KR101001433B1

KR101001433B1 - 당사슬 유도체의 구조해석 방법, 및 당사슬 유도체

Info

Publication number: KR101001433B1
Application number: KR1020107014711A
Authority: KR
Inventors: 가즈아키 가케히; 미쯔히로 기노시타; 유키 마쯔노
Original assignee: 오츠카 가가쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2010-12-14
Also published as: KR100968691B1; TW201124428A; US20090215100A1; KR20100029154A; KR20100092042A; AU2006270732B2; CA2616065A1; AU2006270732A1; CN101223194A; CN101949901A; JP2012162542A; US8691795B2; KR20080028994A; JP5688043B2; CA2759070A1; SG149832A1; WO2007011055A1; CA2616065C; US8318694B2; JPWO2007011055A1

Abstract

당사슬 혼합물로부터 당사슬 유도체를 제조하는 방법으로서, (a) 당사슬 혼합물 중의 당사슬에 지용성기를 도입하여 당사슬 유도체의 혼합물을 얻는 공정, 및 (b) 상기 당사슬 유도체의 혼합물을 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피로 처리하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 당사슬 유도체의 제조방법, 및
암세포 유래 당사슬 혼합물 중의 당사슬의 구조를 해석하는 방법으로서, (a) 암세포 유래 당사슬 혼합물 중의 당사슬에, 2-카르복시페닐아미노기, 3-카르복시페닐아미노기, 4-카르복시페닐아미노기, p-에톡시카르보닐페닐아미노기, 2-피리딜아미노기, 카바메이트계, 및 아미드계 보호기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 지용성기를 도입하여 당사슬 유도체의 혼합물을 얻는 공정, (b) 상기 당사슬 유도체의 혼합물을 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피로 처리하는 공정, 및 (e) 질량분석법으로 처리하는 공정을 포함하는 암세포 유래 당사슬의 구조해석 방법.

Description

당사슬 유도체의 구조해석 방법, 및 당사슬 유도체{Structure analysis method of sugar chain derivative, and sugar chain derivative}

본 발명은 당사슬의 혼합물로부터의 당사슬 유도체의 제조방법 및 당사슬의 구조해석 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명의 당사슬 유도체의 제조방법으로 제조된 신규 당사슬 유도체에 관한 것이다.

당 단백질 중의 당사슬은 단백질의 입체구조의 유지, 프로테아제로부터의 분해를 방지하는 저항성 획득 등의 작용을 담당하고 있다고 생각되어 왔다. 최근 들어, 당 단백질 중의 당사슬이 수정(受精)이나 분화, 시그널 전달, 암화(癌化), 단백질의 세포내 수송이나 생리활성의 조절 등의 생명현상에 관여하는 것이 명확해지고 있다. 또한, 세포표면의 접착분자나 당 단백질성 호르몬 등의 당사슬과 그 기능과의 관계가 명확해져, 당질 과학 컨소시엄 구상이 완성되어 있다. 현재, 당사슬 기능연구의 중심은 그 생합성을 담당하는 당 전이효소(당사슬 유전자)에 관한 연구가 중심이 되고 있지만, 당 전이효소도 또한 게놈 정보에 의해 보존되고, 다른 단백질과의 협조작업에 의해 생명기능에 관여하는 것을 고려하면, 세포, 조직 중에 발현되는 당사슬의 전체상을 파악하여 해석하는 구조 글라이코믹스 수법으로 당사슬의 기능해석을 진행할 필요가 있다.

당사슬 과학에 있어서의 구조 글라이코믹스의 역할은 다수의 생명현상에서 중요한 역할을 담당하고 있는 당사슬 인식 메커니즘을 망라적으로 해석하는 것으로서, 기능 글라이코믹스에 불가결한 요소이다. 구조 글라이코믹스에 요구되는 기술적 요소로서는 높은 망라성, 하이 스루풋(high throughput), 고감도 및 고정도(high precision)이다.

현재, 당 단백질 당사슬의 구조해석법으로서는 단백질로부터 잘라낸 당사슬을 형광표지한 후, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)나 질량분석법(MS)을 사용하여 해석하는 방법이 질량분석의 극적인 기술진보에 의해 유력한 수단으로 되어 있고(비특허문헌 1~4), 시알로 당사슬의 분리에는 오로지 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피가 사용되어 왔다(비특허문헌 5).

[비특허문헌 1] Biomed Chromatogr. 16:103-115(2002) [비특허문헌 2] Anal Biochem. 206:278-287(1992) [비특허문헌 3] Biochem Soc Trans. 21:121-125(1993) [비특허문헌 4] Chem Rev. 102:321-369(2002) [비특허문헌 5] Biochim Biophys Acta. 705:167-173(1982)

세포나 조직 중의 당사슬을 망라적으로 해석하는 경우, 시알산이나 푸코오스 등의 비환원 말단 수식의 다양성과 당사슬의 분지라고 하는 문제가 존재하기 때문에, 혼재하는 당사슬을 충분히 분리할 수 없어 만족할만한 결과를 얻을 수 없었다. 특히 이온교환 칼럼 등을 사용하면, 특이적인 분리능을 가지고 있지 않기 때문에 충분한 분리가 얻어지지 않을 뿐 아니라, 분리조작 후에 탈염처리를 실시해야만 하여 실용적인 방법이라고는 할 수 없다.

