CN114659964A - 外周血t细胞群免疫细胞在制备筛查慢性乙型肝炎转阴效果产品中的应用 - Google Patents

外周血t细胞群免疫细胞在制备筛查慢性乙型肝炎转阴效果产品中的应用 Download PDF

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CN114659964A CN202011535232.9A CN202011535232A CN114659964A CN 114659964 A CN114659964 A CN 114659964A CN 202011535232 A CN202011535232 A CN 202011535232A CN 114659964 A CN114659964 A CN 114659964A
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刘阳
高祥
文艳玲
张政
王鑫
杨倩婷
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Third Peoples Hospital of Shenzhen
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Abstract

本发明公开了检测样品中
Figure DDA0002853159070000011
CD8 T细胞比例的物质、检测样品中CD8 CTL细胞比例的物质或上述物质的组合的下列任一应用：1)在制备鉴别诊断乙肝表面抗原转阴的慢性乙型肝炎患者和乙肝表面抗原未转阴的慢性乙型肝炎患者的产品中的应用；2)在制备预测慢性乙型肝炎患者预后的产品中的应用；3)在制备筛查或辅助诊断慢性乙型肝炎转阴效果产品中的应用。结果表明，人外周血中慢性乙型肝炎转阴组相比慢性乙型肝炎非转阴组，
Figure DDA0002853159070000012
CD8 T细胞比例显著上升，而CD8 CTL细胞的比例显著下降。这些细胞群比例可以在早期作为潜在预后的标志物。

