UA120697C2 - Спосіб виміру активності природних клітин-кілерів (nk) у зразку цільної крові - Google Patents
Спосіб виміру активності природних клітин-кілерів (nk) у зразку цільної крові Download PDFInfo
- Publication number
- UA120697C2 UA120697C2 UAA201310947A UAA201310947A UA120697C2 UA 120697 C2 UA120697 C2 UA 120697C2 UA A201310947 A UAA201310947 A UA A201310947A UA A201310947 A UAA201310947 A UA A201310947A UA 120697 C2 UA120697 C2 UA 120697C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cells
- interleukin
- whole blood
- blood sample
- amino acid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 54
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 76
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title claims description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 105
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 105
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 101
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims abstract description 38
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims abstract description 31
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 28
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 203
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 54
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 52
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 48
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 45
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 39
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 39
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 23
- 102000019355 Synuclein Human genes 0.000 claims description 22
- 108050006783 Synuclein Proteins 0.000 claims description 22
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 21
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims 2
- 241001397173 Kali <angiosperm> Species 0.000 claims 1
- 206010041235 Snoring Diseases 0.000 claims 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 21
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 13
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 7
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 6
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 description 6
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- -1 for example Proteins 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 235000010678 Paulownia tomentosa Nutrition 0.000 description 3
- 240000002834 Paulownia tomentosa Species 0.000 description 3
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 102000004963 gamma-Synuclein Human genes 0.000 description 3
- 108090001121 gamma-Synuclein Proteins 0.000 description 3
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000669 Annexin A4 Proteins 0.000 description 2
- 101100435497 Drosophila melanogaster ari-1 gene Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OHJKXVLJWUPWQG-PNRHKHKDSA-N Heparinsodiumsalt Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NS(O)(=O)=O)[C@@H](O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C(O)=O)O1 OHJKXVLJWUPWQG-PNRHKHKDSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 2
- 102100037591 Neuroserpin Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005904 anticancer immunity Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- RWGFKTVRMDUZSP-UHFFFAOYSA-N cumene Chemical compound CC(C)C1=CC=CC=C1 RWGFKTVRMDUZSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N methyl cyclopropanecarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CC1 PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091027597 miR-1d stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108010080874 neuroserpin Proteins 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000577180 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) Neutral protease 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100498160 Mus musculus Dach1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229910019567 Re Re Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001465 metallisation Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150115538 nero gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M phenylmercury acetate Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- ZEGFMFQPWDMMEP-UHFFFAOYSA-N strontium;sulfide Chemical compound [S-2].[Sr+2] ZEGFMFQPWDMMEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 101150071238 tut1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6866—Interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5434—IL-12
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5443—IL-15
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/54—Determining the risk of relapse
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Винахід стосується способу виміру активності природних клітин-кілерів (NK), який включає: стимулювання NK-клітин у зразку цільної крові за допомогою інкубування зразка цільної крові засобом, що містить щонайменше один стимулюючий цитокін, вибраний з групи, що складається з інтерлейкіну 2, інтерлейкіну 15 та інтерлейкіну 18, таким чином штучно активуючи NK-клітини до вироблення і секреції секретуючих NK-клітинами цитокінів; і вимір кількості секретуючих NK-клітинами цитокінів, секретованих у зразку цільної крові, та застосування кількості як міри для оцінки активності NK-клітин; причому секретуючі NK-клітинами цитокіни містять інтерферон-гамма (IFN-y), фактор некрозу пухлини альфа (TNF-a) або обидва з них; і причому, коли засіб містить інтерлейкін 18, засіб не містить інтерлейкін 12.
Description
Винахід стосується способу виміру активності природних клітин-кілерів (МК), який включає: стимулювання МК-клітин у зразку цільної крові за допомогою інкубування зразка цільної крові засобом, що містить щонайменше один стимулюючий цитокін, вибраний з групи, що складається з інтерлейкіну 2, інтерлейкіну 15 та інтерлейкіну 18, таким чином штучно активуючи
МК-клітини до вироблення і секреції секретуючих МК-клітинами цитокінів; і вимір кількості секретуючих МК-клітинами цитокінів, секретованих у зразку цільної крові, та застосування кількості як міри для оцінки активності МК-клітин; причому секретуючі МК-клітинами цитокіни містять інтерферон-гамма (ІЄМ-у), фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕ-а) або обидва з них; і причому, коли засіб містить інтерлейкін 18, засіб не містить інтерлейкін 12.
Посилання на споріднену заявку
Дана заявка просить пріоритет за заявкою на видачу патенту Кореї Мо 2011-0012983, поданої 14 лютого 2011 року, розкриття якої включено в даний документ за допомогою посилання в повному її обсязі.
Область техніки
Даний винахід відноситься до способу діагностики злоякісної пухлини й набору для діагностики шляхом виміру активності МК-клітин.
Рівень техніки
Відомо, що природні клітини-кілери (МК) беруть участь в уродженому імунітеті, знищуючи патогени й злоякісні клітини й секретуючи інтерферон гама (ІЄМ-у), фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕ-а4), макрофагальньй білок запалення 18 (МІР-18) та інші молекули, опосередковуючи придбаний імунітет. При зустрічі МК-клітин з іншими клітинами МК-клітини задіють механізм, відповідно до якого, якщо відсутні молекули МНС 1 класу, як у випадку злоякісних клітин, або форма молекул класу МНС є нетиповою, як у випадку інфікованих вірусами клітин, то їх молекули головного комплексу гістосумісності (МНС) посилають сигнали
МК-клітинам атакувати ці аномальні клітини за допомогою молекулярних дій. Однак, повідомлялося, що оскільки МК-клітини характеризуються порушеннями функцій і здатностями до диференціації при різних типах злоякісної пухлини, то активність МК-клітин тісно пов'язана з виживанням злоякісних клітин. Таким чином, проводиться інтенсивне дослідження з метою підвищення кількості або активності МК-клітин для імунотерапії злоякісної пухлини.
Що стосується способів діагностики злоякісної пухлини то, вони переважно передбачають виявлення наявності злоякісної пухлини з графічних зображень, які отримуються за допомогою комп'ютерної томографії (КТ), магнітно-резонансної томографії (МРТ) або рентгенограм. Однак, оскільки ці тести звичайно проводять тільки у випадку, якщо пацієнт сильно потребує виконання тестів, через біль або незручність, і їх здійснюють тільки на певних тканинах, то наявність злоякісної пухлини може бути упущене з виду. Був розроблений спосіб визначення ризику захворювання злоякісною пухлиною за допомогою аналізу крові, але його застосування як спосіб діагностики злоякісної пухлини є обмеженим. Це пов'язане з тим, що в пацієнта може виявитися позитивний результат на злоякісну пухлину при наявності скоріше етіологічного
Зо фактору у відповідному органі, а не самої злоякісної пухлини, оскільки спосіб здійснюють за допомогою пухлинних маркерів у крові, як наприклад, для злоякісної пухлини передміхурової залози, колоректальної злоякісної пухлини, злоякісної пухлини яєчників, злоякісної пухлини підшлункової залози або злоякісної пухлини печінки. Були також вжиті спроби діагностики злоякісної пухлини за допомогою антитіл, але такі спроби обмежені певними типами злоякісних пухлин.
Відповідно, як і раніше існує необхідність у нових способах діагностики різних типів злоякісних пухлин.
Сутність винаходу
Таким чином, даний винахід відноситься до способу, який може застосовуватися для діагностики й оцінки злоякісної пухлини, а також до застосовуваних у такому способі наборів і реактивів.
Відповідно з одним аспектом даний винахід відноситься до способу виміру активності МК- клітин, при цьому спосіб передбачає стимулювання МК-клітин у зразку крові, таким чином штучно активуючи МК-клітини до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів, і вимір кількості секретуючих МК-клітинами цитокінів у зразку крові.
Відповідно до певних необмежуючих варіантів здійснення зразок крові може являти собою зразок цільної крові, мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) або МК-клітин.
У відповідності з наступними варіантами здійснення стимулювання МК-клітин може бути здійснене шляхом інкубування зразка крові щонайменше з одним стимулюючим цитокіном, включаючи інтерлейкін 2, інтерлейкін 12, інтерлейкін 15 і інтерлейкін 18 або їх комбінації, або шляхом інкубування зразка крові З ліпополісахаридами (ЛПС) або поліінозиновою:поліцитидиловою кислотою (полі І:Ц).
Відповідно до певних варіантів здійснення секретуючі МК-клітинами цитокіни можуть містити інтерферон-гама (ІЕМ-у), фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕ-а) або макрофагальний білок запалення 18фД (МІР-1р).
У відповідності 3 наступними необмежуючими варіантами здійснення способу макрофагальний білок запалення 18 (МІР-18) може бути використаний у якості контрольної групи для порівняння активації МК-клітин у хворого активацією в здорової людини.
Крім того, відповідно до певних варіантів здійснення спосіб може бути виконаний із бо застосуванням щонайменше одного стимулюючого цитокіну, злитого зі стабілізуючим пептидом.
Наприклад, і без обмеження, стабілізуючий пептид може являти собою пептид із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів. Відповідно до таких варіантів здійснення стабілізуючі пептиди можуть містити амінокислотні залишки 103-115 (5ЕО І МО: 22), амінокислотні залишки 114-126 (5ЕО ІЮ МО: 23), амінокислотні залишки 119-140 (5ЕО ІЮ МО: 24) або амінокислотні залишки 130-140 (ЗЕО ІЮ МО: 25) С-кінцевого кислого хвостового домену а-синуклеїну, амінокислотні залишки 85-134 С-кінцевого кислого хвостового домену В- синуклеїну (5ЕО ІЮ МО: 27), амінокислотні залишки 96-127 С-кінцевого кислого хвостового домену у-синуклеїну (ЗЕО ІЮ МО: 29) або амінокислотні залишки 96-127 С-кінцевого кислого хвостового домену сіноретину (ЗЕО ІЮО МО: 29).
У відповідності з наступними варіантами здійснення етап стимулювання МК-клітин у зразку крові, таким чином штучно активуючи МК-клітини до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів, виконують у середовищі, яка містить білок-носій, наприклад, сироватковий альбумін.
Описаний спосіб є особливо придатним для визначення ймовірності виникнення або рецидиву злоякісної пухлини. Відповідно до таких варіантів здійснення зменшення кількості секретуючих МК-клітинами цитокінів у суб'єктів у порівнянні з рівнями в здорових індивідуумів є показником імовірності виникнення або рецидиву злоякісної пухлини.
Відповідно до додаткового аспекту даний винахід відноситься до набору для виміру активності МК-клітин. Набір буде включати засіб для стимулювання МК-клітин у зразку крові, таким чином штучно активуючи МК-клітини до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів.
Крім того, набір може бути придатний для здійснення описаного вище способу, який передбачає визначення ймовірності виникнення або рецидиву злоякісної пухлини.
У відповідності з наступними необмежуючими варіантами здійснення описаного набору секретуючий МК-клітиною цитокін може являти собою інтерферон-гама (ІЕМ-у) або фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕ-а).
У відповідності з наступним варіантом здійснення засіб для стимуляції МК-клітин у зразку крові й штучної активації МК-клітин до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів може містити щонайменше один стимулюючий цитокін, ЛПС або полі І:Ц, при цьому щонайменше один стимулюючий цитокін включає один або декілька з інтерлейкіну 2, інтерлейкіну 12, інтерлейкіну 15 і інтерлейкіну 18.
Відповідно до певних варіантів здійснення описаний набір може також містити одне або декілька з наступних: антитіло до ІЕМ-у, антитіло до ТМЕ-а і антитіло до МІР-1Д. Без обмеження тим або іншим способом, набір може також додатково містити інструкції для порівняння кількості секретуючих МК-клітинами цитокінів у суб'єкта з рівнями в здорових індивідуумів, при цьому зменшення рівня секретуючих МК-клітинами цитокінів у суб'єкта є показником ймовірності виникнення або рецидиву злоякісної пухлини.
У відповідності з наступним аспектом даний винахід відноситься до химерного білку, який містить цитокін, зв'язаний з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів, при цьому цитокін є або інтерлейкіном 2, або інтерлейкіном 12, або інтерлейкіном 15, або інтерлейкіном 18.
Відповідно до певних необмежуючих варіантів здійснення описаного химерного білка, пептид із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів може містити амінокислотні залишки 103-115 (5ЕО ІЮ МО: 22), амінокислотні залишки 114-126 (5ЕО ІЮ МО: 23), амінокислотні залишки 119-140 (5ЕО ІЮ МО: 24) або амінокислотні залишки 130-140 (5ЕО
ІО МО: 25) С-кінцевого кислого хвостового домену а-синуклеїну, амінокислотні залишки 85-134
С-кінцевого кислого хвостового домену В-синуклеїну (ЗЕО ІЮ МО: 27), амінокислотні залишки 96-127 С-кінцевого кислого хвостового домену у-синуклеїну (ЗЕО ІЮ МО: 29) або амінокислотні залишки 96-127 С-кінцевого кислого хвостового домену сіноретину (5ЕО ІЮ МО: 29).
Також даний винахід відноситься до, які містять описаний вище химерний білок, композицій.
Крім того, даний винахід відноситься до наборів для діагностики злоякісної пухлини, які містять або описані вище химерні білки, або описані вище композиції.
Описаний вище набір для діагностики злоякісної пухлини відповідно до певних необмежуючих варіантів здійснення може також включати щонайменше одне антитіло з наступних: антитіло до ІЕМ-у, антитіло до ТМЕ-а і антитіло до МІР-1рД.
Даний винахід також відноситься до поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність щонайменше з 80 95 ідентичністю відносно амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІО
МО: 4, 5БО І МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 8 або 5ЕО ІЮ МО: 10. Без обмеження, поліпептид може характеризуватися високою процентною ідентичністю, включаючи 81 95, 82 Фо, 83 Уо, 84 Уо, 85 9о, 86 95, 87 9, 88 95, 89 90, 90 У, 91 90, 92 У, 93 Уо, 94 95, 95 У, 96 У, 97 У, 98 У, 99 96 або 100 95 ідентичність відносно послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 6, ЗЕОІЮ МО: 8 і (510) ЗЕО ІЮО МО: 10.
