TWI790567B - 一種用於富集和檢測生物樣品中微生物的方法和裝置 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種用於富集和檢測生物樣品中微生物的方法及裝置,使得生物樣品可通過高分子聚合物改質的基材進行過濾,改質的基材具有高度專一性的有核細胞捕捉或分離能力,並且其中的微生物可通過或流過高分子聚合物改質的基材進入到濾液中,從而在白細胞減除過程中富集生物樣品中的微生物(包括細菌、黴漿菌、真菌、病毒與孢子等),進而降低有核細胞(如白細胞)所造成的病源檢驗干擾。
Description
本發明屬於微生物檢測技術領域,具體涉及一種減除生物樣品中有核細胞的干擾,富集和檢測微生物的方法和裝置。
利用分子檢測的方法在生物樣本中偵測致病微生物(包括細菌、黴漿菌、真菌、病毒與孢子等)時,由於生物樣品中的人源細胞數量和基因體大小都遠遠大於致病微生物的細胞數量和基因體大小,人源DNA通常高達致病微生物DNA的幾萬倍甚至是幾百萬倍之多,故而在致病微生物的分子偵測中,人源DNA的背景干擾一直是一個挑戰。目前有通過differential lysis的方法,例如QIAamp DNA Microbiome Kit和最近發表的改良方法(Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection. Charalampous et al., Nature Biotechnology, 2019),也有人類DNA有甲基化修飾來去除人源DNA的方法,例如NEBNext® Microbiome DNA Enrichment Kit(New England Biolabs)。但是這些方法都有操作複雜、效果不一致的缺點。
本本發明的目的在於提供一種減除生物樣品中的有核細胞的干擾,富集和檢測生物樣品中的微生物的方法和裝置。
為了實現上述目的,本發明提供一種富集和檢測生物樣品中微生物的方法,包括以下步驟:a)取得生物樣品;b)將生物樣品通過Acrodisc®
白細胞針頭過濾器或高分子聚合物改質的基材進行過濾,生物樣品中的有核細胞被捕捉或分離,並且其中的微生物可通過Acrodisc®
白細胞針頭過濾器或高分子聚合物改質的基材進入到濾液中;c)對該濾液進行微生物檢測;其中,所述有核細胞包括紅血球母細胞、白細胞和癌細胞的一種或多種;高分子聚合物通過一種或多種單體進行聚合反應製備而得,且其中一種單體具有式(1)結構:式(1)
R1獨立選自氫、甲基、乙基、羥基、C1至C12烷基及苯基,R2獨立選自氫、甲基、乙基、C1至C6烷基、氨基及苯基,n為1至5的整數。
優選地,生物樣品中的有核細胞為白細胞。
優選地,生物樣品中的微生物為細菌。
優選地,生物樣品中的微生物為真菌。
在一些實施方案中,所得濾液中微生物的保留率為65%以上。
在一些實施方案中,所得濾液中微生物的保留率為80%以上。
在一些實施方案中,生物樣品中的紅細胞可通過或流過高分子聚合物改質的基材進入到濾液中,濾液中紅細胞的保留率為80%以上。
在一些實施方案中,生物樣品中的血小板可通過或流過高分子聚合物改質的基材進入到濾液中,濾液中血小板的保留率為80%以上。
在一些實施方案中,生物樣品中的血漿纖維蛋白原可通過或流過高分子聚合物改質的基材進入到濾液中,濾液中血漿纖維蛋白原的保留率為80%以上。
在一些實施方案中,所得濾液中微生物的檢出率是未經過過濾的生物樣品的檢出率的2倍以上。
在一些實施方案中,所得濾液中微生物的檢出率是未經過過濾的生物樣品的檢出率的40倍以上。
在一些實施方案中,上述式(1)結構的單體可以為N-羥乙基丙烯醯胺或N-(2-羥乙基)丙烯醯胺。
在一些實施方案中,還包括另一單體,該另一單體可以是甲基丙烯酸丁酯,式(1)結構的單體與該另一單體共聚合形成共聚物。
在一些實施方案中,本發明的高分子聚合物為鏈段高分子
在一些實施方案中,本發明的高分子聚合物以塗佈、噴灑或浸漬的方式設置於基材上。該基材可以為聚丙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、纖維素、聚對苯二甲酸丁二酯。高分子聚合物改質的基材的表面元素包含碳、氧及氮,且碳、氧及氮的總莫爾百分比定義為100%,碳的莫爾百分比為約76.22%至約79.84%,氧的莫爾百分比為約18.1%至約21.04%,以及氮的莫爾百分比為約2.05%至約2.75%。
在一些實施方案中,所得濾液經過DNA純化處理,可以通過PCR、qPCR、digital PCR、NGS、MassSpec或Nanopore sequencing進行分析。
優選地,所得濾液經過DNA純化處理,依照Oxford Nanopore快速建庫的方法構建測序文庫,使用Oxford Nanopore GridION測序儀進行測序分析。
在一些實施方案中,生物樣品選自血液、血清、唾液、尿液、糞便、喉嚨或鼻拭子、脊髓液、細胞、淋巴液、腹膜液、玻璃體液、淚液、精液、陰道分泌物、肺積液、漿膜液、支氣管肺泡灌洗液、細胞培養物或組織樣品。
在一些實施方案中,本發明富集和檢測生物樣品中微生物的方法可用於生物樣品的病源檢驗。
