CN114908190A - Hiv dna检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了HIV DNA检测方法，所述方法包括：(1)分离提取全血样本中的外周血单个核细胞，得到外周血单个核细胞液；(2)富集所述外周血单个核细胞液中的CD4⁺T细胞，得到CD4⁺T细胞液；(3)提取所述CD4⁺T细胞中的HIV DNA，得到提取液；(4)对所述提取液进行PCR扩增，以便对HIV DNA进行定性或者定量分析；其中，所述HIV DNA含量为1～1000copies/10⁶个CD4⁺T细胞。本发明的方法可以准确地检测血液样本中低拷贝数的HIV DNA，具有准确性强、灵敏度高、重复性强、用时短、成本低等优点，适于广泛应用。

Description

HIV DNA检测方法

技术领域

本发明涉及检测领域。具体地，本发明涉及HIV DNA检测方法。

背景技术

艾滋病(AIDS)全称是获得性免疫缺陷综合征，病原体为人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus，HIV)，即艾滋病病毒。HIV病毒是一种逆转录病毒，可引起人类细胞免疫功能损害、缺陷，导致一系列致病菌感染和罕见肿瘤的发生，传染快，病死率高。

人体感染HIV后，病毒主要侵犯免疫系统CD4⁺T淋巴细胞及巨噬细胞和树突状细胞等靶细胞。病毒进入人体之后24-48小时内可以到达局部淋巴结，2-9天左右可在外周血中检测到病毒DNA和RNA的成分，10-14天以后才能检测到抗体。由于试剂灵敏度限制，各种诊断试剂在一段时间内是无法检出病毒感染标记物的，将感染后至试剂检测结果呈阳性的时间段称为窗口期(WP)。HIV实验室检测标志物主要包括：抗-HIV抗体、P24抗原、HIV RNA核酸、HIV DNA核酸等。在刚刚发生高危且服用阻断药物期间，HIV感染者血浆中HIV RNA病毒载量、P24抗原水平可以降至检出限以下，早期ART后因不能充分产生抗体应答效应，抗体尚未出现，此时HIV DNA才是检测指标，DNA前病毒检测可用于阻断期间感染HIV的核酸检测。

HIV DNA病毒库会受到HIV感染时间过短、血液中CD4⁺T淋巴细胞数量较少、抗病毒治疗开展过早等影响，导致病毒浓度低、病毒库载量少，难以检测。如果病人已经开始进行ART，HIV RNA载量被药物抑制在检出限以下，病毒特异性抗体尚未产生至检出限以上，此时的检测靶标物只有整合的HIV DNA。如何提高HIV DNA检测的灵敏度，目前尚无具体的方法和详细的策略。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了一种HIV DNA检测方法，该方法可以准确地检测血液样本中HIV DNA，尤其适用于低拷贝HIV DNA，具有准确性强、灵敏度高、重复性强、用时短、成本低等优点，适于广泛应用。

本发明提出了一种HIV DNA检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)分离提取全血样本中的外周血单个核细胞，得到外周血单个核细胞液；(2)富集所述外周血单个核细胞液中的CD4⁺T细胞，得到CD4⁺T细胞液；(3)提取所述CD4⁺T细胞中的HIV DNA，得到提取液；(4)对所述提取液进行PCR扩增，以便对HIV DNA进行定性或者定量分析；其中，所述HIV DNA含量为1～1000copies/10⁶个CD4⁺T细胞。

本发明的发明人发现，对于HIV DNA拷贝数低的全血样本，若直接以全血进行PCR扩增检测，容易出现检测不出拷贝数的现象，即便是可以检测出拷贝数，也容易出现重复性差、准确性低等缺陷。

有鉴于此，发明人进行深入研究，由于HIV DNA主要存在于CD4⁺T细胞中，通过富集全血中的CD4⁺T细胞，并对其中的HIV DNA进行PCR扩增分析，可以准确地获知全血样本中HIV DNA拷贝数，尤其适用于低拷贝HIV DNA，具有准确性强、灵敏度高、重复性强、用时短、成本低等优点，适于广泛应用。