따라서, 이들 당사슬 불균일성 정보에 배려하면서, 세포, 조직에 특징적인 당사슬 구조를 상세하게 해석할 수 있는 실용적인 수법이 열망되고 있었다.

본 발명은 세포나 조직 중의 당사슬과 같이 각종 당사슬이 혼재하고 있는 상태에서 각 당사슬을 분리하여, 취득하는 수단을 제공하는 것을 과제로 한다.

또한, 본 발명은 분리한 각 당사슬 화합물의 구조를 해석하는 수단을 제공하는 것을 과제로 한다.

또한, 본 발명은 신규한 당사슬 유도체를 제공하는 것을 과제로 한다.

발명의 개시

본 발명은 이하의 발명에 관한 것이다.

1. 당사슬 혼합물로부터 당사슬 유도체를 제조하는 방법으로서, (a) 당사슬 혼합물 중의 당사슬에 지용성기(脂溶性基)를 도입하여 당사슬 유도체의 혼합물을 얻는 공정, 및 (b) 상기 당사슬 유도체의 혼합물을 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피로 처리하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 당사슬 유도체의 제조방법.

2. (b) 공정 후에 (c) 아미노 칼럼 또는 아미드 칼럼을 사용하는 순상(順相) 크로마토그래피로 처리하는 공정을 구비한 상기 기재의 당사슬 유도체의 제조방법.

3. (c) 공정 전에 (d) 당 가수분해 효소로 처리하는 공정을 구비한 상기 기재의 당사슬 유도체의 제조방법.

4. 당사슬 혼합물 중의 당사슬의 구조를 해석하는 방법으로서, (a) 당사슬 혼합물 중의 당사슬에 지용성기를 도입하여 당사슬 유도체의 혼합물을 얻는 공정, (b) 상기 당사슬 유도체의 혼합물을 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피로 처리하는 공정, 및 (e) 질량분석법으로 처리하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 당사슬의 구조해석 방법.

5. (b) 공정 후에 (c) 아미노 칼럼 또는 아미드 칼럼을 사용하는 순상 크로마토그래피로 처리하는 공정을 구비한 상기 기재의 당사슬의 구조해석 방법.

6. (c) 공정 전에 (d) 당 가수분해 효소로 처리하는 공정을 구비한 상기 기재의 당사슬의 구조해석 방법.

7. 질량분석법이 MALDI-TOF MS에 의한 질량분석법인 상기 4 기재의 당사슬의 구조해석 방법.

8. 후술하는 화학식 1~6으로 표시되는 당사슬 유도체[화학식 중 R¹은 2-카르복시페닐기, 3-카르복시페닐기, 4-카르복시페닐기, p-에톡시카르보닐페닐기, 또는 2-피리딜기를 나타낸다. R²는 수산기, 기 -Asn 또는 기 -Asn-R³를 나타낸다. 여기서 Asn은 아스파라긴기를 나타내고, R³는 카바메이트계 또는 아미드계 보호기를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.].

9. 화학식 1~6으로 표시되는 당사슬 유도체로부터 유도되는 암 마커.

본 발명자 등은 예의 검토를 거듭한 결과, 당사슬에 지용성기를 도입하여 당사슬 유도체로 한 후, 시알산과 친화성을 갖는 세로토닌을 리간드로 하는 친화성 칼럼 크로마토그래피로 처리함으로써, 아시알로 당사슬과 시알로 당사슬의 분리, 추가로 시알로 당사슬 중의 모노시알로, 디시알로, 트리시알로 및 테트라시알로 당사슬 등을 시알산 잔기의 수에 따라서 분리할 수 있는 것을 발견하였다.

추가로 상기 친화성 칼럼 크로마토그래피에 의해서 분리된 분획을, 각각 아미노 칼럼 또는 아미드 칼럼을 사용한 크로마토그래피에 제공함으로써 분지구조가 상이한 당사슬 유도체를 상세하게 분리할 수 있는 것을 발견하고, 단일구조의 당사슬을 대량으로 제조하는 것을 가능하게 하였다.

또한, 분리한 각 당사슬 유도체에 적당한 당 가수분해 효소를 작용시키고, 아미노 칼럼 또는 아미드 칼럼을 사용한 크로마토그래피에 제공하여 단리하고, 얻어진 당사슬 유도체를 질량분석법으로 처리함으로써 고정도이고 또한 망라적으로 당사슬 구조를 해석할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 제조방법에 있어서 사용하는 당사슬 혼합물의 당사슬은 특별히 제한되지 않고 아스파라긴 결합형 당사슬(N-글리코시드 결합형 당사슬), 뮤신형 당사슬(O-글리코시드 결합형 당사슬), 유리형(遊離型) 당사슬, 더 나아가서는 당사슬 결합 아스파라긴과 같이 아미노산이 결합하고 있는 당사슬을 포함한다.

이들 당사슬은 화학적 수법으로 조제된 당사슬이어도 되지만, 예를 들면 천연 당 당백질에 유래하는 당사슬은 비환원 말단의 당 잔기가 임의로 결실된 당사슬의 혼합물로 되어 있어, 이들 당사슬의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 당사슬 잔기에 시알산 잔기를 갖는 당사슬을 함유하는 당사슬 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.