在一些實施方案中,本發明還提供一種用於富集和檢測生物樣品中微生物的方法的裝置,該裝置包括:上殼體,過濾材料和下殼體,過濾材料位於上殼體和下殼體之間,過濾材料由上述高分子聚合物改質的基材製備而成。上殼體上設有進口,下殼體上設有出口,生物樣品從上殼體的進口進入,經過所述過濾材料的過濾,經下殼體出口流出。
本發明提供的富集和檢測生物樣品中微生物的方法及裝置,使得生物樣品可通過Acrodisc®白細胞針頭過濾器或高分子聚合物改質的基材進行過濾,上述商業化過濾器和改質的基材具有高度專一性的有核細胞捕捉或分離能力,並且生物樣品中的微生物可通過Acrodisc®白細胞針頭過濾器或高分子聚合物改質的基材進入到濾液中;從而在有核細胞減除過程中,富集生物樣品中的微生物(包括細菌、黴漿菌、真菌、病毒與孢子等),進而降低因有核細胞所造成的病源檢驗干擾。
術語“捕捉”是指樣品中的有核細胞,接觸到材料表面上,受到材料與細胞之間的疏水、氫鍵、或靜電分子作用力的吸引,造成各式細胞可能直接吸貼附於材料表面上,或先吸附體積較小的血漿蛋白質與血小板,才導致較大型的細胞貼附,這些過程被定義成有核細胞「捕捉」。
術語“分離”是指將含有人體細胞的樣品通過分離有核細胞的材料後,可將有核細胞由樣品中分離出來,亦指可減少樣品中的有核細胞含量,甚至可大量減少樣品中的有核細胞含量,而使得分離後的濾液的有核細胞濃度小於原來含有人體細胞的樣品。
術語“減除有核細胞”並非是指所有的或實質上所有的有核細胞被完全去除,該用語是用以廣義地指出有核細胞的數目在分離或過濾的過程中減少。
本發明的生物樣品可通過Acrodisc®
白細胞針頭過濾器或高分子聚合物改質的基材進行過濾,該商業化過濾器和改質的基材具有高度專一性的有核細胞捕捉或分離能力,並且其中的微生物可通過Acrodisc®
白細胞針頭過濾器或高分子聚合物改質的基材進入到濾液中;從而在有核細胞減除過程中,富集生物樣品中的微生物(包括細菌、黴漿菌、真菌、病毒與孢子等),進而降低因有核細胞所造成的病源檢驗干擾,並可將得到的有效富集微生物的生物樣品進行DNA純化處理,取適當濃度的純化後的DNA依照Oxford Nanopore快速建庫的方法構建測序文庫,使用Oxford Nanopore GridION測序儀進行測序分析,測序結果表明Acrodisc®
白細胞針頭過濾器和改質的基材可專一性去除有核細胞並達到富集微生物的效果。
本發明所使用的Acrodisc®
白細胞針頭過濾器(Sterile Acrodisc®
White Blood Cell Syringe Filter, Catalog Nos. AP-4951 & AP-4952)是由PALL銷售的一種經過驗證的過濾裝置,其能夠將白細胞與全血樣品分離,同時允許紅細胞(RBC)和血小板通過濾膜。
本發明富集和檢測生物樣品中微生物的方法包括:首先,取得生物樣品如血液;其次,使得生物樣品通過高分子聚合物改質的基材進行過濾,生物樣品中的有核細胞被捕捉或分離,所得濾液中人源有核細胞含量大大降低,為減除人源有核細胞的濾液,並且微生物可通過改質的基材進而在濾液中得到富集。
本發明的高分子聚合物通過一種或多種單體進行聚合反應製備而得,該單體可以是含醯胺基及羥基的單體,該含醯胺基及羥基的單體具有式(1)的結構:(1)
在式(1)中,R1獨立選自氫、甲基、乙基、羥基、C1至C12烷基及苯基,R2獨立選自氫、甲基、乙基、C1至C6烷基、氨基及苯基,n為1至5的整數。
根據本發明的一些實施方式,其中式(1)中的R1為氫,R2為氫,以及n為1。
根據本發明的一些實施方式,該含醯胺基及羥基的單體為N-羥乙基丙烯醯胺((N-Hydroxyethyl acrylamide),或N-(2-羥乙基)丙烯醯胺(N-(2-Hyroxyethyl) acrylamide)。
根據本發明的一些實施方式,該高分子聚合物由式(1)的單體及至少另一單體共聚合形成共聚物,另一單體是甲基丙烯酸丁酯(Butyl methacrylate, BMA)。
根據本發明的一些實施方式,該高分子聚合物為鏈段高分子。
高分子聚合物的製備以已知技術進行,以一種單體作為基材咬合端,以另一種單體作為功能作用端,依比例進行混合,並加入起始劑ACVA,溶劑為乙醇,接著,在70℃的環境下進行聚合反應,從而製備出所需高分子聚合物。待反應完成後,以去離子水作為析出劑將產物析出並乾燥。
本發明的高分子聚合物可以塗佈(coating)、噴灑或浸漬的方式設置於基材上,達到基材改質的目的。具體而言,取適量高分子聚合物,以乙醇為溶劑,配製成高分子溶液,選取合適的基材,裁剪為合適大小,浸泡於高分子溶液中約1分鐘,再以去離子水洗去表面殘餘溶液並乾燥。據此,可獲得經高分子聚合物塗佈(coating)的表面改質的基材。基材的材料可以為聚丙烯(polypropylene, PP)、聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate, PET)、纖維素(cellulose)、聚對苯二甲酸丁二酯(polybutylene terephthalate, PBT)等。改質的基材材料的表面元素包含碳、氧及氮,且碳、氧及氮的總莫爾百分比定義為100 %,碳的莫爾百分比為約76.22%至約79.84%,氧的莫爾百分比為約18.1%至約21.04%,以及氮的莫爾百分比為約2.05%至約2.75%。
