TWI507529B - 同時檢測四種病毒之引子、引子對、方法及套組 - Google Patents

Description

同時檢測四種病毒之引子、引子對、方法及套組

本發明係關於病毒之檢驗技術。特定言之，本發明係關於利用蘭花病毒專一性引子及引子對同時檢測數種蘭花病毒之檢驗技術。

蘭花是重要花卉產品，極具經濟價值，其中又以蝴蝶蘭為主要花卉。例如，台灣的出口量歷年來呈現正向成長現象，於2009年出口金額已達20億台幣。蘭花跟所有植物一樣，於栽培過程中都可能面臨病蟲害之威脅，而導致生長與品質上之損失。對於大多數感染蘭花之病害而言，只要運用傳統的防治方法例如施用藥劑，均可獲得良好之防治效果，唯獨由濾過性病毒所感染之病毒病至今仍缺乏有效之治療對策。因此，病毒造成的病害可說是目前最困擾蘭花產業的病害。

病毒之所以成為蘭花產業上最受關切之病原，其主要原因在於病毒可在蘭花植株上造成全株系統性感染，使蘭株生長緩慢，葉片出現條紋、斑塊、壞疽或綠色分佈不均的嵌紋病徵。有些敏感的品種在花朵上也會出現色澤不均、畸形或提早凋萎等病徵，嚴重損及蘭花之商品價值。

根據文獻之紀錄，可以感染蘭花之病毒種類至少有28種。但證實在台灣地區發生的只有蕙蘭(東亞蘭)嵌紋病毒(Cymbidium mosaic virus ，簡稱CyMV)、齒舌蘭輪斑病毒(Odontoglossum ringspot virus ，簡稱ORSV)、胡瓜嵌紋病毒(Cucumber mosaic virus ，簡稱CMV)及番椒黃化病毒(Capsicum chlorosis tospovirus ，簡稱CaCV)等四種，其中又以CyMV及ORSV感染情況最普遍，對蘭花產業嚴重影響。在台灣CaCV感染雖不普遍，但由於其感染蝴蝶蘭後造成的黃化輪斑與凹陷壞疽病徵首在台灣發現，因此CaCV被稱為「台灣病毒(Taiwan virus)」，這對台灣蝴蝶蘭市場造成相當大的衝擊。惟，後續研究發現，世界各國之辣椒、蕃茄、花生及大岩桐早已有感染CaCV之歷史，其中茄科作物(如蕃茄、辣椒、甜椒及煙草等)對CaCV有高度感病性，感染後會造成輪斑、萎凋甚至死亡。因此，CaCV雖然在台灣蝴蝶蘭感染尚不及CyMV及ORSV普及，但其對農業上可造成的農作損害卻非常廣泛且嚴重。

跟所有作物一樣，要栽培健康完美之蘭花，無病之健康種苗為重要因素。國際市場上對於蘭花除了於品種與美觀考量外更出現「無病毒健康苗」之競爭。面對國際市場競爭，產業界開始應用「組織培養技術」複製分生苗，降低種苗病毒感染率。以現今之蝴蝶蘭產業為例，約有二成之種苗乃利用親本授粉所結之種子繁殖而來，稱為「實生苗」，其餘約八成之種苗乃藉由無性組織培養技術，將優良性狀之植株大量複製成為具有完全相同性狀之種苗，這種種苗稱為「分生苗」。不過分生苗雖然可以複製其親本植株之所有優良性狀，但也可能繼承其親本所感染之「病毒病」，而影響後續之栽培、生育與開花品質。因此優良性狀之蘭株必須經過病毒檢測程序，確定無病毒感染後，才能進行分生組織培養大量複製分生苗，此種程序已成為現今國際蘭花產業界之普識作為。

要確實執行種苗之病毒驗證，必須仰賴敏感及有效率之病毒檢測技術，才能準確篩選感染病毒之植株。過去二十年來國際上最廣泛應用於植物種苗病毒檢測之技術為酵素連結抗體吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)。然而近年來多項研究證據顯示蘭花受到病毒侵入後常會呈現潛隱性感染，於病組織中僅累積微量病毒，因而超出ELISA之偵測範圍，導致漏檢之情況發生。

已有報導提供「四種蘭花病毒免疫快速檢測試劑研發之抗原與抗體」，其提供針對ORSV、CyMV、CaCV及CMV等蝴蝶蘭病毒之血清檢測與高敏感度之核酸檢測試劑與技術(請參行政院農業委員會農業試驗所技轉公告「四種蘭花病毒免疫快速檢測試劑研發之抗原與抗體」http://www.tari.gov.tw/taric/modules/news/article.php?story id=450)。惟，該研究僅提供針對此4種病原進行ELISA之的抗體以及對照抗原，而無揭示關於核酸檢測之試劑及技術。

