CN114395051B - 连接酶融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域。具体地，提供连接酶融合蛋白和包含其的固定化连接酶。本发明还提供所述连接酶融合蛋白或固定化连接酶在制备偶联物中的用途。本发明进一步提供使用连接酶或连接酶单元制备偶联物的方法。

Description

连接酶融合蛋白及其应用
本申请要求2021年1月28日提交的国际专利申请第PCT/CN2021/074082号的优先权，该申请的内容整体援引加入本文。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种连接酶融合蛋白及包含其的固定化连接酶。本发明还提供所述连接酶融合蛋白或固定化连接酶在制备偶联物中的用途。本发明进一步提供使用连接酶或连接酶单元制备偶联物的方法。
背景技术
对于高质量偶联物的需求，特别是如用于生物科学研究、诊断或治疗目的生物偶联物的需求正在迅速增加。然而，生物偶联物的高通量生产远不能令人满意，部分原因是生物分子的复杂性使得难以达到生物偶联物的高质量标准。
常规的偶联方法是基于化学的。例如，在抗体-药物偶联物(ADC)生产的典型方法中，药物通过连接子与抗体中的赖氨酸或半胱氨酸残基化学偶联。在进入偶联工艺之前，抗体通过上下游纯化过程制备。在偶联步骤之后，需要另一个下游纯化过程来除去ADC中的聚集体、溶剂、副产物和杂质。从抗体制备到ADC生产方法中的多个下游步骤显著增加了成本和时间，并且同时降低了产率。此外，出于安全原因，偶联反应必须在化学隔离器中进行，使得该方法难以扩大规模。总之，常规方法涉及多个上游和下游纯化步骤，耗时、不经济、不灵活且缺乏可扩展性。
连接酶，如Sortase酶用于在温和条件下以高度底物特异性和高效的方式催化偶联(例如，WO2015/165413A1，WO2014/177042和WO2014/140317)，从而可以节约时间、降低成本和减少浪费。尽管具有许多优点，然而，由于存在一些挑战，连接酶在偶联反应中的工业应用仍然受到限制。
诸如酶的操作稳定性低和可重复使用性低的挑战可通过酶的固定化克服。溴化氰活化琼脂糖凝胶上的固定化sortase A(参见，例如,Witte et al.,Site-specificprotein modification using immobilized sortase in batch and continuous-flowsystems,Nat Protoc,(2015),10(3):508–516)或固定在镍修饰磁性颗粒上的His6标记sortase A(参见,例如,Zhao et al.,One-step purification and immobilization ofextracellularly expressed sortase A by magnetic particles to develop a robustand recyclable biocatalyst,Sci Rep,(2017),7:6561)已应用于偶联。
然而，除去上游催化反应中残留的酶污染物仍然是大多数酶催化偶联物的主要关注点，特别是生物偶联物，因为残留的酶污染物(对固定化酶而言，非特异性吸附在支持物上的游离酶可能仍会脱落)可能难以除去。因此，需要成本效益、稳定、可控且易于从偶联物产物中除去的连接酶。
发明内容
在一总的方面，本发明提供一种连接酶融合蛋白，其包含连接酶和Halo标签。
在一些实施方案中，连接酶为转肽酶。在一些实施方案中，连接酶为sortase。在一些实施方案中，连接酶是sortase A。在一些优选实施方案中，sortase A包含选自SEQ IDNO:1-26的氨基酸序列或与其具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些其他优选实施方案中，sortase A在位点34、100、105和136处包含SNAT、YNAT、WNDT或VNNS的氨基酸取代，优选地，sortase A包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与其具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一实施方案中，Halo标签为突变的卤代烷烃脱卤酶或其变体，其从卤代烷基底物中除去卤素并与剩余的烷基形成共价键。在一些实施方案中，Halo标签包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一优选方面，本发明提供连接酶融合蛋白，与其来源的连接酶相比，其具有改变的等电点(pI)，其中所述连接酶具有碱性pI而所述Halo标签具有酸性pI。在一些实施方案中，所述连接酶具有约7.5至约10.0的等电点(pI)，所述Halo标签具有约4.5至约5.0的等电点，并且所述连接酶融合蛋白的pI比所述连接酶的pI低约2.0至约4.5个pH单位。
在另一总的方面，本发明提供一种固定化连接酶，其包含本发明的连接酶融合蛋白，其固定在支持物上。
本发明还提供本发明的连接酶融合蛋白或固定化连接酶在制备偶联物中的用途。
在又一总的方面，本发明提供一种制备包含第一部分和第二部分的偶联物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供包含第一部分的系统1和提供包含第二部分的系统2；和
(b)使步骤(a)中的系统1和系统2与连接酶单元接触，催化第一部分和第二部分之间的偶联反应以获得所述偶联物，
其中所述连接酶单元包含连接酶，
所述第一部分和第二部分各自独立地包含生物分子、蛋白、抗体、抗体片段、受体、信号转导因子、细胞生长因子、核酸或核酸类似物、小分子化合物，聚糖、PEG部分、放射性核素、细胞因子、免疫调节剂、示踪分子、荧光团、荧光分子、肽、多肽或肽模拟物；和
所述第一部分和第二部分中的一个进一步包含连接酶供体底物识别基序，并且第一部分和第二部分中的另一个包含连接酶受体底物识别基序。
在一些实施方案中，所述连接酶单元包含游离连接酶，优选转肽酶，特别优选sortase，更特别优选sortase A；最优选地，所述连接酶单元包含本发明的连接酶融合蛋白。
在一些其他实施方案中，所述连接酶单元包含固定到支持物上的连接酶，优选地，所述连接酶共价固定到支持物上；优选地，所述连接酶是转肽酶，特别优选sortase，更特别优选sortase A；最优选地，所述连接酶单元包含本发明的固定化连接酶。
在一些实施方案中，步骤(a)中的系统1和系统2中的至少一个包含一种或多种杂质。在一些其他实施方案中，步骤(a)中的系统1和系统2中的至少一个为收获的澄清细胞培养液(HCCF)。
在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：
(1)在步骤(b)之前将步骤(a)中的系统1进行，和/或
(2)在步骤(b)之前将步骤(a)中的系统2进行，和/或
(3)将步骤(b)中获得的偶联物进行，
一个或多个层析步骤处理以除去一种或多种杂质。
层析步骤可以独立地选自由以下组成的组：亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、混合模式层析、羟基磷灰石层析及其组合。优选地，层析步骤选自亲和层析、离子交换层析及其组合。
在一些实施方案中，第一部分和第二部分中的至少一个包含抗体或抗体片段，并且步骤(1)-(3)中的至少一个包含亲和层析；优选地，抗体或抗体片段包含Fc片段，并且亲和层析为蛋白A亲和层析。
附图说明
图1描述来源于沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)的示例性SrtA(SEQ IDNO:3)及其SNAT变体的sortase活性。
图2描述纯化的(A)Halo-Sortase、(B)His6-Sortase和(C)GB1-Sortase的活性。
图3描述不同氯树脂的酶载量。
图4描述由不同氯树脂制备的固定化Halo-Sortase的催化活性(表示为DAR)。
图5显示在低温下由GB1-Sortase、His-Sortase或Halo-Sortase催化生成的ADC产物的溶解性。
图6描述(A)ADC、(B)Halo-Sortase和(C)ADC+Halo-Sortase在使用Q SepharoseFF介质的AEX上的层析图谱。
图7描述(A)ADC和(B)Halo-Sortase在使用Capto S ImpAct介质的CEX上的层析图谱。
图8描述通过HIC-HPLC分析工艺流程2的粗偶联物混合物中包含的偶联物的DAR组成。
图9显示在工艺流程2中的每个层析步骤之后含有目标ADC的样品中残留杂质的量：蛋白A，蛋白A亲和层析的mAb洗脱物；AEX，AEX的ADC流穿液；CEX，CEX的ADC洗脱物。
图10描述通过HIC-HPLC分析工艺流程1的粗偶联物混合物中包含的偶联物的DAR组成。
图11显示在工艺流程1中的每个层析步骤之后含有目标ADC的样品中残留杂质的量：蛋白A，蛋白A亲和层析的ADC洗脱物；AEX，AEX的ADC流穿液；CEX，CEX的ADC洗脱物。
图12显示在工艺流程3中的每个层析步骤之后含有目标ADC的样品中残留杂质的量：第一蛋白A，蛋白A亲和层析中的mAb洗脱物；第二蛋白A，蛋白A亲和层析的ADC洗脱物；AEX，AEX的ADC流穿液；CEX，CEX的ADC洗脱物。
图13描述含有目标ADC的样品中残留Halo-Sortase的量：偶联物，收集自Halo-Sortase柱流穿液的粗偶联物混合物；蛋白A，蛋白A亲和层析的ADC洗脱物；AEX，AEX的ADC流穿液；CEX，CEX的ADC洗脱物。
图14显示除去连接子-毒素(连接子-负载物中间体)的优化层析图谱，(A)通过Biomax的蛋白A介质；(B)通过GE的蛋白A介质；(C)通过GE的CEX介质。
图15显示制备ADC的步骤流程图示，其采用常规方法(常规ADC工艺流程)和本发明的方法(ADC工艺流程1、ADC工艺流程2、ADC工艺流程3和ADC工艺流程4)：蛋白A，蛋白A层析；低pH，低pH处理；UF/DF，超滤/渗滤；AEX，阴离子交换层析；CEX，阳离子交换层析；HIC，疏水相互作用层析；Mab DS，单克隆抗体下游工艺。
具体实施方式
一般定义
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同含义。此外，与蛋白和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学和免疫学有关的术语和实验方法是本领域广泛使用的术语和常用方法。当本文中出现商品名时，意在指代其相应的商品或其活性成分。本文所引用的所有专利、公开的专利申请和出版物均援引加入本文。同时，为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。
如本文所用，表述“至少一个”或“一个或多个”是指一、二、三、四、五、六、七、八、九或更多、一百、两百、三百、四百、五百、六百、七百、八百、九百或更多，等等。如本文所用，除非明确指出相反，“一个”和“一个”应理解为“至少一个”。
当以范围、优选范围、或者优选数值上限或优选数值下限的形式表述特定量、浓度或其他值或参数的时候，应当理解为相当于具体揭示了通过将任意数值上限或优选数值与任意数值下限或优选数值组合起来的任何范围，不管所述范围是否明确列举。除非另有说明，本文所列出的数值范围旨在包括范围的端点和该范围内的所有整数和分数(小数)。例如，表述“i”为2-20的整数”应理解为i为2到20的任一整数，例如，i可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。其他类似的表述也应以类似的方式理解。
术语“约”和“大约”，当与数值变量结合使用时，如浓度、等电点(pI)、pH、温度或特定范围，通常是指变量的数值和变量的所有数值都在实验误差范围内(例如，平均值的95％置信区间内)或具体值±10％以内，或更宽的范围。
术语“任选”或“任选地”是指其后描述的事件可能发生但不是一定发生，该表述说明包括所述事件或情况发生或不发生的情况。
表述“包含”或类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由…组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由…组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的元素、步骤或成分，其不会实质上影响所要求保护主题的关键和新的特征。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由…组成”和“由…组成”。
如本文所用，“生物分子”的定义涵盖蛋白、核酸、脂质、碳水化合物、小核苷酸、氨基酸及其衍生物。
如本文所用，“核酸”或“多核苷酸”是指至少两个核苷酸或核苷酸衍生物通过磷酸二酯键连接在一起形成的聚合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
如本文所用，“载体”是一种用于将外源核酸转移到宿主细胞中的媒介物，外源核酸在宿主细胞中扩增或表达。如本文所用，“载体”的定义涵盖质粒(如线性化质粒)、病毒载体、粘粒、噬菌体载体、噬菌粒、人工染色体(例如，酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体)等。如本文所用，载体可在宿主细胞内表达和/或复制，是指载体能够在宿主细胞中表达RNA多核苷酸或多肽和/或产生载体的多个拷贝。为了“可表达”或“可复制”，载体可以包含与启动子可操作连接的核酸序列或元件。如本文所用，与核酸序列或元件相关的“可操作连接”是指这些核酸序列在功能上相互关联。例如，启动子可以与编码多肽的核酸序列可操作连接，由此启动子调节或介导核酸的转录。本领域技术人员可根据特定目的选择和使用合适的载体。
如本文所用，“肽”、“多肽”或“蛋白”是指共价连接的两个或多个氨基酸。除非另有具体说明，这些术语可以互换。
如本文所用，“序列同一性”具有本领域公认的含义，并且两个多肽之间的序列同一性百分比可通过使用公开可用的算法比对两个序列来计算，如基于局部比对算法搜索工具(BLAST)和快速自适应收缩/阈值算法(FASTA)(参见，例如：Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994)。虽然有多种方法来测量两个多肽之间的同一性，但术语“同一性”是本领域技术人员所熟知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM J Applied Math48:1073(1988))。
如本文所用，术语“变体”是指与参考蛋白相比，具有一个或多个残基的取代、缺失、插入的蛋白。参考蛋白可以是可从自然资源中分离的天然存在的蛋白(即野生型蛋白)，或者工程化蛋白。如本文所用，变体的功能或活性，如sortase A变体或Halo标签变体，分别与参考sortase A或Halo标签的功能或活性基本相似或相当或更高。
在本说明书的具体上下文中，蛋白中氨基酸的位置定义如下：(i)从N-末端开始；和(ii)将N末端第1个氨基酸位置指定为1。给定位置(如位点34)的氨基酸(如Ser)可以表示为Ser34。给定氨基酸位置(如位点272)的氨基酸(如His)被另一个氨基酸(如Phe)取代可以表示为His272Phe。
如本文所用，“连接酶”是指可以催化两个或多个分子共价连接的酶。连接酶可以特异性催化包含连接酶供体底物识别基序的第一部分和包含连接酶受体底物识别基序的第二部分之间的偶联以产生目标偶联物。
如本文所用，术语“转肽反应”是指其中一个或多个氨基酸(如肽)从一个分子转移到另一个分子的化学反应。转肽酶是能够催化供体底物和受体底物之间的转肽反应的酶。在由sortase催化的简化转肽反应中，sortase首先切割连接酶供体底物的识别基序(也称为供体识别基序，如当使用SrtA时的LPXTG)，通过形成硫酯键产生底物-酶中间体；接着，连接酶受体底物识别基序(也称为受体识别基序，如GGG)亲核攻击硫酯键以释放酶并在两个底物之间形成新的肽键。转肽反应通常会导致两方偶联形成偶联物。
如本文所用，术语“偶联”是指至少两部分(例如，至少两个分子或同一分子的至少两个末端)的共价连接。
如本文所用，“偶联物(conjugate)”可通过至少两部分(例如，至少两个分子或同一分子的至少两个末端/侧链)的共价连接制备。
如本文所用，“生物偶联物”是指偶联的部分中至少一个是生物分子的偶联物。生物偶联物的实例包括偶联至聚合物、脂质、抗体、肽、适配体(aptamer)或小分子配体的治疗分子，如siRNA偶联物、肽激素偶联物、肽-肽偶联物、肽-药物偶联物、抗体-药物偶联物和多特异性抗体等等。
术语“靶向分子”是指对特定目标(例如受体、细胞表面蛋白、细胞因子等)具有亲和性的分子。靶向分子能够通过靶向性递送将负载物运送到体内的特异位点。靶向分子可以识别一种或多种靶标。特异性靶向位点由其识别的靶标所定义。例如，靶向受体的靶向分子能够将细胞毒素递送至含有大量所述受体的位点。靶向分子的实例包括但不限于抗体、抗体片段、给定抗原的结合蛋白、抗体模拟物、对给定靶标具有亲和性的支架蛋白、配体等等。
如本文所用，术语“抗体-药物偶联物(ADC)”是指偶联物，其包含共价偶联至负载物的抗体或抗体片段。
如本文所用，术语连接酶(如sortase)的“活性”、“酶活性”和“催化活性”是指连接酶催化偶联反应的能力并且可以互换使用。如本文所用，sortase在偶联反应中的催化活性，例如，抗体和负载物之间的偶联反应，可以表示为偶联效率(偶联效率＝(偶联抗体的摩尔数：总抗体的摩尔数)×100％)或DAR(药物抗体比，给定抗体药物偶联物制剂的平均药物与抗体比)分布。
如本文所用，术语“抗体(Ab)”是指免疫球蛋白(Ig)分子或其衍生物，其通过至少一个抗原结合位点与抗原特异性结合。“常规”或“全长”抗体通常由四条多肽组成：两条重链(HC)和两条轻链(LC)。如本文所用，“抗体”的定义涵盖常规抗体、重组抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全人源抗体、非人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体(intrabody)、双抗(diabody)、纳米抗体(即，单域抗体、VHH域)和抗独特型抗体。“抗体”还包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员，或其任何衍生物。
如本文所用，抗体的“抗体片段”是指抗体的任何部分，其包含比全长抗体更少的氨基酸残基，如抗原结合片段，其含有抗体可变结构域的至少一部分(例如一个或多个CDR)并且与全长抗体的同源抗原特异性结合，或Fc片段，其含有抗体的重链恒定区，并与细胞表面的Fc受体结合。抗体片段可以通过多种方法获得，如化学或酶处理、化学合成或重组DNA技术。抗体片段的实例包括但不限于Fv(可变区片段)、scFv(单链Fv片段)、dsFv(二硫键稳定的可变片段)、scdsFv(单链二硫键稳定的可变片段)、双抗体、Fd片段(the fragmentdifficult)、Fab(抗原结合片段)、scFab(单链Fab)、Fab’、F(ab’)2、Fc(可结晶片段)及其任何衍生物。
如本文所用，术语“负载物(payload)”是指包含在偶联物中的功能部分，例如，通过连接子连接。负载物的实例包括但不限于小分子化合物(也称为小分子药物，例如，抑制剂和毒素(如细胞毒素))、放射性核素(例如，225Ac、211At、212Bi、213Bi、67Ga、123I、124I、125I、131I、111In、177Lu、191mOs、195mPt、186Re、188Re、119Sb、153Sm、99mTc、227Th和90Y)、聚糖、PEG部分、核酸和类似物(例如，干扰RNA)、示踪分子(例如，荧光团和荧光分子)、多肽(例如，蛋白标签、生物活性肽、酶、抗体和抗体片段以及蛋白毒素)和肽模拟物。如本文所用，包含连接子(如包含连接酶底物识别基序的连接子)的负载物和如上所述的负载物在本发明中。
如本文所用，术语“天然氨基酸”是指氨基酸，其为蛋白组成氨基酸，包括常见的二十种氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)，以及不太常见的硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”是指氨基酸，其并非蛋白组成氨基酸。具体地，该术语是指不是如上述定义的天然氨基酸的氨基酸。
如本文所用，术语“肽模拟物”是指模拟特定肽的构象和期望特征的化合物。
如本文所用，“受体”是指细胞内部或表面上的结构，其结合特定物质并在细胞中产生特定作用。受体可包括如本文所述的T细胞受体、B细胞受体以及信号分子、细胞生长因子和细胞因子的受体。
如本文所用，“信号转导因子”是指在横跨或穿过细胞的信号转导事件中起作用的任何物质。信号转导因子可包括但不限于信号分子(如类固醇激素、视黄酸、甲状腺激素、维生素D3、肽激素、神经肽、类二十烷酸、神经递质和细胞因子)及其受体。
如本文所用，术语“免疫调节剂”是指能够影响免疫系统功能的生物活性物质。免疫调节剂可以是免疫抑制性的(如免疫抑制剂/免疫抑制性的药剂)或免疫刺激性的(如免疫刺激剂(immunostimulant)/免疫增强剂(immunostimulator))。免疫调节剂的实例可包括但不限于细胞因子、胸腺激素(例如，胸腺肽、胸腺素和胸腺生成素)、香菇多糖、β-葡聚糖、菊粉、左旋咪唑、异丙肌苷、IMPDH抑制剂(例如，硫唑嘌呤、来氟米特(leflunomide)、霉酚酸、咪唑立宾(mizoribine)、利巴韦林(ribavirin)和噻唑呋林(tiazofurin))、钙调神经磷酸酶抑制剂(例如，环孢素和他克莫司(tacrolimus))、mTOR抑制剂(例如，西罗莫司(sirolimus)和依维莫司(everolimus))、P38抑制剂、NF-κB抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib))、皮质类固醇(例如，强的松(prednisone)、布地奈德(budesonide)和强的松龙(prednisolone))、Janus激酶抑制剂(例如，托法替尼(tofacitinib)和巴瑞克替尼(baricitinib))、抗细胞因子抗体和针对T细胞受体的抗体。
如本文所用，术语“细胞生长因子”是指能够刺激细胞生长、愈合、增殖、存活和分化的任何物质。生长因子的实例可包括但不限于，表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、畸胎癌衍生生长因子(TDGF))、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和促红细胞生成素(EPO)。
如本文所用，术语“细胞因子”是指由免疫系统的细胞释放并且对其他细胞具有影响的任何物质。细胞因子的实例可以包括趋化因子、淋巴因子、集落刺激因子(CSF)、单核细胞趋化蛋白(MCP)、血管生成因子、白介素、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、生长因子，以及其他分泌的和细胞表面的分子，其可向其他细胞传递信号，但不限于此。细胞因子包括但不限于INFα、INFβ、INFγ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8/CXCL8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IP-10/CXCL10、eotaxin/CCL11、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL4、RANTES/CCL5、TNFα、TNFβ和生长因子。
小分子化合物是指大小与医学中常用的有机分子相当的分子。该术语不涵盖生物大分子(例如，蛋白、核酸等)，但涵盖低分子量的肽或其衍生物，如二肽、三肽、四肽、五肽等等。通常，小分子化合物的分子量可为，例如，约100至约2000Da、约200至约1000Da、约200至约900Da、约200至约800Da、约200至约700Da，约200至约600Da，约200至约500Da。如本文所用，小分子化合物也可称为药物。
细胞毒素是指抑制或阻止细胞表达活性、细胞功能、和/或引起细胞破坏的物质。在某些情况下，目前用于ADC的细胞毒素可能比常用的化疗药物毒性更大。细胞毒素的实例包括但不限于，靶向以下靶标的药物：微管细胞骨架、DNA、RNA、驱动蛋白介导的蛋白转运、细胞凋亡调节。靶向微管细胞骨架的药物可以是，例如，微管稳定剂或微管蛋白聚合抑制剂。微管稳定剂的实例包括但不限于紫杉烷类。微管蛋白聚合抑制剂的实例包括但不限于美登素类(maytansinoids)、奥瑞他汀类(auristatins)、长春碱类、秋水仙碱类和海兔毒素类。DNA靶向药物可以是，例如，直接破坏DNA结构的药物或拓扑异构酶抑制剂。直接破坏DNA结构的药物的实例包括但不限于DNA双链断裂剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂(DNAintercalator)。DNA双链断裂剂可以是，例如，烯二炔类抗生素，包括但不限于达内霉素(dynemicin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、uncialamycin等等。DNA烷化剂可以是，例如，DNA双烷化剂(bis-alkylator)(即DNA交联剂)或DNA单烷化剂。DNA烷化剂的实例包括但不限于吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂(PBD)二聚体、1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚体、CBI-PBD异二聚体、二氢吲哚并-苯二氮
Figure BDA0003489153680000071
(IGN)二聚体、杜卡霉素样(duocarmycin-like)化合物等等。拓扑异构酶抑制剂的实例包括但不限于喜树碱类(camptothecins)和蒽环类(anthracyclines)。靶向RNA的药物可以是，例如，抑制剪接的药物，其实例包括但不限于普拉地内酯(pladienolide)。靶向驱动蛋白介导的蛋白转运的药物可以是，例如，有丝分裂驱动蛋白抑制剂，包括但不限于，纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂。
间隔子是位于不同结构模块之间并且可以在空间上分隔结构模块的结构。间隔子的定义不限于其是否具有特定功能或是否可以在体内被切割或降解。间隔子的实例包括但不限于氨基酸和非氨基酸结构，其中非氨基酸结构可以是，但不限于，氨基酸衍生物或类似物。“间隔子序列”是指作为间隔子的氨基酸序列，其实例包括但不限于单个氨基酸如Leu、Gln等，含有多个氨基酸的序列，例如，含有两个氨基酸的序列如GA等，或，例如，GGGS、GGGGSGGGGS等。间隔子的其他实例包括，例如，自切除间隔子如PAB(p-aminobenzyl，对氨基苄基)等等。
术语“烷基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链饱和脂肪烃基团，其通过单键与分子的其余部分连接。烷基可含有1至20个碳原子，即C1-C20烷基，例如，C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基、C3烷基、C4烷基、C3-C6烷基。烷基的非限制性实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基，或其异构体。二价自由基是指通过从相应的一价自由基中具有自由价电子的碳原子上除去一个氢原子而获得的基团。二价自由基具有两个连接位点，其连接到分子的其余部分。例如，“亚烷基”或“次烷基”是指直链或支链的饱和二价烃基。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-C2H4-)、亚丙基(-C3H6-)、亚丁基(-C4H8-)、亚戊基(-C5H10-)、亚己基(-C6H12-)、1-甲基亚乙基(-CH(CH3)CH2-)、2-甲基亚乙基(-CH2CH(CH3)-)、甲基亚丙基、乙基亚丙基等等。
如本文所用，当一个基团与另一个基团组合时，基团的连接可以是线性或支化的，前提是形成化学上稳定的结构。通过这样的组合形成的结构可以通过该结构中的任何合适的原子连接到分子的其他部分，优选通过指定的化学键连接。例如，当描述C1-4亚烷基与包括-CH2-、-NH-、-(CO)-、-NH(CO)-、-(CO)NH-的基团之一组合时，C1-4亚烷基可与上述基团形成线性连接，如C1-4亚烷基-CH2-、C1-4亚烷基-NH-、C1-4亚烷基-(CO)-、C1-4亚烷基-NH(CO)-、C1-4亚烷基-(CO)NH-、-CH2-C1-4亚烷基、-NH-C1-4亚烷基、-(CO)-C1-4亚烷基、-NH(CO)-C1-4亚烷基、-(CO)NH-C1-4亚烷基。所得二价结构可以进一步连接到分子的其他部分。
如本文所用，术语“等电点(pI)”是分子(如蛋白)在不带表面净电荷时的水溶液的pH(氢浓度指数)值并表达为pH单位。蛋白的pI可以采用本领域所熟知的方法实验测量，如，成像毛细管等电聚焦(iCIEF)和毛细管等电聚焦(CIEF)。具有不同pI的不同生物分子(蛋白、核酸、多糖等)在给定的pH值下可能带有不同的电荷，从而允许通过离子交换层析或等电聚焦等方法将它们分离。
如本文所用，具有“碱性pI”的分子是指该分子的pI高于7.0。如本文所用，具有“酸性pI”的分子是指该分子的pI低于7.0。
如本文所用，“蛋白标签”是指多肽，其可被引入目标分子以促进检测、分离、固定或捕获目标分子，或改善目标分子的一种或多种特性(如表达水平、溶解性和稳定性)。
离子交换层析(IEX)基于生物分子的净表面电荷差异及其对离子交换剂(也称为介质、树脂或固定相)的亲和力差异来分离生物分子。它是一种常用的生物分子纯化技术。例如，在阴离子交换层析中，pI低于缓冲液pH的蛋白将具有负的净表面电荷并与带正电荷的阴离子交换剂结合；然而，另一种pI高于缓冲液pH的蛋白将具有正的净表面电荷并且不与带正电的阴离子交换剂结合，因此将与缓冲液一起通过介质。
如本文所用，术语“支持物”是指可以以固体或半固体形式从反应混合物中分离的水不溶性物质，如表面、凝胶、聚合物、基质、颗粒、树脂、珠子或膜。
术语“澄清(clarification)”是指从含有目标生物分子的系统中除去不溶性杂质。“澄清(clarification)”工艺可以通过比浊度来监测，例如用比浊法浊度单位(NTU)测量。
术语“精纯步骤”是指进一步除去混合物中存在的微量污染物和聚集体的步骤。通常，在ADC或抗体制备过程中，可以采用一个或多个精纯步骤，其中精纯步骤可以选自亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水相互作用层析、混合模式层析和羟基磷灰石层析。
如本文所用，术语“杂质”和“污染物”是指目标分子混合物中不期望的物质，如细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白和其他蛋白、内毒素、介质成分、脂质、过量反应材料(如未反应的连接子-负载物中间体(linker-payload intermediate))、核酸和病毒。
如本文所用，术语“ppm(百万分之几)”是指目标分子(如目标偶联物)每百万单位总重量中含有的污染物(如HCP或蛋白A)的量单位)。该术语用于表示目标分子纯度的量度。