本發明的生物樣品通過上述高分子聚合物改質的基材進行過濾,請參照圖1,是本發明生物樣品通過改質的基材過濾處理的示意圖,改質的基材可通過捕捉、吸附、貼附或粘附有核細胞(包括白細胞)而使其從生物樣品如全血中分離出來,重要的是,過濾過程中幾乎不會吸附血漿蛋白質,亦幾乎不會造成血小板貼附,提高了血小板的保留率,並且會使生物樣品如血液中其餘的物質通過(流過)改質的基材,達到純化之效果,例如紅細胞、血小板、細菌、病毒、孢子等。檢測所得結果表明,過濾後樣品中白細胞的去除率大於70%,甚至可以達到90%以上,過濾後樣品中紅細胞的保留率大於80%,甚至可以達到90%以上,過濾後樣品中血小板的保留率大於80%,甚至可以達到85%以上,過濾後樣品中血漿纖維蛋白原的保留率大於80%,甚至可以達到90%以上。而過濾後樣品的微生物檢出率至少是過濾前樣品微生物檢出率的2倍以上,甚至可以達到更高的倍數,比如40倍。
本發明還提供一種該高分子聚合物改質的基材配合使用的過濾裝置,如圖2所示,該裝置包括上殼體1,過濾材料2,下殼體3,過濾材料2位於上殼體1和下殼體3之間,該上殼體1上設有樣品進口,該下殼體3上設有樣品出口,樣品從上殼體1的進口進入,經過過濾材料2的過濾,之後經下殼體3出口流出,該過濾材料由高分子聚合物改質的基材製備而成。
本發明富集和檢測微生物的方法可應用於該過濾裝置:首先,取得生物樣品如血液;其次,使得生物樣品從上殼體1的進口進入,經過過濾材料2的過濾,之後經下殼體3出口流出,生物樣品中的有核細胞被捕捉或分離,所得濾液中人源有核細胞含量大大降低,為減除人源有核細胞的濾液,並且微生物可通過或流過過濾材料2,進而在濾液中得到富集,並去除來自人體的有核細胞的干擾。微生物得到有效富集的濾液進行DNA純化處理,取適當濃度的純化後的DNA依照Oxford Nanopore快速建庫的方法構建測序文庫,使用Oxford Nanopore GridION測序儀進行測序分析,測序結果表明改質的基材可專一性去除人源有核細胞干擾並達到富集微生物的效果,使得微生物比例得到大幅的增加。
本發明中DNA的測定可以利用本領域公知的方法進行,包括但不限於PCR、qPCR、digital PCR、NGS、MassSpec或Nanopore sequencing技術。
Nanopore sequencing採用的Oxford Nanopore定序技術,這種單分子三代定序技術和需要擴增放大訊號的NGS二代技術相比,具有樣品處理簡單、快速、定序長度超長的優勢(>10kbp)。而這些優點都非常適合應用於臨床上未知微生物致病源的快速鑒定,因此此方法可應用於檢驗敗血症、病源檢驗等領域。
下面結合附圖和具體實施例,進一步闡明本發明,應理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍,在閱讀了本發明之後,本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落於本申請所附請求項所限定的範圍。
細胞株:
下列實施例中使用的所有細胞系均來自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。TF1(ATCC®
CRL-2003™)和Jurkat克隆E6-1(ATCC®
TIB-152™)在含有10% FBS的RPMI培養基中培養;PC-3(ATCC®
CRL1435™)在含有10% FBS的F12K培養基中培養;SK-BR-3(ATCC®
HTB30™)在含有10% FBS的McCoy's 5A培養基中培養;K-562(ATCC®
CCL243™)在含有10% FBS的IMDM培養基培養。於37℃,5% CO2
的培養箱中培養。
實施例1 基材改質的實驗材料
基材的材料為聚丙烯(polypropylene, PP)、聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate, PET)、纖維素(cellulose)、聚對苯二甲酸丁二酯(polybutylene terephthalate, PBT)。PP、PET、Cellulose、PBT分別具有化學結構如下:
實施例2 用於基材改質的高分子聚合物製備
以BMA作為基材咬合端,以HEAA或DMAEMA作為功能作用端,依比例(咬合端約70%,作用端約30%)混合,並加入起始劑ACVA,而溶劑為乙醇。接著,在70℃的環境下進行聚合反應24小時,分別製備出BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA高分子聚合物。待反應完成後,以去離子水作為析出劑將產物析出並乾燥。
實施例3 基材表面改質及測試
選用PP、PET、Cellulose、PBT作為欲改質的基材。
3.1
物理吸附作用力改質PP基材
