UA122967C2 - Похідна глюкагону - Google Patents

Abstract

Винахід стосується пептиду, який є похідною глюкагону, який містить амінокислотну послідовність будь-якої з SEQ ID NO:12-14. Також винахід стосується полінуклеотиду, фармацевтичної композиції, способу профілактики або лікування ожиріння, застосування пептиду для профілактики або лікування ожиріння.

Description

Галузь техніки, до якої належить винахід

Наданий винахід належить до нових похідних глюкагону, що мають чудовий ефект як відносно рецепторів глюкагоноподібного пептиду-ї (ГПП-1), так і відносно рецепторів глюкагону, і до композиції для профілактики або лікування ожиріння, що містить як активний інгредієнт похідне глюкагону.

Рівень техніки

Сучасні економічні успіхи і зміна способу життя супроводжувалися великими змінами у звичках харчування. Зокрема, сучасні ділові люди набирають надлишкову вагу і страждають ожирінням через висококалорійну їжу і недостатнє фізичне навантаження. Згідно з доповіддю

Всесвітньої організації охорони здоров'я (ВООЗ), більше одного мільярда дорослих в усьому світі мають надлишкову вагу, серед них більше трьох мільйонів - з клінічним діагнозом важкого ожиріння, а 250 000 людей в Європі і 2,5 мільйони людей в усьому світі щорічно вмирають від надлишкової ваги або ожиріння (М/огід Неанкйп Огдапігайоп, сіоба! Зігаїеду оп Оієї, Рпузісаї

Асіїміу апа Неани, 2004).

Надлишкова вага і ожиріння підвищують кров'яний тиск і рівень холестерину в крові, що стає причиною різних захворювань, включаючи захворювання серця, діабет, артрит і т.д., або призводять до ускладнень. Крім того, надлишкова вага і ожиріння є одними з основних причин, що підвищують ризик таких захворювань, як артеріосклероз, гіпертонія, гіперліпідемія і серцеві захворювання у дітей і підлітків, а також у дорослих.

Таким чином, сьогодні ожиріння визнано серйозною недугою, що розповсюджена в усьому світі і є причиною різних захворювань. Однак, оскільки вважається, що вилікувати ожиріння можна, приклавши власні зусилля, пацієнти, що страждають ожирінням, оцінюються як люди з низьким рівнем самоконтролю. Тим не менш, ожиріння не є легко виліковним захворюванням, оскільки воно тісно пов'язано з механізмами контролю апетиту і енергетичного метаболізму.

Відповідно, для лікування ожиріння одночасно потрібні як докладання зусиль самого пацієнта для контролю апетиту, так і лікування аномального механізму дії енергетичного метаболізму. В зв'язку з цим виникла необхідність у розробці лікарського засобу, здатного лікувати аномальний механізм дії.

У результаті вказаних вище зусиль були розроблені ліки проти ожиріння, такі як Римонабант

Зо (Запоїі-Амепіїз), Сибутрамін (Арбої), Контрав (ТаКеда), Орлістат (Коспе) і т.д. Однак ці ліки мали недоліки, такі як фатальні побічні реакції або невелика ефективність лікування ожиріння.

Наприклад, приймання Римонабанту викликає таку несприятливу реакцію, як розлад центральної нервової системи, Сибутраміну і Контраву викликають несприятливі реакції серцево-судинної системи, а приймання Орлістату призводить до зниження маси тіла тільки приблизно на 4 кг після його застосування протягом року. Відповідно, можна з впевненістю стверджувати, що відсутні ліки проти ожиріння, які можна безпечно призначати пацієнтам, що страждають ожирінням.

В цьому зв'язку були проведені активні дослідження для розробки нового фармацевтичного препарату, який дозволив би розв'язати проблеми, що виникають під час приймання звичайних препаратів проти ожиріння, при цьому останнім часом велика увага приділяється похідним глюкагону. Глюкагон секретується підшлунковою залозою, коли рівень глюкози в крові падає в результаті, наприклад, медикаментозного лікування, захворювання, дії гормонів або дефіциту ферменту. Глюкагон сигналізує печінці про необхідність розкладання глікогену до глюкози і підвищення рівня глюкози в крові до нормального. Крім того, є повідомлення про те, що глюкагон є ефективним проти ожиріння, додатково до ефекту підвищення рівня глюкози в крові, за рахунок приглушення апетиту і активації гормон-чутливої ліпази в жирових клітинах, тим самим сприяючи розкладанню жиру.

Глюкагоноподібний пептид-ї (який далі називається "ГПП-1"), похідне глюкагону, являє собою речовину, що знаходиться на стадії розробки як лікарського засобу для лікування гіперглікемії у хворих діабетом. ГПП-1 збільшує синтез інсуліну і сприяє його секреції, приглушує секрецію глюкагону, приглушує спорожнювання шлунка, покращує ефективність споживання глюкози і приглушує бажання приймання їжі. Також відомо, що ексендин-4, який секретується отруйною ящіркою і має амінокислотну послідовність, гомологічну приблизно на 5095 послідовності ГПП-1, полегшує стан гіперглікемії у хворих діабетом, активуючи рецептор ГПП-1.

Однак існують вказування, що ліки проти ожиріння, що містять ГПП-1 або ексендин-4, мають побічні ефекти, такі як блювота і нудота.

У зв'язку з цим, увагу привернув оксинтомодулін, як альтернатива ГІПП-1, який може зв'язуватися як з ГПП-1, так із глюкагоном. Оксинтомодулін являє собою пептид, одержаний з преглюкагону, попередника глюкагону, і має таку саму дію, як ГПП-1, а саме, приглушує бо бажання приймання їжі, підсилює відчуття насичення і сприяє розкладанню жиру, що підвищує його потенціал як засіб проти ожиріння.

Однак недолік оксинтомодуліну або його похідних полягає у необхідності щоденного введення високих доз цієї речовини, що пов'язано з коротким періодом його напіввиведення іп мімо і низкою ефективністю.

Розкриття винаходу

Технічне завдання

Автори наданого винаходу, прагнучи покращити ефективність лікування ожиріння одночасно зменшуючи дози, розробили похідне глюкагону з частковою модифікацією його амінокислотної послідовності і підтвердили його ефективну дію, як на рецептори глюкагону, так і на рецептори

ГПП-1, тим самим створивши наданий винахід.

Розв'язання проблеми

Наданий винахід створений з урахуванням вказаних вище проблем, що виникають у попередньому рівні техніки, і метою наданого винаходу є створення нового пептиду, який є дуже ефективним під час лікування ожиріння.

Іншою метою наданого винаходу є надання композиції, що містить цей пептид, для профілактики або лікування ожиріння.

Переваги, що забезпечуються винаходом

Новий пептид за наданим винаходом може істотно активувати як ГПП-рецептори, так і рецептори глюкагону у порівнянні з нативним глюкагоном і є ефективним проти ожиріння навіть під час введення у невеликих кількостях, і, отже, може знайти широке застосування як безпечний і ефективний засіб для лікування ожиріння.