中華民國第096120312號發明專利申請案(公開號200848735)揭示一種檢測蘭花病毒之試劑及方法，其係利用分佈於溶液中之磁性奈米顆粒，每一磁性奈米顆粒包括磁性層、介面活性劑層及多個蘭花病毒抗體。該專利申請案揭示以所述方法檢測CyMV、ORSV及CMV。

中華民國第097112694號發明專利申請案(公開號200942617)揭示可同時偵測ORSV及CyMV引子、引子對、套組及方法。該方法係在反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)、即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應(real-time RT-PCR)或多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應(multiplex RT-PCR)中，利用其所開發之引子及引子對，於單一少量蘭花樣本中進行至少一種病毒核酸的定量。

張清安另發展一種可以於單步驟下同時檢測蘭花CaCV、ORSV及CyMV之多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應檢測技術(請參蘭花種苗病毒檢測與相關產業發展趨勢，農業生技產業季刊，第九期)。

高雄師範大學利用磁顆粒分離技術檢測六種感染蝴蝶蘭病毒之研究，利用多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應偵測CyMV、CMV及ORSV(請參利用磁顆粒分離技術檢測六種感染蝴蝶蘭病毒之研究，黃詩婷，2008，國立高雄師範大學生物科技研究所碩士論文)。

目前市面上檢測蝴蝶蘭病毒之技術多為檢測CyMV及ORSV，尚無可同時檢測CyMV、ORSV、CMV及CaCV等4種病毒之分子檢測方法。是以，仍有需要可快速、具專一性且靈敏地同時檢測CyMV、ORSV、CMV及CaCV等4種蘭花病毒的試劑及方法。

本發明提供一種同時檢測一樣本中CyMV、ORSV、CMV及CaCV感染之方法，其係利用對於CyMV、ORSV、CMV及CaCV之核酸具有專一性之引子及/或引子對將該樣本進行各種反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)，以增幅CyMV、ORSV、CMV及CaCV之特異性核酸，藉此於單一少量樣本中快速並準確偵測低含量之該等病毒核酸，其不僅提高檢測病毒之專一性、靈敏度及準確度，縮短檢測時間，各可降低生產遭病毒感染的植物的風險及成本。

任何可能遭受上述病毒感染的植物均可使用本發明方法、引子、引子對及套組進行檢測。較佳地，該植物為蘭花；更佳地，該植物為蝴蝶蘭。

用語「引子」指具有游離3’羥基的短核酸序列，其可與互補的模板進行鹼基配對交互作用並作為模板股複製的起始點。本發明亦包括該等引子的寡核苷酸的變體，例如具40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%以上相似度但仍會與CyMV、ORSV、CMV及CaCV之核酸結合的核酸序列。根據一較佳具體實施例，如變異序列集中於5’端，可達到約50%的變異度。

在本發明之一較佳實施態樣中，該CyMV之核酸係來自CyMV之RNA依賴型RNA聚合酶基因、該ORSV之核酸係來自ORSV之RNA依賴型RNA聚合酶基因、該CMV之核酸係來自CMV之鞘蛋白基因，及該CaCV之核酸係來自CaCV之核鞘蛋白基因。

在本發明之另一較佳實施態樣中，該CyMV之核酸係來自CyMV之RNA依賴型RNA聚合酶基因、該ORSV之核酸係來自ORSV之RNA依賴型RNA聚合酶基因、該CMV之核酸係來自CMV之鞘蛋白基因，及該CaCV之核酸係來自CaCV之核鞘蛋白基因。

在本發明之另一較佳實施態樣中，該對於CyMV具有專一性之引子係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的序列或與SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具90%以上相似度且與CyMV具有專一性的序列。

在本發明之另一較佳實施態樣中，該對於CyMV具有專一性之引子對包括由SEQ ID NO:7的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:8的序列組成的寡核苷酸。

在本發明之另一較佳實施態樣中，該對於ORSV具有專一性之引子係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的序列或與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具90%以上相似度且與ORSV具有專一性的序列。

在本發明之另一較佳實施態樣中，該對於ORSV具有專一性之引子對包括由SEQ ID NO:5的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:6的序列組成的寡核苷酸。

在本發明之另一較佳實施態樣中，該對於CMV具有專一性之引子係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的序列或與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具90%以上相似度且與CMV具有專一性的序列。

在本發明之另一較佳實施態樣中，該對於CMV具有專一性之引子對包括由SEQ ID NO:1的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:2的序列組成的寡核苷酸。

在本發明之另一較佳實施態樣中，該對於CaCV具有專一性之引子係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的序列或與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具90%以上相似度且與CaCV具有專一性的序列。

在本發明之另一較佳實施態樣中，該對於CaCV具有專一性之引子對包括由SEQ ID NO:3的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:4的序列組成的寡核苷酸。

在本發明之另一較佳實施態樣中，可進一步包括使用係選自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及在可增幅蝴蝶蘭肌動蛋白基因片段之條件下與SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12具90%以上相似度且所組成之群之內部控制引子及/或引子對。

