CN107250155A

CN107250155A - 胰高血糖素衍生物

Info

Publication number: CN107250155A
Application number: CN201580071897.XA
Authority: CN
Inventors: 郑圣烨; 朴永振; 李钟锡; 崔宰赫; 林昌基; 权世昌
Original assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2017-10-13
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: AU2015372767A1; CN107250155B; IL253001A0; JP6758297B2; IL253001B; NZ733649A; US20220025012A1; US11254724B2; UA122967C2; EP3240802A1; BR112017013845A2; PH12017501205A1; US20200140515A1; EP3240802A4; EA036479B1; EP3240802B1; TWI696631B; SG10201906912VA; HK1246323A1; TW201632546A

Abstract

本发明涉及胰高血糖素衍生物的新颖肽和包括该肽作为活性成分的用于预防或治疗肥胖的组合物。根据本发明的胰高血糖素衍生物，相比于天然胰高血糖素，对于胰高血糖素样肽‑1受体和胰高血糖素受体两者显示更优异的活化效果，且因而可广泛地用作治疗肥胖的有效药剂。

Description

胰高血糖素衍生物

技术领域

本发明涉及对于胰高血糖素样肽-l(GLP-l)受体和胰高血糖素受体皆具有优异效果的新颖的胰高血糖素衍生物，以及用于预防或治疗肥胖的含有该胰高血糖素衍生物作为活性成分的组合物。

背景技术

近来的经济进展和生活方式改变已伴随膳食习惯的重大改变。特别地，现今忙碌的人们由于高热量饮食和不充足的运动而变成超重和肥胖。根据世界卫生组织(WHO)的报道，全世界超过10亿的成人超重，他们当中超过三百万人经临床诊断为严重肥胖，并且每年欧洲有250,000人、全世界有二百五十万人因超重或肥胖相关疾病死亡(World HealthOrganization,Global Strategy on Diet,Physical Activity and Health,2004)。

超重和肥胖增加血压和血胆固醇量，因此成为包括心脏疾病、糖尿病、关节炎等多种疾病的成因，或使这些疾病恶化。再者，超重和肥胖为儿童和青少年以及成人中增加如动脉粥状硬化、高血压、高血脂症和心脏疾病风险的一些主因。

像这样，目前肥胖被认为是流行于全世界的严重疾病且为多种疾病的成因。然而，由于肥胖被认为能通过自助努力而克服，肥胖患者被评价为低自我调控的人。尽管如此，因为肥胖为与食欲调控和能量代谢作用的机制密切相关的复杂疾病，所以其不容易治疗。因此，对于肥胖治疗，需要同时进行对于食欲调控的个人努力和能量代谢作用的异常机制的治疗。关于此点，有需要开发能治疗异常作用机制的药物。

以上努力的结果是已开发如利莫那班(Sanofi-Aventis)、西步曲明(Abbott)、康崔扶(Takeda)、奥利司他(Roche)等抗肥胖药物。然而，这些药物具有如致命的不良反应或治疗肥胖效果低的缺点。例如，利莫那班显示中枢神经系统疾病的不良反应，西步曲明和康崔扶显示不良的心血管作用，和奥利司他显示施用1年后仅减少约4kg体重的效果。因此，明显没有对于肥胖患者为安全开处方的可靠抗肥胖药物。

像这样，已进行活跃的研究以开发解决传统抗肥胖药物中的问题的新医药药物，且近来敏锐的注意力已关注于胰高血糖素衍生物。当因例如药物治疗、疾病、激素或酶缺乏而血糖水平降低时，由胰脏分泌胰高血糖素。胰高血糖素发信号至肝脏以将糖原裂解成葡萄糖和提升血液葡萄糖水平回到其正常水平。再者，已报道除了提升血液葡萄糖水平外，胰高血糖素通过压抑食欲和激活脂肪细胞中的激素敏感脂肪酶从而促进脂肪分解而具有抗肥胖效果。

胰高血糖素样肽-1(后文中，称为‘GLP-1’)——一种胰高血糖素衍生物——为开发作为于糖尿病患者中改良高血糖症药物的物质。GLP-1具有增加胰岛素合成和促进其分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、增加葡萄糖的使用和抑制食物摄取的功能。同时，艾塞那肽(exendin)-4——由蜥蜴毒液分泌且显示与GLP-1约50％的氨基酸序列同源性——已知通过活化GLP-1受体而在糖尿病患者中缓解高血糖症。然而，已经报道含有GLP-1或艾塞那肽-4的抗肥胖药物具有引起呕吐和恶心的不良作用。

