CN103088150B - 同时检测四种病毒的引物、引物对、方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明关于可同时检测选自蕙兰嵌纹病毒(Cymbidium mosaic virus；CyMV)、齿舌兰轮斑病毒(Odontglossum ringspot virus；ORSV)、胡瓜嵌纹病毒(Cucumber mosaic virus；CMV)及番椒黄化病毒(Capsicum chlorosis tospovirus；CaCV)的病毒的引物、引物对、方法及试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及病毒的检验技术。具体地讲，本发明涉及利用兰花病毒专一性引物及引物对同时检测数种兰花病毒的检验技术。
背景技术
兰花是重要花卉产品，极具经济价值，其中又以蝴蝶兰为主要花卉。例如，台湾的出口量历年来呈现正向成长现象，于2009年出口金额已达20亿台币。兰花跟所有植物一样，于栽培过程中都可能面临病虫害的威胁，而导致生长与质量上的损失。对于大多数感染兰花的病害而言，只要运用传统的防治方法例如施用药剂，均可获得良好的防治效果，唯独由滤过性病毒所感染的病毒病至今仍缺乏有效的治疗对策。因此，病毒造成的病害可说是目前最困扰兰花产业的病害。
病毒之所以成为兰花产业上最受关切的病原，其主要原因在于病毒可在兰花植株上造成全株统性感染，使兰株生长缓慢，叶片出现条纹、斑块、坏疽或绿色分布不均的嵌纹病征。有些敏感的品种在花朵上也会出现色泽不均、畸形或提早凋萎等病征，严重损及兰花的商品价值。
根据文献的纪录，可以感染兰花的病毒种类至少有28种。但证实在台湾地区发生的只有蕙兰(东亚兰)嵌纹病毒(Cymbidium mosaic virus，简称CyMV)、齿舌兰轮斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，简称ORSV)、胡瓜嵌纹病毒(Cucumber mosaic virus，简称CMV)及番椒黄化病毒(Capsicum chlorosis tospovirus，简称CaCV)等四种，其中又以CyMV及ORSV感染情况最普遍，对兰花产业严重影响。在台湾CaCV感染虽不普遍，但由于其感染蝴蝶兰后造成的黄化轮斑与凹陷坏疽病征首在台湾发现，因此CaCV被称为「台湾病毒(Taiwan virus)」，这对台湾蝴蝶兰市场造成相当大的冲击。然而，后续研究发现，世界各国的辣椒、蕃茄、花生及大岩桐早已有感染CaCV的历史，其中茄科作物(如蕃茄、辣椒、甜椒及烟草等)对CaCV有高度感病性，感染后会造成轮斑、萎凋甚至死亡。因此，CaCV虽然在台湾蝴蝶兰感染尚不及CyMV及ORSV普及，但其对农业上可造成的农作损害却非常广泛且严重。
跟所有作物一样，要栽培健康完美的兰花，无病的健康种苗为重要因素。国际市场上对于兰花除了于品种与美观考量外更出现「无病毒健康苗」的竞争。面对国际市场竞争，产业界开始应用「组织培养技术」复制分生苗，降低种苗病毒感染率。以现今蝴蝶兰产业为例，约有二成的种苗乃利用亲本授粉所结的种子繁殖而来，称为「实生苗」，其余约八成的种苗乃藉由无性组织培养技术，将优良性状的植株大量复制成为具有完全相同性状的种苗，这种种苗称为「分生苗」。不过分生苗虽然可以复制其亲本植株的所有优良性状，但也可能继承其亲本所感染的「病毒病」，而影响后续的栽培、生育与开花质量。因此优良性状的兰株必须经过病毒检测程序，确定无病毒感染后，才能进行分生组织培养大量复制分生苗，此种程序已成为现今国际兰花产业界的普识作为。
要确实执行种苗的病毒验证，必须仰赖敏感及有效率的病毒检测技术，才能准确筛选感染病毒的植株。过去二十年来国际上最广泛应用于植物种苗病毒检测的技术为酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)。然而近年来多项研究证据显示兰花受到病毒侵入后常会呈现潜隐性感染，于病组织中仅累积微量病毒，因而超出ELISA的检测范围，导致漏检的情况发生。
已有报导提供「四种兰花病毒免疫快速检测试剂研发的抗原与抗体」，其提供针对ORSV、CyMV、CaCV及CMV等蝴蝶兰病毒的血清检测与高敏感度的核酸检测试剂与技术(请参行政院农业委员会农业试验所技转公告「四种兰花病毒免疫快速检测试剂研发的抗原与抗体」http://www.tari.gov.tw/taric/modules/news/article.php？storyid＝450)。惟，该研究仅提供针对此4种病原进行ELISA的的抗体以及对照抗原，而无揭示关于核酸检测的试剂及技术。
台湾第096120312号发明专利申请案(公开号200848735)揭示一种检测兰花病毒的试剂及方法，其利用分布于溶液中的磁性奈米颗粒，每一磁性奈米颗粒包括磁性层、接口活性剂层及多个兰花病毒抗体。该专利申请案揭示以所述方法检测CyMV、ORSV及CMV。