本發明引子可使用習知的固相支撐法或其他週知的方法而化學合成。此等核酸序列可使用已知方法修飾。此等修飾的非限制實例包括甲基化、以其類似物取代一或多個核苷酸及核苷酸間修飾，例如，修飾為不帶電荷結合物(如甲基磷酸鹽、磷酸三酯、磷酸醯胺、甲醯胺等)或帶電的結合物(如phosphorothioate、phosphorodithioate等)。核酸可含有一或多個額外共價結合的殘基，例如，蛋白質、螯合劑及烷化劑。本發明的核酸序列亦可使用直接或不直接提供檢測訊號的標記而改變。此等標記的實例包括放射線同位素、螢光分子及生物素。

本發明引子可使用，例如，聚合酶鏈鎖反應(PCR)進行檢測。聚合酶鏈鎖反應包括，但不限於，即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)、即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，簡稱Q-PCR)、多樣單步驟聚合酶連鎖反應(Multiplex PCR)、反轉錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)、即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應、即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應及多樣單步驟反轉錄聚合酶連鎖反應。

在本發明之另一較佳實施態樣中，使用即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應進行病毒核酸增幅，其增幅條件為：

-在50℃下反應10分鐘；

-在95℃下反應5分鐘；及

-在95℃下反應15秒、在40至60℃(較佳為57℃)下反應10至30秒或更長(較佳為15秒)、在72℃下反應15秒及在82℃下反應15秒為1個循環，共重複30個循環。

在本發明方法之另一較佳實施態樣中，使用多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應進行病毒核酸增幅，其增幅條件為：

-在42℃下反應20分鐘；

-在94℃下反應2分鐘；

-在95℃下反應15秒、在40至60℃(較佳為57℃)下反應10至30秒或更長(較佳為30秒)及在72℃下反應20秒為1個循環，共重複30個循環；及

-在72℃下反應10分鐘。

在本發明法之又一較佳實施態樣中，聚合酶鏈鎖反應之反應液中，鎂離子的濃度係介於2 mM至7 mM之間，較佳為介於3 mM至5 mM之間，更佳為4 mM。引子之總和濃度係介於200 nM至800 nM之間，較佳為介於400 nM至800 nM之間，更佳為800 nM，dNTP濃度範圍係介於400至2000 nM之間，較佳係介於400至800 nM之間。

本發明另提供一種用於檢測胡瓜嵌紋病毒(CMV)之引子及/或引子對。根據本發明，用於檢測胡瓜嵌紋病毒之引子係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的序列或與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具90%以上相似度且與CMV具有專一性的序列。根據本發明，用於檢測胡瓜嵌紋病毒之引子對包括由SEQ ID NO:1的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:2的序列組成的寡核苷酸。

本發明另提供一種用於檢測番椒黃化病毒(CaCV)之引子及/或引子對。根據本發明，用於檢測番椒黃化病毒之引子係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的序列或與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具90%以上相似度且與CMV具有專一性的序列。根據本發明，用於檢測番椒黃化病毒之引子對包括由SEQ ID NO:3的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:4的序列組成的寡核苷酸。

本發明另提供一種用於檢測蝴蝶蘭病毒之內部控制引子及/或引子對。根據本發明，用於檢測蝴蝶蘭病毒之內部控制引子係選自由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或與SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12具90%以上相似度且與該內部控制引子具有專一性的序列。根據本發明，用於檢測蝴蝶蘭病毒之內部控制引子對包括由SEQ ID NO:11的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:12的序列組成的寡核苷酸。

根據本發明，可將上述對於CyMV、ORSV、CMV及CaCV之核酸具有專一性之引子及/或引子對或蝴蝶蘭內部控制引子及/或引子對之DNA序列片段再依據基因DNA序列資料向兩邊擴展，分別設計引子，以得到較大片段之CyMV、ORSV、CMV、CaCV及/或蝴蝶蘭特異性核酸片段。

本發明之引子及/或引子對可容許約10至50%之序列變異，而不影響PCR結果。由實驗結果可知，若變異集中於5'端，則最多容許達40%至50%變異(約7至10 mer)。

本發明另提供一種用於檢測胡瓜嵌紋病毒之套組，其包含本發明之用於檢測胡瓜嵌紋病毒之引子及/或引子對。

本發明另提供一種用於檢測番椒黃化病毒之套組，其包含本發明之用於檢測番椒黃化病毒之引子及/或引子對。

本發明另提供一種同時檢測植物樣本中蕙蘭嵌紋病毒CyMV、ORSV、CMV及CaCV感染之套組，其包含前述之對於CyMV、ORSV、CMV及CaCV之核酸具有專一性之引子及/或引子對。

本發明之套組可進一步包含用於進行PCR之PCR反應溶液配方。本發明之套組另可包括適合的反應緩衝液及DNA校正資料。根據本發明，該套組之PCR反應酵素及試劑係技藝人士所熟知者。本發明套組之其它元件及製備係技藝人士，根據習知技術，修改一般PCR套組製備之技術即可製得。