천연 당사슬의 혼합물로서는 천연원료, 예를 들면 유즙(乳汁), 소 유래 페투인(fetuin), 계란 또는 생체의 조직이나 세포에 유래하는 당사슬 혼합물을 들 수 있다. 특히 암조직 또는 암세포에 유래하는 당사슬 혼합물을 사용하는 것은 매우 흥미 깊은 결과를 기대할 수 있기 때문에 바람직하다.

본 발명에서 사용할 수 있는 천연 당사슬의 혼합물로서는, 다음에 나타내는 당사슬 혼합물을 바람직하게 예시할 수 있지만, 시알로 당사슬이 포함되는 당사슬 혼합물이 특히 바람직하다.

상기 천연원료로부터 공지의 방법으로 당 단백질 및/또는 당 펩티드의 혼합물을 얻고, 해당 혼합물에 단백질 분해효소 등을 작용시켜서 펩티드 부분을 절단하고, 겔여과 칼럼이나 이온교환 칼럼 등을 사용한 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 당사슬 결합 아스파라긴의 혼합물을 사용할 수 있다.

또한, 예를 들면 생체의 조직이나 세포, 특히 배양조직이나 배양세포를 사용하여 배양액 중의 조직 또는 세포를 균질화(homogenizing)하고, 이어서 원심분리하여 얻어진 세포막 분획을 2-메르캅토에탄올로 처리한 후, N-글리카나아제(N-glycanase)를 작용시켜서 얻어진 당사슬의 혼합물을 사용할 수 있다.

또한, 배양조직이나 배양세포를 균질화하고, 원심분리한 상청을 채취함으로써 얻어진 유리 당사슬의 혼합물을 사용할 수 있다. 이들의 당사슬 중에는 중성 당사슬로서 고만노오스형 당사슬이나 다양한 시알로 당사슬을 포함하기 때문에, 각종 당사슬의 제조에 적합하다.

얻어진 당사슬 혼합물 중의 당사슬에 지용성기를 도입하여 당사슬 유도체의 혼합물로 한다.

지용성기는 당사슬의 환원 말단의 개환(開環) 알데히드, 당사슬 결합 아스파라긴의 아스파라긴아미노기 또는 카르복실기에 반응하여 형성되는 지용성을 갖는 치환기로서, 예를 들면 2-, 3- 또는 4-카르복시페닐아미노기, p-에톡시카르보닐페닐아미노기, 2-피리딜아미노기 등의 통상 형광표지로서 사용되는 치환기나 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기, tert-부톡시카르보닐(BOC)기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카르보닐기, 아세틸기 등의 카바메이트계 또는 아미드계 보호기로서 사용되는 치환기를 들 수 있다.

이들 지용성기의 도입은 공지의 방법으로 행할 수 있고, 조작의 간편함, 얻어지는 당사슬 유도체의 안정성, 여기광(勵起光)이 수은 광원이나 레이저 광원에 대응하고 있는 것 등으로부터 2-카르복시페닐아미노기, Fmoc기 또는 BOC기를 바람직하게 사용할 수 있다.

예를 들면, 2-아미노안식향산을 사용하여 시아노붕소화수소나트륨이나 디메틸아미노화붕소 등의 환원제의 존재하에서 당사슬과 반응시킴으로써 아미노알디톨 유도체로 할 수 있다.

또한, 예를 들면 9-플루오레닐메틸-N-숙신이미딜카보네이트를 사용하여 탄산수소나트륨 존재하, 당사슬 결합 아스파라긴과 반응시킴으로써 아스파라긴의 아미노기에 카바메이트와 같이 결합한 Fmoc기를 도입할 수 있다.

이상과 같은 조작으로, 지용성기가 도입된 당사슬 유도체의 혼합물을 얻을 수 있다.

얻어진 당사슬 유도체의 혼합물을 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피로 분리한다.

본 발명에 있어서의 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피는 시알산과 친화성을 갖는 세로토닌을 리간드로 하는 친화성 칼럼을 사용한다.

세로토닌 친화성 칼럼으로서는 세로토닌을 충전제에 고정화하여 제작해도 되고, 시판되고 있는 칼럼을 사용해도 된다. 시판의 칼럼으로서는 LA-세로토닌 칼럼(주식회사 J-오일밀즈제) 등을 들 수 있다.

크로마토그래피의 분리조건은 적절히 설정되는 것이지만, 그 일례를 들면, 형광검출기를 사용하여 여기파장 350 ㎚, 형광파장 425 ㎚, 유속 0.5 ㎖/min으로 하고, 이동상을 초순수와 초산암모늄 수용액을 사용하여 직선 구배 용출로 함으로써 분리를 달성할 수 있다.

세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피에 의해 당사슬 유도체의 혼합물을 당사슬 유도체의 시알산 잔기의 수에 따라서 분리할 수 있고, 시알산 잔기를 갖지 않는 아시알로 당사슬 유도체가 가장 빨리 용출되며, 이어서 모노시알로 당사슬 유도체, 디시알로 당사슬 유도체라고 하는 상태로 시알산 잔기 수의 증가에 비례하여 분리 용출할 수 있다.

