TWI342880B - Method for producing sugar chain derivatives, and sugar chain derivatives - Google Patents

Description

1342880 . · 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於由糖鏈混合物製造冑職生物之方法以 、及糖鏈之構造解析方法。尚且亦關於依據本發明之糖鍵衍 生物‘ 4方法所製造之新穎糖鏈衍生物。 【先前技術】 咸認糖蛋白質中的糖鏈係擔任蛋白f立體構造之保 持，防止源自蛋白酶的分解，而獲得抵抗性等作用。最近 •漸漸了解有關糖蛋白質中之糖鏈參與受精或分化，傳達訊 號，癌化，蛋白質於細胞内之輸送及生理活性之調節等生 命現象。此外’亦明瞭細胞表面之接著分子或糖蛋白質性 :荷爾蒙等之糖鏈與其機能的相互關係，而得到糖質科學共 J研究開發之構想。目前，糖鏈機能研究中心係成為有關 主司其生合成之糖轉移酶（糖鏈基因）的研究重心，惟保存 糖轉移酶及基因情報，依據與其他蛋白質之協調作業，而 籲考里生命機能之相關性時，有必要藉由補捉細胞組織中表 現之糖鏈的全體像並加以解析之構造醣質體分析 (glycomics)方法，進一步解析糖鏈之機能。 - ⑨糖鏈科學中構造糖質體分析之角色係網羅式地解析 擔任多種生命現象重要角色的糖鏈認識機構，係機能構造 '醣質體分析不可缺少之要件。構造醣質體分析所要求之= 術要件為：高度網羅性，高產率，高敏感度及高精確度。 目前，糖蛋白質糖鏈之構造解析法，係將由蛋白g切 出之糖鏈經螢光標示後，使用高速液體層析法（HpLc)或質 6 318410 1342880 '量为析法（MS)進行解析之方法，由於質量分析顯著的進步 而成為有力的手段（非專利文獻卜4)唾液酸（sia][〇)糖鏈之分 離至今係僅使用陰離子交換管柱層析法（非專利文獻5)。 (非專利文獻 l)Bi〇med Chromatogr. 16 : 103-115(2002 年） ·.(非專利文獻 2)Anal Biochem 206:278-287(1992 年） (非專利文獻 3)Biochem Soc Trans, 21:121-125(1993 年） (非專利文獻 4)Chem Rev. 102:321-369(2002 年） (非專利文獻 5)Biochem Biophys Acta. 705:167-173(1982 •年） 然而，網羅式解析細胞或組織中的糖鏈時，由於有唾 ，液酸或海藻糖等非還原末端修飾之多樣性及糖鏈分支之問 :喊存在，因而混合之糖鏈不能充分分離，而不能得到滿意 .的結果。特別是，使用離子交換管柱等時，由於不具有特 異的分離能力，不僅不能得到充分的分離，且分離操作後 必須施予脫鹽處理，不能稱為實用的方法。 φ 因此，考慮這些糖鏈的不均一性情報的同時，熱切期 待能夠詳細解析細胞，組織中特徵性糖鏈構造之實用方法。 本發明的課題係由於細胞或組織中如糖鏈般種種糖鏈 為混合存在之狀態，而提供將各別糖鏈分離而取得的手段。 , 再者，本發明的課題為提供解析經分離之各糖鏈化合 ‘物構造之手段。 此外’本發明的課題為提供新穎之糖鏈衍生物。 【發明内容】 本發明係關於以下之發明。 318410 7 1342880 種糖鏈衍生物之製造方法，係由糖鏈混合物製造糖鍵 何生物之方法，其特徵為具備：（a)將脂溶性基導入糖鏈混 合物中的糖鏈而得糖鏈衍生物混合物之步驟，以及邙）以羚 \色胺（serotonine)親和性管柱層析法處理該糖鏈衍生物^ \ 合物之步驟。 此 1如上述記載的糖鏈衍生物之製造方法，係於（b)步驟之 後，具備（c)以使用胺基管纟或酿胺基管柱之順相層析法進 ΤΪ"處理之步驟。 • 3.如上述記載的糖鏈衍生物之製造方》，係於⑷步驟之 - 前，具備（d)以糖水解酶處理之步驟。 一 4·-種糖鏈之構造解析方法，係解析糖鏈混合物中糖鍵構 :造之方法’其特徵為具備：⑷將脂溶性基導入糖鍵混合物 •中=糖鏈而得糖鏈衍生物混合物之步驟，⑻以經色胺親和 性管柱層析法處理該糖鏈衍生物混合物之步驟，（e)依質量 分析法處理之步驟。 鲁5.如上述記載的糖鏈構造解析方法，係於卬）步驟之後， 具備⑷以使用胺基管柱或醯胺基管柱之順相層析法處理 之步驟。 ,6.如上述記載的糖鏈構造解析方法’係於⑷步驟之前，具 備（d)以糖水解酶處理之步驟。 7·如上述4項6己載的糖鏈構造解析方法，其中，質量分析 法係依據MALDI-TOF MS之質量分析法。 8.種下列通式⑴至⑹所示之糖鍵衍生物[式中r1表示 叛基苯基，3_㈣笨基，續基笨基1 卜乙氧基㈣苯基， 318410 8 (，£ 1342880 源自天然糖蛋白質的糖鏈為非還原末端的糖殘基隨機式欠 缺的糖鏈混合物，以使用此類糖鏈混合物為佳。以使用含 有於糖鏈殘基中具有唾液酸殘基之糖鏈的糖鏈混合物為 、佳。 - 天然糖鏈的混合物，可例舉如天然原料，例如源自乳 汁，源自牛之胎球蛋白（Fetuin)，蛋或生物組織或細胞的糖 鏈混合物。特別以使用源自癌組織或癌細胞的糖鏈混合 物，因為能期待非常有趣的結果而佳。 本發明能使用的天然糖鏈的混合物，以下文所例示的 糖鏈混合物為佳，惟以包含唾液酸糖鏈的糖鏈混合物特別 佳。 可使用由上述天然原料根據習知的方法，獲得之糖蛋 白質及/或糖胜肽的混合物，以蛋白質分解酶等作用而切斷 該混合物之胜肽部分，並使用凝膠過濾管柱和離子交換管 柱等層析法精製所得的糖鏈結合天門冬醯胺的混合物。 例如可使用生物組織或細胞，特別是培養組織或培養 細胞，並均勻化培養液中的組織或細胞，接著離心分離所 得的細胞膜流份，以2-巯乙醇處理之後，以N-聚糖酶作用 所得的糖鏈混合物。 再者，可使用將培養組織或培養細胞均句化，並藉由 採取離心分離後之上清液而得的游離糖鏈混合物。此類糖 鏈中因含有中性糖鏈之高甘露糖型糖鏈和多種類的唾液酸 糖鏈，而適合各種糖鏈的製造。 將脂溶性基導入所得糖鏈混合物中之糖鏈中作為糖鏈 10 318410 1342880 衍生物的混合物。 脂溶性基係與糖鏈的還原末端的開環醛，糖鏈結合天 門冬醒胺的天門冬酿胺之胺基或羧基反應而形成的具有脂 、=性的取代基’例如2_，3_或4•縣苯基胺基，對-乙氧基 、幾基苯基胺基，2·^基胺基㈣常作為螢光標識使用的 取代基和9苐基甲氧基羰基（Fm〇c)基，第三·丁氧基羰基 (BOC)基，苄基，烯丙基，烯丙氧基羰基，乙醯基等作為 胺曱酸系或醯胺系保護基使用的取代基。 > I根據習知的方法進行這些脂溶性基的導人，而就操 -作的續便性，所得糖鏈衍生物的安定性而言，由於激發光 ..係對應於水㈣或雷射光料，而以制Μ基苯基胺 -基，Fmoc基或B0(：基為佳。 例如’使用2-胺基苯曱酸，於氰基蝴氫化納或二甲基 胺化爛等還原劑的存在下與糖鏈反應，即可成為胺基醋醇 衍生物。 又，例如可使用9-苐基甲基-N-琥珀醯亞胺基碳酸酯， 於碳酸氫納存在下，與糖鏈結合天門冬⑽反應，即可於 天門冬醯胺的胺基導入如胺甲酸醋般結合的W基。 、依以上的操作，可得到導入脂溶性基的糖鏈衍生物的 以每色胺親和性管柱層才斤法分離所得之糖鏈衍生 混合物。 本發明的經色胺親和性管柱層析法係使用與唾液酸l 有親和性的經色胺作為配位體的親和性管柱。 ’、 318410 2 1342880 - 羥色胺親和性管柱，可使用在填充劑中使羥色胺固定 化而作成者，也可使用市販管柱。市販管柱可列舉如 羥色胺管柱（J-OIL MILLS公司製）等。 \ 層析法的分離條件係適宜地設定，舉一例而言，使用 〜螢光檢測器，以激發波長350nm，螢光波長425nm,流速 0.5ml/min，並使用超純水和乙酸銨水溶液作為移動相進行 直線梯度溶出即可達成分離。 藉由羥色胺親和性管柱層析法，可將糖鏈衍生物的混 •合物依據唾液酸殘基的數目進行分離，不具有唾液酸殘基 -的非唾液酸糖鏈衍生物最早溶出，接著依單唾液酸糖鏈衍 生物，二唾液酸糖鏈衍生物的情形而與唾液酸殘基數目的 •增加成比例的分離溶出。 * 如上述，將經羥色胺親和性管柱分離的糖鏈衍生物， 以使用聚合物基材的胺基管柱或氧化石夕基材的酿胺管柱之 順相HPLC處理’即可進行極為出色的糖鍵衍生物間的分 鲁離。所謂順相層析法，是使用胺基，胺基丙基，丙稀酿胺 基等極性固定相作為填充劑的層析法，係按照相對於樣品 成分的固定相-移動相的樣品成分之分配度的差異而達成 分離。基本上為按照糖鏈的親水性而分離的方式，也可較 佳地使用於結合唾液酸的糖鏈的異構體的分離。同時，也 .可較佳地使用於經稀酸或神經胺酸酶（neuraminidase)處理 的非唾液酸型糖鏈的分離。 f使用的^ 5物基材的胺基管柱，係使用使胺基與聚 乙烯醇系基材凝勝等聚合物結合之固定相作為填充劑的管 318410 12 1342880 柱’可以自行製作，或可以使用市販的管柱。 市販的胺基管柱，可例舉Asahi Shodex NH2P-50 4E (昭和電工公司製）。 、氧化矽基材的醯胺基管柱，係以化學結合將丙烯醯胺 •等酿胺基導入以氧化矽作為固定相的填充劑的管柱，可以 自行製作’亦可使用市販管柱。 市販的醯胺基管柱，可列舉TSK-GEL醯胺-80 (TOSOH公司製）。 I 層析法的分離條件係適當地設定，舉一例而言，使用 螢光檢測器，於激發波長35〇nm，螢光波長425nm，流速 lml/min’以含有乙酸的乙腈和含有乙酸及三乙胺的水溶液 作為移動相進行直線梯度溶出，即可分離。 a如乂上刀離所得的糖鏈衍生物，藉由適當使用糖水解 酶，質里分析法的分析，即可解析其糖鍵構造。 ，水解酶’可使用f知酵素，例如可列舉唾液酸酶， >酶等。苷_ #露糖㈣基葡萄糖胺酶，岩藻糖 析穿析：法係根據採用以往習知的質量分析法之分 ，MS 近年來料糖鏈分析的嫩咖彻 使用聚: = = =管Si定的糖水解酶作，以 相HPLC處理，所得二二^氧化矽基材的醯胺管柱之順 量份及水解酶的特性，3進行質量分析’考慮消失的質 炅進一步重覆此操作，即可解析糖

