CN103370622B - 用于测量nk细胞活性的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种诊断癌症的方法，用于测量NK细胞活性的诊断试剂盒和组合物。癌症的发生可以通过以下方式诊断：通过测量血液中的NK细胞活性来监视体内免疫系统的变化。因此，如本文所述使用来自受试者的血液样品可以容易地预测癌症的发生。

Description

用于测量NK细胞活性的方法和试剂盒
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年2月14日提交的韩国专利申请No.2011-0012983的优先权和利益，所述申请的内容通过引用完整地结合于此。
背景
1.发明领域
本发明涉及使用NK细胞活性的测量值的诊断癌症的方法和诊断试剂盒。
2.相关技术的讨论
已知，天然杀伤(NK)细胞参与先天免疫以除去病原体和癌细胞，并且分泌干扰素-γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)和其他分子以介导适应性免疫。当NK细胞遭遇其他细胞时，NK细胞具有这样的机制，其中当MHC类别1如在癌细胞中那样未出现时，或者当MHC类别的形状如在病毒感染的细胞中那样异常时，它们的主要组织相容性复合体(MHC)将信号发送到NK细胞中以通过它们的分子作用攻击这些异常细胞。然而，因为已经报道NK细胞在多种癌症中具有功能和分化能力的缺陷，所以NK细胞活性与癌细胞的存活密切相关。因此，正进行广泛研究以增加NK细胞的数目或者活性以用于癌症免疫疗法。
同时，诊断癌症的方法主要包括从使用计算层析X射线照相术(CT)、磁共振成像(MRI)或者X射线获得的图形图像发现癌症的存在。然而，因为这些检验通常仅在患者由于疼痛或者不适而强烈需要进行所述检验时进行，并且仅在某些组织中进行，所以癌症的出现可能被忽略。已经发展出了一种使用血液检测来确定癌症风险的方法，但是其作为诊断癌症的方法的应用是有限的。这是因为：由于该方法是使用血液肿瘤标记物(例如前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌或肝癌的标记物)进行的，所以当病因存在于相应器官而不是癌症中时，患者可能表现为对癌症是阳性的。也已经有尝试使用抗体来诊断癌症，但是这样的尝试限于特定类型的癌症。
因此，继续需要用于诊断不同类型癌症的新方法。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供可以用于诊断和评估癌症的方法，以及可用于该方法的试剂盒和试剂。
作为本发明的一个方面，提供测量NK细胞活性的方法，所述方法包括：刺激血液样品中的NK细胞由此人工地激活NK细胞从而产生NK细胞分泌的细胞因子，和测量血液样品中NK细胞分泌的细胞因子的量。
在某些非限制性实施方案中，血液样品可以是全血、外周血单核细胞(PBMC)或者NK细胞的样品。
在另外的实施方案中，刺激NK细胞可以通过将血液样品与至少一种包括白介素2、白介素12、白介素15和白介素18或其组合在内的刺激细胞因子温育，或者通过将血液样品与脂多糖类(LPSs)或者聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)温育来进行。
在某些实施方案中，NK细胞分泌的细胞因子可以包括干扰素-γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或者巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)。
在所述方法的另外的非限制性实施方案中，巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)可以被用作用于将NK细胞的激活与正常人的NK细胞的激活相比较的对照组。
此外，在某些实施方案中，该方法可以使用至少一种与稳定性肽融合的刺激细胞因子来进行。例如，但不希望是限制性的，稳定性肽可以是突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽。在这样的实施方案中，稳定性肽可以包含α-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基103-115(SEQ ID NO:22)，氨基酸残基114-126(SEQ ID NO:23)，氨基酸残基119-140(SEQ ID NO:24)或者氨基酸残基130-140(SEQ ID NO:25)，β-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基85-134(SEQ ID NO:27)，γ-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127(SEQ ID NO:29)，或者synoretin的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127(SEQ ID NO:29)。
在另外的实施方案中，刺激血液样品中的NK细胞由此人工地激活NK细胞从而产生NK细胞分泌的细胞因子的步骤在含有载体蛋白、例如血清清蛋白的培养基中进行。
所述方法尤其可用于检测癌症的发生或者复发。在这样的实施方案中，与正常个体中的水平相比，受试者中NK细胞分泌的细胞因子量的减少指示癌症的发生或复发。
作为本发明的另一个方面，提供用于测量NK细胞活性的试剂盒。该试剂盒将包含用于刺激血液样品中的NK细胞由此人工地激活NK细胞从而产生NK细胞分泌的细胞因子的试剂。此外，该试剂盒可以用于进行如上所述的方法，包括用于检测癌症的发生或者复发。
在所述试剂盒的另外的非限制性实施方案中，NK细胞分泌的细胞因子可以是干扰素-γ(IFN-γ)或者肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
在另外的实施方案中，用于刺激血液样品中的NK细胞和人工地激活NK细胞从而产生NK细胞分泌的细胞因子的试剂可以包括至少一种刺激细胞因子，LPS或者聚I:C，所述至少一种刺激细胞因子包括白介素2、白介素12、白介素15和白介素18中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述试剂盒还可以包括以下一种或多种：抗INF-γ抗体，抗TNF-α抗体，和抗MIP-1β抗体。不希望受到任何限制，所述试剂盒还可以进一步包括用于将受试者中的NK细胞分泌的细胞因子的量与正常个体中的水平比较的使用说明，其中受试者中NK细胞分泌的细胞因子的水平的降低指示癌症的发生或复发。
作为本发明的另一个方面，提供融合蛋白，所述融合蛋白包含与突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽连接的细胞因子，所述细胞因子是白介素2、白介素12、白介素15或白介素18。
在所述融合蛋白的某些非限制性实施方案中，突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽可以包括α-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基103-115(SEQ ID NO:22)，氨基酸残基114-126(SEQ ID NO:23)，氨基酸残基119-140(SEQ ID NO:24)或者氨基酸残基130-140(SEQ ID NO:25)，β-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基85-134(SEQ ID NO:27)，γ-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127(SEQ ID NO:29)，或者synoretin的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127(SEQ ID NO:29)。