台湾第097112694号发明专利申请案(公开号200942617)揭示可同时检测ORSV及CyMV引物、引物对、试剂盒及方法。该方法在反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)、实时反转录聚合酶链锁反应(real-time RT-PCR)或多重反转录聚合酶链锁反应(multiplexRT-PCR)中，利用其所开发的引物及引物对，于单一少量兰花样本中进行至少一种病毒核酸的定量。
张清安另发展一种可以于单步骤下同时检测兰花CaCV、ORSV及CyMV的多重反转录聚合酶链锁反应检测技术(请参兰花种苗病毒检测与相关产业发展趋势，农业生技产业季刊，第九期)。
高雄师范大学利用磁颗粒分离技术检测六种感染蝴蝶兰病毒的研究，利用多重反转录聚合酶链锁反应检测CyMV、CMV及ORSV(请参利用磁颗粒分离技术检测六种感染蝴蝶兰病毒的研究，黄诗婷，2008，国立高雄师范大学生物科技研究所硕士论文)。
目前市面上检测蝴蝶兰病毒的技术多为检测CyMV及ORSV，尚无可同时检测CyMV、ORSV、CMV及CaCV等4种病毒的分子检测方法。所以，仍有需要可快速、具专一性且灵敏地同时检测CyMV、ORSV、CMV及CaCV等4种兰花病毒的试剂及方法。
发明内容
本发明提供一种同时检测一样本中CyMV、ORSV、CMV及CaCV感染的方法，其利用对于CyMV、ORSV、CMV及CaCV的核酸具有专一性的引物及/或引物对将该样本进行各种反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)，以扩增CyMV、ORSV、CMV及CaCV的特异性核酸，藉此于单一少量样本中快速并准确检测检测低含量的这些病毒核酸，其不仅提高检测病毒的专一性、灵敏度及准确度，缩短检测时间，更可降低生产遭病毒感染的植物的风险及成本。
任何可能遭受上述病毒感染的植物均可使用本发明方法、引物、引物对及试剂盒进行检测。较佳地，该植物为兰花；更佳地，该植物为蝴蝶兰。
用语「引物」指具有游离3’羟基的短核酸序列，其可与互补的模板进行碱基配对交互作用并作为模板股复制的起始点。本发明亦包括这些引物的寡核苷酸的变体，例如具40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同源性但仍会与CyMV、ORSV、CMV及CaCV的核酸结合的核酸序列。根据一较佳具体实施例，如变异序列集中于5’端，可达到约50％的变异度。
在本发明的一较佳实施例中，该CyMV的核酸来自CyMV的RNA依赖型RNA聚合酶基因、该ORSV的核酸来自ORSV的RNA依赖型RNA聚合酶基因、该CMV的核酸来自CMV的鞘蛋白基因，及该CaCV的核酸来自CaCV的核鞘蛋白基因。
在本发明的另一较佳实施例中，该CyMV的核酸来自CyMV的RNA依赖型RNA聚合酶基因、该ORSV的核酸来自ORSV的RNA依赖型RNA聚合酶基因、该CMV的核酸来自CMV的鞘蛋白基因，及该CaCV的核酸来自CaCV的核鞘蛋白基因。
在本发明的另一较佳实施例中，该对于CyMV具有专一性的引物包括一寡核苷酸，其由下列序列组成：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的序列或与SEQID NO：7或SEQID NO：8具90％以上同源性且与CyMV具有专一性的序列。
在本发明的另一较佳实施例中，该对于CyMV具有专一性的引物对包括由SEQ IDNO：7的序列组成的寡核苷酸及由SEQID NO：8的序列组成的寡核苷酸。
在本发明的另一较佳实施例中，该对于ORSV具有专一性的引物包括一寡核苷酸，其由下列序列组成：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6的序列或与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6具90％以上同源性且与ORSV具有专一性的序列。
在本发明的另一较佳实施例中，该对于ORSV具有专一性的引物对包括由SEQ IDNO：5的序列组成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：6的序列组成的寡核苷酸。
在本发明的另一较佳实施例中，该对于CMV具有专一性的引物包括一寡核苷酸，其由下列序列组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的序列或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具90％以上同源性且与CMV具有专一性的序列。