从这一点上，作为GLP-1的替代物，胃泌酸调节素已突出显示，其可结合至GLP-1和胰高血糖素肽。胃泌酸调节素为自前胰高血糖素——胰高血糖素前体——所制备的肽，且具有如抑制食物摄取、促进饱足和脂肪分解的与GLP-1相同的效果，因而提升其作为抗肥胖剂的潜力。

然而，胃泌酸调节素或其衍生物具有因其体内短的半衰期和低有效性而每日需以高剂量施用的缺点。

发明内容

技术问题

本发明者们致力于改良肥胖治疗效果同时降低剂量，已开发在其氨基酸序列具有部分修饰的胰高血糖素衍生物，且确认该胰高血糖素衍生物对于胰高血糖素受体和GLP-1受体皆具有优异效果，从而完成本发明。

技术方案

本发明已将现有技术中所发生的上述问题了然于心，而且本发明的目的是提供显示优异肥胖治疗效果的新颖肽。

本发明的另一目的是提供含有该肽的用于预防或治疗肥胖的组合物。

发明的有益效果

相比于天然胰高血糖素，本发明的新颖肽可显著地活化GLP-受体和胰高血糖素受体两者，即使以小量施用也显示优异的抗肥胖效果，且因此其可广泛地用作治疗肥胖的安全和有效的药剂。

具体实施方式

为了实现上述目的，一方面，本发明提供具有下述式1的氨基酸序列的新颖肽：

X1-X2-QGTFTSDYSKYL-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-X24-W-L-X27-X28-X29(式1)

其中，X1为组氨酸、去氨基-组氨酰基、N-二甲基-组氨酰基、β-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、β-羧基咪唑并丙酰基或酪氨酸；

X2为α-甲基-谷氨酸、氨基异丁酸(Aib)、D-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或D-丝氨酸；

X15为半胱氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；

X16为谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、α-甲基-谷氨酸或不存在；

X17为半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或不存在；

X18为半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸或不存在；

X19为丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸或不存在；

X20为赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、α-甲基-谷氨酸或不存在；

X21为天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或不存在；

X23为异亮氨酸、缬氨酸或不存在；

X24为精氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或不存在；

X27为缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或不存在；

X28为谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺或不存在；和

X29为赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或不存在；

限制条件为排除与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。

本发明的肽可包括肽、肽衍生物和其肽模拟物，其通过取代而修饰部分氨基酸(一个或多个)来活化GLP-1受体和胰高血糖素受体。

如本文所用，术语“天然胰高血糖素”意指具有下列氨基酸序列的天然人胰高血糖素：His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO:1)

本发明提供上述所定义的肽作为天然胰高血糖素的衍生物，和在定义本发明所提供的肽中，该肽意图仅通过改变(一次或多次)序列中的位置(一个或多个)X而不同于天然胰高血糖素。

在根据本发明的式1的序列中，氨基酸可被认为是由第1个氨基酸至第29个氨基酸以传统方向由N-末端至C-末端连续编号。因此，式1序列中对于“位置”的描述应以与天然人胰高血糖素和其他分子的位置的描述相同的方式解读。

如本文所用，术语“肽”意指形式为其中二个或更多个氨基酸通过肽键(一个或多个)连接的化合物。对于本发明的目的，肽可意指通过活化GLP-1受体和胰高血糖素受体两者而显示抗肥胖效果的肽。

遍及本发明，通常给予不同氨基酸，如α-氨基异丁酸(Aib)、Sar(N-甲基甘氨酸)和α-甲基-谷氨酸的三字母代码是与对于天然产生的氨基酸的传统一字母或三字母代码一起使用。

此外，本发明中描述的氨基酸是根据IUPAC-IUB命名学简写为如下所示的。

丙氨酸(A)精氨酸(R)

天冬酰胺(N)天冬氨酸(D)

半胱氨酸(C)谷氨酸(E)

谷氨酰胺(Q)甘氨酸(G)

组氨酸(H)异亮氨酸(I)

亮氨酸(L)赖氨酸(K)

甲硫氨酸(M)苯丙氨酸(F)

脯氨酸(P)丝氨酸(S)

苏氨酸(T)色氨酸(W)

酪氨酸(Y)缬氨酸(V)

具有根据本发明式1的氨基酸序列的肽，可包括任何肽，其在SEQ ID NO:1所述的胰高血糖素的氨基酸序列中通过在翻译后引入取代、添加、删除或修饰(例如，甲基化、酰基化、泛素化和分子内共价键)，可活化胰高血糖素受体和GLP-1受体两者。