根据本发明的实施例，上述HIV DNA检测方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，步骤(1)包括：将全血样本加入到淋巴细胞分离液上，梯度离心，使血液形成明显分层，收集中间层的外周血单个核细胞，将所述外周血单个核细胞与缓冲液进行混合，得到外周血单个核细胞液；其中，所述梯度离心条件如下：18～20℃，400～800×g离心20～30分钟，升速4g降速0g。

通过梯度离心处理以使血液分层，中间层为外周血单个核细胞(简称PBMC)，HIVDNA主要存在于PBMC中的CD4⁺T细胞内。对于低拷贝数的HIV DNA，梯度离心条件会显著影响PBMC的分离纯度和收率，进而影响后续HIV DNA检测的准确性。发明人经过大量实验得到上述较佳的梯度离心条件，由此，可以准确地测定HIV DNA拷贝数，重复性强、灵敏度高。

需要说明的是，若全血样本的量过多(如＞15mL)，可以预先将全血样本通过500×g离心10分钟，收集沉淀细胞进行后续实验。

根据本发明的实施例，步骤(2)包括：将所述外周血单个核细胞液中加入抗体，所述抗体可结合非CD4⁺T细胞细胞；将上步所得混合液与可结合所述抗体的的磁珠进行孵育，弃去磁珠，得到CD4⁺T细胞液；其中，所述外周血单个核细胞液浓度为3～7×10⁷细胞/mL；每100mL所述外周血单个核细胞液中磁珠的用量为50～150μL；所述孵育的时间为2～8分钟。

采用阴性分选富集外周血液单个核细胞(PBMC)中CD4⁺T淋巴细胞，具体地，抗体可以结合全血中非CD4⁺T淋巴细胞以外其他细胞，磁珠可以吸附结合这些带有细胞的抗体，然后弃去，剩余液体中含有CD4⁺T淋巴细胞。

发明人经过大量实验得到上述较佳的处理条件，由此，可以保证高效富集CD4⁺T细胞，提高CD4⁺T细胞收率，维持细胞活性。若磁珠的添加量过少或者孵育时间过短，会导致吸附的CD4⁺T细胞少，从而导致CD4⁺T细胞收率低，若磁珠的添加量过多，将增加检测成本。若孵育时间过长，将影响CD4⁺T细胞活性。

根据本发明的实施例，步骤(3)包括：向离心管内加入蛋白酶K；向离心管内加入所述CD4⁺T细胞液和血液裂解液，混匀后孵育；将洗脱液和无水乙醇加入到另一离心管中，并向离心管中插入纯化柱，将所述孵育所得样液转移至纯化柱中，离心，丢弃含有滤出液的离心管；将上步所得纯化柱插入新的离心管中，向所述纯化柱中加入漂洗液，离心，丢弃含有滤出液的离心管；将上步所得纯化柱晾干，加入洗脱液，静置，离心，收集流出的洗脱产物；将所述洗脱产物进行加热孵育，得到提取液。由此，以便于从CD4⁺T细胞中分离出HIV DNA，HIV DNA收率高、纯度高。