Даний винахід також відноситься до олігонуклеотидам, що кодують описані вище химерні білки й поліпептиди. Наприклад, даний винахід відноситься до олігонуклеотиду, що містить послідовність нуклеїнової кислоти щонайменше з 80 95 ідентичністю відносно послідовності нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 7 або 5ЕО ІЮ МО: 9 або її комплементарної послідовності. Такі олігонуклеотиди, без обмеження, можуть характеризуватися більш високою процентною ідентичністю, включаючи 81 95, 82 95, 83 95, 84 Фо, 85 95, 86 95, 87 Усю, 88 о, 89 95, 90 9, 91 Ус, 92 У, 93 95, 94 У, 95 Ус, 96 У, 97 95, 98 Ус, 99 Уо або 100 95 ідентичність, відносно послідовностей 5ЕО ІЮО МО: 1, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 5,
ЗЕО ІЮ МО: 7 або ЗЕО ІЮО МО: 9 або їх комплементарним послідовностям.
Також даний винахід відноситься до, які містять описані вище олігонуклеотиди, векторів, а також до, які містять такі вектори або олігонуклеотиди, клітин-хазяїв.
Короткий опис креслень
Зазначені вище й інші об'єкти, ознаки й переваги даного винаходу стануть більш зрозумілі рядовим фахівцям у даній області техніки при докладному описі ілюстративних варіантів здійснення із прив'язкою до креслень, на яких:
Фіг. 1 являє собою схематичне зображення, що демонструє химерні продукти пептиду 5Р, злитого або з М-кінцем, або з С-кінцем цитокіну, включаючи ПІІ 2, ПІ12, МІ 15 і ПІ 18.
Фіг. 2 являє собою фотознімок, який демонструє результати електрофорезу очищених химерних білків 5Р.
На Фіг. З показана активність штучно активованих у здорової людини МК-клітин за результатами аналізу кількості виробленого інтерферону-у при стимулюванні МК-клітин окремим цитокіном (Фіг. ЗА) або комбінованими цитокінами (Фіг. 38-30).
Фіг. 4 являє собою діаграму, яка демонструє цитокіни, секретовані зі штучно активованих
МК-клітин, при оцінці за допомогою ІФА по типу сендвіча.
На Фіг. 5 показане порівняння білкової активності (А) і стабільності (В) між ЗР 1-2 і 1-2.
На Фіг б показана активність МК-клітин у здорових людей і хворих злоякісним захворюванням, яких обробили окремо 5Р ІІ -2 (10 нг/мл) (умова А) і 5Р 1І-2 (5 нг/мл) «ж 1-12 (5 нг/мл) (умова В).
Фіг. 7 являє собою діаграму, яка демонструє здатність МК-клітин секретувати інтерферон-у у
Т-клітин, МК-клітин, цільної крові й МКПК залежно від стимулюючої дії ІІ 2.
Фіг. 8 являє собою діаграму, яка демонструє різницю в кількості секретуючого з МК-клітин у здорової людини інтерферону-у при стимуляції ЛПС.
Фіг. 9 являє собою діаграму, яка демонструє різницю в здатності МК-клітин секретувати інтерферон-у залежно від концентрацій І/12 і 15 при обробці й відмінності композицій середовищ.
Фіг. 10 являє собою діаграму, що демонструє відмінність у кількості секретуючого інтерферону-у залежно від стадії прогресування злоякісної пухлини.
На Фіг. 11 показані результати аналізу інтерферону-у, виробленого МК-клітинами здорової людини, при стимуляції цитокінами в планшеті для ІФА.
На Фіг. 12 показані результати проточної цитометрії цільної крові від здорових людей при стимуляції цитокінами.
Докладний опис винаходу
Даний винахід відноситься до способу, набору й реактивам для діагностики ймовірності виникнення злоякісної пухлини за допомогою взаємозв'язку злоякісної пухлини з МК-клітинами.
ІЗ цією метою пропонується спосіб виміру активності МК-клітин, який передбачає стимулювання МК-клітин у зразку крові, таким чином штучно активуючи МкК-клітини до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів, і вимір кількості секретуючих МК-клітинами цитокінів у зразку крові.
Було виявлено, що виходячи зі спостережень, що активність МК-клітин є зниженою у хворих злоякісним захворюванням, ймовірність виникнення злоякісної пухлини можна переважно відслідковувати шляхом виміру активності МК-клітин. За допомогою описуваного в даному документі способу можна визначити нормально функціонують МК-клітини чи ні, як правило, подаючи штучний стимул МК-клітинам, і виміряти рівень активації МК-клітин шляхом визначення змін кількості присутніх у зразку крові секретуючих МК-клітинами цитокінів, що відрізняється від інших способів, які передбачають простий вимір від початку присутніх у зразку крові числа МК- клітин або кількості цитокінів. Наприклад, у традиційному способі виміру рівня активації МК- клітин аналіз по вивільненню »'Сг застосовували в якості способу виміру спрямованої на мішень цитотоксичності. Однак при вимірі активності МК-клітин таким способом необхідно було застосовувати радіоактивний ізотоп, а вимір і аналіз є скрутними, складними й дорогими. Тому бо аналіз не підходить для застосування при скринінг-аналізі/способах тестування первинного злоякісної пухлини, за допомогою яких можна просто діагностувати ймовірність виникнення злоякісної пухлини. З іншого боку, відповідно до даного винаходу, оскільки активність МК-клітин може бути виміряна шляхом стимулювання МК-клітин до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів і кількісного визначення вироблених секретуючих МК-клітинами цитокінів, суб'єкт, у якого знижена активність МК-клітин, може бути переважно відібраний як страждаючий злоякісною пухлиною або підданий ризику захворювання злоякісною пухлиною суб'єкт.
Відповідно до даного винаходу зразок крові може включати без обмеження цільну кров, мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК) і МК-клітини, які беруть у суб'єкта. Замість цільної крові МКПК або МК-клітини можуть бути використані інтактними, але відповідно до певних варіантів здійснення застосування цільної крові може бути переважним через більш просту методику й знижених витрат.
При цьому, відповідно до даного винаходу термін "суб'єкт" відноситься до ссавця, у якого є підозра на захворювання злоякісною пухлиною або на наявність рецидивуючого злоякісної пухлини, або яке прагне визначити ймовірність виникнення або рецидиву злоякісної пухлини.
Присутні в зразку крові МК-клітини звичайно присутні в інактивованому стані. Відповідно до даного винаходу щонайменше один цитокін, ліпополісахарид (ЛПС) або поліінозинова:поліцитидилова кислота (полі І:Ц) може бути використаний у якості засобу, також названого в даному документі агоністом або активатором, яке служить для стимуляції таких МК- клітин у зразку крові й штучної активації МК-клітин до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів. У такому випадку застосовуваний для активації МК-клітин цитокін може являти собою інтерлейкін 2, інтерлейкін 12, інтерлейкін 15 і інтерлейкін 18 або їх комбінації. Інтерлейкін 2, інтерлейкін 12, інтерлейкін 15, інтерлейкін 18, ЛПС або полі І:Ц широко відомі в даній області техніки як стимулюючі до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів. Тому, відповідно з одним із ілюстративних варіантів здійснення даного винаходу, стимуляція МК-клітин може бути здійснена шляхом інкубування зразка крові щонайменше з одним цитокіном, включаючи інтерлейкін 2, інтерлейкін 12, інтерлейкін 15 і/або інтерлейкін 18, або шляхом інкубування зразка крові із ЛПС або полі І:Ц.
Відповідно з одним необмежуючим варіантом здійснення стимуляція МК-клітин може бути здійснена шляхом інкубування зразка крові з інтерлейкіном 2. Інтерлейкін 2 є одним із
Зо секретуючих Т-клітинами цитокінів, і відомо, що він асоційований з активацією МК-клітин Т- клітинами при адаптивній імунній відповіді іп мімо. Також, інтерлейкін 2 являє собою цитокін, який звичайно широко використовується для активації МК-клітин іп міго. Отже, стимуляція МК- клітин може бути здійснена шляхом інкубування зразка крові з інтерлейкіном 2.
Відповідно до іншого необмежуючого варіанта здійснення стимуляція МК-клітин може бути здійснена шляхом інкубування зразка крові з інтерлейкіном 2 і інтерлейкіном 12. У випадку із хворими злоякісним захворюванням на ранній стадії активність Т-клітин може бути високою навіть при низькій активності МК-клітин. На відміну від цього, у випадку із хворими злоякісним захворюванням на пізній стадії, активність Т-клітин, а також МК-клітин може бути низькою.
Інтерлейкін 12 бере участь в активації Т-клітин, а також МК-клітин. Таким чином, при обробці інтерлейкіном 12 з інтерлейкіном 2 секретовані внаслідок стимуляції Т-клітин цитокіни додають до секретованим МК-клітинами цитокінам. Тому, можна оцінити загальний рівень імунітету, а також протираковий імунітет МК-клітин і використовувати цей рівень як маркер, який демонструє ступінь розвитку злоякісної пухлини або прогноз лікування злоякісної пухлини. Інтерлейкін 15 і інтерлейкін 18 є секретуючими активованими дендритними клітинами й макрофагами цитокінами й індукують активацію й ріст МК-клітин у ході вродженої імунної відповіді іп міїго.
Зокрема, при об'єднанні інтерлейкіну 12 з інтерлейкіном 15 або інтерлейкіном 18 для стимулювання в МК-клітин секреції секретуючих МК-клітинами цитокінів може бути використана відносно мала кількість інтерлейкіну 12. Таким чином, стимуляція МК-клітин може бути ефективно здійснена шляхом інкубування зразка крові з інтерлейкіном 12 і інтерлейкіном 15 або з інтерлейкіном 12 і інтерлейкіном 18.
Відповідно до даного винаходу цифрову величину секретуючих МК-клітинами цитокінів застосовують у якості критерію для оцінки активності МК-клітин. Відповідно до даного винаходу фраза "секретуючі МК-клітинами цитокіни" відноситься до цитокінів, які секретуються МК- клітинами, зокрема цитокінів з активованих за допомогою штучної стимуляції МК-клітин.
Відповідно з одним варіантом здійснення секретуючі МК-клітинами цитокіни є щонайменше одним цитокіном, обраним із групи з інтерферону-гама (ІЄМ-у), фактора некрозу пухлини альфа (ТМЕ-4) і макрофагального білка запалення 18 (МІР-1ф8). Інтерферон-у секретується МК- клітинами, дендритними клітинами, цитотоксичними Т-клітинами, Тп1-клітинами й т.п. і відомий у якості цитокіну, який відіграє важливу роль в уродженому імунітеті й придбаному імунітеті для бо боротьби зі злоякісною пухлиною. Також, фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕ-0) знищує злоякісні клітини й додатково бере участь у кілінгі стороннього об'єкта, такого як бактерія, індукуючи активацію Т-клітин і відіграючи роль додаткового фактору для продукування антитіла
В-клітинами. Тому, наприклад, якщо цифрова величина інтерферону-у або фактора некрозу пухлини альфа менше, чим цифрова величина інтерферону-у або фактора некрозу пухлини альфа в здорової людини, то це вказує на те, що існує проблема з активністю МК-клітин для боротьби зі злоякісною пухлиною. Отже, можна визначити активність МК-клітин шляхом порівняння кількості секретуючого штучно активованими МК-клітинами інтерферону-у або фактора некрозу пухлини альфа з кількістю інтерферону-у або фактора некрозу пухлини альфа в здорової людини.
При цьому, макрофагальний білок запалення 18 (МІР-1Д) може бути використаний у якості контрольної групи для порівняння активації МК-клітин. Як показано в наступних прикладах, цифрова величина макрофагального білка запалення 18 (МІР-18) є однаково високою як у здорових людей, так і у хворих злоякісним захворюванням. Таким чином, макрофагальний білок запалення 1В(МІР-18) може бути використаний для аналізу активності МК-клітин у здорових людей і хворих злоякісним захворюванням або може бути використаний у якості контрольної групи для аналізу за допомогою набору для діагностики злоякісної пухлини.
Кількісне визначення секретуючих МК-клітинами цитокінів може бути здійснене за допомогою будь-яких відомих у даній області способів, але даний винахід ними не обмежується.
Наприклад, кількісне визначення інтерферону-у може бути здійснене за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу інтерферону-у (ІФА інтерферону-у).
При цьому, щонайменше один цитокін, включаючи інтерлейкін 2, інтерлейкін 12, інтерлейкін 15 або інтерлейкін 18, який застосовують як засіб, що служить для стимуляції МК-клітин у зразку крові й штучної активації МК-клітин до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів, може перебувати у формі химерного білка зі стабілізуючим пептидом.
Інтерлейкін 2, інтерлейкін 12, інтерлейкін 15 або інтерлейкін 18 у формі химерного білка зі стабілізуючим пептидом може забезпечити аналогічну біологічну активність і високу стабільність при зберіганні в порівнянні з інтерлейкіном 2, інтерлейкіном 12, інтерлейкіном 15 або інтерлейкіном 18 дикого типу. Наприклад, якщо цитокін пов'язаний з таким стабілізуючим пептидом, те цитокін має споконвічну активність, у той час же зберігаючи стабільність,
Зо незважаючи на такі зміни в навколишньому середовищі, як ліофілізація.
Стабілізуючий пептид може бути зв'язаний М- або С-кінцем інтерлейкіну 2, інтерлейкіну 12, інтерлейкіну 15 або інтерлейкіну 18, і одержання такого химерного білка може бути здійснене за допомогою відомих способів одержання химерних білків.
Відповідно з одним ілюстративним варіантом здійснення пептид із С-кінцевим кислим хвостовим доменом (амінокислотною послідовністю кислого хвоста альфа-синуклеїну, АТБ) сімейства синуклеїнів може бути використаний у якості стабілізуючого пептиду, який може бути пов'язаний з інтерлейкіном 2, інтерлейкіном 12, інтерлейкіном 15 або інтерлейкіном 18, але даний винахід не обмежується цим. У зареєстрованому патенті Кореї Мо 10-0506766 розкривається, що пептид АТ5 надає білку-партнеру в химерному білку стійкість до впливів навколишнього середовища.
Відповідно з одним ілюстративним варіантом здійснення стабілізуючий пептид, який може бути використаний відповідно до даного винаходу, включає стабілізуючий пептид, обраний з амінокислотних залишків 103-115, амінокислотних залишків 114-126, амінокислотних залишків 119-140 і амінокислотних залишків 130-140 С-кінцевого кислого хвостового домену а-синуклеїну, амінокислотних залишків 85-134 С-кінцевого кислого хвостового домену В-синуклеїну, амінокислотних залишків 96-127 С-кінцевого кислого хвостового домену у-синуклеїну й амінокислотних залишків 96-127 С-кінцевого кислого хвостового домену сіноретину. Відповідно до даного винаходу амінокислотну послідовність пептиду АТ5, пептид АТ5 і спосіб одержання, що включає їх химерного білка можна здійснити за допомогою способу, розкритого в зареєстрованому патенті Кореї Ме 10-0506766. Якщо звернутися до наступних прикладів, то в них показано, що злитий з пептидом АТ5 інтерлейкін 2, інтерлейкін 12, інтерлейкін 15 або інтерлейкін 18 має високу стабільність і проявляє подібну з версією дикого типу активність при активації цитокіну Т-лімфоцитом.