在本发明的另一较佳实施例中，该对于CMV具有专一性的引物对包括由SEQ IDNO：1的序列组成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：2的序列组成的寡核苷酸。
在本发明的另一较佳实施例中，该对于CaCV具有专一性的引物包括一寡核苷酸，其由下列序列组成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的序列或与SEQ ID NO：3或SEQID NO：4具90％以上同源性且与CaCV具有专一性的序列。
在本发明的另一较佳实施例中，该对于CaCV具有专一性的引物对包括由SEQ IDNO：3的序列组成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：4的序列组成的寡核苷酸。
在本发明的另一较佳实施例中，可进一步包括使用选自由SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及在可扩增蝴蝶兰肌动蛋白基因片段的条件下与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12具90％以上同源性且所组成的群的内标(internal control)引物及/或引物对。
本发明引物可使用习知的固相支撑法或其它周知的方法而化学合成。这些核酸序列可使用已知方法修饰。这些修饰的非限制实例包括甲基化、以其类似物取代一或多个核苷酸及核苷酸间修饰，例如，修饰为不带电荷结合物(如甲基磷酸盐、磷酸三酯、磷酸酰胺、甲酰胺等)或带电的结合物(如phosphorothioate、phosphorodithioate等)。核酸可含有一或多个额外共价结合的残基，例如，蛋白质、螯合剂及烷化剂。本发明的核酸序列亦可使用直接或不直接提供检测讯号的标记而改变。这些标记的实例包括放射线同位素、荧光分子及生物素。
本发明引物可使用，例如，聚合酶链锁反应(PCR)进行检测。聚合酶链锁反应包括，但不限于，实时聚合酶链锁反应(Real-time PCR)、实时定量聚合酶连锁反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称Q-PCR)、多重聚合酶连锁反应(Multiplex PCR)、反转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)、实时反转录聚合酶链锁反应、实时定量反转录聚合酶连锁反应及多重反转录聚合酶连锁反应。
在本发明的另一较佳实施例中，使用实时反转录聚合酶链锁反应进行病毒核酸扩增，其扩增条件为：
-在50℃下反应10分钟；
-在95℃下反应5分钟；及
-在95℃下反应15秒、在40至60℃(较佳为57℃)下反应10至30秒或更长(较佳为15秒)、在72℃下反应15秒及在82℃下反应15秒为1个循环，共重复30个循环。
在本发明方法的另一较佳实施例中，使用多重反转录聚合酶链锁反应进行病毒核酸扩增，其扩增条件为：
-在42℃下反应20分钟；
-在94℃下反应2分钟；
-在95℃下反应15秒、在40至60℃(较佳为57℃)下反应10至30秒或更长(较佳为30秒)及在72℃下反应20秒为1个循环，共重复30个循环；及
-在72℃下反应10分钟。
在本发明法的又一较佳实施例中，聚合酶链锁反应的反应液中，镁离子的浓度介于2mM至7mM之间，较佳为介于3mM至5mM之间，更佳为4mM。引物的总和浓度介于200nM至800nM之间，较佳为介于400nM至800nM之间，更佳为800nM，dNTP浓度范围介于400至2000nM之间，较佳介于400至800nM之间。
本发明另提供一种用于检测胡瓜嵌纹病毒(CMV)的引物及/或引物对。根据本发明，用于检测胡瓜嵌纹病毒的引物包括一寡核苷酸，其由下列序列组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的序列或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具90％以上同源性且与CMV具有专一性的序列。根据本发明，用于检测胡瓜嵌纹病毒的引物对包括由SEQ ID NO：1的序列组成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：2的序列组成的寡核苷酸。
本发明另提供一种用于检测番椒黄化病毒(CaCV)的引物及/或引物对。根据本发明，用于检测番椒黄化病毒的引物包括一寡核苷酸，其由下列序列组成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具90％以上同源性且与CMV具有专一性的序列。根据本发明，用于检测番椒黄化病毒的引物对包括由SEQ ID NO：3的序列组成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：4的序列组成的寡核苷酸。