为了氨基酸的取代或添加，除了在人蛋白质中传统观察到的20个氨基酸之外，可使用非典型或非天然产生的氨基酸。非典型氨基酸的商业提供者包括Sigma-Aldrich、ChemPep、Genzyme Pharmaceuticals等。对于包括这些非典型氨基酸的肽序列和对于典型肽序列可合成或由商业肽制造公司购得，例如American Peptide Company或Bachem(USA)或Anygen(Korea)等。

为了增加本发明的肽对胰高血糖素受体和GLP-1受体的效果，在由SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列中，第1个氨基酸——组氨酸——可通过删除组氨酸的α-碳而以4-咪唑并乙酰基取代，通过删除N-末端氨基而以去氨基-组氨酰基取代，通过以二个甲基修饰N-末端氨基而以N-二甲基-组氨酰基取代，通过以羟基取代N-末端氨基而以β-羟基咪唑并丙酰基取代，通过以羧基取代N-末端氨基而以羧基咪唑丙酰基取代，或以酪氨酸取代。

此外，结合至GLP-1受体的结构域可用可强化疏水键和离子键的氨基酸取代。再者，胰高血糖素序列的部分序列可以GLP-1的氨基酸序列或艾塞那肽-4的氨基酸序列取代以增加GLP-1受体的活性。

此外，胰高血糖素序列的部分序列可用可强化α-螺旋的序列取代。优选地，在位置10、14、16、20、24和28的式1的氨基酸(一个或多个)可以由Tyr(4-Me)、Phe、Phe(4-Me)、Phe(4-Cl)、Phe(4-CN)、Phe(4-NO₂)、Phe(4-NH₂)、Phg、Pal、Nal、Ala(2-噻吩基)或Ala(苯并噻吩基)所组成的氨基酸(一个或多个)或其衍生物取代，这些氨基酸已知有助于α-螺旋形成。为此目的欲添加的氨基酸或其衍生物的种类和数目并不限定。

此外，优选地，在式1的氨基酸序列的位置10和14、12和16、16和20、20和24以及24和28的至少一个氨基酸对中的至少一个氨基酸可以谷氨酸或赖氨酸取代，造成可形成环的谷氨酸和赖氨酸对，而且用于插入的环数目亦不限定。

在示例性实施方式中，胰高血糖素的氨基酸序列可以具有结合至GLP-1受体的能力而使该肽对于GLP-1受体和胰高血糖素受体皆可显现优异效果的序列取代。

优选地，本发明的肽可为式1的氨基酸序列中的肽，

其中X1为组氨酸；

X2为α-甲基-谷氨酸；

X15为半胱氨酸或天冬氨酸；

X16为丝氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；

X17为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸或半胱氨酸；

X18为半胱氨酸、缬氨酸或精氨酸；

X19为丙氨酸或缬氨酸；

X20为谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸；

X21为天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸；

X23为异亮氨酸或缬氨酸；

X24为精氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺；

X27为缬氨酸、赖氨酸或甲硫氨酸；

X28为谷氨酰胺、赖氨酸或天冬酰胺；和

X29为赖氨酸、甘氨酸或苏氨酸；

限制条件为排除与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列

更优选，本发明的肽可为包括选自SEQ ID NO:2至14的氨基酸序列的氨基酸序列的肽。

本发明的肽可通过标准合成方法、重组表达系统或本领域中已知的任何方法制备。因此，根据本发明的胰高血糖素类似物可通过包括下述的数种方法合成：

(a)通过固相或液相方法的逐步方法或片段组装而合成肽，分离最终肽，接着纯化；

(b)在宿主细胞中表达编码该肽的核酸构建体，且由该宿主细胞培养物回收该表达产物；

(c)在无细胞管中进行编码肽的核酸构建体的表达，且回收该表达产物；或

通过(a)、(b)和(c)的随机组合而获得肽片段，连接这些片段，从而回收对应肽的方法。

本发明者们通过体外试验确认，本发明的肽相比于天然胰高血糖素对GLP-1受体和胰高血糖素受体具有优异效果(参见表2)。此外，通过体外试验确认，本发明的肽在肥胖动物模式中具有对抗喂食摄入的优异抑制效果，因而证明本发明的肽即使当小量施用时也可显现优异的抗肥胖效果。

因此，本发明的肽为能剌激GLP-1受体和胰高血糖素受体两者中cAMP形成的双重激动剂，且相比于现存胰高血糖素，本发明的肽期待为具有更优异的治疗肥胖的效果。关于此点，本发明的肽对于治疗肥胖和肥胖相关疾病可提供更具吸引力的选择。