Найкращі варіанти здійснення винаходу

Для досягнення вказаних вище цілей у одному зі своїх аспектів наданий винахід належить до нового пептиду, що має амінокислотну послідовність наступної формули 1: х1-Х2-ОСТЕТ5ОУ5КМІ -Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-Х21-Е-Х23-Х2А-ЖІ-І-Х27-Х28-Х29 (Формула 1) де Х!1 являє собою гістидин, дезаміно-гістидил, М-диметил- гістидил, |Д- гідроксіїмідазопропіоніл, 4-імідазоацетил, р- карбоксіїмідазопропіоніл або тирозин;

Х2 являє собою а-метил-глутамінову кислоту, аміноїзомасляну кислоту (АЇБб), ЮО-аланін,

Зо гліцин, Заг(М-метилгліцин), серин або О- серин;

Х15 являє собою цистеїн, аспарагінову кислоту або глутамінову кислоту;

Х16 являє собою глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту, серин, а-метил-глутамінову кислоту або є відсутнім;

Х17 являє собою цистеїн, глутамін, глутамінову кислоту, лізин, аргінін, серин або є відсутнім;

Х18 являє собою цистеїн, аланін, аргінін, валін або є відсутнім;

Х19 являє собою аланін, аргінін, серин, валін або є відсутнім;

Х20 являє собою лізин, гістидин, глутамін, аргінін, «-метил- глутамінову кислоту або є відсутнім;

Х21 являє собою аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, лейцин або є відсутнім;

Х23 являє собою ізолейцин, валін або є відсутнім;

Х24 являє собою аргінін, аланін, цистеїн, глутамінову кислоту, лізин, глутамін, а-метил- глутамінову кислоту або є відсутнім;

Х27 являє собою валін, аланін, лізин, метіонін, глутамін, аргінін або є відсутнім;

Х28 являє собою глутамін, лізин, аспарагін або є відсутнім; і

Х29 являє собою лізин, аланін, гліцин, треонін або є відсутнім; за умови, що амінокислотна послідовність, ідентична ЗЕО ІЮ МО:1, виключена.

Пептид за наданим винаходом може включати пептиди, похідні пептиду і його пептиди- міметики, які можуть активувати як рецептори ГПП-1, так і рецептори глюкагону внаслідок модифікації частини амінокислоти(амінокислот) шляхом заміщення.

Використовуваний у наданому описі термін "нативний глюкагон" належить до нативного людського глюкагону, що має амінокислотну послідовність: Нівз-бег-С1п-С1у- Гпи-Ріе-ТНгі-5ег-

Азр-Туг-5еи-І уб-Туг-І еи-Авр-Зег-Агу-Ага-АІа-СІп-Авр-Рпе-Ма!-Стп- Ггр-Геи-Меї-Авп-ТиИг (5ЕО 1

МО:1).

Наданий винахід належить до пептидів, визначених вище як похідні нативного глюкагону, і визначення пептидів, наведених у наданому винаході, припускає, що вони відрізняються від нативного глюкагону тільки в положенні(положеннях) Х у послідовностях, в яких є зміна(зміни).

В послідовності, наведеної формулою 1, згідно з наданим винаходом амінокислоти можна вважати послідовно пронумерованими, починаючи з першої амінокислоти до 29-ї амінокислоти у звичайному напрямку від М-кінця до С-кінця. Відповідно, опис "положення" в послідовності бо формули 1 слід інтерпретувати так само, як в описах положень нативного людського глюкагону і інших молекул.

Використовуваний у наданому описі термін "пептид" належить до сполуки, наведеної двома або більше амінокислотами, зв'язаними пептидним зв'язком(зв'язками). Для цілей наданого винаходу пептид може належати до пептиду, який є ефективним проти ожиріння за рахунок активації як рецепторів ГІПП-1, так і рецепторів глюкагону.

У наданому винаході трибуквені коди, які звичайно використовуються для позначення різних амінокислот, таких як с- аміноїзомасляна кислота (АїБб), Заг(М-метилгліцин) і «а-метил- глутамінова кислота, використовуються нарівні зі звичайними однобуквеними або трибуквеними кодами, що позначають амінокислоти, що зустрічаються в природі.

Крім того, амінокислоти, описані у наданому винаході, мають наведені нижче скорочені позначення, згідно з номенклатурою ІШРАС-ШВ.

Аланін (А) Аргінін (В)

Аспарагін (М) Аспарагінова кислота (0)

Цистеїн (С) Глутамінова кислота (Е)

Глютамін (0) Гліцин (С)

Гістидин (Н) Ізолейцин (І)

Лейцин (Г) Лізин (К)

Метіонін (М) Фенілаланін (Є)

Пролін (Р) Серин (5)

Треонін (Т) Триптофан (М)

Тирозин (У) Валін (М)

Пептид, який має амінокислотну послідовність, наведену формулою 1, згідно з наданим винаходом може включати будь-який пептид, який може активувати як рецептори глюкагону, так і рецептори ГПП-1, і який одержаний шляхом заміщення, додавання, делеції або модифікації після трансляції (наприклад, метилуванням, ацилюванням, убіквітинюванням і за допомогою внутрішньомолекулярних ковалентних зв'язків) в амінокислотній послідовності глюкагону, наведеної у ЗЕО ІЮ МО:1.

Для заміщення або додавання амінокислот можна використовувати нетипові або амінокислоти, що не зустрічаються в природі, додатково до 20 амінокислот, що зустрічаються в

Зо білках людини. Комерційні постачальники нетипових амінокислот включають 5ідта-А|пагісн,

СпетРер, Сеплуте РПагтасецшіїса!5 і т.д. Послідовності пептидів, що включають ці нетипові амінокислоти і амінокислоти типових пептидів, можуть бути синтезовані або придбані у комерційних компаній-виробників пептидів, наприклад у компанії Атегісап Реріїде або Васпет (О5А) або Апудеп (Когеа) і т.д.

Для підсилення дії пептиду за наданим винаходом на рецептори глюкагону і рецептори ГПП- 1 в амінокислотній послідовності, наведеної ЗЕО ІЮ МО:1, перша амінокислота, гістидин, може бути заміщена 4- імідазоацетилом шляхом вилучення а-вуглецю гістидину, дезаміногістилідом шляхом вилучення М-кінцевої аміногрупи, М- диметилгістидилом шляхом модифікації М-кінцевої аміногрупи двома метильними групами, р-гідроксімідазопропіонілом шляхом заміщення М- термінальної аміногрупи гідроксильною групою, В-карбокси імідазопропіонілом шляхом заміщення М-кінцевої аміногрупи карбоксильною групою або тирозином.

Крім того, в домені, який зв'язується з рецептором ГПП-1, може бути зроблена заміна на амінокислоту, яка може підсилити гідрофобний зв'язок і іонний зв'язок. Крім того, частина послідовності глюкагону може бути заміщена амінокислотною послідовністю ГПП-1 або амінокислотною послідовністю ексендину-4 для збільшення активності рецептора ГПП-1.

Частина послідовності глюкагону також може бути заміщена послідовністю, яка може підсилити а-спіраль. Переважно амінокислота(амінокислоти) формули 1 в положеннях 10, 14, 16, 20, 24. і 28 може бути заміщена амінокислотою(амінокислотами), такими як Туг(4- Ме), РНе,

Рпе(4-Ме), Рпе(4-СІ), Рпе(4-СМ), Рпе(4-МО2), Рпе(4-МН2г), РП, Раї, Маї, АїІа(2-тієніл) або Аїа (бензотієніл), які, як відомо, сприяють утворюванню а-спіралі, або їх похідними. Вигляд і кількість амінокислот або їх похідних, що додаються з цією метою, не обмежені.