本發明主要係針對CMV鞘蛋白(簡稱CMV-CP)與CaCV核鞘蛋白(簡稱CaCV-NP)基因設計簡併引子(degenerate primer)，使引子可同時偵測不同變異之CMV與CaCV。所設計的CMV簡併引子於NCBI序列比對，至少可檢測涵蓋蝴蝶蘭、瓜類、百合、豇豆、胡椒等不同地區變異之CMV(GenBank序列編號分別為AJ131618、DQ004557、EU429567、AY611027、AF198266、FJ896159)。CaCV簡併引子於NCBI序列比對，至少可檢測蝴蝶蘭、百合、孤挺花、花生、番茄等不同地區變異之CaCV(GenBank序列編號分別為EF100595、EF137177、EF602029、EU095940)。

本發明依病原的特定基因序列設計專一性引子，成功的建立可以於一反應液中同時檢測多組病原之多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應(multiplex RT-PCR)與高感度之即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應(real-time RT-PCR)技術。本發明的專一性引子，可使用於多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應(multiplex RT-PCR)，亦適用於即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應(real-time RT-PCR)技術。針對多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應檢測，當調整PCR條件至3 mM至7 mM(較佳為4 mM以上)的Mg²⁺ 濃度時，可於一反應液中同時檢測任意目標病原，檢測極限為1 pg。以即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應來檢測上述病原其增幅效率可達90%至110%(黏和溫度50至60℃)，檢測極限為1fg。

本發明另建立CyMV、ORSV、CaCV與CMV此4種病毒之共同檢測技術。除了上述兩種RT-PCR，亦可使用生物晶片來快速篩檢，其是利用本發明設計之專一性引子夾出之基因片段，取其中約18-30(較佳約25)個連續核苷酸作為探針以達到專一性檢測之目的。

以下實施例純係本發明之例示，故不應以任何方式被視為本發明範圍的限制，其並詳細描述了本發明在前文中所討論的觀點和實施態樣。

實施例 實例1　引子設計

針對Cucunber mosaic virus 鞘蛋白(簡稱CMV-CP)與Capsicum chlorosis tospovirus 核鞘蛋白(簡稱CaCV-NP)基因設計簡並引子，使引子可同時偵測不同基因變異之目標病毒。

由GenBank搜尋已發表的CMV-CP及CaCV-NP基因序列。以CMV-CP基因序列(GenBank序列編號AJ131618、AJ131619、AJ871492、DQ004557、D28780、AJ810266、AY611027、FJ403473、EU128723、AF198622、DQ285569、AK172329、AY172328、EF620777、FJ896156、FJ896157、FJ896160、FJ896159)設計對CMV-CP基因具專一性之引子對CM343-F(SEQ ID NO:1)及CM343-R(SEQ ID NO:2)。以CaCV-NP基因序列(GenBank序列編號EF100595、EF100598、EF100597、EF137177、EF100600、EF602029、EU216023、EU095940)設計引子Ca157-F(SEQ ID NO:3)及Ca157-R(SEQ ID NO:4)。

引子設計原則為GC含量40%以上，並避免形成引子雙體(dimer)結構，且與中華民國第097112694號發明專利申請案之FP-1(SEQ ID NO:5)、RP-1(SEQ ID NO:6)、FP-2(SEQ ID NO:7)、RP-2(SEQ ID NO:8)、FP-3(SEQ ID NO:9)、RP-3(SEQ ID NO:10)引子可於同一條件下專一性增幅。另以蝴蝶蘭肌動蛋白基因(GenBank序列編號U18102)設計Pa183-F(SEQ ID NO:11)及pa183-R(SEQ ID NO:12)引子，以降低共同檢測不專一性干擾。本專利之針對CMV-CP及CaCV-NP基因的引子確認可與中華民國第097112694號發明專利申請案之引子與Pa183-F/pa183-R引子共同檢測。該等引子序列係如下表所示。

實例2　RNA製備

樣品凍乾完成後以玻璃珠磨碎，將磨碎得到之粉末保存於-80℃冰箱。分別取0.1g磨碎樣品以Trizol(invitrogen；cat#15596018)、Quick Gene RNA組織套組II(FujiFilm；cat#RT-S2)與Dr. RNA萃取套組(晶宇生物科技公司；cat#8c2018-01)萃取RNA，萃取步驟參考各家操作手冊。