Відповідно з одним варіантом здійснення етап стимулювання МК-клітин у зразку крові, таким чином штучно активуючи МК-клітини до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів, може бути здійснений в утримуючому білок-носій середовищі. Білок-носій відповідає за стабілізацію цитокінів, таких як інтерлейкін 2, інтерлейкін 12, інтерлейкін 15 або інтерлейкін 18, які використовуються в якості засобу для стимуляції МК-клітин у зразку крові й штучної активації
МК-клітин до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів і, таким чином, для індукції МК- бо клітин до продукування більшої кількості секретуючих МК-клітинами цитокінів. Білок-носій,
відповідно до певних варіантів здійснення, може являти собою бичачий сироватковий альбумін або людський сироватковий альбумін, але не обмежується ними.
При цьому, спосіб виміру активності МК-клітин може бути використаний для скринінг-аналізу ймовірності виникнення або рецидиву злоякісної пухлини.
Активність МК-клітин може бути виміряна шляхом порівняння кількості секретуючих МК- клітинами цитокінів, які секретируются штучно активованими МК-клітинами, з кількістю секретуючих МК-клітинами цитокінів у здорової людини. У цьому випадку, якщо кількість секретуючих МК-клітинами цитокінів менше, чим кількість секретуючих МК-клітинами цитокінів у здорової людини, то активність МК-клітин уважають зниженою. Отже, можна оцінити ризик захворювання злоякісною пухлиною або рецидиву злоякісної пухлини. Якщо активність МК- клітин знижена в порівнянні зі здоровою людиною, суб'єкт може бути первинно класифікований як страждаючий злоякісною пухлиною пацієнт або хворий рецидивуючою злоякісною пухлиною.
Також, ймовірність захворювання або рецидив злоякісної пухлини можуть бути діагностовані за допомогою додаткового діагностичного способу, такого як КТ, МРТ або позитрон-емісійна томографія (ПЕТ) для звичайно здійснюваної діагностики злоякісної пухлини, і за допомогою завершального аналізу тканини. Хоча спосіб відповідно до даного винаходу не є способом остаточної діагностики злоякісної пухлини, спосіб має хороші переваги в тому, що може бути здійснений первинний скринінг-аналіз на ймовірність виникнення або рецидив злоякісної пухлини за допомогою зразка крові.
Крім того, даний винахід відноситься до набору для виміру активності МК-клітин, який включає засіб, такий як агоніст або активатор, які служать для стимуляції МК-клітин у зразку крові й штучної активації МК-клітин до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів. Такий набір для виміру активності МК-клітин може бути використаний для швидкого здійснення вищезгаданого способу виміру активності МК-клітин.
В наборі для виміру активності МК-клітин засіб, який служить для стимуляції МК-клітин і штучної активації МК-клітин до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів, може являти собою в меншій мірі один цитокін, ЛПС або полі І:Ц, і такий цитокін може бути обраний із групи, яка складається з інтерлейкіну 2, інтерлейкіну 12, інтерлейкіну 15 і інтерлейкіну 18.
Крім засобу, який служить для стимуляції МК-клітин і штучної активації МК-клітин до
Зо вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів, таких як інтерферон-у, такий набір для діагностики злоякісної пухлини може включати додаткові компоненти для виміру активності МК- клітин, наприклад, антитіло для кількісного визначення секретуючих МК-клітинами цитокінів і підложку. Відповідно з одним варіантом здійснення набір по даному винаходу додатково містить щонайменше одне антитіло, обране із групи з антитіла до ІЕМ-у, антитіла до ТМЕ-а і антитіла до
МІР-1В.
Антитіло в наборі по даному винаходу може бути зафіксоване на твердій підложці. Антитіло може бути зафіксоване за допомогою різних способів, які описані в літературі (Апіїбодіев: А
І арогаїогу Мапааї, Нагіом/ 5 Гапе; Соїа Зргіпд Натфог, 1988). Підходяща тверда підложка може включати планшет для клітинної культури, планшет для ІФА, пробірку й полімерну плівку. Крім того, тверда підложка включає металевий каркас, синтетичне скло, агарозну гранулу, чашку, плоский корпус або інші плівки або покриття, які підтримуються твердими носіями або прикріплені до них.
Також, набір відповідно до даного винаходу може включати застосовуваний для імунологічного аналізу реактив з антитілом, що вибірково розпізнає секретуючі МК-клітинами цитокіни, такі як інтерферон-у. Імунологічний аналіз може включати всі способи, за допомогою яких може бути виміряне зв'язування антигену з антитілом відповідно до даного винаходу. Такі способи відомі в даній області й включають, наприклад, імуноцитохімію й імуногістохімію, радіоїмуноаналіз, ІФА, імуноблотинг, аналіз по Фарру, реакцію із преципітином, турбідиметричний спосіб, імунодифузію, протиточний електроліз, однорадикальну імунодифузію й імунофлуоресценцію.
Застосовуваний для імунологічного аналізу реактив включає підходящий носій, здатний генерувати обумовлений сигнал мітку, розчинник і детергент. Також, якщо матеріалом мітки є фермент, то реактив може включати субстрат, за допомогою якого можна виміряти ферментативну активність, і засіб для зупинки реакції. Підходящий носій може включати без обмеження розчинний носій, наприклад, один з відомих у даній області фізіологічно доступних буферів (наприклад, РВ5) або нерозчинний носій, наприклад, полімер, такий як магнітні частки, утворені шляхом нанесення металу на полістирол, поліетилен, поліпропілен, поліефір, поліакрилнітрил, фторвмісну смолу, зшиваємий декстран, полісахарид, та латекс, і інші види паперу, скла, металів, агарози і їх комбінацій.
В якості мітки, яка може генерувати обумовлений сигнал, може бути використаний фермент флуоресцируючий матеріал, люмінесцируючий матеріал і радіоактивний матеріал. В якості ферменту може бути використана пероксидаза, лужна фосфатаза, В-ЮО-галактозидаза, глюкооксидаза, малатдегідрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, інвертаза й т.п., а в якості люмінесцируючого матеріалу може бути використаний ізотіоціанат флюоресцеїн або фікобіліпротеїн, і в якості радіоактивного матеріалу можуть бути використані Іїзї, Сія або Нз.
Крім наведених як приклад матеріалів відповідно до даного винаходу можна використовувати будь-які матеріали, які можуть бути використані для імунологічного аналізу.
Крім того, даний винахід відноситься до химерного білка, що включає цитокін, пов'язаний з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів. В цьому випадку цитокін може являти собою інтерлейкін 2, інтерлейкін 12, інтерлейкін 15 або інтерлейкін 18. Як описано вище, химерний білок може бути використаний у якості засобу, який служить для стимуляції МК-клітин і штучної активації МК-клітин до вироблення секретуючих МК-клітинами цитокінів і забезпечує більш високу стабільність, незважаючи на зміни в навколишньому середовищі, такі як ліофілізація або довгострокове зберігання, у порівнянні з інтерлейкіном 2, інтерлейкіном 12, інтерлейкіном 15 або інтерлейкіном 18 дикого типу.
Відповідно з одним ілюстративним варіантом здійснення химерний білок може являти собою химерний білок, в якому інтерлейкін 2 пов'язаний з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів.
Відповідно до іншого ілюстративного варіанта здійснення химерний білок може являти собою химерний білок, в якому інтерлейкін 12 пов'язаний з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів.
Відповідно з ще одним ілюстративним варіантом здійснення химерний білок може являти собою химерний білок, в якому інтерлейкін 15 пов'язаний з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів.
Відповідно з ще одним ілюстративним варіантом здійснення химерний білок може являти собою химерний білок, в якому інтерлейкін 18 пов'язаний з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів.
Пептид із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів у химерному білку може також бути обраний з амінокислотних залишків 103-115, амінокислотних залишків 114-126, амінокислотних залишків 119-140 і амінокислотних залишків 130-140 С-кінцевого кислого хвостового домену с-синуклеїну, амінокислотних залишків 85-134 С-кінцевого кислого хвостового домену В-синуклеїну, амінокислотних залишків 96-127 С-кінцевого кислого хвостового домену у-синуклеїну й амінокислотних залишків 96-127 С-кінцевого кислого
З5 хвостового домену сіноретину.
Крім того, даний винахід відноситься до застосування химерного білка для активації МК- клітин. Як описано вище, такий химерний білок може бути використаний для активації МК-клітин у крові для того, щоб сприяти секреції секретуючих МК-клітинами цитокінів.
Отже, даний винахід відноситься до композиції для активації МК-клітин. У цьому випадку композиція включає щонайменше один химерний білок, обраний із групи, яка складається з інтерлейкіну 2, пов'язаного з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів, інтерлейкіну 12, пов'язаного з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів, інтерлейкіну 15, пов'язаного з пептидом із С-кінцневим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів, і інтерлейкіну 18, пов'язаного з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів.
Відповідно з одним ілюстративним варіантом здійснення пептид із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів може бути обраний з амінокислотних залишків 103- 115, амінокислотних залишків 114-126, амінокислотних залишків 119-140 і амінокислотних залишків 130-140 С-кінцевого кислого хвостового домену а-синуклеїну, амінокислотних залишків 85-134 С-кінцевого кислого хвостового домену В-синуклеїну, амінокислотних залишків 96-127 С- кінцевого кислого хвостового домену у-синуклеїну й амінокислотних залишків 96-127 С- кінцевого кислого хвостового домену сіноретину.
При цьому, композиція для активації МК-клітин крім злитих зі стабілізуючим пептидом цитокінів може включати буфер, здатний підтримувати й зберігати химерний білок.
Більше того, даний винахід відноситься до набору для діагностики злоякісної пухлини, який включає щонайменше один химерний білок, обраний із групи, яка складається з інтерлейкіну 2, пов'язаного з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів, інтерлейкіну 12, пов'язаного з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів, інтерлейкіну 15, пов'язаного з пептидом із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із бо сімейства синуклегїнів, і інтерлейкіну 18, пов'язаного з пептидом с С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів. Як описано вище, при інкубації взятого від суб'єкта зразка крові з химерним білком у зразку крові активуються МК-клітини. Отже, активність МК-клітин у суб'єкта може бути виміряна кількісним визначенням виробленого в результаті активації МК- клітин інтерферону-у, таким чином первинно діагностуючи злоякісну пухлину шляхом класифікації суб'єктів, які мають більш низьку активність МК-клітин, чим активність у здорової людини, як підданих ризику захворювання злоякісною пухлиною або, що мають рецидив злоякісної пухлини пацієнтів.
Відповідно з одним ілюстративним варіантом здійснення пептид із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів може бути обраний з амінокислотних залишків 103- 115, амінокислотних залишків 114-126, амінокислотних залишків 119-140 ії амінокислотних залишків 130-140 С-кінцевого кислого хвостового домену а-синуклеїну, амінокислотних залишків 85-134 С-кінцевого кислого хвостового домену В-синуклеїну, амінокислотних залишків 96-127 С- кінцевого кислого хвостового домену у-синуклеїну й амінокислотних залишків 96-127 С- кінцевого кислого хвостового домену сіноретину.
Крім химерного білка такий набір для діагностики злоякісної пухлини може включати додаткові компоненти, які застосовуються для здійснення способу діагностики відповідно до даного винаходу, наприклад, антитіло для кількісного визначення секретуючих МК-клітинами цитокінів і підложку. Ці компоненти описані вище у зв'язку з набором для виміру активності МК- клітин. Також у набір можуть бути включені інструкції для застосування цих компонентів в описаному вище способі.
Зрозуміло, що ці й інші ознаки, аспекти й переваги кращих варіантів здійснення по даному винаходу будуть більш повно описані в наступних прикладах. Також слід розуміти, що ці приклади наведені лише з метою ілюстрації й не припускають обмеження обсягу даного винаходу. Фахівцеві в даній області буде зрозуміло, що інші аналоги й модифікації можуть бути здійснені без відхилення від заявленого обсягу даного винаходу.
Приклади
Приклад одержання 1: Побудова вектора експресії з химерним білком стабілізуючого пептиду-!іЇ.
Для одержання 1-2, 1-12 1/-15 або 1-18, злитого зі стабілізуючим пептидом, будували
Зо вектор експресії. Який містить амінокислотні залишки 119-140 с-синуклеїну (ЗЕО ІЮ МО: 24; названий далі "5Р") пептид використовували як стабілізуючий пептид. КДНК 112, І/12рз5,
І-12раб, 1-15 ї І-18 одержували шляхом виділення загальної РНК із лімфоцитів людини за допомогою набору для виділення РНК (Іпмігоп Віотесппоіоду) і зворотної транскрипції загальної
РНК за допомогою зворотної транскриптази (Іпмігодеп). Отриману в результаті кКДНнК використовували в якості матриці й ампліфікували за допомогою ПЦР із застосуванням наступних специфічних до кожного гена кДНК праймерів:
І 2-22-ВатН1-Е: АСАССАТОСССТАСТТСААСТТСТ (5ЕО ІЮ МО: 11)
І/2-153-Хпо-В: САСТО Тс,аАдатСсАдатСАа ТаттаАсАТ (5ЕО ЮО МО:12)
І.12-р40-23-ВатНн: сСТавйАТОСАТАТССААСТОаААсСАДАСЦАТОИЯ(ЗЕО ІЮ МО:13)
І.т2-р40-328-СТ-Ні: АТаСОТТаАТтадтадстасааасиаСАСАаАТа ССС (5ЕО 10 МО :14)
П.12-рІо-23-Ватн: СТаСАТОСАСААдАССсТоСССа,атаацо (5ЕО ІЮО МО:15)
І.12-рЗ5-219-СТ-Нії: АТаСТИАТаАТтТасаСспААдаСАТТСАСАТАСС(ЗЕО ІЮ МО:16)
І/15-49-Має: ОЗАЙТСААаСАТАТИААСТасватаААТИатАА (ЗЕО І МО:17)
І/15-162-Ватн-А: СТасАТССАСААСТаИттаАТОИААС (5ЕО ІЮ МО 18)
І/18-37-Ватн: сСТапАТССТАСТТТаССААДИаСтТтТа (ЗЕО ІЮ МО:19)
І/18-193-Есов1: АФАСТаСААТТССТАСТСТТСаТтттта (ЗЕО І МО:20).