S 318410 1342880 鍵構造。 —所得的糖鏈衍生物，藉由除去其脂溶性基，即可人工 地容易而且大量的得到種種糖鏈。 月曰'合丨生基的去除可使用以往習知的方法。 例如’ 2_緩基苯基胺基的去除係於乙酸中與過氧化 在室溫反應而達成’可容易地回收游離型糖鏈。

OC基的去除係於队…二甲基甲醯胺中，於糖 生物中加入嗎福啉使反應達 / 反應而達成。 _ B〇c基的去除係與弱酸 後，1鏈係以糖鏈結合天門冬醯胺時，使與無水肼反肩 後 進行乙酿化的方法.亦於A ^ , 〜 進行：的方法等，即可除去天;二:熱回流後’ ::反應等一糖殘— 本發明者等，根據本發明的構 法，於各種癌細胞中成功的分離至 方法及製造方 ⑴至⑹所社糖鏈。 7未發現到的下列通式 318410 14 1342880

15 318410 1342880

<：£ 16 318410 1342880

[式中R1表示2-羧基苯基’ 3-羧基笨基，4-羧基苯基，對_ 乙氧基羰基苯基，或2-吼啶基。R2表示羥基，基_Asn或基 -Asn-R。於此，Asn表示天門冬醯胺醯基，R3胺曱酸系或 表示醯胺系保護基。Ac表示乙醯基]。 咸認這些新穎糖鏈係於癌細胞中特異性地表現者，可 利用這些糖鏈作為癌標記。 例如製作與這些癌細胞中的特異性糖鏈特異性地辨識 籲的多株抗體或單株抗體，並根據免疫學手法即可進行該糖 鏈的檢測。 多株抗體係以該糖鏈或該糖鏈的不完全抗原邙apte幻 與蛋白質等高分子化合物（載體）結合之結合體作為抗原， 使^鼠’田鼠’天竺鼠，雞，大鼠，兔子，狗，山羊，羊， =等哺乳動物進行免疫過敏反應，從該哺乳動物採取血 ’文，即可調製含有多株抗體的抗血清。 :株抗體例如’可調製以抗體產生細胞和骨越瘤的細 ^。所得之融合瘤細胞而得。培養如上述操作而得到的