术语“超滤”或“UF”是指膜过滤技术，其采用可控孔、半透膜来浓缩或分级溶解的分子。比孔大得多的分子保留在进料溶液中，并与通过膜的液体体积成正比浓缩。超滤膜的孔径一般在1-100nm之间。
术语“渗滤”或“DF”是指使用超滤膜从含有蛋白、肽、核酸和其他生物分子的溶液中完全除去、替换或降低盐或溶剂浓度的技术。该方法根据其分子大小选择性利用渗透性(多孔)膜过滤器分离溶液和悬浮液的成分。超滤和渗滤可以组合使用，称为UF/DF。
病毒灭活被在许多生物治疗剂的纯化工艺中使用以确保安全。数种病毒灭活技术是本领域已知的，包括，温度、pH、辐射和暴露于特定化学试剂中。通常，病毒灭活可以通过低pH处理进行。对于含有Fc片段的分子，病毒灭活可以在例如层析方法步骤(例如蛋白A亲和层析或阳离子交换层析)之后进行。在这种情况下，将含有目标分子的池(pool)调整到病毒灭活所需的pH并保持一定时间(病毒灭活酸化(VIA)步骤)，已证明pH值和时间的组合会导致病毒灭活。将VIA池调整到接近中性的pH值(病毒灭活中和(VIN)步骤)，用于进一步的下游工艺。
病毒过滤(也称为病毒滞留过滤)是许多生物治疗剂纯化工艺中的常见步骤。病毒过滤可以通过UF或纳滤进行。与其他专用的病毒清除单元操作如低pH或热处理相比，在大多数情况下病毒过滤更温和，因此对产品质量的潜在不利影响较小。根据要除去的病毒大小，可以使用市售的病毒过滤产品。
在本文中可互换使用的术语“方法步骤”或“单元操作”是指使用一种或多种方法或装置在纯化过程中实现一定结果。
如本文所用，术语“连续工艺”是指用于纯化目标分子的方法，包括两个或多个方法步骤(或单元操作)，使来自一个方法步骤的输出液直接进入下一方法步骤，而无需中断和/或无需在执行下一方法步骤之前收集来自前一方法步骤的全部输出液。如本文所述，连续工艺还包括这样的方法，其中在任何单个方法步骤中流体物质的输入或输出是不连续的或间歇的。这类过程也可以被称为“半连续”工艺。
连接酶融合蛋白
在一方面，本发明提供一种连接酶融合蛋白，其包含连接酶和Halo标签。
连接酶
本发明的连接酶可以是任何目标连接酶。特别地，其可以特异性催化包含连接酶供体底物识别基序的第一部分和包含连接酶受体底物识别基序的第二部分之间的偶联，从而产生目标偶联物。
在一些实施方案中，连接酶为转肽酶。转肽酶可以是天然存在的或工程化的。在某些优选实施方案中，连接酶为分选酶(sortase)，如sortase A(SrtA)、sortase B(SrtB)、sortase C(SrtC)、sortase D(SrtD)、sortase E(SrtE)或sortase F(SrtF)，但不限于此。本文中的“sortase”或“sortase酶”是指具有sortase活性以催化转肽反应的酶，包括例如，sortase酶超家族的A类、B类、C类、D类、E类和F类sortase(参见，例如，Dramsi,et al.,Sorting sortases:a nomenclature proposal for the various sortases of Gram-positive bacteria,Research in Microbiology,(2005),156:289–297；Bradshaw,etal.,Molecular features of the sortase enzyme family,FEBS Journal,(2015),282:2097–2114；Malik and Kim,A comprehensive in silico analysis of sortasesuperfamily,J Microbiol.,(2019),57(6):431-443；和EP3647419A1)，但不限于此。这样的酶可以称为SrtA、SrtB、SrtC、SrtD、SrtE或SrtF，但不限于此。sortase可以是天然存在的或工程化的。天然存在的sortase可以在多种革兰氏阳性菌中找到，如以下属的任何菌株、种或亚种：链球菌(Streptococcus)(例如，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes))、葡萄球菌(Staphylococcus)(例如，银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、芽孢杆菌(Bacillus)(例如，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis))和李斯特菌(Listeria)(例如，单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes))，但不限于此。工程化sortase，如具有一个或多个氨基酸残基取代、缺失或插入的sortase变体，可从其天然对应物中通过本领域已知的方法获得，如蛋白工程和化学合成。还考虑本领域已知的任何野生型sortase的其他变体(如具有一个或多个活性基团或标记的那些)。前提是该变体具有与野生型sortase相同或相似的功能。本领域技术人员将能够容易地识别sortase并根据其序列和其他特征将其归类到特定类别。然而，sortase的定义不限于任何分类方法或命名系统。
在一些具体实施方案中，连接酶是sortase A(SrtA)。SrtA可以是天然存在的或工程化的。SrtA的实例包括，例如美国专利号7,238,489和如上Malik and Kim,2019中所描述的那些，如以下属的任何菌株、亚种或种：链球菌(例如肺炎链球菌和化脓性链球菌)、葡萄球菌(例如，银白色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)、链霉菌(Streptomyces)(例如，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor))、芽孢杆菌(例如，炭疽芽孢杆菌)、乳杆菌(Lactobacillus)(例如，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))和李斯特菌(例如，单核细胞增生李斯特菌)，但不限于此。各种SrtA的氨基酸序列可以在，例如，美国专利号7,238,489或公共序列数据库(如GenBank和Uniprot)中找到，其相关内容援引加入本文。可用于本发明实施例的天然存在的SrtA氨基酸序列可以是以下Uniprot标识号的蛋白：Q2FV99、A0A3S0JRJ4、A0A2T4Q430、A0A507SMZ3、A0A1F2JEX6、A0A364UNR7、A0A1J3ZU75、A0A0M2NSU2、A0A432A5V1、A0A1J4HB57、A0A4Q8MXV4、W1W5Z3、A0A2T4KDK7、A0A2K4DQX6、A0A2T4KHW3、A0A380FYB6、A0A2K4C0Y9、A0A4Q9WQB8、A0A121AFU6、A0A1Q8DH59、A0A5B2YTH7、A0A533IYI6、Q4L923、A0A1F1M8Z4、A0A2A1KC84和A0A133Q671，但不限于此。工程化SrtA已在各种文献中报道，例如WO 2016/014501，其相关内容援引加入本文。例如，可以考虑与Q2FV99相比具有一个或多个取代(如Pro94Arg、Aspl60Asn、Aspl65Ala、Lysl90Glu、Lysl96Thr、Glul05Lys和Glul08Gln)的工程化SrtA，或者与Q2FV99相比缺失N-末端59个氨基酸的截短SrtA，如WO2016/014501中所述。SrtA变体的氨基酸序列可与上述任何其他氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性。还考虑本领域已知的任何野生型SrtA的变体(如具有一个或多个活性基团或标记的那些)。前提是该变体具有与野生型SrtA相同或相似的功能。
在一些实施方案中，SrtA包含选自SEQ ID NO:1-26(WT)的氨基酸序列。在一些其他实施方案中，SrtA包含选自SEQ ID NO:1-26的氨基酸序列并且在位点34、100、105和136处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，在位点34、100、105和136处的氨基酸残基分别被Ser、Asn、Ala和Thr(即[Ser34][Asn100][Ala105][Thr136]，SNAT)，Tyr、Asn、Ala和Thr(即[Tyr34][Asn100][Ala105][Thr136]，YNAT)，Trp、Asn、Asp和Thr(即[Trp34][Asn100][Asp105][Thr136]，WNDT)，或Val、Asn、Asn和Ser(即[Val34][Asn100][Asn105][Ser136]，VNNS)取代。在一些具体实施方案中，sortase A包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其为SEQID NO:1的SNAT对应物。
在一些实施方案中，sortase A包含与选自SEQ ID NO:1-26的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sortase A包含与选自SEQ ID NO:1-26的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性，并且在位点34、100、105和136处包含SNAT、YNAT、WNDT或VNNS的氨基酸取代的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供一种SrtA，其包含选自SEQ ID NO:1-26的氨基酸序列并且在位点34、100、105和136处包含SNAT、YNAT、WNDT或VNNS的氨基酸取代，或者与其具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。另一方面，本发明提供一种SrtA，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或者与其具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
Halo标签
Halo标签为突变的卤代烷烃脱卤酶或其变体，其从卤代烷基底物(例如，包含卤代烷基部分-(CH2)2-30-X的试剂，其中X是卤素如F、Cl、Br、I，特别是Cl或Br)中除去卤素，并与底物的剩余部分形成共价键。突变的卤代烷烃脱卤酶已在，例如，WO2006/093529和WO2008/054821中描述，其相关内容援引加入本文。可用于本发明的突变卤代烷烃脱卤酶可包括但不限于黄杆菌(Xanthobacter)脱卤酶(如自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophicus)脱卤酶(DhIA))或红球菌(Rhodococcus)脱卤酶(如玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤酶(DhaA))的突变体，如在催化三联体残基处包含一个或多个取代，如用Phe/Ala/Gly/Gln/Asn取代His272或用Cys取代Asp106或其他取代，如WO2008/054821中所述。前提是突变的卤代烷烃脱卤酶能够与卤代烷基底物形成共价键。
在一些优选实施方案中，Halo标签包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，Halo标签包含与SEQ ID NO:28具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
进一步包括额外元件和/或修饰的实施方案
任选地，连接酶融合蛋白可以进一步包含一个或多个附加元件，如附加多肽或标签。优选地，连接酶融合蛋白基本上保留期望的特性。本领域技术人员可以根据融合蛋白的期望功能或特性选择合适的元件。引入此类元件的方法是本领域已知的。
附加多肽可以是具有期望特性的蛋白标签。蛋白标签的实例可以包括但不限于，报告蛋白、结合标签和溶解性增强标签。报告蛋白的实例包括但不限于，荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白及其变体)、AP(碱性磷酸酶)和HRP(辣根过氧化物酶)。结合标签可以共价或非共价方式有效结合相应的结合配偶体。结合标签的实例包括但不限于，多组氨酸标签(即His标签，例如His6或His8标签)、Fc标签(免疫球蛋白重链恒定区(结构域3和4))、钙调素标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、S标签(其与核糖核酸酶S蛋白相互作用)、结合亲和素/链霉亲和素/中性抗生物素的肽(例如，SBP标签、Strep标签和Strep标签Ⅱ)、Halo标签、SNAP标签和CLIP标签(DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的工程突变体)及其变体。当作为重组蛋白的一部分表达时，溶解性增强标签通常可增强重组蛋白的表达水平和溶解性。溶解性增强标签的实例包括但不限于，GB1标签(链球菌蛋白G的B1结构域)、葡萄球菌蛋白A的Z结构域、SUMO(小泛素相关修饰物)、硫氧还蛋白、GST和MBP。应理解，蛋白标签的特性不构成对实施方案的任何限制，并且蛋白标签可以具有一种或多种特性，例如，报告蛋白或结合标签也可以是溶解性增强标签。
附加多肽也可以是短肽，其可用作连接子、间隔子或酶可切割序列(如TEV蛋白酶识别基序或凝血酶识别基序)。在一些实施方案中，使用本领域已知的方法在连接酶和Halo标签之间插入刚性或柔性的连接肽(如多聚甘氨酸段，(G4S)n，其中G为甘氨酸，S为丝氨酸，并且n为1-6的整数，优选n为2-5的整数)，以确保融合蛋白的正常功能。在一些实施方案中，连接肽为(G4S)2。在一些实施方案中，连接酶融合蛋白包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标签是示踪分子，如荧光团、放射性核素、荧光分子、荧光量子点或纳米金颗粒。在一些实施方案中，标签是亲和标签，如生物素。此类标签可用于监测由融合蛋白催化的反应或者追踪或固定融合蛋白。
在一些实施方案中，连接酶融合蛋白包含一个或多个修饰，其中连接酶、Halo标签和附加多肽(当适用时)通过例如取代、缺失、添加、插入一个或多个氨基酸或者在一个或多个合适的残基处引入部分或活性基团而独立地修饰，只要修饰的融合蛋白的期望生物学活性或功能与相应融合蛋白的生物学活性或功能基本相似。
具有碱性pI的连接酶的具体实施方案
在一优选方面，本发明提供与其来源的连接酶相比具有改变的pI的连接酶融合蛋白，其中所述连接酶具有碱性pI而所述Halo标签具有酸性pI。通过将具有碱性pI的连接酶与具有酸性pI的Halo标签融合，获得具有改变的pI的连接酶融合蛋白，从而在特定情况下产生特定的有益效果。例如，与特定条件下(例如，在给定pH值的具体缓冲系统中或在体内环境中)的连接酶相比，所述连接酶融合蛋白可具有改变的电荷特性，从而导致，例如，与连接酶相比，改变的溶解性、稳定性或静电相互作用模式(即，与带电物质形成静电相互作用的能力)。
在一些实施方案中，所述连接酶具有约7.5至约10.0的等电点(pI)，所述Halo标签具有约4.5至约5.0的pI，并且所述连接酶融合蛋白的pI比连接酶的pI低约2.0至约4.5个pH单位。在包含一个或多个附加元件(如上述定义的附加多肽或标记或其组合)和/或修饰(如氨基酸取代、缺失、添加、插入，或部分或活性基团)的实施方案中，优选在连接酶融合蛋白和连接酶之间实现期望的pI差异。在一些实施方案中，附加多肽(如果适用)可具有特定pI，其有助于实现连接酶融合蛋白的期望pI。
在一些实施方案中，连接酶融合蛋白的pI比连接酶的pI低约2.0至约2.5个pH单位，如比连接酶的pI低约2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5个pH单位。在一些实施方案中，连接酶融合蛋白的pI比连接酶的pI低约2.6至约3.0个pH单位，如比连接酶的pI低约2.6、2.7、2.8、2.9或3.0个pH单位。在一些实施方案中，连接酶融合蛋白的pI比连接酶的pI低约3.1至约3.5个pH单位，如比连接酶的pI低约3.1、3.2、3.3、3.4或3.5个pH单位。在一些实施方案中，连接酶融合蛋白的pI比连接酶的pI低约3.6至约4.0个pH单位，如比连接酶的pI低约3.6、3.7、3.8、3.9或4.0个pH单位。在一些实施方案中，连接酶融合蛋白的pI比连接酶的pI低约4.1至约4.5个pH单位，如比连接酶的pI低约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5个pH单位。
在一些实施方案中，连接酶融合蛋白的pI为约4.5至约6.5，如约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。在一些优选实施方案中，连接酶融合蛋白的pI为约5.0至约6.0。
在一些实施方案中，连接酶的pI为约7.5至约8.5，如7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。在一些实施方案中，连接酶的pI为约8.6至约9.5，如8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4或9.5。在一些实施方案中，连接酶的pI为约9.6至约10.0，如约9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。
在一些具体实施方案中，融合蛋白的pI为约5.0至约6.0，并且连接酶的pI为约7.6至约9.7。
在一些实施方案中，连接酶为sortase。所述sortase可以选自以下组成的组：SrtA、SrtB、SrtC、SrtD、SrtE和SrtF。
在一些优选实施方案中，所述SrtA包含选自SEQ ID NO:1-12(WT)的氨基酸序列。在一些其他实施方案中，所述SrtA包含选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列，并且在位点34、100、105和136处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，在位点34、100、105和136处的氨基酸残基分别被Ser、Asn、Ala和Thr(SNAT)，Tyr、Asn、Ala和Thr(YNAT)，Trp、Asn、Asp和Thr(WNDT)或Val、Asn、Asn和Ser(VNNS)取代。这些SrtA的pI列于表1中。
表1
WT SNAT YNAT WNDT VNNS
SEQ ID NO:1 7.673 8.508 8.473 7.675 8.508
SEQ ID NO:2 8.867 9.114 9.066 8.874 9.114
SEQ ID NO:3 9.445 9.458 9.403 9.306 9.458
SEQ ID NO:4 8.874 9.123 9.075 8.881 9.123
SEQ ID NO:5 8.867 9.114 9.066 8.874 9.114
SEQ ID NO:6 9.114 9.306 9.255 9.123 9.306
SEQ ID NO:7 8.868 9.114 9.066 8.874 9.114
SEQ ID NO:8 8.867 9.114 9.066 8.874 9.114
SEQ ID NO:9 9.132 9.471 9.414 9.319 9.471
SEQ ID NO:10 8.896 9.33 9.275 9.141 9.33
SEQ ID NO:11 9.414 9.659 9.605 9.544 9.659
SEQ ID NO:12 8.896 9.33 9.275 9.141 9.33
在一些实施方案中，所述sortase A包含与选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述sortase A包含与选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％氨基酸序列同一性，并且在位点34、100、105和136处包含SNAT、YNAT、WNDT或VNNS的氨基酸取代的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，所述sortase A包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。其为SEQID NO:1的SNAT对应物，并且具有8.508的pI。
在一些实施方案中，使用本领域已知的方法在连接酶和Halo标签之间插入刚性或柔性的连接肽(如多聚甘氨酸段，(G4S)n，其中G为甘氨酸，S为丝氨酸，并且n为1-6的整数，优选n为2-5的整数)，以确保融合蛋白的正常功能。在一些实施方案中，连接肽为(G4S)2。在一些实施方案中，连接酶融合蛋白包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
获得连接酶融合蛋白的方法
连接酶、Halo标签和附加多肽(当适用时)可以任何方式融合。在一些实施方案中，连接酶位于Halo标签的N-末端。在一些实施方案中，Halo标签位于连接酶的N-末端。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的方法在连接酶和Halo标签之间插入刚性或柔性的连接肽(如多聚甘氨酸段，(G4S)n，其中G为甘氨酸，S为丝氨酸，并且n为1-6的整数，优选n为2-5的整数)，以确保融合蛋白的合适功能。在一些实施方案中，连接肽为(G4S)2。在一些实施方案中，连接酶融合蛋白包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
连接酶融合蛋白可以用本领域已知的各种技术获得，如通过重组DNA技术从核酸表达中获得、化学合成、酶催化偶联或化学偶联方法。在一些优选实施方案中，连接酶融合蛋白为由核酸编码的重组蛋白，所述核酸包含编码连接酶和Halo标签的核酸序列。重组蛋白可以在合适的宿主细胞中表达和纯化，如哺乳动物细胞、细菌、酵母细胞或昆虫细胞，优选细菌，如大肠杆菌。
核酸和载体
本发明还提供编码本发明的连接酶融合蛋白的核酸，其包含编码本发明的连接酶的第一多聚核苷酸和编码Halo标签的第二多聚核苷酸，其中所述第一多聚核苷酸和第二多聚核苷酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，本发明的核酸进一步包含编码附加多肽的第三多聚核苷酸，所述附加多肽与连接酶和Halo标签可操作连接。附加多肽的实例如上所述。
在一些实施方案中，第一多聚核苷酸编码sortase A，第二多聚核苷酸编码Halo标签。在一些实施方案中，第一多聚核苷酸编码sortase A，所述sortase A具有选自SEQ IDNO:1-26的氨基酸序列，并且第二多聚核苷酸编码Halo标签，所述Halo标签具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一具体实施方案中，第一多聚核苷酸编码SrtA，所述SrtA具有SEQ IDNO:27的氨基酸序列，并且第二多聚核苷酸编码Halo标签，所述Halo标签具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在另一具体实施方案中，所述核酸编码连接酶融合蛋白，所述连接酶融合蛋白具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列。本领域技术人员会理解，在不违背本发明精神的情况下，核酸中的一个或多个核苷酸可被优化。
在一些实施方案中，本发明的核酸制备为重组核酸，其可进一步包含一种或多种附加多核苷酸，如调控元件和编码蛋白标签的多核苷酸。这样的调控元件可调控本发明的融合蛋白的表达，包括但不限于，增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点(IRES)。包含本发明的核酸的重组核酸可以使用本领域已知的分子克隆技术来制备，例如，化学合成、定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术(参见Sambrook,J.,E.F.Fritsch,and T.Maniatis(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
在一些实施方案中，将本发明的核酸克隆到载体中，优选地，可在宿主细胞(例如，细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞)中表达的表达载体。本领域技术人员能够根据连接酶融合蛋白的性质和所使用的宿主细胞选择合适的表达载体。在一些实施方案中，载体是在细菌(如大肠杆菌)中表达的细菌表达载体。在一些实施方案中，表达载体可进一步包括一种或多种选择标记基因，例如，新霉素或嘌呤霉素抗性基因。表达后，可以根据所用的蛋白标签，采用本领域已知的方法纯化融合蛋白。根据要使用的宿主细胞类型和纯化策略，本领域技术人员能够选择合适的表达载体、启动子、调控元件和蛋白标签。
固定化连接酶
在另一方面，本发明提供一种固定化连接酶，其包含固定在支持物上的本发明的连接酶融合蛋白。
支持物可以是由任何材料制成的固体形式或半固体形式。支持物的非限制性实例可包括但不限于，树脂(例如，琼脂糖树脂、有机硅树脂、聚甲基丙烯酸甲酯树脂、环氧树脂或纤维素树脂)、凝胶(如藻酸盐水凝胶)、珠/微球/颗粒(例如，聚苯乙烯珠、磁性颗粒)、板、孔、管、薄膜、膜、基质和玻璃(例如，载玻片)。
在一些优选实施方案中，支持物是树脂。在一些更优选实施方案中，支持物选自由以下组成的组：琼脂糖树脂、有机硅树脂、聚甲基丙烯酸甲酯树脂和纤维素树脂。在一具体实施方案中，支持物是高度交联的琼脂糖树脂。
酶固定化的方法是本领域已知的，如吸附、共价或非共价结合、包埋、包封和交联。期望固定后能保留连接酶的最大酶活性并且在偶联反应后偶联物产物中存在最小量的游离连接酶。优选地，支持物表面修饰为包含一个或多个官能团，使得连接酶融合蛋白可以共价固定在支持物上。
优选地，支持物包含一个或多个化学活性官能团，其可与连接酶融合蛋白的反应基团(如胺、巯基和羧酸盐)或与卤代烷基底物中的反应基团形成共价键，或者支持物包含相应结合标签/亲和标记的一个或多个结合配偶体，所述结合标签/亲和标记包含在连接酶融合蛋白中。化学活性官能团和反应基团之间的对应关系，或结合标签/亲和标记和结合配偶体之间的对应关系是本领域已知的。
在一些实施方案中，支持物包含化学活性官能团，其可与连接酶融合蛋白上的反应基团(如胺、巯基和羧酸盐)或与卤代烷基底物中的反应基团形成共价键。在一些具体实施方案中，支持物包含的官能团选自由以下组成的组：氰酸酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、胺、碳酸酯、环氧化物、马来酰亚胺、卤代乙酰基、氮丙啶、氯甲酸乙酯和脂肪醛。
在一些实施方案中，支持物是环氧活化树脂、CNBr(溴化氰)-活化树脂或NHS-活化树脂，优选环氧活化树脂。在一些具体实施方案中，支持物是环氧活化的琼脂糖树脂，优选环氧活化的高度交联琼脂糖树脂。在一些优选实施方案中，与卤代烷基底物反应之前，将环氧活化树脂预处理以引入氨基。在一些优选实施方案中，环氧活化树脂的预处理使用氨进行。在一些优选实施方案中，环氧活化树脂的预处理导致在环氧乙烷环上引入氨基并且环氧乙烷环的开环提供羟基。这样的羟基在制备支持物的后续工序中任选地被封端。在一具体实施方案中，环氧活化树脂的预处理导致在环氧乙烷环上引入氨基并且环氧乙烷环的开环提供羟基，其在制备支持物的后续工序中任选地被酯化试剂(例如，乙酰化试剂，如Ac2O)酯化。这样预处理的环氧活化树脂在如上定义的“环氧活化树脂”的范围内。在一些优选实施方案中，所述树脂是琼脂糖树脂(如高度交联琼脂糖树脂)或聚甲基丙烯酸甲酯树脂。
在一些其他实施方案中，支持物包含相应结合标签/亲和标记的一个或多个结合配偶体，所述结合标签/亲和标记包含在连接酶融合蛋白中，如附加标签或亲和标记。反应基团之间或结合标签/亲和标记与结合配偶体之间的对应关系是本领域已知的。结合标签/亲和标签和对应的结合配偶体的实例可以包括但不限于His标签和Ni2+、生物素/SPB标签/Strep标签/Strep标签Ⅱ和链霉亲和素/亲和素/中性亲和素、GST标签和谷胱甘肽、Fc标签和蛋白A、钙调素标签和Ca2+、MBP和直链淀粉、S标签和核糖核酸酶S-蛋白、SNAP标签和苄基鸟嘌呤(BG)衍生物，以及CLIP标签和苄基胞嘧啶(BC)衍生物。
在一些优选实施方案中，支持物通过包含卤代烷基连接子进行官能化以与Halo标签形成共价相互作用。卤代烷基连接子可通过支持物包含的一个或多个官能团与卤代烷基底物中的一个或多个反应基团共价连接引入到支持物，由此获得的支持物也称为卤代烷基连接子修饰的支持物。卤代烷基连接子修饰的支持物在如上定义的“支持物”的范围内。卤代烷基底物的实例包括但不限于例如US20060024808A1和WO2006093529中所述。卤代烷基底物和制备这样的支持物的方法参见，例如，美国专利号7,429,472、7,888,086和8,202,700，日本专利号4748685中的描述，其相关内容援引加入本文。
卤代烷基底物可包含卤代烷基部分，其包含伯或仲卤基，优选伯卤基。卤代烷基部分中的卤基选自F、Cl、Br和I，优选Cl和Br。在一些实施方案中，卤代烷基底物具有下式(I)的结构：
(F1a―H1b)r―Lh―(F2b―H2a)s(I)
其中，
F1和F2独立地为包含反应基团的部分，其可以与支持物所包含的化学活性官能团形成共价键；
H1和H2独立地选自卤代C2-30烷基；
Lh为化学键或为C3-200亚烷基，并且其中所述亚烷基中的一个或多个(-CH2-)结构任选被-O-、-NH-、-(CO)-、-NH(CO)-和-(CO)NH-代替；
Lh任选地被1、2或3个取代基取代，所述取代基选自-O-C1-10烷基、-NH-C1-10烷基、-(CO)-C1-10烷基、-NH(CO)-C1-10烷基和-(CO)NH-C1-10烷基；
a为0或1，b为0或1，条件是a和b不同；
r为1-100的整数；
s为1-100的整数。
在一些实施方案中，r为1-10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，s为1-10的整数，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，F1或F2中的反应基团选自氨基、胺、巯基和活性酯。在一些实施方案中，活性酯含有一个或多个羧酸自由基(如在合适的醇或苯酚的碳酸单酯中，例如缺电子苯酚如4-硝基苯酚；或如在NHS酯或磺基-NHS酯中)或一个或多个磺酸自由基(如在甲磺酸活性酯中，例如，MsO-)。在一具体实施方案中，F1或F2为
Figure BDA0003489153680000161
在一些实施方案中，H1和H2独立地选自卤代C2-20烷基，优选卤代C2-10烷基，特别是卤代C6烷基。在一些具体实施方案中，H1或H2中的烷基为直链烷基。在一具体实施方案中，H1或H2为(CH2)2-30-X，优选(CH2)2-20-X，更优选(CH2)2-10-X，特别是(CH2)6-X，其中X为选自F、Cl、Br和I的卤素。
在一些优选实施方案中，支持物是HaloLinkTM树脂(Promega)。
在一些更优选实施方案中，支持物是可包含卤代烷基连接子的树脂，所述卤代烷基连接子包含-(CH2)2-30-X的结构，其中X为选自F、Cl、Br和I的卤素。在一具体实施方案中，支持物是卤代芳基连接子修饰的树脂，优选琼脂糖树脂或聚甲基丙烯酸甲酯树脂，更优选高度交联琼脂糖树脂。
在一些具体实施方案中，a为1，b为0，r为1，s为1，F1为