本发明另提供一种用于检测蝴蝶兰病毒的内标引物及/或引物对。根据本发明，用于检测蝴蝶兰病毒的内标引物选自由SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12具90％以上同源性且与该内标引物具有专一性的序列。根据本发明，用于检测蝴蝶兰病毒的内标引物对包括由SEQ ID NO：11的序列组成的寡核苷酸及由SEQ ID NO：12的序列组成的寡核苷酸。
根据本发明，可将上述对于CyMV、ORSV、CMV及CaCV的核酸具有专一性的引物及/或引物对或蝴蝶兰内标引物及/或引物对的DNA序列片段再依据基因DNA序列数据向两边扩展，分别设计引物，以得到较大片段的CyMV、ORSV、CMV、CaCV及/或蝴蝶兰特异性核酸片段。
本发明的引物及/或引物对可容许约10至50％的序列变异，而不影响PCR结果。由实验结果可知，若变异集中于5’端，则最多容许达40％至50％变异(约7至10mer)。
本发明另提供一种用于检测胡瓜嵌纹病毒的试剂盒，其包含本发明的用于检测胡瓜嵌纹病毒的引物及/或引物对。
本发明另提供一种用于检测番椒黄化病毒的试剂盒，其包含本发明的用于检测番椒黄化病毒的引物及/或引物对。
本发明另提供一种同时检测植物样本中蕙兰嵌纹病毒CyMV、ORSV、CMV及CaCV感染的试剂盒，其包含前述的对于CyMV、ORSV、CMV及CaCV的核酸具有专一性的引物及/或引物对。
本发明的试剂盒可进一步包含用于进行PCR的PCR反应溶液配方。本发明的试剂盒另可包括适合的反应缓冲液及DNA校正数据。根据本发明，该试剂盒的PCR反应酵素及试剂为本领域技术人员所熟知。本发明试剂盒的其它组件及制备由本领域技术人员，根据习知技术，修改一般PCR试剂盒制备的技术即可制得。
附图说明
图1为5组引物检测目标基因的极限测试图。内标、CyMV、ORSV、CMV与CaCV(括号内为引物名称)分别单独进行检测极限测试。每个引物由左至右分别为7+1E至1+1E拷贝数(copy number)与NTC检测结果。第41至48泳道为5组引物同时检测5个混合的目标基因。由左至右分别为7E+1至1E+1拷贝数与NTC检测结果。
图2为CM343-F/CM343-R引物含量于检测极限影响电泳图。(a)至(c)为引物浓度由低至高的测试：(a)200nM CM343-F/CM343-R引物；(b)400nM CM343-F/CM343-R引物；(c)800nM CM343-F/CM343-R引物。每一引物浓度测试组中，由左至右为MgCl2浓度1mM至4mM。每一MgCl 2浓度测试组中基因浓度由左至右为5+1E至1+1E拷贝数。
图3为不同组合的2至4组引物于多重反转录聚合酶链锁反应的检测极限影响电泳图。(a)CM343-F/CM343-R与另一引物组合。(b)CM343-F/CM343-R与另二引物组合。(c)CM343-F/CM343-R与另三引物组合。括号内为引物名称。
图4为5组基因多重反转录聚合酶链锁反应电泳图。由左至右为Mg2+含量低至高(4、5及6mM)。
图5为多重反转录聚合酶链锁反应检测极限电泳图。测试3至6mM Mg2+含量的多重反转录聚合酶链锁反应检测极限，每一组RNA含量由左至右为8+1E至4+1E拷贝数。
图6为5组引物FP-1/RP-1、FP-2/RP-2、Pa183-F/Pa183-R、CM343-F/CM343-R、Ca157-F/Ca157-R的多重反转录聚合酶链锁反应分析。每一泳道皆含五组基因，第1泳道为五组基因各3+1E拷贝数，第2至6泳道为5组基因不同浓度的测试。
图7为蝴蝶兰样品的多重反转录聚合酶链锁反应检测电泳图。100个样品顺序由上至下排列检测。
图8为引物Ca157-F/Ca157-R与CM343-F/CM343-R的实时反转录聚合酶链锁反应效率测试。图8A与8B为Ca157-F/Ca157-R的结果。图8C与8D为CM343-F/CM343-R的结果。图8A与8C为PCR曲线，图8B与8D为标准曲线。
具体实施方式
本发明主要针对CMV鞘蛋白(简称CMV-CP)与CaCV核鞘蛋白(简称CaCV-NP)基因设计简并引物(degenerate primer)，使引物可同时检测不同变异的CMV与CaCV。所设计的CMV简并引物于NCBI序列比对，至少可检测涵盖蝴蝶兰、瓜类、百合、豇豆、胡椒等不同地区变异的CMV(GenBank序列编号分别为AJ131618、DQ004557、EU429567、AY611027、AF198266、FJ896159)。CaCV简并引物于NCBI序列比对，至少可检测蝴蝶兰、百合、孤挺花、花生、西红柿等不同地区变异的CaCV(GenBank序列编号分别为EF100595、EF137177、EF602029、EU095940)。
