KR20130032410A - Nk 세포의 활성 측정을 이용한 암 진단 방법 및 진단 키트 - Google Patents

Nk 세포의 활성 측정을 이용한 암 진단 방법 및 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NK 세포의 활성 측정을 통한 암 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 암이 생성되었을 때 체내에서 일어나는 면역 시스템의 변화를 혈액 내의 NK 세포의 활성을 측정함으로써 암의 생성 여부를 진단할 수 있다. 본 발명은 검사 대상자의 혈액을 이용하여 암의 생성 여부를 손쉽게 예측할 수 있게 해 준다.

Description

NK 세포의 활성 측정을 이용한 암 진단 방법 및 진단 키트{Method of diagnosing cancer and diagnosis kit using measurement of NK cell activity}
본 출원은 2011년 2월 14일에 출원된 한국특허출원 제2011-0012983호의 우선권을 주장하며, 이는 본 출원에 전체로서 참조를 위해 포함된다.
본 발명은 NK 세포의 활성 측정을 이용한 암 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.
NK 세포(natural killer cell)는 병원균 및 암세포를 제거하는 선천성 면역(innate immunity)에 관여하며, 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β) 및 그 외 적응성 면역(adaptive immunity)을 매개하는 물질들을 분비하는 것으로 알려져 있다. NK 세포가 다른 세포를 만나면, NK 세포의 MHC가 분자 작용을 통해 암세포처럼 MHC Class1이 없거나 바이러스에 감염된 세포와 같이 MHC Class 1의 형태가 비정상적인 경우 NK 세포 내부로 신호를 보내 이러한 비정상세포를 공격하는 시스템을 갖고 있다. 그러나, 여러 종류의 암에서는 이러한 NK 세포의 기능 및 분화 능력에 결함이 있는 것으로 보고되어 암 세포의 생존과 NK 세포의 활성이 밀접한 관련이 되어 있음이 알려져 있다. 따라서, 암 면역 치료를 위해 NK 세포의 수나 활성을 증가시키고자 하는 연구가 다양한 형태로 수행되어 왔다.
한편, 현재까지의 암 진단 방법은 CT, MRI, X선 등의 조영 이미지를 통해 암의 존재를 찾아내는 주를 이루고 있으나, 이러한 검사는 주로 환자가 통증이나 불편함으로 인하여 검사에 대한 적극적 의지를 갖고 있을 때 수행되며, 특정 조직에 국한하여 수행되기 때문에 암의 존재를 지나치기 쉬운 문제점이 존재한다. 혈액으로 암의 발생 가능성을 판별하는 방법이 또한 수행되고 있지만, 이는 전립선암, 대장암, 난소암, 췌장암, 간암 등에 대한 혈액 종양 표지자를 이용하는 것으로 암이 아니더라도 해당 장기에 병인이 있을 경우에는 양성으로 나타나기 때문에 사실상 암의 진단 방법이라고 하기에는 아직 한계가 있다. 항체를 이용하여 암을 진단하고자 하는 시도 또한 이루어지고 있으나 이 또한 일부 암에 국한되어 있다.
따라서, 다양한 유형의 암을 진단하기 위한 새로운 방법에 대한 요구가 계속되고 있다.
그러므로, 본 발명의 목적은 암의 진단 및 검증에서 사용될 수 있는 방법 및 그러한 방법에 유용한 키트 및 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 혈액 시료 내의 NK 세포를 자극하여 NK 세포가 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 단계; 및 상기 혈액 시료 내의 NK 세포 분비성 사이토카인의 양을 측정하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
특정 비제한적 구체예에서, 혈액 시료는 전혈, 말초혈액단핵세포(PBMCs) 또는 NK 세포일 수 있다.
추가의 구체예에서, NK 세포의 자극은 혈액 시료를 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18 중 적어도 하나의 자극성 사이토카인 또는 그들의 조합과 함께 배양하거나, 혈액 시료를 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 폴리 I:C(polyinosinic:polycytidylic acid)와 함께 배양함으로써 수행될 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 NK 세포 분비성 사이토카인은 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양괴사인자-알파(TNF-α) 또는 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β)를 포함할 수 있다.
상기 방법의 추가의 비제한적 구체예에서, 상기 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β)는 NK 세포의 활성을 정상인과 비교하기 위한 대조군으로 사용될 수 있다.
또한, 특정 구체예에서, 상기 방법은 안정화 펩타이드와 융합된 하나 이상의 자극성 사이토카인을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 안정화 펩타이드는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리(Acidic tail amino acid sequence of alpha-synuclein, ATS) 도메인 펩타이드일 수 있다. 그러한 구체예에서, 상기 안정화 펩타이드는 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미본 발명에 따르면, 암이 생성되었을 때 체내에서 일어나는 면역 시스템의 변화를 혈액 내의 NK 세포의 활성을 측정함으로써 암의 생성 또는 재발 여부를 진단할 수 있다. 본 발명은 검사 대상체의 혈액 시료를 이용하여 암의 생성 또는 재발 여부를 손쉽게 예측할 수 있게 해 준다.노산 잔기 103-115(서열번호 22), 아미노산 잔기 114-126(서열번호 23), 아미노산 잔기 119-140(서열번호 24), 아미노산 잔기 130-140(서열번호 25), β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 85-134(서열번호 27), γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 28) 또는 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 29)를 포함할 수 있다.
추가의 구체예에서, 혈액 시료 내의 NK 세포를 자극하여 NK 세포가 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 단계는 운반 단백질(carrier protein), 예를 들어, 혈청 알부민 단백질을 함유하는 배지 중에서 수행될수 있다.
상기 기술된 방법은 암의 생성 또는 암의 재발을 탐지하기 위해 특히 유용하다. 그러한 구체예에서, 정상 개체에서의 레벨과 비교한 대상체에서의 NK 세포 분비성 사이토카인의 양의 감소는 암의 생성 또는 재발의 표지자이다.
본 발명의 추가의 측면에서, NK 세포의 활성 측정을 위한 키트가 제공된다. 상기 키트는 혈액 시료 내의 NK 세포를 자극하여 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제를 포함할 것이다. 추가로, 상기 키트는 암의 생성 또는 재발을 탐지하는 것을 포함하여 상기 기술된 방법을 수행하기 위해 유용할 것이다.
상기 키트의 추가의 비제한적 구체예에서, 상기 NK 세포 분비성 사이토카인은 인터페론-감마 (IFN-γ) 또는 종양괴사인자-알파(TNF-α)일 수 있다.
추가의 구체예에서, NK 세포를 자극하여 인터페론 감마를 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제는 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18 중 하나 이상을 포함하는 적어도 하나의 자극성 사이토카인, LPS 또는 폴리 I:C를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 키트는 항 IFN-γ 항체, 항 TNF-α 항체 및 항 MIP-1β 항체 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 방식으로 제한하고자 하는 의도 없이, 상기 키트는 또한 정상 개체에서의 레벨에 대한 대상체에서의 NK 세포 분비성 사이토카인의 양을 비교하기 위한 설명서를 포함할 수 있으며, 여기에서 대상체에서의 NK 세포 분비성 사이토카인의 레벨에서의 감소는 암 생성 또는 재발의 표지자이다.
본 발명의 추가적 측면에서, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 도메인 펩타이드와 결합되어 있는 사이토카인을 포함하는 융합 단백질이 제공되며, 여기에서 사이토카인은 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 또는 인터루킨 18이다.
상기 융합 단백질의 특정 비제한적 구체예에서, 상기 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 도메인 펩타이드는 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 103-115(서열번호 22), 아미노산 잔기 114-126(서열번호 23), 아미노산 잔기 119-140(서열번호 24), 아미노산 잔기 130-140(서열번호 25), β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 85-134(서열번호 27), γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 28) 및 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 29) 중에서 선택되는 것인 융합 단백질.
상기 융합 단백질을 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
추가로, 상기 기술된 융합 단백질 또는 상기 기술된 조성물을 포함하는 암 진단 키트가 또한 제공된다.
특정 비제한적 구체예에서, 상기 기술된 암 진단 키트는 또한 항 IFN-γ 항체, 항 TNF-α 항체 및 항 MIP-1β 항체 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 80 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 여기에서 또한 제공된다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열에 대하여 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 포함하는 더 높은 퍼센트 상동성을 가질 수 있다.