Figure BDA0003489153680000162
Lh为
Figure BDA0003489153680000163
H2为(CH2)2-20-Cl，并且所述卤代烷基底物为氯代烷基底物，其具有式(Ⅰ-1)的结构：
Figure BDA0003489153680000171
其中，u为1-20的整数，v为0-20的整数，并且w为1-19的整数。
在一具体实施方案中，u为3，v为2，并且w为5，并且所述氯代烷基底物具有下式(I-1-1)的结构：
Figure BDA0003489153680000172
在一些实施方案中，支持物是氯代烷基连接子修饰的支持物并且具有式(II)的结构:
Figure BDA0003489153680000173
其中u为1-20的整数，v为0-20的整数，并且w为1-19的整数；
Figure BDA0003489153680000174
表示支持物，其为树脂、珠、膜、凝胶、基质、薄膜、板、孔、管、载玻片或表面，优选树脂，更优选琼脂糖树脂、有机硅树脂、聚甲基丙烯酸甲酯树脂或纤维素树脂，最优选为高度交联琼脂糖树脂。注意，为清楚起见，仅对单个氯代烷基-连接子部分连接到支持物上进行描述，但应理解，会有许多这样的氯代烷基-连接子部分连接到支持物上。
在一些实施方案中，如式(Ⅱ)所示的氯代烷基连接子修饰的支持物使用表示为
Figure BDA0003489153680000175
的树脂、珠、膜、凝胶、基质、薄膜、板、孔、管、载玻片或表面和式(Ⅰ-1)的氯代烷基底物制备。/>
在一些实施方案中，如式(II)所示的氯代烷基连接子修饰的支持物由预处理的环氧活化树脂制备，所述环氧活化树脂通过在环氧活化树脂的环氧乙烷环上引入氨基而制备，预处理过程中环氧乙烷环的开环提供羟基，其在制备支持物的后续工序中任选地用Ac2O酯化，式(Ⅱ)所示支持物具有式(Ⅱ-1)的结构：
Figure BDA0003489153680000176
其中，
亚结构
Figure BDA0003489153680000177
代表预处理的环氧活化树脂，其中/>
Figure BDA0003489153680000178
部分代表环氧乙烷环，其与氨基反应并开环得到羟基，随后酯化形成AcO-，/>
Figure BDA0003489153680000179
部分代表预处理的环氧活化树脂的其他部分。
在一些实施方案中，固定化连接酶具有以下结构：
Support----Linker----HaloTag----Ligase
其中,
Support是支持物(如固体支持物)，例如选自树脂、珠、膜、凝胶、基质、薄膜、板、孔、管、载玻片或表面，优选树脂，更优选琼脂糖树脂、有机硅树脂、聚甲基丙烯酸甲酯树脂或纤维素树脂，最优选为高度交联琼脂糖树脂；
Linker是与支持物共价结合的连接子部分，例如，包含10-60个碳原子的链，任选地包含一个或多个醚、酯、氨基甲酸酯和/或酰胺键；例如，式(Ⅱ-1’)或(Ⅱ’)的连接子部分
Figure BDA0003489153680000181
其中u为1-20的整数，v为0-20的整数，并且w为1-19的整数；
HaloTag是Halo标签(卤代烷烃脱卤酶多肽)，与连接子共价结合；
Ligase是连接酶；
其中一个或多个“----Linker----HaloTag----Ligase”部分结合到相同的支持物上。
在一些实施方案中，包含式(II-1’)的连接子部分的固定化连接酶通过以下反应获得：1)一种或多种氯代烷基底物与支持物反应，形成氯代烷基连接子修饰的支持物；2)氯代烷基连接子修饰支持物与HaloTag(例如连接酶融合蛋白中包含的Halo标签)随后反应，得到所述固定化连接酶。
连接酶融合蛋白和固定化连接酶的用途
本发明还提供本发明的连接酶融合蛋白或固定化连接酶在制备偶联物中的用途。偶联物的类型不受限制。偶联物可以通过将连接酶融合蛋白或固定化连接酶与第一部分和第二部分接触、偶联获得，其中第一部分和第二部分中的一个包含连接酶供体底物识别基序，另一个包含连接酶受体底物识别基序。
在一些实施方案中，偶联物是生物偶联物。生物偶联物的实例可包括但不限于，siRNA偶联物、肽-激素偶联物、肽-肽偶联物、肽-药物偶联物、抗体-药物偶联物和多特异性抗体。在一些实施方案中，偶联物包含受体、抗体或抗体片段。在一些实施方案中，偶联物是抗体-药物偶联物。
在一些实施方案中，偶联物的pI比连接酶融合蛋白的pI高约1.0至约4.0个pH单位，如比连接酶融合蛋白的pI高约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0个pH单位。在一些优选实施方案中，偶联物的pI比连接酶融合蛋白的pI高约2.0至约4.0个pH单位。
在一些实施方案中，偶联物的pI为约5.5至约10.5，如约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些优选实施方案中，偶联物的pI为约7.5至约10.0。在一些具体实施方案中，偶联物的pI为约8.0至约9.0。
在一些实施方案中，偶联物的pI为约5.5至约10.5，并且连接酶融合蛋白的pI为约4.5至约6.5。在一些具体实施方案中，偶联物的pI为约8.0至约9.0，并且连接酶融合蛋白的pI为约5.0至约6.0。
在一些实施方案中，连接酶融合蛋白和偶联物可使用离子交换层析(IEX)相互分离。所述IEX可以是阴离子交换层析(AEX)、阳离子交换层析(CEX)或其组合。在一些其他实施方案中，连接酶融合蛋白和偶联物可使用等电聚焦相互分离，如iCIEF或CIEF。
在一些具体实施方案中，连接酶是sortase，优选sortase A，并且偶联物是抗体-药物偶联物。
本发明的方法
另一方面，本发明提供一种用于制备包含第一部分和第二部分的偶联物的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含第一部分的系统1和提供包含第二部分的系统2；和
(b)使步骤(a)中的系统1和系统2与连接酶单元接触，催化第一部分和第二部分之间的偶联反应以获得所述偶联物，
其中所述连接酶单元包含连接酶，
所述第一部分和第二部分各自独立地包含生物分子、蛋白、抗体、抗体片段、受体、信号转导因子、细胞生长因子、核酸或核酸类似物、小分子化合物、聚糖、PEG部分、放射性核素、细胞因子、免疫调节剂、示踪分子、荧光团、荧光分子、肽、多肽或肽模拟物；并且
所述第一部分和第二部分中的一个进一步包含连接酶供体底物识别基序，并且第一部分和第二部分中的另一个包含连接酶受体底物识别基序。
在一些实施方案中，第一部分和第二部分通过连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序的偶联而相互连接。
在一些实施方案中，第一部分和第二部分中的至少一个包含连接子，优选所述第一部分或第二部分所包含的连接酶识别基序(即，连接酶供体底物识别基序或连接酶受体底物识别基序)是连接子的一部分。在一些实施方案中，所述第一部分或第二部分包含负载物和连接子，并且所述连接子可以包含连接酶识别基序和一个或多个连接到负载物的结构部分。在其他实施方案中，所述第一部分或第二部分包含生物分子和连接子，连接子可以包含连接酶识别基序和一个或多个与生物分子连接的结构部分。在又一实施方案中，生物分子和/或负载物独立地修饰为包含一个或多个附加部分，如活性基团、间隔子和标记。
术语偶联物的“第一部分”和“第二部分”在本文中用于指偶联物的各部分。例如，对于生物偶联物，第一部分可以是偶联物的生物分子部分，而第二部分可以是另一功能部分或偶联物的其余部分。应当理解，“第一”和“第二”仅为清楚起见用于指定不同的部分，但并不构成任何限制。
术语“系统1”和“系统2”仅用于指定含有待偶联部分的不同部分，但不构成任何限制。系统1和系统2可以各自独立地为任何形式，如水性形式、固体形式或半固体形式。优选地，系统1和系统2中的至少一个是水形式，如(水)溶液或流体。系统1和系统2可以各自独立地选自培养物(如组织培养物、哺乳动物细胞培养物、酵母细胞培养物、细菌细胞培养物和噬菌体培养物)、收获的细胞培养液、含有抗体的溶液、含有连接子-负载物中间体的溶液等。“系统1”和“系统2”可以相同或不同，优选不同。
连接酶单元
连接酶单元(ligase unit)可包含任何连接酶，不受限制。具体地，它可以识别两个部分上的识别基序并催化两个部分之间的偶联。在一些实施方案中，连接酶为转肽酶。在一些实施方案中，连接酶为sortase。Sortase可选自由以下组成的组：SrtA、SrtB、SrtC、SrtD、SrtE、SrtF及其组合。在一些实施方案中，连接酶为如上所述的SrtA。在一些实施方案中，连接酶通过包含一个或多个附加元件，如上所述的蛋白标签或标记，或通过包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入进一步修饰。
连接酶可以是游离的连接酶或固定在支持物上。优选地，连接酶固定在支持物上，从而可以实现更高的操作稳定性和可重复使用性、更低的酶污染、更少的面积占用和连续生产。支持物可以是由任何材料制成的固体形式或半固体形式。支持物的非限制性实例可包括但不限于，树脂(例如，琼脂糖树脂、有机硅树脂、聚甲基丙烯酸甲酯树脂、环氧树脂或纤维素树脂)、凝胶(如藻酸盐水凝胶)、珠/微球/颗粒(例如，聚苯乙烯珠、磁性颗粒)、板、孔、管、薄膜(film)、膜(membrane)、基质和玻璃(例如，载玻片)。
酶固定化方法是本领域已知的，如吸附、共价或非共价结合、包埋、包封和交联。期望固定后能保留连接酶的最大酶活性并且在偶联反应后偶联物产物中存在最小量的游离连接酶。
更优选地，连接酶共价固定到支持物以减少从支持物脱落的游离连接酶的量。非特异性共价固定蛋白的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，支持物包含可与连接酶上的反应基团(如胺、硫醇和羧酸盐)形成共价键的化学活性官能团。这样的官能团可选自由以下组成的组：异硫氰酸酯、异氰酸酯、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、碳酸酯、环氧化物、马来酰亚胺、卤代乙酰基、氮丙啶、氯甲酸乙酯和脂肪醛。
最优选地，连接酶通过自标记蛋白标签共价固定到支持物上，从而保留最大的酶活性。自标记蛋白标签能够与其底物形成共价相互作用。这样的蛋白标签可包括但不限于，SNAP标签、CLIP标签、Halo标签及其变体。因此，支持物可包含蛋白标签的对应底物。
在一些具体实施方案中，连接酶单元包含本发明的连接酶融合蛋白。在一些具体实施方案中，连接酶单元包含本发明的固定化连接酶。
偶联物
所述方法可用于制备各种偶联物。在一些实施方案中，所述偶联物是如上所述的生物偶联物。
在一些实施方案中，偶联物具有式(III)的结构，第一部分包含T，第二部分包含式(IV)的连接子-负载物中间体，
Figure BDA0003489153680000201
其中
T包含生物分子，其任选地修饰为具有连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的一个；
L包含连接子，其包含连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的另一个；
P包含负载物；
z为1-20的整数；
t为1-20的整数。
t表示与单个连接子偶联以形成式(IV)的连接子-负载物中间体的负载物的数目。z表示式(IV)化合物与单个T偶联形成式(III)化合物的数目。
在一实施方案中，z选自以下值：1-10、1-8、1-6或1-4的整数。在另一实施方案中，z为1或2。在一具体的实施方案中，z为2。
生物分子
在本发明中，生物分子可选自由以下组成的组：蛋白、肽、抗体、抗体片段、受体、信号转导因子、细胞生长因子以及核酸和类似物。在一实施方案中，T任选地包含连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的一个，或任选地修饰为具有这类基序中的一个。
在一些实施方案中，T为包含受体、抗体或抗体片段的分子，其任选地修饰为具有连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的一个。在另一些实施方案中，T为受体、抗体或抗体片段，其任选地修饰为具有连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的一个。在一优选实施方案中，T为包含Fc片段和抗体的抗原结合片段的分子，其任选地修饰为具有连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的一个。在另一些实施方案中，T为可溶性受体，其任选地修饰为具有连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的一个。
在一些实施方案中，T为靶向分子，其任选地修饰为具有连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的一个。靶向分子(如抗体或其抗原结合片段)识别的靶标包括但不限于CD19、CD22、CD25、CD30/TNFRSF8、CD33、CD37、CD44v6、CD56、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD117/KIT、CD123、CD138、CD142、CD174、CD227/MUC1、CD352、CLDN18.2、DLL3、ErbB2/HER2、CN33、GPNMB、ENPP3、Nectin-4、EGFRvⅢ、SLC44A4/AGS-5、CEACAM5、PSMA、TIM1、LY6E、LIV1、Nectin4、SLITRK6、HGFR/cMet、SLAMF7/CS1、EGFR、BCMA、AXL、NaPi2B、GCC、STEAP1、MUC16、间皮素(Mesothelin)、ETBR、EphA2、5T4、FOLR1、LAMP1、Cadherin 6、FGFR2、FGFR3、CA6、CanAg、整合素αV、TDGF1、肝配蛋白(Ephrin)A4、Trop2、PTK7、NOTCH3、C4.4A、FLT3。
在一些实施方案中，靶向分子为抗人HER2抗体或其抗原结合片段，其任选地被修饰为具有连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的一个。抗人HER2抗体的实例包括但不限于帕妥珠单抗(Pertuzumab)和曲妥珠单抗(Trastuzumab)。
在一实施方案中，靶向分子为选自抗人TROP2抗体或其抗原结合片段的一种或多种，其任选地被修饰为具有连接酶供体底物识别基序和连接酶供体底物识别基序中的一个。在一具体实施方案中，抗人TROP2抗体是选自基于hrS7(US20140120035)的工程化抗TROP2抗体的一种或多种。在另一具体实施方案中，抗人TROP2抗体是选自基于MAAA1181a(US20160297890)的工程化抗TROP2抗体的一种或多种。
在一优选实施方案中，抗人HER2或TROP2抗体是重组抗体，其选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段和抗体模拟物。在一些实施方案中，抗体模拟物选自由以下组成的组：scFv、微型抗体、双抗体、纳米抗体。为了与式(IV)化合物偶联，本发明的靶向分子可包含修饰部分，其与式(Ⅴ)化合物中的D1或D2连接，即连接子中包含连接酶受体或供体底物识别基序，参见如下。这样的修饰部分的引入位置不受限制，例如，当靶向分子为抗体时，其引入位置可以是，但不限于位于抗体重链或轻链的C-末端或N-末端。
在另一些实施方案中，用于与式(Ⅴ)化合物中的Dl或D2偶联的修饰部分可在抗体重链或轻链的非末端位置处引入，其引入可以使用，例如，化学修饰方法。
在一些实施方案中，本发明的靶向分子是抗体或其抗原结合片段，其可包含末端修饰。末端修饰是指在抗体重链或轻链的C-末端或N-末端的修饰，例如包含连接酶识别基序的修饰。在另一些实施方案中，末端修饰可以进一步包含2-100个氨基酸的间隔子Sp2，其中抗体、Sp2和连接酶识别基序依次连接。在一优选实施方案中，Sp2是含有2-20个氨基酸的间隔子序列。在一些具体实施方案中，Sp2间隔子序列选自由以下组成的组：GA、GGGS和GGGGSGGGGS，特别是GA。
在一优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段的轻链包括3种类型：野生型(LC)；C-末端修饰的轻链(LCCT)，其通过直接引入连接酶识别基序LPXTG进行修饰；和C-末端修饰的轻链(LCCTL)，其通过引入短肽间隔子加上连接酶供体底物识别基序LPXTG进行修饰。抗体或其抗原结合片段的重链包括3种类型：野生型(HC)；C-末端修饰的重链(HCCT)，其通过直接引入连接酶识别基序LPXTG进行修饰；和C-末端修饰的重链(HCCTL)，其通过引入短肽间隔子加上连接酶供体底物识别基序LPXTG进行修饰。X可以是任何天然或非天然的单个氨基酸。当式(Ⅳ)化合物中的z为1或2时，上述重链和轻链的组合可形成8个优选的抗体分子，见氨基酸序列表。
在一些优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段的轻链包括3种类型：野生型(LC)；N-末端修饰的轻链(LCNT)，其通过直接引入连接酶识别基序GGG进行修饰；和N-末端修饰的轻链(LCNTL)，其通过引入短肽间隔子加上连接酶受体底物识别基序GGG进行修饰。抗体或其抗原结合片段的重链包括3种类型：野生型(HC)；N-末端修饰的重链(HCNT)，其通过直接引入连接酶识别基序GGG进行修饰；和N-末端修饰的重链(HCNTL)，其通过引入短肽间隔子加上连接酶受体底物识别基序GGG进行修饰。
本发明的偶联物可进一步包含负载物。所述负载物如本发明中所述。
连接子
在一些实施方案中，所述连接子，即式(III)和式(Ⅴ)中的L为式(Ⅴ)化合物：
(A1p―D1q―Y)t―Lk―(W―A2q―D2p)t (Ⅴ)
其中，
D1和D2独立地为包含连接酶受体或供体底物识别基序的部分；
A1和A2独立地代表连接至负载物的键，或包含可与负载物偶联的反应基团的部分；
Lk为化学键、L1-L2-L3或L1-L2-L3-L4或L4-L1-L2-L3或L4；
L1和L3各自独立地选自由以下基团组成的组：
-CH2-、-NH-、-(CO)-、-NH(CO)-、-(CO)NH-；C1-4亚烷基与以下基团之一的组合：-CH2-、-NH-、-(CO)-、-NH(CO)-、-(CO)NH-；
L2不存在或为C7-34亚烷基，并且其中所述亚烷基中的一个或多个(-CH2-)结构任选地被-O-代替；
L1、L2和L3各自任选且独立地被1、2或3个选自-OR1和-NR1R2的取代基取代；
R1和R2各自独立地选自由以下组成的组：氢、-C1-6烷基、-(CO)-C1-6烷基和-S(＝O)2-C1-6烷基；
L4为肽序列(酰胺键由α-氨基与羧基缩合反应形成)，其中所述肽序列含有任选衍生化的Lys(赖氨酸)(数目1-100)，或含有任选衍生化的Cys(半胱氨酸)(数目1-100)；
Y和W各自独立地不存在或选自由以下组成的组：可切割序列、间隔子Sp1及其组合；
可切割序列包含可被酶切割的氨基酸序列，并且可切割序列包含1-10个氨基酸；
Sp1选自由以下组成的组：含有1-20个氨基酸的间隔子序列、PAB及其组合；
p为0或1，q为0或1，前提是p和q不同，
t如式(Ⅲ)中所定义。
在一些实施方案中，式(Ⅴ)的连接子通过A1或A2与负载物相连，并通过D1或D2与生物分子T所包含的连接酶受体底物识别基序或连接酶供体底物识别基序的偶联作用与生物分子T相连。任选地，生物分子T中的连接酶识别基序以修饰部分的形式存在，其通过，例如，重组方法或化学修饰方法引入到生物分子中。
在一些实施方案中，式(Ⅴ)包含在系统1中的第一部分中，或包含在系统2中的第二部分中。
在一些实施方案中，L1、L2和L3独立地被1、2或3个选自-OR1和-NR1R2的取代基取代。例如，取代发生在(-CH3)、(-CH2-)或
Figure BDA0003489153680000231
结构上，特别是(-CH2-)上。
在一些实施方案中，L2为C7-34亚烷基，其中亚烷基是直链或支链亚烷基基团，任选地亚烷基中的一个或多个(-CH2-)结构可以被-O-代替，亚烷基任选地被1、2或3个选自-OR1和-NR1R2的取代基取代。在又一实施方案中，L2选自任选地被1、2或3个选自-OR1和-NR1R2的取代基取代的基团，其中所述基团如下：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、1-甲基亚乙基、2-甲基亚乙基、2-甲基亚丙基和2-乙基亚丙基。
在另一些实施方案中，L2为-(C2H4-O)i-C1-4亚烷基；i为2-10的整数。“-(C2H4-O)i-”代表PEG单元聚合形成的结构，其中i表示PEG单元的数目。在另一些实施方案中，L2为-(C2H4-O)i-C1-2亚烷基。在一些具体实施方案中，L2为-(C2H4-O)i-C2H4-。在另一些实施方案中，L2为C1-4亚烷基-(O-C2H4)i。在另一些实施方案中，L2为C1-2亚烷基-(O-C2H4)i。在一些具体实施方案中，L2为-C2H4-(O-C2H4)i-。在一些实施方案中，i选自以下值：2-10、2-8、2-6、2-4或4-6。在一具体实施方案中，i为4。
在L4的另一实施方案中，根据期望的偶联数，赖氨酸的ε-氨基可用于通过合适的双功能交联剂在A1或A2部分中引入马来酰亚胺官能团，或用于与另一个赖氨酸的α-羧基形成氨基键来形成支链，然后支链中赖氨酸的α-和ε-氨基可以通过合适的双功能交联剂引入马来酰亚胺基团。依此类推，通过增加主链和/或支链侧链中赖氨酸的数目，通过这样的L4部分引入的A1或A2部分的数目可以达到1-1000。
在L4的另一实施方案中，根据期望的偶联数，每个半胱氨酸的巯基可用于与A1或A2中的马来酰亚胺官能团反应。A1或A2由此可以连接到Lk。A1和A2各自进一步包含可与负载物偶联的反应基团。通过增加L4中的半胱氨酸的数目，例如在L4的主链和/或支链侧链中，通过这样的L4部分引入的A1或A2部分的数目可以达到1-1000。
在一些实施方案中，L4为任选衍生化的赖氨酸。
在一优选实施方案中，赖氨酸的衍生化选自由以下组成的组：1)羧基的酰胺化，所得酰胺NH2任选地被C1-6烷基取代；2)将羧基和/或氨基连接至包含1-10个氨基酸的氨基酸片段或包含1-10个核苷酸的核苷酸片段，其中所述氨基酸片段优选为Gly。
在一些实施方案中，Y和W各自独立地不存在或选自由由以下组成的组：可切割序列、间隔子Spl及其组合。在一具体实施方案中，Y不存在。在另一具体实施方案中，W不存在。在又一具体实施方案中，Y和W都不存在。在一些实施方案中，可切割序列包含可以被识别为酶底物并且可以被酶切割的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，可切割序列可以在细胞的溶酶体中被酶促切割。在另一些具体实施方案中，可切割序列可以被蛋白酶切割，特别是被组织蛋白酶切割。在又一些具体实施方案中，可切割序列可以被谷氨酰胺酶切割。在一些实施方案中，可切割序列选自由以下组成的组：组织蛋白酶限制性位点、谷氨酰胺酶限制性位点及其组合。在一些实施方案中，可切割序列选自Phe-Lys、Val-Cit、Val-Lys、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu及其组合。
在一实施方案中，Y和W各自独立地不存在或选自间隔子Spl。在另一实施方案中，Sp1为间隔子序列，其包含1-10个，优选1-6个，更优选1-4个氨基酸。在一具体实施方案中，Sp1为Leu。在另一具体实施方案中，Sp1为Gln。在一实施方案中，Sp1为PAB。在又一实施方案中，Y和W各自独立地选自由以下组成的组：Phe-Lys-PAB、Val-Cit-PAB和Val-Lys-PAB。
在一些实施方案中，Y和/或W包含的氨基酸可以是天然的或非天然的。在一些具体实施方案中，Y不存在，或者为氨基酸片段1。氨基酸片段1包含1-30个天然或非天然氨基酸，其各自独立地相同或不同。并且氨基酸片段1选自由以下组成的组：包含1-10个氨基酸的可切割序列、包含1-20个氨基酸的间隔子序列及其组合。在另一具体实施方案中，W不存在，或者为氨基酸片段2。氨基酸片段2包含1-30个天然或非天然氨基酸，其各自独立地相同或不同。并且氨基酸片段2选自由以下组成的组：包含1-10个氨基酸的可切割序列、包含1-20个氨基酸的间隔子序列及其组合。
在一些实施方案中，p＝0，q＝1，式(Ⅴ)化合物的结构如下式(Ⅴ-1)所示：
D1―Y―Lk―(W―A2)t (Ⅴ-1)；
其中，A2、D1、Y、Lk和W分别如式(Ⅴ)中所定义。
在另一些实施方案中，p＝1，q＝0，式(III)化合物的结构如下式(Ⅴ-2)所示：
(A1―Y)t―Lk―W―D2 (Ⅴ-2)；
其中，A1、D2、Y、Lk和W分别如式(Ⅴ)中所定义。
在一实施方案中，合适的连接子可以选自WO2014177042A中图13至16中任意一个连接子。在又一实施方案中，合适的连接子可选自WO2015165413A中图7至10中任意一个连接子。
在一实施方案中，合适的连接子可以选自WO2014177042A中图1至12中任意一个连接子。在又一实施方案中，合适的连接子可选自WO2015165413A中图3至6中任意一个连接子。
包含连接酶受体或供体底物识别基序的部分
在一些实施方案中，连接酶为转肽酶。在一些实施方案中，连接酶选自由以下组成的组：天然转肽酶、非天然转肽酶、以上两者的变体，及其组合。非天然转肽酶可以是，但不限于，通过工程化天然转肽酶获得的那些。
在一些优选的实施方案中，连接酶选自由以下组成的组：天然Sortase、非天然Sortase，及其组合。天然Sortase的种类包括SrtA、Srt B、SrtC、SrtD、SrtE、SrtF等(参见，例如，US20110321183A1和EP3647419A1)。连接酶的类型对应于连接酶识别基序，从而用于实现不同分子或结构片段之间的特异性偶联。
在一些实施方案中，连接酶受体底物识别基序选自由以下组成的组：寡聚甘氨酸、寡聚丙氨酸，和聚合度为3-10的寡聚甘氨酸/丙氨酸的混合物。在一些具体实施方案中，连接酶受体底物识别基序为Gn，其中G为甘氨酸(Gly)，n为3-10的整数。
在一些实施方案中，连接酶为SrtA，并且供体识别基序可以为LPXTG，其中X为任何天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，连接酶为SrtB，并且供体识别基序可以为NPXTG，其中X为任何天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，连接酶为SrtC，并且供体识别基序可以为LPXTG，其中X为任何天然或非天然氨基酸。在一些其他实施方案中，连接酶为SrtD，并且供体识别基序可以为LPXTA，其中X为是任何天然或非天然氨基酸。在又一些实施方案中，连接酶为SrtE，并且供体识别基序可以为LAXTG，其中X为任何天然或非天然氨基酸。在一些其他实施方案中，连接酶为SrtF，并且供体识别基序可以为LPXTG，其中X选自由以下组成的组：A、R、N、D、Q、I、L和K。
在另一具体实施方案中，连接酶为来源于金黄色葡萄球菌的SrtA。因此，连接酶识别基序可以为该酶的典型识别基序LPXTG。在又一具体实施方案中，连接酶供体底物识别基序为LPXTGJ，并且连接酶受体底物识别基序为Gn，其中X可为天然或非天然的任何单个氨基酸；J不存在，或者为任选标记的包含1-10个氨基酸的氨基酸片段。在一实施方案中，J不存在。在又一实施方案中，J为包含1-10个氨基酸的氨基酸片段，其中每个氨基酸独立地为任何天然或非天然氨基酸。在另一些实施方案中，J为Gm，其中m为1-10的整数。在又一具体实施方案中，连接酶供体底物识别基序为LPETG。在另一具体实施方案中，连接酶供体底物识别基序为LPETGG。在一实施方案中，连接酶为来源于金黄色葡萄球菌的SrtB并且相应的供体底物识别基序可以为NPQTN。在另一实施方案中，连接酶为来源于炭疽芽孢杆菌的SrtB并且相应的供体底物识别基序可以为NPKTG。在又一实施方案中，连接酶为来源于化脓性链球菌的SrtA并且相应的供体底物识别基序可以为LPXTGJ，其中J如上述所定义。在另一实施方案中，连接酶为来源于天蓝色链霉菌的SrtE并且相应的供体底物识别基序可以为LAXTG。在又一实施方案中，连接酶为的来源于植物乳杆菌SrtA并且相应的供体底物识别基序可以为LPQTSEQ。连接酶识别基序也可以为人工筛选优化的其他全新的转肽酶识别序列。
当LPXTGJ与Gn偶联时，LPXTGJ序列中甘氨酸的上游肽键被Sortase A切割，并且产生的中间体与Gn的游离N端连接，生成新的肽键。所得的氨基酸序列为LPXTGn。序列Gn和LPXTGJ如上述所定义。
在一些具体实施方案中，连接酶为来源于金黄色葡萄球菌的SrtA，供体识别基序为LPETGG，受体识别基序为GGG。
包含反应基团的部分
在一些实施方案中，式(Ⅴ)中的A1和A2各自独立地选自由以下组成的组：氨基化合物、马来酰亚胺及其衍生物、巯基化合物、吡啶巯基化合物(pyridyldithiol)、卤代乙酸(haloacetylic acid)、异氰酸酯(isocyanate)。在另一些实施方案中，A1和A2中的反应基团各自独立地选自由以下组成的组：氨基、马来酰亚胺基、巯基、吡啶巯基(pyridyldithio)、卤代乙酰基(haloacetyl)和异氰酸酯基(isocyanate)。
在一些实施方案中，根据其中反应基团的结构，A1和A2可以各自独立地通过二硫键、硫醚键、硫酯键，或氨基甲酸酯键与迈克尔受体(迈克尔加成的受体分子)共价偶联。在一具体实施方案中，A1和A2各自独立地选自任选衍生化的半胱氨酸。
在另一些具体实施方案中，A1和A2各自独立地选自任选衍生化的半胱氨酸。在一些优选实施方案中，半胱氨酸的衍生化选自由以下组成的组：1)羧基的酰胺化，所得的酰胺NH2任选地被C1-6烷基基团取代；2)氨基的酰化；和3)将羧基和/或氨基连接至包含1-10个氨基酸的氨基酸片段或包含1-10个核苷酸的核苷酸片段，其中所述氨基酸片段优选为Gly。在一具体实施方案中，半胱氨酸的衍生化是指半胱氨酸的羧基的酰胺化或与甘氨酸连接。
在一些实施方案中，A2为
Figure BDA0003489153680000251
其中x选自由以下组成的组：氢、OH、NH2、包含1-10个氨基酸的氨基酸片段，和包含1-10个核苷酸的核苷酸片段。在一些实施方案中，A1为/>
Figure BDA0003489153680000261
其中x选自由以下组成的组：氢、包含1-10个氨基酸的氨基酸片段和包含1-10个核苷酸的核苷酸片段。在一些实施方案中，氨基的酰化是指半胱氨酸的氨基被C1-6烷基羰基取代。/>
在一些实施方案中，(V-1)的连接单元中的t为1，D1为Gn，A2为
Figure BDA0003489153680000262
式(V-1)化合物的结构如下式(V-1-1)所示：
Figure BDA0003489153680000263
其中n为3-10的整数；
x选自由以下组成的组：氢、OH、NH2、包含1-10个氨基酸的氨基酸片段、包含1-10个核苷酸的核苷酸片段；
Lk为L1-L2-L3；
L1、L2、L3、t、Y和W分别如式(V)中所定义。
在一些优选实施方案中，在式(V-1-1)中，x选自OH、NH 2和Gly。
在一些具体实施方案中，在式(V-1-1)中，Y和W都不存在，Lk为L1-L2-L3，L1为-NH-，L3为-(CO)-，L2为-(C2H4-O)i-C2H4-，i＝4，式(V-1-1)化合物的结构如下式(V-1-1-1)所示：
Figure BDA0003489153680000264