Description

外周血T细胞群免疫细胞在制备筛查慢性乙型肝炎转阴效果 产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中外周血T细胞群免疫细胞在制备筛查慢性乙型肝炎转阴效果产品中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染严重威胁人类公共健康，全球有超过3.5亿慢性感染者。成人感染HBV后主要引起急性感染，约95％的感染者发生自愈，5岁以下的儿童感染HBV后更倾向于慢性化。儿童HBV抗病毒治疗存在差异，通过动态测量抗病毒s抗原转阴组和非转阴组在不同时间点的免疫细胞群变化，可以揭示儿童慢乙肝抗病毒治疗预后的关键因素，作为疾病预后的预警因子。检测儿童慢性乙型肝炎特异性外周血免疫细胞亚群动态改变，这些细胞中特异的细胞群变化可以确定儿童慢乙肝抗病毒治疗的疗效。
传统技术都是采用流式细胞术度量，各个荧光通道存在信号干扰且只能度量少数蛋白标志物表达，信息有限。由于外周血本身免疫细胞异质性较强，传统方法精确度有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何筛查或辅助诊断慢性乙型肝炎转阴效果。
为解决上述技术问题，本发明提供了检测样品中
Figure BDA0002853159050000011
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质、检测样品中CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质或上述物质的组合的下列任一应用：
1)在制备鉴别诊断乙肝表面抗原转阴的慢性乙型肝炎患者和乙肝表面抗原未转阴的慢性乙型肝炎患者的产品中的应用；
2)在制备预测慢性乙型肝炎患者预后的产品中的应用；
3)在制备筛查或辅助诊断慢性乙型肝炎转阴效果产品中的应用。
上述应用中，所述检测样品中
Figure BDA0002853159050000012
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质可包括检测
Figure BDA0002853159050000013
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例的试剂和/或仪器，如通过质谱流式检测
Figure BDA0002853159050000014
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例所需的试剂和仪器。
上述应用中，所述
Figure BDA0002853159050000015
CD8 T细胞可为标记物标记的
Figure BDA0002853159050000016
CD8 T细胞。
上述应用中，所述
Figure BDA0002853159050000017
CD8 T细胞具体可为人
Figure BDA0002853159050000018
CD8 T细胞。
上述应用中，所述检测
Figure BDA0002853159050000019
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例，标志物是CD8、CD45RA、CD127。
上述应用中，所述检测样品中CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质可包括检测CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例的试剂和/或仪器，如通过质谱流式检测CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例所需的试剂和仪器。
上述应用中，所述CD8 CTL细胞可为标记物标记的CD8 CTL细胞。
上述应用中，所述CD8 CTL细胞具体可为人CD8 CTL细胞。
上述应用中，所述检测CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例，标志物是CD8、Granzyme B、Perforin。
上述应用中，所述样品是外周血。
上述应用中，所述样品是外周血单个核细胞。
上述应用中，所述样品是人儿童样品。所述儿童为0-6岁儿童。
上述应用中，所述慢性乙型肝炎可为儿童慢性乙型肝炎；所述慢性乙型肝炎为有乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染背景的慢性乙型肝炎。
上述应用中，所述慢性乙型肝炎患者经历抗病毒治疗。所述抗病毒治疗可为以干扰素(IFN)、恩替卡韦(ETV)、拉米夫定(LAM)等任一或多种药物治疗。
为解决上述技术问题，本发明还提供了产品，其为下列任一产品：
1)鉴别诊断乙肝表面抗原转阴的慢性乙型肝炎患者和乙肝表面抗原未转阴的慢性乙型肝炎患者的产品；
2)预测慢性乙型肝炎患者预后的产品；
3)筛查或辅助诊断慢性乙型肝炎转阴效果产品；
所述产品包含检测样品中
Figure BDA0002853159050000021
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质、检测样品中CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质或上述物质的组合。
上述产品中，所述产品还包括说明书；所述说明书有A1-A2中任一种或多种记载：
A1、如果所述检测对象的外周血CD45+免疫细胞中
Figure BDA0002853159050000022
CD8 T细胞的比例大于12％，该检测对象为疑似慢性乙型肝炎抗病毒治疗转阴患者(预后好)，如果所述检测对象的外周血CD45+免疫细胞中
Figure BDA0002853159050000023
CD8 T细胞的含量小于或等于12％，该检测对象候选为慢性乙型肝炎抗病毒治疗未转阴患者(预后差)；
A2、如果所述检测对象的外周血CD45+免疫细胞中CD8 CTL细胞的含量小于4％，该检测对象为疑似慢性乙型肝炎抗病毒治疗转阴患者(预后好)，如果所述检测对象的外周血CD45+免疫细胞中CD8 CTL细胞的含量大于或等于4％，该检测对象候选为慢性乙型肝炎抗病毒治疗未转阴患者(预后差)。
上述产品中，所述检测样品中
Figure BDA0002853159050000024
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质可包括检测
Figure BDA0002853159050000025
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例的试剂和/或仪器，如通过质谱流式检测
Figure BDA0002853159050000031
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例所需的试剂和仪器。
上述产品中，所述
Figure BDA0002853159050000032
CD8 T细胞可为标记物标记的
Figure BDA0002853159050000033
CD8 T细胞。
上述产品中，所述
Figure BDA0002853159050000034
CD8 T细胞具体可为人
Figure BDA0002853159050000035
CD8 T细胞。
上述产品中，所述检测
Figure BDA0002853159050000036
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例，标志物是CD8、CD45RA、CD127。
上述产品中，所述检测样品中CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质可包括检测CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例的试剂和/或仪器，如通过质谱流式检测CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例所需的试剂和仪器。
上述产品中，所述CD8 CTL细胞可为标记物标记的CD8 CTL细胞。
上述产品中，所述CD8 CTL细胞具体可为人CD8 CTL细胞。
上述产品中，所述检测CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例，标志物是CD8、Granzyme B、Perforin。
上述产品中，所述样品是外周血。
上述产品中，所述样品是外周血单个核细胞。
上述产品中，所述样品是人儿童样品。所述儿童为0-6岁儿童。
