CN105384805B - 一种结核病检测多肽及其应用 - Google Patents

一种结核病检测多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的结核特异性检测多肽，其多肽序列为SEQ ID NO.1所示，应用于结核病的血清学检测，敏感性高、特异性强；同时兼顾了血清学检测方法简单、快速，价格便宜的特点，不需要特殊的大型检测设备，使得基层医院也能够广泛开展高敏感性的结核病检测；同时，本发明的结核特异性检测多肽对痰涂片阴性的肺结核，肺外结核和不易获得痰标本的儿童结核的诊断均具有重要价值；另外，本发明的结核特异性检测多肽的特异性抗体及其在制备结核检测试剂盒中应用对结核病检测领域同样意义重大。

Description

一种结核病检测多肽及其应用
技术领域
本发明涉及结核病检测领域，尤其涉及一种结核检测多肽及其应用。
背景技术
由人结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)所引起的结核病是严重危害人类健康的传染病。结核病是WHO重点控制的传染性疾病，目前仍是严重危害人民健康的公共卫生问题。据有关资料统计，全球约有1/3的人口感染结核菌，现有结核病人约2000万，每年新发病800万～1000万人，每年约有200万人死于结核病，是其它所有传染病死亡人数的总和。我国的结核病疫情极其严峻，现有结核感染者5亿，占全球的1/4，每年有13万人死于结核病，为其它各类传染病和寄生虫病死亡人数总和的2倍。近二、三十年来由于人口流动，耐药结核菌传播，艾滋病等因素影响，结核病疫情在全球范围内回升。如今已成为所有传染病中的最大死亡原因(已经超过了狂犬病)，成为青年人的第一杀手。
目前结核病控制存在的最主要问题是病人发现率低，治愈率低。在诊断方面，现有的检查方法均存在着一定的局限性，难以达到快速、准确的结核病诊断。因此，加大结核分枝杆菌的基础研究，寻找快速、灵敏、简便、实用的结核病诊断新方法，提高结核病人的检出率，是目前结核病研究需要迫切解决的问题。
血清学检查是目前结核病实验室三大诊断方法之一，相对细菌学和分子生物学检查具有多种优点，其方法简单、快速，价格便宜，不需要特殊的大型检测设备，即使基层医院也能够广泛开展，对痰涂片阴性的肺结核，肺外结核和不易获得痰标本的儿童结核的诊断均具有重要价值，成为了早期发现与诊断结核病的理想选择。结核病的常规血清学检查存在着敏感性、特异性较低的缺点，限制了临床应用，主要原因是难以得到高敏感性、高特异性的检测标识物。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种高特异性、高敏感性结核病检测多肽，以及相关的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种结核特异性检测多肽，其多肽序列为SEQ ID NO.1所示。
通过对病人和健康人血清或血浆样本中的小分子多肽进行分离富集，采用4800Plus MALDI TOF/TOFTM质谱仪对不同样本中的多肽分子进行鉴定，获得在不同样本的分布具有显著性差异的多肽分子，通过数据分析比较，我们发现如SEQ ID NO.1所示多肽分子P1可以有效区分结核病人和健康人的血清或者血浆样本，在结核病人血清或者血浆中的含量显著低于健康人，进一步利用数据库对该多肽来源的蛋白――凝集素进行血清标本的检测发现，结核病人血清中凝集素的含量显著高于健康人，利用该蛋白可以有效区分结核病人和健康对照，可用于结核病的血清学检测。
另一方面，本发明还提供一种检测结核病的试剂盒，将上述的结核特异性检测多肽作为检测标识物。
同时，本发明还提供一种上述的结核特异性检测多肽的特异性抗体。
另一方面，本发明还包括上述特异性抗体在制备结核检测试剂盒中的应用。
本发明的结核特异性检测多肽，应用于结核病的血清学检测，敏感性高、特异性强；同时兼顾了血清学检测方法简单、快速，价格便宜的特点，不需要特殊的大型检测设备，使得基层医院也能够广泛开展高敏感性的结核病检测；同时，本发明的结核特异性检测多肽对痰涂片阴性的肺结核，肺外结核和不易获得痰标本的儿童结核的诊断均具有重要价值。
附图说明
图1为结核特异性检测多肽P1在不同标本中质谱检测的响应值(A为血清标本；B为血浆标本)；
图2为凝集素在不同血清标本中的ELISA检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种结核特异性检测多肽，其多肽序列为SEQ ID NO.1所示。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1：结核病人血清血浆特异性多肽的鉴定
1实验材料
1.1纳米孔芯片
纳米孔(Nanoporous，NPS)硅薄膜芯片由美国卫理公会医院研究所的胡晔教授馈赠，是一种孔径在1～100nm且具有显著表面效应的多孔材料，不同孔径的纳米孔可以特异性吸附、分离小分子蛋白或多肽。
