TWI668445B - 測量天然殺手細胞活性之方法和診斷套組 - Google Patents

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Abstract

本發明提供診斷癌症之方法、用於測量天然殺手細胞活性之診斷套組及組成物。癌症之發生可透過測量血液中天然殺手細胞之活性以監控活體內免疫系統的變化而加以診斷。因此，使用個體之血液樣本，癌症之發生可依如本發明所描述者容易地加以預測。

Description

測量天然殺手細胞活性之方法和診斷套組 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2011年2月14日提交申請之韓國專利申請案號2011-0012983的優先權和利益，其揭露之內容全部納為本文之參考。
本發明關於用於診斷癌症之方法及使用天然殺手細胞活性之測量值的診斷套組。
已知，天然殺手細胞(NK)參與先天免疫以去除病原體及癌細胞，並分泌γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、巨噬細胞發炎性蛋白-1 β(MIP-1 β)及其他分子以介導適應性免疫。當天然殺手細胞遇到其他細胞時，天然殺手細胞具有一種機制其中當MHC 1類如同在癌細胞中般不存在，或MHC類之形狀如同在感染病毒之細胞中般異常時，其主要組織相容性複合體(MHCs)發送信號給天然殺手細胞以透過其分子作用攻擊這些異常細胞。然而，據報導因為天然殺手細胞在各種癌症中之功能和分化能力有缺陷，天然殺手細胞之活性與癌細胞之存活密切相關。因此，正進行廣泛之研究以增加用於癌症免疫療法之天然殺手細胞的數量或活性。
同時，診斷癌症之方法主要包括從使用電腦斷層掃描 (CT)、磁共振造影(MRI)或X射線取得之圖形影像尋找癌症是否存在。然而，由於這些測試一般僅在病人因為疼痛或不便而有強烈需要進行測試時進行且僅在某些組織中進行，癌症之存在可能被忽略。使用血液測試來測定癌症風險的方法已經研發出來，但其作為診斷癌症之方法的用途有限。這是因為當發生因素存在於對應器官，而非癌症時，該病人可能顯示出癌症陽性，因為該方法係使用血液腫瘤標記(例如用於前列腺癌、結腸癌、卵巢癌、胰腺癌或肝癌之血液腫瘤標記)進行。也有使用抗體診斷癌症之嘗試，但這類嘗試受限於某些類型之癌症。
因此，對於診斷不同類型之癌症的新方法仍有需求。
因此，本發明之目的係提供可用於診斷和評估癌症的方法，以及有用於這類方法的套組和試劑。
本發明的一種觀點係提供測量天然殺手細胞活性的方法，該方法包含刺激血液樣本中天然殺手細胞，從而人為活化天然殺手細胞以產生天然殺手細胞分泌之細胞介素並測量血液樣本中天然殺手細胞分泌之細胞介素的量。
於某些非限制性體系中，該血液樣本可能為全血、周圍血液單核細胞(PBMCs)或天然殺手細胞之樣本。
於進一步之體系中，刺激天然殺手細胞可能經由培育該血液樣本與至少一種刺激性細胞介素(包括介白素2、介白素12、介白素15及介白素18或彼等之組合)，或經 由培育該血液樣本與脂多醣(LPSs)或聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)。
於某些體系中，該天然殺手細胞分泌之細胞介素可能包含γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或巨噬細胞發炎性蛋白-1 β(MIP-1 β)。
於該方法之進一步非限制性體系中可使用巨噬細胞發炎性蛋白-1 β(MIP-1 β)作為對照組以與正常個人之天然殺手細胞的活化情形相比較。
此外，於某些體系中該方法可能使用至少一種與安定肽融合之刺激性細胞介素來進行。例如，但不欲限於此，該安定肽可能為突觸核蛋白(synuclein)家族之C端酸性尾結構域肽。於這類體系中，該安定肽可能包含α-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基103-115(SEQ ID NO：22)、胺基酸殘基114-126(SEQ ID NO：23)、胺基酸殘基119-140(SEQ ID NO：24)或胺基酸殘基130-140(SEQ ID NO：25)、β-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基85-134(SEQ ID NO：27)、γ-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127(SEQ ID NO：29)或突觸蛋白(synoretin)之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127(SEQ ID NO：29)。
於進一步之體系中，該刺激血液樣本中天然殺手細胞，從而人為活化該天然殺手細胞以產生天然殺手細胞分泌之細胞介素的步驟係在含有載體蛋白(例如血清白蛋白)之基質中進行。
如所述之方法在偵測癌症之發生或復發上特別有用。於這類體系中，與正常個體內該天然殺手細胞分泌之細胞介素的量相比較，個體內該天然殺手細胞分泌之細胞介素的量之減少為癌症發生或復發之指標。
本發明之進一步的觀點係提供用於測量天然殺手細胞活性之套組。該套組將包含用於刺激血液樣本中天然殺手細胞從而人為活化該天然殺手細胞以產生天然殺手細胞分泌之細胞介素的試劑。此外，該套組可能有用於進行如上述之方法，包括用於偵測癌症發生或復發。
於所描述之套組的進一步非限制性體系中，該天然殺手細胞分泌之細胞介素可能為γ-干擾素(IFN-γ)或腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。
於進一步之體系中，該用於刺激血液樣本中天然殺手細胞從而人為活化該天然殺手細胞以產生天然殺手細胞分泌之細胞介素的試劑可能包含至少一種刺激性細胞介素、LPS或聚I：C，該至少一種刺激性細胞介素包括一或多種下列者：介白素2、介白素12、介白素15及介白素18。
於某些體系中，所描述之套組可能還包括一或多種下列者：抗IFN-γ抗體、抗TNF-α抗體及抗MIP-1 β抗體。不欲在任何一方面限制，該套組亦可能進一步包含用於比較個體內天然殺手細胞分泌之細胞介素的量與正常個體內天然殺手細胞分泌之細胞介素的量之指示，其中個體內該天然殺手細胞分泌之細胞介素的量水準降低為癌症發生或復發之指標。
本發明之另一觀點係提供一種融合蛋白，其包含與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之細胞介素，該細胞介素為下列群組中之一員：介白素2、介白素12、介白素15或介白素18。