Фіг. 1 є схематичним зображенням, яке демонструє конструкти химерних продуктів 5Р із зазначеними цитокінами, у тому числі 12, І.12рз35, І/12р40, 115 ї 1І/-18. Як показано на цій фігурі, химерний продукт Зр-пІ./2 будували шляхом послідовного субклонування генів, які кодують ампліфікований за допомогою ПЦР пПІЇ2 ії амінокислотні залишки 119-140 а-синуклеїну, в вектор експресії РКЗЕТА. Химерний продукт 5р-пІ-12р40 будували шляхом послідовного субклонування генів, якф кодують ампліфікований за допомогою ПЦР ПІІ 12р40 їі амінокислотні залишки 119-140 а-синуклеїну, в вектор експресії рм/ 1393. Химерний продукт 5Р-ПІЇ12рз5 будували шляхом послідовного субклонування генів, які кодують ампліфікований за допомогою
ПЦР пІСТ2р35 їі амінокислотні залишки 119-140 са-синуклеїну, в вектор експресії рмі 1393.
Химерний продукт ПІЇ15-5Р. пІ,/12р35 будували шляхом послідовного субклонування генів, які кодують ампліфікований за допомогою ПЦР ПІЇ/15 їі амінокислотні залишки 119-140 а- синуклеїну, в вектор експресії рРЕК5ЕТА. Химерний продукт 5Р-ПІ/18 будували шляхом послідовного субклонування генів, які кодують ампліфікований за допомогою ПЦР ПІІ 18 і амінокислотні залишки 119-140 а-синуклеїну, в вектор експресії РК5ЕТА. Послідовності всіх конструктів підтверджували за допомогою секвенування ДНК.
Послідовності нуклеїнових кислот і амінокислотні послідовності химерного продукту ЗР-ПІЇГ 2 викладені в 5ЕО ІЮО МО: 1 ії 2, відповідно. Послідовності нуклеїнових кислот і амінокислотні послідовності химерного продукту 5Р-ПІЇ12р40 викладені в 5ЕО ІЮ МО: З і 4, відповідно.
Послідовності нуклеїнових кислот і амінокислотні послідовності химерного продукту 5Р- п л2рз5 викладені в ЗЕО ІЮ МО: 5 і 6, відповідно. Як показано на Фіг. 1, послідовність із 6Х Нівз- міткою містилася в кожному векторі з метою виділення й очищення химерного продукту 5Р-
ПІСТ2р40 її химерного продукту ЗР-ПІЇ./12р35, які експресувались за допомогою вірусів.
Послідовності нуклеїнових кислот і амінокислотні послідовності химерного продукту ПІ 15-58 викладені в 5ЕО ІЮ МО: 7 і 8, відповідно. Також, послідовності нуклеїнових кислот і амінокислотні послідовності химерного продукту ЗР-ПІЇ18 викладені в 5ЕО ІЮ МО: 9 ії 10, відповідно.
Приклад одержання 2: Експресія й очищення рекомбінантного химерного білка 5Р
Побудований для експресії рекомбінантного білка 5Р-ПІІ 2 вектор експресії трансформували в ВІ 21(0ЕЗ)КІРІ. ЕзеНетісніа соїї (Іпмігодеп) і інкубували. Розчин культури центрифугували при 10000 об/хв. протягом 10 хвилин з одержанням клітинного осаду. Клітинний осад ресуспендовали в фосфатно-сольовому буферному розчині (РВ5, рн 7,4) і потім гомогенізували за допомогою руйнування ультразвуком. Експресований у нерозчинній формі в Е. соїї химерний білок 5Р піддавали процедурі рефолдингу й потім очищали за допомогою іонообмінної смоли.
Побудовані для експресії рекомбінантного білка ЗР-ПІ/12 два вектори експресії трансфікували в лінії клітин комахи, клітини 5121, з одержанням розчину вірусної культури, відповідно. Два отримані в результаті розчини вірусної культури одночасно трансфікували в лінії клітин комах 5121 з одержанням гетеродімерного білка ІІ 12р70, в якого ІІ 12р40 зв'язаний до І. 12р3з»5, та який потім очищали.
Побудований для експресії рекомбінантного білка пІ/15-5Р вектор експресії трансформували в ВІ 21(ОЕЗ3)КІРІ ЕЕ. соїї (Іпмйгодеп) і потім інкубували. Розчин культури центрифугували при 10000 об/хв. протягом 10 хвилин з одержанням клітинного осаду.
Клітинний осад ресуспендовали в РВЗ (рН 7,4) і потім гомогенізували за допомогою руйнування
Зо ультразвуком. Експресований у розчинній формі в Е. соїї химерний білок 5Р очищали за допомогою іонообмінної смоли.
Побудований для експресії рекомбінантного білка 5Р-ПІЇ/18 вектор експресії трансформували в ВІ 21(ОЕЗ3)КІРІ ЕЕ. соїї (Іпмйгодеп) і потім інкубували. Розчин культури центрифугували при 10000 об/хв. протягом 10 хвилин з одержанням клітинного осаду.
Клітинний осад ресуспендовали в РВЗ (рН 7,4) і потім гомогенізували за допомогою руйнування ультразвуком. Експресований у розчинній формі в Е. соїї химерний білок 5Р очищали за допомогою іонообмінної смоли.
Очищений химерний білок 5Р (3 мкг) піддавали електрофорезу в 15 95 ДСН-ПААГ для верифікації кінцевого очищеного білка (Фіг. 2; (а) білок 5Р-ПІ2 (АТСеп, кат. Мо АТОКОЗ4), (Б) білок ІІ 15-5Р (АТОеп, кат. Мо АТОКОВ) і (с) білок 5Р-ІІ 18 (АТОеп, кат. Мо АТОКО7)).
Експериментальний приклад 1: Верифікація різновидів цитокінів, здатних активувати МК- клітини в цільній крові 1 мл цільної крові від здорової людини й 1 мл середовища КРМІ1640 поміщали в 24- ямковий планшет для клітинної культури, змішували з 10 нг/мл кожного з рекомбінантних інтерлейкінов 1-2, 1-12, 1-15 і 11-18 людину й потім культивували протягом 24 годин. Після 24- годинного культивування забирали супернатант і вимірювали за допомогою способу ІФА по типу сендвіча кількість інтерферону-у у супернатанті (Фіг. ЗА). В результаті, секретуючі МК- клітинами цитокіни в зразку крові здорової людини не були визначені через їх малу кількость, але при обробці зразка крові щонайменше одним з І/-2, 1-12, 1-15 і 1-18 рівень секретуючих
МК-клітинами цитокінів у зразку крові підвищувався. При обробці зразка крові тільки стимулятором МК-клітин було видно, що рівень інтерферону-у у зразку крові підвищувався, особливо в оброблених 1І--2 і оброблених 1І--12 груп (фіг. ЗА).
Також, 1 мл цільної крові від здорової людини й 1 мл середовища КРМІ1640 поміщали в 24- ямковий планшет для клітинної культури, обробляли різними комбінаціями рекомбинантних інтерлейкінов людини, як показано на Фіг. ЗВ (10 нг/мл кожного), і культивували протягом 24 годин. Після 24-годинного культивування забирали супернатант і вимірювали рівень інтерферону-у таким самим способом, як описано вище. При обробці цільної крові різними комбінаціями стимуляторів МК-клітин було видно, що рівень інтерферону-у підвищувався, особливо в присутності ІІ -2--ІІ -12 (Фіг. ЗВ).
Додатково, для виміру рівня інтерферону-у після обробки комбінацією 1-12 і 11-15 цільну кров обробляли концентрацією стимулятора МК-клітин, як показано на Фіг. ЗС, і культивували протягом 24 годин. Після 24-годинного культивування забирали супернатант і рівень інтерферону-у вимірювали таким самим способом, як описано вище.
Для виміру рівня інтерферону-у після обробки комбінацією 1-12 і 1-18 цільну кров також обробляли концентрацією стимулятора МК-клітин, як показано на Фіг. ЗО, і потім культивували протягом 24 годин. Після 24-годинного культивування забирали супернатант і рівень інтерферону-у вимірювали таким самим способом, як описано вище.
Експериментальний приклад 2: Верифікація різновидів цитокінів, секретуючих штучно активованими за допомогою 1-2 МК-клітинами
Зразки цільної крові забирали від 61 здорової людини й від 50 хворих злоякісним захворюванням. 1 мл цільної крові й 17 мл середовища КРМІ1640 поміщали в 24-ямковий планшет для клітинної культури, обробляли 10 нг/мл рекомбінантного інтерлейкіну 5Р. 1-2 людини й потім культивували протягом 24 годин. Після 24-годинного культивування забирали супернатант і рівні інтерферону-у, ТМЕ-а і МІР-18 вимірювали за допомогою способу ІФА по типу сендвіча. В результаті підтверджували, що інтерферон-у і ТМЕ-а виділявся із цільної крові здорової людини в меншій кількості, чим такі у хворих злоякісною пухлиною, але МІР-14Д виділявся зі зразків цільної крові здорової людини й хворого злоякісною пухлиною, як показано на Фіг. 4.
У випадку застосовуваних для тесту на захворювання реактивів для діагностики іп мйто використовували ряд валідаційних методик. В цілому, відповідно до даного винаходу використовували нормальний діапазон і аналіз граничного значення. Нормальний діапазон являє собою еталонний діапазон, який використовували для виміру середнього значення й середньоквадратичного відхилення в кожної групи зразків, а аналіз граничного значення являє собою спосіб виміру клінічної чутливості й специфічності шляхом обчислення розрахункової величини діагностичного реактиву іп мій. Клінічна чутливість означає ймовірність, що визнається, як демонструюча позитивні результати діагностичного тесту у випадку, коли пацієнт страждає захворюванням, а клінічна специфічність означає ймовірність, що визнається, як демонструюча негативні результати діагностичного тесту у випадку, коли пацієнт не страждає
Зо захворюванням.
Припустимо, що якщо граничне значення складало більше 10 95 і менше 10 95, граничне значення, відповідно, установлювали для позитивних і негативних значень. Потім, клінічну чутливість і клінічну специфічність вимірювали за допомогою аналізу граничного значення.
Результати наведено в таблиці 1.
Таблиця 1 10011117 тмба | МіРлВ
Клінічначутливість(9б)д | 984 | -:( 909 17777771 (Клінічнаспецифічність(б) ї | 9850 2 «1 | 6950 | 50 (
Згідно з результатами вимірів у групах хворих злоякісним захворюванням і здорових людей
ІЕМ-у характеризується чутливістю 98,4 95 і специфічністю 98 95. Незважаючи на те, що згідно з результатами вимірів ТМЕ-са характеризується чутливістю 90,9 95 і специфічністю 69 95, які були нижче, чим в ІЕМ-у, розроблені на даний момент набори для діагностики злоякісної пухлини характеризуються специфічністю максимум 20-30 905. Таким чином, очікується, що ТМЕ-а, що характеризується специфічністю приблизно 70 95 або більше, також може бути використаний у якості маркера для наборів для діагностики злоякісної пухлини з метою виміру активності МК- клітин.
Експериментальний приклад 3: Порівняння стабільності 5Р 1-2 і 1-2
Для порівняння стабільності 5Р 1-2 і 1-2 від двох людей забирали зразки цільної крові. 1 мл від кожного отриманого зразка цільної крові й 1 мл середовища КРМІ1640 поміщали в 24- ямковий планшет для клітинної культури й потім додавали 5Р 1-2 і 1-2, ретельно перемішали, а потім культивували протягом 24 годин. Після 24-годинного культивування забирали супернатант і рівні інтерферону-у вимірювали за допомогою способу ІФА по типу сендвіча. За результатами аналізів активності ІЇ/-2 ї 5Р 1-2 було видно, що відмінність в активності двох білків було відсутнє (Фіг. 5А). Однак, при обробці цільної крові ЗР 1-2, а не 1-2, в умовах культивування цільної крові, відповідно, підтверджували, що МК-клітини активувалися 5Р І -2, таким чином підвищуючи рівень інтерферону-у (Фіг. 58). Це вказує на відсутність відмінності в активності двох білків, але стабільність ІІ -2 підвищується у зв'язку із застосуванням 5Р.
Експериментальний приклад 4: Порівняння активності МК-клітин від здорових людей і хворих злоякісним захворюванням стосовно умов стимулювання МК-клітин 1 мл кожного зі зразків цільної крові забирали від 20 здорових людей і від 48 хворих злоякісним захворюванням на термінальній стадії (стадія 3-4) ії 1 мл середовища КРМІ1640 поміщали в 24-ямковий планшет для культивування, кожний зразок розділяли на дві підгрупи і підгрупи обробляли 5Р 1І-2 (10 нг/мл) (умова А) і ЗР 1-2 (5 нг/мл) « 1-12 (5 нг/мл) (умова В), відповідно, і потім культивували протягом 24 годин. Після культивування забирали супернатант і вимірювали рівні інтерферону-у за допомогою способу ІФА по типу сендвіча.
У результаті було видно, що приблизно 9095 здорових людей мали високий рівень інтерферону-у, але більшість хворих злоякісним захворюванням мали низький рівень інтерферону-у у випадку умови А, як показано на Фіг. 6. У випадку умови В також було видно, що здорові люди мали високий рівень інтерферону-у, а більшість хворих злоякісним захворюванням мали низький рівень інтерферону-у. Однак, високий рівень інтерферону-у був вище у хворих злоякісним захворюванням у випадку умови В, у порівнянні з випадком умови А.
При обробці зразка цільної крові тільки 5Р 1-2 специфічно активувалися лише МК-клітини (див. наступний експериментальний приклад 5 і Фіг. 7), але МК-клітини були здатні активуватися разом з Т-клітинами при обробці зразка цільної крові комбінацією 5Р 1-2 ї 1-12 ї, отже, рівень інтерферону-у можна було підвищити за рахунок активації Т-клітин. Тому, вважають, що високий рівень інтерферону-у можна спостерігати в деяких хворих злоякісним захворюванням, у яких зберігається активність Т-клітин. Якщо хворі злоякісним захворюванням мають низький рівень інтерферону-у навіть при обробці відповідно до умови В, то можна зробити висновок, що у хворих злоякісним захворюванням були знижені протираковий імунітет МК-клітин і компоненти загального системного імунітету. Вважають, що це можна використовувати як важливий маркер для визначення й прогнозу прогресування злоякісної пухлини.