Крім того, переважно, щоб щонайменше, одна амінокислота в щонайменше одній амінокислотній парі в положеннях 10 ії 14, 12 і 16, 16 і 20, 20 ї 24 ї 24 і 28 амінокислотної послідовності формули 1 могла бути заміщена глутаміновою кислотою або лізином, утворюючи у результаті пару глутамінова кислота-лізин, яка може утворювати кільце, при цьому кількість кілець, що вводяться таким чином, також не обмежена.

В ілюстративному варіанті здійснення амінокислотна послідовність глюкагону може бути заміщена послідовністю, здатною зв'язуватися з рецепторами ГПП-1, таким чином, щоб пептид міг бути ефективним як відносно рецепторів ГПП-1, так і відносно рецепторів глюкагону. 60 Переважно, пептид за наданим винаходом може бути пептидом з амінокислотної послідовності формули 1, в якій Х1 являє собою гістидин;

Х2 являє собою а-метил-глутамінову кислоту;

Х15 являє собою цистеїн або аспарагінову кислоту;

Х16 являє собою серин, глутамінову кислоту або аспарагінову кислоту;

Х17 являє собою аргінін, лізин, глутамінову кислоту або цистеїн;

Х18 являє собою цистеїн, валін або аргінін;

Х19 являє собою аланін або валін;

Х20 являє собою глутамін, лізин або гістидин;

Х21 являє собою аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту або лейцин;

Х23 являє собою ізолейцин або валін;

Х24 являє собою аргінін, глутамінову кислоту або глутамін;

Х27 являє собою валін, лізин або метіонін;

Х28 являє собою глутамін, лізин або аспарагін; і

Х29 являє собою лізин, гліцин або треонін; за умови, що амінокислотна послідовність, ідентична ЗЕО ІЮ МО:1, виключена.

Більш переважно, пептид за наданим винаходом може являти собою пептид, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з амінокислотних послідовностей

ЗЕО ІЮ МО:2-14.

Пептид за наданим винаходом може бути одержаний стандартним синтетичним способом, за допомогою системи експресії рекомбінантних генів або будь-яким способом, відомим у даній галузі. Відповідно, аналог глюкагону згідно з наданим винаходом може бути синтезований множиною способів, включаючи наступні: (а) поетапний синтез пептиду методом твердофазового або рідкофазового синтезу або шляхом складання фрагментів, виділення кінцевого пептиду 3 Подальшим очищенням; (Б) експресію конструкції нуклеїнової кислоти, що кодує пептид в клітині-хазяїні, і виділення продукту експресії з культури клітин-хазяїв; (с) здійснення експресії конструкції нуклеїнової кислоти, що кодує пептид, у пробірці, що не містить клітини, і витягування продукту експресії; або спосіб одержання фрагментів пептиду випадковою комбінацією (а), (Б) і (с), зв'язування фрагментів, тим самим відновлюючи відповідний пептид.

Автори наданого винаходу підтвердили у експериментах іп міго, що пептид за наданим винаходом чинить чудову дію на рецептори ГПП-1 і рецептори глюкагону у порівнянні з нативним глюкагоном (див. Таблицю 2). Крім того, у експериментах іп міго було підтверджено, що пептид за наданим винаходом є дуже ефективним відносно приглушення бажання приймання їжі на тваринній моделі ожиріння, тим самим демонструючи, що пептид за наданим винаходом може бути ефективним для лікування ожиріння навіть під час введення у невеликих кількостях.

Відповідно, пептид за наданим винаходом є подвійним агоністом, здатним стимулювати утворювання цАМФ як в рецепторах ГПП-1, так і в рецепторах глюкагону і, припускається, що він буде дуже ефективним для лікування ожиріння у порівнянні з існуючим глюкагоном. Щодо цього пептид за наданим винаходом може бути більш привабливим під час вибору засобу для лікування ожиріння і пов'язаних з ожирінням захворювань.

Пептид за наданим винаходом, що є подвійним агоністом, може поєднувати ефект ГПП-1 під час приймання їжі і ефект глюкагону у метаболізмі ліпідів і, таким чином, діяти синергічно, прискорюючи вилучення скупчень ліпідів і призводячи до неперервного зниження маси тіла.

Синергічний ефект подвійного агоніста може дозволити знизити фактори ризику розвитку серцево-судинних захворювань, таких як високий рівень холестерину і ЛИНЩ, які можуть не чинити ніякого ефекту на масу тіла.

Відповідно, пептид за наданим винаходом може бути використаний як фармацевтичний лікарський засіб для профілактики збільшення ваги, для зниження ваги, зниження надлишкової ваги і для лікування не тільки ожиріння, включаючи хворобливе ожиріння (наприклад, шляхом регулювання апетиту, процесу їди, приймання їжі, споживання калорій, і/або споживання енергії), але також і пов'язаних з ожирінням захворювань, включаючи, без обмеження, запалення, пов'язане з ожирінням, захворювання жовчного міхура, пов'язане з ожирінням, викликане ожирінням апное уві сні і стан здоров'я. Крім того, пептид за наданим винаходом може бути використаний для лікування захворювань, які можуть бути асоційовані з ожирінням, таких як метаболічний синдром, гіпертонія, дисліпідемії, що індукує артеріосклероз, атеросклероз, артеріосклероз, ішемічна хвороба серця, інсульт і т.д. Однак відносно цих симптомів пептид за наданим винаходом може діяти повністю або частково опосередковано 60 через ефекти, пов'язані з вагою тіла, або може діяти незалежно від них.

Для покращення терапевтичного ефекту похідного глюкагону за наданим винаходом, його можна модифікувати за допомогою традиційних способів у даній галузі техніки, таких як модифікація полімерів, таких як поліетиленгліколь (ПЕГ),, глікани і т.д., або злиття з альбуміном, перенесення, використовування жирних кислот, імуноглобуліну і т.д. Наприклад, щонайменше один бічний ланцюг амінокислоти в сполуці за наданим винаходом може бути кон'югований з полімером іп мімо для того, щоб збільшити розчинність і/або період напіввиведення і/або біодоступність. Відомо, що ці модифікації зменшують кліренс терапевтичних білків і пептидів.

Переважно полімер може бути водорозчинним (амфіпатичним або гідрофільним), нетоксичним і фармацевтично неактивним і, більш переважно, може включати ПЕГ, гомополімер або співполімер ПЕГ, монометилзаміщений полімер ПЕГ (мПЕГ);) або поліамінокислоту, таку як полілізин, поліаспарагінову кислоту і поліглутамінову кислоту.

Фахівцям у даній галузі очевидно, що модифіковані таким чином похідні глюкагону володіють кращим терапевтичним ефектом, ніж нативний глюкагон. Відповідно, варіанти похідних глюкагону також включені у обсяг наданого винаходу.

В іншому аспекті наданий винахід належить до полінуклеотиду, що кодує вказаний пептид.

Використовуваний у наданому описі термін "гомологія" відносно полінуклеотидів, належить до подібності з амінокислотною послідовністю дикого типу і нуклеотидною послідовністю дикого типу і включає послідовності генів з щонайменше 7595 гомологією полінуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, переважно щонайменше 8595, більш переважно щонайменше 9095 і ще більш переважно щонайменше 95595. Ці оцінювання гомологічності можна виконувати неозброєним оком або за допомогою комерційно доступної програми порівнювання.

Комп'ютерні програми, доступні на ринку, можуть розраховувати відсоткову гомологію між двома або більше послідовностями. Гомологію (96) можна розраховувати за сусідніми послідовностями.

Пептид можна одержати у великій кількості шляхом введення полінуклеотиду, що кодує пептид, у вектор, з подальшою його експресією.