於所描述之融合蛋白的某些非限制性體系中，該突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽可能包含下列群組：α-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基103-115(SEQ ID NO：22)、胺基酸殘基114-126(SEQ ID NO：23)、胺基酸殘基119-140(SEQ ID NO：24)或胺基酸殘基130-140(SEQ ID NO：25)、β-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基85-134(SEQ ID NO：27)、γ-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127(SEQ ID NO：29)或突觸蛋白(synoretin)之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127(SEQ ID NO：29)。
本發明亦提供包含上述融合蛋白之組成物。
此外，本發明亦提供包含上述之融合蛋白或上述之組成物的癌症診斷套組。
於某些非限制性體系中，如上述之癌症診斷套組亦可能包括至少一種選自下列群組之抗體：抗IFN-γ抗體、抗TNF-α抗體及抗MIP-1 β抗體。
本發明亦提供包含具有與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10之胺基酸序列至少80%同一性之胺基酸序列的多肽。不欲有所限制，該多肽可能具有較高百分比之同一性，包括與 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：10之序列具有81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之同一性。
本發明亦提供編碼上述融合蛋白及多肽之寡核苷酸。例如，提供包含具有與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9之核酸序列或彼等之互補股至少80%同一性之寡核苷酸。這類寡核苷酸可能，但不限於與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9或彼等之互補股的序列具有較高百分比之同一性，包括81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
本發明亦提供包含上述寡核苷酸之載體以及包含這類載體或寡核苷酸之宿主細胞。
詳細說明
本發明針對利用癌症與天然殺手細胞的相互關係來診斷癌症發生之方法、套組及試劑。
為此，提供測量天然殺手細胞活性的方法，其包含刺激血液樣本中天然殺手細胞從而人為活化天然殺手細胞來產生天然殺手細胞分泌之細胞介素，並測量血液樣本中天 然殺手細胞分泌之細胞介素的量。
本發明者發現基於觀察到癌症患者體內天然殺手細胞活性降低，癌症發生可能主要藉由測量天然殺手細胞之活性來篩選。此處所描述之方法能夠經由給予該天然殺手細胞人工刺激來測定天然殺手細胞的功能是否正常，並經由偵測存在於血液樣本中天然殺手細胞分泌的細胞介素之量的變化來測量天然殺手細胞的活化水準，此方法不同於其他僅單純測量原本存在於血液樣本中天然殺手細胞的數目或細胞介素之量的方法。例如，在測量天然殺手細胞之活化水準的傳統方法中，51Cr釋出分析已被作為測量目標特異性細胞毒性的方法。然而，當以這種方式測量天然殺手細胞之活性時，應使用放射性同位素，且測量和分析是困難、複雜且昂貴的。因此，該分析不適合用於可以簡單地診斷癌症發生之原發癌的篩檢/測試方法中。另一方面，根據本發明，因為天然殺手細胞活性可能藉由刺激天然殺手細胞產生由天然殺手細胞分泌之細胞介素並定量所產生之天然殺手細胞分泌之細胞介素來測量，其中天然殺手細胞活性降低的個體可能容易地被篩檢出為罹患癌症或處於罹患癌症之風險中。
根據本發明，該血液樣本可能包括，但不限於自個體採取之全血、周圍血液單核細胞(PBMCs)及天然殺手細胞。可使用完整之周圍血液單核細胞或天然殺手細胞來取代使用全血，但在某些體系中使用全血可能因方法較簡單且成本降低而較有利。
同時，在本發明中，“個體”一詞係指懷疑罹患癌症或癌症復發，或希望測定癌症發生或復發之哺乳動物。
存在於血液樣本中天然殺手細胞一般係以滅活狀態存在。根據本發明可能使用至少一種細胞介素、脂多醣(LPS)或聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)作為刺激諸如血液樣本中天然殺手細胞的試劑(此處亦稱為激動劑或活化劑)，人為活化天然殺手細胞來產生天然殺手細胞分泌的細胞介素。本發明中，用於活化天然殺手細胞之細胞介素可能為介白素2、介白素12、介白素15和介白素18，或彼等之組合。本技藝廣知能刺激介白素2、介白素12、介白素15、介白素18、LPS或聚I：C來產生天然殺手細胞分泌之細胞介素。因此，根據本發明一種示範之體系，刺激天然殺手細胞可能經由培育該血液樣本與至少一種細胞介素(包括介白素2、介白素12、介白素15和/或介白素18)，或經由培育該血液樣本與LPS或聚I：C。
於一非限制性體系中，刺激天然殺手細胞可能經由培育該血液樣本與介白素2。介白素2為一種T細胞分泌之細胞介素且已知與活體內適應性免疫反應中T細胞活化天然殺手細胞有關。此外，介白素2為被廣泛用於在體外活化天然殺手細胞的細胞介素。因此，刺激天然殺手細胞可能經由培育該血液樣本與介白素2。
於另一非限制性體系中，刺激天然殺手細胞可能經由培育該血液樣本與介白素2及介白素12。在早期癌症患者的情況中，即使天然殺手細胞之活性低，T細胞之活性可 能是高的。相反地，在末期癌症患者的情況中，T細胞以及天然殺手細胞的活性可能是低的。介白素12參與活化T細胞以及天然殺手細胞。因此，若以介白素12與介白素2處理，因刺激T細胞所分泌之細胞介素被添加入由天然殺手細胞分泌之細胞介素中。因此，評估免疫力以及天然殺手細胞之抗癌免疫力之總水準，並使用此水準作為代表癌症過程或癌症治療預後之程度的標記是可能的。介白素15和介白素18為由活化之樹突狀細胞和巨噬細胞所分泌之細胞介素，並在體外先天免疫反應期間誘導天然殺手細胞活化及增長。尤其是，當介白素12與介白素15或介白素18組合時，可能使用相當少量之介白素12來刺激天然殺手細胞中天然殺手細胞分泌之細胞介素的分泌。因此，刺激天然殺手細胞可能經由培育該血液樣本與介白素12及介白素15，或經由培育該血液樣本與介白素12及介白素18有效地進行。