还提供包含上述融合蛋白的组合物。
此外，本文中还提供包含上述融合蛋白或者上述组合物的癌症诊断试剂盒。
在某些非限制性实施方案中，如上所述的癌症诊断试剂盒还可以包括以下的至少一种抗体：抗INF-γ抗体，抗TNF-α抗体和抗MIP-1β抗体。
本文中还提供这样的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。不希望受到限制，所述多肽可以具有更高的百分比同一性，包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的序列具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
还提供编码上述融合蛋白和多肽的寡核苷酸。例如，提供这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9或它们的互补序列具有至少80％同一性的核酸序列。这样的寡核苷酸可以，不受限制地，具有更高的百分比同一性，包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQID NO:9或它们的互补序列具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
还提供包含上述寡核苷酸的载体，以及包含这样的载体或寡核苷酸的宿主细胞。
附图简述
通过参照附图详细描述本发明的示例性实施方案，本发明的以上及其他目的、特征和优势对本领域普通技术人员来说将变得更加明显，其中：
图1是示意图，其显示与包括hIL2，hIL12，hIL15和hIL18在内的细胞因子的N末端或者C末端融合的SP肽的融合产物。
图2是照片，其显示纯化的SP融合蛋白的电泳结果。
图3通过分析当NK细胞被单个细胞因子(图3A)或组合的细胞因子(图3B-3D)刺激时产生的干扰素-γ的量，显示在正常人中被人工激活的NK细胞活性。
图4是这样的图，其通过夹心ELISA显示由人工激活的NK细胞分泌的细胞因子。
图5显示SP IL-2和IL-2间蛋白质活性(A)和稳定性(B)的比较。
图6显示NK细胞在分别用SP IL-2(10ng/ml)(条件A)，和SP IL-2(5ng/ml)+IL-12(5ng/ml)(条件B)处理的正常人和癌症患者中的活性。
图7是这样的图，其显示根据IL2的刺激，在T细胞、NK细胞、全血和PBMC中NK细胞分泌干扰素-γ的能力。
图8是这样的图，其显示当被LPS刺激时由正常人的NK细胞分泌的干扰素-γ的量的变化。
图9是这样的图，其显示根据处理的IL12和IL15的浓度以及培养基组分的差异，NK细胞分泌干扰素-γ的能力的变化。
图10是这样的图，其显示根据癌症的发展阶段分泌的干扰素-γ的量的变化。
图11显示使用ELISA平板分析由被细胞因子刺激的正常人的NK细胞产生的干扰素-γ的结果。
图12显示来自被细胞因子刺激的正常人的全血的流式细胞术结果。详述
本发明涉及利用癌症和NK细胞的相互关系用于诊断癌症的发生的方法、试剂盒和试剂。
为此目的，提供测量NK细胞活性的方法，所述方法包括刺激血液样品中的NK细胞由此人工地激活NK细胞从而产生NK细胞分泌的细胞因子，并且测量在血液样品中NK细胞分泌的细胞因子的量。
本发明的发明人发现，基于NK细胞活性在癌症患者中降低的观察，癌症的发生可以首先通过测量NK细胞活性来筛查。本文所述的方法能够通过给予NK细胞人工刺激，并且通过检测存在于血液样品中的NK细胞分泌的细胞因子的量的变化测量NK细胞的激活水平来测定NK细胞的功能是否正常，所述方法不同于简单测量NK细胞数目或原本存在于血液样品中的细胞因子的量的其他方法。例如，在测量NK细胞的激活水平的常规方法中，51Cr释放测定已经被用作测量靶标特异性细胞毒性的方法。然而，当以此方式测量NK细胞活性时，应当使用放射性同位素，并且测量和分析是困难、复杂和高成本的。因此，该测定不适于用于可以简单地诊断癌症的发生的初步癌症筛查/检验方法。另一方面，根据本发明，因为可以通过刺激NK细胞以产生NK细胞分泌的细胞因子并且量化产生的NK细胞分泌的细胞因子来测量NK细胞活性，所以其中NK细胞活性降低的受试者可以被方便的筛查出作为罹患癌症的受试者或者处于罹患癌症的风险中的受试者。
根据本发明，血液样品可以包括，但不限于，全血、外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞，所述样品取自受试者。可以完整的使用PBMC或者NK细胞以代替全血，但是在某些实施方案中，由于方法更简单并且花费更少，所以使用全血可以是有利的。
同时，在本发明中，术语“受试者”是指被怀疑患有癌症或具有癌症复发或者希望确定癌症的发生或复发的哺乳动物。
存在于血液样品中的NK细胞通常以非激活状态存在。根据本发明，至少一种细胞因子，脂多糖类(LPS)或者聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)可以被用作用来刺激这样的在血液样品中的NK细胞并且人工激活NK细胞以产生NK细胞分泌的细胞因子的试剂，其在本文中也被称为激动剂或者激活剂。在本文中，用于激活NK细胞的细胞因子可以是白介素2、白介素12、白介素15和白介素18或其组合。本领域中广泛已知的是，白介素2、白介素12、白介素15、白介素18、LPS或聚I:C被刺激从而产生NK细胞分泌的细胞因子。因此，根据本发明的一个示例性实施方案，刺激NK细胞可以通过以下方式进行：将血液样品与至少一种包括白介素2、白介素12、白介素15和/或白介素18在内的细胞因子温育，或者将血液样品与LPS或者聚I:C温育。
在一个非限制性实施方案中，刺激NK细胞可以通过将血液样品与白介素2温育来进行。白介素2是一种由T细胞分泌的细胞因子，并且已知为与在体内适应性免疫反应中通过T细胞的NK细胞的激活相关。并且，白介素2是通常广泛用于在体外激活NK细胞的细胞因子。因此，刺激NK细胞可以通过将血液样品与白介素2温育来进行。
在另一个非限制性实施方案中，刺激NK细胞可以通过将血液样品与白介素2和白介素12温育来进行。在处于早期的癌症患者的情况中，虽然NK细胞的活性是低的，但是T细胞的活性可以是高的。相反，在处于晚期的癌症患者的情况中，T细胞以及NK细胞的活性可以是低的。白介素12参与激活T细胞和NK细胞。因此，如果用白介素12和白介素2进行处理，则由于刺激T细胞而分泌的细胞因子与由NK细胞分泌的细胞因子加在一起。因此，可能的是，评估NK细胞的免疫以及抗癌免疫的总水平，并且使用该水平作为表示癌症进程或癌症治疗的预后的程度的标记物。白介素15和白介素18是由激活的树突细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子，并且在体外天然免疫反应期间诱导NK细胞的激活和生长。特别地，当白介素12与白介素15或白介素18组合时，相对少量的白介素12可以用于刺激NK细胞中NK细胞分泌的细胞因子的分泌。因此，刺激NK细胞可以通过将血液样品与白介素12和白介素15，或白介素12和白介素18温育来有效地进行。
根据本发明，NK细胞分泌的细胞因子的数值被用作评估NK细胞活性的量度。在本发明中，“NK细胞分泌的细胞因子”是指由NK细胞分泌的细胞因子，尤其是来自由人工刺激激活的NK细胞的细胞因子。在一个实施方案中，NK细胞分泌的细胞因子是选自干扰素-γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)的组的至少一种细胞因子。干扰素-γ由NK细胞、树突细胞、Tc细胞、Th1细胞等分泌，并且已知是在用于控制癌症的天然免疫和适应性免疫中发挥重要作用的细胞因子。并且，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)杀死癌细胞并且进一步参与杀死外部入侵者如细菌，诱导T细胞的激活，并且充当用于从B细胞生产抗体的辅因子。因此，例如，当干扰素-γ或者肿瘤坏死因子-α的数值小于正常人的干扰素-γ或者肿瘤坏死因子-α的数值时，这指示用于控制癌症的NK细胞活性出现了问题。因此，可能的是，通过比较由人工激活的NK细胞分泌的干扰素-γ或者肿瘤坏死因子-α的量和来自正常人的干扰素-γ或者肿瘤坏死因子-α的量来确定NK细胞活性。