分別取BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA高分子聚合物,以乙醇為溶劑,配製成高分子溶液。取PP基材,裁剪為合適大小,浸泡於高分子溶液中1分鐘,再以去離子水洗去表面殘餘溶液並乾燥。據此,可分別獲得經BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA塗佈(coating)的表面改質的PP基材。
3.2
物理吸附作用力改質PET基材
分別取BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA高分子聚合物,以乙醇為溶劑,配製成高分子溶液。取PET基材,裁剪為合適大小,浸泡於高分子溶液中1分鐘,再以去離子水洗去表面殘餘溶液並乾燥。據此,可分別獲得經BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA塗佈(coating)的表面改質的PET基材。
3.3
物理吸附作用力改質Cellulose基材
分別取BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA高分子聚合物,以乙醇為溶劑,配製成高分子溶液。取Cellulose基材,裁剪為合適大小,浸泡於高分子溶液中1分鐘,再以去離子水洗去表面殘餘溶液並乾燥。據此,可分別獲得經BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA塗佈(coating)的表面改質的Cellulose基材。
3.4
物理吸附作用力改質PBT基材
分別取BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA高分子聚合物,以乙醇為溶劑,配製成高分子溶液。取PBT基材,裁剪為合適大小,浸泡於高分子溶液中1分鐘,再以去離子水洗去表面殘餘溶液並乾燥。據此,可分別獲得經BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA塗佈(coating)的表面改質的PBT基材。
3.5
核磁共振(NMR)的鑒定
將上述高分子聚合物各秤取10 mg,分別溶於1 mL的甲醇(d-MeOH)中,配置為濃度10 mg/mL的溶液並裝入NMR試管,送交中國臺灣國立中央大學貴重儀器中心委測。可由圖譜的特徵峰,分析並計算高分子的化學結構與單體比例。
3.6
表面改質密度量測
進行改質前,先將PP、PET、Cellulose、PBT基材以微量天秤量其重量。當表面完成改質後,將基材乾燥後並經由微量天平秤量該表面改質的基材重量。經由計算實驗前後的基材的重量差,可得到改質於基材表面的高分子聚合物重量。最後經由換算可得每單位面積的高分子聚合物重量,即為表面披覆密度。
3.7
血液過濾測試
將改質後的PP、PET、Cellulose、PBT基材,裁剪成直徑2.6cm的圓形並堆疊20層,置於過濾裝置中鎖緊(類似於圖2中所示裝置)。本部分實驗分為兩種測試方法:
方法一:取10mL全血通過過濾器中改質後的基材進行過濾。然後使用血球計數儀對過濾前、過濾後的血品進行檢驗,計算出白細胞移除率以及血小板保留率。
方法二:於9mL血液中添加1mL大腸桿菌(E. coli
)菌液(6×109
cells/mL),添加後於采血管震盪器搖晃5分鐘,取出血液樣品進行過濾。其他細菌(如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus
))或真菌(如黑麹菌(Aspergillus brasiliensis
))的混合液也比照同樣方法準備。
3.8
酶結合免疫吸附(ELISA)
將前述3.7方法一和方法二過濾前後取得的血液,分別使用離心機進行離心,抽取上清液(即血漿),並使用PBS進行10倍稀釋,稀釋後取出0.25mL移入24孔盤中(24 well-tissue culture polystyrene plate,即24孔的TCPS盤),於樣品中加入0.25mL對纖維蛋白原(Fibrinogen)具有專一性的第一抗體(Monoclonal Anti-human Fibrinogen, Clone,生產公司:Sigma Aldrich Co.,型號:F4639),放置於37℃烘箱30分鐘,加入0.25mL的第二抗體(anti-mouse IgG, rabbit IgG whole, HRP conjugated,生產公司:Wako Co.,型號:014-1761),其對第一抗體具有專一性,只會與第一抗體產生鍵結,放入37℃烘箱反應30分鐘後,加入0.25mL顯色劑3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, TMB),等待6分鐘使其顯色後,再於每個樣品中加入0.25mL 1M的硫酸以終止反應。由每個樣品中(包括TCPS空孔位)吸取200微升溶液置於96孔盤中,藉由Bio-tek型號PowerWare XS的微量盤式分析儀(microplate reader)在UV波長450 nm下檢視讀值,取得過濾前後UV讀值後,經回推得知過濾後蛋白質回收比率。
3.9
細菌過濾測試
使用各種不同的細微生物,包括革蘭氏陽性(Gram+)和陰性(Gram-)菌,例如大腸桿菌(E. coli
