CN117265182A - 检测eb病毒感染骨髓血疾病类型的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测EB病毒感染骨髓血疾病类型的装置，涉及生物技术领域。本发明提供的检测EB病毒感染骨髓血疾病类型的装置，包括预处理模块、细胞分选模块、EB病毒核酸检测模块和分析模块。该装置对EBV的检测既可以定量又可以定位，可以根据检测结果判定感染细胞是否来源于造血干细胞从而辅助临床诊疗；样本取材简便易行，骨髓血中可检测到大量EBV感染细胞，检测周期短；可以同时检测多种细胞标记，节约检测成本，提高检测的特异性，为辅助EBV感染疾病的精准分层治疗提供依据。

Description

检测EB病毒感染骨髓血疾病类型的装置
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种检测EB病毒感染骨髓血疾病类型的装置。
背景技术
EB病毒(EBV)是人类发现的第一种与肿瘤相关的病毒，EBV以潜伏状态存在于感染的细胞中，如果EBV在复制过程中导致细胞破坏和病毒释放，机体免疫力不足以抵抗入侵，将可能导致各种疾病。人体感染EBV后病情轻重不一，多数患者症状轻微，约30％-70％的幼儿或者青少年在EBV原发感染后发展成为传染性单核细胞增多症，通常为自限性。在免疫功能低下的人群中，EBV的长期潜伏感染可能会促使某些恶性肿瘤的发生，如鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌等。除此之外，EBV感染还可能引起慢性活动性EBV感染(CAEBV)，EBV相关淋巴组织增殖性疾病(EBV-LPD)，EBV相关噬血细胞综合征(EBV-HLH)等重症EBV相关疾病。
EBV感染是多种疾病的病因，因此，有效准确的检测EBV感染对疾病的鉴别诊断和合理选择治疗方法的提示意义至关重要。目前EBV感染的检测方法可分为血清学、分子学和组织学检测方法等。
血清学检测由感染EBV的细胞产生相关抗原刺激免疫系统后产生的对应抗体，包括免疫荧光法(IFAs)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和化学发光免疫测定法(CLIA)等，可以定性或者定量对EBV感染患者进行检测，但对于免疫缺陷的病人，可能会因抗体滴度低造成漏诊，也不能提示EBV感染的细胞分化来源。分子检测技术主要通过设计引物、扩增片段等检测样本中的EBV核酸，包括聚合酶链反应(PCR)、重组酶介导的等温扩增技术(RAA)和环介导等温扩增技术(LAMP)等，分子检测技术相较于血清学检测灵敏度更高，可以进一步判断EBV感染患者的疾病活动情况和预后，但因仪器设备参数的不同等各种原因，不同疾病组之间的结果存在较大差异，检测结果缺乏统一的标准。
对组织活检切片进行EBER原位杂交的组织学检测技术是目前诊断EB病毒感染的金标准，该技术大致流程是在抗原修复液中经过加热等处理过的石蜡切片，再依次经过EBER探针杂交、一抗、放大剂、二抗、显色、苏木精等试剂处理后，由病理科医生根据染色强度和阳性细胞比例来判断结果。由于组织活检对病人创伤较大，对标本质量要求较高，临床上并不能作为一种常规筛查检查推行；EBER原位杂交无法同时检测组织或细胞内和细胞表面的多种蛋白，无法对检测结果进行精准定量衡量，对进一步分层治疗的提示作用有限；EBER原位杂交技术操作过程中易出现非特异染色结合和放大低效信号，干扰因素较多，影响实验结果的准确性；另外，EBV相关血液病患者往往病情危重，许多患者出现血小板减少和血管病变，骨髓组织活检创伤大难以实行，导致相关疾病诊断困难。
病毒培养、基因测序、流式细胞术-荧光原位杂交联用技术(Flow-FISH)等技术对实验条件和实验人员技术要求高、耗时较长、检测成本较高，难以满足临床上快速筛查的要求。基于EBV作用机制通路产物的检测和miRNA的研究虽已有实验室检测报道，但尚待更多的研究进一步验证临床应用的可能性。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测EB病毒感染骨髓血疾病类型的装置，该装置结合流式细胞术分选与核酸检测技术，能够快速、准确的对骨髓血中EBV感染细胞进行定位定量检测，为判断EBV感染细胞是否来源于造血干细胞提供可靠依据，缓解现有技术对EBV相关疾病患者诊断难、无法快速确定诊疗方案的现状。
本发明的第二目的在于提供一种EB病毒感染细胞的定位方法在指导制备治疗EB病毒感染疾病的药物中的应用。
第一方面，本发明提供了一种检测EB病毒感染骨髓血疾病类型的装置，包括预处理模块、细胞分选模块、EB病毒核酸检测模块和分析模块；
所述预处理模块用于去除人骨髓血样品中的血浆和红细胞；
所述细胞分选模块用于将经过预处理模块处理后的样品进行细胞分选，至少分选获得CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞；