本发明依病原的特定基因序列设计专一性引物，成功的建立可以于一反应液中同时检测多组病原的多重反转录聚合酶链锁反应(multiplex RT-PCR)与高感度的实时反转录聚合酶链锁反应(real-time RT-PCR)技术。本发明的专一性引物，可使用于多重反转录聚合酶链锁反应(multiplex RT-PCR)，亦适用于实时反转录聚合酶链锁反应(real-time RT-PCR)技术。针对多重反转录聚合酶链锁反应检测，当调整PCR条件至3mM至7mM(较佳为4mM以上)的Mg2+浓度时，可于一反应液中同时检测任意目标病原，检测极限为1pg。以实时反转录聚合酶链锁反应来检测上述病原其扩增效率可达90％至110％(退火温度50至60℃)，检测极限为1fg。
本发明另建立CyMV、ORSV、CaCV与CMV此4种病毒的共同检测技术。除了上述两种RT-PCR，亦可使用生物芯片来快速筛检，其是利用本发明设计的专一性引物扩增出的基因片段，取其中约18-30(较佳约25)个连续核苷酸作为探针以达到专一性检测的目的。
以下实施例单纯是本发明的例示，故不应以任何方式被视为本发明范围的限制，其并详细描述了本发明在前文中所讨论的观点和实施例。
实例1引物设计
针对Cucunber mosaic virus鞘蛋白(简称CMV-CP)与Capsicum chlorosis tospovirus核鞘蛋白(简称CaCV-NP)基因设计简并引物，使引物可同时检测不同基因变异的目标病毒。
由GenBank搜寻已发表的CMV-CP及CaCV-NP基因序列。以CMV-CP基因序列(GenBank序列编号AJ131618、AJ131619、AJ871492、DQ004557、D28780、AJ810266、AY611027、FJ403473、EU128723、AF198622、DQ285569、AK172329、AY172328、EF620777、FJ896156、FJ896157、FJ896160、FJ896159)设计对CMV-CP基因具专一性的引物对CM343-F(SEQ ID NO：1)及CM343-R(SEQ ID NO：2)。以CaCV-NP基因序列(GenBank序列编号EF100595、EF100598、EF100597、EF137177、EF100600、EF602029、EU216023、EU095940)设计引物Ca157-F(SEQ ID NO：3)及Ca157-R(SEQ ID NO：4)。
引物设计原则为GC含量40％以上，并避免形成引物二聚体(dimer)结构，且与台湾第097112694号发明专利申请案的FP-1(SEQ ID NO：5)、RP-1(SEQ ID NO：6)、FP-2(SEQID NO：7)、RP-2(SEQ ID NO：8)、FP-3(SEQ ID NO：9)、RP-3(SEQ ID NO：10)引物可于同一条件下专一性扩增。另以蝴蝶兰肌动蛋白基因(GenBank序列编号U18102)设计Pa183-F(SEQ ID NO：11)及pa183-R(SEQ ID NO：12)引物，以降低共同检测不专一性干扰。本专利的针对CMV-CP及CaCV-NP基因的引物确认可与台湾第097112694号发明专利申请案的引物与Pa183-F/pa183-R引物共同检测。这些引物序列如下表所示。
实例2RNA制备
样品冻干完成后以玻璃珠磨碎，将磨碎得到的粉末保存于-80℃冰箱。分别取0.1g磨碎样品以Trizol(invitrogen；cat#15596018)、Quick Gene RNA组织试剂盒II(FujiFilm；cat#RT-S2)与Dr.RNA萃取试剂盒(晶宇生物科技公司；cat#8c2018-01)萃取RNA，萃取步骤参考各家操作手册。
实例3标准质粒制备
以感染CMV与CaCV病毒的叶片检体核酸为模板，取CM343-F/CM343-R与Ca157-F/Ca157-R简并引物进行RT-PCR扩增，以PromegaSV Gel and PCRClean-Up系统(Promega；cat#A9281)进行DNA片段回收纯化。回收的扩增产物与TA载体黏合，将其选殖于yT&A质粒(益生生技公司；cat#YC103)，并于转型于对应的大肠杆菌(益生生技公司；cat#YE607)后定序。CaCV定序序列为SEQ ID NO：14，比对后确认其为GenBank序列编号EF095725；CMV定序序列为SEQ ID NO：13，比对后确认其为GenBank序列编号EU329011。取3mL含有质粒的隔夜培养的菌液，离心后移除上层液，再以Promega公司所生产的PureYieldTM Plasmid Miniprep系统(Promega；cat#A1223)纯化组来萃取大肠杆菌中的质粒。将纯化的质粒置于4℃暂时保存，或储存于-20℃下永久保存。以DNA限制酶于特定切点水解纯化后的质粒，把DNA和上样缓冲液(loading buffer)混合均匀，注入1％凝胶的试样槽，并加入DNA分子量标准品(DNAmaker)，施以100伏特的电压进行分离。经SyBr Green(SEENING；cat#SE-100)染色后，在UV光源下观察与照相DNA片段分离情形，并藉由DNA分子量标准品来判读DNA大小。