Для експресії рекомбінантного вектора такого типу полінуклеотид за наданим винаходом звичайно вводять у відповідний вектор з утворюванням клонуючого або рекомбінантного вектора, що містить полінуклеотид, причому цей вектор також включений у обсяг наданого винаходу.

Використовуваний у наданому описі термін "рекомбінантний вектор" належить до ДНК- конструкції, яка включає нуклеотидну послідовність полінуклеотиду, що кодує цільовий пептид, яка функціонально зв'язана з відповідною регуляторною послідовністю, здатною експресувати цільовий пептид у придатній клітині-хазяїні. Регуляторна послідовність може включати промотор, здатний ініціювати транскрипцію, операторну послідовність для регулювання транскрипції, послідовність, що кодує відповідний мРНК домен, що зв'язує рибосому, і послідовність регуляції термінації транскрипції і трансляції. Рекомбінантний вектор, після введення у придатну клітину-хазяїна, може реплікуватися або функціонувати незалежно від генома хазяїна і може бути інтегрований безпосередньо в геном.

Рекомбінантний вектор, що використовується у наданому винаході, не обмежений особливими умовами, якщо він реплікується в клітині-хазяїні і може бути сконструйований за допомогою будь-якого вектора, відомого у даній галузі. Прикладами звичайних векторів, які можуть бути використані, включають дикого типу або рекомбінантні плазміди, косміди, віруси і бактеріофаги. Наприклад, як вектор на основі фага або косміди можуть бути використані рРУУЕ15, М13, МВІ З, МВІ 4, ІХІЇ, АЗНІЇ, АРІЇ, 70, 11, Спагоп4А, Спагоп21А і т.д. Як плазмідний вектор можна використовувати плазміди на основі рВК, рис, рВіІ пезсгірії, рРОЕєЕМ, рт, рсі і плазміду на основі РЕТ. Вектори, що використовуються у наданому винаході, не обмежені конкретними векторами, може використовуватися будь-який вектор, відомий у даній галузі.

Рекомбінантний вектор може бути використаний для трансформації клітини-хазяїна для одержання пептиду за наданим винаходом. Крім цього, як частина наданого винаходу, трансформовану клітину можна використовувати для ампліфікації фрагментів нуклеїнових кислот або реплікації векторів за наданим винаходом, або можна використовувати клітинну лінію, що культивується, або клітинну лінію, що використовується для продукування рекомбінантного пептиду за наданим винаходом.

Використовуваний у наданому описі термін "трансформація" належить до введення рекомбінантного вектора, що включає полінуклеотид, що кодує цільовий білок, в клітину-хазяїна таким чином, що цільовий білок, що кодується полінуклеотидом, може бути експресований в клітині-хазяїні. Не має значення, чи вставлений полінуклеотид у хромосому або знаходиться поза хромосомою, якщо трансформований полінуклеотид може бути експресований в клітині- бо хазяїні.

Крім того, полінуклеотид включає ДНК і РНК, які кодують цільовий білок. Полінуклеотид можна вводити у будь-якому вигляді, якщо полінуклеотид може бути експресований після введення в клітину- хазяїна. Наприклад, полінуклеотид може бути введений в клітину-хазяїна у вигляді касети експресії, яка являє собою геномну структуру, що включає всі істотні функції, необхідні для самоекспресії Касета експресії як правило включає промотор, який функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, сигнал термінації транскрипції, домен, що зв'язує рибосому, і сигнал термінації трансляції. Касета експресії може являти собою вектор експресії, що самореплікується. Крім того, сам полінуклеотид може бути введений в клітину-хазяїна і функціонально зв'язаний з послідовністю, необхідною для його експресії в клітині- хазяїні, без обмежень.

Крім того, використовуваний у наданому описі термін "функціонально зв'язаний" належить до стану, в якому промоторна послідовність, що ініціює і опосередковує транскрипцію цільового білка, що кодує полінуклеотид, функціонально зв'язана з послідовністю гена.

Клітина-хазяїн, придатна для наданого винаходу, не обмежена конкретними клітинами, за умови, що клітина-хазяїн може експресувати полінуклеотид за наданим винаходом. Приклади клітин-хазяїв, які можна використовувати у наданому винаході, включають Езспегіспіа 5р., такі як Е. соїї; ВасіШи5 5р., такі як Васійи5 зиБійб5; Рзепдотопах 5р., такі як Рзепдотопах рийда; дріжджі, такі як Ріспіа разіогі5х, засспаготусез сегемізіає і Зспі7озасспаготусе5 ротрбе; клітини комах, таких як 5родоріега Ігидірегаа (ЗЕ9); і клітини тварин, такі як СНО, СО5, В5С і т.д.

У іншому аспекті наданий винахід належить до фармацевтичної композиції для профілактики або лікування ожиріння, що містить вказаний пептид як активний інгредієнт.

Використовуваний у наданому описі термін "профілактика" належить до будь-якої дії, що призводить до приглушення або затримки початку розвитку ожиріння шляхом введення пептиду або фармацевтичної композиції за наданим винаходом, а термін "лікування" належить до будь- якої дії, що призводить до покращення симптоматики ожиріння або сприятливої зміни шляхом введення пептиду або фармацевтичної композиції за наданим винаходом.

Використовуваний тут термін "введення" означає введення конкретної речовини пацієнту відповідним чином. Шлях введення фармацевтичної композиції за наданим винаходом, хоча і не має особливих обмежень, може бути будь-яким традиційним шляхом введення, якщо

Зо фармацевтична композиція може досягати цільової тканини в організмі, наприклад внутрішньочеревинним, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, підшкірним, внутрішньошкірним, пероральним, місцевим, інтраназальним, внутрішньом'язовим, інтраректальним введенням і т.д.

Використовуваний тут термін "ожиріння" належить до стану здоров'я, при якому в організмі накопичується надлишковий жир, при цьому людина вважається гладкою, коли індекс маси тіла (ІМТ, значення, одержане шляхом розподілення ваги людини в кілограмах, на квадрат росту, виміряний у метрах) дорівнює 25 або вище. Ожиріння звичайно викликано дисбалансом енергії внаслідок перевищення споживання калорій над витратою енергії. Ожиріння є метаболічним захворюванням, яке може викликати розвиток діабету і гіперліпідемії, підвищити ризик виникнення сексуальної дисфункції, артриту і серцево-судинних захворювань, а у деяких випадках також пов'язано з виникненням раку.

Фармацевтична композиція за наданим винаходом може включати фармацевтично прийнятний носій, наповнювач або розріджувач.

Використовуваний тут термін "фармацевтично прийнятний" належить до достатньої кількості, яка може демонструвати терапевтичний ефект, при цьому не викликаючи появи яких- небудь несприятливих реакцій, і може бути легко визначена фахівцями у даній галузі за показниками, відомими в галузі медицини, таких як тип захворювань, що підлягають лікуванню, вік пацієнта, вага, стать, чутливість до ліків, шлях введення, кількість введень, лікарський засіб(засоби), який слід комбінувати або приймати одночасно з іншими і т.д.

Фармацевтична композиція за наданим винаходом може додатково включати фармацевтично прийнятний носій. Для перорального введення фармацевтично прийнятний носій може включати, без обмеження, зв'язуюче, лубрикант, дезінтегратор, наповнювач, солюбілізатор, диспергуючий агент, стабілізатор, суспендуючий агент, барвник і віддушки. Для введення у вигляді ін'єкцій суміш також може містити буферний агент, консервант, анальгетик, солюбілізатор, ізотонічний агент і стабілізатор. Для місцевого введення фармацевтично прийнятний носій може включати основу, наповнювач, лубрикант, консервант і т.д.