根据本发明的实施例，所述裂解液包括20-30mmol/L EDTA、50-150mmol/L Tris、0.5-1.5w/v％SDS和400-600mmol/L NaCl，pH值为7-9；所述洗脱液包括5-15mM Tris-HCl和0.5-1.5mM EDTA，pH值为7-9；所述漂洗液包括300-500mM NaCI、10-30mM Tris、1-5mM EDTA和40-60v/v％EtOH，pH值为7-9。由此，有助于提高HIVDNA的收率和纯度。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种HIV DNA检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1-1)取5mL淋巴细胞分离液加入15mL离心管中；(1-2)全血样品加在所述淋巴细胞分离液上；(1-3)将上步所得离心管于18-20℃，600×g离心25分钟，升速4g降速0g；(1-4)取出离心管，将中层云雾状外周血单个核细胞层吸取至无抗凝剂干燥管中；(1-5)将上步所得干燥管于4℃，800×g离心8分钟，去除上清液；(1-6)用1mL预冷PBS重悬上步所得细胞；(1-7)向上步所得细胞中添加4mL的预冷PBS至上步所得重悬细胞液中，在4℃以600×g离心8分钟，去除上清液；(2-1)将上步所得外周血单个核细胞稀释为5×10⁷细胞/mL浓度的细胞样本；(2-2)向所述细胞样本中加入鸡尾酒抗体至终浓度50μL/m，颠倒混匀，常温孵育10min；(2-3)涡旋磁珠30秒，混匀可吸附上步所得样本中除CD4⁺T细胞以外其他细胞的磁珠(EasySep^TM D Magnetic Particles)，每个上步所得样本中加入100μL/mL，颠倒混匀，常温孵育5min，加入生理盐水溶液对样品稀释，用移液管上下吹打2-3次，将磁珠放入回收管并插入磁力架内至少5分钟，吸附磁珠后，吸取富含浓缩CD4⁺T细胞的悬浮液至新试管中；(3-1)取离心管并加入20μL蛋白酶K至管底部；(3-2)向上步管内加入200μL步骤(2-3)所得富含浓缩CD4⁺T细胞的悬浮液；(3-3)向上步管内加入200μL血液裂解液，震荡混匀后56℃孵育10分钟；(3-4)将洗脱液按每个提取样本110μL的体积取出分装到离心管内，并将分装好的洗脱液56℃预热；(3-5)向管内加入200μL无水乙醇，震荡混匀后离心；(3-6)将纯化柱插入2mL收集管内，将步骤(3-3)孵育管内液体全部转移至纯化柱中，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管；(3-7)将纯化柱插入新2mL收集管内，加入500μL漂洗液，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管；(3-8)将纯化柱插入新2mL收集管内，加入500μL漂洗液，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管；(3-9)将纯化柱插入新2mL收集管内，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管；(3-10)将纯化柱插入新离心管内，室温晾干3～5分钟；(3-11)加入56℃预热的洗脱液100μL到纯化柱膜中央，静置3钟，8000×g离心1分钟，收集流出的洗脱产物；(3-12)将含有所述洗脱液产物的离心管于90℃孵育20分钟，孵育后混匀，得到提取液；(4)对所述提取液进行PCR扩增，以便对HIV DNA进行定性或者定量分析；其中，所述HIV DNA含量为1～1000copies/10⁶个CD4⁺T细胞。

由此，根据本发明实施例的方法可以准确地检测低拷贝数的血液样本中的HIVDNA，具有准确性强、灵敏度高、重复性强、用时短、成本低等优点，适于广泛应用。

需要说明的是，“鸡尾酒抗体”为抗体混合物，可以与上面步骤(2-2)所得PBMC细胞液中除CD4⁺T细胞以外的其他细胞发生特异性识别和结合，有助于后续通过磁珠吸附实现分离目的。具体地，鸡尾酒抗体来源于EasySep^TM Human CD4⁺T Cell Enrichment KitCatalog#19052。

根据本发明的实施例，所述全血样本来源于处于HIV窗口期、使用抗病毒药物但突破感染后的早期监测，职业暴露或高危行为后服用HIV抗病毒阻断药物，HIV感染疑难病例的确证等所有血液中HIV病毒低载量及检测结果不确定的受试者。

近两年我国开始推广HIV感染高危风险人群口服抗病毒药物预防感染(PREP)，很多同性恋人群或特殊职业人群，在服用抗病毒药物同时不用任何防护措施发生高危行为，突破药物防御感染病毒的机会大大增加。采用本发明的方法可以准确地确定出这些受试者全血样本中的HIVDNA含量。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的PBMC细胞流式细胞术分析示意图，其中A为实施例1步骤1.7所得PBMC细胞的流式细胞分析图，B为利用白细胞过滤器对大体积全血进行过滤获得的PBMC细胞的流式细胞分析图；