이상과 같이 세로토닌 친화성 칼럼에 의해서 분리된 당사슬 유도체를, 폴리머 베이스의 아미노 칼럼 또는 실리카 베이스의 아미드 칼럼을 사용한 순상 HPLC로 처리함으로써, 매우 우수한 당사슬 유도체간의 분리를 가능하게 할 수 있다. 순상 크로마토그래피란, 아미노기, 아미노프로필기, 아크릴아미드기 등 극성 고정상을 충전제로서 사용하는 크로마토그래피로서, 시료성분의 고정상-이동상에 대한 시료성분의 분배도의 차를 토대로 분리가 달성되는 것을 특징으로 한다. 기본적으로 당사슬의 친수성을 토대로 분리되는 모드로서, 시알산이 결합된 당사슬의 이성체의 분리에도 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 희산(dilute acid)이나 뉴라미니다아제에 의해 처리된 아시알로형 당사슬의 분리에도 바람직하게 사용할 수 있다.

사용하는 폴리머 베이스의 아미노 칼럼으로서는, 아미노기를 폴리비닐알코올계 기재 겔 등의 폴리머에 결합시킨 고정상을 충전제로서 사용한 칼럼으로서, 스스로 제작해도 되지만, 시판되고 있는 칼럼을 사용해도 된다.

시판의 아미노 칼럼으로서는 Asahi Shodex NH2P-504E(쇼와덴코 주식회사제)를 들 수 있다.

실리카 베이스의 아미드 칼럼으로서는, 아크릴아미드 등의 아미드기를 실리카를 고정상으로 하는 충전제에 화학결합시켜서 도입한 칼럼으로서, 스스로 제작해도 되지만, 시판되고 있는 칼럼을 사용해도 된다.

시판의 아미드 칼럼으로서는 TSK-GEL Amide-80(TOSOH Corp제)을 들 수 있다.

크로마토그래피의 분리조건은 적절히 설정되는 것이지만, 그 일례를 들면, 형광검출기를 사용하여 여기파장 350 ㎚, 형광파장 425 ㎚, 유속 1 ㎖/min으로 하고, 이동상을 초산 함유 아세토니트릴과 초산 및 트리에틸아민 함유 수용액을 사용하여 직선 구배 용출로 함으로써 분리할 수 있다.

이상과 같이 단리하여 얻어지는 당사슬 유도체는 당 가수분해 효소의 적용, 질량분석법에 의한 분석으로 그 당사슬 구조를 해석할 수 있다.

당 가수분해 효소로서는 공지의 효소를 사용할 수 있고, 예를 들면 시알리다아제, 갈락토시다아제, 만노시다아제, N-아세틸글루코사미다아제, 푸코시다아제 등을 들 수 있다.

질량분석 방법으로서는 종래 공지의 질량분석법을 채용한 질량분석 장치에 의해서 이루어지지만, 최근 특히 당사슬 분석에 사용되고 있는 MALDI-TOF MS에 의해 측정하는 것이 바람직하다.

당사슬 구조를 해석하기 위해서는 특정 당 가수분해 효소를 작용시킨 후, 폴리머 베이스의 아미노 칼럼 또는 실리카 베이스의 아미드 칼럼을 사용한 순상 HPLC로 처리하고, 얻어진 분획을 질량분석하여 소실된 질량분과 가수분해 효소의 특성을 고려하여, 추가로 이 조작을 반복함으로써 당사슬 구조를 해석할 수 있다.

얻어지는 당사슬 유도체는 그 지용성기를 제거함으로써 각종 당사슬을 인공적으로 용이하고 또한 대량으로 얻을 수 있다.

지용성기의 제거는 종래 공지의 방법을 적용할 수 있다.

예를 들면, 2-카르복시페닐아미노기의 제거는 초산 중에서 과산화수소와 실온에서 반응시킴으로써 달성되고, 용이하게 유리형(遊離型) 당사슬로서 회수할 수 있다. 또한, Fmoc기의 제거는 N,N-디메틸포름아미드 중, 당사슬 유도체에 모르폴린을 첨가하여 반응시킴으로써 달성되고, BOC기의 제거에는 약산을 반응시킴으로써 달성된다.

당사슬이 당사슬 결합 아스파라긴인 경우, 무수 히드라진과 반응시킨 후 아세틸화하는 방법, 염기성 수용액 중에서 가열 환류한 후 아세틸화하는 방법 등에 의해 아스파라긴 잔기를 제거할 수 있다.

이와 같은 당사슬류는 의약품 개발 등의 분야에 있어서 매우 유용하고, 예를 들면 암의 백신 합성을 들 수 있으며, 얻어진 당사슬류를 화학적인 반응이나 당 전이효소에 의한 반응 등을 조합하여 새로운 당 잔기를 결합시키고 유도체화하여 신규 백신의 개발을 가능하게 한다.

본 발명자 등은 본 발명의 구조해석 방법 및 제조방법으로 각종 암세포 중에 지금까지 확인되지 않았던 하기 화학식 1~6으로 나타내어지는 당사슬을 단리하는 것에 성공하였다.

[화학식 중 R¹은 2-카르복시페닐기, 3-카르복시페닐기, 4-카르복시페닐기, p-에톡시카르보닐페닐기, 또는 2-피리딜기를 나타낸다. R²는 수산기, 기 -Asn 또는 기 -Asn-R³를 나타낸다. 여기서 Asn은 아스파라긴기를 나타내고, R³는 카바메이트계 또는 아미드계 보호기를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]

이들 신규한 당사슬은 암세포 중에 특이적으로 발현되는 것으로 생각되어, 이들 당사슬을 암 마커로서 이용할 수 있다.