Фармацевтична композиція за наданим винаходом може бути складена у вигляді різних лікарських форм у комбінації з фармацевтично прийнятним носієм. Наприклад, для перорального введення фармацевтична композиція може бути складена у вигляді таблеток, 60 пастилок, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів, облаток і т.д. Для введення за допомогою (с;

ін'єкцій фармацевтична композиція може бути приготовлена в ампулах у вигляді стандартної лікарської форми або у вигляді мультидозової препаративної форми. Фармацевтична композиція також може бути приготовлена у вигляді розчинів, суспензій, таблеток, пілюль, капсул і препаратів тривалої дії.

З іншого боку, приклади носіїв, наповнювачів і розріджувачів, придатних для фармацевтичної композиції за наданим винаходом, можуть включати лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбіт, маніт, ксиліт, еритрит, мальтит, крохмаль, аравійську камедь, альгінат, желатин, фосфат кальцію, силікат кальцію, целюлозу, метилцелюлозу, мікрокристалічну целюлозу, полівінілпіролідон, воду, метилгідроксибензоат, пропілгідроксибензоат, тальк, стеарат магнію, мінеральні масла і т.д. Крім того, фармацевтична композиція за наданим винаходом може додатково включати наповнювачі, антикоагулянти, лубриканти, зволожники, віддушки, антисептики і т.д.

Крім цього, фармацевтична композиція може бути приготовлена у вигляді лікарської форми, вибраної з групи, що складається з таблеток, пілюль, порошків, гранул, капсул, суспензій, рідкого лікарського засобу для внутрішнього застосування, емульсій, сиропів, стерильних водних розчинів і на основі неводних розчинників, ліофілізованих складів і супозиторіїв.

Крім того, фармацевтична композиція може бути складена у вигляді лікарської форми, придатної для однократного введення в тіло пацієнта традиційним способом, переважно у вигляді препарату, придатного для введення пептидного лікарського засобу, і може бути введена перорально або парентерально, підшкірно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньоартеріально, інтрамедулярно, інтратекально, інтравентрикулярно, внутрішньолегенево, внутрішньошкірно, підшкірно, внутрішньочеревинно, інтраназально, внутрішньошлунково, локально, сублінгвально, внутрішньовагінально або інтраректально згідно з традиційним методом введення, без обмеження.

Пептид також можна використовувати у суміші з різними носіями, такими як сольовий розчин або органічний розчинник, дозволеними для застосування у фармацевтичних препаратах. Для підвищення стабільності або абсорбції пептид можна використовувати разом з вуглеводами, такими як глюкоза, сахароза або декстран, або антиоксидантами, такими як глутатіон, хелатуючі агенти, низькомолекулярні білки або інші стабілізатори і т.д.

Зо Об'єм введень і кількість введень фармацевтичної композиції за наданим винаходом можуть бути визначені згідно з типом лікарського засобу, що використовується як активний інгредієнт, нарівні з іншими факторами, такими як захворювання, що підлягає лікуванню, шлях введення, вік пацієнта, стать, вага, тяжкість захворювання і т.д.

Загальна ефективна доза композиції за наданим винаходом може вводитися пацієнту у вигляді разової дози або у вигляді багаторазової дози протягом тривалого періоду часу згідно з використовуваним протоколом лікування. Фармацевтична композиція за наданим винаходом може мати різний вміст активного інгредієнта залежно від тяжкості захворювання. Переважно, загальна доза пептиду за наданим винаходом може становити від 0,0001 мкг до 500 мг на 1 кг ваги тіла пацієнта. Однак, що стосується дози пептиду, то ефективна доза визначається з урахуванням різних факторів, таких як вік пацієнта, вага, стан здоров'я, стать, тяжкість захворювання, дієта і швидкість екскреції і т.д. Фахівці у даній галузі можуть визначити відповідну ефективну дозу, виходячи з конкретного застосування композиції за наданим винаходом.

Лікарські форми, шляхи введення і способи введення фармацевтичної композиції за наданим винаходом не мають конкретних обмежень за умови, що фармацевтична композиція проявляє ефект згідно із наданим винаходом.

Оскільки для фармацевтичної композиції за наданим винаходом характерні тривала дія і гарний титр іп мімо, то кількість і частота введень фармацевтичної композиції за наданим винаходом можуть бути значно зменшені.

Фармацевтична композиція може вводитися окремо або у комбінації з іншими фармацевтичними препаратами, що проявляють профілактичний або терапевтичний ефект відносно ожиріння. Фармацевтична композиція, що проявляє профілактичний або терапевтичний ефект відносно ожиріння, може включати, без обмеження, агоніст рецептора

ГІПП-1, агоніст рецептора лептину, інгібітор ДПП-ІМ, антагоніст рецептора У5, антагоніст рецептора меланін- концентрувального гормону (МОН), агоніст рецептора У2/3, агоніст рецептора МСЗ3/4, інгібітор ліпази шлунка/підшлункової залози, агоніст 5НТ2с, агоніст ЗА- рецептора, агоніст рецептора аміліну, антагоніст греліну і/або антагоніст рецептора греліну і т.д.

У іншому аспекті наданий винахід належить до способу профілактики або лікування ожиріння, що включає введення суб'єкту пептиду або фармацевтичної композиції, що містить

Гс10) пептид.

Використовуваний тут термін "суб'єкт" належить до суб'єкта с підозрою на ожиріння або суб'єкта, що знаходиться під загрозою розвитку ожиріння, і, зокрема, до ссавців, включаючи людей, щурів і велику рогату худобу, при цьому суб'єктом може бути, без обмежень, будь-який суб'єкт, якого можна лікувати пептидом за наданим винаходом. Введення фармацевтичної композиції, що містить пептид за наданим винаходом, може призводити до ефективного лікування суб'єкта з підозрою на ожиріння, причому ожиріння є таким, як описано вище.

Терапевтичний спосіб за наданим винаходом може включати введення фармацевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить пептид. Загальна добова доза композиції може бути визначена лікарем у результаті відповідного медичного огляду, і композицію можна вводити один раз або у вигляді декількох дробних доз. Однак з урахуванням мети наданого винаходу конкретна терапевтично ефективна доза композиції для будь-якого конкретного пацієнта може варіювати залежно від різних факторів, добре відомих у галузі медицини, включаючи тип і ступінь відповіді, які мають бути одержані, конкретні композиції залежно від того, чи використовуються з ними інші агенти, вік пацієнта, масу тіла, стан здоров'я, стать і дієту, час і шлях введення, швидкість виведення композиції, тривалість лікування, інші препарати, що використовуються в комбінації або одночасно з композицією за наданим винаходом і інші фактори, відомі у галузі медицини.

В іншому аспекті наданий винахід належить до застосування пептиду для одержання фармацевтичного лікарського засобу для профілактики або лікування ожиріння.

Режими виконання винаходу

Далі наданий винахід описаний більш докладно з посиланням на наведені нижче приклади.

Однак ці приклади дані тільки як ілюстрація, і винахід не обмежується цими прикладами.