图2显示了根据本发明一个实施例的CD4⁺T细胞的纯度；

图3显示了根据本发明一个实施例的WTgDNA定量标准曲线；

图4显示了根据本发明一个实施例的HIV DNA定量标准曲线；

图5显示了根据本发明一个实施例的不同组别HIV DNA定量检测结果分析。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1Ficoll法分离待测试管中全血样本PBMC：

1.1准备Ficoll：取5mLFicoll-Paque PLUS(TEMCELL TechnologiesInc.Lymphoprep^TM)加入15mL离心管中；

1.2全血悬液上样：全血样品缓慢加在Ficoll-Paque PLUS上(切记缓慢，不要冲破液面分层)；

1.3梯度离心：18-20℃，600×g离心25分钟(升速4g降速0g)；

1.4吸取白膜PBMC：缓慢拿出离心管，使用巴氏滴管将中层云雾状PBMC细胞层吸取至无抗凝剂干燥管中(请勿震动液面，小心吸取)；

1.5离心：4℃，800×g离心8分钟，去除上清液，收集细胞；

1.6取待计数细胞：用1mL预冷PBS重悬上步所得细胞，取其中10uL重悬细胞液，加入90uL ACK，1min后计数(细胞浓度稀释10倍)；

1.7预冷PBS再清洗：再添加4mL的预冷PBS至上步剩余重悬细胞中，在4℃以600×g离心8分钟，去除上清液，得到PBMC细胞。

发明人前期利用白细胞过滤器对大体积全血进行过滤，获得PBMC细胞。对获得的细胞进行流式细胞术分析，结果如图1所示，过滤得到的CD4⁺T细胞与正常全血中CD4⁺T比例无显著性差异，说明经过滤得到的CD4⁺T细胞可以为后续HIV DNA的提取鉴定提供样本来源。

2免疫磁珠阴性分选富集PBMC中CD4⁺T淋巴细胞。

2.1制备样品：在5mL聚苯乙烯圆底管中，将PBMC稀释为5×10⁷细胞/mL浓度的细胞样本。

2.2与鸡尾酒混合试剂混匀：加入鸡尾酒抗体(STEMCELL TechnologiesInc.EasySep^TMHuman CD4⁺T Cell Enrichment Cocktail)至终浓度50μL/m，颠倒混匀，常温孵育10min。

2.3磁珠吸附分离：涡旋磁珠30秒，混匀磁珠(EasySep^TM D Magnetic Particles)，每个样本加入100μL磁珠/mL步骤2.1的细胞液，颠倒混匀，常温孵育5min，加入生理盐水溶液，将样品稀释至相应体积。用移液管轻柔上下吹打2-3次。将磁珠放入回收管(不带盖)并插入磁力架内至少5分钟。吸附磁珠后，缓慢持续吸取富含浓缩CD4⁺T细胞的悬浮液，转移入新试管中。取少量细胞加入抗CD4-FITC标记的抗体后，上流式细胞仪检测分选的CD4⁺T细胞的纯度。

2.4CD4⁺T细胞活性和纯度及特征性标志鉴定：取10μL细胞悬液用4g/L的台盼蓝进行染色，观察细胞的存活率，细胞存活率计算公式如下：

细胞存活率＝染色阴性细胞数/细胞总数×100％。

取1×10⁵个细胞用抗CD4-FITC的抗体标记，室温避光孵育30min后用PBS液洗涤重悬，上流式细胞仪检测分选的CD4⁺T细胞的纯度。

结果如图2所示，可以看出，采用免疫磁珠法从PBMC中分离纯化CD4+T细胞，经流式细胞仪测定纯度达到(96.2±2.4)％，0.4％台盼兰染色细胞活力为(98.9±2.9)％。

