如啟動子，增強子，抑制子(repressor))、包含例如涉及轉譯起始的序列之5’引導序列、(蛋白質)編碼區域(cDNA或基因組DNA)及包含例如轉錄終止序列之3’未轉譯序列。
如本文中所述，術語「基因之表現」或「基因表現」係指其中可操作地連接至適當調節區域、特別是啟動子之DNA區域(編碼區域)係轉錄成為mRNA分子。mRNA分子接著於細胞中進一步被處理(經由後轉錄過程)，例如藉由轉譯起始及轉譯成為胺基酸鏈(多肽)及藉由轉譯停止密碼子之轉譯終止。
如本文中所使用，術語「野生型」(亦寫為"wildtype"或"wild-type")係指酶或基因之典型形式，因其最常見於自然界中。
如本文中所使用，術語「多肽」係指任何肽、多肽、寡肽或蛋白質。多肽係由連續的胺基酸組成，其等藉由肽鍵連接。聚合物可為線形或分支的，其可包含修飾的胺基酸，且其可被非胺基酸所中斷。多肽可為對應的天然存在的胺基酸之人類、非人類及人工或化學模擬物，以及天然存在的胺基酸聚合物及非天然存在的胺基酸聚合物。該術語亦涵蓋已經由天然方法或化學修飾而被修飾的胺基酸聚合物；舉例而言，藉由雙硫鍵形成、糖化、脂化、乙醯化、醯化、磷酸化或任何其他操作，例如以標記組分接合， 例如但非限於螢光標記、顆粒、生物素、珠、蛋白質、放射性標籤、化學發光標籤、生物發光標籤及類似者。
如本文中所使用，兩種相關核苷酸或胺基酸序列之術語「序列同一性」(以百分比表示)係指具有相同殘基(x 100)之兩種最佳比對的序列中位置數目除以比較之位置數目。間隙，即其中殘基存在於一序列中但非於另一序列中之比對中的位置係視為具有不相同殘基之位置。兩種序列之「最佳比對」係藉由將兩種序列於全部長度比對而發現。換言之，若二種相同序列被比對時，序列同一性值會是100%。
核苷酸或胺基酸殘基之比對序列一般係以矩陣內的行表示。間隙係於殘基之間插入，使得相同或類似的字母以連續的列中比對。
為了測定序列同一性，可使用歐洲分子生物學開放軟體套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)之Needleman及Wunsch整體比對演算法(Needleman and Wunsch,1970,J MolBiol 48(3)：443-53)(EMBOSS,Rice et al.,2000,Trends in Genetics 16(6)：276-277；參見例如http：//www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)，使用預設設定(間隙開啟罰分=10(對於核苷酸)/10(對於蛋白質)及間隙延長罰分=0.5(對於核苷酸)/0.5(對於蛋白質))。對於核苷酸，使用之預設評分矩陣為EDNAFULL，且對於蛋白質，使用之預設評分矩陣為EBLOSUM62。
術語「核苷酸分子」係意欲表明包含DNA(cDNA及/或基因組DNA)、RNA(較佳mRNA)、PNA、LNA及/或嗎啉基(Morpholino)之任何單-或雙股核酸分子。
如本文中所使用，術語「載體」係指用於將外來遺傳物質轉移至另一細胞中之分子媒介物。載體本身通常為由插入物(感興趣的序列)及作為載體「骨架」的較大序列組成之DNA序列。載體轉移遺傳資訊至其他細胞 之目的一般係在目標細胞中分離、複製或表現插入物。
如本文中所使用，術語「質體」係指質體載體，即由於複製起點(“ORI”)而能夠在合適的宿主中自行複製之環狀DNA序列。此外，質體可包含可篩選標記，以指示轉形或旨在導入外來DNA於細胞中的其他程序之成功，以及複數個選殖位點，其包括複數個限制酶共同位點以使得插入物得以插入。稱為選殖或供體載體之質體載體用於使選殖簡化及使感興趣的序列擴增，稱為表現或受體載體之質體載體係特定地用於表現感興趣的基因於一界定的目標細胞中。那些質體載體通常顯示一表現匣，其係由啟動子、核醣體結合位點、轉基因及終止子序列組成。對於表現控制上，那些質體載體含有一抑制子，其係位於質體骨架上。表現質體可為含有得以於不同宿主細胞中繁殖及篩選的元件之穿梭質體。
如本文中所使用，術語「特異地雜交」或「選擇地雜交」係指所討論的核酸序列在含有0.5M磷酸鈉緩衝液(pH 7.2、含有7% SDS、1mM EDTA及100mg/ml鮭魚精子DNA)之雜交溶液中在65℃反應16小時，且於含有9.5 x SSC及0.1% SDS之洗滌溶液中在65℃下洗滌2次20分鐘。