在一些具体实施方案中，在式(V-1-1)中，W不存在，Y为L，L为亮氨酸(Leu)，Lk为L1-L2-L3，L1为-NH-，L3为-(CO)-，L2为-(C2H4-O)i-C2H4-，i＝4，连接单元的结构如下(V-1-1-2)：
Figure BDA0003489153680000265
在又一些具体实施方案中，在式(V-1-1)中，W不存在，Y为Q，Q为谷氨酰胺(Gln)，Lk为L1-L2-L3，L1为-NH-，L3为-(CO)-，L2为-(C2H4-O)i-C2H4-，i＝4，连接单元的结构如下(V-1-1-3)：
Figure BDA0003489153680000271
在一些具体实施方案中，在式(V-1-1)中，Y和W都不存在，Lk是L1-L2-L3，L1为-NH-，L3为-(CO)-，L2为-C5H10-，连接单元的结构如下(V-1-1-4)：
Figure BDA0003489153680000272
在又一些具体实施方案中，在式(V-1-1)中，Y和W都不存在，Lk是L1-L2-L3，L1为-NH-，L3为-(CO)-，L2为被一个-NR1R2基团取代的-C5H10-基团，R1为氢，R2为-(CO)CH3，连接单元的结构如下(V-1-1-5)：
Figure BDA0003489153680000273
在式(V-2)连接单元的一些实施方案中，当t为1，D2为LPXTG且A1为
Figure BDA0003489153680000274
时，化合物式(V-2)的结构如下式(V-2-1)所示：
Figure BDA0003489153680000275
其中x选自：氢、包含1-10个氨基酸的氨基酸片段、包含1-10个核苷酸的核苷酸片段；
Lk为L1-L2-L3；
L1、L2、L3、Y和W分别如式(V)中所定义。
在一实施方案中，x为氢。
在一些实施方案中，A1和A2各自独立地为马来酰亚胺官能团。通过合适的双官能交联剂，将马来酰亚胺官能团引入式(Ⅴ)分子中。
在一些优选实施方案中，用于引入马来酰亚胺官能团的双功能交联剂包括但不限于N-琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate，SMCC)、SMCC的“长链”类似物N-[α-马来酰亚胺基乙酰氧基]琥珀酰亚胺酯(N-[alpha-maleimidoacetoxy]succinimide ester，AMAS)、N-γ-马来酰亚胺丁酰基-氧基琥珀酰亚胺酯(N-gamma-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester，GMBS)、3-马来酰亚胺苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(3-MaleiMidobenzoic acid N-hydroxysucciniMide ester，MBS)、6-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(6-maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester，EMCS)、N-琥珀酰亚胺4-(4-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(N-succinimidyl 4-(4-maleimidophenyl)butyrate，SMPB)、琥珀酰亚胺6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(Succinimidyl 6-[(beta-maleimidopropionamido)hexanoate，SMPH)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate)，LC-SMCC)、N-琥珀酰亚胺基11-(马来酰亚胺基)十一烷酸酯(N-succinimidyl 11-(maleimido)undecanoate，KMUS)，和包含N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇醇)n(N-hydroxy succinimide-(polyethyleneglycol alcohol)n，SM(PEG)n)的双功能交联剂，其中n表示有2、4、6、8、12或24个聚乙二醇(PEG)单元。在与双功能交联剂反应后立即引入到A1或A2的马来酰亚胺官能团的实例如下表所列：
Figure BDA0003489153680000281
在一些实施方案中，A1和A2各自独立地选自mc和mcc。
在式(Ⅴ-1)连接子的一些实施方案中，其中t为1，D1为Gn，G为甘氨酸，A2为mcc，W不存在，Lk为L4，L4为任选衍生化的赖氨酸，式(Ⅴ-1)化合物的结构如下式(Ⅴ-1-2)所示：
Figure BDA0003489153680000291
其中n为3-10的整数；
x选自由以下组成的组：氢、OH、NH2、包含1-10个氨基酸的氨基酸片段、包含1-10个核苷酸的核苷酸片段；
Y如式(Ⅴ)中所定义。
在一具体实施方案中，在式(Ⅴ-1-2)中，Y不存在，n＝3，x为OH，连接子的结构如下(连接子LU104)：
Figure BDA0003489153680000292
负载物
在本发明中，负载物可选自由以下组成的组：氢、小分子化合物(例如，抑制剂和毒素(如细胞毒素))、聚糖、PEG部分、放射性核素、细胞因子、免疫调节剂、核酸和类似物(例如，干扰RNA)、示踪分子(例如，荧光团和荧光分子)、多肽(例如，蛋白标签、生物活性肽、蛋白毒素和酶)、肽模拟物、抗体和抗体片段。
在一些实施方案中，负载物选自由以下组成的组：小分子化合物、免疫调节剂、核酸和类似物、示踪分子、放射性核素、肽模拟物、聚糖和PEG部分。
在一些实施方案中，负载物选自由以下组成的组：生物活性肽、细胞因子、抗体、抗体片段和蛋白受体。
在一些实施方案中，负载物选自由以下组成的组：小分子化合物、核酸分子和示踪分子。在一些优选实施方案中，负载物选自小分子化合物。在更优选的实施方案中，负载物选自由以下组成的组：细胞毒素及其片段。在一些实施方案例中，负载物为一种或多种放射性核素。在另一些实施方案中，负载物为一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，负载物为一种或多种免疫调节剂。
在一些实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：靶向微管细胞骨架的药物。在一些优实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：紫杉烷类、美登素类、奥瑞他汀类、埃博霉素类(epothilones)、考布他汀A-4磷酸酯(combretastatin A-4phosphate)、考布他汀A-4及其衍生物、吲哚-磺胺类、长春碱类如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)，长春甘酯(vinglycinate)，脱水长春碱(anhy-drovinblastine)，多拉司他汀(dolastatin)10和类似物，软海绵素(halichondrin)B和艾日布林(eribulin)，吲哚-3-草酰胺类，鬼臼毒素，7-二乙氨基-3(2’-苯并噁唑基)-香豆素(DBC)，蒂克霉素(discodermolide)，莱利霉素(laulimalide)。在另一些实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：DNA拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱类及其衍生物、米托蒽醌(mitoxantrone)、米托胍腙(mitoguazone)。在一些优选实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧化氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、蛋氨氮芥(phenamet)、胆固醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard)。在另一些优选的实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：亚硝基脲类(nitrosoureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素、福莫特罗(formoterol)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)。在一些实施方案中，细胞毒素选自由氮丙啶类(aziridines)组成的组。在一些优选实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedepa)和乌瑞替哌(uredepa)。在一些实施方案中，细胞毒素选自由抗肿瘤抗生素类组成的组。在一些优选实施方案中，细胞毒素选自由烯二炔抗生素类组成的组。在一些更优选实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：达内霉素、埃斯培拉霉素、新制癌菌素和阿克拉霉素(aclacinomycin)。在另一些优选实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(antramycin)、博来霉素类(bleomycins)、放线菌素C、卡拉比星(carabicin)、去甲柔红霉素(carminomycin)和嗜癌霉素(cardinophyllin)、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、阿霉素(adriamycin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌罗霉素(puromycin)、铁阿霉素(ferric adriamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(rufocromomycin)、链佐星(streptozocin)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)。在又一优选实施方案中，细胞毒素选自单端孢霉烯类(trichothecene)组成的组。在一些更优选实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(bacillocporin)A和安归啶(anguidine)。在一些实施方案中，细胞毒素是抗肿瘤氨基酸衍生物。在一些优选实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：乌苯美司(ubenimex)、偶氮丝氨酸(azaserine)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)。在另一些实施方案中，细胞毒素选自叶酸类似物组成的组。在一些优选实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：二甲基叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙(trimetrexate)和依达曲沙(edatrexate)。在一些实施方案中，细胞毒素选自嘌呤类似物组成的组。在一些优选实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤。在又一实施方案中，细胞毒素选自嘧啶类似物。在一些优选实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：安西他滨(ancitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、依诺他滨(enocitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、氟尿苷。在一些实施方案中，细胞毒素选自雄激素类。在一些优选的实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯。在另一些实施方案中，细胞毒素选自抗肾上腺素组成的组。在一些优选的实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)。在一些实施方案中，细胞毒素选自抗雄激素类。在一些优选实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、醋酸亮丙瑞林(leuprorelin acetate)和戈舍瑞林(goserelin)。在又一实施方案中，细胞毒素选自由蛋白激酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂组成的组。在一些具体实施方案中，细胞毒素选自由以下组成的组：长春碱类、秋水仙碱类、紫杉烷类、奥瑞他汀类和美登素类。在一些具体实施方案中，细胞毒素是奥瑞他汀类，如MMAE(monomethylauristatin E，单甲基奥瑞他汀E)、MMAF(monomethyl auristatin F，单甲基奥瑞他汀F)、MMAD(monomethyl auristatin D，单甲基奥瑞他汀D)等等。单甲基奥瑞他汀化合物的合成和结构如US20060229253中所述，其全部公开内容援引加入本文。
负载物含有反应基团，其可以与式(Ⅴ)化合物中的反应基团反应，从而使负载物与式(Ⅴ)化合物共价偶联。不含有反应基团的化合物需要适当的衍生化以得到负载物。在一些实施方案中，负载物中的反应基团是马来酰亚胺(maleimide)，或不含马来酰亚胺的化合物可以进行合适的反应以得到马来酰亚胺衍生物。例如，MMAF衍生得到mc-MMAF(mc是马来酰亚胺基己酰)。MMAE衍生化得到mc-Val-Cit-PAB-MMAE。上述结构中的mc可以被mcc(4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carbonyl)，4-(马来酰亚胺基甲基)环己基-1-羰基)或马来酰亚胺-R结构代替，其中R是C1-20亚烷基，任选地，亚烷基中的一个或多个(-CH2-)结构可以被-O-代替。
在一些实施方案中，步骤(a)包含：通过使式(V)的连接子与负载物反应来获得系统2。优选地，式(Ⅴ)化合物通过A1或A2部分包含的反应基团各自独立地共价连接至负载物中包含的另一个反应基团，形成式(IV)的连接子-负载物中间体。
A1或A2部分包含的反应基团如上所述。
在一些具体实施方案中，式(Ⅴ)化合物与负载物之间形成的共价键是选自由以下组成的组中的一个或多个：酰胺键、二硫键、硫醚键、硫酯键、肽键、腙键、酯键、醚键和氨基甲酸酯键。
在一些实施方案中，式(Ⅴ)化合物中A1或A2中的反应基团为马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物，负载物中的另一个反应基团为迈克尔受体。并且在与负载物反应后，马来酰亚胺或马来酰亚胺衍生物转变为琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺衍生物。
在一些实施方案中，p＝0，q＝1，式(IV)的中间体如下式(IV-1)所示：
D1―Y―Lk―(W―A2―P)t (Ⅳ-1)。
在另一些实施方案中，p＝1，q＝0，式(IV)化合物的结构如下式(IV-2)所示：
(P―A1―Y)t―Lk―W―D2 (Ⅳ-2)。
在一些实施方案中，包含琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺衍生物的式(IV)的连接子-负载物中间体可以进行开环反应，以获得“开环”中间体。开环反应可以通过类似于WO2015165413A中描述的方法进行。开环中间体也包括在式(Ⅳ)的范围内。
在一些实施方案中，式(IV)的连接子-负载物中间体中的琥珀酰亚胺的开环反应形成如下式(IV-1-2)所示的开环中间体。式(Ⅳ-1-2)落入式(Ⅳ-1)的范围。
D1―Y―Lk―(W―A2open―P)t (Ⅳ-1-2)。
在另一些实施方案中，琥珀酰亚胺环的开环反应在式(IV)的连接子-负载物中间体中形成如下式(IV-2-2)所示的开环中间体。式(Ⅳ-2-2)落入式(Ⅳ-2)的范围。
(P―A1open―Y)t―Lk―W―D2(Ⅳ-2-2)；
其中，“―A1open―”和“―A2open―”的结构选自
Figure BDA0003489153680000321
连接子-负载物中间体的具体实施方案
在一些实施方案中，A1和A2各自独立地选自mc和mcc，其中含有的马来酰亚胺官能团与负载物(P)中的巯基相连，从而连接子和负载物通过硫代琥珀酰亚胺结构(硫代琥珀酰亚胺连接，thiosuccinimide linkage)相互连接。硫代琥珀酰亚胺连接中的琥珀酰亚胺环可进行上述开环反应，得到开环的硫代琥珀酰亚胺结构
Figure BDA0003489153680000322
在一些实施方案中，L的结构如式(V-1-1)中所定义，式(IV-1)的连接子-负载物中间体具有式(IV-1-1)的结构。式(IV-1-1)的连接子-负载物中间体可以通过式(V-1-1)的相应连接子与负载物(P)反应制备。
在一些具体实施方案中，式(IV-1)中，D1为Gn，G为甘氨酸，A2为
Figure BDA0003489153680000323
在一些实施Lk为L4，L4为任选衍生化的赖氨酸。在一些实施方案中，式(IV-2)中D2为Gn，G为甘氨酸。在一些实施方案中，连接子-负载物中间体的具有如下式(Ⅳ-1-1)所示的结构：
Figure BDA0003489153680000324
在一些优选实施方案中，式(Ⅳ-1-1)中，Y和W均不存在，负载物为mc(开环)-Toxin，连接子-负载物中间体具有如下式(Ⅳ-1-2-1)或式(Ⅳ-1-2’-1)所示的结构：
Figure BDA0003489153680000331
其中Toxin代表式(III)中所定义的细胞毒素；n、Lk和x分别如式(Ⅳ-1-1)中所定义。
在一些更优选实施方案中，式(Ⅳ-1-2-1)和式(Ⅳ-1-2’-1)中，细胞毒素为MMAF，即，负载物为mc(开环)-MMAF，连接子-负载物中间体具有如下式(Ⅳ-1-3)或式(Ⅳ-1-3’)所示的结构：
Figure BDA0003489153680000332
/>
Figure BDA0003489153680000341
式(Ⅳ-1-3)和(Ⅳ-1-3’)是异构体，其中：
T、n、Lk和x分别如式(Ⅳ-1-1)中所定义。
在另一些具体实施方案中，式(Ⅳ-1-3)和(Ⅳ-1-3’)中，Lk为L1-L2-L3，L1为-NH-，L3为-(CO)-，L2为-(C2H4-O)i-C2H4-，i＝4，连接子-负载物中间体具有如下式(Ⅳ-1-4)和(Ⅳ-1-4’)所示的结构：
Figure BDA0003489153680000342
式(Ⅳ-1-4)和(Ⅳ-1-4’)是异构体，其中：
n和x分别如式(Ⅳ-1-1)中所定义。
在一些具体实施方案中，式(Ⅳ-1)中，W不存在，t为1，负载物为Toxin，A2为mcc，Lk为L4，L4为任选衍生化的赖氨酸，D1为Gn，G为甘氨酸，连接体-负载物中间体的具有如下式(Ⅳ-1-5-1)所示的结构：
Figure BDA0003489153680000351
其中Toxin、n、Y和x如上所定义。
在一些实施方案中，连接子-负载物中间体具有如下式(IV-1-5)或(IV-1-5’)所示的结构：
Figure BDA0003489153680000352
其中Toxin、n、Y和x如上所定义。
式(Ⅳ-1-5)和(Ⅳ-1-5’)的连接子-负载物中间体可以通过式(Ⅳ-1-5-1)的开环反应制备。
在一些优选实施方案中，Toxin为美登素，优选DM1。
在一些具体实施方案中，在式(Ⅳ-1-5)和(Ⅳ-1-5’)中，细胞毒素为DM1，Y不存在，连接子-负载物中间体具有如下式(Ⅳ-1-6)或(Ⅳ-1-6’)所示的结构。式(Ⅳ-1-6)落入式(Ⅳ-1-5)的范围，式(Ⅳ-1-6’)落入式(Ⅳ-1-5’)的范围。
Figure BDA0003489153680000361
其中n和x如上所定义。
偶联物的具体实施方案
在一些实施方案中，t为1，并且偶联物具有选自以下式(1)、(2)、(2’)、(3)、(3’)、(4)、(4’)、(5)、(5’)、(6)、(6’)的结构。
在一些实施方案中，L―P的结构如式(V-1-1)中所定义，式(III)的偶联物具有式(1)的结构。式(1)的偶联物可以通过式(V-1-1)的相应连接子-负载物中间体与生物分子(T)的偶联反应制备。
Figure BDA0003489153680000371
其中n为3-10的整数；
x为OH、NH2或Gly；
Lk为L1-L2-L3；
T、Payload和z分别如式(Ⅲ)中所定义；L1、L2、L3、Y和W分别如式(Ⅴ)中所定义。
在一些实施方案中，L―P的结构如式(IV-1-2-1)或(IV-1-2’-1)中所定义，并且式(III)的偶联物具有选自以下式(2)和(2’)的结构。在一些具体实施方案中，L―P的结构如式(Ⅳ-1-3)或(Ⅳ-1-3’)中所定义，式(Ⅲ)的偶联物具有选自下式(3)和(3’)的结构。在一些更具体的实施方案中，L―P的结构如式(Ⅳ-1-4)或(Ⅳ-1-4’)中所定义，式(Ⅲ)的偶联物具有选自下式(4)和(4’)的结构。式(4)落入式(3)的范围，式(3)落入式(2)的范围，式(2)落入式(1)的范围。式(4’)落入式(3’)的范围，式(3’)落入式(2’)的范围，式(2’)落入式(1)的范围。
在一些优选实施方案中，Y和W都不存在，式(1)中的负载物为mc(开环)-毒素，偶联物的结构如下式(2)或式(2’)所示：
Figure BDA0003489153680000372
/>
Figure BDA0003489153680000381
其中Toxin代表式(III)中所定义的细胞毒素；T、n、Lk、x和z分别如式(1)中所定义。
在一些更优选的实施方案中，式(2)和式(2’)中的细胞毒素为MMAF，即，负载物为mc(开环)-MMAF，偶联物的结构如下所示式(3)或式(3’)所示：
Figure BDA0003489153680000382
/>
式(3)和(3’)是异构体，其中：
T、n、Lk、x和z分别如式(1)中所定义。
在另一些具体实施方案中，Lk为L1-L2-L3，L1为-NH-，并且L3为-(CO)-，L2为-(C2H4-O)i-C2H4-，i＝4。偶联物的结构如下式(4)和(4’)所示：
Figure BDA0003489153680000391
式(4)和(4’)是异构体，其中：
T、n、x和z分别如式(1)中所定义。
在一些具体实施方案中，靶向分子为抗体帕妥珠单抗、hrS7或MAAA1181a。
在一些实施方案中，t为1，L―P的结构如式(IV-1-5)或(IV-1-5’)中所定义，式(III)的偶联物具有选自下式(5)和(5’)的结构。(5)或(5’)的偶联物可以通过式(Ⅳ-1-5)或(Ⅳ-1-5’)的相应连接子-负载物中间体与生物分子(T)的偶联反应制备。在一些具体实施方案中，式(III)的偶联物具有选自下式(6)和(6’)的结构。(6)或(6’)的偶联物可以通过式(Ⅳ-1-6)或(Ⅳ-1-6’)的相应连接子-负载物中间体与生物分子(T)的偶联反应制备。式(6)落入式(5)的范围，式(6’)落入式(5’)的范围。
Figure BDA0003489153680000401
在一些具体实施方案中，Y不存在。偶联物的结构如下式(6)和(6’)所示
Figure BDA0003489153680000411
式(6)和(6’)是异构体。在一些实施方案中，T为抗人HER2抗体。在另一些实施方案中，T为修饰的曲妥珠单抗。
本发明的方法的具体实施方案
本发明的方法与本领域常规化学偶联方法的不同之处在于偶联步骤通过连接酶以位点特异性方式催化，其中连接酶特异性识别待偶联部分上的识别基序。而在常规化学偶联反应中，期望在偶联反应之前纯化待偶联的部分以避免非特异性偶联产生的不期望的副产物。
因此，在一方面，本发明的方法不需要在偶联步骤之前纯化待偶联的部分，从而减少总体操作时间和步骤，同时增加最终产率。相应地，在一些实施方案中，步骤(a)中的系统1和/或系统2进一步包含一种或多种杂质。
在另一方面，所述方法特别有利于包含化学不稳定分子，如生物分子(如蛋白)的偶联物。在一些具体方面，所述方法适用于制备生物偶联物，其中第一部分和第二部分中的至少一个包含生物分子。
通常，生产生物分子的方法涉及细胞培养方法，例如，使用哺乳动物或细菌宿主细胞系来生产目标蛋白，如抗体或抗体片段。在大多数情况下，所得到的收集物经过澄清以除去细胞和细胞碎片，获得收获的澄清细胞培养液(HCCF)，其含有杂质，如宿主细胞蛋白(HCP)、培养基成分和核酸。在基于常规化学偶联的方法中，HCCF进一步经过一系列纯化步骤以获得用于下游偶联反应的高纯度生物分子。在某些其他情况下，收获的收集物经过提取、澄清、浓缩以沉淀目标蛋白，然后重新溶解沉淀物，然后进行纯化。由于本发明的方法中的连接酶可以特异性催化第一部分和第二部分之间的偶联，因此系统1和/或系统2中的杂质几乎不会影响步骤(b)中的偶联效率和/或特异性，系统1和系统2的高纯度不再是步骤(b)的先决条件。在一些实施方案中，步骤(a)的系统1和系统2中的至少一个是收获的澄清细胞培养液(HCCF)。HCCF可以从组织培养物、哺乳动物细胞培养物、酵母细胞培养物、细菌细胞培养物、噬菌体培养物等中获得。在一些实施方案中，也可以使用除HCCF之外的其他样品。
在另一优选方面，本发明的方法可以与生物分子的生产过程灵活整合以获得包含该生物分子的生物偶联物。例如，所述方法可以很容易地与单克隆抗体或抗体片段的生产过程整合，以生产包含单克隆抗体或抗体片段的生物偶联物。生物偶联物可以通过相同的制造设施进行制造，其与所包含的生物分子的产品周期相同，具有相似的总产率，同时原有生产设施和管道可以在很大程度上保持不变。
在另一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤
(1)在步骤(b)之前将步骤(a)中的系统1进行，和/或
(2)在步骤(b)之前将步骤(a)中的系统2进行，和/或
(3)将步骤(b)中获得的偶联物进行
一个或多个层析步骤处理以除去一种或多种杂质。
层析步骤可以独立地选自由以下组成的组：亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、混合模式层析、羟基磷灰石层析及其组合。离子交换层析可选自由以下组成的组：阴离子交换层析、阳离子交换层析、混合模式离子交换层析及其组合。在一些优选实施方案中，离子交换层析是阴离子交换层析和阳离子交换层析的组合。在一些实施方案中，步骤(3)中的层析步骤也称为精纯步骤。精纯步骤可以包含亲和层析、疏水相互作用层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、混合模式层析和羟基磷灰石层析。
在一些实施方案中，第一部分和第二部分中的至少一个包含抗体或抗体片段，并且步骤(1)-(3)中的至少一个包含亲和层析。抗体可以是常规抗体、重组抗体、多特异性抗体、全人源抗体、非人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体或纳米抗体。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)，或其任何活性衍生物。抗体片段可以是Fv片段、scFv片段、dsFv片段、scdsFv片段、Fd片段、Fab片段、scFab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fc片段或双抗(diabody)。根据抗体或抗体片段的性质，亲和层析可以是蛋白A亲和层析、蛋白G亲和层析、蛋白L亲和层析(如CaptoTML亲和层析)、KappaSelect亲和层析、LamdaFabSelect亲和层析或MabselectTM亲和层析。在一些实施方案中，第一部分和第二部分中的至少一个包含Fc片段，并且亲和层析是蛋白A亲和层析。在一些实施方案中，第一部分包含Fc片段。优选地，Fc片段是IgG型抗体的Fc片段，如选自于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些具体实施方案中，T是抗体，亲和层析是蛋白A亲和层析。本领域技术人员能够根据待偶联部分的性质选择合适的亲和层析方法。
在一些优选实施方案中，步骤(1)、(2)和(3)中的层析步骤选自亲和层析、离子交换层析及其组合。
在一些实施方案中，步骤(1)和(2)不存在；步骤(3)为亲和层析和离子交换层析的组合(工艺流程1)。在另一些实施方案中，步骤(1)和步骤(2)中的至少一个包含亲和层析，并且步骤(3)包含离子交换层析(工艺流程2)。在又一些实施方案中，步骤(1)和步骤(2)中的至少一个包含亲和层析，并且步骤(3)包含亲和层析和离子交换层析的组合(工艺流程3)。在又一些实施方案中，步骤(1)和步骤(2)中的至少一个包含亲和层析和/或离子交换层析，并且步骤(3)包含亲和层析、疏水相互作用层析和离子交换层析的组合(工艺流程4)。
在一些具体实施方案中，步骤(1)和(2)不存在；步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3a-1)：蛋白A亲和层析；
(3a-2)：阴离子交换层析；和
(3a-3)：阳离子交换层析。
在另一些具体实施方案中，步骤(1)和(2)中的至少一个包含蛋白A亲和层析，并且步骤(3)包含任何顺序的以下步骤：
(3b-1)：阴离子交换层析；和
(3b-2)：阳离子交换层析。
在又一些具体实施方案中，步骤(1)和(2)中的至少一个包括蛋白A亲和层析，并且步骤(3)包含任何顺序的以下步骤：
(3c-1)：蛋白A亲和层析；
(3c-2)：阴离子交换层析；和
(3c-3)：阳离子交换层析。
在一些具体实施方案中，第一部分和/或第二部分包含Fc片段，步骤(1)和(2)不存在，并且步骤(3)包含任何顺序的以下步骤：
(3a-1)：蛋白A亲和层析；
(3a-2)：阴离子交换层析；和
(3a-3)：阳离子交换层析。
在另一些具体实施方案中，第一部分包含Fc片段，步骤(1)包含蛋白A亲和层析，步骤(3)包括任何顺序的以下步骤：
(3b-1)：阴离子交换层析；和
(3b-2)：阳离子交换层析。
在又一些具体实施方案中，第一部分包含Fc片段，步骤(1)包含蛋白A亲和层析，步骤(3)包含任何顺序的以下步骤：
(3c-1)：蛋白A亲和层析；
(3c-2)：阴离子交换层析；和
(3c-3)：阳离子交换层析。
在又一些具体实施方案中，第二部分包含Fc片段，步骤(2)包含蛋白A亲和层析，步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3b-1)：阴离子交换层析；和
(3b-2)：阳离子交换层析。
在又一些具体实施方案中，第二部分包含Fc片段，步骤(2)包含蛋白A亲和层析，步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3c-1)：蛋白A亲和层析；
(3c-2)：阴离子交换层析；和
(3c-3)：阳离子交换层析。
在又一些具体实施例中，步骤(1)或步骤(2)包含蛋白A亲和层析和阴离子交换层析，步骤(3)包括任何顺序的以下步骤：
(3d-1)：蛋白A亲和层析；
(3d-2)：阳离子交换层析；和
(3d-3)：疏水相互作用层析。
在一些实施方案中，亲和层析以结合-洗脱模式进行。在另一些实施方案中，离子交换层析以结合-洗脱(bind-and-elute)模式或流穿(flow-through)模式进行。