本发明的肽——为双重激动剂——可组合GLP-1在食物摄入中的效果和胰高血糖素在脂肪代谢中的效果，从而协同地作用以加速脂质累积物的移除和体重的持续降低。作为双重激动剂的该协同效果可助于降低心血管风险因子，如高胆固醇和LDL，这些因子可与对于体重的效果完全无关。

因此，本发明的肽可用作医药药物用于防止重量增加、促进重量降低、减低超重和不但治疗包括病态肥胖的肥胖(例如通过调整食欲、摄食、食物摄人、热量摄入和/或能量消耗)，而且治疗肥胖相关疾病，包括肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病、肥胖诱发的睡眠呼吸暂停，但不限于此，以及健康状况。此外，本发明的肽可用于治疗可与肥胖相关的医学状况，如代谢综合征、高血压、动脉硬化诱发的血脂异常、动脉粥状硬化、动脉硬化、冠状动脉心脏疾病、中风等。然而，关于这些症状，本发明的肽的效果可完全地或部分地通过体重相关效果而调节或可与这些无关。

为了提高本发明的胰高血糖素衍生物的治疗效果，该胰高血糖素衍生物可使用本领域的传统技术修饰，如聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚糖等的修饰，或与白蛋白、转铁蛋白(transferring)、脂肪酸、免疫球蛋白等的融合物。例如，本发明化合物中至少一个氨基酸侧链可于体内接合至聚合物以增加溶解性和/或半衰期和/或增加生物利用度。这些修饰已知降低治疗蛋白质和肽的清除。

优选地，聚合物可为水溶性(两性的或亲水的)、无毒的和药学上无活性的，和更优选可包括PEG、PEG的均聚物或共聚物、PEG的单甲基取代聚合物(mPEG)或聚氨基酸如聚赖氨酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸。

对本领域技术人员显而易见的是经此修饰的胰高血糖素衍生物较天然胰高血糖素具有更优异的治疗效果。因此，胰高血糖素衍生物的变异体亦包括在本发明的范围中。

另一方面，本发明提供编码该肽的多核苷酸。

如本文所用，术语“同源性”，如使用于多核苷酸，意指与野生型氨基酸序列和野S生型核苷酸序列的序列相似度，且包括与编码该多肽的多核苷酸序列共享至少75％、优选至少85％、更优选至少90％、和甚至更优选至少95％的基因序列。这些同源性比较可以通过肉眼或使用可容易购得的比较程序进行。市场上可取得的计算机程序可计算二个或更多个序列之间的同源性，其表示为百分比(％)。可计算相邻序列之间的同源性(％)。

肽可通过将编码肽的多核苷酸插入至载体，接着通过其表达而大量获得。

此类重组表达中，本发明的多核苷酸通常被插入至合适载体，且形成拥有该核苷酸的克隆或重组载体，且该载体亦包括在本发明的范围中。

如本文所用，术语“重组载体”意指包括编码目标肽的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，该多核苷酸可操作地连接至合适的调控序列，使得目标肽能在合适的宿主细胞中表达。该调控序列可包括能起始转录的启动子、用于调控转录的操作子序列、编码合适的mRNA核糖体-结合结构域的序列和用于调控转录和翻译终止的序列。重组载体，一旦转化至适当的宿主细胞后，就可无关于宿主基因组而复制或起作用，且可整合至宿主基因组本身。

用于本发明的重组载体没有特别限定，只要该载体可在宿主细胞中复制，且其可使用本领域中已知的任何载体构建。将使用的传统载体的实例可包括野生型或重组质粒、粘粒、病毒、和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等。作为质粒载体，可使用基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL、和基于pET的质粒。将用于本发明的载体没有特别限定，本领域已知的任何载体皆可使用。

重组载体可用于转化宿主细胞以产生本发明的肽。此外，作为本发明的一部分，经转化细胞可用于本发明的核酸片段的扩增或载体的复制，或经培养细胞或细胞系可用于重组制造本发明的肽。

如本文所用，术语“转化”意指将包括编码目标蛋白质的多核苷酸的重组载体导入至宿主细胞，以便能在该宿主细胞中表达该多核苷酸所编码的目标蛋白质。不论是否插入多核苷酸以位于染色体内或染色体外，只要转化的多核苷酸可在宿主细胞中表达即可。