상기 기술된 융합 단백질 및 폴리펩타이드를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드가 또한 제공된다. 예를 들어, 올리고 뉴클레오타이드는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 염기 서열에 대한80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 상보체(complement)가 제공된다. 그러한 올리고뉴클레오타이드는, 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 염기 서열 또는 그의 상보체에 대하여 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 포함하는 더 높은 퍼센트 상동성을 가질 수 있다.
상기 기술된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 그러한 벡터 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 숙주세포가 제공된다.
본 발명은 암과 NK 세포의 상관성을 이용하여 암의 생성을 진단하는 방법, 키트 및 시약에 관한 것이다.
이를 위해, 본 발명은 혈액 시료 내의 NK 세포를 자극하여 NK 세포가 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 단계; 및 상기 혈액 시료 내의 NK 세포 분비성 사이토카인의 양을 측정하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 암 환자들에서는 NK 세포의 활성이 떨어져 있다는 점에 착안하여 NK세포의 활성을 측정하여 암의 생성 여부를 일차적으로 선별(screening)해 낼 수 있을 것이라는 점에 착안하였다. 여기에서 기술된 방법은 단순히 혈액 시료 내의 NK 세포의 수나 혈액 시료 내에 원래 존재하던 사이토카인의 양을 측정하는 것이 아니라, 혈액 시료 내에 존재하는 NK 세포에 인위적으로 자극을 가하여 NK 세포 분비성 사이토카인의 양적 변화의 탐지를 통해 NK 세포의 활성화 정도를 측정함으로써 NK 세포가 정상적으로 그 기능을 발휘하고 있는지 확인할 수 있는 방법을 제공한다. 기존에는 NK 세포의 활성화 정도를 측정하는 방법으로서, 예를 들어, 표적 특이적 세포독성측정법인 51Cr 방출 측정법(51Cr release assay)을 이용하여 왔으나, 이러한 방식으로 NK 세포의 활성을 측정할 경우 방사성동위원소를 사용해야 하고, 측정 및 분석이 어렵고 복잡하며, 비경제적이다. 그러므로 암의 생성 여부를 간단하게 진단할 수 있는 1차적인 암 선별검사 방법으로 사용하기엔 부적합하다. 반면, 본 발명에서는 NK 세포를 자극하여 NK 세포가 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 하고, 이러한 NK 세포 분비성 사이토카인을 정량함으로써 NK 세포의 활성을 측정할 수 있기 때문에, NK 세포의 활성이 저하된 대상체를 암 생성 환자 또는 그러한 가능성이 있는 대상체로서 선별해 낼 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 혈액 시료는 이에 제한되는 것은 아니나, 대상체로부터 채취한 전혈, 말초혈액단핵세포 또는 NK 세포일 수 있다. 전혈 대신 말초혈액단핵세포 또는 NK 세포 그 자체를 이용할 수도 있으나, 전혈을 이용하는 것이 방법이나 비용 면에서 바람직하다. 한편, 본 발명에 있어서, 대상체란 암의 생성 또는 암의 재발이 의심되거나, 암이 생성 또는 암의 재발 여부를 알아 보고자 하는 포유동물을 의미한다.
혈액 시료 내에 존재하는 NK 세포는 일반적으로 비활성화된 상태로 존재한다. 본 발명에서는 이러한 혈액 시료 내 NK 세포를 자극하여 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제로서 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인, 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 폴리 I:C(poly I:C)를 이용할 수 있다. 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15, 인터루킨 18, 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 폴리 I:C(poly I:C)는 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 자극하는 것으로 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, NK 세포의 자극은 혈액 시료를 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인과 함께 배양하거나, 혈액 시료를 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 폴리 I:C(poly I:C)와 함께 배양함으로써 수행될 수 있다.
한 구체예에서, NK 세포의 자극은 혈액 시료를 인터루킨 2와 함께 배양함으로써 수행되는 것일 수 있다. 인터루킨 2는 T 세포가 분비하는 사이토카인으로서 체내 적응면역반응에 있어서 T 세포에 의한 NK 세포의 활성화에 관여하는 것으로 알려져 있으며 시험관 내에서 NK 세포를 활성화 시키기 위해 일반적으로 많이 사용되는 사이토카인이다. 따라서 상기 NK 세포의 자극은 혈액 시료를 인터루킨 2와 함께 배양함으로써 수행될 수 있다.
또 다른 구체예에서, NK 세포의 자극은 혈액 시료를 인터루킨 2 및 인터루킨 12와 함께 배양함으로써 수행되는 것일 수 있다. 초기 암의 경우에는 NK 세포의 활성이 낮아도 T 세포의 활성은 높을 가능성이 있는 반면, 말기 암의 경우에는 NK 세포의 활성뿐만 아니라 T 세포의 활성도 낮아질 가능성이 있다. 인터루킨 12는 NK 세포의 활성화뿐만 아니라 T 세포의 활성화에도 관여한다. 따라서, 인터루킨 12를 인터루킨 2와 함께 처리하게 되면 NK 세포에 의해 분비되는 사이토카인에 T 세포 자극에 의해 분비되는 사이토카인이 더해지게 되므로 NK 세포의 항암 면역력뿐만 아니라 환자의 전체적인 면역력을 평가할 수 있고, 이는 암의 진행 정도 또는 암의 치료 예후를 나타내는 지표의 역할을 할 수 있게 된다. 인터루킨 15와 인터루킨 18 또한 활성화된 수지상세포와 대식세포 등에서 분비되는 사이토카인으로서 체내 선천면역반응 과정에서 NK 세포의 활성화 및 증식을 유발한다. 특히 인터루킨 12를 인터루킨 15 또는 인터루킨 18과 조합할 경우에 상대적으로 적은 양을 사용하여 NK 세포 분비성 사이토카인의 분비를 유도할 수 있다. 따라서 혈액 시료를 인터루킨 12 및 인터루킨 15, 또는 인터루킨 12 및 인터루킨 18과 함께 배양함으로써 NK 세포의 자극을 효과적으로 수행할 수 있다.
본 발명에서 NK 세포의 활성을 측정하기 위한 척도로 이용되는 것은 NK 세포 분비성 사이토카인의 수치이다.본 발명에 있어서, NK 세포 분비성 사이토카인이라 함은 NK 세포에 의해 분비되는 사이토카인으로서 특히 인위적 자극에 의해 NK 세포가 활성화되면 분비되는 사이토카인을 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 NK 세포 분비성 사이토카인은 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양괴사인자-알파(TNF-α) 및 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β)로부터 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인일 수 있다. 인터페론 감마는 NK 세포, 수지상 세포, Tc 세포, Th1 세포 등에 의해 분비되며, 암의 제어에 대한 선천성 면역과 적응성 면역에 중요한 역할을 하는 사이토카인으로 알려져 있다. 종양괴사인자-알파(TNF-α) 또한 암세포를 죽일 뿐만 아니라, 대식세포와 같은 세포에 작용하여 세균과 같은 외부 침입자들을 죽이는 역할을 하며, T 세포의 활성을 유도하고, B 세포에 작용하여 항체 생산을 위한 보조인자로 작용한다. 따라서, 예를 들어, 인터페론 감마나 종양괴사인자-알파의 수치가 정상인에 비해 낮은 경우 암의 제어를 위한 NK 세포의 활성에 문제가 있음을 나타낼 수 있으므로, 인위적으로 활성화시킨 NK 세포로부터 분비된 인터페론 감마나 종양괴사인자-알파의 양을 정상인의 인터페론 감마나 종양괴사인자-알파의 양과 비교함으로써 NK 세포의 활성을 판단할 수 있게 된다.
한편, 상기 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β)는 NK 세포의 활성화를 비교하기 위한 대조군으로 사용될 수 있다. 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β)는 NK 세포를 인위적으로 활성화시키더라도 정상인과 암 환자에서 동일하게 높게 분비되는 양상을 나타낸다. 따라서, 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β)는 정상인과 암 환자에서의 NK 세포의 활성을 분석하거나, 암 진단 키트의 분석에서 대조군으로 사용할 수 있다.
NK 세포 분비성 사이토카인의 양을 정량하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인터페론 감마의 양을 정량하고자 할 경우, 이에 제한되는 것은 아니나 인터페론 감마 효소결합면역검사(Interferon gamma ELISA)를 이용하여 수행할 수 있다.
한편, 혈액 시료 내 NK 세포를 자극하여 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제로서 사용되는 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인은 안정화 펩타이드와 결합된 융합 단백질의 형태일 수 있다.