所述EB病毒核酸检测模块用于对分选获得的细胞分别进行DNA提取和EB病毒核酸检测；
所述分析模块根据EB病毒核酸检测模块的结果确定EB病毒感染的细胞；若CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞均被EB病毒感染，则判定造血干细胞被EB病毒感染。
作为进一步技术方案，所述细胞分选模块包括流式细胞分选仪；
所述EB病毒核酸检测的方法包括荧光定量PCR。
第二方面，本发明提供了一种EB病毒感染细胞的定位方法在指导制备治疗EB病毒感染疾病的药物中的应用，所述EB病毒感染细胞的定位方法包括以下步骤：
提取人骨髓血；然后采用流式细胞分选仪至少分选获得CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞；再对分选获得的细胞分别进行DNA提取和EB病毒核酸检测，根据检测结果确定EB病毒感染的细胞。
作为进一步技术方案，若CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞均被EB病毒感染，则判定造血干细胞被EB病毒感染。
作为进一步技术方案，采用流式细胞分选仪分选之前，还包括对人骨髓血进行预处理；
所述预处理包括去除人骨髓血中的血浆和红细胞。
作为进一步技术方案，采用离心的方法去除人骨髓血的血浆。
作为进一步技术方案，采用红细胞裂解液去除人骨髓血的红细胞。
作为进一步技术方案，所述分选包括：获得4份预处理后的人骨髓血样品；
第一份样品加入荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体和荧光标记的抗CD8抗体；
第二份样品加入荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD19抗体和荧光标记的抗CD56抗体；
第三份样品加入荧光标记的抗CD45抗体、荧光标记的抗CD14抗体和荧光标记的抗CD15抗体；
第四份样品加入荧光标记的抗CD45抗体、荧光标记的抗CD41a抗体和荧光标记的抗CD235a抗体；
孵育后过流式细胞分选仪进行分选。
作为进一步技术方案，所述孵育为在避光环境下孵育10-20min。
作为进一步技术方案，所述EB病毒核酸检测的方法包括荧光定量PCR。
与现有技术相比，本发明检测EB病毒感染骨髓血疾病类型的装置具有如下有益效果：
1.对EBV的检测既可以定量又可以定位，可以根据检测结果判定感染细胞是否来源于造血干细胞从而辅助临床诊疗。
2.样本取材简便易行，骨髓血中可检测到大量EBV感染细胞，检测周期短。
3.可以同时检测多种细胞标记，节约检测成本，提高检测的特异性，为研究治疗EBV感染的靶向药物提供参考方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为EBV相关噬血细胞综合征治疗路径图；
图2和图3为患者(P1)骨髓血的流式细胞术分选结果；
图4和图5为患者(P2)骨髓血的流式细胞术分选结果；
图6和图7为患者(P3)骨髓血的流式细胞术分选结果。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种检测EB病毒感染骨髓血疾病类型的装置，包括预处理模块、细胞分选模块、EB病毒核酸检测模块和分析模块；
所述预处理模块用于去除人骨髓血样品中的血浆和红细胞；
所述细胞分选模块用于将经过预处理模块处理后的样品进行细胞分选，至少分选获得CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞；
所述EB病毒核酸检测模块用于对分选获得的细胞分别进行DNA提取和EB病毒核酸检测；
所述分析模块根据EB病毒核酸检测模块的结果确定EB病毒感染的细胞；若CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞均被EB病毒感染，则判定造血干细胞被EB病毒感染。
本发明装置将流式细胞术和核酸检测(如PCR)结合对人骨髓血进行检测，流式细胞术利用细胞表面标志分子可以对EBV可能感染的细胞进行定位，解决了血清抗原抗体反应、单独的PCR只能定量检测的问题，且PCR技术对流式分选后的样本进行DNA扩增，检测灵敏度更高。EBER原位杂交技术是EBV检测的金标准，对于EBV相关血液疾病检测需取骨髓组织活检，此操作对患者创伤大，且可能因为取材不理想而需再次穿刺，本发明可以少量抽取骨髓血来辅助定位定量检查EBV感染的细胞类型，且取材成功率高，当天即可检测出结果，有助于快速确定诊疗方案。