Експериментальний приклад 5: Порівняння активності МК-клітин від здорових людей і хворого злоякісним захворюванням при впливі ІІ 2 залежно від типу зразків крові
Для визначення відмінності здатності секретувати інтерферон-у при впливі 1/2 залежно від типу зразків крові від здорових людей здійснювали наступний експеримент. Вимірювали (а) здатність секретувати інтерферон-у в МК-клітин на 1 нг/мл І/2 від Т-клітин, (Б) здатність
Зо секретувати інтерферон-у в МК-клітин на 1 нг/мл 1/2 від МК-клітин, (с) здатність секретувати інтерферон-у в МК-клітин на 1 нг/мл 1/2 із цільної крові й (а) здатність секретувати інтерферон-у в МК-клітин залежно від концентрації І 2 від МКПК. Результати показані на Фіг. 7. Інтерферон-у вимірювали таким самим способом, як описано вище. У результаті, оскільки змінилася кількість інтерферону-у, секретуючого в результаті активації //2 Т-клітин, але вона не сильно відрізнялася від кількості інтерферону-у у не обробленої групи, то Т-клітини не були придатні для застосування у вигляді зразка крові. У цільній крові, МКПК ї МК-клітини мають значиму відмінність у кількості інтерферону-у у порівнянні з кількістю інтерферону-у у не обробленій групі. Тому, цільну кров, МКІПК і МК-клітини оцінювали як придатні зразки крові для застосування в способі й наборі відповідно до даного винаходу.
Експериментальний приклад 6: Порівняння активності МК-клітин від здорових людей при впливі ЛПС
Як інший приклад засобу, що служить для стимуляції МК-клітин у зразку крові й штучної активації МК-клітин до вироблення інтерферону-у, для виміру кількості інтерферону-у із цільної крові людини використовували ЛПС. Як показано на Фіг. 8, виявили, що секрецію інтерферону-у індукували за допомогою 50 нг/мл ЛПС, що вказує на те, що МК-клітини можуть бути штучно активовані до вироблення інтерферону-у навіть при стимуляції МК-клітин неспецифічним агоністом, таким як ЛПС.
Експериментальний приклад 7: Стимуляція МК-клітин за допомогою ПІЇ 12 і ПІІ 15, злитих зі стабілізуючим пептидом
У якості пробірки для інкубування МК-клітин здобували й використовували утримуючу антикоагулянт натрієву сіль гепарину пробірку (ВО) для запобігання згортання крові. Забирали 5 мл цільної крові й поміщали в утримуючу антикоагулянт (натрієву сіль гепарину) пробірку. 1 мл отриманої цільної крові змішали із середовищем КРІМ1640 і активаторами МК-клітин, туди ж додавали 5р-пІЇ2/11/12. Отриману в результаті суміш інкубували при 37 "С протягом 16-24 годин. Стимуляцію МК-клітин у цільній крові за допомогою злитого зі стабілізуючим пептидом ЗР
НПІІ.2 ї ПІ-12 визначили шляхом виміру кількості інтерферону-у у крові, інкубованій відповідно до описаного вище в експериментальному прикладі способу.
При цьому, вимірювали кількість секретованого інтерферону-у залежно від умов культивування цільної крові. Як показано на Фіг. 9, було виявлено, що здатність секретувати бо інтерферон-у в МК-клітин підвищувалася при інкубації МК-клітин в РВ5 з додаванням білка-
носія, такого як бичачий сироватковий альбумін, у порівнянні з тим, коли МК-клітини інкубували в РВ5.
Експериментальний приклад 8: Відмінність секреції інтерферону-у залежно від стадії прогресування злоякісної пухлини
Для визначення кількості секретованого інтерферону-у залежно від стадії прогресування злоякісної пухлини цільну кров від хворої злоякісною пухлиною пацієнтки 1 (пацієнтка повністю видужала від злоякісної пухлини молочної залози), хворого злоякісною пухлиною пацієнта 2 (хворого підозрою на захворювання злоякісною пухлиною мозку) і здорової людини інкубували протягом 24 годин у середовищі КРМІ1640 з додаванням 100 нг/мл 112 і 1000 нг/мл І 15 і вимірювали описаним вище способом кількості секретованого інтерферону-у. Також, цільну кров піддали проточній цитометрії.
У результаті, були підтверджені здатності секретувати інтерферон-у, по порядку, у здорової людини, хворої злоякісною пухлиною пацієнтки 1 і хворого злоякісною пухлиною пацієнта 2, як показано на Фіг. 10. Таким чином, було підтверджено, що кількості секретованого інтерферону-у залежно від стадії прогресування злоякісної пухлини відрізнялися. На підставі цих фактів, було видно, що спосіб відповідно до даного винаходу може бути використаний для виміру кількості секретованого МК-клітинами інтерферону-у у зразку крові, таким чином прогнозуючи ймовірність виникнення й стадію прогресування злоякісної пухлини або прогнозуючи рецидив злоякісної пухлини.
Експериментальний приклад 9: Кількісне визначення інтерферону-у, виробленого в результаті стимуляції МК-клітин
У якості пробірки для інкубування МК-клітин придбали й використовували утримуючу антикоагулянт натрієву сіль гепарину пробірку (ВО) для запобігання згортання крові. Від восьми здорових людей забирали по 5 мл цільної крові й поміщали в утримуючу антикоагулянт (натрієву сіль гепарину) пробірку. 1 мл отриманої цільної крові змішали із середовищем
ЕРІМ1640, туди ж додавали 5р-піІ12/ПІІ 15-5Р, зв'язаний зі стабілізуючим пептидом. Отриману в результаті суміш інкубували при 37 "С протягом 16-24 годин.
Інкубовану при 37 "С цільну кров від восьми здорових людей центрифугували при 1500- 2000 д з одержанням сироватки у вигляді супернатанту. Потім забирали 150-200 мкл сироватки
Зо й провели ІФА на інтерферон-у. Первинне антитіло з 0,05 9о твіну (моноклональне антитіло до інтерферону-у людини, Аїдеп, кат. Мо АТОКО2) розвели буфером для сенсибілізації поверхонь (0,1 карбонат натрію, рії 9,5) у співвідношенні 1:1000. Розведене первинне антитіло розділяли на 9б-ямковому титровальному мікропланшеті для ІФА (Мипс Махізогр; МОМС, Непервіл,
Ілінойс) з дозою по 100 мкл/лунка й залишили при температурі 4 "С на 16-18 годин. Після цього розчин видалили з планшета й промили планшет промиваючим розчином (утримуючим 0,05 95 твіну 20 РВ5) з дозою по 400 мкл/лунка. У цьому випадку промивання здійснювали три рази.
Потім, РВ5 утримуючий 10 95 фетальної бичачої сироватки (ФБС) розділяли з дозою по 300 мкл/лунка й витримали при кімнатній температурі протягом 1 години. Після цього розчин видалили із планшета і планшет промили РВ5Т (утримуючим 0,05 95 твіну 20 розчином РВ5) з дозою по 400 мкл/лунка У цьому випадку промивання здійснювали три рази. Покритий первинним антитілом 96-ямковий титровальний мікропланшет для ІФА герметично закрили й зберігали при 4 "С до застосування.
Стандартний розчин інтерферону-у (РВ5, що містить 200 нг рекомбінантного інтерферону-у людини (Аїдеп, кат. Мо ІР(ОС4001) і 0,05 95 Ргосіїп 300) розвели й розділяли 3 дозою по 100 мкл/лунка в покритому первинним антитілом 96-ямковому титровальному мікропланшеті для ІФА, і отриману на експериментальному етапі сироватку пацієнта розділяли з дозою 100 мкл/лунка, і потім витримали при кімнатній температурі протягом 2 годин.
Таблиця 2
ГТ 1 1 2 |з 41| 516 7 | 8 | 9 | о | 11 | 12
В Холостий |Холостий НІ Ні Ні ні ні нг Т0ні Ч0ні Чнб ін о 52 582 ні нг сні ні ні Ін Ін Тні Чнб н
Холостий: тільки буфер, 51-56: стандарт у серійних розведеннях, і НІ (невідомо): сироватка пацієнта
Через 2 години розчин з 96-ямкового титровального мікропланшета для ІФА вилучили й промили планшет промиваючим розчином з дозою по 400 мкл/лунка. У цьому випадку промивання здійснювали три рази. Потім, вторинне антитіло (біотиніловане моноклональне антитіло до інтерферону-у людини (Аїдеп кат. Ме АТОКОЗ)) розвели розчином для розведення в співвідношенні 1:500, розділяли з дозою по 100 мкл/лунка й потім витримали при кімнатній температурі протягом 1 години. Після цього розчин вилучили із планшета й планшет промили три рази промиваючим розчином з дозою по 400 мкл/лунка. Розчин кон'югованого з НАР стрептавідину (Тпепто Зсіепіййс, кат. Мо 21130) розвели розчином для розведення в співвідношенні 1:3000, розділяли з дозою по 100 мкл/лунка й потім витримали при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Потім, розведений розчин кон'югованого з НАР стрептавідину розділяли в планшеті для ІФА й інкубували протягом 1 години. Після одногодинного інкубування розчин з 96-ямкового титровального мікропланшета для ІФА вилучили й планшет промили три рази промиваючим розчином з дозою по 400 мкл/лунка.
Для готування розчину субстрату 1 мг тетраметилбензидину (ТМБ) розчинили в 1 мл диметилсульфоксиду (ДМСО) і отриману в результаті суміш розвели У мл 0,05 М фосфат- цитратного буфера. Потім, розчин субстрату розділяли по планшету з дозою по 100 мкл/лунка й витримали при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.
Розчин для зупинення реакції (2 н. розчин сірчаної кислоти в розчині для розведення) розділяли з дозою по 100 мкл/лунка для зупинення реакції й вимірювали отриманий у результаті реакційний розчин при 450 нм за допомогою Іфа-рідера.
Здатності секретувати інтерферон-у в МК-клітин, обмірювані із застосуванням цільної крові від восьми здорових людей, показані на Фіг. 11. Ці результати вказують на те, що при стимуляції цільної крові цитокіном присутні в крові імунні клітини ефективно активуються з індукцією секреції інтерферону-у.
Крім того, після стимуляції цільної крові від восьми здорових людей цитокіном цільну кров піддали проточній цитометрії. Отримані результати відображені на Фіг. 12. Виходячи із цих результатів, виявили, що МК-клітини проявляли цитотоксичність, оскільки МК-клітини були
Зо активовані в результаті стимуляції цільної крові. СО56 був маркером МК-клітин, а СО107а був маркером, що вказує на те, що МК-клітини секретували цитотоксичні гранули. Оскільки результати по секреції інтерферону-у на Фіг. 11 значимо корелювали з результатами по виробленої МК-клітинами цитотоксичності на Фіг. 12, було видно, що здатність секретувати інтерферон-у в МК-клітин у результаті стимуляції цільної крові опосередковано виражає цитотоксичність МК-клітин.
Відповідно до даного винаходу ймовірність виникнення й рецидив злоякісної пухлини можуть бути діагностовані за допомогою відстеження змін імунної системи іп мімо і виміру активності МК-клітин у крові, наприклад у суб'єкта, хворого злоякісною пухлиною, або з підозрою на злоякісну пухлину. Даний винахід може, таким чином, бути придатним для прогнозування ймовірності виникнення або рецидиву злоякісної пухлини із застосуванням зразка крові від суб'єкта.
Незважаючи на те, що в даному документі були розкриті ілюстративні варіанти здійснення, слід розуміти, що можуть бути можливі інші варіанти. Такі варіанти не будуть Вважатися відхиленням від об'єму ілюстративних варіантів здійснення даної заявки, і всі подібного роду модифікації, як це буде очевидно для рядового фахівця в даній області, маються на увазі як включені в об'єм наведеної далі формули винаходу.