實例3　標準質體製備

以感染CMV與CaCV病毒之葉片檢體核酸為模板，取CM343-F/CM343-R與Ca157-F/Ca157-R簡併引子進行RT-PCR增幅，以Promega WizardSV Gel and PCR Clean-Up系統(Promega；cat#A9281)進行DNA片段回收純化。回收之增幅產物與TA載體黏合，將其選殖於yT&A質體(益生生技公司；cat#YC103)，並於轉型於對應的大腸桿菌(益生生技公司；cat# YE607)後定序。CaCV定序序列為SEQ ID NO:14，比對後確認其為GenBank序列編號EF095725；CMV定序序列為SEQ ID NO:13，比對後確認其為GenBank序列編號EU329011。取3 mL含有質體之隔夜培養的菌液，離心後移除上層液，再以Promega公司所生產的PureYield^TM Plasmid Miniprep系統(Promega；cat#A1223)純化組來萃取大腸桿菌中的質體。將純化的質體置於4℃暫時保存，或儲存於-20℃下永久保存。以DNA限制酶於特定切點水解純化後的質體，把DNA和沈降劑(loading buffer)混合均勻，注入1%凝膠的試樣槽，並加入DNA分子量標準品(DNA maker)，施以100伏特的電壓進行分離。經SyBr Green(SEENING；cat#SE-100)染色後，在UV光源下觀察與照相DNA片段分離情形，並藉由DNA分子量標準品來判讀DNA大小。

實例4　反轉錄基因

大量抽取含T7啟動子與目標基因之質體，分別以限制酶酵素Xbal線性化質體，並回收線性之質體。以AmpliScribe T7-Flash轉錄套組(AmpliScribe；cat#ASF3257)進行反轉錄。依據操作手冊配製反應液，置於37℃下反應3小時進行轉錄。完成轉錄反應後各自添加1 μl DNase將線性質體降解後進行RNA回收，再以每50 μl RNA添加2.5 μl RNA Armor試劑(Protech；cat#RT-R486)以避免RNA降解。

實例5　多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應(Multiplex RT-PCR)之反應條件探討

檢測靈敏度除了與技術類別有關，試劑材料與實驗設計方法也都會影響其結果。影響PCR檢測靈敏度之因素則有PCR溫度條件、引子專一性、引子濃度、Mg²⁺ 濃度、K⁺ 濃度與Tag種類等。多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應技術為於同一反應液中，同時進行多於一組基因之增幅，此技術所需的儀器耗材與檢測步驟皆與一般PCR相同。但，當進行多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應反應時，引子間是否會相互作用，產生不專一產物。亦或多組基因同時增幅效率是否會不同，而導致部份基因檢測靈敏度下降。或者當不同基因濃度有差異時，是否會造成競爭抑制導致偽陰性等，皆須進一步探討以排除可能之影響。

欲使五組基因同時檢測時增幅效率一致，進行不同條件之共同檢測極限測試。本實例探討100~800 nM引子與1~4 mM MgCl₂ 濃度組合下之最佳增幅條件範圍。另，討論多組基因同時檢測時之競爭效應，固定引子濃度，以不同基因組合搭配3~6 mM MgCl₂ 之條件探討最佳增幅結果。以Flexi DNA聚合酶(Promega；cat#M8295)進行多樣單步驟聚合酶鏈鎖反應。增幅條件為：94℃下反應2分鐘，一循環；以95℃下反應15秒、57℃下反應30秒及72℃下反應20秒為一循環，共進行30個循環；及72℃下反應10分鐘，一循環。

以one step RT-PCR套組(Invitrogen；cat#12574026)進行反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)，增幅條件為：42℃下反應20分鐘，一循環；94℃下反應2分鐘，一循環；以95℃下反應15秒、57℃下反應30秒及72℃下反應20秒為一循環，共進行30個循環；及72℃下反應10分鐘，一循環。

(1)　單一組引子PCR測試

一般PCR檢測極限約3+1E複本數，本發明之CM343-F/CM343-R與Ca157-F/Ca157-R引子與中華民國第097112694號發明專利申請案之FP-1/RP-1、FP-2/RP-2及FP-3/RP-3，檢測極限測試結果如圖1所示。在此條件下，除了CM343-F/CM343-R引子檢測極限僅為5+1E複本數外，其餘四組引子皆可達3+1E複本數。而以5組引子同時進行多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應增幅時，基因個別含量由7+1E至3+1E及CM343-F/CM343-R皆無法同時增幅。此結果發現CM343-F/CM343-R引子之增幅效率不佳，可能為簡並引子之緣故。因此，需增加CM343-F/CM343-R引子量與改變反應中之Mg²⁺ 濃度，以提高CM343-F/CM343-R之檢測極限。

如圖2所示，當引子總和濃度為200 nM，Mg²⁺ 濃度提高至4 mM時，檢測極限亦僅5+1E複本數(圖2(a))。當引子總和濃度提高至400 nM，Mg²⁺ 濃度提高至3 mM時，CM343-F/CM343-R基因之檢測極限達3+1E複本數(圖2(b))。當引子總和濃度提高至800 nM濃度時，Mg²⁺ 濃度2 mM時即可使檢測極限達3+1E複本數(圖二(c))。由於Mg²⁺ 濃度過高可能會有不專一產物產生，因此以總和濃度800 nM之CM343-F/CM343-R引子進行測試。