Приклад 1: Одержання клітинних ліній для активації іп мімо -1-1» Одержання клітинних ліній, що демонструють відповідь ЦАМФ на ГІПП-1

Реакцію ПЛР проводили з використовуванням відкритої рамки зчитування (ВРЗ) кКДНК (Огібепе Тесппоіодіе5, Іпс., ОБА) гена рецептора людини ГІППП-1ї, що використовується як матриця, разом з прямим і зворотним праймерами, наведеними у 5ЕО ІЮ МО':15 і 16, які включають сайти рестрикції для Ніпапі ї ЕсоОКІ, відповідно.

Зокрема, проводили реакцію ПЛР (денатурація при 957С протягом 60 секунд, відпал при

Зо 55"С протягом 60 секунд і подовження при 68"С протягом 30 секунд), що включає 30 циклів.

Продукт ПЛР піддавали електрофорезу у 1,095 агарозному гелі, і з нього елюювали фрагмент розміром 405 п.о.

Прямий праймер 5-ССсСсОСсПЧВбоСсооСсаСсааоСастАТТССАААТАС-3'

Зворотний праймер 5-СЧчААСсССатоС,аасАа,авАСатоаАСТСТТААСПАТАаИ-З!

Продукт ПЛР клонували у відомий вектор для експресії генів у клітинах тварин, хосс/аніг (патент Кореї Мо 10-0880509, що також згадується далі), для конструювання рекомбінантного вектора хоосС/сІ РІК.

Одержаний таким чином рекомбінантний вектор хоосС/сІ РІК трансформували в клітини клітинної лінії яєчників китайського хом'ячка СНО 0044, які культивували в середовищі

ОМЕМ/Е12, що містить 1095 ЕВ5, з використовуванням ліпофектаміну (Іпмігодепе, ОА), після чого проводили відбір і культивування в селективному середовищі, що містить 5418 (1 мг/мл) і метотрексат (10 нм). З них відбирали лінії моноклональних клітин, з яких остаточно відбирали лінії клітин, що демонструють гарну відповідь ЦАМФ на ГПП-1 у дозозалежному режимі. -1-2» Одержання клітинних ліній, що демонструють відповідь ЦАМФ на глюкагон

Реакцію ПЛР проводили з використовуванням відкритої рамки зчитування (ВРЗ) кКДНК (Огібепе Тесппоїіодіеє5, Іпс., ОБА) гена рецептора глюкагону людини, що використовується як матриця, разом із прямим і зворотним праймерами, наведеними у ЗЕО ІЮ МО: 17 і 18, які включають сайти рестрикції для ЕсокКІ і ХпоЇї, відповідно.

Зокрема, проводили реакцію ПЛР (денатурація при 957С протягом 60 секунд, відпал при 55"С протягом 60 секунд і подовження при 68"С протягом 30 секунд), що включає 30 циклів.

Продукт ПЛР піддавали електрофорезу у 1,095 агарозному гелі, і з нього елюювали фрагмент розміром 435 п.о.

Прямий праймер 5-САИСОАСАССОСАСС,а ТОСССССОатТАСТТААСОИСО-3"

Зворотний праймер 5-СТААСССаАСТОТСсСОасААсСАСстТаАасСтасо-3

Продукт ПЛР клонували у відомий вектор для експресії генів в клітинах тварин хоос/аніг для конструювання рекомбінантного вектора хоосС/ЗзСссв.

Одержаний таким чином рекомбінантний вектор хооС/ЗССК трансформували в клітини клітинної лінії яєчників китайського хом'ячка СНО 0044, які культивували в середовищі

ОМЕМ/Е12, що містить 1095 ЕВ5, з використовуванням ліпофектаміну (Іпийгодепе, О5А), після бо чого проводили відбір і культивування в селективному середовищі, що містить 5418 (1 мг/мл) і метотрексат (10 нМ). З них відбирали лінії моноклональних клітин, з яких остаточно відбирали лінії клітин, що демонструють гарну відповідь ЦАМФ на глюкагон у дозозалежному режимі.

Приклад 2: Синтез похідних глюкагону

Для розробки похідного глюкагону з гарною дією як на рецептори СІ Р-1, так і на рецептори глюкагону, в амінокислотній послідовності нативного глюкагону, наведеній у 5ЕО ІЮ МО-1, виконували заміщення для одержання амінокислотної послідовності, яка має здатність зв'язуватися з ГПП-1, і синтезували похідні глюкагону, надані в наведеній нижче таблиці 1.

Таблиця 1

У наведеній вище таблиці 1 амінокислота, позначена як "Х" у послідовностях 5ЕО ІЮ МО:2- 14, являє собою а-метилглутамінову кислоту, яка є амінокислотою, що не зустрічається в природі, а залишок лізину в цих послідовностях може утворювати кільце з залишком глутамінової кислоти.

Приклад 3: Вимірювання іп міїго активності похідних глюкагону

Для вимірювання активності проти ожиріння похідних глюкагону, синтезованих у прикладі 2 вимірювали іп міго клітинну активність похідних глюкагону з використовуванням трансформованих клітинних ліній, одержаних у прикладах 1-1 і 1-2.

Трансформовані клітинні лінії одержували таким чином, щоб ген рецептора ГПП-1 людини і ген рецептора глюкагону людини могли експресуватися у СНО, відповідно, з придатною для вимірювання активністю ГІПП-1 і глюкагону. Відповідно, активність похідних глюкагону, синтезованих згідно з наданим винаходом, вимірювали, використовуючи трансформовані клітинні лінії, відповідно.

Зокрема, трансформовані клітинні лінії субкультивували два або три рази на тиждень, шляхом додавання у 96-лунковий планшет аліквот у кількості 1х109 клітин/лунка і культивували протягом 24 годин, відповідно.

Клітини культури промивали буферним розчином Кребса-Рінгера, що містить бікарбонат (КРБ), суспендували в 40 мл буферного розчину ККВ, що містить 1 мМ З3-ізобутил-1- метилксантин (ІВМХ), і залишали при кімнатній температурі на 5 хвилин.

Нативний глюкагон (ЗЕО ІЮО МО:1) або похідні глюкагону (наведені пептидами з ЗЕО ІЮ

Зо МО:12-14) згідно з наданим винаходом піддавали серійному 5-кратному розведенню у діапазоні від 1000 нМ до 0,02 нМ, додавали туди 40 Мл вказаних вище клітин і культивували у

СО?2 інкубаторі при 37! С протягом 1 години.

Потім до відповідних одержаних розчинів додавали 20 мл буфера для лізису клітин, і клітинні лізати наносили на набір для аналізу ЦАМФ (Моїіесшіаг ЮОемісе, ОБА) для вимірювання концентрації ЦАМФ, обчислювали значення ЕС50 і порівнювали між собою. Результати показані у наведеній нижче таблиці 2.

Таблиця 2

ЗБОЮ МОолЛа / Ї777771717171717171709611111117111111111111111111981С

Як показано у наведеній вище таблиці 2, похідні глюкагону згідно з наданим винаходом показали чудові ефекти як відносно рецепторів ГПП-1, так і відносно рецепторів глюкагону у порівнянні з нативним глюкагоном, наведеним у 5ЕО ІЮ МО-1.

Відомо, що глюкагон є ефективним у лікуванні ожиріння завдяки активації рецепторів ГПП-1 і рецепторів глюкагону, тим самим приглушуючи апетит, покращуючи відчуття ситості і сприяючи лізису жирових клітин. Оскільки як показано у наданому описі, похідні глюкагону згідно з наданим винаходом мають чудові ефекти іп міго як відносно рецепторів ГІПП-1, так і відносно рецепторів глюкагону у порівнянні з нативним глюкагоном, ці похідні глюкагону можуть бути використані як більш ефективний агент для лікування ожиріння у порівнянні з існуючим глюкагоном.