根據本發明，天然殺手細胞分泌之細胞介素的數值可作為評估天然殺手細胞活性的測量值。本發明中，“天然殺手細胞分泌之細胞介素”係指從天然殺手細胞分泌之細胞介素，尤其是藉由人工刺激從活化之天然殺手細胞分泌之細胞介素。於一體系中，該天然殺手細胞分泌之細胞介素為至少一種選自下列群組之細胞介素：γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及巨噬細胞發炎性蛋白-1 β(MIP-1 β)。γ-干擾素係由天然殺手細胞、樹突狀細胞、Tc細胞、Th1細胞，等分泌且已知為控制癌 症之先天免疫和適應性免疫作用中的重要細胞介素。此外，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)殺死癌細胞並進一步參與殺死外部入侵者(諸如細菌)、誘導T細胞活化並在從B細胞製造抗體的作用中擔任補充因子的角色。因此，例如，當γ-干擾素或腫瘤壞死因子-α之數值小於正常人中之γ-干擾素或腫瘤壞死因子-α的數值時，這指示天然殺手細胞活性在控制癌症上有問題。因此，有可能經由比較從人工活化之天然殺手細胞分泌的γ-干擾素或腫瘤壞死因子-α之量與從正常人分泌的γ-干擾素或腫瘤壞死因子-α之量來測定天然殺手細胞之活性。
與此同時，可使用巨噬細胞發炎性蛋白-1 β(MIP-1 β)作為對照組以比較天然殺手細胞之活化情形。如以下實例所示，巨噬細胞發炎性蛋白-1 β(MIP-1 β)之數值在正常人和癌症患者中同樣高。因此，巨噬細胞發炎性蛋白-1 β(MIP-1 β)可以用來分析正常人及癌症患者中之天然殺手細胞的活性，或可作為使用癌症診斷套組的對照組。
天然殺手細胞分泌之細胞介素的量化可藉由本技藝已知之任何方法進行，但本發明並不侷限於此。例如，可使用γ-干擾素酶聯免疫吸附試驗(γ-干擾素ELISA)進行γ-干擾素之量化。
同時，作為刺激血液樣本中天然殺手細胞的試劑從而人為活化天然殺手細胞來產生天然殺手細胞分泌之細胞介素的細胞介素(包括介白素2、介白素12、介白素15或 介白素18)中至少一種可能呈與安定肽之融合蛋白的形式。
與野生型介白素2、介白素12、介白素15或介白素18相比較，呈與安定肽之融合蛋白形式的介白素2、介白素12、介白素15或介白素18可能會提供類似之生物活性及高儲存穩定性。例如，當細胞介素與這類安定肽結合時，儘管環境改變(諸如冷凍乾燥)，該細胞介素具有天生活性，同時保持穩定性。
安定肽可能結合介白素2、介白素12、介白素15或介白素18之N或C端，且製備這類融合蛋白可能使用已知之製備融合蛋白的方法進行。
根據一種示範之體系，突觸核蛋白之C端酸性尾(α-突觸核蛋白之酸性尾胺基酸序列，ATS)結構域肽可作為安定肽，其可結合介白素2、介白素12、介白素15或介白素18，但本發明不限於此。韓國註冊專利案10-0506766號中揭露ATS肽賦予融合之夥伴蛋白對抗環境壓力的抗性。
根據一種示範之體系，可用於本發明之安定肽包括選自下列群組之安定肽：α-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基103-115、胺基酸殘基114-126、胺基酸殘基119-140及胺基酸殘基130-140、β-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基85-134、γ-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127及突觸蛋白(synoretin)之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127。在 本發明中，可使用在韓國註冊專利案10-0506766號中揭露之方法來製備ATS肽之胺基酸序列、ATS肽及包含彼等之融合蛋白。參考以下實例，其顯示出與ATS肽融合之介白素2、介白素12、介白素15或介白素18是高度穩定的，且當該細胞介素被T淋巴細胞活化時其表達與野生型變體類似之活性。
於一種體系中，刺激血液樣本中天然殺手細胞從而人為活化天然殺手細胞來產生天然殺手細胞分泌之細胞介素的步驟可在含有載體蛋白之基質中進行。該載體蛋白參與穩定細胞介素，諸如介白素2、介白素12、介白素15或介白素18，這些細胞介素係作為刺激血液樣本中天然殺手細胞的試劑從而人為活化天然殺手細胞來產生天然殺手細胞分泌之細胞介素，藉此誘導天然殺手細胞製造更多之天然殺手細胞分泌之細胞介素。於某些體系中，該載體蛋白可能為牛血清白蛋白或人血清白蛋白，但不僅限於此。
同日等，測量天然殺手細胞活性的方法可以用來篩選癌症之發生或復發。
天然殺手細胞之活性可經由比較從人為活化之天然殺手細胞分泌之天然殺手細胞分泌的細胞介素的量與來自正常人之天然殺手細胞分泌之細胞介素的量進行測量。在這種情況下，當天然殺手細胞分泌之細胞介素的量比來自正常人之天然殺手細胞分泌之細胞介素的量少時，該天然殺手細胞之活性被認為降低。因此，評估癌症或癌症復發之風險是可能的。當天然殺手細胞之活性較正常人之活性降 低時，個體可能最初被分類為懷疑罹患癌症之病人或癌症復發之病人。此外，癌症之發生或復發可能透過其他通常用於診斷癌症之診斷方法(諸如CT、MRI或正子發射斷層掃描(PET))，及透過最後之組織測試診斷。雖然根據本發明之方法並非明確診斷癌症之方法，該方法之優點在於可能先使用血液篩選癌症是否發生或復發。
此外，本發明提供用於測量天然殺手細胞之活性的套組，其包括能刺激血液樣本中天然殺手細胞從而人為活化天然殺手細胞來產生天然殺手細胞分泌之細胞介素的試劑，諸如激動劑或活化劑。這類用於測量天然殺手細胞之活性的套組可用於容易地執行上述測量天然殺手細胞之活性的方法。
在測量天然殺手細胞之活性的套組中，該用於刺激天然殺手細胞從而人為活化天然殺手細胞來產生天然殺手細胞分泌之細胞介素的試劑可能為至少一種細胞介素、LPS或聚I：C，且該細胞介素可能選自下列群組：介白素2、介白素12、介白素15和介白素18。
除了用於刺激天然殺手細胞從而人為活化天然殺手細胞來產生天然殺手細胞分泌之細胞介素(諸如γ-干擾素)的試劑外，這類癌症診斷套組可能包括用於測量天然殺手細胞活性之額外組件，例如用於量化該天然殺手細胞分泌之細胞介素的抗體及受質。於一體系中，本發明之套組進一步包含至少一種選自下列群組之抗體：抗IFN-γ抗體、抗TNF-α抗體及抗MIP-1 β抗體。
在根據本發明之套組中的抗體可被固定在固體受質上。該抗體可使用如文獻(Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow & Lane：Cold Spring Harbor,1988)中所描述之各種方法固定。合適之固體受質可能包括細胞培養盤、ELISA盤、管子及聚合物膜。此外，該固體受質包括棒、合成玻璃、瓊脂糖珠、杯子、扁平包，或其他由固相支撐物支撐或連接到固相支撐物之薄膜或塗層。