(2)　以2至4組引子進行多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應共同檢測

PCR反應中，dNTP與寡核酸之反應需要Mg²⁺ 輔助，因此Mg²⁺ 含量與dNTP與寡核酸需為一最佳比例。多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應中引子含量較單一基因PCR高，增幅基因所需之dNTP亦較單一基因PCR高。因此為得最佳的多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應，進行2組至4組基因組合，討論所需的最佳Mg²⁺ 含量。如圖3所示，當增幅基因組數提高時，所需之Mg²⁺ 含量亦須提高。因此，要同時增幅4組基因，至少須4 mM含量之Mg²⁺ 。與單一基因增幅比較(圖2)，多組基因同時增幅的確需要較多Mg²⁺ 予以輔助。

(3)　以5組引子FP-1/RP-1、FP-2/RP-2、FP-3/RP-3、CM343-F/CM343-R、Ca157-F/Ca157-R進行多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應共同檢測

未調整前，5組基因無法同時增幅(請見圖1)。經調整引子與Mg²⁺ 量後，五組基因同時增幅結果如圖4所示。

轉錄目標基因RNA，確認多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應條件，及5個基因多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應檢測結果如圖5所示。在5組基因含量相同之狀況下，當Mg²⁺ 含量>4 mM時，共同檢測極限最佳為5+1E樣本數，相當於1 pg RNA。

(4)　以5組引子FP-1/RP-1、FP-2/RP-2、pa183-F/pa183-R、CM343-F/CM343-R、Ca157-F/Ca157-R Multiplex PCR共同檢測

在樣品實際檢測過程中為求降低不專一干擾影響，將內部控制組引子更換為pa183-F/pa183-R，以進行共同檢測測試，其結果如圖6所示。由結果可確認檢測病毒之引子可搭配不同內部控制組。

實例6　以多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應檢測蝴蝶蘭樣品

以實際蝴蝶蘭樣品測試5組引子FP-1/RP-1、FP-2/RP-2、Pa183-F/Pa183-R、CM343-F/CM343-R、Ca157-F/Ca157-R。以此5組引子進行蝴蝶蘭約莫120個樣品實際檢測，結果如圖7所示。由多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應檢測統計結果發現，樣品感染CyMV與ORSV機率較高，分別為約50%與55%；而CaCV與CMV則僅分別為8%與5%。

實例7　即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應(Real-time RT-PCR)引子效率與檢測極限探討

引子放大效率會影響共同反應時的準確性，最佳的狀態應為2倍放大，最佳放大效率為90-110%，計算公式為：效率(η)=[10(^-1/斜率 )]-1，其中斜率為Y/X，X為濃度或複本數(copy number)的log值，Y為Ct值(Threshold cycle)。因此當放大效率為100%時，斜率約-3，以此方法換算判斷最佳引子放大效率。

為得到5組引子最佳增幅條件，進行30~60℃引子效率探討。分別取含目標基因的質體測定濃度後，進行10倍連續稀釋PCR放大，標準曲線R² >0.95方可信任。以iQ SYBR Green supermix PCR套組(Bio Rad；cat#170-8884)調配PCR反應液，進行即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應引子效率與檢測極限分析。以iScript One-Step RT-PCR Kit With SYBR Green(Bio Rad；cat#BP170-8893)進行即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應測試分析。

以iQ SYBR Green supermix PCR套組進行即時聚合酶鏈鎖反應測試之增幅條件為：95℃下反應5分鐘，一循環；以95℃下反應15秒、57℃下反應15秒、72℃下反應15秒*及82℃下反應15秒*為一循環，共進行30個循環；及55至95℃熔解溫度測試，其中*為螢光偵測點。以iScrip one step RT PCR with SYBR進行即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應測試之增幅條件為：50℃下反應10分鐘，一循環；95℃下反應5 min分鐘，一循環；以95℃下反應15秒、57℃下反應15秒、72℃下反應15秒*及82℃下反應15秒*為一循環，共進行30個循環；及55至95℃熔解溫度測試，其中*為螢光偵測點。

CM343-F/CM343-R與Ca157-F/Ca157-R之引子放大效率測試，確認該等引子與中華民國第097112694號發明專利申請案之FP-1/RP-1、FP-2/RP-2及FP-3/RP-3，於同一條件下增幅之引子放大效率達90至110%(請見如圖8)。測試結果R² 值皆可達0.95至0.999，引子放大效率亦皆位於90~110%間。此外，此5組引子由melt curve判斷，其增幅結果具有高度專一性，如圖九。當CM343-F/CM343-R-FR結果當引子總合提高至800 nM濃度，其餘4組引子總合200 nM時，5組引子檢測極限皆達3+1E(約10 fg)。

實例8　以生物晶片檢測極限探討

利用增幅後之基因片段其中約25個(例如20-30個)連續的核苷酸或其互補序列作為生物晶片之探針。因上述探針的序列可經由定序得知，故亦可直接在晶片上合成探針片段。

以下提供生物晶片之製作方法的一個實施例，但是本發明並不限於此方法。首先，將一空白晶片在45℃下烘烤約5分鐘，分別將40微莫耳濃度之(μM)寡核苷酸探針加入探針溶液混合，再用點片機點在設定的位置，置於45℃烘烤1-2分鐘，最後再以紫外線交聯器(UV crosslinker)於0.8焦爾，6分鐘的條件下將寡核苷酸探針固定在晶片上。