J7 338410 1342880 “ 融合瘤細胞，而可純化所得的單株抗體。 【實施方式】 [實施發明的最佳形態] ·.- 以下表示參考例及實施例，然而，本發明不受限於下 、.列實施例。 實施例1以羥色胺親和性層析法分離源自人類血清之[1 -酸性糖蛋白質（AGP)]糖鏈 將源自人類血清的AGP(Sigma-Aldrich Japan製）lmg 春溶解於2〇mM填酸緩衝溶液（pH7,5) 5〇 "卜加入N-聚糖酶 F(2單位，4 //丨），37。(：下反應12小時。反應後以i〇〇°c煮 沸3分鐘並回收離心分離後之上清液。 溶解2-胺基笨曱酸（2AA)和氰基硼氫化鈉於2%硼 .酸，4%乙酸鈉之混合液（500 /^1)中使分別成為3%添加該 溶液100 // 1至回收之上清液中’於8〇°c反應1小時。使 用以50%曱醇水溶液平衡化之sephadexLH-20管枉 鲁（〇.7cm i.d，，30cm)對反應混合物進行區分，用分光光度計 (曰立製，F-4010型），以激發波長335nm，螢光波長41〇nm 測定各流份，回收最初溶出的螢光性流份，作為糖鏈衍生 物的混合物。 .» 製得的混合物提供於羥色胺親和性管柱層析，而得分 .離的糖鏈衍生物。第1圖表示以親和性管柱層析法的分離 結果。 幾色胺親和性營枝層析的條件 管柱：LA-經色胺管柱（4,6x150mm，japan 0il m⑴s製） 318410 18 1342880 . 泵：JASCO PU-980 型 流速：0.5ml/min 檢測器：JASCO FP-920型螢光檢測器 、激發波長：350nm 螢光波長:425nm -4 移動相：以超純水作為溶液A，40mM乙酸銨水溶液作為溶 液B。 梯度條件：以樣品注入後2分鐘溶液B為5%，37分後乙 #酸銨濃度為30mM，進行直線梯度溶出，然後以1 〇分鐘成 為40mM進行溶出。 再者，羥色胺親和性層析法的分離條件係以下的實施 -例中亦同。 實施例2(以羥色胺親和性層析法分離源自人類癌細胞之糖 鏈） •細胞培養 使用人類腎腺癌細胞ACHN，人類肺癌細胞A549，人 類胃癌細胞MKN45及人類組織球性淋巴腫U937。使用含 10%將ACHN及A549預先以50°C加熱30分鐘使不活化 •的牛血清[NEWBORN CALF SERUM(NCS)，Sigma-Aldrich • Japan 製]的 DMEM(Dulbecco's 修飾 Eagle 培養液， Sigma-Aldrich Japan 製），U937 及 MKN45 係採用包含 10 %NCS 的 RPMI_1640(Sigma-Aldrich Japan 製），於 5%C02 存在下37°C下於組織培養皿中培養。將去除U937之細胞 318410 1342880 • 在80%群集（confluent)狀態下，以等張化磷酸緩衝液（pbs) . 洗淨培養中的細胞後’加入胰蛋白酶溶液，以37°C處理5 分鐘之後，回收脫離的細胞，以PBS洗淨後進行繼代培養。 、細胞膜流份的镅作

細胞膜流份的製作係使用80%群集狀態的細胞，採用 細胞刮片’自培養孤回收。回收的細胞以PBS洗淨後，使 於含1%蛋白酶抑制劑的10mM Na2HP04(pH7.5)中成為ix 1 〇8細胞/5ml的濃度’以玻璃均化器均化後，添加包含〇 5M •蔗糖的 20mM Tris-HCl 緩衝液（PH7.5) 10ml，於 4t：，以 3000rpm離心分離15分鐘後回收上清液後，於4°c，以 19000rpm離心分離’以所得的沉澱作為細胞膜流份。 •來自細胞膜流份之糖#的分雛 -« 於細胞膜流份（ΙχΙΟ7細胞）中加入1%SDS溶液40# 1 ’添加成為1 %之2-巯乙醇後，在丨00°c的沸騰水浴上加 熱5分鐘進行可溶解化。將包含膜流份的溶液冷卻至室 鲁溫，加入NP-40使成為1%，加入磷酸緩衝液（pH7 5)使其 最終》辰度成為20mM。並且，加入N-聚糖酶f 4 // 1 (2單 位，Roche Diagnostics 製），37°C 下培養一夜，在 100ΐ 的 •沸騰水浴上煮沸5分鐘，加入95%乙醇使其最終濃度成為 75%後，於4°C，以15000ι·ριη離心分離，並將上清液減壓 ’乾燥成固體，即為源自細胞膜之糖鏈。 凋製的各種源自細胞膜的糖鏈，與上述實施例丨同樣 地導入2-ΑΑ後，用羥色胺親和性管柱層析法處理，得到 各糖鏈衍生物的流份。第2圖表示以管柱層析法的分離結 318410 20 1342880 . 果。 實施例3(以順相型醯胺管柱對源自癌細胞之糖鏈的分離及 構造解析） 將實施例2所得各流份的源自癌細胞之糖鏈衍生物 ·* - (相當於lxl〇7細胞），以20mM乙酸緩衝液（pH5.0)20//l 溶解，加入唾液酸酶4 # 1 (2 mU, Markin Bio製）以37°C反 應24小時。反應後以100°C煮沸3分鐘，回收離心分離後 •之上清液。 所得的上清液供至使用醯胺基管柱的順相HPLC，分 別取得糖鏈衍生物。第3圖至第7圖表示以HPLC分離之 -結果。 • HPLC條件 管柱：TSK_GEL 醯胺-80(TOSOH 公司，Japan;4.6x250mm) 管柱溫度：40°C I 泵：JASCO PU-980 型 流速：lml/min 檢測器JASCO FP-920型螢光檢測器 激發波長：350nm •螢光波長:425nm •移動相：使用含有0.2%乙酸的乙腈溶液作為溶液A，含有 0.1%乙酸及0.1%三乙基胺的水溶液作為溶液B。 梯度條件：以樣品注入2分鐘後溶液B成為30%，60分後 溶液B成為6 5 %進行直線梯度溶出。

21 318410 1342880 .土乂_鲼.水_解酶及質免赶^的構造解析 將源自U937的波峰31的糖鏈衍生物以2〇mM檸檬酸 缓衝液（ρΗ3·5)20//1溶解，添加半乳糖酶⑺ 、mU，生化學工業公司製）以3rc反應24小時。反應後以 ..i〇〇m 3分鐘並回收離心分離後之上清液。將所得上清 液供至使用醯胺基管柱的順相HPLC所得之一部份流份， 以MALDI-TOF MS進行分析。結果，得到分子量2718之 糖鏈衍生物（a)。 • a 20mM #檬酸緩衝液（pH5〇)2〇川容解上述糖鍵衍 -生物（a)，加入石-N-乙醯基己醣胺酶（hexaminidase)丨# 1 (1 〇 • · m U，生化學工業公司製）以3 7 〇c反應2 4小時。反應後以】⑻ -°C煮沸3分鐘並以離心分離回收上清液，所得之上清液與 -上述同樣進行分析的結果，得到分子量19〇6之糖鏈衍生物 (b)。 再以半乳糖酶處理糖鏈衍生物（b)的結果，得到分 ❿子量1582的糖鏈衍生物（c)。 由以上的結果，判定波峰31係下式所示的糖鏈衍生 318410 22 1342880

相同地，波峰3 5的糖鍵衍生物，以沒-半乳糖酶、/3 -N_乙醯基己醣胺酶，接著以/9 -半乳糖酶處理，也判定為 下式所示的糖鏈衍生物。

關於其他波峰的衍生物，適宜地使用水解酶，進行 MALDI-TOF MS分析等，將相當於第3圖至第7圖所示波 峰的糖鏈構造示於表1至5。再者，表1至14中的分子量 表示2-胺基苯甲酸結合在糖鏈還原末端狀態的分子量 (MW)，記號係如下示。 23 318410 1342880

Gal:D-半乳糖，GlcNAc:N-乙醯基葡萄糖胺（acetyl glucosamine)，

Man:D-甘露糖，Fuc:海藻糖，2-AA:2-胺基笨甲酸，NeuAc: 、液酸。 .. 於此，2-胺基苯曱酸結合於糖鏈還原末端的糖鏈，例 如，如下式表示的糖鏈部分構造，係以-4GlcNAc /3 l-4GlcNAc_2-AA 表示。