此外，根據本發明之套組可能包括用於免疫分析之試劑，該試劑具有選擇性辦識天然殺手細胞分泌之細胞介素(諸如γ-干擾素)之抗體。該免疫分析可能包括所有可以測量抗原與根據本發明之抗體結合的方法。這類方法為本技藝所已知，且包括，例如免疫細胞化學及免疫組織化學、放射免疫分析、ELISA、免疫點墨、Farr分析、沉澱反應、比濁法、免疫擴散法、逆電流電解法、單向輻射免疫擴散法及免疫螢光。
用於免疫分析之試劑包括合適之載體、能夠產生偵測信號之標籤、溶解劑及洗滌劑。另外，當該標示物質為酶時，該試劑可能包括可以測量酶之活性的受質及停止反應試劑。該合適之載體可能包括，但不限於可溶性載體，例如本技藝已知之生理上可用之緩衝劑(例如PBS)或不溶性載體，例如聚合物，諸如藉由將金屬塗覆在聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟樹脂、交聯葡聚醣、多醣和乳膠，以及其他紙類、玻璃、金屬、瓊脂糖及彼等之組合上所取得之磁性粒子。
可使用酶、螢光物質、發光物質和放射活性物質作為可產生可偵測之信號的標籤。在酶方面，可使用過氧化物酶、鹼性磷酸酶β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉化酶，等，而異硫氰酸酯螢光素或藻膽蛋白(phycobiliprotein)可以作為螢光物質，異亮素醇(isolucinol)或光澤精(lucigenin)可作為發光物質，且I131、C14或H3可作為放射活性物質。然而，除了示範之物質外，本發明可使用任何可用於免疫分析之物質。
此外，本發明提供包含與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之細胞介素的融合蛋白。此處，該細胞介素可能為介白素2、介白素12、介白素15或介白素18。如上述，這類融合蛋白可作為用於刺激天然殺手細胞，人為活化天然殺手細胞從而產生天然殺手細胞分泌之細胞介素的試劑，且可不管環境改變(諸如冷凍乾燥或長期儲存)，提供較野生型介白素2、介白素12、介白素15或介白素18高的穩定性。
根據一種示範體系，該融合蛋白可能為其中該介白素2與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之融合蛋白。
根據另一種示範體系，該融合蛋白可能為其中該介白素12與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之融合蛋白。
根據再另一種示範體系，該融合蛋白可能為其中該介 白素15與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之融合蛋白。
根據再另一種示範體系，該融合蛋白可能為其中該介白素18與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之融合蛋白。
在融合蛋白中，該突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽亦可能選自下列群組：α-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基103-115、胺基酸殘基114-126、胺基酸殘基119-140及胺基酸殘基130-140、β-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基85-134、γ-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127及突觸蛋白(synoretin)之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127。
此外，本發明提供該融合蛋白於活化天然殺手細胞的用途。如上述，這類融合蛋白可用於活化血液中之天然殺手細胞，以促進天然殺手細胞分泌之細胞介素的分泌。
因此，本發明提供用於活化天然殺手細胞之組成物。此處，該組成物包含至少一種選自下列群組之融合蛋白：與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之介白素2、與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之介白素12、與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之介白素15及與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之介白素18。
根據一種示範之體係，該突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽可能選自下列群組：α-突觸核蛋白之C端酸 性尾結構域的胺基酸殘基103-115、胺基酸殘基114-126、胺基酸殘基119-140及胺基酸殘基130-140、β-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基85-134、γ-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127及突觸蛋白(synoretin)之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127。
同時，除了與安定肽融合之細胞介素外，用於活化天然殺手細胞之組成物可能包括能保持和儲存該融合蛋白之緩衝劑。
此外，本發明提供一種癌症診斷套組，其包括至少一種選自下列群組之融合蛋白：與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之介白素2、與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之介白素12、與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之介白素15及與突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽結合之介白素18。如上述，當將從個體採取之血液樣本與融合蛋白一起培育時，該血液樣本中天然殺手細胞被活化。因此，個體內之天然殺手細胞的活性可以透過量化由活化之天然殺手細胞所產生之γ-干擾素來測量從而先藉由將具有較正常人低之天然殺手細胞活性之個體分類成處於罹患癌症之風險中或癌症復發之患者來診斷癌症。