)、海藻希瓦菌(Shewanella algae
, SA)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus
)、假中間葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius
, SP)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae
, CRKP)、Imtechella halotolerans
(I. Halo)和Allobacillus halotolerans
(A. Halo)等,以及真菌,例如黑麴黴(Aspergillus brasiliensis
)。將等量的菌液分別經過過濾或不經過過濾,分別使用Acrodisc®
白細胞針頭過濾器或改質後的PP、PET、Cellulose、PBT基材進行細菌過濾能力的測試。
組別1:Shewanella algae
(Gram-)、Staphylococcus pseudintermedius
(Gram-)、Klebsiella pneumoniae
(Gram-)。
組別2:E. coli
(Gram-)、Staphylococcus aureus
(Gram+)、Aspergillus brasiliensis
(真菌)。
組別3:Imtechella halotolerans
(Gram-)、Allobacillus halotolerans
(Gram+)。
3.10 DNA
純化、濃度測量、Semi-quantitative Real-Time PCR半定量PCR和宏基因定序
將前述3.7方法二中加入細菌的血液分為兩份,一份進行過濾,一份不經過濾作為對照組,分別使用離心機進行離心並抽取上清夜(即血漿),以及3.9中細菌過濾測試的菌液,均使用DNeasy Blood and Tissue Kit進行DNA純化,純化後的DNA使用nanodrop spectrophotometer測量濃度,進行過濾前後的濃度對比,以及對應的細菌或真菌的Semi-quantitative Real-Time PCR的半定量對比。並取適當濃度的DNA,依照Oxford Nanopore快速建庫的方法構建測序文庫,使用Oxford Nanopore GridION測序儀進行測序分析,從測序結果的分析證明改質後的基材去除宿主白細胞/人源DNA並達到富集微生物DNA的效果。
實施例4 基材改質的檢測結果
4.1
核磁共振(NMR)的分析結果
如下表一所示,為方便後續說明,在此將高分子化合物如BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA各縮寫為B-r-H與B-r-D。圖3為各單體、高分子聚合物的結構式及其化學位移理論預測值。圖4為各單體及高分子聚合物的NMR圖譜實測圖,具體實驗條件及實際檢驗數值列於表一。核磁共振分析後,HEAA的特徵峰主要體現於a處,DMAEMA的特徵峰主要體現於b處。由核磁共振的圖譜及資料可得知本試驗所用的高分子聚合物已成功進行合成。
表一
4.2 PP
、PET、Cellulose、PBT基材披覆密度量測結果
如圖5所示,為B-r-H與B-r-D改質的PP、PET、Cellulose、PBT基材的披覆密度結果圖。藉由對改質前後的基材重量進行秤量,並量測基材的表面積,可算得基材表面的各高分子披覆密度,介於約0.1至約0.3 mg/cm2
。
4.3
血液過濾測試結果
如前述試驗方法中所提的血液過濾測試,利用改質後的基材對血液及添加細菌之血液進行過濾。經由血球計數儀檢測後可得知過濾前與過濾後的血樣中各種血液細胞含量,依此計算出白細胞移除率與各細胞保留率,血漿纖維蛋白原(Fibrinogen)使用ELISA酵素免疫鏈結反應進行檢測,E. coli
等細菌使用吸收光譜儀進行檢測。
RBC(Red blood cell)是紅細胞,WBC(White blood cell)是白細胞,PLT(Platelet)是指血小板,E. coil
(Escherichia coli
)為大腸桿菌,Fibrinogen為血漿纖維蛋白原。根據表二可知經HEAA改質後的基材對白細胞的捕捉率至少達到94%,保留93%以上紅細胞與87%以上的血小板,且血漿纖維蛋白原可保留93%以上。意即,全血流經改質後的基材時,大部分白細胞會貼附於基材上,剩下的濾液中能保留大部分的紅細胞、血小板與血漿纖維蛋白原。據此,本發明的B-r-H改質基材對於白細胞捕捉有極高的專一性,不會造成紅細胞與血小板的捕捉或貼附,是作為全血減除白細胞的良好材料。當然,在其他實施方式中,亦可以使用例如紅細胞濃縮液或血小板濃縮液通過上述改質基材,均可達到專一性去除白細胞的效果。
相對於使用B-r-D以及DMAEMA等聚合物進行改質的習知捕捉、分離或過濾白細胞的方式而言,不僅是白細胞捕捉率提高,更重要的是能保留大部分的紅細胞、血小板與血漿蛋白原,是故明顯可知,血液通過B-r-H是通過不同於過去的作用機制來達成功效。
表三顯示血液中添加E. coil