Усі згадані в даному описі документи включені в нього за допомогою посилань.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІПОВНОСТЕЙ
Не АТГен Ко Лтя. «ІЩЕ С СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ ЗЛОЯКІСНОЇ НУХЛИНИ Й НАБІР ДЛЯ
АІАГНОСтТИКи ШЛЯХОМ ВИМІРУ АКТИВНОСТІ МКК ИиН
Іще Ба ЦО О сім КВОТ хз 2011-02-14 «І І «ІТ» Раеншв версія 3.5 «рі: і «дір» 474 хрії: ВМА «тії» Штучна послідовність. «ВК «23» химевна ходуюча послідонність РАВ З ках і дЕпевососів дозвіл досс Маїрзаатс сспогзасе алеерізіся пуасіясраа що ссірзавсся саісссстас Нсзавйсізсзазеваза сасассівся зсіввався 120
Наствсір зиілслраї дан слві ява пла анпасазравіссславстє 150 зссвавнесісвсВніза вн асвів сссдаЕНЛЕв сспсзвайсі вайдеВісМ О2- гарівістає авранразсіславосістс плрсанрівс ваанавсісзаяаврсзва З засінсасіізавасссар грасизвіс лдисазііся асшіазівнеістввазстя 0350 заевезієти зилтсяасас сліштрісва Пишствів ввасассвас сайшіяяаа ОСЛО ністазасх слівсвзнас сим рісза арсзісісісазенсів пра 474 «1» «Ре 157 хріз» РЕ еєдІ13» Штучних послідовність «ВК «23» химевний поліпептид Р-НІ «Я І
Меї Ар Рго Акр Аза 1 АБ Бук Сі Ме Рг ех Сі бів СТУ Тук 1 5 10 15 сп Авр Ту Сі Рго Стій Аїд іх ех Бо Тім За: Зех Зег ТВх Ї ух 20 25 50
Туз Ті сівтіен Сів тер сфй Невтецієніви Авр ев Стій МЕ Це 35 а 4х іс Ас оіу Пе Аза Аа УТ уз Ав Різ Гуз Бе Ті лі МТ Ті
ЗО 55 50
Ті Вел Ре Туг Ме Бгто лу Гу Аіз Тім ін Іецпіле Нізіс 55 то ее 5 спа сузІеп сі са Сі: Ів іль Ро Бенц Сі Сів Уа ев Асп ен
БА КЗ, 5
Аіаста Зекі ув Азп Ве Бе І еп Атк Рго Атс Арі еп Не Зек Ах іп0 таз 1106
Пе вп узі Пе У Гео См епі лз Су бек СВ Тім ТВ РНе міт 115 120 125 сСуз Сів тує Аз Ар С Тім АБ тіж Пе баг Ні РБе еп ав Аге 130 135 Іза
Тер Пе Тіх Рпе Су Сп Зет Пе Пе беї Тім Тез ТК 155 150 155 «іо З «р» 014 «212» БХА «тії» Штучна послідовність. «ВК «23» химевна кодуюча послізонвість ЗРАВІ І 2р «а З дшелоОосіВ зозВ(рливс Празар спос ясе дапевізіся прасіясрза 00 ссіввавссе взіссВЕіао спезасіваде знасзівні вевісвітов апа 20 ідесвелів ссссіврава виіенівзвіс сісзосіві: аспососівлп аразецівні 180 зісзесіноа ссірсзсса сарсарірар вісіаваисісіввсзадає ссірасса 0 7ЯЙ сазншісязар ав роара їссіввссаділсвосівіс зсазловасе севевнся 0300 звесайсвсісстрстисісслсзазазе вазелісвла івтссзствмайна НО заврдассзра лараасесва ззагаанвсс ПісізавВі рсванросза равНайсі 20 ковсвнНіся ссіостввіс ястваговзса зісзрісітв анірасап савіеаяа 0 550 зрсзЕСпЯзе всіспкствасссссзаврЕ відасівся Бассівстас веєтвтя ОМ дзЕпрадісз дароосасва сапрравіи ввріассввідслдіссса девисасвяї ВИЙ росівоссав сівсірансз вдвісіосс апрасутсніврізсвівс срісзсвав Об сісапрійіс ялялсівсаєс спроавсцно Ноаісзрее зсвісжпсяа ассівасеся 720 сссллрнасттЕсарсівах дссаняаае азс сес засів свасівесвя БО іїзссствсз ссішволстасіссасаиссіаснсісссівасвнсів Если 8-Й свдярсвава всзавлнася зазсаапові позі срсасаврвс спсарвосяов ЗК
Бісзвісттос вспаззаїєс савсайасс вірсвеносс зесассроста єівавса бо іспеовосе здісносціс івівсестс ес асліс аселісвста сівба МНК
ЕМ Ве ш-еЕ - Е «Б: А «1: 337 1» ВК «13» Штучна послідовність «п23» химерний посліпентнд ЗР-ВИ 1 2рао «Кк: 4
Ме Ар Ріо Авр Ам Си Аа Гт Сн Мет Рго Зех спр ах; СУ Тут 1 5 Но 15 сів Ар Бук Сн Ріо Січ Аза СТУ Зет Не Тірііціевіхв ля Ар
Зо Ма 30 тв Ту Ух Уві с Бей Авр Ітр Гук Его Ар Аа Рго іх Сім Меї 3 З зх магма ген Тім Су Ар Те Рів Сх Ста Ар у Пе Ти Ігр ТНг 0
Тева хроів есе ост УаТев сік бе Сітіх Тім іев ІК Ве 55 т 7 5
Сій Уві тує Сх Ре су Азр Аза су Сів Ті Тім Суз Ніз Гуз СОУ
Ку З; 25 сус Уа ес Бех Ніз Бетіеп епі ев ей Ні Бук Гу С Ахр іп їз 110
Су Це Тер бе ТВ Ар ЦеТетіле Ар сів Гуз Си Ріо Її у А 5 1:15 150 РІ
Туз Тік Ре Ген Атв Су Сій ЗІЗ ух ап Тут бек Сх Аг Ре Тіт 130 135 І4а
Су ігр Прієм ПН Тік Не зе лів Азріги Тін Ре бе Узі Був 155 150 155 150 ес Зег АтЕ Су ет Зв Ахр Бгто Спо сіх хі тій Суб СЯу Аа Аа 155 15 іТ5
Тішіги бег Аз єн Ак УЗ Агв Сік Ар авпіхв Сів Туга Тег 150 Ідх Не
Веб уві Сі Суз Сів сім бер бег Аза Сук Рго Ат Аа Ся Ст бек 155 о Зах
ТетРгоа Пес Угі Міеї Узі Ар Ав Уа БНЗІхз Ред бує ТУЮ С мо 215 220
Ази Бук ів бек яву Ре Ре Це Агв Яр Пе Пе уз Ріта Ав Ро
РівіхзАзпіспсіп епі ух Ріо Ген Був Ар бет Ага Спр Оу ві Си тах З 255 агат Тр Си Тут Рго Аве Ти Тір бе Тін Рто Ні Бех Буг Ріє бо 265 ТО чегГев Тім Ре Сх Уві св Узі Сі сх ув бег Гу Ате Са Ге
Ут5 ТВО 282
Гу аАкраАтв Узі Ве Тім Арі лк іх бег АЇз Тк а) Не Су Аге
ЗО 25 щю
Туз Ав Аз Зег Пе ех Уві Ате АЗС бр Ага Бут Буг беї Зег 305 Ба з15 Б,
Зех Тгр Зег сім Тгроаїз бах Уві Рез ЄС ув бех Ні Нив Ні Би Ні
НЕ
«рі х «11 аб «ді А «тії» Штучна послідовність. «Те «223» химерна ходуюча посліловність 5Е-ВН І 2вІ5
Сум х
Ввевсссів зсанацаес Пенал сспсіцтаво задевінся аваство вай 0 ссірзавсся саіссзизаа ссіссссвів восазсісспи ассєввсаа: писссаіює 120 єНезссаєтсссааалосі нсівасавсє вісзрсазса іссіссврва вдссавасяя 1850 засіставлаві іассенЕ спопсідах вав саєс вісппралі саслалавні О-Ю звазссзрса савіртанис сівасеса Посаанов ссааслпліва вавстет 0 засістаєзв азасИсап івісаєсааас ктіасНисе двосіссав зазваєсіст 0300
Ніхмедіра сссцпессіганіанізп моз авасіїсдава із ссаствраю 420 псазвасслівааірсаза допсівців сасссіянаа восазасн істашлісва ВО засаівстЕв сарпапеЗісардсіодів сзЕссссіва вінсазозв іван 5 ссвсзазаж: ссісссцва праассотат іНізіаала сіаанажова ясіствсяія ОО систе сшісарзаігспоптовнтс асізйспіа вврісцівлр сіяістваВі 0 бо всНнсссянс вісасспіса ссастий 657 «Віа» 6 «Вібз РК «1» Штучна послідовність «35» химерний поліпептид ЗАВ 12рва5 «ад» 6
Ме Азр Ріо Ар Ап Сіш Ав Тут СЯ Меї Рго Хех ССС У Тег 1 ї ці 15 са Ахо Бук Січ Рго Сі АЇх ОЇу Зег Аг Ап Ге Рго Уві Аз Тіт о 25 зо
Різ Ар орто Сі Ме Ре та Суз Беб Ні: Ні ех Сів Ап і евіец
З Я
Ахв Аїз Са Бех Ава Мет теп Сів Гу Аля Ав Св Тім Бек СТи РБе 2 5 О
Тує Его Су Тк Зег с сти Пе А ко Би «ДЕ Ар Пе Ті ГГ ув Ар аз 7 та Ко,
Був ТВ: чех Тв Усі Аз Суз без Ро Іеп сій еп Тім Іл Авп
З що 95
Ся бегсух ем Аді бег Акя Стій Тім 5ег Ре Це Ті Аза слу ет і 105 110 сук Беп аіз Бег Ах ух Тк Бех Ре Міс Ме Аізісп сСухвт еп Зеї 115 По 123
Бег Не ТУг Сів Ар Реп бує Мех Тугітій Узі Сім ВНе ув Тім Мігї 150 155 ЕюЮ зви АівІлвІвец еп а Ар то їх тв Ой Пе Ре Те Алр й 155 150 155 іа
Ав Меївеп ліз Уві Не Авросіц ів Ме сій Аїві ер ве Ре дев 165 170 174
Бегблм тів Уві Ра а Р. ув Бек Зекіев С Си Рго Ар Ве Тут 1850 135 І1З30
Бльіміле Неї Івен Су беїенів Ні: Аз Ре до Це Ага 195 зо ще
Аа Уві тіж Пе брата Уві Ме Чех Тут Бер Аза Аз Зег НИ Ні за 215 250
Ніз Ні Ні Не -узЕ й «рій 7 «11 480 ау» ПМА. «313» Штучна послідовність «о щух «233» химерна колуютта послідовність БІ .15-5Е «ак 7 асвасівше лавини хакттатів заазазани ас ісзВснии за сайте сізспема іасвосззаві ша стсзос ссавссяз вріласзвся 130 зідалрієсі пси ва лезвлн аніасно аск сврала ідсавтан 180 співвізсас пзвалалісє оВслосіа всязасааса НІС ЛСізлісосаяі ЗО
БІЗВСаБИЛІ стЕдцірсва дианвішівав шаастсаве запала івзаванні 30
Яссававц Пеізсацітіссвани Новісався спсісєвіс севісствяс 0 30 зпівзисси аієзадівсс йсісариза првіжсаав зсіасиазссіядавссіяв 20 мк В «1рх 158
«212» ВЕТ «3131» Штучна послідовність «Зк» «злі» химерний полпшептнд БІ.15-5Р
МегАвп тв уві Аза Уа Це бегАзпіго уз у ЦЕ С Арі 1 2 З 15
Не Сп бек Ме Ні Пе Ар АБ Тім еп Тут Ті Са бе Ар Уаї 80 75 Зо
Ніро ЗетСузіх Уві Тін зі Месії сте РвеТепіспісіігв
МЕ за чх
Сів Узі Пе бег Реп сій бек СЯх А вро Аз чех Пе Би Ар Тін Уві 50 25 що сій Аззіее Пе Неїерв ліз Ап А мі Зеті ек Заг бег Асі Сі Ас та а 50 чі Тв с бе сту Су І у Сів Ста Сб св 1 сі сін сін І уз А ет
Ж що а
Неї Сип Рнеїтеп с Зег РНе Улі Ні Це Уві Сів Ме: Біне Пе 100 105 110
Ав Ти Зег Сіу Зег Аяр Его Авр Аза Сі Аїз Туга Мі: Ріо Зег 115 1720 175
Спів ста СЛУ Тут сій Ар Та и Рго іа Аз 130 135 «2102 9 «2122 МА «833» Штучна посліловність «Ії» химерна кодуюча послідовність ЗРАВН ІВ
«УНде я аіпезсссіє зсавірчнес плісваатв сспсієзня завіса анлстасвда. 50 ссірзавсср вВісстспІірвсавеси дазнзавзіслиіся давала В2О авішаєсяде ПеСПсВІ рассаасва алісвност іаніравва їзівзства 150 їсірзсівіз вливіааис яссссрнясс ваз лава іа ізвавнівяс 0 Са садсстзнає списів васала к повазі яаюмютевс 0 пе ловаса ванпаніс співала зісадіссіЄ сізацтвсліспаявнвся 300 андарієлсевісивисп сплаєласішісесаввас півасявіва швівснай: 20 кажснея саіжеозаве зіаєнієз реп лірзза засзварвра сспцізая 80 станів зааладвиивіслацяссе даїевіствіашшисво опелляас ОЗ
Епадастия 545 «В 10 «рр 1853 «різ» РЕК «ЗІЗ» Штучна послідовність тему» «23» кимевний поліпентид БРА ІВ «У 10
Ме Аве Ріо Ар хв С із Бук Св Міеб Бгто Бех СИ Са Су Тег 1 З НО; 15
Сп Або Ту Си Ргоа СЯ Аа Сі Зет Тут Ре су Був Бен Ста ех зо іувіенаег ут Не Аг Ап ер ази Арій Уві їец Бе Пе Ар 35 І 45 сіп сіу А5п о Атв Рго Гео Ре Сх Ар Меї ТВх Ар Бек Ар Суз Ате а 35 о
Ар Ази Аз Ре Ага Тінб Пе Ріє Че Пе бе Мер Туті ле ар Зег ша а т ко
Сі Рг Ага Су Ме Аа Уа Тім Пе его узі Був суз Січ Їх Це
Бех Тіж ев Зег ух Св й ев Ел Пе Не ет Ре Гл (тр Міг Ази 100 125 Но
Рто Рго Аз Ап Неї те Ар Ті і ув Зег ав Пе Пе Ре Ре ста 115 1285 175
Ата бе УВІ Ріо сну НіЗ Азрова Т у Бек хів Ре Сі Зег г бег 130 132 о
Ту Спа СіЖ Бук Рпеїви Аз Єуг Сів ух Сів Ага Арі Ре Туя 145 їЕщ 155 15 тез Неїецпіхуз уз Сіл Азр Сп еп іх Авр Ато Хек Не Міех Ре і85 НО 175
ТУЯ Сі Авап Сто Ар 150 «ЕЙР 1 «оре 24 «ід» ОМА «152 Штучна посліловність «зо «ах прямий праймер1ії 3 33 Вані кабфе» 1 зсзведіссс сізспсзав Ще за «ЗЕ» 28 чіл х ПХА, «21352 Штучна лослідовніств «23352 зворотний пранмер 11.2-153-ХНа саспіседи іспасісві впевеВї 25
«різ 13 кВ 5 кіз» МА «1» Штучна лослідювність «Же прямий праймер 112 р 25-Назті «кщойх 13 шізовісси зіжрраасід зпразавне БУ «рік 14 «ре 32 хг БМА «313» Штучна нослілюнність «Оце «32» зворахний праймер 112-40-32 К-СТ-Нів «ка 1 агрегеаіва расвсави всасанаівс се 3 «АВ 15 «рії: 25 «хе МА «15» Штучна послідовність «у. щ пе с хоІ3- прямий праймер 12-05 23- Ватні «НИ» 15
БІвЕвжссля завссссе вівве йо кві 15 «8112 35 «2» ДМА, «315 Штучна послідовність «235» зворотний позимер 11123-535-319-СТ-НІв аа 15 зіпрісвіна їсваансяі ісвещаес ве; хорі: 17 «Гр 30 «різ» ВМА «813» Шітучна послілонність
«ЯМ» «діа» прямий праймер 11 .15-5-Маде «ад 17
Еарісавесвійизаєтв вів вва 30 «ІМ ІВ «ар За «13 Штучна послідовність «мух «дІ3» знаротний праймер 115-152 Вджні «щу» ІВ вБівсзісєпе завівнові дає ІА «ик 15 «арх Ла хві2 КА «213з Штучна послідовність «дах прямин праймер 1 15-37- Ватні «а 19