在本文中所述方法之具體實例中，包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽係以細胞裂解物提供及/或包含於全細胞中。
如本文中所使用，術語「全細胞」係指包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽係提供於其表現之細胞中，亦即，該等細胞之細胞壁未被特意地破壞。
該全細胞可為例如發酵過程中產生之新鮮生物質。或者，全細胞可在使用之前冷凍。
換言之，令人驚訝地發現即使酶，即包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽，其為(重組)全細胞所表現，僅存在於細胞中，該基質的生物可利用性足以使該酶可與細胞中的該基質反應。
用於酶合成的大腸桿菌細胞被發現以恆定比例的總蛋白質含量產生所欲的酶。換言之，給定量的總細胞蛋白質(約5g)總是包含相同量的可溶性酶濃度。也因為此理由，全細胞、而非細胞裂解物可用於實驗中。
使用全細胞具有不需使用用於提供細胞萃取物之昂貴且耗時的方法之優點。
在一個具體實例中，該全細胞為大腸桿菌細胞，其選自群組：MG1655、W3110、JM101、BL21DE3、DH5alpha。
此外，所選擇的大腸桿菌較佳地帶有SEQ ID NO.7之質體且表現由來自該質體的SEQ ID NO.1所組成的酶。
或者，所選擇的大腸桿菌較佳地帶有SEQ ID NO.8之質體且表現由來自該質體的SEQ ID NO.4所組成的酶。
在本文所述方法的一個具體實例中，包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽係在反應開始時加入根據式I的α鹵烷酸之外消旋物，或該具有去鹵酶活性的多肽係在反應期間的開始及不同時間點加入該α鹵烷酸之外消旋物。
令人驚訝地，不同劑量型態對於方法表現並無影響。因此，熟習該項技術者可選擇最合適用於所討論的方法之給藥型態。所請酶的此性質係提供使用酶於給定生產方法中之最大彈性。
在本文所述方法的一個具體實例中，包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽係在反應期間的開始及不同時間點加入該α鹵烷酸之外消旋物，其中該添加的多肽濃度在每一個時間點相同。
在本文所述方法的一個具體實例中，包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽係在反應期間的開始及不同時間點加入該α鹵烷酸之外消旋物，其中該添加的多肽濃度在每一個時間點不同。
在本文所述方法的一個具體實例中，該外消旋物係加入具有去鹵酶活性的多肽，該具有去鹵酶活性的多肽包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性之序列，或該具有去鹵酶活性的多肽係加入該外消旋物中。
在該根據式I的α鹵烷酸之外消旋物加入包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽之情況中，較佳地所有的該根據式I的α鹵烷酸之外消旋物系在反應開始時加入，其中該外消旋物的pH值係在添加之前最適化於反應條件中。
令人驚訝地，是否該根據式I的α鹵烷酸之外消旋物(即基質)加入包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽，或是否該具有去鹵酶的多肽加入該根據式I的α鹵烷酸之外消旋物對於方法表現並無影響。
在本文所述方法的一個具體實例中，本文所述之具有去鹵酶活性的二種多肽的任一者係在pH 9.5下以全細胞提供，且該根據式I的α鹵烷酸之外消旋物係加入該多肽，其中該根據式I的α鹵烷酸之外消旋物亦在pH 9.5 下提供，且pH 9.5係在反應期間經由以合適的鹼滴定而維持恆定。
合適的鹼可例如選自由水性KOH或NaOH組成之群組。
在本文所述方法的一些具體實例中，該根據式I的α鹵烷酸之外消旋物之濃度係介於80與200g/L之間，較佳地介於90與150g/L之間，最佳地其為100g/L。換言之，該α鹵烷酸之外消旋物較佳地以可達到完全轉換之方式選擇。