在一些优选实施方案中，阴离子交换层析以流穿模式进行。在一些实施方案中，流穿纯化方法步骤中获得的样品连续流入下一方法步骤。在另一些优选实施方案中，阳离子交换层析以结合-洗脱模式进行。在一些实施方案中，结合-洗脱纯化方法步骤中获得的样品连续流入下一方法步骤。
在一些实施方案中，步骤(b)以分批模式、半连续模式或连续模式进行。在另一些实施方案中，步骤(a)、(b)和(1)至(3)中的至少一个以半连续模式或连续模式进行；优选地，步骤(a)、(b)和(1)至(3)以连续模式进行。
在一些具体实施方案中，本发明的方法以连续模式进行；所述方法包括：
(a’)：提供流体中的系统1；并提供流体中的系统2；
(b’)：将系统1和/或系统2独立地进行层析步骤以获得系统1的洗脱物和/或系统2的洗脱物，其中系统1的洗脱物和/或系统2的洗脱物具有降低的杂质水平；
(c’)：将步骤(a’)或(b’)中的系统1和系统2混合形成反应流体，并将连接酶单元应用到所述反应流体中以催化T与式(Ⅳ)的连接子-负载物中间体的偶联反应，从而得到粗偶联物混合物，其中所述粗偶联物混合物包含目标偶联物和一种或多种杂质；
(d’)：将步骤(c’)的粗偶联物混合物进行层析步骤以除去杂质，得到具有期望纯度的目标偶联物；
其中
将步骤(a’)至(d’)连接以保持流体相互连通，从而使样品可以从一个方法步骤连续流动到下一个方法步骤。
本发明的方法可适合于制备特定偶联物，例如，通过进一步包括选自由以下组成的额外步骤：发酵、澄清、层析、pH调节、病毒灭活、病毒过滤、超滤、渗滤、无菌过滤、制剂及其组合。本领域技术人员将能够组合所述额外步骤与本发明的方法，以及安排用于制备特定偶联物的步骤顺序。
在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括病毒灭活、病毒过滤、UF/DF和/或制剂的步骤。在一些实施方案中，病毒灭活通过低pH处理完成，例如，在蛋白A亲和层析之后。病毒过滤可以在偶联步骤，即步骤(b)之后或之前进行。优选地，病毒过滤在至少一个层析步骤之后进行。在一些实施方案中，病毒过滤在偶联步骤之后进行，例如，在精纯步骤之后(例如，ADC工艺流程1-3)。在一些其他实施方案中，病毒过滤在偶联步骤之前进行，例如，在离子交换层析之后(例如，ADC工艺流程4)。在一些实施方案中，在偶联步骤之后和步骤(3)之前进行UF/DF(例如，ADC工艺流程3-4)。
在一些具体实施方案中，步骤(1)或步骤(2)包括蛋白A亲和层析，在偶联步骤之后和步骤(3)之前进行UF/DF，其中步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3e-1)：阴离子交换层析；和
(3e-2)：阳离子交换层析。
在另一些具体实施方案中，步骤(1)或步骤(2)包括蛋白A亲和层析和阴离子交换层析，在偶联步骤之后和步骤(3)之前进行UF/DF，其中步骤(3)包含阳离子交换层析或疏水相互作用层析。
在一些具体实施方案中，偶联物为ADC，所述方法如图15所示，包括ADC工艺流程1、ADC工艺流程2、ADC工艺流程3和ADC工艺流程4。与常规ADC工艺流程相比，本发明的方法涉及更少的步骤，从而减少所述方法的操作时间、材料和空间。此外，在常规ADC工艺流程中，偶联通常在病毒过滤后进行；而在本发明的方法中，偶联可以在病毒过滤之前(工艺流程1-3)或之后(工艺流程4)进行，提供更大的生产灵活性。
在一些实施方案中，本发明提供一种连接酶融合蛋白(本发明所述的连接酶融合蛋白)，其包含连接酶和Halo标签。例如，本发明提供
1.1.本发明所述的连接酶融合蛋白，其中所述连接酶为转肽酶，优选sortase。
1.2.本发明所述的连接酶融合蛋白，其中所述连接酶为sortase A。
1.3.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述连接酶为sortase，优选sortase A；和/或连接酶供体底物识别基序为LPXTGJ；优选LPXTG或LPETGG；和/或连接酶受体底物识别基序为Gn，其中G为甘氨酸(Gly)，n为3-10的整数；X为任何天然或非天然氨基酸；J不存在，或为包含1-10个氨基酸的氨基酸片段，其中每个氨基酸独立地为任何天然或非天然氨基酸；优选地，J不存在或为Gm，其中m为1-10的整数。
1.4.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述连接酶能够催化包含连接酶供体底物识别基序(例如包含末端序列LPXTG或LPXTGG，其中X为任何天然氨基酸)的第一部分和包含连接酶受体底物识别基序(例如，包含末端多聚甘氨酸序列，例如GGG)的第二部分之间的偶联，产生第一部分和第二部分的偶联物。
1.5.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述连接酶包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO:1-26中的任一个；
b.SEQ ID NO:1-26中的任一个，其中在位点34、100、105和136处的氨基酸残基任选地分别被Ser、Asn、Ala和Thr(即[Ser34][Asn100][Ala105][Thr136]，SNAT)，Tyr、Asn、Ala和Thr(即[Tyr34][Asn100][Ala105][Thr136]，YNAT)，Trp、Asn、Asp和Thr(即[Trp34][Asn100][Asp105][Thr136]，WNDT)或Val、Asn、Asn和Ser(即[Val34][Asn100][Asn105][Ser136]，VNNS)取代；例如，其中所述连接酶包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列(即SEQ IDNO:1的SNAT对应物)；和
c.具有sortase活性并且与(a)或(b)中任一项具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
1.6.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述Halo标签为多肽，其催化卤素从卤代烷基部分脱离，并与脱卤烷基部分形成共价键。
1.7.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述Halo标签来源于细菌卤代烷烃脱卤酶，其催化卤素从卤代烷基部分脱离，并与脱卤烷基部分形成共价键，并且发生突变以防止所形成的共价键水解，例如，来源于自养黄杆菌或玫瑰红红球菌的卤代烷烃脱卤酶，其中参与水解的残基发生突变，例如，其中对应于玫瑰红红球菌脱卤酶的氨基酸残基272位点处的组氨酸残基发生突变。
1.8.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述Halo标签包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；或具有脱卤酶活性并且与SEQ ID NO:28具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
1.9.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述连接酶具有约7.5至约10.0的等电点(pI)；所述Halo标签具有约4.5至约5.0的等电点，并且所述连接酶融合蛋白的等电点(pI)比所述连接酶的等电点(pI)低约2.0至约4.5个pH单位。
1.10.任何前述连接酶融合蛋白，其包含SEQ ID NO:29的序列；或具有脱卤酶活性、sortase活性并且与SEQ ID NO:29具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在另一些实施方案中，本发明提供一种固定化连接酶(本发明所述的固定化连接酶)，其包含通过Halo标签连接到支持物的连接酶，例如，其中所述固定化连接酶通过包含连接酶和Halo标签的连接酶融合蛋白(例如，任何本发明所述的连接酶融合蛋白)与表面包含卤代烷基连接子(优选氯代烷基连接子)的支持物反应固定化，使得所述连接酶融合蛋白通过卤代烷基连接子和Halo标签共价相互作用固定到支持物上；例如，
1.1.本发明所述的固定化连接酶，其中所述固定化连接酶通过包含连接酶和Halo标签的连接酶融合蛋白与包含卤代烷基连接子的支持物的反应固定化，其中所述连接酶融合蛋白是任何本发明所述的连接酶融合蛋白。
1.2.任何前述固定化连接酶，其中所述固定化连接酶通过包含连接酶和Halo标签的连接酶融合蛋白与包含卤代烷基连接子的支持物反应固定化，其中所述卤代烷基连接子由具有式(I-1-1)或(Ⅰ-1)结构的卤代烷基底物生成：
Figure BDA0003489153680000461
其中u为1-20的整数，v为0-20的整数，并且w为1-19的整数。
1.3.任何前述固定化连接酶，其中所述连接酶通过包含连接酶和Halo标签的连接酶融合蛋白与包含卤代烷基连接子的支持物反应固定化，例如，其中所述支持物具有式(II-1)或(Ⅱ)结构：
Figure BDA0003489153680000462
其中
Figure BDA0003489153680000463
为支持物，例如选自树脂、珠、膜、凝胶、基质、薄膜、板、孔、管、载玻片或表面，优选树脂，更优选琼脂糖树脂、有机硅树脂、聚甲基丙烯酸甲酯树脂或纤维素树脂，最优选高度交联的琼脂糖树脂；并且
其中u为1-20的整数，v为0-20的整数，并且w为1-19的整数。
[注意，为清楚起见，仅对单个氯代烷基-连接子部分连接到支持物上进行描述，但应理解，会有许多这样的氯代烷基-连接子部分连接到支持物上。]
1.4.任何前述固定化连接酶，其具有以下结构：
Support----Linker----HaloTag----Ligase
其中
Support为支持物(如固体支持物)，例如选自树脂、珠、膜、凝胶、基质、薄膜、板、孔、管、载玻片或表面，优选树脂，更优选琼脂糖树脂、有机硅树脂、聚甲基丙烯酸甲酯树脂或纤维素树脂，最优选高度交联的琼脂糖树脂；
Linker为与支持物共价结合的连接子部分，例如包含10至60个碳原子的链，任选地包含一个或多个醚、酯、氨基甲酸酯和/或酰胺键，例如，式(II-1’)或(Ⅱ’)的连接子部分
Figure BDA0003489153680000471
其中u为1-20的整数，v为0-20的整数，并且w为1-19的整数；
HaloTag为Halo标签(卤代烷烃脱卤酶多肽)，与连接子共价结合；
Ligase为连接酶多肽；
其中一个或多个“----Linker----HaloTag----Ligase”部分结合到相同的支持物上。
1.5.任何前述固定化连接酶，其中所述连接酶为sortase，优选sortase A；和/或连接酶供体底物识别基序为LPXTGJ；优选LPXTG或LPETGG；和/或连接酶受体底物识别基序为Gn，其中G为甘氨酸(Gly)，n为3-10的整数；X为任何天然或非天然氨基酸；J不存在，或为包含1-10个氨基酸的氨基酸片段，其中每个氨基酸独立地为任何天然或非天然氨基酸；优选地，J不存在或为Gm，其中m为1-10的整数。
1.6.任何前述固定化连接酶，其中所述连接酶能够催化包含连接酶供体底物识别基序(例如，包含末端序列LPXTG或LPXTGG，其中X为任何天然氨基酸)的第一部分与包含连接酶受体底物识别基序(例如，包含末端多聚甘氨酸序列，例如GGG)的第二部分之间的偶联，产生所述第一部分和第二部分的偶联物。
1.7.任何前述固定化连接酶，其中所述连接酶包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO:1-26中的任一个；
b.SEQ ID NO:1-26中的任一个，其中在位点34、100、105和136处的氨基酸残基任选地分别被Ser、Asn、Ala和Thr(即[Ser34][Asn100][Ala105][Thr136]，SNAT)，Tyr、Asn、Ala和Thr(即[Tyr34][Asn100][Ala105][Thr136]，YNAT)，Trp、Asn、Asp和Thr(即[Trp34][Asn100][Asp105][Thr136]，WNDT)或Val、Asn、Asn和Ser(即[Val34][Asn100][Asn105][Ser136]，VNNS)取代；例如，其中连接酶包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列(即SEQ ID NO:1的SNAT对应物)；和
c.具有sortase活性并且与(a)或(b)中任一项具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
1.8.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述Halo标签为多肽，其催化卤素从卤代烷基部分脱离，并与脱卤烷基部分形成共价键。
1.9.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述Halo标签来源于细菌卤代烷烃脱卤酶，其催化卤素从卤代烷基部分脱离，并与脱卤烷基部分形成共价键，并且发生突变以防止所形成的共价键水解，例如，来源于自养黄杆菌或玫瑰红红球菌的卤代烷烃脱卤酶，其中参与水解的残基发生突变，例如，其中对应于玫瑰红红球菌脱卤酶的氨基酸残基272位点处的组氨酸残基发生突变。
1.10.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述Halo标签包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；或具有脱卤酶活性并且与SEQ ID NO:28具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
1.11.任何前述连接酶融合蛋白，其中所述连接酶具有约7.5至约10.0的等电点(pI)；所述Halo标签具有约4.5至约5.0的等电点，并且所述连接酶融合蛋白的等电点(pI)比所述连接酶的等电点(pI)低约2.0至约4.5个pH单位。
1.12.任何前述连接酶融合蛋白，其包含SEQ ID NO:29的序列；或具有脱卤酶活性、sortase活性并且与SEQ ID NO:29具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
1.13.任何前述固定化连接酶，其包含SEQ ID NO:29的序列；或具有脱卤酶活性、sortase活性并且与SEQ ID NO:29具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，并通过连接子结合到支持物。
在另一些实施方案中，本发明提供一种用于制备包含第一部分和第二部分的偶联物(例如，药物-抗体偶联物)的方法(本发明所述的方法)，其中所述第一部分和第二部分中的一个包含连接酶供体底物识别基序，并且所述第一部分和第二部分中的另一个包含连接酶受体底物识别基序，所述方法包括在连接酶单元的存在下使第一部分与第二部分接触，其中所述连接酶单元为固定化连接酶或者包含连接酶和Halo标签的连接酶融合蛋白；例如，
1.1.本发明所述的方法，其中所述连接酶单元为固定化连接酶，其包含通过Halo标签连接到支持物的连接酶，例如，其中所述固定化连接酶为任何本发明所述的固定化连接酶。
1.2.本发明所述的方法，其中所述连接酶单元为任何本发明所述的连接酶融合蛋白。
1.3.任何前述方法包括以下步骤：
(a)提供包含第一部分的系统1和提供包含第二部分的系统2；和
(b)使步骤(a)中的系统1和系统2与连接酶单元接触，催化第一部分和第二部分之间的偶联反应以获得偶联物；
其中所述第一部分和第二部分各自独立地包含生物分子、蛋白、抗体、抗体片段、受体、信号转导因子、细胞生长因子、核酸或核酸类似物、小分子化合物、聚糖、PEG部分、放射性核素、细胞因子、免疫调节剂、示踪分子、荧光团、荧光分子、肽、多肽或肽模拟物；并且
其中所述第一部分和第二部分中的一个进一步包含连接酶供体底物识别基序，并且所述第一部分和第二部分中的另一个包含连接酶受体底物识别基序，从而所述连接酶单元将催化连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序之间的偶联；
例如，其中步骤(b)以分批模式、半连续模式或连续模式进行。
1.4.前述方法进一步包括以下步骤
(1)在步骤(b)之前将步骤(a)中的系统1进行，和/或
(2)在步骤(b)之前将步骤(a)中的系统2进行，和/或
(3)将步骤(b)中获得的偶联物进行，
一个或多个层析步骤处理以除去一种或多种杂质；
例如，其中层析步骤独立地选自亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析及其组合；其中离子交换层析选自阴离子交换层析、阳离子交换层析及其组合；
优选地，所述层析步骤选自亲和层析、离子交换层析及其组合；
例如，其中步骤(a)、(b)和(1)-(3)中的至少一个以半连续模式或连续模式进行；例如，其中，步骤(a)、(b)和(1)-(3)以连续模式进行；
例如，其中第一部分和第二部分中的至少一个包含抗体或抗体片段，并且步骤(1)-(3)中的至少一个包含亲和层析；例如，其中抗体或抗体片段包含Fc片段，并且亲和层析是蛋白A亲和层析；
例如，其中第一部分或第二部分包含Fc片段，
步骤(1)和(2)不存在，并且步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3a-1)：蛋白A亲和层析；
(3a-2)：阴离子交换层析；和
(3a-3)：阳离子交换层析；
或者
步骤(1)或步骤(2)包含蛋白A亲和层析，并且步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3b-1)：阴离子交换层析；和
(3b-2)：阳离子交换层析；
或者
步骤(1)或步骤(2)包含蛋白A亲和层析，并且步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3c-1)：蛋白A亲和层析；
(3c-2)：阴离子交换层析；和
(3c-3)：阳离子交换层析；
或者
步骤(1)或步骤(2)包含蛋白A亲和层析和阴离子交换层析，并且步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3d-1)：蛋白A亲和层析；
(3d-2)：阳离子交换层析；和
(3d-3)：疏水相互作用层析；
例如，其中亲和层析以结合-洗脱模式进行；和/或离子交换层析以结合-洗脱模式或流穿模式进行；例如，其中，阴离子交换层析以流穿模式进行；和/或阳离子交换层析以结合-洗脱模式进行。
1.5.任何前述方法，其中所述第一部分和第二部分之间的反应中存在一种或多种杂质。
1.6.任何前述方法，其中所述第一部分或第二部分包含在收获的澄清细胞培养液(HCCF)中。
1.7.任何前述方法，其中所述连接酶单元为连接酶融合蛋白，其包含连接酶和Halo标签，进一步包括使连接酶单元与包含卤代烷基连接子的支持物反应的步骤以及，在第一部分和第二部分之间的反应基本完成后，除去所形成的固定化连接酶，例如，本发明所述的任何固定化连接酶。
1.8.任何前述方法，其中所述连接酶单元为固定化连接酶，例如，任何本发明所述的固定化连接酶，进一步包括在第一部分和第二部分之间的反应基本完成后除去固定化连接酶。
1.9.任何前述方法，其中所述偶联物具有式(III)的结构，所述第一部分包含T，所述第二部分包含式(IV)的连接子-负载物中间体：
Figure BDA0003489153680000491
其中
T包含生物分子，其任选地修饰为具有连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的一个；
L包含连接子，其包含连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的另一个；
P包含负载物；
z为1-20的整数；
t为1-20的整数。
1.10.前述方法，其中
T包含蛋白、肽、抗体、抗体片段、受体、信号转导因子、细胞生长因子和核酸或类似物；和/或
P包含氢、小分子化合物(优选毒素)、聚糖、PEG部分、放射性核素、细胞因子、免疫调节剂、核酸或类似物、示踪分子、荧光团、荧光分子、肽、多肽、肽模拟物、抗体、抗体片段或蛋白。
1.11.任何前述方法，其中所述连接酶为sortase，优选sortase A；和/或连接酶供体底物识别基序为LPXTGJ；优选LPXTG或LPETGG；和/或连接酶受体底物识别基序为Gn，其中G为甘氨酸(Gly)，n为3-10的整数；
X为任何天然或非天然氨基酸；
J不存在，或者为包含1-10个氨基酸的氨基酸片段，其中每个氨基酸独立地为任何天然或非天然氨基酸；优选地，J不存在或为Gm，其中m为1-10的整数。
有益效果
在一方面，本发明提供一种连接酶融合蛋白，其具有以下有利特征中的至少一个：
(1)所述连接酶融合蛋白具有高表达性和溶解性，从而降低酶纯化的成本；
(2)所述连接酶融合蛋白易于大量纯化，具有高纯度和活性，特别适合工业化应用；和
(3)所述连接酶融合蛋白易于在生理条件下固定，不仅有利于连接酶的储存和运输，而且有助于保持最大的酶活性和增加生产可扩展性。
在另一方面，本发明提供一种固定化连接酶，其包含所述连接酶融合蛋白。所述固定化连接酶具有以下有利特征中的至少一个：
(1)高稳定性；
(2)高的可重复使用性，反应完成后，固定化连接酶可以很容易地从反应体系中回收和分离，同时酶促活性基本不受影响；
(3)良好的耐碱性，使固定化连接酶的碱清洗成为可能；和
(4)高酶载量，高酶活性，因此，与游离连接酶相比，所述固定化连接酶可以在密闭空间内催化高浓度酶活性的偶联反应，从而节省工作、储存空间和试剂成本。
因此，本发明的固定化连接酶可控、可重复使用、成本效益且易于扩大规模，因此特别有利于工业应用。
在一些具体方面，与连接酶融合蛋白来源的连接酶相比，所述连接酶融合蛋白具有改变的等电点，从而允许从最终偶联物产物中有效的除去残留的酶污染物。这样的特征对于有效亲和纯化不包含亲和部分的偶联物尤其重要。例如，对于pI为约8至约9的偶联物，可以使用pI为约5至约6的连接酶融合蛋白，并且偶联物和连接酶融合蛋白可以通过阴离子交换层析分离，其中连接酶融合蛋白与层析介质结合，而偶联物流穿；或通过阳离子交换层析分离，其中偶联物与层析介质结合，而连接酶融合蛋白流穿。更重要地，由于连接酶融合蛋白的pI改变，可能存在的痕量游离酶(例如，非特异性吸附在支持物上的酶可能会在催化过程中脱落)可以容易地除去。
在另一方面，本发明提供使用本发明的连接酶融合蛋白或固定化连接酶制备偶联物的方法。
用于制备含有蛋白部分的偶联物的常规方法包括至少两组纯化过程：偶联步骤前蛋白的上游和下游纯化，以及偶联步骤后偶联产物的下游纯化，每组包括几个层析步骤。对于ADC(抗体-药物偶联物)的制备，目前主流的偶联技术是基于化学的，其中药物通过连接子与抗体中的赖氨酸或半胱氨酸残基化学偶联。在偶联步骤之前，通过上游和下游过程制备高纯度抗体，因为纯度较低的抗体会导致不可预测的结果，如抗体进料中含有杂质时，负载物和赖氨酸/半胱氨酸偶联反应可导致产生副产物。抗体进料中的杂质降低偶联步骤的产率，从而对方法过程的生产率造成压力，导致需要增加投入，进而加重整个方法过程的复杂性。在偶联步骤之后，需要另一个下游纯化过程来除去ADC中的聚集体、溶剂、副产物和杂质。常规方法中的双下游步骤显著增加成本和时间，同时降低产率。此外，出于安全原因，偶联反应必须在化学隔离器中进行，使得该方法过程难以扩大规模。总体而言，常规方法涉及多个上游和下游纯化步骤，耗时、不经济、不灵活且缺乏可扩展性。
本发明的方法实现以下技术效果中的至少一种：
(1)由于连接酶的底物特异性，所述方法可以在没有预先从原材料中对待偶联部分进行纯化工序的情况下进行，从而导致总体操作时间和步骤减少，成本降低(例如，纯水或注射用水、各种缓冲液试剂、层析介质等等)，产率提高；
(2)所述方法可以灵活地与待偶联抗体等生物分子部分的偶联工序整合，即目标偶联物可以由其中包含生物分子部分的同一生产设施，在同一产品周期中生产，具有相似的总产率，而原有生产设施和管道可以在很大程度上保持不变；
(3)所述方法可以很容易地扩大规模以满足工业需求，特别是当使用固定化连接酶时；
(4)实现过程中产品质量分析的简化；
(5)实现对上游催化反应中的杂质如过量的反应物和残留酶污染物的有效除去；和
(6)实现时空经济性的提高等。
除了上述优点之外，与常规方法相比，本发明的方法在制备生物偶联物方面至少有以下特别的优点：
(1)聚集物(如抗体和ADC聚集物)的形成最少，从而提高最终产率，同时减少除去聚集物的工作量；和
(2)生物偶联物上的DAR比和偶联位点可以很容易地控制，从而产生具有更高同质性和明确物理化学特性的生物偶联物。
实施例
为了更清楚地说明本发明的目的和技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例并非旨在限制本发明的范围。以下实施例中未提及的具体实验方法均按照常规实验方法进行。
仪器、材料和试剂
除非另有说明，所述仪器和试剂可商购或可根据本领域的常规方法制备。
MabSelect Sure ProA从GE获得；Q Sepharose FF/Capto S ImpAct从GE获得。用于抗体表达的CHO细胞从Thermo Fisher Scientific获得。pcDNA3.3从Life Technology获得。
HIC-HPLC：Butyl-HIC；流动相A：25mM PB，2M(NH4)2SO4，pH 7.0；流动相B：25mM PB，pH 7.0；流速：0.8ml/min；采集时间：25分钟；进样量：20μg；柱温：25℃；检测波长：280nm；样品室温度：8℃。
通用方法
抗体生产的通用方法
抗体制备的方法可参见如US20170112944A1，其全部内容援引加入本文。简言之，将编码抗人HER2抗体曲妥珠单抗的质粒构建体转染到CHO细胞中，其中抗体轻链的C末端通过包含供体识别基序LPETGG进行修饰以获得抗体T-LCCTL-HC。从转染的CHO细胞中筛选出高表达的细胞群，其参照曲妥珠单抗的培养方法在5-10升反应器中进行培养。将细胞培养物离心以获得收获的澄清细胞培养液(HCCF)。
HCCF可用作用于偶联反应的抗体进料(工艺流程1)或进一步经过下游处理中以提供用于偶联反应的纯化抗体(工艺流程2和3)。
抗体纯化的通用方法
抗体纯化的方法可参见如US20170112944A1，其全部内容援引加入本文。简言之，T-LCCTL-HC的纯化采用标准方法，其使用蛋白A亲和层析(MabSelect Sure ProA)和Sepharose S阳离子交换层析的组合，纯化的产物溶解在原始的曲妥珠单抗药物缓冲液中(5mM组氨酸-HCl、2％海藻糖、0.009％聚山梨醇酯20，pH 6.0)。
连接子-负载物中间体制备的通用方法
生产连接子-负载物中间体的方法可参见如US20170112944A1，其全部内容援引加入本文。简言之，方法如下：
将具有式(Ⅴ-1-2)结构的连接子溶液与负载物溶液一起孵育，形成具有式(Ⅳ-1-5-1)的连接子-负载物中间体，其进一步开环反应得到具有式(Ⅳ-1-5)或(Ⅳ-1-5’)结构的开环连接子-负载物中间体。在实施例中，负载物为DM1，连接子-负载物中间体具有式(Ⅳ-1-6)或(Ⅳ-1-6’)的结构。开环连接子-负载物中间体通过HPLC进行纯化和分析。
偶联反应的通用方法
使用从蛋白A亲和层析纯化的抗体生产ADC的方法可参见如US20170112944A1，其全部内容援引加入本文。简要地，方法如下：
如上所述，分别制备含有具有式(Ⅳ-1-6)或(Ⅳ-1-6’)结构的连接子-负载物中间体(0.1-50mg/ml)和抗体T-LCCTL-HC(1-100mg/ml)的缓冲液。
将固定化Halo-Sortase按所需的量填充到容器中。用20mM Tris-HCl、1-3M NaCl(pH 6.0-10.0)、0.1-1.0M NaOH处理固定化Halo-Sortase。将固定化Halo-Sortase在空气浴或水浴中在10-40℃预热约30分钟或以上。将抗体溶液和连接子-负载物中间体溶液按照既定的比例(抗体：连接子-负载物中间体＝1:1-1:100)混合，得到混合物，然后将混合物加入含有处理过的固定化Halo-Sortase的容器中(下拉(pull-down)模式)或Halo-Sortase柱中(流穿模式)。启动偶联反应。反应时间为5分钟到24小时。
偶联反应完成后，收集反应溶液或固定化Halo-Sortase柱的流穿液，得到包含目标偶联物的粗偶联物混合物，目标偶联物具有式(6)或(6’)的结构。将粗偶联物混合物经过HIC-HPLC分析ADC的DAR以确定反应的偶联效率。
蛋白A亲和层析的通用方法
用20mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5平衡柱，并装入粗偶联物混合物。继续用20mMTris、150mM NaCl、pH 7.5冲洗，直到达到期望的偏移量(基线)。任选地，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 5.0洗去杂质(洗涤步骤)。用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 3.3-3.7洗脱期望的ADC。收集含有期望ADC的洗脱物。使用1M Tris-HCl，pH 9.0将洗脱物的pH调节至pH 5.0-6.0。使用ELISA分析或qPCR分析洗脱物中的残留杂质，如HCP、DNA和蛋白A。
阴离子交换层析的通用方法
用Q Sepharose FF介质填充层析柱。用20-100mM Tris-HCl pH 6.5-8.0平衡柱，并装入收集来自蛋白A亲和层析的合并洗脱物。收集含有目标ADC的流穿液。继续用20mMTris-HCl pH 6.5-8.0冲洗，直到达到期望的偏移量(基线)。使用20-100mM Tris-HCl、1MNaCl pH 6.5-8.0重新生成层析柱。使用1M NaOH原位清洁(CIP)30分钟。分析洗脱物中的残留杂质，如HCP、DNA和蛋白A。
阳离子交换层析的通用方法
用Capto S ImpAct介质填充柱。用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 5.0-6.0平衡柱，并装入蛋白A亲和层析的洗脱物。继续用pH 5.0-6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冲洗，直到达到期望的偏移量(基线)。用柠檬酸盐-柠檬酸钠缓冲液、100-500mM NaCl、pH 5.0-6.0洗脱目标ADC。收集含有目标ADC的洗脱物。用柠檬酸盐-柠檬酸钠缓冲液、1M NaCl、pH 6.0再生层析柱。使用1M NaOH原位清洁(CIP)30分钟。分析洗脱物中的残留杂质，如HCP、DNA和蛋白A。
实施例1：连接酶融合蛋白的制备
1.1SrtAs的克隆和纯化
编码SrtA(具有选自SEQ ID NO:1-26的氨基酸序列的SrtA及其变体([Ser34][Asn100][Ala105][Thr136]，SNAT；[Tyr34][Asn100][Ala105][Thr136]，YNAT；[Trp34][Asn100][Asp105][Thr136]，WNDT；[Val34][Asn100][Asn105][Ser136]，VNNS)的核酸通过基因合成标准方法和Gibson组装技术亚克隆到pET-21a(+)表达载体中的NdeI和EcoRI处。并且将His6标签插入到SrtA开放阅读框的N末端。