此外，多核苷酸包括编码目标蛋白质的DNA和RNA。多核苷酸可以任何形式导入，只要其可在被导入至宿主细胞后表达即可。例如，该多核苷酸可以表达盒的形式被导入至宿主细胞，该表达盒为包括自我表达所需要的所有基本特征的基因组结构。表达盒通常可包括可操作地连接至该多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可为可自我复制的表达载体。此外，该多核苷酸自身可被导入至宿主细胞且可操作地连接至用于其在宿主细胞中表达必需的序列，但不限定于此。

此外，如本文所用，术语“可操作地连接”意指一种状态，其中启动子序列功能性地连接至该基因序列，该启动子序列起始和调节编码目标蛋白质的多核苷酸的转录。

适合于本发明的宿主细胞没有特别限定，只要其可表达本发明的多核苷酸即可。可用于本发明的宿主细胞的实例可包括埃希氏菌属(Escherichia sp.)如大肠杆菌(E.coli)；芽孢杆菌(Bacillus sp.)如枯草杆菌(Bacillus subtilis)；假单胞菌属(Pseudomonas sp.)如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；酵母如毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆虫细胞如秋粘虫(Spodoptera frugiperda)(SF9)；和动物细胞如CHO、COS、BSC等。

另一方面，本发明提供用于预防或治疗肥胖的含有肽作为活性成分的药物组合物。

如本文所用，术语“预防”意指通过施用本发明的肽或药物组合物而造成抑制或延迟肥胖发生的任何作用，术语“治疗”意指通过施用本发明的肽或药物组合物而造成肥胖症状改善或有利改变的任何作用。

如本文所用，术语“施用”意指以合适的方式对患者导入特定物质。本发明的药物组合物的施用途径，虽无特别限定，但是可以是任何一般途径，例如，腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、经口、局部、鼻内、肺内、直肠内等，只要药物组合物可到达体内的目标组织即可。

如本文所用，术语“肥胖”意指体内已累积过多身体脂肪的医学状况，且当身体质量指数(BMI；通过人的重量(kg)除以身高(m)平方所获得的测量值)为25或更高时认定为肥胖。一般而言，肥胖由因热量摄取高于能量消耗的能量不平衡所引起。肥胖为代谢疾病，其可诱发糖尿病和高脂血症，增加性功能障碍、关节炎和心血管疾病的风险，而且在某些情况中，其亦与癌症的发生相关。

本发明的药物组合物可包括药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

如本文所用，术语“药血可接受的”意指足量，其可显现治疗效果但不发生任何不良反应，且其可由本领域技术人员根据医药领域已知的因素如欲治疗的疾病种类、患者的年龄、体重、性别、对药物的敏感性、施用途径、施用数目、欲组合或同时使用的药物(一种或多种)等来决定。

本发明药物组合物可进一步包括药学可接受的载体。对于经口施用，药学可接受的载体可包括，但不限于，粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和香料。对于可注射施用，可混合使用缓冲剂、防腐剂、镇痛药、增溶剂、等张剂和稳定剂。对于局部施用，药学可接受的载体可包括基料、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。

本发明的药物组合物可与药学可接受的载体组合而配制成各种剂型。例如，对于经口施用，医药组合物可配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、圆片等。对于可注射施用，药物组合物可配制成呈单一剂量形式的安瓿或多剂量施用。药物组合物亦可配制成溶液、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊和长效制剂。

另一方面，适用于本发明的药物组合物的载体、赋形剂和稀释剂的实例可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。此外，本发明的药物组合物可进一步包括填料、抗凝结剂、润滑剂、保湿剂、香料、防腐剂等。

此外，本发明的药物组合物可配制成选自以下中的一个：片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊、悬浮剂、内用的液体药物、乳剂、糖浆、无菌水溶液、非水溶剂、冷冻干燥的机制和栓剂。

此外，药物组合物可根据传统方法配制成用于单位施用至患者身体的合适制剂，优选地配制成用于肽药物施用的制剂类型，且根据传统方法通过皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、肺内、皮内、皮下、腹膜内、鼻内、胃内、局部、舌下、阴道内或直肠内途径(但不限于此)经口或胃肠外施用。

此外，肽可通过与多种载体如盐水溶液或有机溶剂混合使用，其可接受为医药药物。为了增加稳定性或吸收性，可与碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或右旋糖、或抗氧化剂如谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质或其他稳定剂等一起使用。