1.2结核病人，疾病对照及健康人血清
20例结核病人血清、血浆标本采集自上海市肺科医院结核科门诊或住院的结核病人，均为结核分枝杆菌培养阳性；20例非结核性疾病对照血清采集自上海市肺科医院呼吸科门诊确诊的非结核病性呼吸系统疾病病人；23例健康人血清、血浆采集自上海市肺科医院门诊体检的健康华东汉族人，均有卡介苗接种史。所有人选均排除了合并糖尿病、自身免疫性疾病及HIV感染。血清、血浆标本采集后分装，－80℃冻存。
1.3主要化学试剂
乙腈(Acetonitrile，ACN)，三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)，基质α－氰基－4－羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)购自美国Sigma公司；CultureWellTM分隔盖玻片购自美国life technologies公司；标准多肽购自德国BrukerDaltonics公司。
1.4主要仪器
AB4800MALDI-TOF系统(美国ABI公司)；全自动高压灭菌器(日本Hirayama公司)；超纯水分离系统(英国USF Elga公司)；普通离心机(德国eppendorf公司)；深低温冰箱(美国Thermo Scientific公司)。
2方法及结果
2.1血清、血浆标本的预处理
用去离子配制含50％ACN和0.1％TFA的样本稀释液，取2.8μl加入到分装离心后的25μl血清、血浆标本中，使ACN的终浓度为5％，TFA为0.01％，混匀后，置于桌面式漩涡振荡仪室温混合30分钟。
2.2血清、血浆标本中多肽的分离提纯
2.2.1在160℃烤箱中预先过夜烘烤纳米孔芯片，或者将芯片贮存在干燥器中直到使用，以避免空气中水分子对芯片表面的水合作用。
2.2.2使用压缩空气抹掉可能附着在芯片表面的任何微粒。
2.2.3按照检测样本数量，裁剪包含相同数量检测孔的CultureWell分隔盖玻片100％乙醇清洁后，用镊子将盖玻片放置于芯片表面，并保证盖玻片与芯片的紧密贴合。
2.2.4用移液器吸取预处理的血清或血浆样本5μL分别加入到盖玻片3mm孔中，每个样品制备2复孔，室温湿盒中孵育30分钟。
2.2.5用移液器吸取孔中残留的样本，加入10μL去离子水至各孔中进行冲洗，重复4次。
2.2.6为了模仿生物样品的复杂度及评估小分子量多肽的富集效率，我们选取了一些已知分子量和浓度的标准多肽作为标准品，同时校正质谱分子量。包括标准多肽1045.5(Sigma公司，分子量为1045.5Da)，2465(Sigma公司，分子量为2465Da)，原始浓度为1μmol/L，用洗脱缓冲液(50％ACN+0.1％TFA)1：50稀释至使用浓度。
2.2.7用含有标准多肽的洗脱缓冲液6μL/孔加入至每个样本孔中，室温孵育2min，将缓冲液吸至微量离心管中，用于MALDI-TOF检测。
2.3多肽的MALDI-TOF分析
2.3.1吸取1μL上述制备好的样品点靶至不锈钢靶板，等样品点干后再在同样位置上点加1μL饱和基质(洗脱缓冲液+CHCA,浓度为5g/L)，室温放置干燥。
2.3.2取1μL校正液于校正点中，同样加入基质后进行干燥。
2.3.3将靶板送入质谱仪进行打靶并收集质谱图。选定正离子反射模式，激光能量为4200和3000，扫描范围为m/z 800～5000Da。
2.4数据分析
MALDI-TOF数据采用ConvertPeakList软件进行处理后生成文本文件，再输入到SpecAlign软件进行处理。利用PAFFT相关法对所有质谱图谱峰进行比对；利用总离子量(Total Ion Count，TIC)对所有质谱峰进行归一化整理；利用Cluster 3.0软件进行分层聚簇；利用MarkerView软件进行主成分分析(Principle Component Analysis，PCA)以及t检验。不同组别之间的t值及p值利用MarkerView软件进行计算。寻找不同样本组的血清、血浆表达差异多肽。
2.5多肽鉴定
经过血清、血浆样本的PCA分析，选取在不同样本组中具有显著统计学差异的多肽进行比较，发现多肽1531.89m/z(结核特异性检测多肽P1)在结核病人血清和血浆样本中的响应值均显著低于健康对照，结果见附图1，提示该多肽在结核病人外周血中的含量发生显著变化，可能具有判别结核病人和健康人的价值。获得兴趣肽后再进行二级质谱分析；将二级质谱图数据导入BioTools软件工具，在MASCOT网站进行在线搜库，最终鉴定该多肽来源于凝集素第3亚型。
实施例2：多肽P1来源蛋白――凝集素对血清标本的检测
1.实验材料
1.1血清标本：
18份活动性肺结核患者(痰标本结核分枝杆菌培养均为阳性)和17份有卡介苗接种史的健康人血清标本均为上海市肺科医院血清标本库保存。