細菌後過濾結果,由結果顯示經HEAA改質後的基材對白細胞的捕捉率至少達到95%,保留92%以上紅細胞與87%以上的血小板,且E. coli保留率達82%以上。意即,全血流經改質後的基材時,大部分白細胞會貼附於基材上,剩下的濾液中能保留血液中其他細胞與細菌。據此,相對於使用B-r-D以及DMAEMA等聚合物進行改質的習知捕捉、分離或過濾白細胞的方式而言,本發明的B-r-H改質基材對於白細胞捕捉有極高的專一性(不會造成紅細胞與血小板的捕捉或貼附),能保留大部分的紅細胞、血小板與血漿蛋白原,並且大部分細菌可不被貼附從而通過改質後的基材,因此專一性去除白細胞之濾液可有效提升病源之檢驗靈敏度,提高病源檢驗之準確性。
表二
表三
4.4
細菌過濾DNA濃度測試結果
如前述試驗方法中所提的細菌過濾測試,使用組別1的微生物組合,利用對白細胞捕捉專一性高並可保留其他細胞和E. coli
的B-r-H改質基材對其他種類的細菌進行過濾測試。表四顯示等量的菌液,包括海藻希瓦菌(Shewanella algae
, SA),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius
, SP),肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae
, CRKP),經過B-r-H改質基材過濾後,DNA回收量可以達到不經過過濾的92%以上,說明常見的細菌大部分都可以通過這種白細胞捕捉專一性高的改質基材。
表四
4.5
血液添加類比樣本Semi-quantitative Real-Time PCR半定量對比結果
正常人全血中加入組別2的微生物組合,具體組成為106
CFU/mL或104
CFU/mL的混合微生物(大腸桿菌(E. coli
):金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus
):黑麹菌(Aspergillus brasiliensis
)=1:1:1)。5 mL全血以2,000g離心15分鐘後,取出上部的血漿,經過或不經過B-r-H改質基材過濾後,再用13,500 rpm高速離心10分鐘,去掉上清液,對底部產物進行DNA純化。純化後的DNA使用特定菌的引子(見表五),使用SYBR-green Semi-quantitative Real-Time PCR半定量方法在Light Cycler 96 (Roche) PCR儀上進行半定量比較。半定量分析結果如表六所示,W/O filter代表未經過過濾的樣品,W/ filter代表經過過濾的樣品,經過B-r-H改質基材過濾的血液樣本中,大腸桿菌(E. coli
, Gram -)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus
, Gram+)、黑麹菌(Aspergillus brasiliensis
, 真菌)的相應濃度和未經過濾的血液樣本裡的濃度沒有顯著差異。結果說明經過B-r-H改質基材過濾後,血液中的細菌和真菌大部分都可以通過這種白細胞捕捉專一性高的改質基材。
表五
表六
SEQ ID No. | Primer Name | Primer sequence |
1 | E. coli -F | GTCCAAAGCGGCGATTTG |
2 | E. coli -R | CCAGCCATGCACACTGATAC |
3 | S. aureus -F | AAGCGCATAACAAGCGAGAT |
4 | S. aureus -R | TGACGGAATGCATTTGATGT |
5 | A. brasiliensis _18S-F | CTGAAAGCGTGCAGTCTGAG |
6 | A. brasiliensis _18S-R | TGTGCGTTCAAAGACTCGAT |
4.6
血液添加類比樣本巨集基因測序結果
4.6.1 陽性對照測序結果:
使用ZymoBIOMICS™ Spike-in Control I (High Microbial Load) (ZYMO RESEARCH, Catalog Nos. D6320 & D6320-10) 作為陽性對照,該產品含有等量的兩個菌株:Imtechella halotolerans
和Allobacillus halotolerans
。正常人全血中分別加入總菌量1×104
和1×106
cells/mL的菌,取5 mL樣本以2,000g離心15分鐘後,取出上部的血漿,分別經過或不經過Acrodisc®
白細胞針頭過濾器和B-r-H改質基材過濾後,再用13,500 rpm高速離心10分鐘,去掉上清液,使用TANBead®
Nucleic Acid Extraction kit Blood Bacterial DNA Auto Plate(TAN Bead, CatM6BGA45)對底部產物進行DNA純化,純化後的DNA使用Oxford Nanopore Technologies (ONT) SQK-RBK004 Rapid Barcoding Kit建立定序文庫後,使用ONT FLOMIN106(revD) flow cell進行定序。定序分析結果如表七所示,W/O代表未經過濾的樣品,W/f Devin和W/f PALL分別代表經過B-r-H改質基材和Acrodisc®