将SrtA表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。在LB中加入50μg/ml氨苄青霉素37℃培养至OD600＝0.5-0.8，加入IPTG至终浓度为0.2mM，25℃诱导sortase表达12小时。离心收集目标细胞并重新悬浮在裂解缓冲液(50mM Tris pH 8.0，300mM NaCl)中，然后进行超声裂解，并按照制造商的说明在Ni-NTA琼脂糖上纯化上清液。通过SDS-PAGE判断sortase的纯度>90％。SrtA的浓度使用消光系数方法测量A280计算得出。
1.2Sortase活性评价
使用荧光分光光度法测量实施例1.1中制备的重组SrtA的sortase活性。于37℃，通过加入0.625μM纯化的SrtA(或变体)启动在96孔板中的反应(总体积100μL、0.085mMAbz-LPETGK-Dnp、18mM三甘氨酸的缓冲液A(缓冲液A：5mM CaCl2、150mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH 7.5)。Abz-LPETGK-Dnp是一种内部淬灭肽，以2-氨基苯并咪唑(Abz)作为荧光团和2,4-二硝基苯基(Dnp)作为淬灭剂。Sortase切割肽LPETGK，Dnp和Abz分离，Abz的荧光信号可被检测到，用于指示sortase的活性。1小时后连续收集荧光信号的增加(λexc/λem＝320nm/420nm，增益＝85，Biotek Cytation3酶标仪)。
示例性例SrtA来源于华氏葡萄球菌(SEQ ID NO:3)的SrtA及其变体([Ser34][Asn100][Ala105][Thr136]，SNAT)的活性以条形图显示(图1)。结果表明，SNAT变体SrtA的活性比其野生型SrtA(SEQ ID No:3)高约1倍，而两者均具有sortase活性。1.3本发明的连接酶融合蛋白(Halo-Sortase)的克隆
将编码本发明连接酶融合蛋白(Halo-Sortase)的核酸克隆到细菌表达载体pET21a或pET24d中，连接酶融合蛋白各自包含SrtA(具有选自SEQ ID NO:1-26的氨基酸序列的SrtA及其变体([Ser34][Asn100][Ala105][Thr136]，SNAT；[Tyr34][Asn100][Ala105][Thr136]，YNAT；[Trp34][Asn100][Asp105][Thr136]，WNDT；[Val34][Asn100][Asn105][Ser136]，VNNS))和具有SEQ ID NO:28氨基酸序列的Halo标签。
具有SEQ ID NO:29氨基酸序列的Halo-Sortase用于以下实施例，该Halo-Sortase包含来源于金黄色葡萄球菌的SrtA变体(SEQ ID NO:27)和Halo标签(SEQ ID NO:28)。1.4Halo-Sortase的纯化
Halo-Sortase在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，纯化并储存在-80℃，5％-10％的甘油中。带有His6标签的His-Sortase和带有GB1标签的GB1-Sortase以类似的方式制备以进行比较。
1.5Halo-Sortase的活性
方法：
(1)将纯化的抗体T-LCCTL-HC与具有式(Ⅳ-1-6)或(Ⅳ-1-6’)结构的连接子-负载物中间体在偶联缓冲液中以最佳摩尔比(Ab:连接子-负载物中间体＝1:1-1:100)混合。
(2)将实施例1.4制备的Halo-Sortase、His-Sortase或GB1-Sortase分别与步骤(1)的混合物在4-40℃下孵育0.5-20小时。
(3)将步骤(2)所得产物保存在4℃或-80℃。
(4)将产物进行12％SDS-PAGE电泳以确定偶联效率。
结果如图2所示，Halo-Sortase、GB1-Sortase和His-Sortase的偶联效率大于90％。
实施例2：固定化Halo-Sortase的制备
2.1氯代烷基-连接子修饰的树脂(Chloro Resin)的制备
制备氯树脂的方法参见，例如，美国专利号7,429,472、7,888,086和8,202,700，其全部内容援引加入本文。用于制备氯树脂的树脂见表2。
表2
Figure BDA0003489153680000541
方法：
(1)预处理
对于NHS活化树脂(Bestchrom)和CNBr活化树脂(Bestchrom)：
用异丙醇过滤树脂，滤饼用DMF洗涤一次，然后抽吸干。用DMF将滤饼转移到烧瓶中并搅拌。接着，向混合物中加入乙二胺，并搅拌10到15小时。过滤并用DMF洗涤滤饼。然后沥干液体。
对于环氧活化树脂：
用异丙醇过滤树脂，滤饼用H2O洗涤一次，然后抽吸干。将滤饼转移到烧瓶中并搅拌。接着，向混合物中加入25％～28％的浓氨水，将体系缓慢加热至40-50℃，并在40-50℃搅拌下反应。将体系温度降至20-30℃，过滤混合物。用H2O洗涤滤饼直至滤液pH达到约7-8。接着，用DMF洗涤滤饼并沥干液体。
(2)将步骤(1)的滤饼转移到烧瓶中并搅拌。接着，将含有上述式(I-1-1)结构的氯代烷基底物的DMF和三乙胺依次加入体系中。搅拌反应。接着，过滤系统并用DMF洗涤滤饼，最后沥干液体。
(3)将步骤(2)的滤饼转移到烧瓶中。打开搅拌。接着，向混合物中依次加入Ac2O和三乙胺。搅拌反应。然后，过滤混合物并用DMF洗涤滤饼。然后用H2O洗涤滤饼并沥干液体。最后，用20％乙醇将混合物转移到容器中进行储存。
结果：得到具有式(II-1)结构的氯树脂：
Figure BDA0003489153680000551
其中
Figure BDA0003489153680000552
为高度交联的琼脂糖树脂或聚甲基丙烯酸甲酯树脂。
2.2Halo-Sortase在氯树脂上的固定化
方法：
(1)将实施例1.4制备的纯化Halo-Sortase和实施例2.1制备的氯树脂在室温下孵育10分钟-24小时；
(2)用20mM Tris-HCl、150mM NaCl(pH 6.0-10.0)洗涤树脂3次；
(3)测定固定化Halo-Sortase的酶活性；
(4)任选地，用固定化Halo-Sortase填充柱子，得到Halo-Sortase柱；
(5)将步骤(3)中的固定化Halo-Sortase或步骤(4)中的Halo-Sortase柱用20mMTris-HCl、1-3M NaCl(pH 6.0-10.0)、0.1-1.0M NaOH洗涤并保存在4℃。
实施例3：氯树脂的表征
方法：
(1)取每种待测氯树脂250μl，加入过量Halo-Sortase，将试管置于转子上，室温孵育2小时；
(2)在固定化反应的不同时间点(分别为15分钟、30分钟、1小时和2小时)，将试管于室温以3000g离心3分钟，每种氯树脂取一滴上清液，并用Nanodrop分光光度计测定上清液中Halo-Sortase的浓度；
(3)计算每个时间点Halo-Sortase的浓度，再将其从Halo-Sortase的初始浓度中减去，得到各时间点固定化Halo-Sortase的量，将固定在氯树脂上的Halo-Sortase量作为偶联时间的函数，绘制出曲线。
结果显示在图3中：固定在氯树脂上的Halo-Sortase的量在时间点2小时达到平台期，显示每种氯树脂的最大载量。
实施例4：固定化Halo-Sortase的表征
方法：
(1)如实施例2.2中所述，将固定量的Halo-sortase固定在氯树脂上。
(2)用5-10倍树脂体积的1×储存缓冲液洗涤固定化酶3次，每次以3000g室温离心3分钟，使固定化酶树脂沉淀；在偶联缓冲液中重新悬浮固定化酶。
(3)取每种固定化酶树脂25μl，加入200μl包含供体识别基序LPETGG的GFP蛋白和含有连接子-负载物中间体(包含与小分子化合物偶联的受体识别基序GGG)的小分子反应缓冲液，开始偶联反应。
(4)在偶联反应的不同时间点(分别为15分钟、30分钟、1小时和2小时)，取上清液样品进行HIC-HPLC分析。
(5)通过HIC-HPLC确定偶联效率。结果如图4所示(偶联活性表示为随时间推移的DAR)。
实施例5：Halo-Sortase低温催化的ADC产物的溶解性
方法：
(1)使用重组sortase蛋白GB1-Sortase、His-Sortase或Halo-Sortase按照“通用方法”中所述的方法制备ADC样品。
(2)将ADC样品在冰上静置10分钟。
(3)将ADC样品以12000g离心5分钟，并将上清液转移到新的试管中。
(4)在步骤(3)的沉淀中加入20μl 1×SDS上样缓冲液以溶解沉淀，取5μl上样。
(5)将所有样品95℃煮10min，用12％SDS-PAGE凝胶进行上样分析。
结果如图5所示：当置于冰上时，大部分GB1-Sortase催化的ADC沉淀，而Halo-Sortase或His-Sortase催化的ADC没有沉淀。结果表明，与GB1-Sortase催化的ADC相比，Halo-Sortase或His-Sortase催化的ADC在寒冷条件下更稳定，并且可能在具有较长保持时间的偶联过程(这对于生物偶联物的生产很常见)中存活。因此，His-Sortase和Halo-Sortase在产物溶解性方面优于GB1-Sortase。
实施例6：Halo-Sortase和ADC的分离
6.1使用阴离子交换层析(AEX)分离Halo-Sortase和ADC
方法：
(1)用Q Sepharose FF介质填充柱。
(2)用20mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡柱并上样(A：ADC；B：Halo-Sortase；和C：ADC和Halo-Sortase的混合物(ADC:Halo-Sortase的质量比分别为约100:1)。
(3)用20mM Tris-HCl(pH 7.5)冲洗柱，直到基线、洗脱液pH和电导率稳定。
(4)用20mM Tris-HCl，1M NaCl(pH 7.5)重新生成柱。
(5)使用1M NaOH进行原位清洗(CIP)。
结果如图6所示：在pH 7.5时，ADC通过Q FF层析柱(流穿[FT]模式)，这与常规ADC&Ab纯化方法一致；Halo-Sortase与Q FF层析柱结合(结合/洗脱[B/E]模式)并被20mM Tris-HCl、1M NaCl pH 7.5洗脱；对于ADC和Halo-Sortase的混合物，ADC通过Q FF柱，而Halo-Sortase结合Q FF柱，两者分离良好。
6.2使用阳离子交换层析(CEX)分离Halo-Sortase和ADC
方法：
(1)用Capto S ImpAct介质填充柱。
(2)用20mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH 6.2)平衡柱并上样(分别为A：ADC；和B：Halo-Sortase；C：ADC和Halo-Sortase的混合物)。
(3)用20mM柠檬酸/柠檬酸钠(pH 6.2)平衡柱，直到基线、洗脱液pH和电导率稳定。
(4)用20mM柠檬酸/柠檬酸钠、160mM NaCl、pH 6.2洗脱样品。
(5)用20mM柠檬酸/柠檬酸钠、1M NaCl、pH 6.2重新生成柱，并用1M NaOH进行原位清洗(CIP)。
结果如图7所示：在pH 6.2时，ADC结合Capto S ImpAct柱(结合/洗脱[B/E]模式)；在pH 7.5时，Halo-Sortase流过Capto S ImpAct层析柱(流穿[FT]模式)；对于ADC和Halo-Sortase的混合物，ADC与Capto S ImpAct柱结合，而Halo-Sortase则通过，两者分离良好。
6.3从反应产物中除去His6-Sortase或Halo-Sortase的比较
His6-Sortase和Halo-Sortase的等电点以及用于分离His6-Sortase或Halo-Sortase与反应产物ADC的层析模式(AEX和CEX)如表3所示。His6-Sortase具有8.92的等电点，接近ADC的等电点(8-9)。His6-Sortase和ADC都与CEX中的阳离子交换剂结合，并且都通过AEX中的阴离子交换剂，因此很难将两者分开。Halo-Sortase的等电点为5.7。Halo-Sortase和ADC可以使用AEX或CEX轻松分离。
表3
His6-Sortase Halo-Sortase ADC
等电点 8.92 5.70 8-9
AEX上的模式 流穿 结合-洗脱 流穿
CEX上的模式 结合-洗脱 流穿 结合-洗脱
实施例7：使用通过蛋白A亲和层析纯化的抗体制备ADC(工艺流程2)
7.1偶联反应
根据“通用方法”中所述的方法，使用从HCCF的蛋白A亲和层析获得的单克隆抗体(mAb)(即，蛋白A亲和层析的mAb洗脱物)制备目标ADC。抗体进料中HCP的含量为1000至2000ppm。用于偶联反应的容器是实施例2.2中制备的Halo-Sortase柱。收集作为Halo-Sortase柱的流穿液的粗偶联物混合物。根据HIC-HPLC分析(见图10)，所制备的ADC的DAR为1.83。偶联效率为91.6％(表4)。
表4
Figure BDA0003489153680000571
7.2杂质的除去
将7.1中收集的粗偶联物混合物依次进行AEX和CEX；并收集每个步骤中含有目标ADC的样品(分别为AEX的ADC流穿液和CEX的ADC洗脱物)。用ELISA和qPCR分析蛋白A亲和层析的mAb洗脱物、AEX的ADC流穿液和CEX的ADC洗脱物，以确定残留杂质的量。
AEX层析后观察到HCP含量大约减少一个对数(90％)。经过一系列层析纯化后，HCP、DNA和蛋白A水平均降至1ppm以下(见图9)。
实施例8：使用从HCCF获得的抗体制备ADC(工艺流程1)
8.1偶联反应
根据“通用方法”中所述的方法制备目标ADC，使用HCCF作为抗体进料。在抗体进料中CHO HCP的含量为100000至1000000ppm。
用于偶联反应的容器是实施例2.2中制备的Halo-Sortase柱。收集作为Halo-Sortase柱的流穿液的粗偶联物混合物。根据HIC-HPLC分析(见图11)，制备的ADC的DAR为1.81，偶联效率为90.5％(见表5)。
表5
Figure BDA0003489153680000581
8.2杂质的检测和去除
将8.1中收集的粗制偶联物混合物依次进行蛋白A亲和层析、AEX和CEX；收集每个步骤中含有ADC的溶液(分别为蛋白A亲和层析的ADC洗脱物、AEX的ADC流穿液和CEX的ADC洗脱物)，并用ELISA和qPCR分析以确定残留杂质的量。
AEX层析后，观察到HCP含量减少了大约80％，DNA含量减少了大约三个对数(99.9％)。在CEX层析后，观察到HCP含量减少了大约93％。经过一系列层析纯化后，DNA和蛋白A的含量水平降低到5ppm以下，HCP的水平降低到40ppm以下(见图11)。
本发明的工艺流程适用于ADC的快速制备，特别是小规模的，例如在实验室中，或用于如生物活性研究目的ADC的高通量制备。
实施例9：使用通过蛋白A亲和层析纯化的抗体制备ADC(工艺流程3)
9.1偶联反应
根据“通用方法”中所述的方法，使用从HCCF的蛋白A亲和层析获得的单克隆抗体(即，蛋白A亲和层析的mAb洗脱物)制备目标ADC。用于偶联反应的容器是实施例2.2中制备的Halo-Sortase柱。收集作为Halo-Sortase柱的流穿液的粗偶联物混合物。
9.2杂质的除去
以类似于8.2的方式，将9.1中收集的粗偶联物混合物依次进行蛋白A亲和层析、AEX和CEX。使用ELISA和qPCR分析蛋白A亲和层析的mAb洗脱物、蛋白A亲和层析的ADC洗脱物、AEX的ADC流穿液和CEX的ADC洗脱物，以确定残留杂质的量。结果表明，经过一系列层析纯化后，HCP和蛋白A的水平降低到2ppm以下(见图12)。因此，采用两个蛋白A亲和层析步骤不会影响产物在可能浸出蛋白A方面的质量。第二个蛋白A亲和层析步骤的洗脱物中杂质含量低，表明这个方法可以耐受更高浓度/更高复杂性的上样样品。因此，本实施例可以理解为纯化过程的概念验证，比实施例7和实施例8描述的方法更为复杂。
9.3除去残留的酶污染物(即偶联后从Halo-Sortase柱上脱落的酶)
如实施例9.1中所述，收集作为Halo-Sortase柱的流穿液的粗偶联物混合物，然后依次进行蛋白A亲和层析、AEX和CEX。对粗偶联物混合物、蛋白A亲和层析的ADC洗脱物、AEX的ADC流穿液和CEX的ADC洗脱物进行ELISA分析以确定残留酶污染物的量。
如图13所示，在一系列层析纯化之后，残留酶污染物减少三个对数(99.9％)。特别是，与仅使用蛋白A亲和层析的一步纯化相比，阴离子交换层析和阳离子交换层析进一步将最终产物中残留酶的量减少约78％。
实施例10：连接子-负载物中间体和ADC的分离
从含有目标ADC的粗偶联物混合物中除去连接子-负载物中间体的常规方法通常涉及超滤(UF)。然而，超滤过程中产生的剪切力增加蛋白分子聚集的风险。这在从产品ADC中除去小分子(例如，连接子-负载物中间体)的情况下尤其值得关注，因为与未偶联的蛋白分子相比，ADC的超滤时间长且疏水性增强。
本发明提供多种单元操作(方法步骤)的选择以除去连接子-负载物中间体。下文提供层析步骤的实施例。在这些实施例中，ADC样品根据“通用方法”中所述的方法制备，使用从HCCF的蛋白A亲和层析获得的抗体，或使用HCCF作为抗体进料。层析步骤根据“通用方法”中所述的方法进行。
10.1蛋白A亲和层析
使用类似于9.1的方法制备目标ADC。收集作为Halo-Sortase柱的流穿液的粗偶联物混合物，然后使用由不同供应商(Biomax和GE)提供的蛋白A层析介质进行蛋白A亲和层析。采用GE蛋白A的方法包含洗涤步骤。而使用Biomax蛋白A的方法不包含洗涤步骤。结果如图14所示。
10.2 CEX
使用类似于9.1的方法制备目标ADC。收集作为Halo-Sortase柱的流穿液的粗偶联物混合物，然后使用GE提供的CEX介质进行CEX层析。
结果如图14所示。
10.3蛋白A亲和层析，AEX和CEX
使用类似于7.1的方法制备目标ADC。收集作为Halo-Sortase柱的流穿液的粗偶联物混合物，然后依次进行蛋白A亲和层析、AEX和CEX。每个步骤中含有目标ADC的样品通过RP-HPLC进行分析，以确定残留的连接子-负载物中间体(Linker-Toxin)。
蛋白A亲和层析后，观察到连接子-负载物中间体含量减少超过4个对数(超过99.99％)。
本发明提供用于除去连接子-负载物中间体的多种方法，例如蛋白A亲和层析、AEX、CEX及其组合。在精纯步骤之后，还可以通过额外步骤如超滤和/或渗滤来实现进一步纯化。因此，可以彻底除去连接子-负载物中间体。
序列表
SEQ ID NO:1(sortase A)
AKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVK
SEQ ID NO:2(sortase A)
KTPEIPKDKSKMAGYIKVPDAEIEEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEGNESLSDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNETRKYKMTSIRDVDPSDVKVLDEHKGEKNQLTLITCDNYNKETGVWEKRKIFVAKEIK
SEQ ID NO:3(sortase A)
KAPAIPKDKSKMAGYIKVPDAEIEEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEGNESLTDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNETRKYKMTSIRNVDPSDVKVLDEHKGEKNQLTLITCDNYNKNTGVWEKRKIFVAKQIN
SEQ ID NO:4(sortase A)
KTPTIPKDKSKMAGYIEVPDAEIKEPVYPGPATLEQLNRGVSFAEGDESLDQQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNQTRKYKMTKIHDVNPSDVEVLDEQKGKKNQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFIATQVN
SEQ ID NO:5(sortase A)
KAVEIPKDKSKMAGYIKIPDAEIEEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEGNESLSDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNETRKYKMTSIRDVDPSDVKVLDEHKGEKNQLTLITCDNYNKETGVWEKRKIFVAKEIK
SEQ ID NO:6(sortase A)
KAPEIPKDKSKMAGYIKVPDAEIEEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEGNESLTDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNETRKYKMTSIRDVDPSDVKVLDEHKGEKNQLTLITCDNYNKNTGVWEKRKIFVAKQIN
SEQ ID NO:7(sortase A)
KKPTIPKDKSKMAGYIEVPDAEIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEGDESLDQQNIAIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNEVRKYKMTKIHDVDPTEVKVLDEHKGKKNQLTLITCDDYNEQTGVWEKRKIFVATQVN
SEQ ID NO:8(sortase A)
KAVEIPKDKSKMVGYIKVPDAEIEEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEGNESLSDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNETRKYKMTSIRDVDPSDVKVLDEHKGEKNQLTLITCDNYNKETGVWEKRKIFVAKEIK
SEQ ID NO:9(sortase A)
ESPQIPKDKAKMAGYIEIPDAQIKEPVYPGPATPQQLNRGVSFAEGDESLNQQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNQTRKYKITKIHDVKPTEVKVLDEHPSKKNQLTLITCDDYNEQTGVWETRKIFVATQMN
SEQ ID NO:10(sortase A)
STPKIPSDKSKMAGYIEVPDAQIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEGDESLNQQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKSAKIGSKVYFKTGNQTRKYKITKIRDVKPTEVKVLDEHPNKKNQLTLITCDDYNEETGVWETRKIFIATQIN
SEQ ID NO:11(sortase A)
ERPQIPKDKAKMAGYIEIPDAQIKEPVYPGPATPQQLNRGVSFAEGDESLYQQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVRNQTRKYKITKIHDVKPTEVKVLDEHPSKKNQLTLITCDDYNEQTGVWETRKIFVATQMN
SEQ ID NO:12(sortase A)
STPKIPSDKSKMAGYIEVPDAQIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEGDESLNQQNISIAGHTFTDRSHYQFTNLKSAKIGSKVYFKTGNQTRKYKITKIRDVKPTEVKVLDEHPNKKNQLTLITCDDYNEETGVWETRKIFIATQIN
SEQ ID NO:13(sortase A)
EKPTISKDKSKMTGYISIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEEDESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSKVTFKIGNETRKYKMTSIRDVNPEDVEVLDEHKGKKNQLTLITCDDYNENTGVWEKRKIFVAEEVK
SEQ ID NO:14(sortase A)
EKPTISKDKSKMTGYISIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEEDESLDDQNISIAGHTFTDRPNYQFTNLKAAKKGSKVTFKIGNETRKYKMTSIRDVDPDAVEVLDENKGKKNQLTLITCDDYNENTGVWEKRKIFVAEQIK
SEQ ID NO:15(sortase A)
EKPTISKDKSKMTGYISIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEEDESLDDQNISIAGHTFTDRPNYQFTNLKAAKKGSKVTFKTGNETRKYKMTSIRDVDPDAVEVLDENKGKKNQLTLITCDDYNENTGVWEKRKIFVAEQIK
SEQ ID NO:16(sortase A)
ETPTIPKDKSKMAGYISIPDAEIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEEDEKLDDQNISIAGHTFIDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNETRKYKMTSIRDVNPDDVKVLDEHKGETNQLTLITCDNYNEQTGIWEKRKIFVAKQIN
SEQ ID NO:17(sortase A)
ETPTIPKDKSKMAGYISIPDAEIKEPVYPGPATPEQLDRGVSFAEEDEKLDDQNISIAGHTFIDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNETRKYKMTSIRDVNPDDVKVLDEHKGETNQLTLITCDNYNEQTGIWEKRKIFIAKQIN
SEQ ID NO:18(sortase A)
EKPTIPKDKSKMAGYISVPDAEIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEGDESLDDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGDETREYKMTSIRDVDPEDVQVLDEHKGETNQLTLITCDNYNQQTGVWEKRKIFVAKQIK
SEQ ID NO:19(sortase A)
ERPTIPKNKSEMAGYISIPDAEIKEPVYPGPATLEQLNRGVSFAEGDESLDDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGDETREYKMTSIRDVDPEDVQVLDEHKGETNQLTLITCDNYNQQTGVWEKRKIFVAKQIK
SEQ ID NO:20(sortase A)
QTPTIPKDKSKMAGYISVPDAEIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEEDESLSDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKIGNETREYKMTSIRDVNPDQVEVLNEHKGEKNQLTLITCDDYNEQTGVWEKRKIFVAKQVK
SEQ ID NO:21(sortase A)
QTPTIPKDKTKMAGYISVPDAEIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEKDESLSDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKIGNETREYKMTSIRDVNPDEVEVLDEHKGEKNQLTLITCDDYNEQTGVWEKRKIFVAKQVK
SEQ ID NO:22(sortase A)
ERPTIPKDKSKMAGYISVPDAEIKEPVYPGPATLEQLNRGVSFAEGDESLDDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGDETREYKMTSIRDVNPEDVQVLDEHEGETNQLTLITCDNYNQQTGVWEKRKIFVAKQIK
SEQ ID NO:23(sortase A)
QTPTIPKDKTKMAGYISVPDAEIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEKDESLSDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKIGNETREYKMTSIRDVNPDEVEVLDEHKGEKNQLTLITCDDYNEQTGVWEKRKIFVAKQVN
SEQ ID NO:24(sortase A)
DKPTIPKDKAEMAGYLRIPDADINEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEEQESLDDQNIAIAGHTYIGRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNETREYKMTTIRDVNPDEIDVLDEHRGDKNRLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFIAEQIK
SEQ ID NO:25(sortase A)
QTPTIPKDKTKMAGYISVPDAEIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFTEKDESLSDQNISIAGHTFTDRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKIGNETREYKMTSIRDVNPDEVEVLDEHKGEKNQLTLITCDDYNEQTGVWEKRKIFVAKQVN
SEQ ID NO:26(sortase A)
DKPTIPKDKAEMAGYLRIPDADINEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEEQESLDDQNIAIAGHTYIGRPHYQFTNLKAAKKGSKVYFKVGNETREYKMTTIRDVDPDEIDVLDEHRGDKNRLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFIAEQIK
SEQ ID NO:27(sortase A，SEQ ID NO:1的SNAT对应物)
AKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATSEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRNVKPTAVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWETRKIFVATEVK
SEQ ID NO:28(Halo标签)
MAEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPRDGTPVLFLHGNPTSSYVWRNIIPHVAPTHRCIAPDLIGMGKSDKPDLGYFFDDHVRFMDAFIEALGLEEVVLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGIAFMEFIRPIPTWDEWPEFARETFQAFRTTDVGRKLIIDQNVFIEGTLPMGVVRPLTEVEMDHYREPFLNPVDREPLWRFPNELPIAGEPANIVALVEEYMDWLHQSPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAARLAKSLPNCKAVDIGPGLNLLQEDNPDLIGSEIARWLSTLEISG
SEQ ID NO:29(Halo-Sortase)
MAEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPRDGTPVLFLHGNPTSSYVWRNIIPHVAPTHRCIAPDLIGMGKSDKPDLGYFFDDHVRFMDAFIEALGLEEVVLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGIAFMEFIRPIPTWDEWPEFARETFQAFRTTDVGRKLIIDQNVFIEGTLPMGVVRPLTEVEMDHYREPFLNPVDREPLWRFPNELPIAGEPANIVALVEEYMDWLHQSPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAARLAKSLPNCKAVDIGPGLNLLQEDNPDLIGSEIARWLSTLEISGGGGGSGGGGSAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATSEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRNVKPTAVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWETRKIFVATEVK
序列表
<110> 启德医药科技（苏州）有限公司
<120> 连接酶融合蛋白及其应用
<130> I2021TC6472CS
<150> PCT/CN2021/074082
<151> 2021-01-28
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 1
Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Ile Asp
50 55 60
Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly Ser
65 70 75 80
Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met Thr
85 90 95
Ser Ile Arg Asp Val Lys Pro Thr Asp Val Gly Val Leu Asp Glu Gln
100 105 110
Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn
115 120 125
Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr Glu
130 135 140
Val Lys
145
<210> 2
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 2
Lys Thr Pro Glu Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Met Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Lys Val Pro Asp Ala Glu Ile Glu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Gly Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ser Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Thr Asp
50 55 60
Arg Pro His Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly Ser
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Lys Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met Thr
85 90 95
Ser Ile Arg Asp Val Asp Pro Ser Asp Val Lys Val Leu Asp Glu His
100 105 110
Lys Gly Glu Lys Asn Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asn Tyr Asn
115 120 125
Lys Glu Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Lys Glu
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Ile Lys
145
<210> 3
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 3
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1 5 10 15
Lys Val Pro Asp Ala Glu Ile Glu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> sortase A
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 7
Lys Lys Pro Thr Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Met Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Glu Val Pro Asp Ala Glu Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Gly Asp Glu
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Gln Asn Ile Ala Ile Ala Gly His Thr Phe Thr Asp
50 55 60
Arg Pro His Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly Ser
65 70 75 80
Lys Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Val Arg Lys Tyr Lys Met Thr
85 90 95
Lys Ile His Asp Val Asp Pro Thr Glu Val Lys Val Leu Asp Glu His
100 105 110
Lys Gly Lys Lys Asn Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn
115 120 125
Glu Gln Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr Gln
130 135 140
Val Asn
145
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<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 8
Lys Ala Val Glu Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Met Val Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Lys Val Pro Asp Ala Glu Ile Glu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Gly Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ser Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Thr Asp
50 55 60
Arg Pro His Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly Ser
65 70 75 80
Lys Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met Thr
85 90 95
Ser Ile Arg Asp Val Asp Pro Ser Asp Val Lys Val Leu Asp Glu His
100 105 110
Lys Gly Glu Lys Asn Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asn Tyr Asn
115 120 125
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130 135 140
Ile Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 9
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1 5 10 15
Glu Ile Pro Asp Ala Gln Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Gln Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Gly Asp Glu
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50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
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<220>
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<400> 12
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130 135 140
Ile Asn
145
<210> 13
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 13
Glu Lys Pro Thr Ile Ser Lys Asp Lys Ser Lys Met Thr Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asp Glu
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Lys Val Thr Phe Lys Ile Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met Thr
85 90 95
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Lys Gly Lys Lys Asn Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn
115 120 125
Glu Asn Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Glu Glu
130 135 140
Val Lys
145
<210> 14
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 14
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1 5 10 15
Ser Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
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130 135 140
Ile Lys
145
<210> 15
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 15
Glu Lys Pro Thr Ile Ser Lys Asp Lys Ser Lys Met Thr Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
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Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asp Glu
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Lys Gly Lys Lys Asn Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn
115 120 125
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130 135 140
Ile Lys
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<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 16
Glu Thr Pro Thr Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Met Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Ile Pro Asp Ala Glu Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asp Glu
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50 55 60
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115 120 125
Glu Gln Thr Gly Ile Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Lys Gln
130 135 140
Ile Asn
145
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<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 17
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1 5 10 15
Ser Ile Pro Asp Ala Glu Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
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130 135 140
Ile Asn
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<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 18
Glu Lys Pro Thr Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Met Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Val Pro Asp Ala Glu Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Gly Asp Glu
35 40 45
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Gln Gln Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Lys Gln
130 135 140
Ile Lys
145
<210> 19
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 19
Glu Arg Pro Thr Ile Pro Lys Asn Lys Ser Glu Met Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Ile Pro Asp Ala Glu Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Leu Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Gly Asp Glu
35 40 45
Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Thr Asp
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65 70 75 80
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Gln Gln Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Lys Gln
130 135 140
Ile Lys
145
<210> 20
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 20
Gln Thr Pro Thr Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Met Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Val Pro Asp Ala Glu Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
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Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asp Glu
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Lys Val Tyr Phe Lys Ile Gly Asn Glu Thr Arg Glu Tyr Lys Met Thr
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Lys Gly Glu Lys Asn Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn
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Glu Gln Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Lys Gln
130 135 140
Val Lys
145
<210> 21
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 21
Gln Thr Pro Thr Ile Pro Lys Asp Lys Thr Lys Met Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Val Pro Asp Ala Glu Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Lys Asp Glu
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50 55 60
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65 70 75 80
Lys Val Tyr Phe Lys Ile Gly Asn Glu Thr Arg Glu Tyr Lys Met Thr
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Glu Gln Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Lys Gln
130 135 140
Val Lys
145
<210> 22
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 22
Glu Arg Pro Thr Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Met Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Val Pro Asp Ala Glu Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Leu Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Gly Asp Glu
35 40 45
Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Thr Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Val Tyr Phe Lys Val Gly Asp Glu Thr Arg Glu Tyr Lys Met Thr
85 90 95
Ser Ile Arg Asp Val Asn Pro Glu Asp Val Gln Val Leu Asp Glu His
100 105 110
Glu Gly Glu Thr Asn Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asn Tyr Asn
115 120 125
Gln Gln Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Lys Gln
130 135 140
Ile Lys
145
<210> 23
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 23
Gln Thr Pro Thr Ile Pro Lys Asp Lys Thr Lys Met Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Val Pro Asp Ala Glu Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Lys Asp Glu
35 40 45
Ser Leu Ser Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Thr Asp
50 55 60
Arg Pro His Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly Ser
65 70 75 80
Lys Val Tyr Phe Lys Ile Gly Asn Glu Thr Arg Glu Tyr Lys Met Thr
85 90 95
Ser Ile Arg Asp Val Asn Pro Asp Glu Val Glu Val Leu Asp Glu His
100 105 110
Lys Gly Glu Lys Asn Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn
115 120 125
Glu Gln Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Lys Gln
130 135 140
Val Asn
145
<210> 24
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 24
Asp Lys Pro Thr Ile Pro Lys Asp Lys Ala Glu Met Ala Gly Tyr Leu
1 5 10 15
Arg Ile Pro Asp Ala Asp Ile Asn Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Gln Glu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Lys Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Glu Tyr Lys Met Thr
85 90 95
Thr Ile Arg Asp Val Asn Pro Asp Glu Ile Asp Val Leu Asp Glu His
100 105 110
Arg Gly Asp Lys Asn Arg Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn
115 120 125
Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Ile Ala Glu Gln
130 135 140
Ile Lys
145
<210> 25
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 25
Gln Thr Pro Thr Ile Pro Lys Asp Lys Thr Lys Met Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Val Pro Asp Ala Glu Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Thr Glu Lys Asp Glu
35 40 45
Ser Leu Ser Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Thr Asp
50 55 60
Arg Pro His Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly Ser
65 70 75 80
Lys Val Tyr Phe Lys Ile Gly Asn Glu Thr Arg Glu Tyr Lys Met Thr
85 90 95
Ser Ile Arg Asp Val Asn Pro Asp Glu Val Glu Val Leu Asp Glu His
100 105 110
Lys Gly Glu Lys Asn Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn
115 120 125
Glu Gln Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Lys Gln
130 135 140
Val Asn
145
<210> 26
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A
<400> 26
Asp Lys Pro Thr Ile Pro Lys Asp Lys Ala Glu Met Ala Gly Tyr Leu
1 5 10 15
Arg Ile Pro Asp Ala Asp Ile Asn Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Gln Glu
35 40 45
Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ala Ile Ala Gly His Thr Tyr Ile Gly
50 55 60
Arg Pro His Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly Ser
65 70 75 80
Lys Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Glu Tyr Lys Met Thr
85 90 95
Thr Ile Arg Asp Val Asp Pro Asp Glu Ile Asp Val Leu Asp Glu His
100 105 110
Arg Gly Asp Lys Asn Arg Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn
115 120 125
Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Ile Ala Glu Gln
130 135 140
Ile Lys
145
<210> 27
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase A, SEQ ID NO: 1的SNAT对应物
<400> 27
Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Ser Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Ile Asp
50 55 60
Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly Ser
65 70 75 80
Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met Thr
85 90 95
Ser Ile Arg Asn Val Lys Pro Thr Ala Val Gly Val Leu Asp Glu Gln
100 105 110
Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn
115 120 125
Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Thr Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr Glu
130 135 140
Val Lys