本发明的药物组合物的施用量和次数可根据作为活性成分的药物类型，以及其他因素如欲治疗的疾病、施用途径、患者的年龄、性别、体重、和病的严重性等来决定。

本发明组合物的总有效剂量可作为单一剂量或可根据区段治疗方案作为多剂量长时期施用至患者。本发明的药物组合物可根据疾病严重性而具有不同含量的活性成分。优选地，本发明的肽的总剂量可为患者体重每1kg约0.0001μg至500mg。然而，关于肽的剂量，有效剂量考虑多种因素如患者的年龄、体重、健康状况、性别、病严重性、膳食和排泄率等来决定，本领域技术人员可根据本发明组合物的特别用途而决定合适的有效剂量。

本发明的药物组合物的制剂、施用途径和施用方法可没有特别限定，只要该药物组合物可显示本发明的效果即可。

由于本发明的药物组合物具有优异的体内持续时间与效价，本发明的药物组合物的施用次数和频率可显著降低。

药物组合物可单独施用或与显示预防或治疗肥胖效果的其他药物制剂组合施用。显示预防或治疗肥胖效果的药物制剂可包括，但不具体限于，GLP-1受体激动剂、瘦素受体激动剂、DPP-IV抑制剂、Y5受体拮抗剂、黑色素浓缩激素(MCH)受体拮抗剂、Y2/3受体激动剂、MC3/4受体激动剂、胃/胰脂肪酶抑制剂、5HT2c激动剂、3A受体激动剂、糊精受体激动剂、饥饿肽拮抗剂和/或饥饿肽受体拮抗剂等。

另一方面，本发明提供用于预防或治疗肥胖的方法，包括对受试者施用该肽或含有该肽的药物组合物。

如本文所用，术语“受试者”意指怀疑具有肥胖或处于具有肥胖风险的受试者，且具体地，意指哺乳动物，包括人类、大鼠和牛，但受试者可为可通过本发明的肽治疗的任何受试者，而无限定。含有本发明的肽的药物组合物的施用可有效地治疗怀疑具有肥胖的受试者，且该肥胖与上面描述的相同。

本发明的治疗方法可包括施用药学有效量的含有该肽的药物组合物。组合物的每日总剂量可通过合适的医学判断由医师决定，且该组合物可一次或以几次分份剂量施用。然而，鉴于本发明的目的，对于任何特定患者的组合物的具体的治疗有效剂量可根据医学领域中熟知的各种因素而变化，包括欲达到的响应的种类与程度，根据其他药剂是否与其使用的特定组合物，患者的年龄、体重、健康状况、性别和膳食，施用的时间与途径，组合物的排出速率，治疗的持续时间，与本发明组合物组合或同时使用的其他药物和医学领域中已知的其他因素。

又一方面，本发明提供肽在制备用于预防或治疗肥胖的医药药物中的用途。

发明方式

后文中，本发明将参照下述实施例更详细地进行描述。然而，这些实施例仅作说明的目的，且本发明不意图受限于这些实施例。

实施例1：用于体内活化的细胞系的产生

<1-1>显示响应于GLP-1的cAMP的细胞系的产生

使用人GLP-1受体基因的cDNA(OriGene Technologies,Inc.,USA)的开放阅读框架(ORF)作为模板，以及分别包括Hindlll和EcoRI限制酶切位点的SEQ ID NOS:15和16表示的正向和反向引物来进行PCR反应。

特别地，进行PCR反应30个循环(95℃变性60秒，55℃退火60秒，和68℃延伸30秒)。PCR产物在1.0％琼脂凝胶中进行电泳，通过洗脱由其获得405bp片段。

正向引物：5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3'

反向引物：5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3'

PCR产物克隆至已知的动物细胞表达载体x0GC/dhfr(韩国专利号10-0880509，后文相同)，以构建重组载体x0GC/GLP1R。

由此所构建的重组载体x0GC/GLP1R使用Lipofectamine(Invitrogene,USA)转化至中国仓鼠卵巢细胞系CHO DG44的细胞中，该细胞培养于含有10％FBS的DMEM/F12培养基中，且于含有G418(l mg/mL)和氨甲蝶呤(10nM)的选择培养基中选择与培养。自其选择单克隆细胞系，且于其中，最终选择显示以剂量依赖方式响应GLP-1的优异cAMP的细胞系。

<1-2>显示响应于胰高血糖素的cAMP的细胞系的产生

使用人胰高血糖素受体基因的cDNA(OriGene Technologies,Inc.,USA)的开放阅读框架(ORF)作为模板，以及分别包括EcoRI和XhoI限制酶切位点的SEQ ID NOS:17和18表示的正向引物和反向引物来进行PCR反应。