上述产品中，所述慢性乙型肝炎可为儿童慢性乙型肝炎；所述慢性乙型肝炎为有乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染背景的慢性乙型肝炎。
上述产品中，所述慢性乙型肝炎患者经历抗病毒治疗。所述抗病毒治疗可为以干扰素(IFN)、恩替卡韦(ETV)、拉米夫定(LAM)等任一或多种药物治疗。
实验结果表明，人外周血中慢性乙型肝炎转阴组相比慢性乙型肝炎非转阴组，
Figure BDA0002853159050000037
CD8 T细胞比例显著上升，而CD8 CTL细胞的比例显著下降。这些细胞群比例可以在早期作为潜在预后的标志物。
附图说明
图1为实施例1筛选鉴定儿童慢性乙型肝炎转阴生物标志物的流程图。
图2为实施例1中慢性乙型肝炎儿童与健康儿童肝脏质谱流式分析结果图。
图3为实施例1中转阴非转阴组T细胞群免疫细胞比例变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
按照图1的流程，采用质谱流式(CyToF)测量2-6岁儿童经过2周慢性乙型肝炎抗病毒治疗转阴(乙肝表面抗原转阴)组2人与非转阴(乙肝表面抗原未转阴)组2人的人外周血单个核细胞(PMBC)中33个T细胞蛋白标志物(见表1)和36个B细胞相关蛋白标志物(见表2)，然后结合生物信息分析算法对细胞-蛋白表达进行聚类分群，计算细胞群组间差异，确定抗病毒预后差异的关键细胞亚群。
表1 人外周血单个核细胞(PMBC)中的33个T细胞蛋白标志物
Figure BDA0002853159050000041
Figure BDA0002853159050000051
表2 人外周血单个核细胞(PMBC)中的36个B细胞相关蛋白标志物
Figure BDA0002853159050000052
Figure BDA0002853159050000061
转阴组的入组标准：0-6岁，男孩，采用干扰素(IFN)、恩替卡韦(ETV)、拉米夫定(LAM)进行抗病毒治疗，乙肝表面抗原浓度小于0.05IU/ml(罗氏Cobas)。
非转阴组的入组标准：0-6岁，男孩，采用干扰素(IFN)、恩替卡韦(ETV)、拉米夫定(LAM)进行抗病毒治疗，乙肝表面抗原浓度大于等于0.05IU/ml(罗氏Cobas)。
所用待测样本为外周血，具体步骤如下：
1.样本处理：
(1)将血样混匀，2000rpm 25℃离心5min。
(2)取适量PBS加入血样，混匀后缓慢加到淋巴细胞分离液上层，2000rpm25℃离心20min。
(3)吸取离心后中间层淋巴细胞，加入10ml PBS离心管内，2000rpm 4℃离心5min。
(4)离心完毕后弃上清，重悬计数，2000rpm 4℃离心5min。
(5)弃上清，加入细胞冻存液冻存。
2.质谱流式染色
(1)细胞计数，取3x106个细胞(不要低于1x106个)，用不含Ca2+Mg2+的PBS重悬，将体积调至1ml。
(2)转入流式管内，加入终浓度为0.5μM(如母液为5mM，按照1:10000稀释)的顺铂，混匀后室温放置2min(此浓度和孵育时间为推荐值，可根据不同类型的样本最终染色强度进行调整)。
(3)加入2ml Cell Staining Buffer终止反应，常温300g离心5分钟(此时进行步骤5)。
(4)弃上清。
(5)配置block mix，每个样本对应50μl。
(6)每管样本加入50μl block mix，重悬细胞，室温放置10min，孵育结束后不必去除封闭液，直接加入antibody cocktail。
(7)配置膜蛋白antibody cocktail。
(8)向封闭结束后的每管样本中加入50μl antibody cocktail(加上之前的50μl封闭液，此时体积为100μl)。
(9)轻柔吹打混匀细胞，室温放置15min。
(10)轻柔vortex混匀细胞，继续室温放置15min。
(11)每管样本中加入2ml Cell Staining Buffer，离心300g×5min，弃上清。
(12)重复步骤11。
(13)轻柔vortex，在残留的上清中完全打散细胞。
(14)配置Nuclear Antigen Staining Buffer。将一份4x Nuclear AntigenStaining Buffer Concentrate加入三份Nuclear Antigen Staining Buffer Diluent，每个样本配置1ml。
(15)轻柔vortex混匀。室温放置30min。
(16)每管中加入2ml Nuclear Antigen Staining Perm清洗细胞，离心800g×5min，弃上清。
(17)重复步骤16。(离心时间进入步骤18配置antibody cocktail)
(18)Antibody cocktail配置。
(19)每管细胞中加入50μl antibody cocktail。
(20)轻柔涡旋震荡细胞，室温放置30-45min。
(21)每管加入2ml Cell Staining Buffer，离心800g×5min，弃上清。
(22)重复步骤21，弃上清，在回流的上清中涡旋震荡，打散细胞。
固定细胞(新鲜固定)。
(23)用PBS配置终浓度为1.6％的甲醛溶液，每个样本需要1ml。
(24)每个样本中加入1ml 1.6％的甲醛溶液，vortex混匀。
(25)室温放置10min。
(26)离心800gx5min，弃上清
(27)在fix and perm buffer里加入终浓度为125nM的Ir，每个样品用量1ml。
(28)握住流式管管口，一边Vortex，一边逐滴加入1ml cell intercalation溶液
(29)离心800gx5min，弃上清。
(30)每管样本加入2ml Cell StainingBuffer重悬细胞，离心800gx5min，弃上清。
(31)每管样本加入1ml PBS重悬细胞，取10μl进行细胞计数。离心800gx5min，弃上清。
(32)配置10％EQ beads溶液(1份EQ beads+9份CAS)。
(33)根据细胞计数结果，用10％EQ beads溶液将细胞重悬为1x106/ml(Helios)的悬液。
(34)用带35um滤网的流式管过滤细胞悬液。
(35)上机采集数据(WB Injector)。
其中染色用的通用蛋白标志物为：CD45，CD196，CD19，CD5，CD38，CD1c，IgD，CD20，IgA，CD56，CD86，CD72，CD21，IgG3，CD183，CD279，CD184，CD10，CD22，CD14，IgG2，CD11c，IgG1，CD95，CD40，CD85j，CD197，CD24，CD3，CD44，IgM，CD27，HLA-DR，CD71，FCRL5，CD16
B细胞蛋白标志物为：CD45，CD196，CD19，CD5，CD38，CD1c，IgD，CD20，IgA，CD56，CD86，CD72，CD21，IgG3，CD183，CD279，CD184，CD10，CD22，CD14，IgG2，CD11c，IgG1，CD95，CD40，CD85j，CD197，CD24，CD3，CD44，IgM，CD27，HLA-DR，CD71，FCRL5，CD16。
3.下机数据预处理
质谱流式下机数据采用FlowJo圈门去除死细胞、Doublets，选择CD45+细胞用于后续数据分析。
4.数据分析
采用R cytofkit包进行细胞群聚类、差异表达分析。以FlowJo预处理的FCS文件为输入，依次进行数据变换(cytofAsinh)、细胞分群(FlowSOM、PhenoGraph)、数据降维(PCA、t-SNE、ISOMAP)。细胞群不同分组采用t检验计算组间差异的显著性。通过细胞蛋白标志物的表达，构建外周血免疫图谱，具体见图2。
通过大量蛋白标志物的表达，可以对外周血不同的细胞进行精确分群，然后比较组间差异。转阴非转阴组T细胞群免疫细胞比例变化分析结果见图3，转阴组相比非转阴组，
Figure BDA0002853159050000081
CD8 T细胞(主要标志物是CD8、CD45RA、CD127)比例显著上升，而CD8 CTL细胞(主要标志物是CD8、Granzyme B、Perforin)的比例显著下降。这些细胞群比例可以在早期作为潜在预后的标志物(图3)：检测对象的外周血CD45+免疫细胞中
Figure BDA0002853159050000091
CD8 T细胞的比例大于12％，该检测对象为疑似慢性乙型肝炎抗病毒治疗转阴患者(预后好)，如果所述检测对象的外周血CD45+免疫细胞中
Figure BDA0002853159050000092
CD8 T细胞的含量小于或等于12％，该检测对象候选为慢性乙型肝炎抗病毒治疗非转阴患者(预后差)；检测对象的外周血中CD8 CTL细胞的含量小于4％，该检测对象为疑似慢性乙型肝炎抗病毒治疗转阴患者(预后好)，如果所述检测对象的外周血中CD8 CTL细胞的含量大于或等于4％，该检测对象候选为慢性乙型肝炎抗病毒治疗非转阴患者(预后差)。