同时，巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)可以被用作用于比较NK细胞的激活的对照组。如在以下实施例中所示，巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)的数值在正常人和癌症患者中都相似地高。因此，巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)可以被用于分析NK细胞在正常人和癌症患者中的活性，或者可以被用作使用癌症诊断试剂盒的分析的对照组。
NK细胞分泌的细胞因子的量化可以通过本领域中已知的任何方法进行，但是本发明不限于此。例如，干扰素-γ的量化可以使用干扰素-γ酶联免疫吸附测定(干扰素-γELISA)进行。
同时，被用作用来刺激血液样品中的NK细胞和人工激活NK细胞以产生NK细胞分泌的细胞因子的试剂的包括白介素2、白介素12、白介素15或白介素18在内的至少一种细胞因子，可以是与稳定性肽的融合蛋白的形式。
与野生型的白介素2、白介素12、白介素15或白介素18的生物学活性和存储稳定性相比，与稳定性肽(stabilizing peptide)的融合蛋白的形式的白介素2、白介素12、白介素15或白介素18可以提供相似的生物学活性和高的存储稳定性。例如，当细胞因子连接到这样的稳定性肽时，细胞因子具有先天的活性，同时保持稳定性而不管环境如何变化(如冷冻干燥)。
稳定性肽可以连接到白介素2、白介素12、白介素15或白介素18的N末端或C末端，并且这样的融合蛋白的制备可以使用已知的制备融合蛋白的方法进行。
根据一个示例性实施方案，突触核蛋白家族的C端酸性尾部(α-突触核蛋白的酸性尾部氨基酸序列，ATS)结构域肽可以被用作可以连接到白介素2、白介素12、白介素15或白介素18的稳定性肽，但是本发明不限于此。韩国登记专利No.10-0506766公开了ATS肽给融合伙伴蛋白赋予抵抗环境胁迫(stress)的抗性。
根据一个示例性实施方案，本文中可以使用的稳定性肽包括选自以下的稳定性肽：α-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基103-115，氨基酸残基114-126，氨基酸残基119-140和氨基酸残基130-140，β-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基85-134，γ-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127，和synoretin的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127。在本发明中，ATS肽的氨基酸序列，ATS肽和制备包含其的融合蛋白的方法可以使用在韩国登记专利No.10-0506766中公开的方法进行。参照以下实施例，被证明的是，与ATS肽融合的白介素2、白介素12、白介素15或白介素18是高度稳定的，并且当所述细胞因子被T淋巴细胞激活时，表现出与野生型相似的活性。
在一个实施方案中，刺激血液样品中的NK细胞由此人工地激活NK细胞从而产生NK细胞分泌的细胞因子的步骤可以在含有载体蛋白的培养基中进行。载体蛋白的作用是稳定细胞因子如白介素2、白介素12、白介素15或白介素18，所述细胞因子被用作用于刺激血液样品中的NK细胞和人工地激活NK细胞从而产生NK细胞分泌的细胞因子，并且由此诱导NK细胞产生更多的NK细胞分泌的细胞因子的试剂。在某些实施方案中，载体蛋白可以是牛血清清蛋白或者人血清清蛋白，但不限于此。
同时，测量NK细胞活性的方法可以用于筛查癌症的发生或复发。
NK细胞活性可以通过以下方式测量：比较由人工激活的NK细胞分泌的NK细胞分泌的细胞因子的量和来自正常人的NK细胞分泌的细胞因子的量。在此情况中，当NK细胞分泌的细胞因子的量小于正常人的NK细胞分泌的细胞因子的量时，认为NK细胞活性下降。因此，可能的是，估计癌症或癌症复发的风险。当与正常人相比NK细胞活性下降时，受试者可以首先被归类为疑似患有癌症的患者或者具有癌症复发的患者。同样，癌症的发生或复发可以通过另外的诊断方法如用于通常进行癌症诊断的CT、MRI或正电子发射断层扫描(PET)以及通过最终的组织检验来诊断。虽然根据本发明的方法不是确定地诊断癌症的方法，但是该方法的优点在于：可以使用血液初步筛查出癌症的发生或复发。
此外，本发明提供用于测量NK细胞活性的试剂盒，所述试剂盒包括试剂，如用来刺激血液样品中的NK细胞和人工激活NK细胞以产生NK细胞分泌的细胞因子的激动剂或者激活剂。这样的用于测量NK细胞活性的试剂盒可以用于容易地进行上述测量NK细胞活性的方法。
在用于测量NK细胞活性的试剂盒中，用来刺激NK细胞和人工激活NK细胞以产生NK细胞分泌的细胞因子的试剂可以是至少一种细胞因子、LPS或聚I:C，并且细胞因子可以选择由以下组成的组：白介素2、白介素12、白介素15和白介素18。
除了用来刺激NK细胞和人工激活NK细胞以产生NK细胞分泌的细胞因子如干扰素-γ的试剂以外，这样的癌症诊断试剂盒可以包括额外的用于测量NK细胞活性的组分，例如用于量化NK细胞分泌的细胞因子的抗体，以及底物。在一个实施方案中，本发明的试剂盒还包括选自抗INF-γ抗体，抗TNF-α抗体和抗MIP-1β抗体的组的至少一种抗体。
根据本发明的试剂盒中的抗体可以被固定到固体基质上。可以使用如在文献中所述的多种方法来固定所述抗体(Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，Harlow&Lane；Cold Spring Harbor，1988)。合适的固体基质可以包括细胞培养板，ELISA平板，试管和聚合膜。此外，固体基质包括棒(bar)，合成玻璃，琼脂糖小珠，杯，扁平外壳或被固体支持物支撑或附着于固体支持物的其他膜或涂层。
此外，根据本发明的试剂盒可以包括用于利用选择性识别NK细胞分泌的细胞因子如干扰素-γ的抗体的免疫学分析的试剂。免疫学分析可以包括可以测量抗原与根据本发明的抗体结合的所有方法。这样的方法是本领域中已知的，并且包括，例如，免疫细胞化学和免疫组织化学、放射线免疫测定、ELISA、免疫印迹、Farr测定、沉淀素反应、比浊法、免疫扩散、对流电解、单成分辐射免疫扩散和免疫荧光。
用于免疫学分析的试剂包括合适的载体、能够产生可检测信号的标记、溶解剂和去垢剂。此外，当标记材料是酶时，试剂可以包括可以测量酶活性的底物，和反应终止剂。合适的载体可以包括，但不限于，可溶性载体，例如本领域中已知的生理用缓冲剂中的一种(例如，PBS)，或不可溶的载体，例如聚合物如通过将金属包被在聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、可交联右旋糖酐、多糖和乳胶上获得的磁性颗粒，以及其他纸张、玻璃、金属、琼脂糖，及它们的组合。
作为可以产生可检测信号的标记，可以使用酶、荧光材料、发光材料和放射线材料。作为酶，可以使用过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、转化酶等，并且异硫氰酸荧光素或者藻胆蛋白可以被用作荧光材料，isolucinol或者光泽精可以用作发光材料，而I131、C14或者H3可以用作放射性材料。然而，除了示例性材料以外，可以用于免疫学分析的任何材料都可以在此处使用。
此外，本发明提供融合蛋白，所述融合蛋白包含与突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽连接的细胞因子。此处，细胞因子可以是白介素2、白介素12、白介素15或白介素18。如上所述，这样的融合蛋白可以用作用来刺激NK细胞和人工激活NK细胞以产生NK细胞分泌的细胞因子的试剂，并且与野生型白介素2、白介素12、白介素15或白介素18相比，提供更高的稳定性，而不管环境如何变化如冻干或长期储存。