3CD4⁺T细胞中提取HIV DNA

3.1取自备的1.5mL离心管，并加入20μL蛋白酶K至管底部。

3.2向管内加入200μL步骤2所得CD4⁺T细胞液，当CD4⁺T细胞液体积小于200μL时，可加入PBS补足至200μL。

3.3向管内加入200μL血液裂解液，震荡混匀后56℃孵育10分钟。

注意：请勿将蛋白酶K直接加入到血液裂解液中。

3.4将洗脱液按每个提取样本110μL的体积取出分装到自备的2mL离心管内，并将分装好的洗脱液56℃预热。

3.5向管内加入200μL无水乙醇，震荡混匀后短暂离心。

3.6将纯化柱插入2mL收集管内，将孵育管内液体全部转移至纯化柱中，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管。

3.7将纯化柱插入新2mL收集管内，加入500μL漂洗液，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管。

3.8将纯化柱插入新2mL收集管内，加入500μL漂洗液，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管。

3.9将纯化柱插入新2mL收集管内，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管。

3.10将纯化柱插入新1.5mL离心管内，室温晾干3～5分钟。

3.11加入56℃预热的洗脱液100μL到纯化柱膜中央，静置3钟，8000×g离心1分钟，收集流出的洗脱产物。

3.12将洗脱产物管放入到90℃的加热装置中，孵育20分钟，孵育后混匀，得到提取液。

裂解液包括25mmol/L EDTA、100mmol/L Tris、1％(W/V)SDS和500mmol/L NaCl，pH8.0，洗脱液包括10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH＝8.0，漂洗液包括400mM NaCI、20mMTris、2mM EDTA和50％EtOH(v/v)，pH7.5。

4荧光定量PCR仪检测。

将野生型基因组DNA(WT gDNA)作为阳性对照以及HIV DNA标准品进行荧光定量PCR检测，绘制标准曲线，结果如图3和图4所示。

将步骤3.12所得提取液进行荧光定量PCR检测，基于标准曲线计算得到相应的HIVDNA拷贝量。

发明人同时比较了全血样本检测，即不进行步骤1和2，直接进行步骤3，将步骤3.2中的“步骤2所得CD4⁺T细胞液”替换为“全血样本”。结果如图5所示，可以看出，全血组定量结果均没有检测到HIV DNA，免疫磁珠分离CD4⁺T淋巴细胞组HIV DNA定量结果分别为：137.1、73.4、429.3copies/10⁶个CD4⁺T细胞。由此表明，针对采用常规方法提取HIV DNA结果为0的样本，采用本发明的方法可以准确地检出其拷贝数，从而可以实现极限低拷贝。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种HIV DNA检测方法，其特征在于，包括：

(1)分离提取全血样本中的外周血单个核细胞，得到外周血单个核细胞液；

(2)富集所述外周血单个核细胞液中的CD4⁺T细胞，得到CD4⁺T细胞液；

(3)提取所述CD4⁺T细胞中的HIV DNA，得到提取液；

(4)对所述提取液进行PCR扩增，以便对HIV DNA进行定性或者定量分析；

其中，所述HIV DNA含量为1～1000copies/10⁶个CD4⁺T细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：

将全血样本加入到淋巴细胞分离液上，梯度离心，使血液形成分层，收集中间层的外周血单个核细胞，将所述外周血单个核细胞与缓冲液进行混合，得到外周血单个核细胞液；

其中，所述梯度离心条件如下：18～20℃，400～800×g离心20～30分钟，升速4g降速0g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：