ЕІСЕМІССТВ СИМ ВрсаВВ СЕ 74 «АБ по «311 37 «іх ДЕК «різ» Штучне паслідовність ши 33» прямни пранмер 11.15-153-Есові ау» ЗО авасілезаі юставісй сеце 77 «М 1 «ие 130 «312» ВЕТ «рії» ою Заріеп: «Й25» альфа- синуклеїн людини
«аю» 21
МегАхр УВЕ Ре Меті ух Су еп бе ув А із іль сти Сіу М лаї 1 5 й іх
Аіз Аз Аза Сіл Туз ТВі ув св сте Уві Аа сти Аа Аа сп Бу а 25 30
Тл Сіх УаІвео тує УВІ Су бек хв Те Туз сій сх Кв
Зх що Ах
УаЕНів сх Уві Аа тіш Узі Аіз сім іль Тім уз са ств УВЕ ТЕ 0
Ап ут Су сСпу Аз ві ущі КВк Су хі Ті Аіз У Аз с ух 7 72 БО
Ти Уві Сів Су Аз Су Бех Пе АЇа АВ АД Ті у Ре Узії ув 53 За 95
Еуз Арі ги сік ух А ва сть Сх у АЛа Рто Стр сі Оу Це 150 10х 110
БГеп сів Авр Мебіто Уві Авр Ро Ар Аза С ліз Тут Ста Ме Его 115 120 125
Бегсли Сів Сі ТУ Сів Ар Тує Си Рго СЯ: Аз 130 135 1 «212» РЕТ «різ» Наша Заріете «225» альфа-сннуклеїн люлини залишки 103-115 кінцевого кнСлОогО хвостового домену «Вк 2
Ав ін ій Сіу Ав га Св Сів СПУ Пе еп Спо Ар і 5 і; «211» 23 «Рій РКТ «215» Бмпа баріепе «ох «233» альфа-єннуклеїн людини залишки 114-126 С -хінпевого кислого хвостового домену «ой» 23 сп Ар Ме Ро Уві Ар Ріо Ар ази Сі Аїа Ту й 1 5 10
Но Азр Ав С ліз ТУ СВ а «вій» за «вррх 22 «12 РКТ «315 Рмпо хадеп «235» альфз-сннуклеїн людини залишки 119-140 С -кінцевого кислого хвостового домену «щей» за
Авр Ро Аза Ада Сі АЇа Тут Са Мега Бех і: СО СУ Тух СВІ. і 5 їй 15
Ар Тут ОП Рго С АВ то «мі «віз: РЕТ «813 Ношто Хапоеи «ВИХ» зльфа-синуклеїн людннно залишки 130-140 С-кінцевого кислаго хвоставого домену
«ДЕ» 25
Стіва та СУ Тут Сів Ар Ти Рро ха Ада 1 т З «В 134 «212» ВЕТ «2139 Ното Заріепе «Хе «вих» йдета-сннуклеїн людини «ой» 26
Ме Азр уві ве МесІ ла Ск ем бе Ме АЇзль сс Уа ма 1 2 З іх
Аа Ах Аз Са іл Пн іл Сі Су Узі Ті си Аїз Аа См Гуз
ТВетуссімсіу Увіїє) Тух У Сіу ек бух Ти о Ате Сіл Спу УВІ
Уві са слу Уа Аа чег ул Дів сій же Бін Був Сн СН Аз Бе
Зо 5 що
Бівієч Сау СТУ Аа Уві Ре ет Су дів СУ Ази Не Аз ліз їз а 7 Ук БИ
Той ісп УМ уз Ат Вр ОТи Ріе Ріо Тім Ар еп уз Рго Св й 5 5 сій Узі Аа Сів Си Аіз Аз Ста СЯ Ріо еп Пе Сів Ро Гео Ве. іс 105 116 ста Рг Сх су Ста Зеї Туї Са Ар Рго Рго Св Січ Сів ТУ З 115 1720 125 сій Тук сій Рго Сі Аа 150
«іо 27 «81» 5) «21» РЕТ хві1ї» Ното заріеюа «83» дета-синуклеїн людини залишики 855-134 С кінцевого кислого хвостового домену «дю 27 ілв Ате сі ій Рре го Бім Аєр бе Гуз Ро с Сім Узі Ай Са 1 5 НЯ! 15
Сл Аїз Аз Сів ба Рхо Тез Пе Сов Рів Ева Мер би Рез с су 23 Б сім баг Гук Сів Авр Ро Рго Ср С: Си 13х Сів сій Тег СН Рід 3х аа 45
Сі їз 50 «1 ЗЕ «1 17 «МУ» РЕТ «2137 Ното Барне «ОЗ «223» тамма-сннуклеїн людини ісіноретнк «ак жа
Ме Азр Уві Рреїже ії хз Сх Ре беї Пе Аівіхз Сів су Уві ві 1 5 тю 15 су Аа УВІ сі ув їм Гуз Сіп біу Уві іш Ста Ада Аза ств Ех т 25 З
ТімІхз сів су уві МебТую У Сі Аз Бу Тім Гу ць Ав уві за 45 часі ек Уві м бе Узі Аійсівіяз Ті вуз СЯ іп Аа Ас
Ада ві Бех Сів Ав Уа Уа беєбек Узі Аза Тім Хі Ав ТВгІ1 дя 55 то 75 ко
Ті Узі св сів Аз Сік Аа Не Аз УМ ін Зег сі Узі Уві Ате
ВІ за 25
Був СО Арі ен Аге Рго бег Аза Ріо сив осі Сн Сх СТ Аів ех 100 105 110 ілз Оу є сів Уві АТ Єв Сів Аз (хв Бех СУ Чу Ар 115 120 125 «вій» зо «ар» 32 «211» Нота Заріене «о «823» гамма-сниуклеїн людини ссіноретині! залишки 965-127 С-юінбевога
ЕЩВСЛлЛОГО хВОСТОвОгОо ДОМменУу «ах 29
Ав і лз сі ар вел Ахте Ро Зет Аіз го Св Сів Сум Ну С Аа. 1 х 1 15
БегГже сін дв Сбв сім Ущі Аа ЄМ сх АТа сів бек Су ХУ Ар
Claims (22)
1. Спосіб виміру активності природних клітин-кілерів (МК), який включає: стимулювання МК-клітин у зразку цільної крові за допомогою інкубування зразка цільної крові засобом, що містить щонайменше один стимулюючий цитокін, вибраний з групи, що складається з інтерлейкіну 2, інтерлейкіну 15 та інтерлейкіну 18, таким чином штучно активуючи МК-клітини до вироблення і секреції секретуючих МК-клітинами цитокінів; і вимір кількості секретуючих МК-клітинами цитокінів, секретованих у зразку цільної крові, та застосування кількості як міри для оцінки активності МК-клітин; причому секретуючі МК-клітинами цитокіни містять інтерферон-гамма (ІЄМ-у), фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕ-а) або обидва з них; і причому, коли засіб містить інтерлейкін 18, засіб не містить інтерлейкін 12.
2. Спосіб за п. 1, де стимуляцію МК-клітин здійснюють за допомогою інкубування зразка цільної крові з інтерлейкіном 2.
3. Спосіб за п. 1, де стимуляцію МК-клітин здійснюють за допомогою інкубування зразка цільної крові з інтерлейкіном 2 і інтерлейкіном 12.
4. Спосіб за п. 1, де стимуляцію МК-клітин здійснюють за допомогою інкубування зразка цільної крові з інтерлейкіном 12 і інтерлейкіном 15.
5. Спосіб за п. 1, де стимуляцію МК-клітин здійснюють за допомогою інкубування зразка цільної крові з інтерлейкіном 15.
6. Спосіб за п. 1, де секретовані МК-клітинами цитокіни додатково містять макрофагальний білок запалення-13 (МІР-1рД).
7. Спосіб за п. 1, де секретованим МК-клітинами цитокіном є інтерферон-гамма (ІЕМ-у). Зо
8. Спосіб за п. 1, де секретованим МК-клітинами цитокіном є фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕ-а).
9. Спосіб за п. 6, де макрофагальний білок запалення-14ф8 (МІР-1р) застосовують як контрольну групу для порівняння активації МК-клітин з активацією в здорової людини.
10. Спосіб за п. 1, де вимір кількості секретованих МК-клітинами цитокінів здійснюють за допомогою імуноаналізу.
11. Спосіб за п. 10, де імуноаналіз являє собою твердофазний імуноферментний аналіз (ІФА).
12. Спосіб за п. 1, де щонайменше один стимулюючий цитокін знаходиться у формі химерного білка зі стабілізуючим пептидом.
13. Спосіб за п. 12, де стабілізуючий пептид являє собою пептид із С-кінцевим кислим хвостовим доменом із сімейства синуклеїнів.
14. Спосіб за п. 13, де стабілізуючий пептид містить амінокислотні залишки 103-115 (5ЕО ІЮ МО: 22), амінокислотні залишки 114-126 (5ЕО ІЮ МО: 23), амінокислотні залишки 119-140 (ЗЕО І МО: 24) або амінокислотні залишки 130-140 (5ЕО ІЮ МО: 25) С-кінцевого кислого хвостового домену а-синуклеїну, амінокислотні залишки 85-134 С-кінцевого кислого хвостового домену Д- синуклеїну (ЗЕО ІЮ МО: 27), амінокислотні залишки 1-127 у-синуклеїну (ЗЕО ІЮ МО: 28), або амінокислотні залишки 96-127 С-кінцевого кислого хвостового домену у-синуклеїну (ЗЕО ІЮО МО:
29).
15. Спосіб за п. 1, де етап стимулювання МК-клітин у зразку цільної крові, таким чином штучно активуючи МК-клітини до вироблення і секреції секретуючих МК-клітинами цитокінів, здійснюють у розчині (ліофілізованому або рідкому), що містить білок-носій.
16. Спосіб за будь-яким із пп. 1-15, де зазначений спосіб призначений для визначення ймовірності виникнення або рецидиву злоякісної пухлини.
17. Спосіб за п. 16, де зниження кількості секретованих МК-клітинами цитокінів у суб'єкта в порівнянні з рівнями в здорових людей є показником ймовірності виникнення або рецидиву злоякісної пухлини.
18. Спосіб за п. 1, де вимір активності МК-клітин включає порівняння виміряної кількості секретованих МК-клітинами цитокінів, секретованих у зразку цільної крові, з такою у здорової людини.
19. Спосіб за п. 1, де відстежують зміни активності МК-клітин.
20. Спосіб за п. 1, де стимулювання МК-клітин виконують шляхом інкубування зразка цільної крові з інтерлейкіном 2 або з інтерлейкіном 2 у вигляді химерного білка зі стабілізуючим пептидом.
21. Спосіб за п. 1, де стимулювання МК-клітин виконують шляхом інкубування зразка цільної крові з інтерлейкіном 15 або з інтерлейкіном 15 у вигляді химерного білка зі стабілізуючим пептидом.
22. Спосіб за п. 1, де щонайменше один стимулюючий цитокін знаходиться у формі химерного білка зі стабілізуючим пептидом, де химерний білок містить амінокислотну послідовність щонайменше з 95 95 ідентичністю стосовно амінокислотної послідовності ЗЕО ІО МО: 2, 8 або 10 або складається з неї.
Гр | во КЕ Шев ех КЕ СВБ
З. НЯ Чи (Да Е шо З | І о МЕ КОХ М ше Ве Ох : У За о и Фі:
А іх. КУ; зх х їй т їе ! У з я р. "ж ши шщи щу Ж У овау ; сяк с ЗЕМ ж Е г 3. КК ях і У У 1 ня у. Я щеня я РЕЖ З во й й й й С ТВ Ж Я їх ; й Й КЗ Я ЗА Е УНН У З йо я щ Ж Я Ж щ г з і ще : ; і Ї НН Я ОХ. ме НЕ Ще й не КК сення ик ше М З М: Вобйевнй ВО НЕ щі с: В М жан ЗО о ве Бо з о Ж ШЕ Ше ШЕ ШЕ «Фне З ТЕМедатта ТМЕ-аірна МІР-Зоеїа 7 В з щі з :
ШЕ .
Ж. і Б.Я Е і й г - хз з ши же ж ше шо о фрі дн.
г. В Е і- ї В КЕ ж ж ж І че ще Жкжжннй, | » В ннннтеуеснносссс ОВ ВВВВК.-. в не и в пн : г Я і ся Я й : г о Ф с г ск З
Х ЖК я ек ох ТЕ я сен Бех ня ї 65 ер Ох і хмекбює ВІКА о ї ; ї їх ох ТМ : ї ї й хух ; Кя зе : че Ї ї КЗ ї ї ї ду, | м КЕ. В Ж пд З Н йо: с ооо «в хх ї Як. Ма вне, НН ІЗ У х о Кн ов їх БУ ї о НЯ вена ФК Ш ре і ях, Ки щ і ес їй Оу ї ще с ши: ши: ши шк соч Кк ! 7 х що як т Ж М що ї й ах : Ж ЖК Н бак ше шЖЕ ї Я КОХ МУ ї в. Ж ГКУ їх Же У гу я Ї мкм сов Х З їх Шо кох ї Ки ї ї щ Б Б ї зу оче о і Ше вся шк - СЯ зов я Мі т Ж КОН х що Я х КИ Е ї їх ї х хе КЕ нн нн нн п нн нн ан о ання с як: жхх їх слух «ов. а кали су уко сх ому М кв що м: ке НН М ЖЕ КС В ОТ ОК КОНЦ ая смт Х ї Ж шо М хх. Е ж - К- сизу я З А : ше т що х Ї; Щш соя Е: са я жк ке ШИЯ ни шт : КО во г а С ща Ж ва щ І ту. ов Ех 5 - я Кк ьо жо Я ох ЩІ м пт Ох У Ж: ща у. ЕЕ: КУ Е: Не Г-Я її Ж : Е ЯН Ка ІЗ БІК Я я х Я І . я : КК Е Е: як і Я | ЮК. дк ре і їх 1 І ! Е З ж 5 ВВ Б ооо оо НИК я легіноорннй ДАК боснння не ооо оо ооо усссфювюмсе ї т я е ее ща й х М З Еш шк шк ек : ну дк гля сккстуєкіхе йде кумі - Кочцвнтуваців нем) іс но Концентваців охнаи
Умова А | Умова й а З Я Ве ов Ж а ВН - | с шк Ж «к х з ьо ХЕ. МО ег ща я хе
В. ше ЕЗ й з ке їх ж Ко Ж із ш ; як рн Ж нак Я тож 5 ж 14 зх "З з ро й Я Бай х м с жона а я тт У ї» Ф о гу " йо е М. пава СОКОЕНОЯВІ ПЕНЯ РЕК ВВЕ З. рем Заруренві зву і лацаєвк з регквя захноркваннях звхворювинняМ кв . Т-кеутини ще О00МКовнтини В о: : Н Ж: нн: Зх : | ро : пох : ОО в гої що хх: щЕ | : ше щ ши че | ще ож | « по пк рої 5 ват ! З ! їе ї з ро З ї і ! ! щ Цічьна кров Ше ше МКИК ї : ! Шо : З : їж | оо ше ШИ ши ро ї Ор АК ЗА : Ко ЕЗЩ РО дк С званих: : ше ' ши ще : ! Н Же І ч ї де : Я К ЕЕ і ЕЕ ві ! ЩЕ в ще І шк о Зої шк шк ОВ | | п : В їй шо В Х що Н ї Й Й в : ї їй о цЗагВе у ї нання: НН І Я а І НН бе чне
ДУ У У У У У УК УК У УМ У У У УК У У У У КУ У УА УК У У ККУ У Е й Е 5 Ж вки : : ав здорові люди .