根据一个示例性实施方案中，融合蛋白可以是这样的融合蛋白，其中白介素2连接到突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽。
根据另一个示例性实施方案中，融合蛋白可以是这样的融合蛋白，其中白介素12连接到突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽。
根据另一个示例性实施方案中，融合蛋白可以是这样的融合蛋白，其中白介素15连接到突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽。
根据另一个示例性实施方案中，融合蛋白可以是这样的融合蛋白，其中白介素18连接到突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽。
在融合蛋白中，突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽也可以选自：α-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基103-115，氨基酸残基114-126，氨基酸残基119-140和氨基酸残基130-140，β-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基85-134，γ-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127，和synoretin的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127。
此外，本发明提供融合蛋白在激活NK细胞中的用途。如上所述，这样的融合蛋白可以用于激活血液中的NK细胞从而促进NK细胞分泌的细胞因子的分泌。
因此，本发明提供用于激活NK细胞的组合物。此处，组合物包含选自由以下组成的组的至少一种融合蛋白：与突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽连接的白介素2，与突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽连接的白介素12，与突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽连接的白介素15，和与突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽连接的白介素18。
根据一个示例性实施方案，突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽可以选自α-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基103-115，氨基酸残基114-126，氨基酸残基119-140和氨基酸残基130-140，β-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基85-134，γ-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127，和synoretin的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127。
同时，除了与稳定性肽融合的细胞因子以外，用于激活NK细胞的组合物可以包括能够保存和储存融合蛋白的缓冲剂。
此外，本发明提供癌症诊断试剂盒，其包含选自由以下组成的组的至少一种融合蛋白：与突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽连接的白介素2，与突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽连接的白介素12，与突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽连接的白介素15，和与突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽连接的白介素18。如上所述，当取自受试者的血液样品与融合蛋白温育时，血液样品中的NK细胞被激活。因此，可以通过量化由NK细胞的激活产生的干扰素-γ来测量受试者中的NK细胞活性，由此通过将具有比正常人的NK细胞活性低的NK细胞活性的受试者归类为处于罹患癌症的风险下或具有癌症复发的患者，初步诊断癌症。
根据一个示例性实施方案，突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽可以选自α-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基103-115，氨基酸残基114-126，氨基酸残基119-140和氨基酸残基130-140，β-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基85-134，γ-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127，和synoretin的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127。
除了融合蛋白以外，这样的癌症诊断试剂盒可以包括用于进行根据本发明的诊断方法的额外的组分，例如用于量化NK细胞分泌的细胞因子的抗体，和底物。这些组分已经在上文中连同用于测量NK细胞活性的试剂盒一起被描述。在上述方法中使用这些组分的使用说明也可以被包含在试剂盒中。
要理解，在以下实施例中，将更全面的描述本发明的优选实施方案的这些和其他特征、方面和优点。还要理解，仅为说明目的而提供这些实施例，而不意在限制本发明的范围。本领域技术人员将理解，可以在不背离如所要求保护的本发明的范围的情况下制备其他等同物和进行其他修改。
实施例
制备实施例1:构建具有稳定性肽-IL融合蛋白的表达载体
为了制备与稳定性肽融合的IL-2、IL-12、IL-15或IL-18，构建表达载体。含有α-突触核蛋白的氨基酸残基119-140(SEQ ID NO:24；下文中被称为“SP”)的肽被用作稳定性肽。通过使用总RNA提取试剂盒(Invitron Biotechnology)从人淋巴细胞分离总RNA和使用反转录酶(Invitrogen)反转录总RNA来获得IL2，IL12p35，IL12p40，IL15和IL-18的cDNA。所得的cDNA被用作模板，并且利用PCR使用以下特异于各个cDNA基因的引物进行扩增：
IL2-22-BamH1-F：ACAGGATCCCCTACTTCAAGTTCT (SEQ ID NO:11)
IL2-153-Xho-R：CACTCTCGAGTCAAGTCAGTGTTGAGAT (SEQ ID NO:12)
IL12-p40-23-BamH:GTGGATCCATATGGGAACTGAAGAAAGATG (SEQ ID NO:13)
IL12-p40-328-CT-His:ATGGTGATGATGACTGCAGGGCACAGATGCCC (SEQ ID NO：14)
IL12-p35-23-BamH:GTGGATCCAGAAACCTCCCCGTGGC (SEQ ID NO:15)
IL12-p35-219-CT-His:ATGGTGATGATGGGAAGCATTCAGATAGC (SEQ ID NO:16)
IL15-49-Nde:GAGTCAAGCATATGAACTGGGTGAATGTAA (SEQ ID NO:17)
IL15-162-BamH-R:GTGGATCCAGAAGTGTTGATGAAC (SEQ ID NO:18)
IL18-37-BamH:GTGGATCCTACTTTGGCAAGCTTG (SEQ ID NO:19)
IL18-193-EcoR1:AGACTGGAATTCCTAGTCTTCGTTTTG (SEQ ID NO：20).