NHAc NHAc MALDI-TOF MS 分析 使用 Voyager DE-PRO(PE Biosystems, Framingham， MA)裝置，以線性一/負離子型式測定。以加速電壓20kV， 柵極電壓 96.3%，延遲時間 1000 nsec，Lens Off set 1.25， 雷射強度（氮雷射）2700測定之。溶解於水中的樣品0.5# L 與2,5-二羥基苯甲酸（011]3)的2〇111§/1111^甲醇溶液0.5//1^ 混合，乾燥後，作為測定用樣品。 24 318410 1342880 【表1】

波峰 編號 MW 構造 1 1029 Manor/\ 63 Many!?；-¥GlcNAc^/-/GlcNAc-2-AA Manor/ 2 1176 Mano7\ ,Many9；-/GlcNAcy97-^GlcNAc-2-AA „ 6 Man ay 丨 Fucar/ 3 1192 Man-Mana/^ \ Man^；-4GlcNAc/?；-4GlcNAc-2-AA Maaa/ 4 1379 Mana/\ 63 Man/?/-^GlcNAc/?；-^GIcNAc-2-AA GIcNAc-Manor7X f Fuca/ 5 1395 Mana/\ 3 Many07-4GlcNAc^7-^G]cNAc-2-AA Galy0；-4GlcNAc-Mana7 ^ 6 1354 Man \ Man-Mand、 \ Man/?7-/GlcNAc^7-^GIcNAc-2-AA Mana7 7 1541 Manor/、 63 Man^l-4GlcfiAc/31-4GlcNAc-2-AA GaI^；-4GlcNAc-Mana/ ^ f Fucor/ 8 1516 Man \ Man-Man 〇/、 t Man/?；-^GlcNAc^；-^GlcNAc-2-AA Man-Man or7 9 1582 GIcNAc-Mana/^ g Man和-々GlcNAcp/一 GlcNAc-2-AA GlcNAc-Mana/^ f Fucai 10 1678 Man-Man \ Man-Man or/\ \ Man^；-^GlcNAc>3/-^GlcNAc-2-AA / J Man-Man a7 11 1785 GlcNAc \ GlcNAc-Man cr/、 63 Many07-¥GlcNAc/?；-^GlcNAc-2-AA GlcNAc-Mana/^ f Fuca7 25 318410 1342880 【表2】 波峰 編號 MW 構造 12 1760 Gal^7-4GlcNAc-Man al^ 63 Man/?i-4GlcNAc^；-4GlcNAc-2-AA Gal^；-4GicNAc-Mana； ^ 13 1840 Man \ Man-Man-Man \ Man^-^GlcNAc/ffy-^GlcNAc^-AA Man-Man-Man aJ 14 1906 Gal^-^GlcNAc-Man j Man^/-^GIcNAcy?；-#GlcNAc-2-AA Gal^/-^GIcNAc-Man aJ ^ f Fuca/ 15 2002 Man-Man \ Man-Man-Man al^ 63 Manyff；-/GlcNAc^；^GIcNAc-2-AA Man-Man-Man a/ / 16 2052 GaI/?/-^GIcNAc-Mana7^ ， 63 Man/?7-^GlcNAcyff7-^GlcNAc-2-AA Gal^；-^GIcNAc-Man al ^ f 3 Fnca] 1 Fucai 17 2125 Gal…GlcNAc、 GaI>ff/-^GlcNAc-Mana7^ 63 Man^7-^GlcNAc^GlcNAc-2-AA GalySMGlcNAc-Man or. 18 2116 GlcNAc \ GalyfiMGlcNAc-Mana/、 j Man^7-/GlcNAc>S/-4GlcNAc-2-AA Gal/3!MGlcNAc-Mana〆 f GlcNAci/ 19 2636 Gal>?；-/GIcNAc^ Gal>SMGlcNAc-Maii or/、 63 Man/?7-#GlcNAc^；-4GlcNAc-2-AA Gal/?/-^GlcNAc-Man aly f / Fuca/ GaI>5/-4GlcNAc 20 3001 Gal々/一 GlcNAc-Gal炎一 GkNAc、 Galyffi-^GlcNAc-ManaJ^ j Man^；-4GlcNAc/7/-^GIcNAc-2-AA Gaiy?7-4GlcNAc-Mana； ^ f / Fuccri Gal^7-^GIcNAc 26 318410 I34288〇 【表3】 波峰 MW 構造 21 1557 Man-Manor/^ 63 Man/?；-4GlcNAc/?；-4GlcNAc-2-AA Gal^7-^GlcNAc-Man al ^ 22 1598 GlcNAc-ManaJ\ 63 Manyff；-^GlcNAc/?7-^GIcNAc-2-AA Gal^7-^GIcNAc-Mana7 X 23 1743 GlcN Ac-Man or7 \ 63 Man^；-^GlcNAc^7-4GlcNAc-2-AA Gal^；-4GlcNAc-Mana； ^ f Fuca7 24 2270 Ga ⑹-4GkNA' Gal>07 一 GlcNAc-Man 63 Man/?；-^GlcNAc^；-^GIcNAc-2-AA Gal/?；-^GIcNAc-Man a； ^ f Fucai 25 2417 Gal/?；-4GlcNAc \ · Gal/57-VGIcNAc-Man al^ 63 ManfiJ-4GlcTiAcfil-4GlcfiAc-2-AA Gal^-ZGlcNAc-Mana/^ f 3 Fucai l Fucar7 26 2491 Galy^GlcNAc' GalyS/-^GlcNAc-Man al^ 63 Man^；-#GlcNAc/?；~#GlcNAc-2-AA Gal^Z-^GIcNAc-Mana/^ Gal^；-^GlcNAc 27 2563 Fucal 1 3 Ga⑹一 GlcNAc、 Gal々/-4GlcNAc-Mana/\ 5 ManyftMGIcNAc/aMGlcNAc-2-AA Gal>ff/-4GkNAc-Mana, f 3 Fuca/ 1 Fuca/ 28 2782 Galyff/^GlcNAc^ Gal 夕/-¥GlcNAc-Mano/\ 63 Man/?；-^GlcNAc/?；-/GlcNAc-2-AA Gal^/WGlcNAc-Man a/ f / Fuca/ Gal>5/-4GlcNAc 3 1 Fuca7 1