在本文所述方法的一個具體實例中，包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽係以活性全細胞提供，且該活性全細胞的生物質具有介於15-200g/L、較佳地介於25-100g/L之間之濃度。
在本文所述方法的一些具體實例中，該根據式I的α鹵烷酸之外消旋物與全細胞的生物質(包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽)之比例係介於2：1至15：1、較佳地介於3：1至10：1、最佳地介於4：1之間。
由於包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽受到較高基質濃度所抑制，基質(即該根據式I的α鹵烷酸)-對-酶(即包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽，包含於全細胞中且因此以生物質提供)之比例為-隨著較低基質濃度而增加。
在本文所述方法的一個具體實例中，該根據式I的α鹵烷酸之鹵素X係選自由溴化物及氯化物組成之群組。
在本文所述方法的一個具體實例中，該根據式I的α鹵烷酸之基團R 為1至6個碳原子的烷基鏈，其中該烷基鏈為碳原子γ或δ，且其中接續該碳原子γ或δ上的支鏈為環狀。
在本文所述方法的一個具體實例中，該根據式I的α鹵烷酸之基團R係選自由乙基、丁基、2-甲基-丙基及甲基-環丙基組成之群組。
在本文所述方法的一個具體實例中，pH值係經由以合適的鹼例如氫氧化鉀或氫氧化鈉滴定而維持恆定。
由於發現反應條件可容易地規模放大，故介於1毫升與數千升之間的反應體積為可能的。
在本文所述方法的一個具體實例中，包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽係為鹵酸去鹵化酶。
在本文所述方法的一個較佳具體實例中，具有去鹵酶活性的多肽係由SEQ ID NO 1序列組成且與選自2-氯丁酸、2-溴-己酸、2-溴-4-甲基戊酸及2-溴-3-環丙基-丙酸組成的群組之外消旋基質反應。
在本文所述方法的一個替代之較佳具體實例中，具有去鹵酶活性的多肽係由SEQ ID NO 4序列組成且與選自2-氯丁酸、2-氟丁酸、2-溴-己酸及2-溴-4-甲基戊酸之外消旋基質反應。
在所選α鹵烷酸的S-鏡像異構物之選擇性水解作用後，R-鏡像異構物及水解的鏡像異構物係以混合物存在。對於一些應用上，有利的是僅得到即純化R-鏡像異構物。因此，所選根據式I的α鹵烷酸之R-鏡像異構物與水解鏡像異構物的混合物係進一步被處理。
在另外的方面，本文中所述者係關於使用本文所述方法於選擇性水解該α鹵烷酸的S-鏡像異構物，其中R-鏡像異構物超越量係介於90.0與99.9之間。
令人驚訝地發現使用包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽用於與包含根據式I之α鹵烷酸的R-鏡像異構物及S-鏡像異構物之外消旋物(其中在SEQ ID NO 1之情況中，X為鹵素，非為氟之鹵素，且R為含有至多6個碳原子之烷基鏈，其中該烷基鏈在碳原子γ或δ上可為直鏈或支鏈)接觸1-8小時，其中對於包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列之多肽，pH係在9-10之範圍內且溫度係在15-35℃之範圍內，或對於包含SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列之多肽，pH係為9-10且溫度係在55-65℃之範圍內，該多肽將進行對於該α鹵烷酸的S-鏡像異構物之選擇性水解作用，其中R-鏡像異構物之鏡像異構物係超越量係介於90.0與99.9之間。
此結果係為無法預期的，因為如此高比率的鏡像異構物超越量極為不尋常，尤其是由於包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列之具有去鹵酶活性的多肽係在極短反應時間1-8小時內達到90-99之鏡像異構物超越量之值。
因此，令人驚訝地發現經由以所述條件使用包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽容許替代的、更安全的及更具成本有效性與時間效率的方法，達成及/或促進根據式I之α鹵烷酸的R及S鏡像異構物之分離，其根據具有包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該等序列中任一者至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽之兩種鏡像異構物之不同反應行為。