根據一種示範之體係，該突觸核蛋白家族之C端酸性尾結構域肽可能選自下列群組：α-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基103-115、胺基酸殘基114-126、 胺基酸殘基119-140及胺基酸殘基130-140、β-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基85-134、γ-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127及突觸蛋白(synoretin)之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127。
除了融合蛋白外，這類癌症診斷套組可能包括用於執行根據本發明之診斷方法的額外組件，例如：用於量化天然殺手細胞分泌之細胞介素的抗體和受質。上文中已描述這些組件與用於測量天然殺手細胞之活性的套組。在上述方法中使用這些組件之說明亦可包含在套組中。
很明顯地，本發明之較佳體係的這些及其他特點、面向及優點將更充分描述於下列實例中。亦可以理解這些實例僅用於說明，並不欲限制本發明之範圍。熟習本技藝之人士將了解可在不悖離所主張之本發明的範圍下製作其他同等物及修改。
製備實例1：構建具安定肽-IL融合蛋白之表達載體
為了製備與安定肽融合之IL-2、IL-12、IL-15或IL-18，構建一個表達載體。使用含有α-突觸核蛋白之胺基酸殘基119-140(SEQ ID NO：24；以下稱為“SP”)的肽作為安定肽。使用總RNA萃取套組(Invitron生物技術)從人類淋巴細胞分離出總RNA並使用逆轉錄酶(Invitrogen公司)將總RNA逆轉錄來取得IL-2、IL-12p35 、IL-12p40、IL-15及IL-18之cDNAs。使用所產生之cDNA作為模板，並使用下列特異於各cDNA基因之引物藉由PCR擴增：
第1圖為顯示SP與註明之細胞介素(包括IL-2、IL-12p35、IL-12p40、IL-15及IL-18)的融合產物之構造物的結構示意圖。如圖中所示，SP-hIL2融合產物係經由連續將編碼經PCR擴增之hIL2及α-突觸核蛋白之胺基酸殘基119-140的基因分殖入pRSETA表達載體內來構建。SP-hIL12p40融合產物係經由連續將編碼經PCR擴增之 hIL12p40及α-突觸核蛋白之胺基酸殘基119-140的基因分殖入pVL1393表達載體內來構建。SP-hIL12p35融合產物係經由連續將編碼經PCR擴增之hIL12p35及α-突觸核蛋白之胺基酸殘基119-140的基因分殖入pVL1393表達載體內來構建。hIL15-SP融合產物係經由連續將編碼經PCR擴增之hIL15及α-突觸核蛋白之胺基酸殘基119-140的基因分殖入pRSETA表達載體內來構建。SP-hIL18融合產物係經由連續將編碼經PCR擴增之hIL8及α-突觸核蛋白之胺基酸殘基119-140的基因分殖入pRSETA表達載體內來構建。透過DNA定序來證實所有構造物之序列。
SP-hIL2融合產物之核酸及胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：1和2中。SP-hIL12p40融合產物之核酸及胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：3和4中。SP-hIL12p35融合產物之核酸及胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：5和6中。如第1圖所示，各載體內包含用於分離及純化由病毒表達之SP-hIL12p40融合產物及SP-hIL12p35融合產物的6X His-標籤序列。hIL15-SP融合產物之核酸及胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：7和8中。此外，hIL18-SP融合產物之核酸及胺基酸序列分別列於9和10中。
製備性實例2：重組SP融合蛋白之表達和純化
將構建來表達重組之SP-hIL2蛋白質的表達載體轉形入大腸桿菌BL21(DE3)RIPL(Invitrogen公司)中並培養之。將培養液在10,000 rpm離心10分鐘以取得細胞小 丸。將細胞小丸重新懸浮在磷酸鹽緩衝液(PBS，pH值7.4)中，然後藉由超音波處理均化。將表達在大腸桿菌中之不溶形式的SP融合蛋白進行再折疊程序，然後使用離子交換樹脂純化之。
將構建之兩個表達重組SP-hIL12蛋白質的表達載體轉染入昆蟲細胞株，sf21細胞中以分別產生病毒培養液。將兩種產生之病毒培養液同時轉染入昆蟲sf21細胞株中以產生異二聚體IL12p70蛋白質(其中該IL12p40與IL12p35結合)，再將其純化。
將經構建以表達重組hIL15-SP蛋白質之表達載體轉染入大腸桿菌BL21(DE3)RIPL(Invitrogen公司)中，再培育之。將培養液在10,000 rpm離心10分鐘以取得細胞小丸。將細胞小丸重新懸浮在PBS(pH值7.4)中，然後藉由超音波處理均化。使用離子交換樹脂將表達在大腸桿菌中之可溶形式的SP融合蛋白純化。
將經構建以表達重組SP-hIL18蛋白的表達載體轉染入大腸桿菌BL21(DE3)RIPL(Invitrogen公司)中，再培養之。將培養液在10,000 rpm離心10分鐘以取得細胞小丸。將細胞小丸重新懸浮在PBS(pH值7.4)中，然後藉由超音波處理均化之。使用離子交換樹脂將表達在大腸桿菌中之可溶形式的SP融合蛋白純化。
使用15% SDS-PAGE將純化之SP融合蛋白(3微克)進行電泳，以確認最終之純化蛋白(第2圖；(a)SP-hIL2蛋白(ATGen，目錄# ATGK04)，(b)IL15-SP蛋 白(ATGen，目錄# ATGK06)，及(c)SP-IL18蛋白(ATGen，目錄# ATGK07))。
實驗性實例1：確認能活化全血中之天然殺手細胞的細胞介素種類
將1毫升來自正常人之全血及1毫升RPMI 1640基質放入24孔細胞培養盤中，與10毫微克/毫升之各重組之人介白素IL-2、IL-12、IL-15及IL-18混合，然後培養24小時。培養24小時後，採取上清液，使用三明治ELISA法測量上清液中之γ-干擾素的量(第3A圖)。結果，正常人之血液樣本中因為由天然殺手細胞分泌之細胞介素的含量很少而未檢測到，但當以至少一種IL-2、IL-12、IL-15及IL-18處理該血液樣本時，血液樣本中由天然殺手細胞所分泌之細胞介素的水準提高。當以單獨之天然殺手細胞刺激因子處理血液樣本時，可見到血液樣本中之γ-干擾素的水準增加，尤其是在經IL-2處理及經IL-12處理之組別中(第3A圖)。
同樣地，將1毫升來自正常人之全血及1毫升RPMI 1640基質放入24孔細胞培養盤中，依第3B圖中所示以重組之人介白素的各種組合(各10毫微克/毫升)處理之，然後培養24小時。培養24小時後，採取上清液，依上述之相同方法測量γ-干擾素的水準。當以天然殺手細胞刺激因子之各種組合處理全血樣本時，可見到γ-干擾素的水準增加，尤其是在IL-2+IL-12之存在下(第3B圖) 。