27 318410 1342880 【表4】

1 皮峰 編號 MW 構造 29 2928 ¥ucal \ 3 Gai)!?；^GIcNAc^ Gal 你-4GlcNAc-Manori\ g Ma WGlcNAc夕/-4GlcNAc-2-AA Gal/JMGIcNAc-Mana// f / Fuca/ Gal/ZMGIcNAc 3 1 Fuca/ 30 3147 Gal；«MGlcNAc-Gal；SMGicNA' Gal/?；-^GlcNAc-Mana/x 3 Man^7-¥GlcNAc^；~#GlcNAc-2-AA Galyff/-¥GIcNAc-Mancr/ ^ f / Fucor/ Gal心GlcNAc 3 1 , Fucori 31 3366 Gal/SMGlcNAc-Galy^GlcNAc、 Gal^/^GIcNAc-Gal/W-^GIcNAc-Manai^ g Man/XMG 丨 cNAcyfl； 一 G 丨cNAc-2-AA Gal/?7-4GlcNAc-Mana/ f / Fuca7 Gal卢WGlcNAc 32 1921 Man \ Ga^fiMGlcNAc-Mana/、 g Man…GfcNAcy?/-iGIcNAc-2-AA Gal^flMGlcNAc-Mana/ f Fuca/ 33 2109 Gal/JMGlcNAc-Man a/、 ^ ManfiMGleTiAcj31-4Glcmc-2-AA GaI^/-¥GlcNAc-Man a；/ f f Fuca7 GlcNAca； 34 3731 (Gal/?/-4GIcNAc)rGal^/-^GIcNAc^ Gal…GlcNAc-Galyff/一 GlcNAc-Man a;、 63 Man^；-4GlcNAc/?/-^GlcNAc-2-AA GaI/?7-^GlcNAc-Man a/ f / Fuca7 Gal^/.^GIcNAc 28 318410 1342880 【表5】 « < . • • p- . _ 波峰 編號 MW m m I 35 4096 (Ga 收-/GlcNAc)rGa ⑹ WGlcNAc、 Galf/4GkNAc-Gal>9MGIcNAc-Mana/\ 3 Man^；-^GIcNAc>07^GIcNAc-2-A J Gal>SMGlcNAc-Gal々/-4GlcNAc-Mancr/ / f / Fuca； Gal>3MGIcNAc 36 4461 (Gal^GlcNAc)rGal炎名 IcNAc、 (Gal^/-^GlcNAc)2-Gal>57-^GIcNAc-Manir7x 63 Man>07-4GlcNAc^7-/GlcNAc-2-AA Gal^/^GlcNAc-Gal^/^GlcNAc-Man alX f / FucaJ Gal卢/-彳 GIcNAc 37 4826 (Gal/?7^GlcNAc)3-GaI^/-/GIcNAc^ (GaI>fi7-4GlcNAc)2-GaI>S7 -^GIcNAc-Man al^ j Manyff7-4GlcNAc^；-4GlcNAc-2-AA Gal^MGlcNAc-Gal^MGIcNAc-Man〆 f / FucaJ Gal^MGlcNAc 38 5191 (Gal…GlcNAc>3-GalyflMGIcNAc、 (GaIyfl7-¥GlcNAc)2-Gal^/-/GlcNAc-Mana/x 望 Man與-彳 GIcNAc々/-#GIcNAc-2-Aa| Gal^；-^GlcNAc-Gal^/-^GIcNAc-Mana/ ^ f / FucaJ Gal/^GlcNAc-Gal；^GlcNAc -· 39 5556 (Gal々/-#GlcNAc)3-Gal;SMGlcNAC\ (Gal^7-/GlcNAc)2-Gal^/.^GlcNAc-Mana/x 63 Man/?/-4GlcNAc^/-^GlcNAc-2-AJ (GalyS/4GlcNAc)2-Gal〜GIcNAc-Mano；/ f / Fuccr； GaIyS7-^GlcNAc-Galy0/-#GlcNAc 40 2474 Gal>97-^GlcNAc-Man α/χ 3 Man>5；-/GlcNAc^/-^GIcNAc-2-AA GaI/?7-^GIcNAc-Man al ^ 1 6\ / Fuca/ Gal>5/-^GlcNAc GlcNAci； | 29 318410 1342880 實施例4(細胞内存在的游離糖鏈1) 人類胃癌細胞MKN45以PBS洗淨後，使成為lxlO8 細胞/5ml的濃度並使用玻璃均化器，於含1 %的蛋白酶抑 ..制劑的10mM Na2HP04(pH7.5)中均化後，加入含0.5M蔗 糖的 20mM Tris-HCl 緩衝液（pH7.5) 1 Oml，於 4 °C，以 3000rpm離心分離15分鐘後，收集上清液，並且，於4°C， 以19000rpm離心分離，並將上清液減壓至乾固，得到游 離型糖鏈混合物。 所得的游離型糖鏈混合物與實施例1記載的方法相同 地，導入2-AA而得游離型糖鍵衍生物的混合物，用經色 胺親和性管柱層析法進行區分而得游離型糖鏈衍生物。 第8圖表示以親和性管柱層析的分離結果。 以使用胺基管柱之順相HPLC分離所得的各流份，得 到游離型糖鏈衍生物。 HPLC條件 管柱：Asahi Shodex NH2P-50 4E(Showa Denko，Tokyo, Japan;4.6x250mm) 管柱溫度：50°C 泵：JASCOPU-980 型 ‘流速：lml/min •檢測器：JASCOFP-920型螢光檢測器 激發波長：350nm 螢光波長：425nm 移動相：溶液A使用含有2%乙酸的乙腈溶液，溶液B使用

30 318410 ΐί5%乙酸及3%三乙基胺的水溶液。 冰r =件以樣品注入後2分鐘溶液Β成為30%，80分後 、成為95%進行直線梯度溶出，至1〇〇分鐘止保 ，' 液 β 為 95%。 .所得之游離型糖鏈衍生物以糖水解酶（唾液酸酶， 路糖酶，$·半乳糖酶，0_Ν_乙酿基己醣胺酶等）適宜地 用’並以使用上述胺基管柱之順相HPLC分離後，；東处 乾燥所得到的流份後，以MALDI_T〇F Ms分析，以解析^ 零離型糖鏈衍生物的構造。 . α-甘露糖酶的處理’係將糖鏈衍生物溶解於20mM捭 …樣酸緩衝液(_.5)20//1中，加入α_甘露糖酶2#1(1〇仙丁， -生化學工業公司製）以3rc反應24小時，反應後以⑽。c .煮彿3分鐘，回收離心分離後之上清液。以其他糖水解酶 的處理係與上述實施例的記載相同。所得的糖鍵衍生物示 於表6及7。 • 表6及7之游離型糖鏈係新穎化合物，例如編號i之 分子量1321的糖鍵衍生物係如下式所示。

318410 31 1342880

【表6】 MW 構造 1321 j Man/37-^GlcNAc-2-AA NeuAc-GaI)37-^GIcNAc-Mana7 1483 Man a/. 3 Manj87-4GIcNAc-2-AA NeuAc-GaI/J7-4GlcNAc-Mana/ / 1686 GlcNAc-Mana7^ j Manj3；-/GlcNAc-2-AA NeuAc-Gal^7-^GlcNAc-Mana/ 2140 NeuAc-Gal^y-^GIcNAc-Mana/^ j Man^7-^GIcNAc-2-AA NeuAc-Gal 讲-4GlcNAc-Man<r// 2343 GlcNAc \ NeuAc-Gal/^y-^GIcNAc-Mana/^ j Man^7-4GlcNAc-2-AA NeuAc-Gal^y-^GlcNAc-Mana/7 NeuAc-Gal^Z-^GIcNAc^ 2505 (NeuAc—)2 < 一 Ga 听一 GlcNAc、 Gal/?7-/GlcNAc-Mana/v j Man^7-^GIcNAc-2-AA Gal/37-^GIcNAc-Mana；/ 2795 NeuAc-Gai/?/-孝 GicNAc、 NeuAc-Gal^/-^GIcNAc-Mana/^ 63 Man)37-4GlcNAc-2-AA NeuAc-Gal^7-**/GlcNAc-Mana// 2999 (NeuAc—)3 < f GlcNAc \ Gal^；-^GlcNAc-Mana；N j Manj37-^GIcNAc-2-AA Gal/37-/GlcNAc-Mana/ 、GalW-4GlcNA/ 3160 (NeuAc—)3 *< 'Galj3/-4GlcNAC\ GaI/3/-^GIcNAc-Mana；x j Man/?/-^GIcNAc-2-AA Galj37-^GlcNAc-Mana// 、Gal)3i-4GlcNAc/ 32 318410 1342880 【表7】 MW 構造 3451 NeuAc-Gal 月/-彳 GlcNA\ NeuAc-Gal/37-^GIcNAc-Mana/^ 63 Man^/-4GlcNAc-2-AA NeuAc-Gal^/WGlcISAc-Mano^/ NeuAc-Gal/3/-4GlcNA/ 3816 NeuAc-Gal^；-^GlcNAc-Galj37-4G]cNAc^ NeuAc-Gal^Z-^GIcNAc-Manay^ j Man^/-^GlcNAc-2-AA NeuAc-Gal^37-¥GlcNAc-Mana7 NeuAc-Gal/^GlcNAc’ 貫施例5 (細胞内存在的游離糖鍵2) 替代人類胃癌細胞MKN45而使用人類T細胞淋巴腫 -·瘤Jurkat27(糖鏈導入細胞株）之外，與實施例4同樣地操 作而得游離型糖鏈混合物。 -· 與實施例1記載的方法同樣的導入2-AA於所得之游 離型糖鏈混合物，而得到游離型糖鏈衍生物的混合物，用 經色胺親和性管柱層析法進行區分而得到游離型糖鏈衍生 φ物。 以使用醯胺管柱之順相HPLC分離所得的各流份，而 • 得游離型糖鏈衍生物。 .-HPLC條件 管柱：TSK-GEL 醯胺-80(TOSOH CORPORATION, Japan; 4.6x250mm) 管柱溫度：40°C 泵：JASCOPU-980 型 33 318410 1342880 流速：lml/min 檢測器：JASCO FP-920型螢光檢測器 激發波長：350nm 、.螢光波長：425nm ^移動相：使用含有1 %乙酸的乙腈溶液為溶液A，含有0.2 %乙酸及0.2%三乙基胺的水溶液為溶液B。 梯度條件：以樣品注入2分鐘後溶液B成為30%，60分後 溶液B成為65%進行直線梯度溶出。 • HPLC的分離結果示於第9圖。 將所得的游離型糖鏈衍生物與實施例4同樣操作，解 析游離型糖鏈衍生物的構造。所得之糖鏈衍生物示於表8。