在另一方面，本文所述者係關於選擇性水解根據式II之α鹵烷酸的鏡像異構物之方法，
其中R為具1至6個碳原子之烷基鏈，其中該烷基鏈在碳原子γ或δ上可為直鏈或支鏈，其係使用具有去鹵酶活性之多肽，其包含如SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列。
令人驚訝地發現，包含如SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽係選擇地水解式II之α鹵烷酸(即包含氟原子)的S鏡像異構物，其極有效地且具高鏡像異構物超越量。
較佳地，使用包含如SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列之具有去鹵酶活性的多肽之上述方法係在55-65℃及pH 9.5下進行。
因此，在包含如SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽之情況中，除了上述所稱α鹵烷酸以外，2-氟丁酸亦為特別較佳的。
在另一方面，本文所述係關於使用包含如SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽於選擇地水解式II之α鹵烷酸的S鏡像異構物，其中R-鏡像異構物之鏡像異構物超越量係介於90.0與99.9之間。
在一較佳具體實例中，該方法係如以下進行：將由SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列組成之具有去鹵酶活性的多肽在室溫於pH 9.5下加入2- 溴丁酸，使該反應進行4-6小時，同時經由以3M氫氧化鉀滴定而使pH值維持恆定。
在一特別較佳具體實例中，該方法係如以下進行：將10mg/ml總細胞蛋白質以含有由SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列組成之具有去鹵酶活性的多肽之細胞萃取物在室溫、pH 9.5且於6L反應體積中加入100g/l的2-溴丁酸中。使該反應進行4-6小時，同時經由以3M氫氧化鉀滴定而使pH值維持恆定。
在另一個特別較佳具體實例中，該方法係如以下進行：將由SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列組成的多肽在55℃溫度、pH 9.5下加入2-溴丁酸中。使該反應進行4-6小時，同時經由以3M氫氧化鉀滴定而使pH值維持恆定。
在另外一個特別較佳具體實例中，該方法係如以下進行：將10mg/ml總細胞蛋白質以含有由SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列組成之具有去鹵酶活性的多肽之細胞萃取物在55℃溫度、pH 9.5下加入2-氟丁酸中。
圖1顯示在相關於pH值(即9.5)及溫度(即25℃)之最適化條件下進行之反應。在此情況中，使用100g/L的2-溴丁酸作為基質，存在20mM甘胺酸，且使用2g/L細胞裂解物(即帶有pKA81a-HADH-PP-AJ質體之大腸桿菌MG1655)於表現去鹵酶。每小時添加該細胞裂解物3次。
圖2顯示圖1之反應的最佳pH係介於pH 8與pH 10之間。
圖3顯示代替使用(無菌)細胞裂解物，也可使用表現所請酶之全細胞於轉換反應中。
圖4顯示若提供基質且加入酶於基質中，則維持轉換反應之效率。
圖5顯示若酶以發酵培養液提供且加入酶，則維持轉換反應之效率。
本發明將以下列實例來更詳細說明，而無任何意圖將其限制於此。
實例
實例1：選擇的鹵酸去鹵酶活性之篩選
將來自惡臭假單胞菌(P.putida)AJ、惡臭假單胞菌109及東工大硫化葉菌(S.tokodaii)7(Jones et al.,1992(J Gen Microbiol.1992 Apr；138(4)：675-83,Kawasaki et al.,1994 BiosciBiotechnolBiochem.1994 Jan；58(1)：160-3及Bachas-Daunert et al.,2009 ApplBiochemBiotechnol.2009 Nov；159(2)：382-93)之不同鹵酸去鹵酶選殖至大腸桿菌MG1655中，且使其經由IPTG處理而過度表現。使用50g/L 2-溴丁酸作為基質，且在反應開始及在3.5h後時加入2 x 1.6g/L細胞裂解物，同時pH為9且溫度設定至37℃。