利用標記分子標記探針，標記分子包括，但不限於，生物素(Biotin)、螢光素、毛地黃等標記分子。本實施例中以具有生物素(Biotin)標定的引子與待測樣本的DNA進行聚合酶連鎖反應，其每一個反應液總體積為25 μl，內含2 ng待測樣本模板DNA、250 μM dNTPs、1 X PCR緩衝液、0.2 μM引子，以及0.5U Taq Pluse耐熱聚合酶(Bio Basic Inc.,Canada)。反應條件為95℃ 2分鐘1個循環，(95℃ 15秒，55℃ 15秒，72℃ 15秒)30個循環，72℃ 10分鐘1個循環完成反應，而得到具有生物素標定的待測樣本的增幅產物，即為雜合反應之標的(target)。

將生物素標定的target DNA片段與本發明之生物晶片上之寡核苷酸探針進行雜合。依照本發明之較佳實施例，進行雜合反應之方法包含在晶片每一反應槽先加入雜合反應液，再加入適量生物素標定的target DNA片段與之混合，置於60℃環境下1小時，以進行雜合反應。之後洗去未雜合的target片段，再加入顯色劑(4 μl NBT/BCIP+196 μl Detection buffer)置於暗室中反應10分鐘，反應後以清水清洗，並在45℃下烘乾，以出現色斑的有無判定待測樣本中是否有病原的存在。

<110>　台灣糖業股份有限公司

<120>　同時檢測四種病毒之引子、引子對、方法及套組

<130>　156872

<160>　14

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　18

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　1

<210>　2

<211>　19

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　2

<210>　3

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人工序列

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<210>　4

<211>　21

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　4

<210>　5

<211>　18

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　5

<210>　6

<211>　20

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　6

<210>　7

<211>　20

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　7

<210>　8

<211>　21

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　8

<210>　9

<211>　18

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　9

<210>　10

<211>　19

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　10

<210>　11

<211>　18

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　11

<210>　12

<211>　19

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　12

<210>　13

<211>　157

<212>　DNA

<213>　番椒黃化病毒(Capsicum chlorosis tospovirus)

<400>　13

<210>　14

<211>　343

<212>　DNA

<213>　胡瓜嵌紋病毒(Cucumber mosaic virus)

<400>　14

圖1為5組引子檢測目標基因之極限測試圖。內部控制組、CyMV、ORSV、CMV與CaCV(括弧內為引子名稱)分別單獨進行檢測極限測試。每個引子由左至右分別為7+1E至1+1E複本數與NTC檢測結果。第41至48泳道為5組引子同時檢測5個混合之目標基因。由左至右分別為7E+1至1E+1複本數與NTC檢測結果。

圖2為CM343-F/CM343-R引子含量於檢測極限影響電泳圖。(a)~(c)為引子濃度由低至高之測試：(a) 200 nM CM343-F/CM343-R引子；(b) 400 nM CM343-F/CM343-R引子；(c)800 nM CM343-F/CM343-R引子。每一引子濃度測試組中，由左至右為MgCl₂ 濃度1 mM至4 mM。每一MgCl₂ 濃度測試組中基因濃度由左至右為5+1E~1至1E複本數。

圖3為不同組合之2至4組引子於多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應之檢測極限影響電泳圖。(a) CM343-F/CM343-R與另一引子組合。(b) CM343-F/CM343-R與另二引子組合。(c) CM343-F/CM343-R與另三引子組合。括弧內為引子名稱。

圖4為5組基因多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應電泳圖。由左至右為Mg²⁺ 含量低至高(4、5及6 mM)。

圖5為多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應檢測極限電泳圖。測試3至6 mM Mg²⁺ 含量的多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應檢測極限，每一組RNA含量由左至右為8+1E至4+1E複本數。

圖6為5組引子FP-1/RP-1、FP-2/RP-2、Pa183-F/Pa183-R、CM343-F/CM343-R、Ca157-F/Ca157-R之多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應分析。每一泳道皆含五組基因，第1泳道為五組基因各3+1E複本數，第2至6泳道為5組基因不同濃度之測試。

圖7為蝴蝶蘭樣品之多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應檢測電泳圖。100個樣品順序由上至下排列檢測。

圖8為引子Ca157-F/Ca157-R與CM343-F/CM343-R之即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應效率測試。圖8A與8B為Ca157-F/Ca157-R的結果。圖8C與8D為CM343-F/CM343-R的結果。圖8A與8C為PCR曲線，圖8B與8D為標準曲線。

(無元件符號說明)

Claims (19)