예를 들면 이들 암세포 중의 특이적인 당사슬과 특이적으로 인식하는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체를 제작하고, 면역학적 수법으로 상기 당사슬의 검출을 행함으로써 이루어진다.

다중클론 항체는 상기 당사슬 또는 상기 당사슬의 합텐과 단백질 등의 고분자 화합물(담체)을 결합시킨 결합체를 항원으로 하여 마우스, 햄스터, 기니피그, 닭, 랫트, 토끼, 개, 염소, 양, 소 등의 포유동물을 면역 감작(感作)하고, 상기 포유동물로부터 혈액을 채취하여 다중클론 항체를 포함하는 항혈청을 조제할 수 있다.

단일클론 항체는, 예를 들면 항체생산 세포와 골수종 세포주의 세포융합에 의해 얻어지는 하이브리도마를 조제하여 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마를 배양하고, 생산되는 단일클론 항체를 정제하면 된다.

본 발명의 방법에 의하면, 특히 세포 또는 조직 중의 당사슬 혼합물을 상세하게 분리할 수 있고, 망라적으로 그 당사슬 구조를 해석하는 것을 가능하게 함으로써, 종래 알려져 있지 않았던 당사슬 및 그 기능을 탐구할 수 있어, 이후의 당사슬 연구에 있어서의 커다란 공헌을 기대할 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 얻어진 당사슬 유도체의 친화성 칼럼 크로마토그램이다.
도 2는 실시예 2에서 얻어진 당사슬 유도체의 친화성 칼럼 크로마토그램이다.
도 3은 실시예 3에서 얻어진 당사슬 유도체의 HPLC로의 크로마토그램이다.
도 4는 실시예 3에서 얻어진 당사슬 유도체의 HPLC로의 크로마토그램이다.
도 5는 실시예 3에서 얻어진 당사슬 유도체의 HPLC로의 크로마토그램이다.
도 6은 실시예 3에서 얻어진 당사슬 유도체의 HPLC로의 크로마토그램이다.
도 7은 실시예 3에서 얻어진 당사슬 유도체의 HPLC로의 크로마토그램이다.
도 8은 실시예 4에서 얻어진 당사슬 유도체의 친화성 칼럼 크로마토그램이다.
도 9는 실시예 5에서 얻어진 당사슬 유도체의 HPLC로의 크로마토그램이다.
도 10은 실시예 6에서 얻어진 당사슬 유도체의 친화성 칼럼 크로마토그램이다.
도 11은 실시예 7에서 얻어진 당사슬 유도체의 친화성 칼럼 크로마토그램이다.
도 12는 실시예 7에서 얻어진 당사슬 유도체의 HPLC로의 크로마토그램이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하에 참고예 및 실시예를 나타내지만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 세로토닌 친화성 크로마토그래피에 의한 인간 혈청 유래[1-산성 당 단백질(AGP)] 당사슬의 분리

인간 혈청 유래 AGP(시그마 알드리치 재팬제) 1 ㎎을 20 mM 인산 완충용액(pH 7.5) 50 ㎕에 용해하고, N-glycanase F(2 Unit, 4 ㎕)를 첨가하여 37℃에서 12시간 반응시켰다. 반응 후 100℃에서 3분간 끓여 원심분리 후의 상청을 회수하였다.

회수한 상청에 2-아미노안식향산(2-AA) 및 시아노수소화붕소나트륨을 각각 3%가 되도록 2% 붕산, 4% 초산나트륨 혼액(500 ㎕)에 용해하여 100 ㎕ 첨가하고, 80℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 50% 메탄올 수용액으로 평형화한 Sephadex LH-20 칼럼(0.7 ㎝ i.d., 30 ㎝)을 사용하여 분획하고, 분광광도계(히타치제, F-4010형)를 사용하여 여기파장 335 ㎚, 형광파장 410 ㎚로 각 분획을 측정하고, 최초로 용출되는 형광성 분획을 회수하여 당사슬 유도체의 혼합물로 하였다.

얻어진 혼합물을 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피에 제공하고, 분리한 당사슬 유도체를 얻었다. 친화성 칼럼 크로마토그래피로의 분리결과를 도 1에 나타낸다.

세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피의 조건

칼럼: LA-Serotonin 칼럼(4.6×150 ㎜, Japan Oil mills제)

펌프: JASCO PU-980형

유속: 0.5 ㎖/min

검출기: JASCO FP-920형 형광검출기

여기파장: 350 ㎚

형광파장: 425 ㎚

이동상: 용액 A로서 초순수, 용액 B로서 40 mM 초산암모늄 수용액을 사용하였다.

구배조건: 시료주입 후 2분간을 용액 B 5%로 하고, 37분 후에 초산암모늄 농도가 30 mM가 되도록 직선 구배 용출을 행한 후 10분간 40 mM가 되도록 행하였다.

또한, 세로토닌 친화성 크로마토그래피의 분리조건은 이하의 실시예에 있어서도 동일하게 하였다.