活性及立體選擇性-即S-鏡像異構物之優先水解-係使用氣相層析法以來自惡臭假單胞菌AJ(SEQ ID NO 1)之酶經由分析而證實所有三種酶係顯示最高選擇性，達到高於90%之ee值。
實例2：pH對於反應結果之影響
為了測試最佳pH範圍，反應條件係設定為：
- 100g/L的2-溴丁基(基質)
- 表現惡臭假單胞菌AJ鹵酸去鹵酶(SEQ ID NO 1)的大腸桿菌之1.5g/L細胞裂解物(6次，每小時)
- 20mM甘胺酸
- 溫度：25℃
- pH：維持恆定於8.0、9.0、10.0
如圖2中所示，最佳結果是以pH 9-10所達到。
實例3：使用惡臭假單胞菌的鹵酸去鹵酶(即具有由SEQ ID NO.1組成之具有去鹵酶活性的多肽)用於產生鏡像異構物超越量的選擇性去鹵化作用之進一步最適化
在第一情況中，使用於10mM甘胺酸之100g/l的rac-2-溴丁酸作為基質。由於基質在25℃比在37℃更穩定，即使酶活性的最適溫度係在37℃，使反應在25℃下進行，且因此防止自動水解(數據未顯示)。
酶係以細胞裂解物提供且在反應開始時全部加入或每小時以2mg/ml濃度加入。經由以3M KOH滴定而使pH值維持恆定於9.5，直到在大約4小時候反應完成。然後，以濃縮的H2SO4調整pH至pH 1.5，且使細胞殘渣於Celite上過濾。以MTBE進行萃取，且以CuSO4水溶液進行洗滌以除去剩下的2-羥基丁酸。最後，在真空下進行濃縮。
令人驚訝地發現此反應可靠地達到高於99%之鏡像異構物超越量率值(數據未顯示)。
這些高的鏡像異構物超越量率，即在反應後，只有α鹵烷酸的R-鏡像異構物及α鹵烷酸的原先S-鏡像異構物的羥基化產物存在，使得該方法用於大型工業規模上具有吸引力。
實例4：以全細胞之轉換
令人驚訝地發現，代替製備細胞裂解物，可使用全細胞於轉換反應中。此具有可省略製備(無菌)細胞裂解物之耗時的步驟之優點。
在第一情況中，以100g/L濃度使用2-溴丁酸作為基質。反應參數設定至150ml、25℃、500rpm、20mM甘胺酸緩衝液及pH 9.5。使用3M KOH使此pH維持恆定，以基質混合物製備反應容器，且藉由添加酶、即添加表現來自惡臭假單胞菌AJ的去鹵酶酵素(即由SEQ ID NO.1組成之具有去鹵酶活性的多肽)之大腸桿菌MG1655的全細胞而使反應開始。該等細 胞係以8.3g/L的濃度分別在反應開始時或在1、2及3小時之後逐步添加(參見圖3)。含有該酶的全細胞之最終濃度為25g/L或50g/L。反應在4小時後完成，圖3中呈現的結果及下表係證實該反應理想上係進行超過1小時(例如4小時)。
接著，將反應重複，但由表現來自惡臭假單胞菌AJ的去鹵酶酵素(即由SEQ ID NO.1組成之具有去鹵酶活性的多肽)之大腸桿菌MG1655細胞組成的生物質係在添加基質之前加入反應容器中。結果係示於圖4及下表中，這些結果證實可能先提供呈包含全細胞的生物質之酶並將基質加入該生物質中。
此外，轉化作用係使用發酵培養液進行。同樣地，帶有pKA81a-HADH-PP-AJ質體的大腸桿菌MG1655係用於表現去鹵酶酵素，即由SEQ ID NO.1組成之具有去鹵酶活性的多肽。酵素生產係藉由使用標準程序將大腸桿菌於最小培養基中發酵而進行。在基因表現後，達到100g/L的細胞濃度。生物轉化作用後續係以未處理的發酵培養液而完成。使發酵培養液冷卻至25℃，且藉由添加3M KOH而調整pH至9.5。藉由 添加含有100g/L的2-溴丁酸、0.5Vol.(v/v)甘胺酸緩衝液於pH 9.5及2Vol(v/v)5M KOH之基質混合物而使去鹵酶反應開始。在1小時後該反應達到完全轉換(即90% ee)(參見圖5)。
由羥基丁酸與R-2-溴丁酸之所得混合物，使用標準技術例如酸化及萃取，可得到約30%純的R-2-溴丁酸。
實例5：其他基質之測試
除了2-溴丁酸，其他基質係被測試且結果如下所列
實例6：放大規模(Upscaling)