안정화 펩타이드가 결합되어 있는 융합 단백질의 형태의 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 또는 인터루킨 18은 야생형의 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 또는 인터루킨 18과 비교할 때 생물학적 활성도는 비슷하면서도 높은 저장안정성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 이러한 안정화 펩타이드와 결합시켜 사용할 경우 사이토카인은 동결건조와 같은 환경적인 변화에도 불구하고 안정성을 유지하며 본래의 활성을 보유하게 된다.
상기 안정화 펩타이드는 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 또는 인터루킨 18의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있으며, 이러한 융합 단백질의 제조는 공지의 융합 단백질 제조방법을 이용할 수 있다.
한 구체예에서, 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 또는 인터루킨 18과 결합될 수 있는 안정화 펩타이드로는 이에 제한되는 것은 아니나, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리(Acidic tail amino acid sequence of alpha-synuclein, ATS) 영역 펩타이드를 사용할 수 있다. 대한민국 등록특허 10-0506766호에서는 ATS 펩타이드가 융합 파트너 단백질에 환경 스트레스에 대한 내성을 부여함에 대해 보고하고 있다.
한 구체예에서, 상기 안정화 펩타이드는 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 103-115, 아미노산 잔기 114-126, 아미노산 잔기 119-140, 아미노산 잔기 130-140, β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 85-134, γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127 및 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127 중에서 선택되는 안정화 펩타이드를 사용할 수 있다. 본 발명에서 ATS 펩타이드의 서열, ATS 펩타이드 및 이를 포함하는 융합단백질의 제조 방법에 대해서는 상기 대한민국 등록특허 10-0506766호에 개시된 방법을 사용할 수 있다. 하기 실시예에서는 ATS 펩타이드와 융합된 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 또는 인터루킨 18이 매우 안정하며, T 림프구의 활성화에 대해 야생형과 유사한 활성을 나타냄을 보여준다.
한 구체예에서, 혈액 시료 내의 NK 세포를 자극하여 NK 세포가 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 단계는 운반 단백질(carrier protein)을 함유하는 배지 중에서 수행될 수 있다. 운반 단백질은 NK 세포를 자극하여 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제로서 사용되는 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15, 인터루킨 18 등의 사이토카인을 보다 안정화시켜주는 역할을 함으로써 NK 세포가 보다 많은 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 운반 단백질은 소혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민일 수 있다.
한편, 상기 NK 세포의 활성을 측정하는 방법은 암의 생성 또는 암의 재발을 선별하기 위해 사용되는 것일 수 있다.
인위적으로 활성화시킨 NK 세포로부터 생성된 NK 세포 분비성 사이토카인의 양을 정상인의 사이토카인의 양과 비교함으로써 NK 세포의 활성을 측정하게 되는데, 이 때 NK 세포 분비성 사이토카인의 양이 정상인의 NK 세포 분비성 사이토카인의 양보다 적은 경우 NK 세포의 활성이 저하되어 있는 것이므로, 이 경우 대상체에서의 암의 생성 또는 암의 재발 가능성을 의심할 수 있게 된다. 정상인에 비해 NK 세포의 활성이 저하되어 있는 경우, 대상체는 일차적으로 암 의심 환자 또는 암 재발 환자로 분류될 수 있으며, 일반적으로 수행되고 있는 암 진단을 위한 CT, MRI, PET 등의 추가적인 진단법과, 최종적인 조직 검사를 통해 암을 진단하거나 암의 재발을 진단하게 된다. 비록, 본 발명에 따른 방법은 암을 확진할 수 있는 방법은 아니나, 암의 생성 또는 재발 가능성을 혈액으로부터 일차적으로 선별해 낼 수 있다는 점에서 큰 이점을 제공한다.
본 발명은 또한 혈액 시료 내의 NK 세포를 자극하여 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제를 포함하는 NK 세포의 활성 측정용 키트를 제공한다. 이러한 NK 세포의 활성 측정용 키트는 앞서 설명한 NK 세포의 활성을 측정하는 방법을 간편하게 실시할 수 있게 해 준다.
상기 NK 세포의 활성 측정용 키트에 있어서, NK 세포를 자극하여 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제는 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인, 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 폴리 I:C (poly I:C)일 수 있다.
이러한 암 진단 키트에는 NK 세포를 자극하여 NK 세포가 인터페론 감마와 같은 NK세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제 외에도, NK 세포의 활성 측정을 위한 추가적인 구성요소, 예컨대 NK 세포 분비성 사이토카인 정량을 위한 항체, 기질 등을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 키트는 항 IFN-γ 항체, 항 TNF-α 및 항 MIP-1β 항체로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 항체는 바람직하게는 고체 기질상에 고정된다. 항체는 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 고체 기질로 세포 배양 플레이트, ELISA플레이트, 튜브 및 폴리머성 막을 들 수 있다. 이외에도, 막대, 합성 글래스, 아가로우스 비즈, 컵, 플랫 팩(flat packs) 또는 그 외의 고체 지지체에 의해 지지되거나, 이러한 것들에 부착된 막이나 코팅을 갖는 것들이 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 인터페론 감마와 같은 NK 세포 분비성 사이토카인을 선택적으로 인식하는 항체와 함께 면역학적 분석에 사용되는 시약을 포함할 수 있다. 상기 면역학적 분석은 본 발명 항체에 대한 항원의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoa bsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 침강소 반응법, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한가지(예를 들어, PBS) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 락텍스에 금속을 도금한 자성미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지로는 효소, 형광물질, 발광물질 및 방사성 물질 등을 사용할 수 있다. 효소로는 퍼옥시다아제, 알카린포스파타아제, β-D-갈락토시다아제, 글리코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있으며, 형광물질로는 플루오르신이소티옥시아네이트, 피코빌리프로테인 등을 사용할 수 있고, 발광물질로는 이소루시놀, 루시제닌 등을, 방사성 물질로는 I131, C14, H3 등을 사용할 수 있다. 그러나, 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인이 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합되어 있는 융합 단백질을 제공한다. 앞서 설명한 바와 같이, 이러한 융합 단백질은 NK 세포를 자극하여 NK 세포가 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제로 사용할 수 있으며, 이들은 야생형의 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 또는 인터루킨 18에 비해 동결건조나 장기적인 보관 등의 환경 변화에도 불구하고 높은 안정성을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 인터루킨 2와 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드가 결합되어 있는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 융합 단백질은 인터루킨 12와 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합되어 있는 것일 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 융합 단백질이 인터루킨 15와 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합되어 있는 것일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 융합 단백질이 인터루킨 18과 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합되어 있는 것일 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질에 있어서, 상기 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드는 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 103-115, 아미노산 잔기 114-126, 아미노산 잔기 119-140, 아미노산 잔기 130-140, β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 85-134, γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127 및 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질의 NK 세포 활성화를 위한 용도를 제공한다. 앞서 설명한 바와 같이 이러한 융합 단백질은 혈액 내의 NK 세포를 활성화시켜 NK 세포 분비성 사이토카인의 분비를 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 2, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 12, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 15 및 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 융합단백질을 포함하는 NK 세포 활성화용 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드는 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 103-115, 아미노산 잔기 114-126, 아미노산 잔기 119-140, 아미노산 잔기 130-140, β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 85-134, γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127 및 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127 중에서 선택되는 것일 수 있다.
한편, 상기 NK 세포 활성화용 조성물에는 안정화 펩타이드와 융합된 사이토카인 외에도 이러한 융합 단백질을 보관, 저장할 수 있는 완충액 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 2, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 12, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 15 및 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 융합 단백질을 포함하는 암 진단 키트를 제공한다. 앞서 설명한 바와 같이, 대상체로부터 채취한 혈액 샘플과 상기 융합 단백질을 함께 배양하면 혈액 샘플 내의 NK 세포가 활성화되므로, NK 세포의 활성화에 따라 생성된 인터페론 감마를 정량함으로써 대상체의 NK 세포의 활성을 측정하고, 이로부터 NK 세포의 활성이 정상에 비해 감소되어 있는 대상체를 암의 생성 또는 암의 재발 가능성이 있는 환자로 분류하는 일차적인 수준의 암 진단이 가능하다.
한 구체예에서, 상기 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드는 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 103-115, 아미노산 잔기 114-126, 아미노산 잔기 119-140, 아미노산 잔기 130-140, β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 85-134, γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127 및 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127 중에서 선택되는 것일 수 있다.