실시예 2 (인간 암세포 유래 당사슬의 세로토닌 친화성 크로마토그래피에 의한 분리)

세포배양

인간 신장 선암세포(human renal adenocarcinoma) ACHN, 인간 폐암세포 A549, 인간 위암세포 MKN45 및 인간 조직구성 림프종 U937을 사용하였다. ACHN 및 A549는 미리 50℃에서 30분간 가열함으로써 비동화(非動化)한 소 혈청[NEWBORN CALF SERUM(NCS), 시그마 알드리치 재팬제]을 10% 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 시그마 알드리치 재팬제)을 사용하고, U937 및 MKN45에서는 10% NCS를 포함하는 RPMI-1640(시그마 알드리치 재팬제)을 사용하여 5% CO₂ 존재하 37℃에서 조직배양 샬레 중에서 배양하였다. U937을 제외한 세포는 80% 컨플루언트 상태에서 배양 중의 세포를 등장화 인산 완충액(PBS)으로 세정한 후, 트립신 용액을 첨가하여 37℃에서 5분간 처리한 후, 박리된 세포를 회수하여 PBS로 세정한 후 계대배양하였다.

세포막 분획의 조제

세포막 분획의 조제에는 80% 컨플루언트 상태의 세포를 사용하고, 셀 스크레이퍼를 사용하여 배양기로부터 회수하였다. 회수한 세포는 PBS로 세정한 후, 1×10⁸ cell/5 ㎖의 농도가 되도록 1%의 프로테아제 억제제(protease inhibitor)를 포함하는 10 mM Na₂HPO₄(pH 7.5) 중 유리 균질화기(glass homogenizer)를 사용하여 균질화한 후, 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 20 mM의 Tris-HCl buffer(pH 7.5)를 10 ㎖ 첨가하고, 4℃, 3000 rpm으로 15분간 원심분리 후 상청을 회수한 후, 4℃, 19000 rpm으로 원심분리하여 얻어진 침전을 세포막 분획으로 하였다.

세포막 분획으로부터의 당사슬의 유리(遊離)

세포막 분획(1×10⁷ cell)에 1% SDS 용액 40 ㎕를 첨가하고, 2-메르캅토에탄올을 1%가 되도록 첨가한 후, 100℃의 비등 수욕조(boiling water bath) 상에서 5분간 가열함으로써 가용화를 행하였다. 막 분획을 포함하는 용액을 실온까지 냉각하여, NP-40을 1%가 되도록 첨가하고, 최종농도가 20 mM가 되도록 인산 완충액(pH 7.5)을 첨가하였다. 추가로, N-glycanase F 4 ㎕(2 Unit, Roche diagnostics제)를 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하여, 100℃의 비등 수욕조 상에서 5분간 끓이고, 95% 에탄올을 최종농도가 75%가 되도록 첨가한 후, 4℃, 15000 rpm으로 원심분리하여 상청을 감압 건고(乾固)하여, 세포막 유래 당사슬로 하였다.

조제한 각 세포막 유래 당사슬에 상기 실시예 1과 동일하게 2-AA를 도입한 후, 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 각 당사슬 유도체 분획을 얻었다. 칼럼 크로마토그래피로의 분리결과를 도 2에 나타낸다.

실시예 3 (순상형 아미드 칼럼에 의한 암세포 유래 당사슬의 분리 및 구조해석)

실시예 2에서 얻어진 각 분획의 암세포 유래 당사슬 유도체(1×10⁷ cell 상당)를 20 mM 초산 완충액(pH 5.0) 20 ㎕에 용해하고, 시알리다아제 4 ㎕(2 mU, 마루킨 바이오제)를 첨가하여 37℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후 100℃에서 3분간 끓이고, 원심분리 후의 상청을 회수하였다.

얻어진 상청을 아미드 칼럼을 사용한 순상 HPLC에 제공하고, 당사슬 유도체를 분취(分取)하였다. HPLC로의 분리결과를 도 3~7에 나타낸다.

HPLC 조건

칼럼: TSK-GEL Amide-80(TOSOH CORPORATION, Japan; 4.6 ×250 ㎜)

칼럼온도: 40℃

펌프: JASCO PU-980형

유속: 1 ㎖/min

검출기: JASCO FP-920형 형광검출기

여기파장: 350 ㎚

형광파장: 425 ㎚

이동상: 용액 A로서 0.2% 초산을 포함하는 아세토니트릴 용액, 용액 B로서 0.1% 초산 및 0.1% 트리에틸아민을 포함하는 수용액을 사용하였다.

구배조건: 시료주입 후 2분간을 용액 B 30%로 하고, 60분 후에 용액 B가 65%가 되도록 직선 구배 용출을 행하였다.

당 가수분해 효소와 질량분석법에 의한 구조해석

U937 유래의 피크 31의 당사슬 유도체를 20 mM 구연산 완충액(pH 3.5) 20 ㎕에 용해하고, β-갈락토시다아제 1 ㎕(25 mU, 세이카가쿠 고교사제)를 첨가하여 37℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후 100℃에서 3분간 끓여 원심분리한 후의 상청을 회수하였다. 얻어진 상청을 아미드 칼럼을 사용한 순상 HPLC에 제공하여 얻은 분획의 일부를 MALDI-TOF MS에 의해 분석하였다. 결과, 분자량 2718의 당사슬 유도체(a)가 얻어졌다.