1. 一種同時檢測植物樣本中4種病毒感染之方法，其中該等病毒為蕙蘭嵌紋病毒(Cymbidium mosaic virus ；CyMV)、齒舌蘭輪斑病毒(Odontglossum ringspot virus ；ORSV)、胡瓜嵌紋病毒(Cucumber mosaic virus ；CMV)及番椒黃化病毒(Capsicum chlorosis tospovirus ；CaCV)，該方法包含下列步驟：(a)提供植物樣本；(b)提供對於CyMV、ORSV、CMV及CaCV之核酸具有專一性之引子及/或引子對；(c)利用該等引子及/或引子對在可同時增幅該等病毒核酸之條件下對該植物樣本進行反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)，以增幅CyMV、ORSV、CMV及CaCV之特異性核酸；及(d)偵測經增幅之樣本中是否含有該等病毒之核酸；其中，該對於CyMV具有專一性之引子係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的序列或與SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8具90%以上相似度且與CyMV具有專一性的序列；及該對於CyMV具有專一性之引子對包括由SEQ ID NO：7的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：8的序列組成的寡核苷酸；該對於ORSV具有專一性之引子係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6的序列或與SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6具90%以上相似度且與 ORSV具有專一性的序列；及該對於ORSV具有專一性之引子對包括由SEQ ID NO：5的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：6的序列組成的寡核苷酸；該對於CMV具有專一性之引子係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的序列或與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具90%以上相似度且與CMV具有專一性的序列；及該對於CMV具有專一性之引子對包括由SEQ ID NO：1的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：2的序列組成的寡核苷酸；該對於CaCV具有專一性之引子係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的序列或與SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具90%以上相似度且與CaCV具有專一性的序列；及該對於CaCV具有專一性之引子對包括由SEQ ID NO：3的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：4的序列組成的寡核苷酸。
2. 如請求項1之方法，其中該CyMV之核酸係來自CyMV之RNA依賴型RNA聚合酶基因、該ORSV之核酸係來自ORSV之RNA依賴型RNA聚合酶基因、該CMV之核酸係來自CMV之鞘蛋白基因，及該CaCV之核酸係來自CaCV之核鞘蛋白基因。
3. 如請求項1之方法，其進一步包括使用內部控制引子及/或引子對，該內部控制引子及/或引子對係可增幅蝴蝶蘭肌動蛋白基因之片段，該引子及/或引子對係選自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及在可增幅蝴蝶蘭肌動蛋白基因片段之條件下與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12之互補序列雜交之核酸序列所組成之群。
4. 如請求項1之方法，其中該反轉錄聚合酶鏈鎖反應為即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應(real-time RT-PCR)或多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應(multiplex RT-PCR)。
5. 如請求項4之方法，其中該反轉錄聚合酶鏈鎖反應為即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應，且該增幅條件為：-在50℃下反應10分鐘；-在95℃下反應5分鐘；及-在95℃下反應15秒、在57℃下反應15秒、在72℃下反應15秒及在82℃下反應15秒為1個循環，共重複30個循環。
6. 如請求項4之方法，其中該反轉錄聚合酶鏈鎖反應為多樣單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應，且該增幅條件為：-在42℃下反應20分鐘；-在94℃下反應2分鐘；-在95℃下反應15秒、在57℃下反應30秒及在72℃下反應20秒為1個循環，共重複30個循環；及-在72℃下反應10分鐘。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該反應之反應液中，鎂離子的濃度係介於2mM至7mM之間。
8. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該等引子之總和濃度係介於200nM至800nM之間。
9. 一種用於檢測胡瓜嵌紋病毒之引子，其係包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的序列或與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具90%以上相似度且與CMV具有專一性的序列。
10. 一種用於檢測胡瓜嵌紋病毒之引子對，其包括由SEQ ID NO：1的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：2的序列組成的寡核苷酸。
11. 一種用於檢測番椒黃化病毒之引子，其包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的序列或與SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具90%以上相似度且與CaCV具有專一性的序列。
12. 一種用於檢測番椒黃化病毒之引子對，其包括由SEQ ID NO：3的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：4的序列組成的寡核苷酸。
13. 一種用於檢測蝴蝶蘭病毒之內部控制引子，其包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12的序列或與SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12具90%以上相似度且與該內部控制引子具有專一性的序列。
14. 一種用於檢測蝴蝶蘭病毒之內部控制引子對，其包括由SEQ ID NO：11的序列組成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：12的序列組成的寡核苷酸。
15. 一種用於用於檢測胡瓜嵌紋病毒之套組，其包含如請求項9之引子及/或請求項10之引子對。
16. 一種用於檢測番椒黃化病毒之套組，其包含如請求項11 之引子及/或請求項12之引子對。
17. 一種同時檢測植物樣本中4種病毒感染之套組，其包含如請求項1所定義之引子及/或引子對。
18. 如請求項15至17中任一項之套組，其進一步包含用於進行反轉錄聚合酶鏈鎖反應之試劑。
19. 一種同時檢測植物樣本中4種病毒感染之生物晶片，其包含如請求項1所定義之引子及/或引子對。