Claims (10)

1.检测样品中
Figure FDA0002853159040000011
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质、检测样品中CD8CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质或上述物质的组合的下列任一应用：
1)在制备鉴别诊断乙肝表面抗原转阴的慢性乙型肝炎患者和乙肝表面抗原未转阴的慢性乙型肝炎患者的产品中的应用；
2)在制备预测慢性乙型肝炎患者预后的产品中的应用；
3)在制备筛查或辅助诊断慢性乙型肝炎转阴效果产品中的应用。
2.下列任一产品：
1)鉴别诊断乙肝表面抗原转阴的慢性乙型肝炎患者和乙肝表面抗原未转阴的慢性乙型肝炎患者的产品；
2)预测慢性乙型肝炎患者预后的产品；
3)筛查或辅助诊断慢性乙型肝炎转阴效果产品；
其特征在于：所述产品包含检测样品中
Figure FDA0002853159040000012
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质、检测样品中CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例的物质或上述物质的组合。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于：所述产品还包括说明书；所述说明书有A1-A2中任一种或多种记载：
A1、如果所述检测对象的外周血CD45+免疫细胞中
Figure FDA0002853159040000013
CD8 T细胞的比例大于12％，该检测对象为疑似慢性乙型肝炎抗病毒治疗转阴患者，如果所述检测对象的外周血CD45+免疫细胞中
Figure FDA0002853159040000014
CD8 T细胞的含量小于或等于12％，该检测对象候选为慢性乙型肝炎抗病毒治疗未转阴患者；
A2、如果所述检测对象的外周血CD45+免疫细胞中CD8 CTL细胞的含量小于4％，该检测对象为疑似慢性乙型肝炎抗病毒治疗转阴患者，如果所述检测对象的外周血CD45+免疫细胞中CD8 CTL细胞的含量大于或等于4％，该检测对象候选为慢性乙型肝炎抗病毒治疗未转阴患者。
4.根据权利要求2或3所述的产品，其特征在于：所述产品用于质谱流式检测。
5.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2-4任一所述的产品，其特征在于：所述样品是外周血样品。
6.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2-4任一所述的产品，其特征在于：所述样品是外周血单个核细胞。
7.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2-4任一所述的产品，其特征在于：所述样品是人儿童样品。
8.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2-4任一所述的产品，其特征在于：所述检测
Figure FDA0002853159040000021
CD8 T细胞在CD45+免疫细胞中比例，标志物是CD8、CD45RA、CD127。
9.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2-4任一所述的产品，其特征在于：所述检测CD8 CTL细胞在CD45+免疫细胞中比例，标志物是CD8、Granzyme B、Perforin。
10.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2-4任一所述的产品，其特征在于：所述慢性乙型肝炎患者经历抗病毒治疗。
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