再者，為了測量以IL-12與IL-15之組合處理後的γ-干擾素之水準，依第3C圖所示之天然殺手細胞刺激因子的濃度處理全血，並培養24小時。培養24小時後，採取上清液，依上述之相同方法測量γ-干擾素的水準。
為了測量以IL-12與IL-18之組合處理後的γ-干擾素之水準，亦依第3D圖所示之天然殺手細胞刺激因子的濃度處理全血，然後培養24小時。培養24小時後，採取上清液，依上述之相同方法測量γ-干擾素的水準。
實驗性實例2：確認從藉由人工方式以IL-2活化後從天然殺手細胞分泌之細胞介素的種類
從61位正常人和50名癌症患者採取全血樣本。將1毫升全血及1毫升RPMI 1640基質放入24孔細胞培養盤中，以10毫微克/毫升之重組之人介白素SP-IL-2處理之，然後培養24小時。培養24小時後，採取上清液，使用三明治ELISA法測量γ-干擾素、TNF-α及MIP-1 β的水準。結果，如第4圖所示，從正常人之全血分泌出的γ-干擾素及TNF-α的量確認高於從癌症患者中分泌出者，但從正常人之全血分泌出的MIP-1 β的量與從癌症患者中分泌出者相當。
在用於疾病測試之體外診斷試劑的情況中可使用各種驗證技術。一般而言，此處使用正常之範圍及截斷分析。該正常範圍為用於測量各樣本組之平均值和標準偏差的參 考範圍，但截斷分析為經由計算體外診斷試劑之估計值來測量臨床敏感度及特異性的方法。臨床敏感度意指當病人患有某種疾病時診斷測試被證明顯示出陽性結果的機率，而臨床特異性意指當病人未患有某種疾病時診斷測試被證明顯示出陰性結果的機率。
假設，當截斷值超過10%及低於10%時，該截斷值分別設定為正值和負值。然後，使用截斷分析測量臨床敏感度及臨床特異性。結果列於表1中。
在癌症患者及正常人之組別中，IFN-γ所測得之敏感度為98.4%，特異性為98%。雖然TNF-α所測得之敏感度為90.9%且特異性為69%，此數值低於IFN-γ之數值，迄今所開發之癌症診斷套組的特異性至高為20%至30%。因此，預計TNF-α具有約70%或更高之特異性，或可能作為癌症診斷套組的標記以測量天然殺手細胞之活性。
實驗性實例3：SP IL-2和IL-2之穩定性的比較
為了比較SP IL-2和IL-2之穩定性，從兩個人採取全血樣本。將各1毫升所取得之全血樣本及1毫升RPMI 1640基質放入24孔細胞培養盤中，然後加入SP IL-2和IL-2，充分混合後培養24小時。培養24小時後，採取上清液，使用三明治ELISA法測量γ-干擾素之水準。結果，從IL-2和SP IL-2活性分析之結果可見到二種蛋白質之活性沒有差異(第5A圖)。然而，當分別在全血培養條件下以SP IL-2而非IL-2處理全血時，可確認天然殺手細胞被SP IL-2活化從而增加γ-干擾素之水準(第5B圖)。這指出該兩種蛋白質之活性無差異，但因為應用SP而使IL-2之穩定性增加。
實驗性實例4：根據模擬天然殺手細胞之條件比較來自正常人及和癌症患者的天然殺手細胞活性
將各1毫升取自20位正常人及48名末期癌症患者(第3及4期)之全血及1毫升RPMI 1640基質放入24孔細胞培養盤中，將各樣本分成兩小組，分別以SP IL-2(10毫微克/毫升)(條件A)及SP IL-2(5毫微克/毫升)+IL-12(5毫微克/毫升)(條件B)處理之，然後培養24小時。培養後，採取上清液，使用三明治ELISA法測量γ-干擾素的水準。
結果，如第6圖所示，在條件A的情況下約90%之正常人具有高γ-干擾素水準，但大多數之癌症患者的γ-干擾素水準低。在條件B之情況下亦可見到正常人具有高γ-干擾素水準，但大多數之癌症患者的γ-干擾素水準低。然而，癌症患者之γ-干擾素水準在條件B之情況下較 在條件A下為高。當單獨以SP IL-2處理該全血液樣本時，僅天然殺手細胞被特異活化(見以下實驗性實例5及第7圖)，但當以SP IL-2和IL-2之組合處理該全血樣本時天然殺手細胞可能與T細胞一起被活化，因此γ-干擾素之水準可能經由活化T細胞而增加。因此，高γ-干擾素水準被認為可能在一些其中仍保留T細胞活性的癌症患者中觀察到。當癌症患者即使以條件B處理時仍具有低γ-干擾素水準時，可以推斷出癌症患者中之天然殺手細胞的抗癌免疫力及全身系統性免疫力下降。這被認為可用來作為測定癌症進展或預後的重要標記。
實驗性實例5：根據血液樣本之類型比較藉由IL2刺激時來自正常人及癌症患者之天然殺手細胞的活性
為了測定根據來自正常人之血液樣本類型，藉由IL2刺激所造成之分泌γ-干擾素的能力差異進行以下實驗。測量(a)天然殺手細胞在1毫微克/毫升來自T細胞之IL-2上時分泌γ-干擾素的能力，(b)天然殺手細胞在1毫微克/毫升來自天然殺手細胞之IL-2上時分泌γ-干擾素的能力，(c)天然殺手細胞在1毫微克/毫升來自全血之IL-2上時分泌γ-干擾素的能力，及(d)天然殺手細胞根據來自PBMC之IL-2濃度分泌γ-干擾素的能力。結果示於第7圖中。依上述之相同方式測量γ-干擾素。結果，由於藉由T細胞中之IL-2活化所分泌之γ-干擾素的量改變，但與未處理組之γ-干擾素並非高度不同，T細胞不適 合作為血液樣本。與未處理組之γ-干擾素的量相比較，在全血、PBMCs及天然殺手細胞中之γ-干擾素的量有顯著差異。因此，全血、PBMCs及天然殺手細胞經評估為適合應用於根據本發明之方法和套組的血液樣本。
實驗性實例6：藉由LPS比較來自正常人之天然殺手細胞的活性
使用另一作為刺激血液樣本中天然殺手細胞從而人為活化天然殺手細胞來產生γ-干擾素的試劑實例LPS測量來自人全血之γ-干擾素的量。如第8圖所示，其透露出50毫微克/毫升之LPS可誘導γ-干擾素分泌，這指出當以非特異性激動劑(諸如LPS)刺激天然殺手細胞時，天然殺手細胞可以人工方式被活化來產生γ-干擾素。
實驗性實例7：藉由與安定肽融合之hIL12及hIL15刺激天然殺手細胞
購買包含抗凝劑肝素鈉之管(BD)來作為培育天然殺手細胞之管，並用來防止凝血。採取5毫升全血，置入含有該抗凝血劑(肝素鈉)之管中。將1毫升取得之全血與RPIM1640混合，並將天然殺手細胞之活化劑，SP-hIL2/hIL12加入其中。將所產生之混合物在37℃下培育16至24小時。根據上述實驗性實例中所描述之方法來測量培育之血液中的γ-干擾素的量來測定與該安定肽融合之SPhIL2及hIL12刺激全血中之天然殺手細胞的情形。
同時，測量根據全血培養條件所分泌之γ-干擾素的量。如第9圖所示，其透露當將天然殺手細胞培育在補充載體蛋白(諸如牛血清白蛋白)之PBS中時，與將天然殺手細胞培育在PBS中相比較，該天然殺手細胞分泌γ-干擾素的能力增加。