이러한 암 진단 키트에는 상기 융합단백질 외에도, 본 발명의 진단 방법의 수행을 위한 추가적인 구성요소, 예컨대 NK 세포 분비성 사이토카인의 정량을 위한 항체, 기질 등을 포함할 수 있다. 이에 대해서는 NK 세포 활성 측정용 키트에 대해 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 상기 및 그 외 목적, 특징 및 장점은 하기 도면을 참조로 하여 그의 예시적인 구체예들을 상세히 기재함으로써 당업자에게 보다 명확해 질 수 있다.
도 1은 hIL2, hIL12, hIL15 및 hIL18을 비롯한 사이토카인의 N 말단 또는 C 말단에 SP 펩타이드가 융합된 융합 산물을 보여주는 모식도이다.
도 2는 정제된 SP 융합 단백질의 전기영동 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 NK 세포를 단일 사이토카인으로 자극할 경우(도 3A) 또는 복합 사이토카인으로 자극할 경우(도 3B 내지 3D) 인위적으로 활성화된 정상인의 NK 세포의 활성을 인터페론 감마의 생성량 분석을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 4는 인위적으로 활성화된 NK 세포로부터 분비된 사이토카인들을 sandwich ELISA 법을 통해 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 SP IL-2와 IL-2 간의 단백질 활성(A) 및 안정성(B)을 비교한 결과를 보여준다.
도 6은 SP IL-2 (10ng/ml)(Condition A)과 SP IL-2(5ng/ml)+IL-12(5ng/ml)(Condition B)를 처리한 정상인 및 암 환자에서의 NK 세포의 활성을 비교한 결과를 보여준다.
도 7은 T 세포, NK 세포, 전혈 및 PBMC에서의 IL2의 자극에 따른 NK 세포의 인터페론 감마 분비능을 보여주는 그래프이다.
도 8은 LPS에 의해 자극된 정상인의 NK 세포로부터 분비된 인터페론 감마의 분비량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 9는 배지의 조성에 따른 차이와 처리하는 IL12와 IL15의 농도에 따른 NK 세포의 인터페론 분비능의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 10은 암의 진행 단계에 따른 인터페론 감마의 분비량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 11은 사이토카인에 의해 자극된 정상인의 NK 세포로부터 생성된 인터페론 감마를 ELISA 플레이트를 이용하여 분석한 결과를 보여준다.
도 12는 사이토카인에 의해 자극된 정상인의 전혈에 대한 유세포 분석 결과를 보여준다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[ 실시예 ]
제조예 1: 안정화 펩타이드 - IL 융합 단백질의 발현벡터 제조
안정화 펩타이드가 융합된 IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-18의 제조를 위해 발현벡터를 제조하였다. 안정화 펩타이드로는 알파-시누클레인의 아미노산 잔기 119-140으로 이루어진 펩타이드(서열번호 23; 이하, “SP”라고도 나타냄)를 사용하였다. IL2, IL12p35, IL12p40, IL15와 IL-18 의 cDNA는 인간의 임파구로부터 Total RNA Extraction Kit (인트론바이오테크놀로지)를 이용하여 total RNA를 분리한 다음, 역전사효소(invitrogen)를 이용하여 얻었다. 얻어진 cDNA를 템플레이트로 하여 각각의 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다.
Figure pct00001
도 1은 hIL12,IL12p35, IL12p40, IL15와 IL-18 를 포함하는 사이토카인의 N 말단에 SP 펩타이드가 융합된 구조를 보여주는 모식도이다.
SP-hIL2 융합 제조물은 pRSETA 발현벡터에 PCR로 증폭된 hIL2와 알파-시누클레인의 아미노산 잔기 119-140을 코딩하는 유전자를 연속적으로 서브클로닝하여 작제하였다.
SP-hIL12p40 융합 제조물은 pVL1393 발현벡터에 PCR로 증폭된 hIL12p40와 알파-시누클레인의 아미노산 잔기 119-140을 코딩하는 유전자를 연속적으로 서브클로닝하여 작제하였다. SP-hIL12p35 융합 제조물은 pVL1393 발현벡터에 PCR로 증폭된 hIL12p35와 알파-시누클레인의 아미노산 잔기 119-140을 코딩하는 유전자를 연속적으로 서브클로닝하여 작제하였다.
hIL15-SP 융합 제조물은 pRSETA 발현벡터에 PCR로 증폭된 hIL15와 알파-시누클레인의 아미노산 잔기 119-140을 코딩하는 유전자를 연속적으로 서브클로닝하여 작제하였다.
SP-hIL18 융합 제조물은 pRSETA 발현벡터에 PCR로 증폭된 hIL18와 알파-시누클레인의 아미노산 잔기 119-140을 코딩하는 유전자를 연속적으로 서브클로닝하여 작제하였다.
모든 작제물은 DNA 시퀀싱에 의해 그 서열을 확인하였다.
SP-hIL2 융합 제조물의 염기 서열 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 1 및 2로 나타내었다. SP-hIL12p40 융합 제조물의 염기 서열 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 3 및 4로, SP-hIL12p35 융합 제조물의 염기 서열 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 5 및 6으로 나타내었다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 바이러스에 의해 발현되는 SP-hIL12p40 융합 제조물과 SP-hIL12p35 융합 제조물에는 분리, 정제를 위해 6X His-태깅 서열이 포함되어 있다. hIL15-SP 융합 제조물의 염기 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 7 및 8로 나타내었다. SP-hIL18 융합 제조물은 융합 제조물의 염기 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 9 및 10으로 나타내었다.
제조예 2: 재조합 SP 융합 단백질의 발현 및 정제
재조합 SP-hIL2 단백질을 발현시키기 위해 제조한 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)RIPL (Invitrogen)에 각각 형질전환 시킨 후 배양하였다. 배양액을 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 획득하고, 상기 세포를 인산완충용액 염수(PBS, pH7.4)에 재현탁한 다음 초음파 처리에 의해 파괴시켰다. 대장균에서 불 용성 발현된 SP 융합 단백질은 재접힘 과정을 거친 후, 이온 교환 수지를 이용하여 정제하였다.
재조합 SP-hIL12 단백질을 발현시키기 위해 제조한 발현벡터 2종을 각각 곤충세포 sf21 세포에 형질주입하여 바이러스 배양액을 생산하였다. 생산된 2종의 바이러스 배양액은 동시에 곤충세포 sf21 세포에 감염시켜 IL12p40과 IL12p35가 결합된 헤테로다이머 IL12p70 단백질을 정제, 생산하였다.
재조합 hIL15-SP 단백질을 발현시키기 위해 제조한 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)RIPL (Invitrogen)에 각각 형질전환 시킨 후 배양하였다. 배양액을 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 획득하고, 상기 세포를 인산완충용액 염수(PBS, pH7.4)에 재현탁한 다음 초음파 처리에 의해 파괴시켰다. 대장균에서 가용성 발현된 SP 융합 단백질은 이온 교환 수지를 이용하여 정제하였다.
재조합 SP-hIL18 단백질을 발현시키기 위해 제조한 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)RIPL (Invitrogen)에 각각 형질전환 시킨 후 배양하였다. 배양액을 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 획득하고, 상기 세포를 인산완충용액 염수(PBS, pH7.4)에 재현탁한 다음 초음파 처리에 의해 파괴시켰다. 대장균에서 가용성 발현된 SP 융합 단백질은 이온 교환 수지를 이용하여 정제하였다.
정제된 SP 융합 단백질(3ug)을 15% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동하여, 최종 정제된 단백질을 확인하였다(도 2; (a) SP-hIL2 단백질 (ATGen, Cat# ATGK04), (b) IL15-SP 단백질 (ATGen, Cat# ATGK06), (c) SP-IL18 단백질 (ATGen, Cat# ATGK07)).
실험예 1: 전혈에서 NK 세포를 활성화할 수 있는 사이토카인의 종류 확인
정상인의 전혈 1ml과 RPMI1640 media 1ml를 24웰 세포 배양 플레이트에 넣은 후 재조합 인간 인터루킨인 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 각각 10ng/ml과 잘 섞은 다음 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상청액을 취하여, sandwich ELISA 법을 이용하여 인터페론-감마의 양을 측정하였다(도 3A). 그 결과, 정상인의 혈액 시료 내에서는 NK 세포 분비성 사이토카인이 매우 미미한 양으로 존재하여 그 양이 측정되지 않는 것과는 달리, 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인를 처리할 경우, 혈액 내의 NK 세포 분비성 사이토카인의 양은 증가하였다. NK 세포 자극제를 단독 처리하였을 때, 특히 IL-2 처리군과 IL-12 처리군에서 혈액 시료 내 인터페론-감마의 양이 크게 증가하였음을 알 수 있다(도 3A).