实例4反转录基因
大量抽取含T7启动子与目标基因的质粒，分别以限制酶酵素Xbal线性化质粒，并回收线性的质粒。以AmpliScribe T7-Flash转录试剂盒(AmpliScribe；cat#ASF3257)进行反转录。依据操作手册配制反应液，置于37℃下反应3小时进行转录。完成转录反应后各自添加1μl DNase将线性质粒降解后进行RNA回收，再以每50μl RNA添加2.5μl RNA Armor试剂(Protech；cat#RT-R486)以避免RNA降解。
实例5多重反转录聚合酶链锁反应(Multiplex RT-PCR)的反应条件探讨
检测灵敏度除了与技术类别有关，试剂材料与实验设计方法也都会影响其结果。影响PCR检测灵敏度的因素则有PCR温度条件、引物专一性、引物浓度、Mg2+浓度、K+浓度与Tag种类等。多重反转录聚合酶链锁反应技术为于同一反应液中，同时进行多于一组基因的扩增，此技术所需的仪器耗材与检测步骤皆与一般PCR相同。但，当进行多重反转录聚合酶链锁反应反应时，引物间是否会相互作用，产生不专一产物。亦或多组基因同时扩增效率是否会不同，而导致部份基因检测灵敏度下降。或者当不同基因浓度有差异时，是否会造成竞争抑制导致假阴性等，皆须进一步探讨以排除可能的影响。
欲使五组基因同时检测时扩增效率一致，进行不同条件的共同检测极限测试。本实例探讨100～800nM引物与1～4mM MgCl2浓度组合下的最佳扩增条件范围。另，讨论多组基因同时检测时的竞争效应，固定引物浓度，以不同基因组合搭配3～6mMMgCl2的条件探讨最佳扩增结果。以Flexi DNA聚合酶(Promega；cat#M8295)进行多重聚合酶链锁反应。扩增条件为：94℃下反应2分钟，一循环；以95℃下反应15秒、57℃下反应30秒及72℃下反应20秒为一循环，共进行30个循环；及72℃下反应10分钟，一循环。
以one step RT-PCR试剂盒(Invitrogen；cat#12574026)进行反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)，扩增条件为：42℃下反应20分钟，一循环；94℃下反应2分钟，一循环；以95℃下反应15秒、57℃下反应30秒及72℃下反应20秒为一循环，共进行30个循环；及72℃下反应10分钟，一循环。
(1)单一组引物PCR测试
一般PCR检测极限约3+1E拷贝数，本发明的CM343-F/CM343-R与Ca157-F/Ca157-R引物与台湾第097112694号发明专利申请案的FP-1/RP-1、FP-2/RP-2及FP-3/RP-3，检测极限测试结果如图1所示。在此条件下，除了CM343-F/CM343-R引物检测极限仅为5+1E拷贝数外，其余四组引物皆可达3+1E拷贝数。而以5组引物同时进行多重反转录聚合酶链锁反应扩增时，基因个别含量由7+1E至3+1E及CM343-F/CM343-R皆无法同时扩增。此结果发现CM343-F/CM343-R引物的扩增效率不佳，可能为简并引物的缘故。因此，需增加CM343-F/CM343-R引物量与改变反应中的Mg2+浓度，以提高CM343-F/CM343-R的检测极限。
如图2所示，当引物总和浓度为200nM，Mg2+浓度提高至4mM时，检测极限亦仅5+1E拷贝数(图2(a))。当引物总和浓度提高至400nM，Mg2+浓度提高至3mM时，CM343-F/CM343-R基因的检测极限达3+1E拷贝数(图2(b))。当引物总和浓度提高至800nM浓度时，Mg2+浓度2mM时即可使检测极限达3+1E拷贝数(图二(c))。由于Mg2+浓度过高可能会有不专一产物产生，因此以总和浓度800nM的CM343-F/CM343-R引物进行测试。
(2)以2至4组引物进行多重反转录聚合酶链锁反应共同检测
PCR反应中，dNTP与寡核酸的反应需要Mg2+辅助，因此Mg2+含量与dNTP与寡核酸需为一最佳比例。多重反转录聚合酶链锁反应中引物含量较单一基因PCR高，扩增基因所需的dNTP亦较单一基因PCR高。因此为得最佳的多重反转录聚合酶链锁反应，进行2组至4组基因组合，讨论所需的最佳Mg2+含量。如图3所示，当扩增基因组数提高时，所需的Mg2+含量亦须提高。因此，要同时扩增4组基因，至少须4mM含量的Mg2+。与单一基因扩增比较(图2)，多组基因同时扩增的确需要较多Mg2+予以辅助。