本发明着重于临床应用，通过准确定位EBV感染的细胞类型与造血干细胞的关系，可以辅助临床医生鉴别EBV相关血液病、针对患者EBV感染的不同结果制定更有针对性的治疗方案。临床实践中EBV感染骨髓血中的不同细胞类型的血液病患者治疗方案和预后有很大差别，B细胞感染EBV引起的淋巴细胞增殖型疾病经免疫治疗后通常预后良好；NK或T淋巴细胞感染EBV的患者在临床上缺乏有效的治疗选择，预后较差，存活率较低。对于EBV感染引起的慢性活动性EBV感染(CAEBV)、噬血细胞综合症(HLH)等病情危重的血液疾病，造血干细胞移植是目前唯一有希望治愈的办法。实行造血干细胞移植前需要供者配型、受者化疗、供者受者全面的身体检查等准备工作，早期确定移植方案，可以为准备工作争取时间，尽早为患者行造血干细胞移植，以延长患者的生存期。以EBV-HLH为例，可以通过本发明的装置对骨髓血样本中EBV感染进行检测，如果发现EBV感染仅存在于B细胞，则行B细胞单抗隆抗体治疗方案；如果发现感染存在于非造血干细胞来源的T、NK等细胞类型感染，则行免疫疗法组合治疗方案；如果发现感染存在多个造血干细胞终末分化群的EBV感染，则认为EBV感染细胞来源于造血干细胞，进而启动异基因造血干细胞移植方案。EBV相关噬血细胞综合征治疗路径图如图1(图中，NK为自然杀伤；HSCT为造血干细胞移植；NR为无效)所示。
骨髓是造血干细胞主要存在的场所，骨髓血中的EBV检测可以更准确的反映造血干细胞的感染情况。本发明相较于骨髓组织活检，不必反复取材，操作时间短，检测所需骨髓血量少，又可以同时检测多个分子标志物，提高了临床检测的精确度。同时，我们将进一步完善检测方案，尝试在肝炎病毒、巨细胞病毒、流感病毒等常见病毒相关疾病中推行本方法的可行性，为临床疾病的诊疗提供更多的基础资料。
在一些可选的实施方式中，所述细胞分选模块包括流式细胞分选仪；
所述EB病毒核酸检测的方法包括但不限于荧光定量PCR，或者采用本领域技术人员所熟知的其他核酸检测方法。
在一些可选的实施方式中，采用离心的方法去除人骨髓血的血浆。
在一些可选的实施方式中，采用红细胞裂解液去除人骨髓血的红细胞。
在一些可选的实施方式中，所述分选包括以下步骤：获得4份预处理后的人骨髓血样品；
第一份样品加入荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体和荧光标记的抗CD8抗体；
第二份样品加入荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD19抗体和荧光标记的抗CD56抗体；
第三份样品加入荧光标记的抗CD45抗体、荧光标记的抗CD14抗体和荧光标记的抗CD15抗体；
第四份样品加入荧光标记的抗CD45抗体、荧光标记的抗CD41a抗体和荧光标记的抗CD235a抗体；
孵育后过流式细胞分选仪进行分选。
第二方面，本发明提供了一种EB病毒感染细胞的定位方法在指导制备治疗EB病毒感染疾病的药物中的应用，所述EB病毒感染细胞的定位方法包括以下步骤：
提取人骨髓血；然后采用流式细胞分选仪至少分选获得CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞；再对分选获得的细胞分别进行DNA提取和EB病毒核酸检测，根据检测结果确定EB病毒感染的细胞。
EB病毒感染细胞的定位方法可以确定EB病毒感染的细胞，根据EB病毒感染的细胞类型能够为研究治疗EBV感染的靶向药物提供参考方向。
在一些可选的实施方式中，若CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞均被EB病毒感染，则判定造血干细胞被EB病毒感染。
在一些可选的实施方式中，采用流式细胞分选仪分选之前，还包括对人骨髓血进行预处理；
所述预处理包括去除人骨髓血中的血浆和红细胞。
由于骨髓血中含有大量的红细胞，通过去除红细胞有助于其他细胞的分选。
在一些可选的实施方式中，采用离心的方法去除人骨髓血的血浆。
在一些可选的实施方式中，采用红细胞裂解液去除人骨髓血的红细胞。
在一些可选的实施方式中，所述分选包括：获得4份预处理后的人骨髓血样品；
第一份样品加入荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体和荧光标记的抗CD8抗体；
第二份样品加入荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD19抗体和荧光标记的抗CD56抗体；
第三份样品加入荧光标记的抗CD45抗体、荧光标记的抗CD14抗体和荧光标记的抗CD15抗体；
第四份样品加入荧光标记的抗CD45抗体、荧光标记的抗CD41a抗体和荧光标记的抗CD235a抗体；
孵育后过流式细胞分选仪进行分选。
在一些可选的实施方式中，所述孵育为在避光环境下孵育10-20min，优选为15min。