또한, 정상인의 전혈 1ml과 RPMI1640 media 1ml를 24 웰 세포 배양 플레이트에 넣은 후 재조합 인간 인터루킨을 도 3B와 같이 다양한 조합으로 처리(각각 10ng/ml)한 다음 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상청액을 취하여 같은 방법으로 인터페론 감마의 양을 측정하였다. NK 세포 자극제를 다양한 조합으로 처리하였을 때에는 특히 IL-2+IL-12 조건에서 인터페론-감마의 양이 크게 증가함을 확인할 수 있었다(도 3B).
추가로, IL-12와 IL-15 조합 처리에 따른 인터페론-감마의 양을 측정하기 위해 도 3C와 같은 농도로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상청액을 취하여 같은 방법으로 인터페론-감마의 양을 측정하였다. 그 결과, IL-12와 IL-15 조합 조건에서도 인터페론-감마의 양이 증가함을 확인할 수 있었다(도 3C).
또한, IL-12와 IL-18 조합 처리에 따른 인터페론-감마의 양을 측정하기 위해 도 3D와 같은 농도로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상청액을 취하여 같은 방법으로 인터페론-감마의 양을 측정하였다. 그 결과, IL-12와 IL-18 조합 조건에서도 인터페론-감마의 양이 증가함을 확인할 수 있었다(도 3D).
실험예 2: IL -2로 인위적으로 활성화된 NK 세포로부터 분비된 사이토카인의 종류 확인
정상인 61명과 암환자 50명으로부터 전혈을 채취하였다. 전혈 1ml과 RPMI1640 media 1ml를 24 웰 세포 배양 플레이트에 넣은 후 재조합 인간 인터루킨 SP IL-2 10ng/ml를 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상청액을 취하여 sandwich ELISA 법으로 인터페론-감마, TNF-α, MIP-1β의 양을 측정하였다. 그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 인터페론-감마와 TNF-α 의 경우, 정상인 보다 암환자에서 낮게 분비되는 반면, MIP-1β의 경우 정상인과 암환자 모두에서 높게 분비됨을 알 수 있었다.
질병검사에 사용되는 체외진단용 시약의 경우 여러 가지 검증 기법이 사용되며 주로 normal range와 cut- off 평가법이 사용된다. Normal range는 reference range로서 시료의 각 그룹의 평균값과 표준편차를 측정하는 방법이고, cut-off 평가법은 체외진단시약의 추정 값을 계산하는 방법으로 임상적 민감도와 임상적 특이도를 측정하는 방법이다. 임상적 민감도(clinical sensitivity)는 환자가 질병에 걸렸을 경우, 진단 검사의 결과가 양성으로 나올 확률을 의미하며, 임상적 특이도(clinical specificity)는 환자가 질병에 걸리지 않았을 경우, 진단 검사의 결과가 음성으로 나올 확률을 의미한다.
10% 이상을 양성/ 10%미만을 음성으로 cut-off을 설정하여 보았을 때 cut-off 평가법을 이용하여, 임상적 민감도와 임상적 특이도를 측정한 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure pct00002
암환자와 정상인 그룹에서 IFN-감마의 경우 민감도 98.4%, 특이도 98%로 측정되었다. TNF-알파의 경우 민감도 90.9%, 특이도 69%로 측정되어 비록 IFN-감마에 비해서는 민감도나 특이도가 낮지만, 현재까지 개발된 암 진단 키트의 경우 특이도가 20~30%에 지나지 않기 때문에 특이도가 70%에 이르는 TNF-알파 또한 NK 세포의 활성 측정을 통한 암 진단키트의 지표로서 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
실험예 3: SP IL -2와 IL - 2 의 안정성 비교
SP IL-2와 IL-2간의 안정성을 비교 시험하기 위하여 두 사람으로부터 전혈을 채혈하였다. 채혈한 전혈1ml과 RPMI1640 media 1ml를 24웰 세포 배양 플레이트에 넣은 후 SP IL-2와 IL-2를 넣고 잘 섞은 다음 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상청액을 취하여, 샌드위치 ELISA 법으로 인터페론-감마를 측정하였다. IL-2와 SP IL-2 activity assay 결과, 이들 두 단백질의 활성에는 큰 차이가 없었다(도 5A). 그러나 전혈배양 조건에서 IL-2 보다 SP IL-2를 처리하였을 때 SP IL-2에 의해 NK 세포가 인위적으로 활성화되어 생산된 인터페론의 양이 더 증가하였음을 확인할 수 있다(도 5B). 이것은 이들 두 단백질의 활성은 차이가 없었지만, SP를 적용시킨 IL-2의 안정성이 증가하였음을 보여주는 결과이다.
실험예 4: NK 세포의 자극 조건에 따른 정상인과 암 환자의 NK 세포의 활성 비교
정상인 20명과 3~4기의 말기암 환자 48명으로부터 채혈한 전혈 1ml를 RPMI1640 media 1ml를 24웰 배양 플레이트에 넣은 다음, 각각의 샘플을 두 개의 조건으로 나누어 SP IL-2 (10ng/ml)(Condition A)과 SP IL-2(5ng/ml)+IL-12(5ng/ml) (Condition B)를 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 상청액을 취하여 sandwich ELISA 방법으로 인터페론-감마의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, condition A의 경우 정상인의 약 90% 정도에서 인터페론-감마의 수치가 높은 반면, 암 환자는 대부분 낮은 인터페론 감마 수치를 나타내었다. condition B의 경우에도 정상인은 높은 인터페론-감마 수치를 나타낸 반면, 암 환자는 대부분 낮은 인터페론 감마 수치를 나타내었으나, condition A와 비교할 때 condition B의 암 환자에서의 인터페론 감마 수치가 더 높았다. SP IL-2 단독 처리시 NK 세포만을 특이적으로 활성화시키는 것과는 대조적으로(하기 실험예 5의 도 7 참조), SP IL-2+IL-12 조합 처리시 T 세포의 활성화도 함께 일어날 가능성이 있고 이에 의해 T 세포의 활성화에 의한 인터페론-감마의 양의 증가 가능성이 있다. 따라서 T 세포의 활성이 남아 있는 일부 암 환자의 경우 인터페론-감마의 수치가 높게 나오는 경우가 존재할 것으로 사료된다. 만약 Condition B 조건에서도 인터페론 감마의 수치가 낮게 나온 암 환자는 NK 세포의 항암 면역력뿐만 아니라 체내의 전반적인 면역력이 감소했음을 유추할 수 있을 것으로 예상된다. 이는 암 진행 정도, 또는 암의 치료 예후를 판단하는 중요한 지표로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
실험예 5: 혈액 시료의 종류에 따른 IL2 에 의한 정상인과 암환자의 NK 세포의 활성 비교
정상인의 혈액 시료의 종류에 따른 IL2에 따른 인터페론 감마의 분비능의 차이를 알아보고자 하였다. (a) T 세포에서의 1ng/ml IL2에 대한 NK 세포의 인터페론 감마 분비능, (b) NK 세포에서의 1ng/ml IL2에 대한 NK 세포의 인터페론 감마 분비능, (c) 전혈에서의 1ng/ml IL2에 대한 NK 세포의 인터페론 감마 분비능 및 (d) PBMC에서의 IL2 농도에 따른 NK 세포의 인터페론 감마 분비능을 측정하고, 그 결과를 도 7로 나타내었다. 인터페론 감마의 측정은 위의 방법과 동일하다. 그 결과, T 세포에서는 IL2의 자극에 의한 인터페론 감마의 변화가 있긴 하나 무처리군과 차이가 크지 않아 혈액 시료로 삼기에는 적당하지 않았으며, 전혈, PBMC, NK 세포에서는 무리처군과 비교할 때 인터페론 감마의 양이 큰 차이를 나타내어 본 발명의 방법 및 키트에 적용하기에 적합한 혈액 시료로 평가되었다.