1.2主要试剂：
人源凝集素竞争ELISA检测试剂盒购自瑞士Adipogen公司。
1.3相关试剂的配制：
见试剂盒说明书
1.4仪器设备：
ROTINA38台式冷冻高速离心机(德国Hettich公司)；Thermo MK3酶标仪(美国THERMO公司)；HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；全自动高压灭菌器(日本Hirayama公司)；超纯水分离系统(英国USF Elga公司)。
2.方法及结果
2.1标准品配制：
标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：
40nmol/L(6号标准品)原倍浓度不用稀释直接加入50ul。
20nmol/L(5号标准品)100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
10nmol/L(4号标准品)100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
5.0nmol/L(3号标准品)100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
2.5nmol/L(2号标准品)100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
1.25nmol/L(1号标准品)100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0nmol/L(空白对照)直接加入50ul标准品稀释液。
2.2根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。
每个标准品和空白孔均做2复孔。血清标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
2.3加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。
立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
2.4甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
2.5每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
2.6甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
2.7每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
2.8取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
2.9于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值。以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的clusterin标准品浓度为横坐标(X)，做得相应的曲线，样品的clusterin含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。结果见附图2。
本发明的结核特异性检测多肽，应用于结核病的血清学检测，敏感性高、特异性强；同时兼顾了血清学检测方法简单、快速，价格便宜的特点，不需要特殊的大型检测设备，使得基层医院也能够广泛开展高敏感性的结核病检测；同时，本发明的结核特异性检测多肽对痰涂片阴性的肺结核，肺外结核和不易获得痰标本的儿童结核的诊断均具有重要价值；另外，本发明的结核特异性检测多肽的特异性抗体及其在制备结核检测试剂盒中应用对结核病检测领域同样意义重大。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
<110> 上海市肺科医院
<120> 一种结核病检测用多肽及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 12
<212> 多肽
<213> 凝集素
<400> 1
Arg Pro His Phe Phe Phe Pro Lys Ser Arg Ile Val
1 5 10 12

Claims (2)

1.一种序列为SEQ ID NO.1所示的多肽作为结核检测标识物的应用。
2.一种结核特异性检测多肽的特异性抗体在制备结核检测试剂盒中的应用，其中，结核特异性检测多肽序列为SEQ ID NO.1所示。
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