在一些可选的实施方式中，所述EB病毒核酸检测的方法包括但不限于荧光定量PCR，或者采用本领域技术人员所熟知的其他核酸检测方法。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
一种检测EB病毒感染骨髓血疾病类型的装置，包括预处理模块、细胞分选模块、EB病毒核酸检测模块和分析模块；
预处理模块用于去除人骨髓血样品中的血浆和红细胞；
细胞分选模块用于将经过预处理模块处理后的样品进行细胞分选，至少分选获得CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞；主要包括流式细胞分选仪；
EB病毒核酸检测模块用于对分选获得的细胞分别进行DNA提取和EB病毒核酸检测；
分析模块根据EB病毒核酸检测模块的结果确定EB病毒感染的细胞。
应用该装置的实验方法如下：
实验中使用的试剂和仪器来源如下：
实验包括以下步骤：
1实验前准备
1.1实验前准备每个样品准备10个1.5mlEP管，标记样品名。
2分离血浆及核酸提取
2.1将样品连同采血管一起进行3000rpm离心10分钟(无特殊说明，本实验所有离心条件均为室温)。
2.2分离血浆至于5ml圆底管中。
2.3使用之江核酸提取试剂盒，按照说明书方法操作，在样品孔分别加入1ul圣湘EBV试剂盒中的内标、6ul的助沉剂、20ul蛋白酶K以及200ul分离出的血浆。放入核酸提取仪中，按要求的程序进行核酸提取。
2.4将提好的核酸样品取出，置于1.5mL的EP管中，放在4℃冰箱，备用。
3提取分选细胞核酸
3.1在取过血浆的样品管中加入3ml左右的红细胞裂解液，混匀。
3.2将血细胞样品转移到50ml离心管中(管盖和管身写序号)，并补满红细胞裂解液。
3.3混匀，静置7min裂红，中途上下颠倒混匀一次。
3.4裂红完成后，1400rpm离心5min。
3.5离心完成后，弃掉上清液。加满PBS缓冲液，并1400rpm离心5min。
3.6离心完成后，弃掉上清液。余液大概有300ul，加入100ul PBS，移管。转移到5ml流式管中。(其中各管样品体积为CD4&CD8样品管：CD19&CD56样品管：CD14&CD15样品管：CD41a&CD235a样品管＝1：1：1：1)。
3.7染色，CD4&CD8细胞分选：每个样品管中需要加入5ul CD3、CD4、CD8荧光标记的抗体；
CD19&CD56细胞分选：每个样品管中需要加入5ul CD3、CD19、CD56荧光标记的抗体。
CD14&CD15细胞分选：每个样品管中需要加入5ul CD45、CD14、CD15荧光标记的抗体。
CD41a&CD235a细胞分选：每个样品管中需要加入5ul CD45、CD41a、CD235a荧光标记的抗体。
混匀。室温避光孵育15min。
3.8避光孵育完成后，加入2ml的PBS,1400rpm离心5min。
3.9弃上清，加入800ul PBS缓冲液混匀，使用流式细胞分选仪分选目标细胞。
3.10将分选完成后的CD3+CD4+细胞、CD3+CD8+细胞、CD3-CD19+细胞、CD56+细胞、CD45+CD14+、CD45+CD15+细胞、CD45-CD41a+细胞、CD45-CD235a+细胞和100ul未分选的CD19&CD56细胞分别转移到QD4、QD8、QD19、QD56、QD14、QD15、QD41a、QD235a、序号(样品会根据接收当天接收顺序再次编号)管中。离心1400rpm,5min。
3.11离心完成后，弃掉上清液。余液留有100ul，加入100ul的DNA提取试剂，混匀。
3.12将混匀后的样品放在100℃的恒温混匀仪上干浴10min。
3.13完成干浴后，将样品离心，12000rpm离心30秒。完成离心后，将样品取出，放在4℃冰箱，备用。
4PCR扩增
4.1从-20℃冰箱拿出圣湘EBV病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，平衡至室温。
4.2取出试剂盒中的标准品混匀(Ⅰ：4*10^7、Ⅱ：4*10^6、Ⅲ：4*10^5、Ⅳ：4*10^4)。
由标准品“Ⅳ”10倍稀释(5ul的Ⅳ+45ul的ddH2O)得到标准品“E”(4*10^3)。
由标准品“E”10倍稀释(5ul的“E”+45ul的ddH2O)得到标准品“F”(4*10^2)。
由标准品“Ⅳ”8倍稀释(5ul的Ⅳ+35ul的ddH2O)标准品“G”(5*10^3)。
由标准品“E”2倍稀释(10ul的“E”+10ul的ddH2O)稀释得到标准品“H”(2*10^3)。
分别取10ul的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、E、F、G、H与等体积的核酸释放剂混合，得到最终的标准品。
4.3配置PCR反应液:19ul主反应液*(n+12)+1ul酶*(n+12)(n为待测样品数)。