(3)以5组引物FP-1/RP-1、FP-2/RP-2、FP-3/RP-3、CM343-F/CM343-R、Ca157-F/Ca157-R进行多重反转录聚合酶链锁反应共同检测
未调整前，5组基因无法同时扩增(请见图1)。经调整引物与Mg2+量后，五组基因同时扩增结果如图4所示。
转录目标基因RNA，确认多重反转录聚合酶链锁反应条件，及5个基因多重反转录聚合酶链锁反应检测结果如图5所示。在5组基因含量相同的状况下，当Mg2+含量＞4mM时，共同检测极限最佳为5+1E样本数，相当于1pg RNA。
(4)以5组引物FP-1/RP-1、FP-2/RP-2、pa183-F/pa183-R、CM343-F/CM343-R、Ca157-F/Ca157-R Multiplex PCR共同检测
在样品实际检测过程中为求降低不专一干扰影响，将内标引物更换为pa183-F/pa183-R，以进行共同检测测试，其结果如图6所示。由结果可确认检测病毒的引物可搭配不同内标。
实例6以多重反转录聚合酶链锁反应检测蝴蝶兰样品
以实际蝴蝶兰样品测试5组引物FP-1/RP-1、FP-2/RP-2、Pa183-F/Pa183-R、CM343-F/CM343-R、Ca157-F/Ca157-R。以此5组引物进行蝴蝶兰约莫120个样品实际检测，结果如图7所示。由多重反转录聚合酶链锁反应检测统计结果发现，样品感染CyMV与ORSV机率较高，分别为约50％与55％；而CaCV与CMV则仅分别为8％与5％。
实例7实时反转录聚合酶链锁反应(Real-time RT-PCR)引物效率与检测极限探讨
引物放大效率会影响共同反应时的准确性，最佳的状态应为2倍放大，最佳放大效率为90-110％，计算公式为：效率(η)＝[10(-1/斜率)]-1，其中斜率为Y/X，X为浓度或拷贝数(copy number)的log值，Y为Ct值(Threshold cycle)。因此当放大效率为100％时，斜率约-3，以此方法换算判断最佳引物放大效率。
为得到5组引物最佳扩增条件，进行30～60℃引物效率探讨。分别取含目标基因的质粒测定浓度后，进行10倍连续稀释PCR放大，标准曲线R2＞0.95方可信任。以iQ SYBRGreen supermix PCR试剂盒(Bio Rad；cat#170-8884)调配PCR反应液，进行实时反转录聚合酶链锁反应引物效率与检测极限分析。以iScript One-Step RT-PCR Kit With SYBRGreen(Bio Rad；cat#BP170-8893)进行实时反转录聚合酶链锁反应测试分析。
以iQ SYBR Green supermix PCR试剂盒进行实时聚合酶链锁反应测试的扩增条件为：95℃下反应5分钟，一循环；以95℃下反应15秒、57℃下反应15秒、72℃下反应15秒*及82℃下反应15秒*为一循环，共进行30个循环；及55至95℃熔解温度测试，其中*为荧光检测点。以iScrip one step RT PCRwith SYBR进行实时反转录聚合酶链锁反应测试的扩增条件为：50℃下反应10分钟，一循环；95℃下反应5min分钟，一循环；以95℃下反应15秒、57℃下反应15秒、72℃下反应15秒*及82℃下反应15秒*为一循环，共进行30个循环；及55至95℃熔解温度测试，其中*为荧光检测点。
CM343-F/CM343-R与Ca157-F/Ca157-R的引物放大效率测试，确认这些引物与台湾第097112694号发明专利申请案的FP-1/RP-1、FP-2/RP-2及FP-3/RP-3，于同一条件下扩增的引物放大效率达90至110％(请见如图8)。测试结果R2值皆可达0.95至0.999，引物放大效率亦皆位于90～110％间。此外，此5组引物由melt curve判断，其扩增结果具有高度专一性，如图9。当CM343-F/CM343-R-FR结果当引物总合提高至800nM浓度，其余4组引物总合200nM时，5组引物检测极限皆达3+1E(约10fg)。
实例8以生物芯片检测极限探讨
利用扩增后的基因片段其中约25个(例如20-30个)连续的核苷酸或其互补序列作为生物芯片的探针。因上述探针的序列可经由测序得知，故亦可直接在芯片上合成探针片段。
以下提供生物芯片的制作方法的一个实施例，但是本发明并不限于此方法。首先，将一空白芯片在45℃下烘烤约5分钟，分别将40微摩尔浓度的(μM)寡核苷酸探针加入探针溶液混合，再用点片机点在设定的位置，置于45℃烘烤1-2分钟，最后再以紫外线交联器(UV crosslinker)于0.8焦尔，6分钟的条件下将寡核苷酸探针固定在芯片上。