145
<210> 28
<211> 297
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Halo标签
<400> 28
Met Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu
1 5 10 15
Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly
20 25 30
Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp
35 40 45
Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro
50 55 60
Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe
65 70 75 80
Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly
85 90 95
Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly
100 105 110
Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe
115 120 125
Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe
130 135 140
Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys
145 150 155 160
Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly
165 170 175
Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro
180 185 190
Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu
195 200 205
Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu
210 215 220
Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp
225 230 235 240
Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala
245 250 255
Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn
260 265 270
Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg
275 280 285
Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly
290 295
<210> 29
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Halo-Sortase
<400> 29
Met Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu
1 5 10 15
Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly
20 25 30
Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp
35 40 45
Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro
50 55 60
Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe
65 70 75 80
Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly
85 90 95
Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly
100 105 110
Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe
115 120 125
Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe
130 135 140
Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys
145 150 155 160
Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly
165 170 175
Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro
180 185 190
Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu
195 200 205
Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu
210 215 220
Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp
225 230 235 240
Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala
245 250 255
Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn
260 265 270
Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg
275 280 285
Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala
305 310 315 320
Gly Tyr Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro
325 330 335
Gly Pro Ala Thr Ser Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu
340 345 350
Glu Asn Glu Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr
355 360 365
Phe Ile Asp Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys
370 375 380
Lys Gly Ser Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr
385 390 395 400
Lys Met Thr Ser Ile Arg Asn Val Lys Pro Thr Ala Val Gly Val Leu
405 410 415
Asp Glu Gln Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp
420 425 430
Asp Tyr Asn Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Thr Arg Lys Ile Phe Val
435 440 445
Ala Thr Glu Val Lys
450

Claims (50)

1.一种连接酶融合蛋白，其由连接酶和Halo标签以及任选存在的连接肽组成，其中
所述连接酶具有7.5至10.0的等电点(pI)，
所述Halo标签具有4.5至5.0的等电点，并且
所述连接酶融合蛋白的pI比所述连接酶的pI低2.0至4.5个pH单位；
并且其中所述连接酶是sortase A，所述sortase A包含选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的连接酶融合蛋白，其中
所述sortase A包含选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列，并且在位点34、100、105和136处包含SNAT、YNAT、WNDT或VNNS的氨基酸取代。
3.权利要求1的连接酶融合蛋白，其中
所述sortase A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-12任一项所示。
4.权利要求1的连接酶融合蛋白，其中所述sortase A包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1的连接酶融合蛋白，其中所述sortase A的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。
6.权利要求1-5中任一项的连接酶融合蛋白，其中
所述Halo标签包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
7.权利要求1-5中任一项的连接酶融合蛋白，其中
所述Halo标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。
8.权利要求1的连接酶融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示。
9.权利要求1的连接酶融合蛋白，其等电点为4.5至6.5。
10.权利要求1的连接酶融合蛋白，其等电点为5.0至6.0。
11.一种固定化连接酶，其包含固定在支持物上的权利要求1-10中任一项的连接酶融合蛋白。
12.权利要求11的固定化连接酶，其中
所述支持物包含卤代烷基连接子，使得所述连接酶融合蛋白通过卤代烷基连接子和Halo标签之间的共价相互作用固定在所述支持物上。
13.权利要求12的固定化连接酶，其中所述卤代烷基连接子为氯代烷基连接子。
14.权利要求13的固定化连接酶，其中
氯代烷基连接子由具有式(I-1)结构的氯代烷基底物产生：
Figure FDA0004235172160000021
其中，u为1-20的整数，v为0-20的整数，w为1-19的整数。
15.权利要求14的固定化连接酶，其中
所述支持物具有式(Ⅱ)的结构：
Figure FDA0004235172160000022
其中u为1-20的整数，v为0-20的整数，w为1-19的整数；
Figure FDA0004235172160000023
为树脂、珠子、膜、凝胶、基质、薄膜、板、孔、管、载玻片或表面。
16.权利要求15的固定化连接酶，其中
Figure FDA0004235172160000024
为树脂。
17.权利要求15的固定化连接酶，其中
Figure FDA0004235172160000025
为琼脂糖树脂、有机硅树脂、聚甲基丙烯酸甲酯树脂或纤维素树脂。
18.一种用于制备包含第一部分和第二部分的偶联物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供包含第一部分的系统1和提供包含第二部分的系统2；和
(b)使步骤(a)中的系统1和系统2与连接酶单元接触，催化第一部分和第二部分之间的偶联反应以获得所述偶联物；
其中所述连接酶单元包含权利要求1-10中任一项的连接酶融合蛋白或者权利要求11-17中任一项的固定化连接酶；
所述第一部分和第二部分各自独立地包含蛋白、受体、信号转导因子、细胞生长因子、核酸或核酸类似物、小分子化合物，聚糖、PEG部分、放射性核素、细胞因子、免疫调节剂、示踪分子、肽或肽模拟物；并且
所述第一部分和第二部分中的一个进一步包含连接酶供体底物识别基序，并且第一部分和第二部分中的另一个包含连接酶受体底物识别基序。
19.权利要求18的方法，其中
所述蛋白为抗体或抗体片段；所述示踪分子为荧光团或荧光分子。
20.权利要求18的方法，其中
步骤(a)中的系统1和系统2中的至少一个包含一种或多种杂质。
21.权利要求18的方法，其中
步骤(a)中的系统1和系统2中的至少一个为收获的澄清细胞培养液(HCCF)。
22.权利要求18的方法，进一步包括以下步骤：
(1)在步骤(b)之前将步骤(a)中的系统1进行，和/或
(2)在步骤(b)之前将步骤(a)中的系统2进行，和/或
(3)将对步骤(b)中获得的偶联物进行，
一个或多个层析步骤处理以除去一种或多种杂质。
23.权利要求22的方法，其中
所述层析步骤独立地选自亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析及其组合；
其中所述离子交换层析选自阴离子交换层析、阳离子交换层析及其组合。
24.权利要求22的方法，其中所述层析步骤选自亲和层析、离子交换层析及其组合。
25.权利要求23的方法，其中
所述第一部分和第二部分中至少一个包含抗体或抗体片段，并且步骤(1)-(3)中的至少一个包含亲和层析。
26.权利要求25的方法，其中所述抗体或抗体片段包含Fc片段，所述亲和层析是蛋白A亲和层析。
27.权利要求23的方法，其中所述第一部分或第二部分包含Fc片段，
步骤(1)和(2)不存在，并且步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3a-1)：蛋白A亲和层析；
(3a-2)：阴离子交换层析；和
(3a-3)：阳离子交换层析；
或者
步骤(1)或步骤(2)包含蛋白A亲和层析，并且步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3b-1)：阴离子交换层析；和
(3b-2)：阳离子交换层析；
或者
步骤(1)或步骤(2)包含蛋白A亲和层析，并且步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3c-1)：蛋白A亲和层析；
(3c-2)：阴离子交换层析；和
(3c-3)：阳离子交换层析；
或者
步骤(1)或步骤(2)包含蛋白A亲和层析和阴离子交换层析，并且步骤(3)包含任意顺序的以下步骤：
(3d-1)：蛋白A亲和层析；
(3d-2)：阳离子交换层析；和
(3d-3)：疏水相互作用层析；
或者
步骤(1)或步骤(2)包含蛋白A亲和层析，在步骤(b)之后和步骤(3)之前进行UF/DF，其中步骤(3)包含任何顺序的以下步骤：
(3e-1)：阴离子交换层析；和
(3e-2)：阳离子交换层析；
或者
步骤(1)或步骤(2)包含蛋白A亲和层析和阴离子交换层析，在步骤(b)之后和步骤(3)之前进行UF/DF，其中步骤(3)包含阳离子交换层析或疏水相互作用层析。
28.权利要求23的方法，其中
所述亲和层析以结合-洗脱模式进行；和/或
所述离子交换层析采用结合-洗脱模式或流穿模式进行。
29.权利要求23的方法，其中
所述阴离子交换层析以流穿模式进行；和/或
所述阳离子交换层析以结合-洗脱模式进行。
30.权利要求18-29中任一项的方法，其中
步骤(b)以分批模式、半连续模式或连续模式进行。
31.权利要求22-29中任一项的方法，其中
步骤(a)、(b)和(1)-(3)中的至少一个以半连续模式或连续模式进行。
32.权利要求22-29中任一项的方法，其中步骤(a)、(b)和(1)-(3)以连续模式进行。
33.权利要求18-29中任一项的方法，其中
所述偶联物具有式(Ⅲ)的结构，
所述第一部分包含T，和
所述第二部分包含式(IV)的连接子-负载物中间体
Figure FDA0004235172160000041
其中
T包含生物分子，其任选地修饰为具有连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的一个；
L包含连接子，其包含连接酶供体底物识别基序和连接酶受体底物识别基序中的另一个；
P包含负载物；
z为1-20的整数；
t为1-20的整数。
34.权利要求33的方法，其中
T包含蛋白、肽、受体、信号转导因子、细胞生长因子或核酸或核酸类似物；和/或
P包含小分子化合物。
35.权利要求34的方法，其中
所述蛋白为抗体或抗体片段。
36.权利要求33的方法，其中P包含毒素、聚糖、PEG部分、放射性核素、细胞因子、免疫调节剂、核酸或核酸类似物、示踪分子、肽肽模拟物或蛋白。
37.权利要求36的方法，其中所述蛋白为抗体或抗体片段；所述示踪分子为荧光团或荧光分子。
38.权利要求18-29中任一项的方法，其中
所述连接酶供体底物识别基序为LPXTGJ；和/或
所述连接酶受体底物识别基序为Gn，其中G为甘氨酸(Gly)，n为3-10的整数；
X为任何天然或非天然氨基酸；
J不存在，或者为包含1-10个氨基酸的氨基酸片段，其中每个氨基酸独立地为任何天然或非天然氨基酸。
39.权利要求38的方法，其中J不存在或为Gm，其中m为1-10的整数。
40.权利要求38的方法，其中
所述连接酶供体底物识别基序为LPXTG或LPETGG。
41.权利要求38的方法，其中
所述连接酶供体底物识别基序为LPETGG；并且
所述连接酶受体底物识别基序为Gn，其中G为甘氨酸(Gly)，n为3-10的整数。
42.权利要求18-29中任一项的方法，其中所述偶联物具有选自以下式(3)、(3’)、(5)和(5’)的结构：
Figure FDA0004235172160000061
Figure FDA0004235172160000071
其中n为3-10的整数；
x为OH、NH2或Gly；
Toxin代表细胞毒素；
Lk为L1-L2-L3；
L1和L3各自独立地选自由以下组成的组：
-CH2-、-NH-、-(CO)-、-NH(CO)-、-(CO)NH-；以及C1-4亚烷基与以下基团之一的组合：-CH2-、-NH-、-(CO)-、-NH(CO)-、-(CO)NH-；
L2不存在或为C7-34亚烷基，并且任选地，所述亚烷基中的一个或多个(-CH2-)结构可被-O-代替；
L1、L2和L3各自任选且独立地被1、2或3个选自-OR1和-NR1R2的取代基取代；
R1和R2各自独立地选自由以下组成的组：氢、-C1-6烷基、-(CO)-C1-6烷基和-S(＝O)2-C1-6烷基；
Y不存在或选自由以下组成的组：可切割序列、间隔子Sp1及其组合；
所述可切割序列包含能够被酶切断的氨基酸序列，并且所述可切割序列包含1-10个氨基酸；
Sp1选自由以下组成的组：含有1-20个氨基酸的间隔子序列、PAB及其组合；
T和z分别如权利要求33中所定义。
43.权利要求42的方法，其中所述细胞毒素选自由以下组成的组：紫杉烷类，美登素类，奥瑞他汀类，埃博霉素类，考布他汀A-4磷酸酯，考布他汀A-4及其衍生物，吲哚-磺胺类，长春碱类如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春氟宁、长春甘酯、脱水长春碱，多拉司他汀10和类似物，软海绵素B，艾日布林，吲哚-3-草酰胺类，鬼臼毒素类，7-二乙氨基-3(2’-苯并噁唑基)-香豆素(DBC)，蒂克霉素，莱利霉素，喜碱树及其衍生物，米托蒽醌，米托胍腙，氮芥类，亚硝基尿类，氮丙啶类，苯并多巴，卡波醌，美妥替哌，乌瑞替哌，达内霉素，埃斯培拉霉素，新制癌菌素，阿克拉霉素，放线菌素，安曲霉素，博来霉素类，放线菌素C，卡拉比星，去甲柔红霉素，嗜癌霉素，放线菌素D，柔毛霉素，地托比星，阿霉素，表柔比星，依索比星，依达比星，麻西罗霉素，丝裂霉素，诺加霉素，橄榄霉素，培洛霉素，泊非霉素，嘌罗霉素，铁阿霉素，罗多比星，链黑霉素，链佐星，净司他丁，左柔比星，单端孢霉烯类，T-2毒素，疣孢菌素A，杆孢菌素A，安归啶，乌苯美司，偶氮丝氨酸，6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸，二甲基叶酸，甲氨蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙，依达曲沙，氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤，安西他滨，吉西他滨，依诺他滨，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，氟尿苷，卡普睾酮，丙酸甲雄烷酮，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯，氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦，氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，醋酸亮丙瑞林，蛋白激酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂。
44.权利要求42的方法，其中所述细胞毒素选自奥瑞他汀类。
45.权利要求44的方法，其中所述细胞毒素选自MMAE、MMAF或MMAD。
46.权利要求42的方法，其中Y不存在，并且所述偶联物具有选自以下式(4)、(4’)、(6)和(6’)的结构：
Figure FDA0004235172160000081
Figure FDA0004235172160000091
47.一种用于制备偶联物的方法，其包括使连接酶单元与连接子-负载物中间体和T接触，催化T与连接子-负载物中间体之间的偶联反应以获得所述偶联物，
Figure FDA0004235172160000092
其中所述连接子-负载物中间体具有式(Ⅳ-1-5)或(Ⅳ-1-5’)的结构，
所述偶联物具有式(5)或(5’)的结构，并且
式(Ⅳ-1-5)、(Ⅳ-1-5’)、(5)和(5’)如下所示
Figure FDA0004235172160000101
Figure FDA0004235172160000111
T为生物分子，其可以任选地修饰为具有连接酶供体底物识别基序；
n为3-10的整数；和
Toxin如权利要求42中所定义；
所述连接酶单元包含权利要求1-10中任一项的连接酶融合蛋白或者权利要求11-17中任一项的固定化连接酶。
48.权利要求47的方法，其中
式(Ⅳ-1-5)的连接子-负载物中间体具有式(Ⅳ-1-6)的结构，
式(Ⅳ-1-5’)的连接子-负载物中间体具有式(Ⅳ-1-6’)的结构，
式(5)的偶联物具有式(6)的结构，
式(5’)的偶联物具有式(6’)的结构，
式(Ⅳ-1-6)、(Ⅳ-1-6’)、(6)和(6’)如下所示
Figure FDA0004235172160000112
/>
Figure FDA0004235172160000121
49.权利要求1-10中任一项的连接酶融合蛋白，或权利要求11-17中任一项的固定化连接酶在制备偶联物中的用途。
50.权利要求49的用途，其中所述偶联物如权利要求18-48中任一项所定义。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106856656B (zh) 2014-04-29 2021-01-26 启德医药科技（苏州）有限公司 一种稳定型抗体药物耦联物及其制备方法和用途
CN116917484A (zh) 2021-01-28 2023-10-20 启德医药科技（苏州）有限公司 连接酶融合蛋白及其应用
US11814394B2 (en) 2021-11-16 2023-11-14 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Exatecan derivatives, linker-payloads, and conjugates and thereof
WO2024002330A1 (zh) * 2022-07-01 2024-01-04 启德医药科技（苏州）有限公司 固定化的内切糖苷酶融合蛋白及其应用
WO2024078612A1 (en) * 2022-10-14 2024-04-18 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Linker-payload compound, conjugates and applications thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105722851A (zh) * 2013-04-28 2016-06-29 秦刚 一种新型的连接子及其制备方法和用途

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US54821A (en) * 1866-05-15 Improvement in machines for boarding and graining leather
CA2365523A1 (en) 1999-04-15 2000-10-26 The Regents Of The University Of California Identification of sortase gene
US7256257B2 (en) 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
EP1483295B1 (en) 2002-03-01 2008-12-10 Immunomedics, Inc. Rs7 antibodies
US7429472B2 (en) 2003-01-31 2008-09-30 Promega Corporation Method of immobilizing a protein or molecule via a mutant dehalogenase that is bound to an immobilized dehalogenase substrate and linked directly or indirectly to the protein or molecule
EP1594962B1 (en) 2003-01-31 2014-08-27 Promega Corporation Covalent tethering of functional groups to proteins
DE10331870A1 (de) * 2003-07-14 2005-02-10 Basf Ag Kosmetische und pharmazeutische Mittel auf Basis von Polyelektrolyt-Komplexen
US7034553B2 (en) 2003-12-05 2006-04-25 Prodont, Inc. Direct resistance measurement corrosion probe
US7425436B2 (en) 2004-07-30 2008-09-16 Promega Corporation Covalent tethering of functional groups to proteins and substrates therefor
EP2087107A2 (en) 2006-10-30 2009-08-12 Promega Corporation Mutant hydrolase proteins with enhanced kinetics and functional expression
WO2010087994A2 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
DE102009008252B4 (de) * 2009-02-02 2012-01-19 Technische Universität Dresden Autokatalytischer Proteinlinker und seine Verwendung zur Herstellung von Fusionsproteinen
EP2777714A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
WO2014145441A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sortase-mediated protein purification and ligation
WO2014183066A2 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein modification of living cells using sortase
RU2705367C2 (ru) 2013-12-25 2019-11-07 Дайити Санкио Компани, Лимитед Конъюгат анти-trop2 антитело-лекарственное средство
WO2015127365A2 (en) * 2014-02-21 2015-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Calcium-independent sortase a mutants
CN106856656B (zh) 2014-04-29 2021-01-26 启德医药科技（苏州）有限公司 一种稳定型抗体药物耦联物及其制备方法和用途
WO2016014501A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase molecules and uses thereof
EP3436578B1 (en) * 2016-03-30 2022-01-19 F. Hoffmann-La Roche AG Improved sortase
CN106237341B (zh) * 2016-07-12 2019-07-30 浙江大学 一种抗体偶联药物及其制备方法和应用
CA3036829A1 (en) * 2016-09-14 2018-03-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Proximity-based sortase-mediated protein purification and ligation
CA3112212A1 (en) * 2018-10-03 2020-04-09 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Covalent adaptor synnotch and chimeric antigen receptors (cars) for programmable antigen-targeting
EP3647419A1 (en) 2018-11-02 2020-05-06 NBE Therapeutics AG Sortase f and its use in methods for conjugation
CN116917484A (zh) 2021-01-28 2023-10-20 启德医药科技（苏州）有限公司 连接酶融合蛋白及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105722851A (zh) * 2013-04-28 2016-06-29 秦刚 一种新型的连接子及其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022160156A1 (en) 2022-08-04
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