使反應規模放大至2000升之先決條件為發現該酶可於全細胞中使用，其係以生物質提供而不需要製備細胞裂解物。因此，可省略耗時及昂貴的製備步驟例如過濾細胞裂解物，其在大規模上並非經濟上可行的。此外，反應可藉由添加基質(外消旋物)或包含於全細胞的酶之生物質之發現表示可以最大彈性使用設備。為了進一步調整該方法，pH滴定所使用之KOH(參見如上)係以50% NaOH替換，用於產物萃取之溶液係由MTBE改為 MIBK，且用於移除副產物之CuSO4係以CaCl2替換，以容許更容易及更便宜的廢物處理。
<110> 拜耳廠股份有限公司
<120> 由外消旋形式製備掌性alpha鹵烷酸之方法
<130> BTS173006
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 227
<212> PRT
<213> 惡臭假單胞菌AJ1
<400> 1
<210> 2
<211> 684
<212> DNA
<213> 惡臭假單胞菌AJ1
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<210> 3
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<210> 4
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<213> 東工大硫化葉菌7
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<213> pKA81a-HADH-PP-AJ質體
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<213> 來自東工大硫化葉菌7之具有鹵酸去鹵酶之pKA81a-HADH-載體
<400> 8

Claims (8)

  1. 一種選擇性水解根據式I的α鹵烷酸之S-鏡像異構物之方法， 其中X為鹵素，及R為具1至6個碳原子之烷基鏈，其中該烷基鏈在碳原子γ或δ上可為直鏈或支鏈，該方法包含- 提供該α鹵烷酸的R-鏡像異構物及S-鏡像異構物之外消旋物，- 提供具有去鹵酶活性之多肽，其包含如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列，- 使該外消旋物反應1-8小時，其中對於包含如SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性之多肽，pH係在9-10之範圍內且溫度係在15-35℃之範圍內，或對於包含如SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性之多肽，pH係在9-10之範圍內且溫度係在55-65℃之範圍內，-且其中R-鏡像異構物之介於90.0與99.9%間的鏡像異構物超越量係在1-8小時之後達到。
  2. 根據請求項1之方法，其中根據式I的α鹵烷酸之外消旋物與包含如SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性的多肽之全細胞生物量之比例係介於2：1至15：1之間，較佳地介於3：1至10：1之間，最佳為4：1。
  3. 根據請求項1或2之方法，其中該式I的α鹵烷酸之鹵素為溴化物或氯化物。
  4. 根據前述請求項中任一項之方法，其中該式I的α鹵烷酸之基團R係選自由乙基、丁基、2-甲基-丙基及甲基-環丙基組成之群組。
  5. 一種根據請求項1至4中任一項之方法用於選擇性水解該α鹵烷酸之S-鏡像異構物的用途，其中R-鏡像異構物之鏡像異構物超越量係介於90.0與99.9%間。
  6. 一種選擇性水解根據式II的α鹵烷酸之S-鏡像異構物之方法， 其中R為具1至6個碳原子之烷基，其中該烷基鏈在碳原子γ或δ上可為支鏈，其使用包含如SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或具有與該序列至少80%序列同一性的序列之具有去鹵酶活性之多肽。
  7. 根據請求項5之方法用於選擇性水解該α鹵烷酸之S-鏡像異構物的用途，其中R-鏡像異構物之鏡像異構物超越量係介於90.0與99.9%間。
  8. 根據請求項1或5之方法，其中該烷基鏈在碳原子γ或δ上係為支鏈，且在碳原子γ或δ上支鏈後的碳原子為環狀。
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