실험예 6: LPS 에 의한 정상인의 NK 세포의 활성 비교
혈액 시료 내의 NK 세포를 자극하여 인터페론 감마를 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제의 또다른 예인 LPS를 이용하여 사람의 전혈에서의 인터페론 감마의 양을 측정하였다. 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 50ng/ml LPS에서 인터페론 감마의 분비가 유도 되었음을 알 수 있고 이러한 결과는 LPS 와 같은 비특이적 자극제로 NK 세포를 자극해도 인터페론 감마를 생성하도록 NK 세포를 인위적으로 활성화시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실험예 7: 안정화 펩타이드와 hIL12 및 hIL15 의 융합에 의한 NK 세포의 자극
NK 세포 배양용 튜브는 혈액의 응고를 막기 위해 항응고제인 sodium heparin이 첨가되어 있는 튜브 (BD)를 구입하여 사용하였다. 항응고제(sodium heparin)가 들어있는 튜브에 5ml의 전혈을 채취하여 준비하였다. 채취한 5ml의 전혈 중 1ml의 전혈을 RPMI1640 배지와 섞었다. NK 세포 활성화제(SP hIL2/hIL12를 첨가하였다. 16-24 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 안정화 펩타이드가 융합된 SP hIL2와 hIL12에 의해 전혈 내에 존재하는 NK 세포가 자극이 되었는지는 상기 기술된 방법에 따라 배양된 혈액 내 인터페론 감마의 양을 측정하였다.
한편, 전혈의 배양 조건에 따른 인터페론 감마의 분비량을 측정하였다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, PBS 에서 배양을 할 경우에 비해 사이토카인을 안정화시켜주는 역할을 하는 소혈청알부민과 같은 운반 단백질을 보충해 준 PBS 중에서 배양할 경우 NK 세포의 인터페론 감마 분비능이 상승하는 것을 알 수 있다.
실험예 8: 암의 진행 정도에 따른 인터페론 감마의 분비량 차이
암의 진행 정도에 따라 인터페론 감마의 분비량을 확인하기 위해, 암환자1(유방암 완치 환자), 암환자2(뇌암 의심 환자), 및 정상인의 전혈을 100ng/ml IL12와 1000ng/ml IL15가 처리된 RPMI1640 배지에서 24시간 배양 후 상기 실험예들에서 기술한 바와 같이 인터페론 감마 분비량을 측정하였다. 또한, 이들의 전혈에 대해 유세포 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 인터페론 분비능이 정상인> 유방암 완치 환자> 뇌암 의심 환자의 순으로 나타나, 암의 진행 정도에 따라 인터페론 감마의 분비량이 달라짐을 확인할 수 있었다. 이러한 사실은 본 발명의 방법으로 혈액 시료 내에 존재하는 NK 세포에 의한 인터페론 감마의 분비량을 측정하여 암의 발생, 진행 정도를 예측하거나, 암의 재발을 예측하는데 사용할 수 있음을 시사하는 결과라고 할 수 있다.
실험예 9: NK 세포의 자극에 의해 생성된 인터페론 감마의 정량
NK 세포 배양용 튜브는 혈액의 응고를 막기 위해 항응고제인 sodium heparin이 첨가되어있는 튜브 (BD)를 구입하여 사용하였다. 항응고제(sodium heparin)가 들어있는 튜브에 정상인 8명으로부터 5ml의 전혈을 채취하여 준비하였다. 채취한 5ml의 전혈 중 1ml을 취하여 RPMI1640 배지와 혼합하고, 안정화 펩타이드가 결합된 SP-hIL12 단백질과 hIL15-SP 여기에 첨가해 주었다. 16-24 시간 동안 37℃에서 배양하였다.
37℃에서 배양된 8인의 정상인의 전혈을 1500-2000 xg 에서 원심분리하고, 상층액인 혈청에서 150-200ul 취하여 감마인터페론 효소결합면역검사 (interferon γ ELISA)를 수행하였다. 0.05% Tween 1차 항체(anti-human interferon-gamma monoclonal antibody, ATGen Cat# ATGK02) 를 코팅 완충액(0.1 Sodium carbonate, pH9.5)를 이용하여 1:1000의 비율로 희석하였다. 희석된 1차 항체를 96-웰 마이크로타이터 ELISA 플레이트(Nunc Maxisorp; NUNC, Naperville, IL)에 100ul/well씩 분주하고, 4℃에서 16~18시간 동안 방치한 후, 플레이트에 들어 있는 용액을 제거하고 세척용액(0.05% Tween 20 함유 PBS)를 400ul/well씩 넣어 세척하며, 3회 반복하여 수행하였다. 그런 다음, 10% FBS(Fetal bovine serum; 우태아혈청)가 포함된 PBS를 300ul/well씩 분주하고, 상온에서 1시간 동안 방치한 후, 플레이트 내의 용액을 제거한 후 PBST (0.05% Tween 20이 포함된 PBS (phosphate buffered saline) 용액)를 400ul/well씩 넣어 세척하며, 3회 반복하여 수행하였다. 1차 항체가 코팅된 96-웰 마이크로타이터 ELISA 플레이트는 밀봉하여, 4℃에 보관하여 사용하였다.
1차 항체가 코팅된 96-웰 마이크로타이터 ELISA 플레이트에 하기 표 1과 같이 인터페론감마 표준용액(Recombinant human interferon-gamma (ATGen, Cat# IFG4001) 200ng과 0.05% Proclin 300 함유 PBS)을 희석하여 100ul/well씩 분주하고, 실험 단계에서 준비된 환자혈청을 100ul/well씩 분주한 후 상온에서 2시간 동안 방치하였다.
Figure pct00003

2시간 후, 96-웰 마이크로타이터 ELISA 플레이트에 들어 있는 용액을 제거한 후 세척용액을 400ul/well씩 넣어 세척하며, 3회 반복하여 수행하였다. 그런 다음, 2차 항체(Biotinylated anti-human interferon-gamma monoclonal antibody (ATGen Cat# ATGK03))를 희석용액으로 1:500의 비율로 희석하여, 100ul/well씩 분주하고 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 플레이트 내의 용액을 제거하고 세척용액을 400ul/well씩 넣어 3회 세척하였다. HRP 컨쥬게이트된-스트렙타비딘(HRP conjugated streptavidin solution(Thermo scienfific, Cat# 21130))을 희석용액으로 1:3000 비율로 희석하여, 100ul/well씩 분주하고 상온에서 30분간 방치하였다. 그런 다음 ELISA 플레이트에 분주하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후, 96-웰 마이크로타이터 ELISA 플레이트에 들어 있는 용액을 제거한 후 세척용액을 400ul/well씩 넣어 3회 세척하였다.
TMB (tetramethlbenzidine) 1mg을 DMSO(dimethylsulfoxide) 1ml에 녹인 후 0.05M phophate citrate buffer 9ml에 희석하여 기질 용액을 만들고, 이를 플레이트에 100ul/well씩 분주하고, 상온에서 30분간 방치하였다.
반응정지용액(2N 묽은황산용액)을 100ul/well씩 분주하여 반응을 정지시키고, ELISA reader를 이용하여 450nm에서 측정하였다.
8명의 정상인 전혈을 이용한 NK 세포의 인터페론 감마 분비능을 도 11에 나타내었다. 이 결과는 사이토카인을 사용한 전혈 자극이 혈액에 존재하는 면역세포를 효과적으로 활성화하여 인터페론 감마를 분비하게 함을 보여 주고 있다.
또한, 상기 8명의 정상인의 전혈을 사이토카인으로 자극한 후에 유세포분석을 실시하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 이 결과는 전혈 자극에 의해 NK 세포가 활성화 되어서 세포독성을 나타내고 있음을 보여 주고 있다. CD56은 NK세포의 표지자이며 CD107a는 NK 세포가 세포독성과립을 분비하고 있음을 보여 주는 표지자이다. 도 11의 인터페론 감마 분비 결과와 도 12의 NK 세포에 의한 세포독성 결과가 유의한 상관관계가 있으므로 전혈 자극에 의한 NK 세포의 인터페론 감마 분비능을 측정하는 것이 NK 세포의 세포독성을 잘 대변해 주고 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 암이 생성되었을 때 체내에서 일어나는 면역 시스템의 변화를 혈액 내의 NK 세포의 활성을 측정함으로써 암의 생성 또는 재발 여부를 진단할 수 있다. 본 발명은 검사 대상체의 혈액 시료를 이용하여 암의 생성 또는 재발 여부를 손쉽게 예측할 수 있게 해 준다.
상기 기술된 실시예는 변형될 수 있다. 이러한 변형된 예들도 본 명세서의 실시예의 범주에 포함되며 통상의 기술자에게 자명한 모든 개조나 수정 또한 다음의 청구항의 범위에 포함된다.