图1是示意图，其显示SP与包括IL2，IL12p35，IL12p40，IL15和IL-18在内的所示细胞因子的融合产物的构建体。如在图中所示，通过相继将编码PCR扩增的hIL2和α-突触核蛋白的氨基酸残基119-140的基因亚克隆到pRSETA表达载体中来构建SP-hIL2融合产物。通过相继将编码PCR扩增的hIL12p40和α-突触核蛋白的氨基酸残基119-140的基因亚克隆到pVL1393表达载体中来构建SP-hIL12p40融合产物。通过相继将编码PCR扩增的hIL12p35和α-突触核蛋白的氨基酸残基119-140的基因亚克隆到pVL1393表达载体中来构建SP-hIL12p35融合产物。通过相继将编码PCR扩增的hIL15和α-突触核蛋白的氨基酸残基119-140的基因亚克隆到pRSETA表达载体中来构建hIL15-SP融合产物。通过相继将编码PCR扩增的hIL18和α-突触核蛋白的氨基酸残基119-140的基因亚克隆到pRSETA表达载体中来构建SP-hIL18融合产物。所有构建体的序列都通过DNA测序确认。
SP-hIL2融合产物的核酸和氨基酸序列分别如在SEQ ID NOS:1和2中所示。SP-hIL12p40融合产物的核酸和氨基酸序列分别如在SEQ ID NOS:3和4中所示。SP-hIL12p35融合产物的核酸和氨基酸序列分别如在SEQ ID NOS:5和6中所示。如在图1中所示，6X His-标签序列被包含在各个载体中用于由病毒表达的SP-hIL12p40融合产物和SP-hIL12p35融合产物的分离和纯化。hIL15-SP融合产物的核酸和氨基酸序列分别如在SEQ ID NOS:7和8中所示。此外，SP-hIL18融合产物的核酸和氨基酸序列分别如在SEQ ID NOS:9和10中所示。
制备实施例2:重组SP融合蛋白的表达和纯化
将构建的用于表达重组SP-hIL2蛋白的表达载体转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)RIPL(Invitrogen)中，并进行温育。将培养物溶液在10,000rpm离心10分钟从而获得细胞沉淀。将细胞沉淀重悬在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中，并且然后通过超声处理均质化。对在大肠杆菌(E.coli)中以不可溶形式表达的SP融合蛋白进行重折叠过程，并且然后使用离子交换树脂进行纯化。
将构建的用以表达重组SP-hIL12蛋白的两个表达载体分别转染到昆虫细胞系sf21细胞中以制备病毒培养物溶液。将所得的两种病毒培养物溶液同时转染到昆虫sf21细胞系中以制备其中IL12p40连接到IL12p35的异源二聚体IL12p70蛋白，然后对其进行纯化。
将构建的用以表达重组hIL15-SP蛋白的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)RIPL(Invitrogen)中，并且然后温育。将培养物溶液以10,000rpm离心10分钟以获得细胞沉淀。将细胞沉淀重悬在PBS(pH 7.4)中，并且然后通过超声处理均质化。使用离子交换树脂对在大肠杆菌中以可溶形式表达的SP融合蛋白进行纯化。
将构建的用以表达重组SP-hIL18蛋白的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)RIPL(Invitrogen)中，并且然后温育。将培养物溶液以10,000rpm离心10分钟以获得细胞沉淀。将细胞沉淀重悬在PBS(pH 7.4)中，并且然后通过超声处理均质化。使用离子交换树脂对在大肠杆菌中以可溶形式表达的SP融合蛋白进行纯化。
使用15％SDS-PAGE对纯化的SP融合蛋白(3ug)进行电泳以确认最终纯化的蛋白(图2；(a)SP-hIL2蛋白(ATGen，货号ATGK04)，(b)IL15-SP蛋白(ATGen，货号ATGK06)，和(c)SP-IL18蛋白(ATGen，货号ATGK07))。
实验例1：确认全血中能够激活NK细胞的细胞因子的种类
将1ml来自正常人的全血和1ml的RPMI1640培养基放入24孔细胞培养平板中，与各10ng/ml的重组人白介素IL-2，IL-12，IL-15和IL-18混合，并且然后培养24小时。在24小时培养后，取上清，并且使用夹心ELISA法测量上清中干扰素-γ的量(图3A)。结果，由于其痕量而未在正常人的血液样品中检测到由NK细胞分泌的细胞因子，但是当血液样品用IL-2，IL-12，IL-15和IL-18中的至少一种处理时，在血液样品中由NK细胞分泌的细胞因子的水平提高。当血液样品用NK细胞刺激剂单独处理时，观察到血液样品中干扰素-γ的水平提高，尤其在IL-2处理组和IL-12处理组中(图3A)。
同样，将1ml的来自正常人的全血和1ml的RPMI1640培养基放入24孔细胞培养平板中，用重组人白介素的不同组合进行处理，如在图3B中所示(各10ng/ml)，并且培养24小时。在24小时的培养后，取上清，以与如上所述相同的方式测量干扰素-γ的水平。当全血用NK细胞刺激剂的不同组合处理时，观察到的是，干扰素-γ的水平升高，尤其在IL-2+IL-12的存在下(图3B)。
此外，为了测量用IL-12和IL-15的组合处理后的干扰素-γ的水平，用一定浓度的NK细胞刺激剂处理全血，如在图3C中所示，并且培养24小时。在24小时的培养后，取上清，并且以与如上所述相同的方式测量干扰素-γ的水平。
为了测量用IL-12和IL-18的组合处理后的干扰素-γ的水平，同样用一定浓度的NK细胞刺激剂处理全血，如在图3D中所示，并且然后培养24小时。在24小时的培养后，取上清，并且以与如上所述相同的方式测量干扰素-γ的水平。
实验例2：确认由利用IL-2人工激活的NK细胞分泌的细胞因子的类型
全血样品取自61个正常人和50个癌症患者。将1ml的全血和1ml的RPMI1640培养基放入24孔细胞培养平板中，用10ng/ml的重组人白介素SP IL-2处理，并且然后培养24小时。在24小时的培养后，取上清，并且然后使用夹心ELISA法测量干扰素-γ、TNF-α和MIP-1β的水平。结果，确认的是，由正常人的全血分泌的干扰素-γ和TNF-α的量小于由癌症患者的全血分泌的干扰素-γ和TNF-α的量，但是MIP-1β分泌自正常人和癌症患者的全血样品，如在图4中所示。