具体地，进行PCR反应30个循环(95℃变性60秒，55℃退火60秒，和68℃延伸30秒)。PCR产物在1.0％琼脂凝胶上进行电泳，通过洗脱由其获得435bp片段。

正向引物：5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'

反向引物：5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'

PCR产物克隆至已知的动物细胞表达载体x0GC/dhfr，以构建重组载体x0GC/GCCR。

由此所构建的重组载体x0GC/GCCR使用Lipofectamine(Invitrogene，USA)转化至中国仓鼠卵巢细胞系CHO DG44的细胞中，该细胞培养于含有10％FBS的DMEM/F12培养基中，且于含有G418(1mg/mL)和氨甲蝶呤(10nM)的选择培养基中选择与培养。自其选择单克隆细胞系，且于其中，最终选择显示以剂量依赖方式响应胰高血糖素的优异cAMP的细胞系。

实施例2：胰高血糖素衍生物的合成

为了开发对于GLP-1受体和胰高血糖素受体两者具有优异效果的胰高血糖素衍生物，SEQ ID NO:1表示的天然胰高血糖素的氨基酸序列用具有结合至GLP-1受体的能力的氨基酸序列取代，且如下述表1所示合成胰高血糖素衍生物。

表1

上述表1中，SEQ ID NO:2至14的序列中表示为“X”的氨基酸代表α-甲基-谷氨酸，其为非天然氨基酸，且这些序列中的赖氨酸残基可与谷氨酸残基形成环。

实施例3：胰高血糖素衍生物的体外活性的测量

为了测量实施例2中所合成的胰高血糖素衍生物的抗肥胖活性，使用实施例1-1和1-2中所制备的转化细胞系测量胰高血糖素衍生物的体外细胞活性。

制备转化细胞系使得人GLP-1受体基因和人胰高血糖素受体基因可分别表达于CHO，和适合用于测量GLP-1和胰高血糖素的活性。因此，根据本发明所合成的胰高血糖素的活性分别使用转化细胞系测量。

具体地，转化细胞系分别每周传代培养二或三次，以l x 10⁵细胞/孔分取至96-孔板，且培养24小时。

培养的细胞用Krebs-Ringer Bicarbonate(KRB)缓冲溶液清洗，悬浮于40mL的含有1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的KRB缓冲溶液，且于室温静置5分钟。

根据本发明的天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)或胰高血糖素衍生物(代表性地，SEQ ID NO:12至14的肽)进行范围为1000nM至0.02nM 5-倍间隔的连续稀释，对其添加40mL的上述细胞，且于CO₂培养箱中于37℃培养1小时。

然后，20mL的细胞裂解缓冲液添加至各自所得物，且将该细胞裂解物施加至cAMP分析试剂盒(Molecular Device,USA)以测量cAMP浓度，且计算与相互比较EC₅₀值。结果显示于下述表2中。

表2

如上述表2所示，根据本发明的胰高血糖素衍生物相比于SEQ ID NO:1表示的天然胰高血糖素，对于GLP-1受体和胰高血糖素受体两者显示优异的效果。

胰高血糖素已知通过活化GLP-1受体和胰高血糖素受体而具有肥胖治疗效果，从而抑制食欲、增进饱足和促进脂肪细胞裂解。由于根据本发明的胰高血糖素衍生物，相比于天然胰高血糖素，显示对于GLP-1受体和胰高血糖素受体两者具有优异的体外效果，所以这些胰高血糖素衍生物可用作较现存胰高血糖素对于治疗肥胖更有效的药剂。

虽然用于说明目的已公开本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员将明了可能的各种修饰、添加和取代，而不背离如所附权利要求中公开的本发明的范围与精神。

序列表

<110> 韩美药品株式会社

<120> 胰高血糖素衍生物

<130> OPA15332

<150> KR10-2014-0193691

<151> 2014-12-30

<160> 18

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 人胰高血糖素

<400> 1

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 2

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 2

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Cys Ala Lys Glu Phe Ile Gln Trp Leu Val Asn Thr

20 25

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 3

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Cys Val Lys Leu Phe Ile Gln Trp Leu Val Asn Thr

20 25

<210> 4

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 4

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Cys Ala Lys Glu Phe Val Glu Trp Leu Val Asn Thr

20 25

<210> 5

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 5

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Cys Ala His Glu Phe Val Glu Trp Leu Val Asn Thr

20 25

<210> 6

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 6

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Ala His Glu Phe Val Glu Trp Leu Val Asn Thr

20 25

<210> 7

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 7

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Val His Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Thr