그 당사슬 유도체(a)를 20 mM 구연산 완충액(pH 5.0) 20 ㎕에 용해하고, β-N-아세틸헥사미니다아제 1 ㎕(10 mU, 세이카가쿠 고교사제)를 첨가하여 37℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후 100℃에서 3분간 끓여 원심분리한 후의 상청을 회수하고, 얻어진 상청을 상기와 동일하게 분석한 결과, 분자량 1906의 당사슬 유도체(b)가 얻어졌다.

추가로 당사슬 유도체(b)를 β-갈락토시다아제로 처리한 결과, 분자량 1582의 당사슬 유도체(c)가 얻어졌다.

이상의 결과로부터, 피크 31은 하기 식으로 표시되는 당사슬 유도체인 것이 판명되었다.

동일하게 피크 35의 당사슬 유도체도 β-갈락토시다아제, β-N-아세틸헥사미니다아제, 이어서 β-갈락토시다아제로 처리하고, 하기 식으로 표시되는 당사슬 유도체인 것이 판명되었다.

다른 피크의 유도체에 대해서도 가수분해 효소를 적절히 사용하고, MALDI-TOF MS 분석 등을 행하여 도 3~7에 나타내는 피크에 상당하는 당사슬 구조를 표 1~5에 나타내었다. 또한, 표 1~14 중의 분자량은 당사슬 환원 말단에 2-아미노안식향산이 결합한 상태에서의 분자량(MW)을 나타내고, 기호는 다음의 것을 나타낸다.

Gal: D-갈락토오스, GlcNAc: N-아세틸글루코사민, Man: D-만노오스, Fuc: 푸코오스, 2-AA: 2-아미노안식향산, NeuAc: 시알산.

여기서 당사슬 환원 말단에 2-아미노안식향산이 결합한 당사슬, 예를 들면 다음 식으로 표시되는 당사슬 부분구조는 -4GlcNAcβ1-4GlcNAc-2-AA로 표기하기로 한다.

MALDI-TOF MS 분석

장치에는 보이저(Voyager) DE-PRO(PE Biosystems, Framingham, MA)를 사용하고, 리니어/음이온 모드에 의해 가속전압 20 kV, 그리드 전압 96.3%, 지연시간 1000 nsec, 렌즈 오프셋 1.25, 레이저 강도(질소 레이저) 2700으로 측정하였다. 물에 용해한 샘플 0.5 μL와 2,5-디히드록시벤조산(DHB)의 20 ㎎/mL 메탄올 용액 0.5 μL를 혼화하고, 건조한 후, 측정용 시료로서 사용하였다.

실시예 4 (세포내에 존재하는 유리 당사슬 1)

인간 위암세포 MKN45를 PBS로 세정한 후, 1×10⁸ cell/5 ㎖의 농도가 되도록 유리 균질화기를 사용하여 1%의 프로테아제 억제제를 포함하는 10 mM Na₂HPO₄(pH 7.5) 중에서 균질화한 후, 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 20 mM의 Tris-HCl buffer(pH 7.5)를 10 ㎖ 첨가하고, 4℃, 3000 rpm으로 15분간 원심분리 후 상청을 모아, 추가로 4℃, 19000 rpm으로 원심분리하고, 그 상청을 감압 건고하여 유리형 당사슬 혼합물을 얻었다.

얻어진 유리형 당사슬 혼합물에 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게, 2-AA를 도입하여 유리형 당사슬 유도체의 혼합물을 얻고, 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피로 분획하여 유리형 당사슬 유도체를 얻었다.

친화성 칼럼 크로마토그래피에 의한 분리결과를 도 8에 나타낸다.

얻어진 각 분획을 아미노 칼럼을 사용한 순상 HPLC로 분리하고, 유리형 당사슬 유도체를 얻었다.

HPLC 조건

칼럼: Asahi Shodex NH2P-50 4E(Showa Denko, Tokyo, Japan; 4.6×250 ㎜)

칼럼 온도: 50℃

펌프: JASCO PU-980형

유속: 1 ㎖/min

검출기: JASCO FP-920형 형광검출기

여기파장: 350 ㎚

형광파장: 425 ㎚

이동상: 용액 A로서 2% 초산을 포함하는 아세토니트릴 용액, 용액 B로서 5% 초산 및 3% 트리에틸아민을 포함하는 수용액을 사용하였다.

구배조건 : 시료 주입 후 2분간을 용액 B 30%로 하고, 80분 후에 용액 B가 95%가 되도록 직선 구배 용출을 행하여 100분까지 용액 B를 95%가 되도록 유지하였다.

얻어진 유리형 당사슬 유도체를 당 가수분해 효소(시알리다아제, α-만노시다아제, β-갈락토시다아제, β-N-아세틸헥사미다아제 등)를 적절히 작용시켜 상기 아미노 칼럼을 사용한 순상 HPLC로 분리한 후, 얻어진 분획을 동결건조한 후, MALDI-TOF MS로 분석함으로써 유리형 당사슬 유도체의 구조를 해석하였다.

또한, α-만노시다아제로의 처리는 당사슬 유도체를 20 mM 구연산 완충액(pH 4.5) 20 ㎕에 용해하고, α-만노시다아제 2 ㎕(10 mU, 세이카가쿠 고교사제)를 첨가하여 37℃에서 24시간 반응시키고, 반응 후 100℃에서 3분간 끓여서 원심분리 후의 상청을 회수함으로써 이루어진다. 그 밖의 당 가수분해 효소로의 처리는 상기 실시예에서의 기재와 동일하게 하였다. 얻어진 당사슬 유도체를 표 6 및 7에 나타낸다.