利用标记分子标记探针，标记分子包括，但不限于，生物素(Biotin)、荧光素、毛地黄等标记分子。本实施例中以具有生物素(Biotin)标定的引物与待测样本的DNA进行聚合酶连锁反应，其每一个反应液总体积为25μl，内含2ng待测样本模板DNA、250μM dNTPs、1X PCR缓冲液、0.2μM引物，以及0.5U Taq Pluse耐热聚合酶(Bio BasicInc.，Canada)。反应条件为95℃2分钟1个循环，(95℃15秒，55℃15秒，72℃15秒)30个循环，72℃10分钟1个循环完成反应，而得到具有生物素标定的待测样本的扩增产物，即为杂合反应的标的(target)。
将生物素标定的target DNA片段与本发明的生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交。依照本发明的较佳实施例，进行杂交反应的方法包含在芯片每一反应槽先加入杂交反应液，再加入适量生物素标定的target DNA片段与之混合，置于60℃环境下1小时，以进行杂交反应。之后洗去未杂交上的target片段，再加入显色剂(4μl NBT/BCIP+196μl Detection buffer)置于暗室中反应10分钟，反应后以清水清洗，并在45℃下烘干，以出现色斑的有无判定待测样本中是否有病原的存在。
Claims (8)
1.一种同时检测植物样本中4种病毒感染的方法，其中这些病毒为蕙兰嵌纹病毒(Cymbidium mosaic virus；CyMV)、齿舌兰轮斑病毒(Odontglossum ringspot virus；ORSV)、胡瓜嵌纹病毒(Cucumber mosaic virus；CMV)及番椒黄化病毒(Capsicum chlorosis tospovirus；CaCV)，该方法包含下列步骤：
(a)提供植物样本；
(b)提供对于CyMV、ORSV、CMV及CaCV的核酸具有专一性的引物对；
(c)利用这些引物对在可同时扩增这些病毒核酸的条件下对该植物样本进行反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)，以扩增CyMV、ORSV、CMV及CaCV的特异性核酸；及
(d)检测经扩增的样本中是否含有这些病毒的核酸；
其中，该对于CyMV具有专一性的引物对包括由SEQ ID NO:7的序列组成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:8的序列组成的寡核苷酸；
该对于ORSV具有专一性的引物对包括由SEQ ID NO:5的序列组成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:6的序列组成的寡核苷酸；
该对于CMV具有专一性的引物对包括由SEQ ID NO:1的序列组成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:2的序列组成的寡核苷酸；
该对于CaCV具有专一性的引物对包括由SEQ ID NO:3的序列组成的寡核苷酸及由SEQ ID NO:4的序列组成的寡核苷酸；
该可同时扩增这些病毒核酸的条件包含：该反应的反应液中，镁离子的浓度介于4 mM至7 mM之间；及这些引物的总和浓度介于200 nM至800 nM之间。
2.如权利要求1的方法，其中该CyMV的核酸来自CyMV的RNA依赖型RNA聚合酶基因、该ORSV的核酸来自ORSV的RNA依赖型RNA聚合酶基因、该CMV的核酸来自CMV的鞘蛋白基因，及该CaCV的核酸来自CaCV的核鞘蛋白基因。
3.如权利要求1的方法，其进一步包括使用内标引物对，该内标引物对可扩增蝴蝶兰肌动蛋白基因的片段，该引物对选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12的核酸序列所组成的群。
4.如权利要求1的方法，其中该反转录聚合酶链锁反应为实时反转录聚合酶链锁反应(real-time RT-PCR)或多重反转录聚合酶链锁反应(multiplex RT-PCR)。
5.如权利要求4的方法，其中该反转录聚合酶链锁反应为实时反转录聚合酶链锁反应，且该扩增条件为：
-在50℃下反应10分钟；
-在95℃下反应5分钟；及
-在95℃下反应15秒、在57℃下反应15秒、在72℃下反应15秒及在82℃下反应15秒为1个循环，共重复30个循环。
6.如权利要求4的方法，其中该反转录聚合酶链锁反应为多重反转录聚合酶链锁反应，且该扩增条件为：
-在42℃下反应20分钟；
-在94℃下反应2分钟；
-在95℃下反应15秒、在57℃下反应30秒及在72℃下反应20秒为1个循环，共重复30个循环；及
-在72℃下反应10分钟。
7.一种同时检测植物样本中4种病毒感染的试剂盒，其包含如权利要求1所定义的引物对。
8.一种同时检测植物样本中4种病毒感染的生物芯片，其包含如权利要求1所定义的引物对。
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