在用于疾病检验的体外诊断试剂的情况中，使用多种确认技术。通常，本文中使用正常范围和截止测定。正常范围是用于测量各组样品的平均值和标准偏差的参考范围，而截止测定是通过计算体外诊断试剂的估计值来测量临床灵敏度和特异性的方法。临床灵敏度是指当患者患有疾病时被证实显示诊断检验的阳性结果的几率，而临床特异性是指当患者不患有疾病时被证实显示诊断检验的阴性结果的几率。
假定，当截止值超过10％和低于10％时，截止值被分别设定为阳性值和阴性值。然后，使用截止测定来测量临床灵敏度和临床特异性。结果列于表1中。
表1
IFN-γ TNF-α MIP-1β
临床灵敏度(％) 98.4 90.9 100
临床特异性(％) 98.0 69.0 50
在癌症患者和正常人的组中，IFN-γ被测量为具有98.4％的灵敏度和98％的特异性。虽然TNF-α被测量为具有90.9％的灵敏度和69％的特异性(低于IFN-γ的灵敏度和特异性)，但是最近开发的癌症诊断试剂盒具有最多20至30％的特异性。因此，预期，具有约70％以上特异性的TNF-α也可以被用作用于测量NK细胞活性的癌症诊断试剂盒的标记物。
实验例3：比较SP IL-2和IL-2的稳定性
为了比较SP IL-2和IL-2的稳定性，全血样品取自两个人。将各1ml的所获得的全血样品和1ml的RPMI1640培养基放入24孔细胞培养平板中，并且然后加入SP IL-2和IL-2，充分混合，并且然后培养24小时。在24小时的培养后，取上清，并且使用夹心ELISA法测量干扰素-γ的水平。从IL-2和SP IL-2活性测定的结果，观察到的是，两种蛋白的活性没有差异(图5A)。然而，当在全血培养条件下分别用SP IL-2而不是IL-2处理全血时，可以确认的是，NK细胞被SP IL-2激活，由此增加干扰素-γ的水平(图5B)。这表明两种蛋白的活性没有差异，但是IL-2的稳定性由于应用SP而增加。
实验例4：根据用于刺激NK细胞的条件比较正常人和癌症患者的NK细胞活性
将各1ml的取自20个正常人和48个晚期(3期至4期)癌症患者的全血样品，和1ml的RPMI1640培养基放入24孔培养平板中，每个样品分成两个亚组，并且分别用SP IL-2(10ng/ml)(条件A)和SP IL-2(5ng/ml)+IL-12(5ng/ml)(条件B)来处理所述两个亚组，并且然后培养24小时。培养后，取上清，并且使用夹心ELISA法测量干扰素-γ的水平。
结果，观察到的是，在条件A的情况中，约90％的正常人具有高的干扰素-γ水平，而大部分的癌症患者具有低的干扰素-γ水平，如在图6中所示。在条件B的情况中，也观察到正常人具有高的干扰素-γ水平而大多数的癌症患者具有低的干扰素-γ水平。然而，在条件B的情况中，与条件A的情况相比，高的干扰素-γ水平在癌症患者中更高。当全血样品用SP IL-2单独处理时，仅NK细胞被特异性地激活(见以下实验例5和图7)，但是当全血样品用SP IL-2和IL-12的组合处理时，NK细胞可能与T细胞一起被激活，并且因此干扰素-γ的水平可能由T细胞的激活而提高。因此，在一些其中T细胞活性保持的癌症患者中，认为可能观察到高的干扰素-γ水平。当癌症患者具有低的干扰素-γ水平(甚至在用条件B处理时)，可以推断NK细胞的抗癌免疫和总体全身免疫在癌症患者中下降。这被认为是可以用作用于确定癌症进展或预后的重要标记物。
实验例5：根据血液样品的类型来比较正常人和癌症患者的通过IL2的NK细胞活性
为了确定根据来自正常人的血液样品的类型的通过IL2的干扰素-γ分泌能力的差异，进行以下实验。测量(a)采用1ng/ml的IL2时，来自T细胞的NK细胞的干扰素-γ分泌能力，(b)采用1ng/ml的IL2时，来自NK细胞的NK细胞的干扰素-γ分泌能力，(c)采用1ng/ml的IL2时，来自全血的NK细胞的干扰素-γ分泌能力，和(d)根据IL2的浓度的来自PBMC的NK细胞的干扰素-γ分泌能力。结果显示在图7中。以与如上所述相同的方式测量干扰素-γ。结果，因为由T细胞中的IL2的激活而分泌的干扰素-γ的量改变，但是并非显著不同于未处理组的干扰素-γ的量，所以T细胞不适合用作血液样品。在全血、PBMC和NK细胞中，与未处理组的干扰素-γ的量相比，干扰素-γ的量有显著差别。因此，全血、PBMC和NK细胞被评估为是适用于根据本发明的方法和试剂盒的合适血液样品。
实验例6：比较通过LPS的正常人的NK细胞活性
作为用来刺激血液样品中的NK细胞和人工激活NK细胞以产生干扰素-γ的试剂的另一个实例，LPS被用于测量来自人全血的干扰素-γ的量。如在图8中所示，被揭示的是，50ng/ml的LPS诱导干扰素-γ的分泌，这表明，甚至当NK细胞用非特异性激动剂如LPS刺激时，NK细胞仍可以被人工激活以产生干扰素-γ。
实验例7：通过与稳定性肽融合的hIL12和hIL15刺激NK细胞
作为用于温育NK细胞的试管，购买并使用含有抗凝血剂，肝素钠的试管(BD)以防止血液凝结。取5ml的全血并将其放入含有抗凝血剂(肝素钠)的试管。将1ml的所获得的全血与RPIM1640培养基混合，并向其中加入NK细胞的激活剂，SP-hIL2/hIL12。将所得的混合物在37℃温育16至24小时。通过hIL12和与稳定性肽融合的SP hIL2对全血中的NK细胞的刺激，通过根据在以上实验例中描述的方法测量被温育的血液中的干扰素-γ的量来测定。
同时，测量根据全血的培养条件分泌的干扰素-γ的量。如在图9中所示，被揭示的是，与当在PBS中温育NK细胞时相比，当在补充以载体蛋白如牛血清清蛋白的PBS中对NK细胞进行温育时，NK细胞的干扰素-γ分泌能力增加。
实验例8：根据癌症发展阶段干扰素-γ分泌的差异
为了确定根据癌症发展阶段的分泌的干扰素-γ的量，将来自癌症患者1(一名完全从乳腺癌恢复的患者)、癌症患者2(一名疑似具有脑癌的患者)和正常人的全血在补充以100ng/ml的IL12和1000ng/ml的IL15的RPMI1640培养基中温育24小时，并且如上所述地测量分泌的干扰素-γ的量。同样，对全血进行流式细胞术。
结果，确定干扰素-γ分泌能力是按以下次序：正常人、癌症患者1和癌症患者2，如在图10中所示。因此，确认的是，根据癌症发展阶段，分泌的干扰素-γ的量是不同的。从这些事实，观察到的是，根据本发明的方法可以用于测量由血液样品中的NK细胞分泌的干扰素-γ的量，由此预测癌症的发生和进展阶段，或者预测癌症的复发。