實驗性實例8：根據癌症之進展階段的γ-干擾素之分泌差異
為了測定根據癌症之進展階段所分泌的γ-干擾素之量，將從癌症患者1(完全從乳癌康復之病人)、癌症患者2(懷疑罹患腦癌之病人)和正常人取得之全血在補充了100毫微克/毫升IL12及1000毫微克/毫升IL15之RPMI基質中培養24小時，並依上述測量分泌之γ-干擾素之量。此外，將全血以流式細胞儀進行分析。
結果，如第10圖中所示，確認分泌γ-干擾素之能力依序為正常人、癌症患者1及癌症患者2。因此，證實根據癌症之進展階段所分泌之γ-干擾素的量是不同的。從這些事實，可知根據本發明之方法可用於測量血液樣本中由天然殺手細胞所分泌之γ-干擾素的量從而預測癌症之發生和進展階段，或預測癌症的復發。
實驗性實例9：定量經由刺激天然殺手細胞所產生之γ-干擾素
購買包含抗凝劑肝素鈉之管(BD)來作為培育天然殺 手細胞之管，並用來防止凝血。從八個正常人採取5毫升全血並置入含有該抗凝血劑(肝素鈉)之管中。將1毫升所取得之全血與RPIM1640混合，並將與安定肽結合之SP-Hil12/hIL15-SP加入其中。將所產生之混合物在37℃下培育16至24小時。
將在37℃培育之來自八個正常人的全血在1500至2000g離心以取得為上清液之血清。然後，採取150至200微升之血清進行γ-干擾素ELISA。以塗層緩衝液(0.1%碳酸鈉，pH值9.5)將0.05%吐溫(Tween)初級抗體(抗人γ-干擾素單株抗體，ATGen目錄# ATGK02)以1：1000之比率稀釋。將稀釋之初級抗體以100微升/孔之劑量分裝至96孔微量滴定ELISA盤(Nunc Maxisorp；NUNC，內珀維爾，伊利諾卅)上並保存在4℃下16至18小時。然後，移除盤中之溶液並以劑量為400微升/孔之清洗液(含0.05%吐溫20之PBS)清洗該盤。在此情況下，執行清洗三次。然後，以300微升/孔之劑量將含10%胎牛血清(FBS)之PBS分裝並保持在室溫1個小時。然後，移除盤中之溶液並以劑量為400微升/孔之PBST(含0.05%吐溫20之PBS溶液)清洗該盤。在此情況下，執行清洗三次。將塗覆初級抗體之96孔微量滴定ELISA盤密封，並儲存在4℃以供使用。
將γ-干擾素標準溶液(包含200毫微克重組之人γ-干擾素(ATGen，目錄# IFG4001)及0.05% Proclin 300之PBS)稀釋，並以100微升/孔之劑量分裝在塗覆初級 抗體之96孔微量滴定ELISA盤中，並將在實驗階段製備之患者血清以100微升/孔之劑量分裝，然後保存在室溫下2小時。
空白：僅緩衝液，S1-S6：系列稀釋之標準，和UK(未知)：患者血清
2小時後，移除96孔微量滴定ELISA盤中之溶液並以劑量為400微升/孔之清洗液清洗該盤。在此情況下，執行清洗三次。然後，以稀釋液將二級抗體(生物素化之抗人γ-干擾素單株抗體(ATGen目錄# ATGK03))以1：500之比率稀釋，將稀釋之二級抗體以100微升/孔之劑量分裝並保存在室溫下1小時。然後，移除盤中之溶液並以劑量為400微升/孔之清洗液清洗該盤三次。以稀釋液將與HRP共軛結合之鏈黴親和素(streptavidin)溶液(Thermo Scientific，目錄# 21130)以1：3000之比率稀釋，將稀釋之溶液以100微升/孔之劑量分裝並保存在室溫下30分鐘。然後，將稀釋之與HRP共軛結合之鏈黴親和素溶液分裝在ELISA盤中並培育1小時。培育1小時後， 移除96孔微量滴定ELISA盤中之溶液並以劑量為400微升/孔之清洗液清洗該盤三次。
將1毫克四甲基聯苯胺(TMB)溶解於1毫升二甲亞碸(DMSO)中，並以9毫升0.05M磷酸鹽檸檬酸鹽緩衝液稀釋由此產生之混合物以製備受質溶液。然後，將受質溶液以100微升/孔之劑量分裝入盤中，並保持在室溫下30分鐘。
以100微升/孔之劑量將反應終止液(2N稀釋之硫酸溶液)分裝以停止反應，並使用ELISA讀計在450 nm處測量所產生之反應溶液。
使用來自八個正常人之全血所測得之天然殺手細胞分泌γ-干擾素的能力顯示於第11圖中。這些結果指出當以細胞介素刺激全血時，存在於血液中之免疫細胞被有效地活化以誘導分泌γ-干擾素。
此外，以細胞介素刺激來自八個正常人之全血後，將全血在流式細胞儀中進行分析。結果顯示於第12圖中。從這些結果中透露出天然殺手細胞被全血之刺激活化時表現出細胞毒性。CD56為天然殺手細胞之標記，而CD 107a為指示天然殺手細胞分泌細胞毒性顆粒的標記。由於第11圖中γ-干擾素分泌的結果明顯與第12圖中天然殺手細胞造成之毒性結果相關，可知由全血之刺激所造成之天然殺手細胞分泌γ-干擾素的能力間接表現天然殺手細胞之細胞毒性。
根據本發明，癌症之發生或復發可藉由監測，例如罹 患或懷疑罹患癌症之個體體內的免疫系統之變化及測量血液中天然殺手細胞之活性來診斷。因此，本發明可能有用於使用來自個體之血液樣本預測癌症之發生或復發。
雖然本文已揭露示範之體系，應了解其他的變化是可能的。這類變化不被視為悖離本申請案之示範體系的範圍，且熟習本技藝之人士將清楚明白所有這類修改擬包括在下列申請專利之範圍內。
此處列舉之所有文件納為本文之參考。
藉由參考本發明中之圖形，詳細描述其示範體系，本技藝之一般技術人士將更清楚明白本發明之上述及其他目標、特徵和優點，其中：第1圖為顯示與細胞介素(包括hIL2、hIL12、hIL 15及hIL 18)之N端或C端融合的SP肽之融合產物的示意圖。
第2圖為顯示純化之SP融合蛋白的電泳結果之照片。
第3圖顯示在正常人體內人為活化之天然殺手細胞的活性，此係當該天然殺手細胞受單一細胞介素(第3A圖)或組合之細胞介素(第3B-3D圖)刺激時透過分析所產生之γ-干擾素的量取得。
第4圖顯示透過三明治ELISA分析時，人為活化之天然殺手細胞所分泌之細胞介素的圖形。
第5圖顯示SP IL-2與IL-2之間的蛋白質活性(A)和穩定性(B)的比較。
第6圖顯示在分別以SP IL-2(10毫微克/毫升)(條件A)和SP IL-2(5毫微克/毫升)+IL-12(5毫微克/毫升)(條件B)治療之正常人及癌症患者中的天然殺手細胞之活性。
第7圖之圖形顯示天然殺手細胞根據來自T細胞、天然殺手細胞，全血及PBMC之IL-2的刺激而分泌γ-干擾素的能力。
第8圖之圖形顯示藉由LPS刺激，從正常人之天然殺手細胞分泌之γ-干擾素的量之變化。
第9圖之圖形顯示天然殺手細胞根據治療之IL12和IL15濃度及基質之組成物中的差異在分泌γ-干擾素之能力上的變化。
第10圖之圖形顯示根據癌症之進展階段所分泌之γ-干擾素的量之變化。
第11圖顯示使用ELISA盤分析藉由細胞介素刺激正常人之天然殺手細胞產生γ-干擾素的結果。
第12圖顯示來自由細胞介素刺激造成之正常人的全血流式細胞儀分析結果。
<110> AT基因公司(ATGen Co.Ltd.)