Е. я і 3 «5 чи Ї ї з ше : 1 нич: !
С. - ЕВ: ї КЕ ШИ ї шу ща я ї Б щ- о.вБа ваш о.о15 | ше КУ ще ї Я х ; ЛИС інгма ї он Я Ж - Чи й ШИ скпевюр фо че ДКТИВВСЮ я Буфер дня розведення за ІДИ пе ув ке для розведені хх вктиватова як за о. о - Я зола КЕ: Я Е ТЯ ї й. о зесє : ; ще НК С еШ о. і. о - : З К: З х ї 8 Я ї З З ОО КО їі й і п ОО Щй ! а квккн З х З хх Е Кох хх Ї ох ЩЕ о ш : Е Бак 5 ЖЕ: КО БЕЗ Ез шк: їз : Я маш ї Й НК: ох сх З й в є Кк г Активатар: ДОЛЬ ге з КЗ
Фіг. З
ККУ т ЖК КК КК КК КК КК КК КАК КК КК АААААКЖЖЖЯ ревнива ка « жах 5 5. в лл л. сі Пацівні з ровом Націемг з раком Зморона люднна захаотнованням 7 здхвемкваннЯМ З їх Ж Фе о З и в по пох Б хх Ей КОП КН сх - ї х ж: -Х ОХ ж ї 8 ОК М ооо у о В со В я ХО «555 "7 1885 ракх І! Здовсона і Здерома ЯдОВНЯЗ ЗеОвя ща 3 ЗИОрОжх Гіеню Ех Ко ШЕ ПИ НИ Я В РЕ хх ї я ї я Ах ї ні Е Б А ж У : ря песен пики нн нн нн неашикннне пианнне х Я Е чик Ен и о Й ДеЖИИ МЕДИ НЕ зни м ШИ ШЕ: Я а: Уа Ще Я ак: шої : ЗК й ї Ї ак: ко : НЕ ни НИЄ ення Я її СЕ ШИЯ НЕ і г Не ії ах їі мае її З но п х сс її а ОК її оо КОТ, Не «А я ОК КК КІ с ХУ ХХ щих :ї й КУ А . т | ЗЕ. що сот: ВІЙ ще у М хх ЖК ТІ ї пен ї щООю шо п в -о ши ншшЕ: Чо п я дует, й однині, ЩЕ Дрю я с дров ОК ВІВ МО а КО СКК В то» їх М зна ом: ро уж Що ев м Ме Ж ХА ЕЕ ЗК М ЕН БЕЖ Б : Ж:
КЕ. : Б ей : п : Не шт гі веж ух ОКХ ї шах СТ ХО ї х ОХ ХО шк НІ КОМ КХ КО її хі В 4 і «3 : - В ТО ддуувку кю жу ники, со М маєток мують, м кн в НЕ М аткюу тато век виш х хх Бей Я Ен шт БОНН во - я М як є оо ота сонне сон кочате рів 13
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110012983A KR20120093002A (ko) | 2011-02-14 | 2011-02-14 | Ｎｋ 세포의 활성 측정을 이용한 암 진단 방법 및 진단 키트 |
| PCT/IB2012/000259 WO2012110878A2 (en) | 2011-02-14 | 2012-02-10 | Method of diagnosing cancer and diagnosis kit using measurement of nk cell activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA120697C2 true UA120697C2 (uk) | 2020-01-27 |
Family
ID=46672988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201310947A UA120697C2 (uk) | 2011-02-14 | 2012-02-10 | Спосіб виміру активності природних клітин-кілерів (nk) у зразку цільної крові |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11442069B2 (uk) |
| EP (1) | EP2676139B1 (uk) |
| JP (5) | JP6629497B2 (uk) |
| KR (3) | KR20120093002A (uk) |
| CN (1) | CN103370622B (uk) |
| AU (2) | AU2012219184A1 (uk) |
| BR (1) | BR112013020454B1 (uk) |
| CA (1) | CA2826053C (uk) |
| CL (1) | CL2013002361A1 (uk) |
| DK (1) | DK2676139T3 (uk) |
| EA (1) | EA038959B1 (uk) |
| ES (1) | ES2797549T3 (uk) |
| IL (1) | IL227952B (uk) |
| MX (1) | MX361731B (uk) |
| MY (1) | MY175351A (uk) |
| RU (1) | RU2635194C2 (uk) |
| SG (1) | SG192247A1 (uk) |
| TW (2) | TWI668445B (uk) |
| UA (1) | UA120697C2 (uk) |
| WO (1) | WO2012110878A2 (uk) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120093002A (ko) * | 2011-02-14 | 2012-08-22 | (주)에이티젠 | Ｎｋ 세포의 활성 측정을 이용한 암 진단 방법 및 진단 키트 |
| WO2015069187A1 (en) * | 2013-11-05 | 2015-05-14 | Agency For Science, Technology And Research | Bladder Carcinoma Biomarkers |
| JP6073417B2 (ja) * | 2015-06-26 | 2017-02-01 | チャ バイオテック カンパニー リミテッド | 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物 |
| WO2017204446A2 (ko) * | 2016-05-24 | 2017-11-30 | 울산대학교 산학협력단 | 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법 |
| KR101926166B1 (ko) * | 2016-05-24 | 2018-12-06 | 재단법인 아산사회복지재단 | 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법 |
| CN106085958A (zh) * | 2016-08-04 | 2016-11-09 | 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 | 一种nk细胞的制备方法 |
| CN107686828A (zh) * | 2016-08-04 | 2018-02-13 | 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 | 一种nk细胞无血清培养基 |
| CN106222140A (zh) * | 2016-08-04 | 2016-12-14 | 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 | 一种nk细胞无血清培养基及其配制方法 |
| SG11201906947SA (en) | 2017-02-17 | 2019-08-27 | Bristol Myers Squibb Co | Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof |
| KR102090698B1 (ko) * | 2017-08-24 | 2020-04-23 | 연세대학교 산학협력단 | 암의 진단, 모니터링, 또는 예후 예측을 위해 생체 외 인터페론-감마의 양을 측정하는 방법 |
| JP2022546486A (ja) * | 2019-08-29 | 2022-11-04 | ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | 細胞凍結保存培地 |
| EP4015526A4 (en) * | 2019-09-25 | 2023-01-04 | Leto Laboratories Co., Ltd | RECOMBINED INTERLEUKIN-15 ANALOG |
| WO2021108389A1 (en) * | 2019-11-29 | 2021-06-03 | Nkmax Co., Ltd. | Method of producing natural killer cells and compositions thereof |
| CN113533729A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-10-22 | 北京大学人民医院 | 一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法及其应用 |
| AU2022413768A1 (en) * | 2021-12-17 | 2024-06-13 | Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Limited | Sequences and methods for production of recombinant biological molecules in vesicles |
| KR20230156518A (ko) | 2022-05-06 | 2023-11-14 | (주)다이오진 | 엑소좀 내의 인터페론 감마 유전자 측정을 이용한 암 조기 진단 방법 및 진단 키트 |
| CN115247149B (zh) * | 2022-08-22 | 2023-06-16 | 华域生物科技(天津)有限公司 | 适用于nk细胞的培养基组合物及培养方法 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA888978B (en) * | 1987-12-04 | 1990-07-25 | Du Pont | Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxylterminal extension |
| KR100340091B1 (ko) * | 1993-08-09 | 2002-09-27 | 베르찌 이스트반 | 킬러세포개재세포용해를위한암세포감작용약학적제제 |
| EP0820299B1 (en) * | 1995-02-06 | 2002-04-24 | Genetics Institute, Inc. | Formulations for il-12 |
| US20060057651A1 (en) * | 2000-12-08 | 2006-03-16 | Bowdish Katherine S | Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof |
| WO2003016513A1 (en) | 2001-08-13 | 2003-02-27 | Junjiro Tsuchiyama | Epstein-barr virus-negative nk cell line |
| JP2005517389A (ja) * | 2001-11-20 | 2005-06-16 | アトゲン カンパニー リミティッド | 環境ストレス耐性を有する新規のペプチド及びこれを含む融合蛋白質 |
| WO2003082206A2 (en) * | 2002-03-26 | 2003-10-09 | Centocor, Inc. | Multiple sclerosis-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses |
| JP2004305095A (ja) | 2003-04-07 | 2004-11-04 | Limuloid Science Kk | 細胞活性化検出方法 |
| CN1297567C (zh) * | 2003-06-13 | 2007-01-31 | 马菁 | 具有抗肿瘤功能的双功能融合蛋白及其制备方法和应用 |
| WO2005014642A2 (en) * | 2003-07-21 | 2005-02-17 | Transgene S.A. | Novel multifunctional cytokines |
| WO2005013950A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Avanir Pharmaceuticals | Selective pharmacologic inhibition of protein trafficking and related methods of treating human diseases |
| US20050112130A1 (en) | 2003-11-05 | 2005-05-26 | Bhat Neelima M. | Enhanced B cell cytotoxicity of CDIM binding antibody |
| US20050203010A1 (en) * | 2003-11-14 | 2005-09-15 | Atgen Co., Ltd. | Novel peptides conferring environmental stress resistance and fusion proteins including said peptides |
| KR100565764B1 (ko) * | 2005-05-02 | 2006-03-28 | (주)에이티젠 | 환경 스트레스에 내성을 부여하는 신규한 펩타이드 및 이를포함하는 융합 단백질 |
| JP4653465B2 (ja) | 2004-10-25 | 2011-03-16 | 泰信 小林 | ナチュラルキラー細胞の増殖促進方法およびそれに用いる培養組成物 |
| WO2006110577A2 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-19 | Morningside Venture Investments Limited | Use of fril proteins for reducing the production of pro-inflammatory cytokines |
| WO2008013975A2 (en) * | 2006-07-28 | 2008-01-31 | The Research Foundation Of State University Of New York | Methods and kits for measurement of lymphocyte function |
| US20080138833A1 (en) * | 2006-12-07 | 2008-06-12 | Wyeth | Methods and compositions for assessing il-12 or the neutralization of il-12 in a sample |
| CA2675291C (en) | 2007-01-11 | 2017-05-23 | Novo Nordisk A/S | Killer ig-like receptor (kir) antibodies, formulations, and uses thereof |
| EP2048237A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-15 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences |
| KR20120093002A (ko) | 2011-02-14 | 2012-08-22 | (주)에이티젠 | Ｎｋ 세포의 활성 측정을 이용한 암 진단 방법 및 진단 키트 |
-
2011
- 2011-02-14 KR KR1020110012983A patent/KR20120093002A/ko unknown
-
2012
- 2012-02-10 RU RU2013141487A patent/RU2635194C2/ru active
- 2012-02-10 AU AU2012219184A patent/AU2012219184A1/en not_active Abandoned
- 2012-02-10 JP JP2013553044A patent/JP6629497B2/ja active Active
- 2012-02-10 MX MX2013009380A patent/MX361731B/es active IP Right Grant
- 2012-02-10 MY MYPI2013002917A patent/MY175351A/en unknown
- 2012-02-10 DK DK12747246.2T patent/DK2676139T3/da active
- 2012-02-10 ES ES12747246T patent/ES2797549T3/es active Active
- 2012-02-10 KR KR1020137031527A patent/KR101438573B1/ko active IP Right Grant
- 2012-02-10 EA EA201391187A patent/EA038959B1/ru unknown
- 2012-02-10 CA CA2826053A patent/CA2826053C/en active Active
- 2012-02-10 BR BR112013020454-0A patent/BR112013020454B1/pt active IP Right Grant
- 2012-02-10 EP EP12747246.2A patent/EP2676139B1/en active Active
- 2012-02-10 US US13/985,301 patent/US11442069B2/en active Active
- 2012-02-10 KR KR1020137006311A patent/KR101341538B1/ko active IP Right Grant
- 2012-02-10 UA UAA201310947A patent/UA120697C2/uk unknown
- 2012-02-10 CN CN201280008685.3A patent/CN103370622B/zh active Active
- 2012-02-10 WO PCT/IB2012/000259 patent/WO2012110878A2/en active Application Filing
- 2012-02-10 SG SG2013058375A patent/SG192247A1/en unknown
- 2012-02-14 TW TW101104742A patent/TWI668445B/zh active
- 2012-02-14 TW TW106103526A patent/TWI681191B/zh active
-
2013
- 2013-08-14 CL CL2013002361A patent/CL2013002361A1/es unknown
- 2013-08-14 IL IL227952A patent/IL227952B/en active IP Right Grant
-
2017
- 2017-03-31 JP JP2017069908A patent/JP6798922B2/ja active Active
- 2017-04-20 AU AU2017202628A patent/AU2017202628B2/en active Active
-
2019
- 2019-07-05 JP JP2019126244A patent/JP2019207242A/ja active Pending
-
2021
- 2021-12-06 JP JP2021197948A patent/JP2022043119A/ja not_active Withdrawn
-
2022
- 2022-03-10 US US17/691,391 patent/US20220229070A1/en active Pending
-
2023
- 2023-05-08 JP JP2023076634A patent/JP2023115006A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA120697C2 (uk) | Спосіб виміру активності природних клітин-кілерів (nk) у зразку цільної крові | |
| JP4532273B2 (ja) | 癌に関係するタンパク質 | |
| CN105492023A (zh) | Tspan 33是用于治疗b细胞霍奇金淋巴瘤的抗体靶向疗法的候选物 | |
| Mroczko et al. | Stem cell factor (SCF) and interleukin 3 (IL-3) in the sera of patients with colorectal cancer | |
| CN108414756A (zh) | 一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法 | |
| CN108414755A (zh) | 一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片 | |
| US7531634B2 (en) | Bladder matrix protein peptides and methods of detection of bladder cancer | |
| JPWO2007037538A1 (ja) | Ｓｐｏ１１遺伝子の治療的又は診断的用途 | |
| JPWO2007026960A1 (ja) | Ｍｏｃｓ３遺伝子の治療的又は診断的用途 | |
| WO2012133994A1 (ko) | Pauf 및 그의 결합 파트너를 상호작용을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법 | |
| NZ614345B2 (en) | Method and use for measurement of nk cell activity | |
| NZ710432B2 (en) | Method and use for measurement of nk cell activity | |
| JPWO2007037555A1 (ja) | Ｄｕｓｐ１５遺伝子の治療的又は診断的用途 | |
| JPWO2007037532A1 (ja) | Ｓｒｍｓ遺伝子の治療的又は診断的用途 |