实验例9：量化通过刺激NK细胞产生的干扰素-γ
作为用于温育NK细胞的试管，购买并使用含有抗凝血剂，肝素钠的试管(BD)以防止血液凝结。从八名正常人取5ml的全血并且将其放入含有抗凝血剂(肝素钠)的试管。将1ml的所获得的全血与RPIM1640培养基混合，并向其中加入连接到稳定性肽的SP-hIL12/hIL15-SP。将所得的混合物在37℃温育16至24小时。
将在37℃温育的来自八名正常人的全血以1500至2000g离心以获得为上清的血清。然后，取150至200ul的血清并对其进行干扰素-γELISA。利用包被缓冲液(0.1碳酸钠，pH 9.5)以1:1000的比率稀释0.05％Tween一抗(抗人干扰素-γ单克隆抗体，ATGen货号ATGK02)。将稀释的一抗以100ul/孔的剂量分配到96孔微滴定ELISA平板(Nunc Maxisorp；NUNC，Naperville，IL)上，并且在4℃保持16至18小时。之后，除去平板中的溶液，并用洗涤溶液(含0.05％Tween 20的PBS)以400ul/孔的剂量洗涤平板。在此情况中，进行三次洗涤。然后，以300ul/孔的剂量分配含10％胎牛血清(FBS)的PBS，并且在室温保持1小时。之后，将平板中的溶液除去，并用PBST(含0.05％Tween 20的PBS溶液)以400ul/孔的剂量洗涤平板。在此情况中，进行三次洗涤。将包被有一抗的96孔微滴定ELISA平板密封，并于4℃存储以用于使用。
稀释干扰素-γ标准溶液(含200ng的重组人干扰素-γ(ATGen，货号IFG4001)和0.05％Proclin 300的PBS)并将其以100ul/孔的剂量分配到用一抗包被的96孔微滴定ELISA平板中，并且以100ul/孔的剂量分配在实验阶段制备的患者的血清，并且然后在室温保持2小时。
表2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 空白 空白 UK UK UK UK UK UK UK UK UK UK
B 空白 空白 UK UK UK UK UK UK UK UK UK UK
C S1 S1 UK UK UK UK UK UK UK UK UK UK
D S2 S2 UK UK UK UK UK UK UK UK UK UK
E S3 S3 UK UK UK UK UK UK UK UK UK UK
F S4 S4 UK UK UK UK UK UK UK UK UK UK
G S5 S5 UK UK UK UK UK UK UK UK UK UK
H S6 S6 UK UK UK UK UK UK UK UK UK UK
空白：仅有缓冲液，S1-S6：连续稀释的标准液，UK(未知)：患者血清
2小时后，除去96孔微滴定ELISA平板中的溶液，并且用洗涤溶液以400ul/孔的剂量洗涤平板。在此情况中，进行三次洗涤。然后，用稀释溶液以1：500的比率稀释二抗(生物素化的抗人干扰素-γ单克隆抗体(ATGen货号ATGK03))，以100ul/孔的剂量进行分配，并且然后在室温保持1小时。之后，除去板中的溶液，并且用洗涤溶液以400ul/孔的剂量将平板洗涤三次。用稀释溶液以1：3000的比率稀释HRP缀合的链霉抗生物素溶液(ThermoScientific，货号21130)，以100ul/孔的剂量进行分配，并且然后在室温保持30分钟。然后，将稀释的HRP缀合的链霉抗生物素溶液分配到ELISA平板中，并且温育1小时。在一小时的温育后，去除96孔微滴定ELISA平板中的溶液，并且用洗涤溶液以400ul/孔的剂量将平板洗涤三次。
将1mg的四甲基联苯胺(TMB)溶解到1ml的二甲亚砜(DMSO)中，并且用9ml的0.05M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液稀释所得的混合物以制备底物溶液。然后，将底物溶液以100ul/孔的剂量分配到平板中，并且在室温保持30分钟。
以100ul/孔的剂量分配反应终止溶液(2N稀硫酸溶液)以终止反应，并且使用ELISA读数器在450nm处测量所得的反应溶液。
使用来自八个正常人的全血测量的NK细胞的干扰素-γ分泌能力显示在图11中。这些结果表明，当全血被细胞因子刺激时，存在于血液中的免疫细胞有效地被激活从而诱导干扰素-γ的分泌。
此外，在来自八个正常人的全血被细胞因子刺激后，对全血进行流式细胞术检验。结果显示在图12中。从这些结果，被揭示的是，当通过刺激全血激活NK细胞时，NK细胞表达细胞毒性。CD56是NK细胞的标记物，而CD107a是指示NK细胞分泌细胞毒性颗粒的标记物。因为图11的干扰素-γ分泌结果与图12的NK细胞细胞毒性结果显著相关，所以观察到的是，通过刺激全血的NK细胞的干扰素-γ分泌能力间接表示NK细胞的细胞毒性。
根据本发明，癌症的发生或复发可以通过以下方式被诊断：监视体内免疫系统的变化和测量血液中的NK细胞活性，例如在患有或疑似患有癌症的受试者中。本发明因此可以用于使用来自受试者的血液样品来预测癌症的发生或复发。
虽然示例性实施方案已在本文中公开，但是应当理解的是，其他变化是可能的。这样的变化不被视为背离了本申请的示例性实施方案的范围，并且所有这样的对本领域技术人员将是显而易见的改良意在被包括在以下权利要求的范围内。
本文中引用的所有文献通过引用结合于此。

Claims (26)

1.至少一种刺激细胞因子在制备用于测量天然杀伤(NK)细胞活性的试剂盒中的应用，其中所述刺激细胞因子被提供用于刺激全血样品中的NK细胞和由此人工地激活所述NK细胞以产生和分泌NK细胞分泌的细胞因子；其中分泌到所述全血样品中的所述NK细胞分泌的细胞因子的量被用于测量NK细胞活性；并且其中所述至少一种刺激细胞因子是选自由白介素2、白介素15和白介素18组成的组的至少一种纯化的/分离的刺激细胞因子。