白細胞針頭過濾器過濾的樣品;ΔA和ΔI是指以人體細胞的數值為基本值時,細菌的數量是否相對大於人體細胞量,當ΔA和ΔI值越低,代表細菌的相對總量越多。結果表明,通過Acrodisc®
白細胞針頭過濾器或B-r-H修飾的底物過濾後,確實可以富集生物樣本中的微生物,其中1×104
cells/mL的樣品效果最顯著,一般來說人體中的致病微生物濃度也相當低,因此該結果符合我們的預期。
表七
I. Halo | A. Halo | Homo | ΔI | ΔΔI | ΔA | ΔΔA | |
1 × 104 cells/mL | |||||||
w/o | 27.6 | 26.22 | 28.58 | -0.98 | - | -2.36 | - |
w/f Devin | 30.05 | 26.46 | 33.47 | -3.42 | -2.44 | -7.01 | -4.65 |
w/f PALL | 28.06 | 26.12 | 33.04 | -4.98 | -4.00 | -6.92 | -4.56 |
1 × 106 cells/mL | |||||||
w/o | 20.23 | 18.66 | 28.99 | -8.76 | - | -10.33 | - |
w/f Devin | 21.4 | 20.49 | 31.1 | -9.70 | -0.94 | -10.61 | -0.28 |
w/f PALL | 21.22 | 19.19 | 31.16 | -9.94 | -1.18 | -11.97 | -1.64 |
4.6.2 病原微生物測序結果:
正常人全血中加入2.5×103
CFUE. coli
/mL和1 ng/mLKlebsiella pneumonia
gDNA。取5 mL樣本以2,000g離心15分鐘後,取出上部的血漿,經過或不經過B-r-H改質基材過濾後,再用13,500 rpm高速離心10分鐘,去掉上清液,對底部產物進行DNA純化。純化後的DNA使用Oxford Nanopore Technologies (ONT) SQK-RBK004 Rapid Barcoding Kit建立定序文庫後,使用ONT FLOMIN106 (revD) flow cell進行定序。定序分析結果如表八所示,W/O fiter-1和W/O fiter-2代表未經過過濾的樣品,W/ fiter-1和W/ fiter-2代表經過過濾的樣品,經過B-r-H改質基材過濾的樣本中K. Pneumonia的占比和不經過過濾處理的樣本相比,分別從0.2%和0.3%增加到10.6%和13.4%;E. coli
則從0.05%和0.03%增加到2.8%和5.2%。結果說明經過B-r-H改質基材過濾後,的確可以起到富集血液樣品中微生物的作用,使微生物的檢出率提高40倍以上。
表八
4.7
有核細胞過濾測試結果
五個人源有核細胞株(見表九)用於測試B-r-H改質基材捕捉分離有核細胞的能力。將細胞回收並懸浮於5 mL PBS中,取10 μL細胞進行計數,接著用PBS將細胞稀釋至1×106
cells/ mL,並調整樣品的最終體積大於3 mL。取20 μL細胞樣品以LUNA-II Automated Cell Counter (Logos Biosystems)計數,重複三次。取1 mL樣本經過B-r-H改質基材過濾,最後取20 μL濾液進行計數,重複三次。
結果顯示,B-r-H改質基材具有至少99%的有核細胞捕獲率,意味著當生物樣品流改質基材時,大多數人源有核細胞將粘附在上面。由表十的結果可得知,通過B-r-H改質基材過濾後,能夠特異性除去樣品中的人源有核細胞。
表九
表十
細胞株 | 來源 / 細胞類型 | 生長特性 |
TF1 | 骨髓 / 紅血球母細胞 | 懸浮 |
Jurkat | 外周血 / T淋巴細胞 | 懸浮 |
PC-3 | 前列腺 / 腺癌細胞 | 貼壁 |
SK-BR-3 | 乳腺 / 腺癌細胞 | 貼壁 |
K-562 | 骨髓 / 淋巴母細胞 | 懸浮 |
細胞株 | 過濾前 (cells/mL) | 過濾後 (cells/mL) | ||||
1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | |
TF1 | 9.88×105 | 9.88×105 | 9.88×105 | 2.50×103 | 0 | 0 |
Jurkat | 1.05×106 | 1.05×106 | 1.05×106 | 0 | 2.50×103 | 0 |
PC-3 | 8.12×105 | 8.32×105 | 9.50×105 | 0 | 4.00×103 | 0 |
SK-BR-3 | 8.24×105 | 8.24×105 | 8.16×105 | 0 | 0 | 0 |
K-562 | 1.28×106 | 1.37×106 | 1.16×106 | 0 | 0 | 0 |
1:上殼體
2:過濾材料
3:下殼體
圖1:本發明生物樣品通過改質的基材過濾處理的示意圖。