Хоча кращі варіанти здійснення наданого винаходу були розкриті з метою ілюстрації, фахівці у даній галузі зрозуміють, що можливі різні модифікації, додавання і заміни, що не виходять за рамки і суть винаходу, розкриту у формулі винаходу, що прикладається.

Claims (15)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Пептид, який містить амінокислотну послідовність будь-якої з БЕО ІЮ МО:12-14. 20

2. Пептид за п. 1, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:12.

3. Пептид за п. 1, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:13.

4. Пептид за п. 1, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:14.

5. Пептид за будь-яким із попередніх пунктів, де пептид здатний активувати рецептор ГПП-1 і рецептор глюкагону. 25

6. Пептид за будь-яким із попередніх пунктів, де пептид є ефективним проти ожиріння.

7. Пептид за будь-яким із попередніх пунктів, в якому амінокислоти в положеннях 12 і 16 або 16 і 20 пептиду формують кільце.

8. Полінуклеотид, який кодує пептид за будь-яким з пп. 1-7.

9. Фармацевтична композиція для профілактики або лікування ожиріння, яка містить пептид за 30 будь-яким з пп. 1-7 як активний агент.

10. Фармацевтична композиція за п. 9, яка додатково містить фармацевтично прийнятний носій.

11. Фармацевтична композиція за п. 9 або 10, де фармацевтичну композицію вводять окремо або у комбінації з іншими фармацевтичними препаратами, що проявляють профілактичний або терапевтичний ефект відносно ожиріння. 35

12. Фармацевтична композиція за п. 11, де фармацевтичний препарат, який проявляє профілактичний або терапевтичний ефект відносно ожиріння, являє собою агоніст рецептора ГІПП-1, агоніст рецептора лептину, інгібітор ДПП-ІМ, антагоніст рецептора У5, антагоніст рецептора меланінконцентрувального гормону (МСН), агоніст рецептора 2/3, агоніст рецептора МСЗ3/4, інгібітор ліпази шлунка/підшлункової залози, агоніст 5НТ2с, агоніст ЗА- 40 рецептора, агоніст рецептора аміліну, антагоніст греліну або антагоніст рецептора греліну.

13. Спосіб профілактики або лікування ожиріння, що включає введення суб'єкту пептиду за будь-яким з пп. 1-7 або фармацевтичної композиції за будь-яким з пп. 9-12.

14. Застосування пептиду за будь-яким з пп. 1-7 або композиції за будь-яким з пп. 9-12 для одержання лікарського засобу для профілактики або лікування ожиріння. 45 15. Застосування пептиду за будь-яким з пп. 1-7 або композиції за будь-яким з пп. 9-12 для профілактики або лікування ожиріння.

сЕдіВаи ЗЕ «ії» НЕММІ РИАВМ.

ПО, БЖ, «30 Покідні снлЕжариКу «1305 сгБІ535х «їз кКіОевпіа піз «і» дпіаеіде как МВ «ати» КорзЕвнЕів я «иїпх 1 «Від ВЗ «іх» Ййротяеїн «кій» Ккиюватся чай Ка із йех пів шу ТУ вве тах йеж вав ХУ ЗвЕ Зх Ук о бем дво; дж ї 5 155 Акту ду Аа пу Ав о гвВе УЗА пієб Тв оЗаи Ме дя ТБх 2 5 ке а «їх 8 «їй Прихехю «ії шужчне попнпідсявність «сих «ХЕ» пахне КклпЕватону «ЕТ «ші» БАБІАКТ «ий їх кати Ха: дайдса сейсю апьгахвехсвиветтамінаву пазпаеш «ОМ й Зі Хаз Зі ЗА дк Вчне Тех о Звк Аве тТУХ Шавх ду ТУх Цеи Аввошли 151515 пув о йпев вів Ба пів Бпе їіє Зв ТЕр опа аю за тах йо ях А «тт у так ІЮИМ ям хижі цраваки «Віа» штучна послідсанісик «ах «ваз похідне жпшЕа вану «ших «піз ВАБІДНЕ «ик і «и 3У Жва дви себою зль»аасметилподутамімови киспежу «ау Віз хХаа ЩІ ощшМуУ тах Бле Таж Ппеж Аве о Же пет бе дек Сем ба у 1 510158 й їв Суд чаМ пу Бач ВА ї3Ф пі Тк уки Уві йо ТВвх во 5 «віх 4 «тих ВВ «иїйх прое У БІК сЕвіІлиаи КО «ії» шШтУучий песик зеньште хви «235 пекідме вБлюижарину «ай «вті ВАХ Де ДЯ гав. сяк ТК «3» Хв звиде п5вою злювзасметиделУвамиомнови жЖмпншшУ «ЯК» й АВ і Віз Хва ій ПУ Таж БаФ ТВ бе Бароко Бех ув тТук бе»и йввоаАх 1 5 15