34 318410 1342880 【表Μ 波峰 編號 構造 1 Man \ Man-Man^ Man-GIcNAc-2-AA Man〆 2 Man \ Man-Man^ Man-GlcNAc-2-AA Man-Man 3 ( Man- ^ \ Man \ Man-Man^ / Man-GlcNAc-2-AA Man-Man 4 (Man—)2 - Man \ Man-Man^ < \ ^Man-GlcNAc-2-AA Man-Man 5 Man-Man \ Man-Man-MaH\ ^Man-GlcNAc-2-AA Man-Man-Man 實施例6(人類子宮頸癌細胞的糖鏈） 將人類子宮頸癌細胞HeLa以含10%預先以50°C加熱 30分鐘使不活化的NCS之DMEM進行培養。在80%群集 狀態中，以PBS洗淨培養中的細胞後，加入胰蛋白酶溶液， 以37t處理5分鐘後，回收脫離的細胞，以PBS洗淨後進 行繼代培養，以與實施例2記載的細胞膜流份的製作，及 自細胞膜流份分離糖鏈的同樣操作進行處理，獲得源自細 胞膜的糖鏈混合物，並與上述實施例1同樣地導入2-AA 後，以羥色胺親和性管柱層析進行處理1而得各糖鏈衍生 35 318410 1342880 . 物之流份。 管柱層析的分離結果示於第ίο圖。 將所得到的唾液酸糖鏈衍生物流份，單唾液酸糖鏈衍 生物流份及二唾液酸糖鏈衍生物流份以唾液酸酶處理之 '.後，以使用胺基管柱之順相HPLC分離，得到糖鏈衍生物。 HPLC條件與實施例4相同。 得到的糖鏈衍生物以糖水解酶（唾液酸酶，（2 -甘露糖 酶，冷-半乳糖酶，/5-N-乙醯基己醣胺酶等）適宜地作用， • 並以使用上述胺基管柱之順相HPLC分離後，凍結乾燥得 • 到的流份後，進行MALDI-TOF MS分析，以解析糖鏈衍生 物的構造。 得到的糖鏈衍生物示於表9至12。

36 318410 1342880 【表9】 非唾液酸糖鏈衍生物 MW 構造 1354 Man \ Man-Mana7^ \ Man^；-4GlcNAcj3/-^GlcNAc-2-AA / ^ Mana7 1516 Man \ Man-Mana/. ,Man^3/-4GIcNAc^；-4GlcNAc-2-AA / J Man-Maned 1678 Man-Man \ Man-ManaA 3 Manj37-^GlcNAc^7-4GlcNAc-2-AA Man-Mana7 1760 Gal^37-4GIcNAc-Mana/^ j Man/3y-^GIcNAc/37-^GIcNAc-2-AA Gal^37-4GlcNAc-Mana/ ^ 1840 Man \ Man-Man-Mana7v 3 Man/3；-/GlcNAc^；-4GlcNAc-2-AA Man-Man-Mana7 1906 Gal^/-4GlcNAc-Mana/\ j Man^7-¥GlcNAc^7-/GlcNAc-2-AA Gal^Z-^GlcNAc-Mana/^ f Fucal 2002 Man-Man \ Man-Man-Mana/. 、^· 3 Manj3/-^GIcNAc^7-4GlcNAc-2-AA Man-Man-Mana/

37 318410 1342880

【表10】 單唾液酸糖鏈衍生物 MW 構造 1686 NeuAc-Gal^V-^GlcNAc-Manay^ j Manj57-^GlcNAc^/-^GlcNAc-2-AA Mana7 1889 Neu Ac-GaI^7**4GIcN Ac-Man aJ ^ 63 Man)3；-4GlcNAc)5；-¥GlcNAc-2-AA Mana7/ f GIcNAca； 2051 NeuAc-- Gal)37-4GlcNAc-Mana7x j Man)37-4GlcNAc)3/-4GlcNAc-2-AA Galj37-^GlcNAc-Mana7 2197 NeuAc—— Gal^MGlcNAc-Mana/\ 63 Man^7-^GlcNAcj3/-4GlcNAc-2-AA Gal月/-4GlcNAc-Manct/ f Fucct/ 2254 NeuAc Gal^/^GIcNAc-Mana； > Gal)37-/GlcNAc-Mana7 GlcNAct lan/3/-/GlcNAc^7-4GlcNAc-2-AA 4 tl 2343 NeuAc—， ^ GaI^7-4GlcNAc-Mana；x 63 Man)3/-^GIcNAc/3/-/GlcNAc-2-AA GaJ)S；-4GlcNAc-Mana7/ f 3 Fuca/ 1 Fuca/ 2400 NeuAc-** - Gal^/-/GIcNAc-Mana； > Gal^7-^GIcNAc-Mana7 GlcNAcc Ian 炽-4GlcNAc月/-彳 GlcNAc-2-AA ί 6 1 Fuca/ tl 2546 NeuAc—- GaI/37-4GlcNAc-Mana7 A Galj37-^GIcNAc-Mana7 3 Fuca) GlcNAcc Ian^；-/GJcNAc)3；-/GIcNAc-2-AA f 6 1 Fuca/ tl 38 318410 1342880 【表11】 二唾液酸糖鏈衍生物-1