20 25

<210> 8

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 8

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Lys Cys Ala His Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Lys

20 25

<210> 9

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 9

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Glu Cys Ala His Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Gln Gly

20 25

<210> 10

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 10

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Glu Cys Ala Lys Glu Phe Ile Arg Trp Leu Lys Lys Gly

20 25

<210> 11

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 不确定

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 11

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Glu Cys Ala Lys Glu Phe Ile Arg Trp Leu Lys Lys Gly

20 25

<210> 12

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 12

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Cys Glu

1 5 10 15

Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 13

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 13

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Cys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 14

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰高血糖素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa是α-甲基-谷氨酸

<400> 14

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Cys Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 15

cccggccccc gcggccgcta ttcgaaatac 30

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 16

gaacggtccg gaggacgtcg actcttaaga tag 33

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 17

cagcgacacc gaccgtcccc ccgtacttaa ggcc 34

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 18

ctaaccgact ctcggggaag actgagctcg cc 32

Claims

1.一种肽，其包括下述式1的氨基酸序列：

X1-X2-QGTFTSDYSKYL-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-X24-W-L-X27-X28-X29(式1)

X15为半胱氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；

X16为谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、α-甲基-谷氨酸或不存在；

X18为半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸或不存在；

X19为丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸或不存在；

X21为天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或不存在；

X23为异亮氨酸、缬氨酸或不存在；

X28为谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺或不存在；和

X29为赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或不存在；

限制条件为排除与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的肽，其中，在式1所述的氨基酸序列中，其中X1为组氨酸；

X2为α-甲基-谷氨酸；

X15为半胱氨酸或天冬氨酸；

X16为丝氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；

X17为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸或半胱氨酸；

X18为半胱氨酸、缬氨酸或精氨酸；

X19为丙氨酸或缬氨酸；

X20为谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸；

X21为天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸；

X23为异亮氨酸或缬氨酸；

X24为精氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺；

X27为缬氨酸、赖氨酸或甲硫氨酸；

X28为谷氨酰胺、赖氨酸或天冬酰胺；和

X29为赖氨酸、甘氨酸或苏氨酸；

限制条件为排除与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的肽，其中所述肽为能活化GLP-1受体和胰高血糖素受体的胰高血糖素衍生物。

4.权利要求1所述的肽，其中所述肽具有抗肥胖效果。

5.权利要求1所述的肽，其中在上述所述式1的所述氨基酸序列的位置10、14、16、20、24和28的至少一个氨基酸用选自以下的氨基酸取代：Tyr(4-Me)、Phe、Phe(4-Me)、Phe(4-Cl)、Phe(4-CN)、Phe(4-NO₂)、Phe(4-NH₂)、Phg、Pal、Nal、Ala(2-噻吩基)和Ala(苯并噻吩基)或其衍生物。

6.权利要求1所述的肽，其中在上述所述式1的所述氨基酸序列的位置10和14、12和16、16和20、20和24以及24和28的至少一个氨基酸对中的至少一个氨基酸用谷氨酸或赖氨酸取代。

7.权利要求1所述的肽，其中在上述所述式1的所述氨基酸序列的位置10和14、12和16、16和20、20和24以及24和28的至少一个氨基酸对形成环。

8.权利要求1所述的肽，其中所述肽包括选自SEQ ID NO:2至14的氨基酸序列的氨基酸序列。

9.一种多核苷酸，其编码权利要求1至8中任一项所述的肽。

10.一种用于预防或治疗肥胖的药物组合物，其包括权利要求1至8中任一项所述的肽作为活性成分。

11.权利要求10所述的药物组合物，其进一步包括药学上可接受的载体。

12.权利要求10所述的药物组合物，其中所述药物组合物单独施用或与显示预防或治疗肥胖效果的其他药物制剂组合施用。

13.权利要求12所述的药物组合物，其中所述显示预防或治疗肥胖效果的药物制剂选自GLP-1受体激动剂、瘦素受体激动剂、DPP-IV抑制剂、Y5受体拮抗剂、黑色素浓缩激素(MCH)受体拮抗剂、Y2/3受体激动剂、MC3/4受体激动剂、胃/胰脂肪酶抑制剂、5HT2c激动剂、3A受体激动剂、糊精受体激动剂、饥饿肽拮抗剂和饥饿肽受体拮抗剂。

14.一种用于预防或治疗肥胖的方法，包括对受试者施用权利要求1至8中任一项所述的肽或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物。

15.权利要求1至8中任一项所述的肽或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物在制备用于预防或治疗肥胖的医药药物中的用途。