4.4加样，在0.2mlPCR八排管中，将配置好的反应液混匀，每个样品孔加入20ul的PCR反应液和5ul的待测样品，盖好八排管的盖子。做好标记，瞬时离心，去气泡。
4.5上机扩增，按照圣湘EBV病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)中要求的扩增程序进行检测。
4.6根据检测结果确定EB病毒感染的细胞。
试验例
1.如表1和图2-图3所示，为采用实施例1的装置和检测方法对于CAEBV患者(P1，男，24岁)骨髓血的检测结果，骨髓血T、B、NK、巨核、红细胞、单核、粒细胞均有EBV DNA检出。
表1检测患者(P1)骨髓血中感染EBV的结果
2.如表2和图4-图5所示，为采用实施例1的装置和检测方法对于原发性噬血细胞综合征患者(P2，女，17岁)骨髓血的检测结果，只有骨髓血T细胞有EBV DNA检出。
表2检测患者(P2)骨髓血中感染EBV的结果
3.如表3和图6-图7所示，为采用实施例1的装置和检测方法对于造血干细胞移植健康供者(P3，女，50岁)骨髓血的检测结果，骨髓血各细胞群均无EBV DNA检出。
表3检测患者(P3)骨髓血中感染EBV的结果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种检测EB病毒感染骨髓血疾病类型的装置，其特征在于，包括预处理模块、细胞分选模块、EB病毒核酸检测模块和分析模块；
所述预处理模块用于去除人骨髓血样品中的血浆和红细胞；
所述细胞分选模块用于将经过预处理模块处理后的样品进行细胞分选，至少分选获得CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞；
所述EB病毒核酸检测模块用于对分选获得的细胞分别进行DNA提取和EB病毒核酸检测；
所述分析模块根据EB病毒核酸检测模块的结果确定EB病毒感染的细胞；若CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞均被EB病毒感染，则判定造血干细胞被EB病毒感染。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述细胞分选模块包括流式细胞分选仪；
所述EB病毒核酸检测的方法包括荧光定量PCR。
3.一种EB病毒感染细胞的定位方法在指导制备治疗EB病毒感染疾病的药物中的应用，其特征在于，所述EB病毒感染细胞的定位方法包括以下步骤：
提取人骨髓血；然后采用流式细胞分选仪至少分选获得CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞；再对分选获得的细胞分别进行DNA提取和EB病毒核酸检测，根据检测结果确定EB病毒感染的细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，若CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨核细胞或血小板，以及红细胞均被EB病毒感染，则判定造血干细胞被EB病毒感染。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用流式细胞分选仪分选之前，还包括对人骨髓血进行预处理；
所述预处理包括去除人骨髓血中的血浆和红细胞。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用离心的方法去除人骨髓血的血浆。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用红细胞裂解液去除人骨髓血的红细胞。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述分选包括：获得4份预处理后的人骨髓血样品；
第一份样品加入荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD4抗体和荧光标记的抗CD8抗体；
第二份样品加入荧光标记的抗CD3抗体、荧光标记的抗CD19抗体和荧光标记的抗CD56抗体；
第三份样品加入荧光标记的抗CD45抗体、荧光标记的抗CD14抗体和荧光标记的抗CD15抗体；
第四份样品加入荧光标记的抗CD45抗体、荧光标记的抗CD41a抗体和荧光标记的抗CD235a抗体；
孵育后过流式细胞分选仪进行分选。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述孵育为在避光环境下孵育10-20min。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述EB病毒核酸检测的方法包括荧光定量PCR。
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