MW 構造 2342 NeuAc-Gal-GlcNAc-Mana/^ f Man"/一 GlcNAc 沢-4GlcNAc-2-AA NeuAc-Gal-GIcNAc-Mana/ κ 2545 (NeuAc—)2， Γ Gal-GIcNAc-Mana7x j Manj37-4GlcNAc^7--/GlcNAc-2-AA GaI-GlcNAc-Mana7/ f GIcNAca； 2691 (NeuAc—)2， Gal-GIcNAc-Mana7 > Gal-GlcNAc-Mana/ GlcNAcc ian^7-/GIcNAc/?/-^GlcNAc-2-AA f 6\ Fucal tl 2748 (NeuAc—)2 < 「 GlcNAc \ Gal-GlcNAc-Mana/、 Gal-GlcNAc-Mana/ V» GlcNAcc [an^7-/GlcNAc/?；-^G]cNAc-2-AA xl 2894 (NeuAc—)2 — Γ GlcNAc \ Gal-GlcNAc-Mana/. jN Gal-GlcNAc-Mana/ GlcNAci [an)3/-/GlcNAc/?/-^GlcNAc-2-AA i 6 1 Fuca/ il 3056 (NeuAc—)2 r Gal-GlcNAc-ManaA Gal-GlcNAc-Manai (Gal-GlcNAc GlcNAcc [an/J7-^GIcNAc^7-^GIcNAc-2-AA t 6 1 Fuca/ tl 3113 (NeuAc~)2 ^ "GIcNAc-Gal-GlcNAc^ Gal-GJcNAc-Mana/^ 63 Manj3；-^GIcNAc^；-4GlcNAc-2-AA Gal-GlcNAc-Mana；^ 4 GlcNAca/ 39 318410 1342880 【表12】 二唾液酸糖鏈衍生物_2 MW 構造 3259 (NeuAc—)2 ^ f GlcNAc-Gal-GlcNAc \ Gal-GlcNAc-Mana7. 3 Man/3；.4GlcNAcj57-^GIcNAc-2.AA Gal-GIcNAc-Manct/ f f Fuca) GIcNAca/ 3405 (NeuAc—)2 < fGIcNAc-Gal-GIcNAc \ Gal-GIcNAc-Mana/v > Gal-GIcN Ac-Man aJ ^ ' 、 3 Fuca/ GlcNAci [an/?7-^GIcNAcj37-^GIcNAc-2-AA i 6 1 Fuca] xl 3421 (NeuAc—)2 < CGlcNAc-Gal-GlcNAc \ Gal-GlcNAc-Mano:/\ 63 Mani3；-^GlcNAc/?/-^GlcNAc-2-AA Gal-GlcNAc-Mana/ f / Fuca/ 、 Gai-GlcNAc 3624 (NeuAc—)2 < ’GIcNAc-Gal-GicNAc \ Gal-GIcNAc-ManaA Gal-GlcNAc-Mana/ 、 Gal-GlcNAc GIcNAcc [an)37--/GlcNAc^/-4GlcNAc-2-AA i 6 \ Fuca/ tl • 實施例7(癌細胞特異性抗原CD98的糖鏈）

以免痦沉澱法製作CD98-HC 蛋白質 A-洋菜糖（Agarose)50//l(Sigma-Aldrich Japan .製）以PBS 200// 1洗淨後，加入PBS 50// 1和抗CD98抗體 10/z g/10/z卜於室溫反應60分鐘。反應後，以PBS lml 除去非吸著成分，而得抗CD98抗體固定化洋菜糖。對抗 CD98抗體固定化洋菜糖，以1 % NP-40(400 # 1)添加可溶 40 318410 1342880 化之HeLa細胞的膜流份（2x 1 07細胞），用旋轉振盪器 (Rotary shaker)以4°C培養一夜。此後，以lmlPBS洗淨， 除去非吸著成分，離心分離後，對抗CD98抗體固定化洋 菜糖加入離解溶液（250mM Tris-HCl緩衝液pH6.8/4.6% SDS，20%甘油）及2-巯乙醇的9:1混合液20// 1，煮沸5分 鐘，以 15000rpm離心的上清液作為 CD98-HC，供至 SDS-PAGE。 SDS聚丙烯醯胺凝勝雷泳 凝膠電泳裝置及電源均同採用Bio Rad製品。電泳凝 膠使用7.5%凝膠。電泳緩衝液使用25mM Tris，198mM甘 油，l%(w/v)SDS進行。最初的1小時每片凝膠以5mA， 繼之以10mA進行電泳至凝膠下部。 考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue)染色 SDS-Page 結束後，於 40%(v/v)曱醇，10%(v/v)乙酸 /0.2%考馬斯亮藍R250中，進行蛋白質染色。1小時後， 用曱醇：乙酸：水（=4:1:5)脫色。 西方墨點法（Western Blot ) • 將SDS-PAGE後的凝膠以BIO-RAD製半乾式吸墨 ，（hemidry bloting)裝置（半乾轉印槽），將凝膠中的蛋白質樣 品轉印至 PVDF 膜。PVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜係 預先以曱醇浸泡60秒，然後使用48mM Tris，39mM甘胺 酸，20%曱醇（ρΗ9·0)浸泡1小時者’以100mA固定電流 41 318410 1342880 . 施加電壓1小時進行轉印。轉印後，以含5%脫脂乳及0.05 % Tween 20的PBS對PVDF膜進行阻斷操作之後，加入含 有抗 CD98 抗體 5// g 之 0.05%Tween 20/PBS(5ml)使其反 ...應一夜。反應後，以含0.05% Tween 20的PBS(20ml)洗淨 PVDF膜4次後，加入含HRP標識蛋白質A5//1之0.05 % Tween 20/PBS(5ml)，使其反應1小時。反應後，以含0.05 %Tween 20 的 PBS(20ml)洗淨 PVDF 膜 4 次，加入含 0.05 %DAB(3,3'-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽），0.0031%過氧化氫溶 • 液20ml，使其發色。 - 藉由N-聚糖酶F的凝膠内分解 以CBB染色確認染色帶之後，以水取代染色液，切下 目標帶，放入微試管内。然後加入乙腈1〇〇#1放置30分 ’鐘使凝膠脫水，除去乙腈後加入含2單位N-聚糖酶F的 Tris-HCl緩衝液（pH7.5)100/z卜37。(：下培養一夜後，切出 糖鏈。然後，回收提取液再加入水200# 1攪拌30分鐘， I 由凝膠得到糖鏈混合物。 於以上所得的糖鏈混合物中，與上述實施例1相同地 導入2-AA後，以羥色胺親和性管柱層析法處理，而得各 糖鏈衍生物之流份。 • 管柱層析法的分離結果示於第11圖。 ' 所得之單唾液酸糖鏈衍生物流份及二唾液酸糖鏈衍生 物流份經唾液酸酶處理之後，以使用胺基管柱之順相 HPLC分離，獲得糖鏈衍生物。HPLC條件係與實施例4 相同。HPLC的分離結果示於第12圖。 42 318410 U42880 得到的糖鏈衍生物以糖鏈水解酶（唾液酸酶，α ^ 糖酶，冷·半乳糖酶，冷-Ν-乙醯基己醣胺酶等）適當地= 用’以上述使用胺基管柱的順相HPLC分離後，凍結乾燥 所得的流份後，以MALDI-TOF MS分析，解析糖鏈衍生物 的構造。 得到的糖鏈衍生物示於表13至14。