2.根据权利要求1所述的应用，其中对所述NK细胞的刺激是通过以下方式进行：将所述全血样品与所述刺激细胞因子温育。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中对所述NK细胞的刺激是通过将所述全血样品与至少白介素2温育来进行。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其中对所述NK细胞的刺激是通过将所述全血样品与白介素2和白介素12温育来进行。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其中对所述NK细胞的刺激是通过将所述全血样品与至少白介素15温育来进行。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其中对所述NK细胞的刺激是通过将所述全血样品与白介素15和白介素12温育来进行。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其中对所述NK细胞的刺激是通过将所述全血样品与白介素18和白介素12温育来进行。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述NK细胞分泌的细胞因子选自由以下组成的组：干扰素-γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)。
9.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述NK细胞分泌的细胞因子是干扰素-γ(IFN-γ)。
10.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述NK细胞分泌的细胞因子是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
11.根据权利要求1或2所述的应用，其中巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)被用作用于NK细胞的激活与正常人的NK细胞的激活比较的对照组。
12.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述全血样品中的所述NK细胞分泌的细胞因子的量是通过免疫测定来测量。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
14.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述至少一种刺激细胞因子是与稳定性肽的融合蛋白的形式。
15.根据权利要求14所述的应用，其中所述稳定性肽是突触核蛋白家族的C端酸性尾部结构域肽。
16.根据权利要求15所述的应用，其中所述稳定性肽包括α-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基103-115(SEQ ID NO:22)，氨基酸残基114-126(SEQ ID NO:23)，氨基酸残基119-140(SEQ ID NO:24)或氨基酸残基130-140(SEQ ID NO:25)，β-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基85-134(SEQ ID NO:27)，γ-突触核蛋白的氨基酸残基1-127(SEQ ID NO:28)，或γ-突触核蛋白的C端酸性尾部结构域的氨基酸残基96-127(SEQ IDNO:29)。
17.根据权利要求1或2所述的应用，其中刺激所述全血样品中的NK细胞由此人工地激活所述NK细胞以产生和分泌NK细胞分泌的细胞因子是在包含载体蛋白的培养基中进行。
18.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述至少一种刺激细胞因子是与稳定性肽的融合蛋白的形式，其中所述融合蛋白包含由SEQ ID NO:2、8或10的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
19.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述试剂盒用于检测癌症的发生或者复发，其中与正常个体中的水平相比，受试者中NK细胞分泌的细胞因子量的减少指示癌症的发生或复发。
20.根据权利要求1或2所述的应用，其中对NK细胞的刺激是通过以下方式进行：将所述全血样品和白介素2温育，或和作为与稳定性肽的融合蛋白的形式的白介素2温育。
21.根据权利要求1或2所述的应用，其中对NK细胞的刺激是通过以下方式进行：将所述全血样品和白介素15温育，或和作为与稳定性肽的融合蛋白的形式的白介素15温育。
22.一种用于测量天然杀伤(NK)细胞活性的试剂盒，所述试剂盒包括：
用于刺激全血样品中的NK细胞由此人工地激活所述NK细胞以产生和分泌NK细胞分泌的细胞因子的试剂，其中刺激NK细胞的试剂包含融合蛋白，所述融合蛋白用于激活全血中的NK细胞以促进NK细胞分泌的细胞因子的分泌，所述融合蛋白包含由SEQ ID NO:2、4、6、8或10的氨基酸序列组成的氨基酸序列；和
酶联免疫吸附测定(ELISA)平板，其包含固定于其上的至少一种抗体，所述抗体选自：抗干扰素-γ抗体、抗TNF-α抗体和抗MIP-1β抗体，所述抗体用于测量由激活的NK细胞分泌到全血样品中的NK细胞分泌的细胞因子。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述NK细胞分泌的细胞因子是干扰素-γ(IFN-γ)。
24.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述NK细胞分泌的细胞因子是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
25.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述NK细胞分泌的细胞因子是巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)。
26.根据权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于比较受试者中所述NK细胞分泌的细胞因子的量和正常个体中的水平的使用说明。
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