<120> 測量天然殺手細胞活性之方法和診斷套組
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<160> 29
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP-hIL2融合編碼序列
<400> 1
<210> 2
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SP-hIL2融合多肽
<400> 2
<210> 3
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP-hIL12p40融合編碼序列
<400> 3
<210> 4
<211> 337
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SP-hIL12p40融合多肽
<400> 4
<210> 5
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP-hIL12p35融合編碼序列
<400> 5
<210> 6
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SP-hIL12p35融合多肽
<400> 6
<210> 7
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL15-SP融合編碼序列
<400> 7
<210> 8
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL15-SP融合多肽
<400> 8
<210> 9
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP-hIL18融合編碼序列
<400> 9
<210> 10
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SP-hIL18融合多肽
<400> 10
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2-22-BamH1前向引物
<400> 11
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2-153-Xho逆向引物
<400> 12
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12-p40-23-BamH1前向引物
<400> 13
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12-p40-328-CT-His逆向引物
<400> 14
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12-p35-23-BamH1前向引物
<400> 15
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12-p35-219-CT-His逆向引物
<400> 16
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15-49-Nde前向引物
<400> 17
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15-162-BamH1逆向引物
<400> 18
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL18-37-BamH1前向引物
<400> 19
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL18-193-EcoR1逆向引物
<400> 20
<210> 21
<211> 140
<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<223> 人α突觸核蛋白
<400> 21
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<223> 人α突觸核蛋白/C端酸性尾結構域 103-115
<400> 22
<210> 23
<211> 23
<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<223> 人α突觸核蛋白/C端酸性尾結構域 114-126
<400> 23
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<223> 人α突觸核蛋白/C端酸性尾結構域 119-140
<400> 24
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<223> 人α突觸核蛋白/C端酸性尾結構域 130-140
<400> 25
<210> 26
<211> 134
<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<223> 人β突觸核蛋白
<400> 26
<210> 27
<211> 50
<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<223> 人β突觸核蛋白/C端酸性尾結構域 85-134
<400> 27
<210> 28
<211> 127
<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<223> 人γ突觸核蛋白(synoretin)
<400> 28
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<223> 人γ突觸核蛋白(synoretin)/C端酸性尾結構域 殘基96-127
<400> 29

Claims (22)

  1. 一種測量天然殺手(NK)細胞活性之方法，其包含：經由培育全血液樣本與包含至少一種刺激性細胞介素之試劑以刺激該全血液樣本中天然殺手細胞，從而人為活化該天然殺手細胞以產生並分泌天然殺手細胞分泌之細胞介素，該至少一種刺激性細胞介素係選自下列群組：介白素2、介白素15及介白素18；及測量分泌至該全血液樣本中該天然殺手細胞分泌之細胞介素的量並使用該量作為測量值以評估天然殺手細胞活性；其中該天然殺手細胞分泌之細胞介素包含γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或該二者。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中實施對天然殺手細胞之刺激係經由培育該全血液樣本與介白素2。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中實施對天然殺手細胞之刺激係經由培育該全血液樣本與介白素2及介白素12。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中實施對天然殺手細胞之刺激係經由培育該全血液樣本與介白素12及介白素15。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中實施對天然殺手細胞之刺激係經由培育該全血液樣本與介白素15。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該天然殺手細胞分泌之細胞介素進一步包含巨噬細胞發炎性蛋白-1 β(MIP-1 β)。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該天然殺手細胞分泌之細胞介素為γ-干擾素(IFN-γ)。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該天然殺手細胞分泌之細胞介素為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。
  9. 如申請專利範圍第6項之方法，其中巨噬細胞發炎性蛋白-1 β(MIP-1 β)係用於作為與正常人之天然殺手細胞活化相比較之天然殺手細胞活化的對照組。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中測量天然殺手細胞分泌之細胞介素的量係藉由免疫分析進行。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該免疫分析係酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一種刺激性細胞介素係呈與安定肽之融合蛋白的形式。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該安定肽為突觸核蛋白(synuclein)家族之C端酸性尾結構域肽。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該安定肽包含α-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基103-115(SEQ ID NO：22)、胺基酸殘基114-126(SEQ ID NO：23)、胺基酸殘基119-140(SEQ ID NO：24)或胺基酸殘基130-140(SEQ ID NO：25)、β-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基85-134(SEQ ID NO：27)、γ-突觸核蛋白之C端酸性尾結構域的胺基酸殘基96-127(SEQ ID NO：29)或γ-突觸核蛋白之胺基酸殘基1-127(SEQ ID NO：28)。
  15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該刺激全血液樣本中天然殺手細胞從而人為活化該天然殺手細胞以產生並分泌天然殺手細胞分泌之細胞介素的步驟係在含有載體蛋白之基質(冷凍乾燥的或液態的)中進行。
  16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一種刺激性細胞介素係呈與安定肽之融合蛋白的形式，其中該融合蛋白包含與SEQ ID NO：2、8或10之胺基酸序列具有至少80%同一性、至少90%同一性或至少95%同一性之胺基酸序列或係由SEQ ID NO：2、8或10之胺基酸序列構成。
  17. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法係用於偵測癌症之發生或復發，其中與正常個體內該天然殺手細胞分泌之細胞介素的量相比較，個體內該天然殺手細胞分泌之細胞介素的量之減少為癌症發生或復發之指標。
  18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該測量天然殺手細胞活性包含比較所測量的分泌至該全血液樣本中該天然殺手細胞分泌之細胞介素的量與正常人分泌之細胞介素的量。
  19. 如申請專利範圍第1項之方法，其中監測天然殺手細胞活性之變化。
  20. 如申請專利範圍第1項之方法，其中實施對天然殺手細胞之刺激係經由培育該全血液樣本與介白素2或介白素2與安定肽之呈融合蛋白的形式。
  21. 如申請專利範圍第1項之方法，其中實施對天然殺手細胞之刺激係經由培育該全血液樣本與介白素15或介白素15與安定肽之呈融合蛋白的形式。
  22. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該天然殺手細胞分泌之細胞介素為γ-干擾素(IFN-γ)。
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