43 318410 1342880 【表13】 波峰 編號 MW 構造 I 2051 NeuAc — < Gal^7-4GlcNAc-Mana7v 3 Man^；-^GIcNAcy3；-^GlcNAc-2-AA Gal)5/-^GlcNAc-Mana7 Π 2197 NeuAc — A Gal^/-^GIcNAc-Mana/ 3 Man^；-^GIcNAc^；--/GlcNAc-2-AA Ga 矽/-4GlcNAc-Mana/ f Fuca) m 2343 NeuAc Gal^7-^GIcNAc-Mana/v 3 Man/?7-4GlcNAc)37-iGlcNAc-2-AA Gal/JWGlcNAc-Mana/ 6\ 3 Fuca/ 1 Fuca/ IV 2400 NeuAc— Gal/3；-^GIcNAc-Mana/ 3 Man^；-^GlcNAc^7-4GlcNAc-2-AA Gal/^-ZGlcNAc-Maim/〆 4 f Fuca/ GlcNAca/ V 2562 NeuAc- ’Gal 別-4GlcNAC\ GaIj37-^GlcNAc-Mana7^ j Man^/-^GlcNAc/J/-^GIcNAc-2-AA Gal 讲-4GlcNAc-Mana// f Fuca/ VI 2781 NeuAc — 〆 "*Ga ⑹-4GlcNAC\ Galj8/-4GlcNAc-Mana/\ 63 Man/?/-^GIcNAc/?/-¥GlcNAc-2-AA Gal^V-^GlcNAc-Mana/^ 、Gal"/一 GIcNa/ νπ 2927 NeuAc~ -< 'Gal讲-4GlcNAC\ Galj3/-^GIcNAc-Mana7. j Man/JMGIcNAc^7-4GlcNAc-2-AA Gal/J7-4GlcNAc-M«Da/ f / Fuca) 、Gal/?/-4GlcNAc 44 318410 1342880 【表14】 波峰 編號 MW 構造 Μ 2342 NeuAc-Gal^37-^GIcNAc-Mana/^ 63 ManjS；-4GIcNAc^；-4GlcNAc-2-AA NeuAc-Gal^7-^GIcNAc-Mano：y/ Κ 2488 NeuAc-Gal^/-4GlcNAc-Manct/\ j Manj3/-^GJcNAc/?；-^GIcNAc-2-AA NeuAc-Gal^7-^GIcNAc-Mana// f Fuca/ X 2545 (NeuAc—)2 - GaI^57-¥GlcNAc-Mana7^ j Man/?；-4GlcNAc/J7-</GlcNAc-2-AA Gal)W-4GlcNAc-Manct/ 4 GIcNAca/ XI 2691 (NeuAc—)2 — Gal 叫-4GlcNAc-Manct/\ 63 Man/?7-^GlcNAc/3/-4GlcNAc-2-AA .Gal/3/-4GlcNAc-Mana/ 4 f Fuca/ GIcNAca/ ΧΠ 2853 (NeuAc-)2 < ’Gal/?/-/GIcNAC\ GaI^7-^GIcNAc-Mana；x j Man^7-4GlcNAc^7-/GIcNAc-2-AA Galj3；-¥GlcNAc-Mana7/ f Fuca/ XIII 3072 (NeuAc—)2 ^ <Ga 说MGIcNAc、 Gal^/-4GlcNAc-Mana/x g ManjS^MGlcNAcp^MGIcNAdAA Gal^5/-4GlcNAc-Mana7/ 、Gal)iMGIcNAc/ XIV 3275 r (NeuAc-)2 < N. GIcNAc-Gal如-4GlcNAC\ GaIj37-^GlcNAc-Mana/^ 3 Mani3/-#GlcNAc/3/-4GlcNAc-2-AA Gal/37-4GlcNAc-Mana7/ Gal/J^MGkNA/

[產業利用性] 依據本發明的方法，特別可詳盡地分離細胞或組織中 的糖鏈混合物，而可網羅性地解析其糖鏈構造，而可探求

45 318410 1342880 以往未知的糖鏈及其機能，對今後的糖鏈研究亦可期待有 很大的貢獻。 【圖式簡單說明】 第1圖是實施例1所得糖鏈衍生物的親和性管柱層析 圖。 第2圖是實施例2所得糖鏈衍生物的親和性管柱層析 圖。 第3圖是實施例3所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。 第4圖是實施例3所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。 第5圖是實施例3所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。 第6圖是實施例3所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。 第7圖是實施例3所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。 第8圖是實施例4所得糖鏈衍生物的親和性管柱層析 圖。 第9圖是實施例5所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。 第10圖是實施例ό所得糖鏈衍生物的親和性管柱層析 圖。 第11圖是實施例7所得糖鏈衍生物的親和性管柱層析 圖。 第12圖是實施例7所得糖鏈衍生物的HpLC的層析 圖0 46 318410

Claims (1)

1342880 第95126175號專利申請案 100年3月3日修正替換頁 十、申請專利範圍： 1. 一種糖鏈衍生物之製造方法，係由糖鏈混合物製造式 (1)、（3)至（6)所示糖鏈衍生物之方法，其特徵為具備： (a) 將脂溶性基導入糖鏈混合物中的糖鏈而得糖鏈 衍生物混合物之步驟，以及 (b) 以經色胺（serotonine)親和性管柱層析法處理該 糖鏈衍生物混合物之步驟，式中R1表示2-羧基苯基， 3-羧基笨基，4-羧基苯基，對-乙氧基羰基苯基，或2-0比基，R2表不藉_基’基-Asn_或者基_ Asn-R，於此Asn 表示天門冬醯胺基，R3表示胺曱酸系或者醯胺系保護 基；Ac表示乙醢基

(3) 47 318410修正版 第95126175號專利申請案 100年3月3曰修正替換頁

48 318410修正版 1342880 第95126175號專利申請案 | 100年3月3日修正替換頁 ()v驟之後，具備（C)以使用胺基管柱或醯胺基管柱之 ^ 順相層析法處理之步驟。 ，3.如巾請專^圍第2項的糖鏈衍生物之製造方法，係於 (C)步驟之刖，具備（d)以糖水解酶處理之步驟。 ，4.如申凊專利範圍第1項的糖鏈衍生物之製造方法，其 中，該脂溶性基係2_錄苯基胺基或者祕曱氧基艘 基。 5. 如申請專利範圍第2項的糖鏈衍生物之製造方法，其 中，該胺基官柱係聚合物基材之胺基管柱。 6. 如申請專利範圍第2項的糖鏈衍生物之製造方法，其 - 中，该醯胺基官柱係氧化矽基材之醯胺基管柱。 7·如申請專利範圍第1項的糖鏈衍生物之製造方法，其 中，該糖鏈混合物係天然糖鏈之混合物。 8·如申凊專利範圍第1項的糖鏈衍生物之製造方法，其 中，該糖鏈混合物係源自細胞糖鏈之混合物。 9. 如申請專利範圍第1項的糖鏈衍生物之製造方法，其 中，該糖鏈混合物係包含唾液酸糖鏈而成之糖鏈混合 物。 10. —種糖鏈衍生物，係由式（1)、（3)至（6)所示， 式中R1表不2-羧基苯基，3_綾基笨基，4羧基笨 基，對·乙氧基羰基苯基，或2_吼啶基；R2表示羥基， 基-Asn-或者基-Asn-R3 ;於此Asn表示天門冬醯胺基， R3表示胺甲酸系或者醯胺系保護基；Ac表示乙醯基： 318410修正版 49 1342880

第95126175號專利申請案 100年3月3日修正替換頁

NHAc ⑴

NH-R1 NHAc NHAc HO HO^\ HO^ .NHA HO·^ OH Hn HO-OH χλγ'^^' (3)

nu— wn HO HO^^NHAc Ηο^^α^φ

(4) 50 318410修正版 第95126175號專利申請案 100年3月3日修正替換頁

NH-R1 HO HO^^qHC^J^O HO^/NHA OH HO^1^ OH HO HO H&w yNHAc HO HC HO NMAe HO kH。瞻 (5)

(6) 51 .318410修正版