圖2:本發明用於富集和檢測生物樣品中微生物方法的過濾裝置。
圖3:本發明單體、高分子聚合物的結構式及其核磁共振圖譜信號的化學位移理論預測值。
圖4:本發明單體、高分子聚合物的核磁共振圖譜實測圖。
圖5:本發明的B-r-H與B-r-D改質的PP、PET、Cellulose、PBT基材的披覆密度結果圖。
Claims (27)
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中,所述生物樣品中的微生物為細菌。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中,所述生物樣品中的微生物為真菌。
- 如申請專利範圍第1項所述的方法,其中,所述生物樣品中的有核細胞為白細胞。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的方法,其中,所述濾液中微生物的保留率為65%以上。
- 如申請專利範圍第5項所述的方法,其中,所述濾液中微生物的保留率為80%以上。
- 如申請專利範圍第5項所述的方法,其中,所述生物樣品中的紅細胞可通過或流過所述高分子聚合物改質的基材進入到濾液中,所述紅細胞的保留率為80%以上。
- 如申請專利範圍第5項所述的方法,其中,所述生物樣品中的血小板可通過或流過所述高分子聚合物改質的基材進入到濾液中,所述血小板的保留率為80%以上。
- 如申請專利範圍第5項所述的方法,其中,所述生物樣品中的血漿纖維蛋白原可通過或流過所述高分子聚合物改質的基材進入到濾液中,所述血漿纖維蛋白原的保留率為80%以上。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的方法,其中,所述濾液中微生物的檢出率是未經過過濾的所述生物樣品的檢出率的2倍以上。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的方法,其特徵在於,所述濾液中微生物的檢出率是未經過過濾的所述生物樣品的檢出率的40倍以上。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一所述的方法,其特徵在於,所述式(1)結構的單體為N-羥乙基丙烯醯胺或N-(2-羥乙基)丙烯醯胺。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一所述的方法,其特徵在於,還包括另一單體,所述另一單體是甲基丙烯酸丁酯,式(1)結構的單體與所述另一單體共聚合形成共聚物。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一所述的方法,其特徵在於,所述高分子聚合物為鏈段高分子。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一所述的方法,其特徵在於,所述高分子聚合物以塗佈、噴灑或浸漬的方式設置於基材上。
- 如申請專利範圍第17項所述的方法,其特徵在於,所述基材為聚丙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、纖維素、聚對苯二甲酸丁二酯。
- 如申請專利範圍第18項所述的方法,其特徵在於,所述改質的基材的表面元素包含碳、氧及氮,且碳、氧及氮的總莫爾百分比定義為100%,碳的莫爾百分比為約76.22%至約79.84%,氧的莫爾百分比為約18.1%至約21.04%,以及氮的莫爾百分比為約2.05%至約2.75%。
- 如申請專利範圍第19項所述的方法,其特徵在於,所述方法用於生物樣品的病源檢驗。
- 如申請專利範圍第20項所述的方法,其特徵在於,所述生物樣品選自血液、血清、唾液、尿液、糞便、喉嚨或鼻拭子、脊髓液、細胞、淋巴液、腹膜液、玻璃體液、淚液、精液、陰道分泌物、肺積液、漿膜液、支氣管肺泡灌洗液、細胞培養物或組織樣品。
- 如申請專利範圍第19項所述的方法,其特徵在於,所述濾液經過DNA純化處理,可以通過PCR、qPCR、digital PCR、NGS、MassSpec或Nanopore sequencing進行分析。
- 如申請專利範圍第22項所述的方法,其特徵在於,所述濾液經過DNA純化處理,依照Oxford Nanopore快速建庫的方法構建測序文庫,使用Oxford Nanopore GridION測序儀進行測序分析。
- 如申請專利範圍第21項所述的方法,其特徵在於,所述方法用於生物樣品的病源檢驗。
- 一種富集和檢測生物樣品中微生物的裝置,其特徵在於,所述裝置包括:上殼體,過濾材料和下殼體,所述過濾材料位於上殼體和下殼體之間,所述過濾材料由請求項1的高分子聚合物改質的基材製備而成。
- 如申請專利範圍第25項所述的裝置,其特徵在於,所述上殼體上設有進口,所述下殼體上設有出口,生物樣品從上殼體的進口進入,經過所述過濾材料的過濾,經下殼體出口流出。
- 如申請專利範圍第26項所述的裝置,其特徵在於,所述裝置可用於生物樣品的病源檢驗的用途。
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