将所述外周血单个核细胞液中加入抗体，所述抗体可结合非CD4⁺T细胞细胞；

将上步所得混合液与可结合所述抗体的磁珠进行孵育，弃去磁珠，得到CD4⁺T细胞液；

其中，所述外周血单个核细胞液浓度为3～7×10⁷细胞/mL；

每100mL所述外周血单个核细胞液中磁珠的用量为50～150μL；

所述孵育的时间为2～8分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)包括：

向离心管内加入蛋白酶K；

向离心管内加入所述CD4⁺T细胞液和血液裂解液，混匀后孵育；

将洗脱液和无水乙醇加入到另一离心管中，并向离心管中插入纯化柱，将所述孵育所得样液转移至纯化柱中，离心，丢弃含有滤出液的离心管；

将上步所得纯化柱插入新的离心管中，向所述纯化柱中加入漂洗液，离心，丢弃含有滤出液的离心管；

将上步所得纯化柱晾干，加入洗脱液，静置，离心，收集流出的洗脱产物；

将所述洗脱产物进行加热孵育，得到提取液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述裂解液包括20-30mmol/L EDTA、50-150mmol/L Tris、0.5-1.5w/v％SDS和400-600mmol/L NaCl，pH值为7-9；

所述洗脱液包括5-15mM Tris-HCl和0.5-1.5mM EDTA，pH值为7-9；

所述漂洗液包括300-500mM NaCI、10-30mM Tris、1-5mM EDTA和40-60v/v％EtOH，pH值为7-9。

6.一种HIV DNA检测方法，其特征在于，包括：

(1-1)取5mL淋巴细胞分离液加入15mL离心管中；

(1-2)全血样品加在所述淋巴细胞分离液上；

(1-3)将上步所得离心管于18-20℃，600×g离心25分钟，升速4g降速0g；

(1-4)取出离心管，将中层云雾状外周血单个核细胞层吸取至无抗凝剂干燥管中；

(1-5)将上步所得干燥管于4℃，800×g离心8分钟，去除上清液；

(1-6)用1mL预冷PBS重悬上步所得细胞；

(1-7)向上步所得细胞中添加4mL的预冷PBS至上步所得重悬细胞液中，在4℃以600×g离心8分钟，去除上清液；

(2-1)将上步所得外周血单个核细胞稀释为5×10⁷细胞/mL浓度的细胞样本；

(2-2)向所述细胞样本中加入鸡尾酒抗体至终浓度50μL/m，颠倒混匀，常温孵育10min；

(2-3)涡旋磁珠30秒，混匀可吸附上步所得样本中除CD4⁺T细胞以外其他细胞的磁珠，每个上步所得样本中加入100μL/mL，颠倒混匀，常温孵育5min，加入生理盐水溶液稀释，用移液管上下吹打2-3次，将磁珠放入回收管并插入磁力架内至少5分钟，吸附磁珠后，吸取富含浓缩CD4⁺T细胞的悬浮液至新试管中；

(3-1)取离心管并加入20μL蛋白酶K至管底部；

(3-2)向上步管内加入200μL步骤(2-3)所得富含浓缩CD4⁺T细胞的悬浮液；

(3-3)向上步管内加入200μL血液裂解液，震荡混匀后56℃孵育10分钟；

(3-4)将洗脱液按每个提取样本110μL的体积取出分装到离心管内，并将分装好的洗脱液56℃预热；

(3-5)向管内加入200μL无水乙醇，震荡混匀后离心；

(3-6)将纯化柱插入2mL收集管内，将步骤(3-3)孵育管内液体全部转移至纯化柱中，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管；

(3-7)将纯化柱插入新2mL收集管内，加入500μL漂洗液，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管；

(3-8)将纯化柱插入新2mL收集管内，加入500μL漂洗液，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管；

(3-9)将纯化柱插入新2mL收集管内，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管；

(3-10)将纯化柱插入新离心管内，室温晾干3～5分钟；

(3-11)加入56℃预热的洗脱液100μL到纯化柱膜中央，静置3钟，8000×g离心1分钟，收集流出的洗脱产物；

(3-12)将含有所述洗脱液产物的离心管于90℃孵育20分钟，孵育后混匀，得到提取液；

(4)对所述提取液进行PCR扩增，以便对HIV DNA进行定性或者定量分析；

其中，所述HIV DNA含量为1～1000copies/10⁶个CD4⁺T细胞。

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