15 Ми Сжа біз Бе піс Бе ві Бін ТїЕЖробех Уві йжа тах Ва 25

«РИМ «Рів иа «іш Ппрохехе «В33М Штучна послідовні ть ках «Зах похідне соаюкаКону ВХ «ші БАБІ «Едем іі «аз Ха пвпнєе сибею знпьовз'метидедитамановВУ хнплоше чкадпим 5 ів Ха Зій БІіФ КвВЕ Ве» Так Сех Аво Туш бес му Зк Вви зав о Фіц Її Бі Був ск Аза ів Зів Бве Уві бій ТЕв Гей Жаі ВВ не ЗУ сна Є «лк шо «кій пюЮоетежи «І ЩЦівіцоа о дея, м зма йи щу МаАх посла дк хх ПЕТ па «ка» похідна влюкакомну «хай ен «Іі» ВАРІВНУ еле ки худ ше НЯ; каві» хай хай спЗзООюЮ альо метмлемуКаМИВОВУ ЖИСЯсКУ «ЕТ в Вів хаа Зі Біо їВвк їв» ЖнЕ Жак Аве» ТУух вх СБуж ТМ Бех бур ех 51 Був ж о Аів нів щіб Бве тв) 515 Тв о зем Хв Ази ЖЕ Я «ИЙ ОО кизії» ха «вія прове м хіх Штучна послані хх «їх пзкхадне спюКавону о аБІЙД:С акдіхааи а «ЕХ «ші БАВІдНТ «аа ій стилплк хва папдєе сосеКлЕК вжввасметинпнитемімовУ кислету «ат їз Хава Зід мЩіу ТВу Ввхе таж БВет о Ави Жук Зих бух Тук еа Аве Бех муз бух Зі Ніж ПЕ БВе їі Біб Сїкробва уз давл о Тлх в 5 «ВИХ В «іх ва «Вам пПраехеїв «віх ШеУчне зЗосвідовніст «их «вка похідне глюкатану «й их єв ЗАВІТАВ сюди и «аа Жва пвиде сойою алефасвитипгаетамівову кислу «І В вв аа Чьй біУ ЖК оБье ТЕ Зах ав Тх зу Муй ТУ Без Лав Зх У 0 ЗУжш пи Аза Вів Біб б Зме їі ім Тев дай Уже вва БУХ т 25 «Віл х -піїУ кола та Же чт У Й му, сша писк «ВМ щеочий моні повні шок ХХХ І ХХ ХУ ТУЮ Х Мо ха м пизди влюКатОоНу рн кам УС тудолю т хлая «ЕХ ЦІМ ЕХ Х шу пт Сеня Се Жккж є аач дпвлниж шВезою шлеезсмастинпелУутамінову внислОчнУ ау г «ах ге по АК я. У я, яку У. М КУ УК То п т. НК ток ки Та Кос «7 С ціх ва і по тих шк хо ки пах обме ІЗ ока СНИ пу ща НЯізЗ хХваа Зі б ЖВх ваз жваЕ Зех зве тую бек бУз Тух пам Ат ке що вто ту ОВО БО СУ пОраоля іа йіщ млі за її іа Шу бу гче іа щі ча с хв та Ві ЗІ бле їла ші щу Вомем АВ АТ АХ тр о кц Мо Оу тп Ам КЮ -к дотж: «іх З Се ль Не ікс ох «г чия Мр 3 Сина Зк ел мет у У І Му М СУК Х сяє штучива ПЛІД СВ онов чИни счкит дома спа гОонУ си наче гхсут мсїг синів ВАВТАВТ текло дик хо хі ШОЕ Х хв Ох КН я денно ння Іа нин «сих ква авлЕє Собою злдьдасметинпраутамінсвУ ЕВОЛІКУ п че нен ОО шу ше ЛУ кл КЕ, ен У сапип ій ЖК Хо. ОН У г не Ус. Ух їж же жи жав ух бан КО ре 7 ех Мою кож Тех т Вів Хав за ші Те пе тТВж о Щет во Тк Ма б Жех Вам Аг Зі фе ДВ Зх гУхки Аж тк хх ВЕК хх зле Мо ок том Жов г зи із су ді був зів вп їле дет шжкв о бе пу Був Піх зт прах жк Ми й ХАН КО Ж пу я не - Си скла прута оси ее Нове ут й ми Ул і хх хо о ЕЖУуляюа еп АХ ДИ ВЛА Ох КОМ чи ооо А НН сошки пом шдниа можеш нишу «Зав чу сю те В тиків ЧЕМЖОКИ лк тя тих сект їхі ЕТ ТЕ Бе сті том ох ух Ку хх ру хе как си жом ха ме КВ МеВ Ук ху «иа Жах явимш слово пль:ачмиснледУВАМІМИВЕ КВслОУВУ аа Фі мо смол я рю нев Ва ть шов дому блем о щем Тим МЖлимо Тиху; Можу ТД наіз Хвшж ит АУ ЩЕ Ваз тих дк одве Тух меж Св Туш Мпез дж ЗАВ з її чи х.5

5. М о ке я ль -м ме их ща Ук. а. зЛЬня ї чоюх Я - хи. їх с її хх Ж ххх ях " із хау Ж току и ЗАС З г КЕ пох тах іо Фа Са пін осуш йла БУ Бів впе їУє баз шхв о Квае Би БУВ БАКУ зі 5 отр ж ОКА МО ймях «ту тої п хх 7 «київ ша ЛЕК ю Па хохомам ох хі жк МОХУ ик іх гаю пед м умі ж хеошо ш Ж Уучнщ О ІМК ши І г ЖЖ? ЩЕ жо зїжгумої мли сумку м іухУуя ходити МмаЖОИЩН Ми У «Ви еться фулуУт ДО дека ММ Е КАХ кю і жа (жі ро ее модулю км тих ужик мо теж сх у тт уч же кто, З киик тях ожю сту фрі ххх? пав деиВе по»шОю валюьшеасмеатинипУтаМміновуУ ВЕКЛлЛЯКМУ «ЕЕ 15 щік Ми Мо зу у ос вн НН НЕ так бю Тов Му да Мати я паж маш ол КУ СК Х Е а жі сх пав ж ЗХ жи КУ о ум сміх я ц пох ОВ ОК 15 ті дует Що оц Жоіхм МУХ Є іх кн з тех тоді Мк. й Мк муж ях п ож ю ж сам жиш о ж ХА Ту. шо мМ мех ММК Ов «жа її ре чн «В ВВ УТ ТОТХ Ук ет ку Ж. ко оКх х І а ХОМА рок Ппбиезха 12 Мухи жи у і Їх са жна полоні сту КАМ о НА А оку ко що ля нути жилки БЖ ІК бБлІкнОНУ скл ТОК МИХ ех ту ВОД ВОЩЙ ки ВАШТАНУ Кока НН» иа т їіК МТ м Ма др -е хуй ка ЩЕ щу нок кути треї у В ВК кт у ОКА хек мкавй авлийеЕ собою ще тзсеместилпипУутаміЕімоОовмуУу КисНИиЖхУ писку ЕК р; ПВА дО дриля у ж хи я.

СТУ що СМ: ХЖіжуло оду боки щи Теж Мід мо Жодних У я на хва шій чі Тв вне тбнк Жевк дав Тух й душ ЖЕ ес дя ща яп жо Бан Я Же ях кох КН їжу жу Кк гоже оче бо Ха Фі ж Де Міс Хоше ЛЬ Уа хо Зла Буж біз ВВЕ Хей 51065 Тхв беа Беї Аве ЖЕ ОС ЕЕ й АК 4 їх д СК ї мидллз я ши ПЕВ ШУ «ий 14 «ЛІ У жОс тик Жррхтчх У ХО чхіши МБротежя оду тю скит тій ятати и тр ох «ки шщишшама ТОК ОшАСХВ «и М хай пока щне псишкаеКОмнУ «ЕЕ «ки ВБАКІАНТ оно НИНІ «лиш І Ка КА ж сажі жи чи ОМ.

Я МУ тлу ви ух ях ве УК МВ кр хо дажжкуюмрУ вих кт Мпа далях «сом Впь»изЗ'МмалинилУпамиьове вБалпняхуУ пред ій ц ее й Тл хх бах ЗУМ г им о емує Долю беж ач я Хм Сік ус бору Дом мИЧа пів хижа о шал оду жа Бе Твх шЖех дав о тТшжжЖ Ве Бук Жук бив йзЕв оси вті Н пут КТ Темі ЕЛ хо Ума лим ТЛОМ лиж ї с жи Мою ЛИ Уж су ДЕ дж ма внв УА ій о Тхв нео Ме Ав ЇВ зок СД ТЕ км КМ кві» 18 ау у ха у км діа дж МК велич пеме хг атриеи т отих Хот. «ща М штучна лоні двніте хи ЖАХ сх : чай китах чримна поЗимає шу, ч Ж КЗ мамліввт сере секрети що Кос ди киселю пива спамІв слава о М х чх «ЖИ х 15 «їх 33 У СТУ х, СУКІхІх я вих УК хи піхов х зт кож зх чт ЩЕ тирсу ВОЮ докум, А МИХ «її» завЗзротнав праймер сапИпВ пвзазппчМихи часа вис лесца Кна Ка Ка нині «сиїїж ха «кпіїйв ДЕК «с Зса кухар мес мою Ом Е тк ПЕК У БО ЛК МІК КТК «ий» рн ЧК т. сус Ева чис лт прамМиий првамет» я отут М а ЗУ мн в АК кими тут ім оса вдих "7 саасоствивок сдассосст овочева Фк Ух «пів» їв шоу пли х«ік дик «іїх Штучна посбдпідзнви кала З ПКУ попи СИН хх де «мороку мм «ЖЖ ОО КЕНУ пиИихнаи примар вро дог каси В питали писала стани поле р жі юю Мо У щі т