여기에서 인용된 모든 문헌은 본 명세서에 참고로서 포함된다.
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atcacctgga ccttggacca gagcagtgag gtcttaggct ctggcaaaac cctgaccatc 240 caagtcaaag agtttggaga tgctggccag tacacctgtc acaaaggagg cgaggttcta 300 agccattcgc tcctgctgct tcacaaaaag gaagatggaa tttggtccac tgatatttta 360 aaggaccaga aagaacccaa aaataagacc tttctaagat gcgaggccaa gaattattct 420 ggacgtttca cctgctggtg gctgacgaca atcagtactg atttgacatt cagtgtcaaa 480 agcagcagag gctcttctga cccccaaggg gtgacgtgcg gagctgctac actctctgca 540 gagagagtca gaggggacaa caaggagtat gagtactcag tggagtgcca ggaggacagt 600 gcctgcccag ctgctgagga gagtctgccc attgaggtca tggtggatgc cgttcacaag 660 ctcaagtatg aaaactacac cagcagcttc ttcatcaggg acatcatcaa acctgaccca 720 cccaagaact tgcagctgaa gccattaaag aattctcggc aggtggaggt cagctgggag 780 taccctgaca cctggagtac tccacattcc tacttctccc tgacattctg cgttcaggtc 840 cagggcaaga gcaagagaga aaagaaagat agagtcttca cggacaagac ctcagccacg 900 gtcatctgcc gcaaaaatgc cagcattagc gtgcgggccc aggaccgcta ctatagctca 960 tcttggagcg aatgggcatc tgtgccctgc agtcatcatc accatcacca ctga 1014 <210> 4 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP-hIL12p40 fusion polypeptide <400> 4 Met Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr 1 5 10 15 Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp 20 25 30 Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met 35 40 45 Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr 50 55 60 Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly 85 90 95 Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp 100 105 110 Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn 115 120 125 Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr 130 135 140 Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys 145 150 155 160 Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala 165 170 175 Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr 180 185 190 Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser 195 200 205 Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu 210 215 220 Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro 225 230 235 240 Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu 245 250 255 Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe 260 265 270 Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys 275 280 285 Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg 290 295 300 Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser 305 310 315 320 Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser His His His His His 325 330 335 His <210> 5 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP-hIL12p35 fusion coding sequence <400> 5 atggaccctg acaatgaggc ttatgaaatg ccttctgagg aagggtatca agactacgaa 60 cctgaagccg gatccagaaa cctccccgtg gccactccag acccaggaat gttcccatgc 120 cttcaccact cccaaaacct gctgagggcc gtcagcaaca tgctccagaa ggccagacaa 180 actctagaat tttacccttg cacttctgaa gagattgatc atgaagatat cacaaaagat 240 aaaaccagca cagtggaggc ctgtttacca ttggaattaa ccaagaatga aagctgtctt 300 aactcaagag aaacttcatt tatcacaaac ggtagttgcc tggcctccag aaagacctct 360 tttatgatgg ccctgtgcct tagtagtatt tatgaagact tgaagatgta ccaggtggag 420 ttcaagacca tgaatgcaaa gcttctgatg gaccctaaga ggcaaatctt tctagatcaa 480 aacatgctgg cagttattga tgagctgatg caggccctga atttcaacag tgagactgtg 540 ccacaaaaat cctcccttga agaaccggat ttttataaaa ctaaaatcaa gctctgcata 600 cttcttcatg ctttcagaat tcgggcagtg actattgata gagtgatgag ctatctgaat 660 gcttcccatc atcaccatca ccactga 687 <210> 6 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP-hIL12p35 fusion polypeptide <400> 6 Met Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr 1 5 10 15 Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr 20 25 30 Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu 35 40 45 Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe 50 55 60 Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp 65 70 75 80 Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn 85 90 95 Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser 100 105 110 Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser 115 120 125 Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met 130 135 140 Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln 145 150 155 160 Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn 165 170 175 Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr 180 185 190 Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg 195 200 205 Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser His His 210 215 220 His His His His 225 <210> 7 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hIL15-SP fusion coding sequence <400> 7 atgaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg 60 catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca 120 atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt 180 catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 240 gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 300 ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttctggatc cgatcctgac 360 aatgaggctt atgaaatgcc ttctgaggaa gggtatcaag actacgaacc tgaagcctaa 420 <210> 8 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIL15-SP fusion polypeptide <400> 8 Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 1 5 10 15 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 20 25 30 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 50 55 60 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 100 105 110 Asn Thr Ser Gly Ser Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser 115 120 125 Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 <210> 9 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP-hIL18 fusion coding sequence <400> 9 atggaccctg acaatgaggc ttatgaaatg ccttctgagg aagggtatca agactacgaa 60 cctgaagccg gatcctactt tggcaagctt gaatctaaat tatcagtcat aagaaatttg 120 aatgaccaag ttctcttcat tgaccaagga aatcggcctc tatttgaaga tatgactgat 180 tctgactgta gagataatgc accccggacc atatttatta taagtatgta taaagatagc 240 cagcctagag gtatggctgt aactatctct gtgaagtgtg agaaaatttc aactctctcc 300 tgtgagaaca aaattatttc ctttaaggaa atgaatcctc ctgataacat caaggataca 360 aaaagtgaca tcatattctt tcagagaagt gtcccaggac atgataataa gatgcaattt 420 gaatcttcat catacgaagg atactttcta gcttgtgaaa aagagagaga cctttttaaa 480 ctcattttga aaaaagagga tgaattgggg gatagatcta taatgttcac tgttcaaaac 540 gaagactag 549 <210> 10 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP-hIL18 fusion polypeptide <400> 10 Met Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr 1 5 10 15 Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly Ser Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser 20 25 30 Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp 35 40 45 Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg 50 55 60 Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser 65 70 75 80 Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile 85 90 95 Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn 100 105 110 Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln 115 120 125 Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser 130 135 140 Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys 145 150 155 160 Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe 165 170 175 Thr Val Gln Asn Glu Asp 180 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2-22-BamH1 forward primer <400> 11 acaggatccc ctacttcaag ttct 24 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2-153-Xho reverse primer <400> 12 cactctcgag tcaagtcagt gttgagat 28 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL12-p40-23-BamH1 forward primer <400> 13 gtggatccat atgggaactg aagaaagatg 30 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL12-p40-328-CT-His reverse primer <400> 14 atggtgatga tgactgcagg gcacagatgc cc 32 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL12-p35-23-BamH1 forward primer <400> 15 gtggatccag aaacctcccc gtggc 25 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL12-p35-219-CT-His reverse primer <400> 16 atggtgatga tgggaagcat tcagatagc 29 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL15-49-Nde forward primer <400> 17 gagtcaagca tatgaactgg gtgaatgtaa 30 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL15-162-BamH1 reverse primer <400> 18 gtggatccag aagtgttgat gaac 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL18-37-BamH1 forward primer <400> 19 gtggatccta ctttggcaag cttg 24 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL18-193-EcoR1 reverse primer <400> 20 agactggaat tcctagtctt cgttttg 27 <210> 21 <211> 140 <212> PRT <213> Homo Sapien <220> <223> human alpha synuclein <400> 21 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapien <220> <223> human alpha synuclein / C-terminal acidic tail domain residues 103-115 <400> 22 Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp 1 5 10 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Homo Sapien <220> <223> human alpha synuclein / C-terminal acidic tail domain residues 114-126 <400> 23 Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro Val Asp 1 5 10 15 Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu 20 <210> 24 <211> 22 <212> PRT <213> Homo Sapien <220> <223> human alpha synuclein / C-terminal acidic tail domain residues 119-140 <400> 24 Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln 1 5 10 15 Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 20 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapien <220> <223> human alpha synuclein / C-terminal acidic tail domain residues 130-140 <400> 25 Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 134 <212> PRT <213> Homo Sapien <220> <223> human beta synuclein <400> 26 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val 35 40 45 Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser 50 55 60 His Leu Gly Gly Ala Val Phe Ser Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala 65 70 75 80 Thr Gly Leu Val Lys Arg Glu Glu Phe Pro Thr Asp Leu Lys Pro Glu 85 90 95 Glu Val Ala Gln Glu Ala Ala Glu Glu Pro Leu Ile Glu Pro Leu Met 100 105 110 Glu Pro Glu Gly Glu Ser Tyr Glu Asp Pro Pro Gln Glu Glu Tyr Gln 115 120 125 Glu Tyr Glu Pro Glu Ala 130 <210> 27 <211> 50 <212> PRT <213> Homo Sapien <220> <223> human beta synuclein / C-terminal acidic tail domain residues 85-134 <400> 27 Lys Arg Glu Glu Phe Pro Thr Asp Leu Lys Pro Glu Glu Val Ala Gln 1 5 10 15 Glu Ala Ala Glu Glu Pro Leu Ile Glu Pro Leu Met Glu Pro Glu Gly 20 25 30 Glu Ser Tyr Glu Asp Pro Pro Gln Glu Glu Tyr Gln Glu Tyr Glu Pro 35 40 45 Glu Ala 50 <210> 28 <211> 127 <212> PRT <213> Homo Sapien <220> <223> human gamma synuclein (synoretin) <400> 28 Met Asp Val Phe Lys Lys Gly Phe Ser Ile Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Gly Ala Val Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Met Tyr Val Gly Ala Lys Thr Lys Glu Asn Val 35 40 45 Val Gln Ser Val Thr Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Asn 50 55 60 Ala Val Ser Glu Ala Val Val Ser Ser Val Asn Thr Val Ala Thr Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Glu Ala Glu Asn Ile Ala Val Thr Ser Gly Val Val Arg 85 90 95 Lys Glu Asp Leu Arg Pro Ser Ala Pro Gln Gln Glu Gly Glu Ala Ser 100 105 110 Lys Glu Lys Glu Glu Val Ala Glu Glu Ala Gln Ser Gly Gly Asp 115 120 125 <210> 29 <211> 32 <212> PRT <213> Homo Sapien <220> <223> human gamma synuclein (synoretin) / C-terminal acidic tail domain residues 96-127 <400> 29 Arg Lys Glu Asp Leu Arg Pro Ser Ala Pro Gln Gln Glu Gly Glu Ala 1 5 10 15 Ser Lys Glu Lys Glu Glu Val Ala Glu Glu Ala Gln Ser Gly Gly Asp 20 25 30

Claims (47)

  1. 혈액 시료 내의 NK 세포를 자극하여 NK 세포가 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 단계; 및
    상기 혈액 시료 내의 NK 세포 분비성 사이토카인의 양을 측정하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈액 시료는 전혈, 말초혈액단핵세포 또는 NK 세포인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    NK 세포의 자극은 혈액 시료를 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인과 함께 배양하거나, 혈액 시료를 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 폴리 I:C (poly I:C)와 함께 배양함으로써 수행되는 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    NK 세포의 자극은 혈액 시료를 인터루킨 2와 함께 배양함으로써 수행되는 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    NK 세포의 자극은 혈액 시료를 인터루킨 2 및 인터루킨 12와 함께 배양함으로써 수행되는 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    NK 세포의 자극은 혈액 시료를 인터루킨 12 및 인터루킨 15와 함께 배양함으로써 수행되는 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    NK 세포의 자극은 혈액 시료를 인터루킨 12 및 인터루킨 18과 함께 배양함으로써 수행되는 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 NK 세포 분비성 사이토카인은 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양괴사인자-알파(TNF-α) 및 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β)로부터 선택되는 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 NK 세포 분비성 사이토카인은 인터페론-감마 (IFN-γ)인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 NK 세포 분비성 사이토카인은 종양괴사인자-알파(TNF-α)인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β)는 NK 세포의 활성을 정상인과 비교하기 위한 대조군으로 사용되는 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 NK 세포 분비성 사이토카인의 양의 측정은 효소결합면역검사(ELISA)에 의해 수행되는 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  13. 제3항에 있어서,
    상기 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인은 안정화 펩타이드와 결합된 융합 단백질의 형태인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 안정화 펩타이드는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리(Acidic tail amino acid sequence of alpha-synuclein, ATS) 영역 펩타이드인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 안정화 펩타이드는 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 103-115(서열번호 22), 아미노산 잔기 114-126(서열번호 23), 아미노산 잔기 119-140(서열번호 24), 아미노산 잔기 130-140(서열번호 25), β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 85-134(서열번호 27), γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 28) 및 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 29) 중에서 선택되는 안정화 펩타이드인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    혈액 시료 내의 NK 세포를 자극하여 NK 세포가 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 단계는 운반 단백질(carrier protein)을 함유하는 배지 중에서 수행되는 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포의 활성을 측정하는 방법은 암의 생성 또는 암의 재발을 선별검사하기 위해 사용되는 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    정상 개체에서의 레벨과 비교한 대상체에서의 NK 세포 분비성 사이토카인의 양의 감소는 암의 생성 또는 암의 재발의 표지자인 것인 NK 세포의 활성을 측정하는 방법.
  19. 혈액 시료 내의 NK 세포를 자극하여 NK 세포 분비성 사이토카인을 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제를 포함하는 NK 세포의 활성 측정용 키트.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 NK 세포 분비성 사이토카인은 인터페론-감마 (IFN-γ)인 NK 세포의 활성 측정용 키트.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 NK 세포 분비성 사이토카인은 종양괴사인자-알파(TNF-α)인 NK 세포의 활성 측정용 키트.
  22. 제19항에 있어서,
    NK 세포를 자극하여 인터페론 감마를 생성하도록 인위적으로 활성화시키는 자극제는 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인, 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 폴리 I:C (poly I:C)인 NK 세포의 활성 측정용 키트.
  23. 제19항에 있어서,
    상기 키트는 항 IFN-γ 항체, 항 TNF-α 항체 및 항 MIP-1β 항체로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항체를 추가로 포함하는 것인 NK 세포의 활성 측정용 키트.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포의 활성 측정용 키트는 암의 생성 또는 암의 재발을 선별검사하기 위해 사용되는 것인 NK 세포의 활성 측정용 키트.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 키트는 대상체에서의 NK 세포 분비성 사이토카인의 양을 정상 개체에서의 레벨과 비교하기 위한 설명서를 추가로 포함하는 것으로, 대상체에서의 NK 세포 분비성 사이토카인의 레벨의 감소는 암의 생성 또는 암의 재발의 표지자인 NK 세포의 활성 측정용 키트.
  26. 인터루킨 2, 인터루킨 12, 인터루킨 15 및 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인이 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합되어 있는 융합 단백질.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 인터루킨 2와 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드가 결합되어 있는 것인 융합 단백질.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 인터루킨 12와 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합되어 있는 것인 융합 단백질.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 인터루킨 15와 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합되어 있는 것인 융합 단백질.
  30. 제26항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 인터루킨 18과 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합되어 있는 것인 융합 단백질.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드는 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 103-115(서열번호 22), 아미노산 잔기 114-126(서열번호 23), 아미노산 잔기 119-140(서열번호 24), 아미노산 잔기 130-140(서열번호 25), β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 85-134(서열번호 27), γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 28) 및 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 29) 중에서 선택되는 것인 융합 단백질.
  32. 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 2, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 12, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 15 및 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 융합단백질을 포함하는 NK 세포 활성화용 조성물.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드는 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 103-115(서열번호 22), 아미노산 잔기 114-126(서열번호 23), 아미노산 잔기 119-140(서열번호 24), 아미노산 잔기 130-140(서열번호 25), β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 85-134(서열번호 27), γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 28) 및 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 29) 중에서 선택되는 것인 NK 세포 활성화용 조성물.
  34. 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 2, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 12, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 15 및 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드와 결합된 인터루킨 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 융합단백질을 포함하는 암 진단 키트.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드는 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 103-115(서열번호 22), 아미노산 잔기 114-126(서열번호 23), 아미노산 잔기 119-140(서열번호 24), 아미노산 잔기 130-140(서열번호 25), β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 85-134(서열번호 27), γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 28) 및 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 잔기 96-127(서열번호 29) 중에서 선택되는 것인 암 진단 키트.
  36. 제34항에 있어서,
    항 IFN-γ 항체, 항 TNF-α 및 항 MIP-1β 항체로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항체를 추가로 포함하는 것인 암 진단 키트.
  37. 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  38. 제37항에 있어서,
    서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  39. 제37항에 있어서,
    서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  40. 제37항에 있어서,
    서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드.
  42. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드; 또는 그의 상보체.
  43. 제42항에 있어서,
    서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 염기 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드; 또는 그의 상보체.
  44. 제42항에 있어서,
    서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 염기 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드; 또는 그의 상보체.
  45. 제42항에 있어서,
    서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드; 또는 그의 상보체.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  47. 제46항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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