표 6 및 7의 유리형 당사슬은 신규 화합물로서, 예를 들면 No.1의 분자량 1321인 당사슬 유도체는 하기 식으로 표시된다.

실시예 5 (세포내에 존재하는 유리 당사슬 2)

인간 위암세포 MKN45 대신에 인간 T세포 림프종 Jurkat27(당사슬 도입 세포주)을 사용한 것 이외에는, 실시예 4와 동일하게 조작하여 유리형 당사슬 혼합물을 얻었다.

얻어진 유리형 당사슬 혼합물에 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 2-AA를 도입하여 유리형 당사슬 유도체의 혼합물을 얻고, 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피로 분획하여 유리형 당사슬 유도체를 얻었다.

얻어진 각 분획을 아미드 칼럼을 사용한 순상 HPLC로 분리하여, 유리형 당사슬 유도체를 얻었다.

HPLC 조건

칼럼: TSK-GEL Amide-80(TOSOH CORPORATION, Japan; 4.6×250 ㎜)

칼럼 온도: 40℃

펌프: JASCO PU-980형

유속: 1 ㎖/min

검출기: JASCO FP-920형 형광검출기

여기파장: 350 ㎚

형광파장: 425 ㎚

이동상: 용액 A로서 0.1% 초산을 포함하는 아세토니트릴 용액, 용액 B로서 0.2% 초산 및 0.2% 트리에틸아민을 포함하는 수용액을 사용하였다.

구배조건 : 시료 주입 후 2분간을 용액 B 30%로 하고, 60분 후에 용액 B가 65%가 되도록 직선 구배 용출을 행하였다.

HPLC로의 분리결과를 도 9에 나타낸다.

얻어진 유리형 당사슬 유도체를 실시예 4와 동일하게 조작하여 유리형 당사슬 유도체의 구조를 해석하였다. 얻어진 당사슬 유도체를 표 8에 나타낸다.

실시예 6 (인간 자궁경부암 세포의 당사슬)

인간 자궁경부암 세포 HeLa를 미리 50℃에서 30분간 가열함으로써 비동화한 NCS를 10% 포함하는 DMEM을 사용하여 배양하였다. 80% 컨플루언트 상태에 있어서, 배양 중의 세포를 PBS로 세정한 후, 트립신 용액을 첨가하여 37℃에서 5분간 처리한 후, 박리된 세포를 회수하여 PBS로 세정 후 계대배양하고, 실시예 2에 기재된 세포막 분획의 조제, 세포막 분획으로부터의 당사슬의 유리와 동일하게 처리하여 세포막 유래의 당사슬 혼합물을 얻고, 상기 실시예 1과 동일하게 2-AA를 도입한 후, 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피로 처리하여, 각 당사슬 유도체 분획을 얻었다.

칼럼 크로마토그래피로의 분리결과를 도 10에 나타낸다.

얻어진 아시알로 당사슬 유도체 분획, 모노시알로 당사슬 유도체 분획 및 디시알로 당사슬 유도체 분획을 시알리다아제 처리한 후, 아미노 칼럼을 사용한 순상 HPLC로 분리하여 당사슬 유도체를 얻었다. HPLC 조건은 실시예 4와 동일하게 하였다.

얻어진 당사슬 유도체를 당 가수분해 효소(시알리다아제, α-만노시다아제, β-갈락토시다아제, β-N-아세틸헥사미니다아제 등)를 적절히 작용시켜 상기 아미노 칼럼을 사용한 순상 HPLC로 분리한 후, 얻어진 분획을 동결건조한 후, MALDI-TOF MS로 분석함으로써 당사슬 유도체의 구조를 해석하였다.

얻어진 당사슬 유도체를 표 9~12에 나타낸다.

실시예 7 (암세포 특이적 항원 CD98의 당사슬)

면역침강법에 의한 CD98 - HC 의 조제

프로테인 A-아가로오스 50 ㎕(시그마 알드리치 재팬제)를 PBS 200 ㎕에 의해 세정한 후, PBS 50 ㎕ 및 항 CD98 항체를 10 ㎍/10 ㎕ 첨가하고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 반응 후 PBS 1 ㎖에 의해 비흡착성분을 제거하고, 항 CD98 항체 고정화 아가로오스를 얻었다. 항 CD98 항체 고정화 아가로오스에 1% NP-40(400 ㎕)에 의해 가용화한 HeLa 세포의 막 분획(2×10⁷ cell)을 첨가하고, 로터리 셰이커를 사용하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 그 후, PBS를 1 ㎖에 의해 세정하고, 비흡착성분을 제거하여 원심분리한 후, 항 CD98 항체 고정화 아가로오스에 해리용액(250 mM Tris-HCl buffer pH 6.8/4.6% SDS, 20% Glycerin)과 2-메르캅토에탄올의 9:1 혼액을 20 ㎕ 첨가하고, 5분간 끓여서 15000 rpm으로 원심한 상청을 CD98-HC로 하여 SDS-PAGE에 제공하였다.

SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동

겔 전기영동 장치 및 전원은 모두 Bio Rad제를 사용하였다. 영동 겔은 7.5% 겔을 사용하였다. 영동 완충액으로서 25 mM 트리스, 198 mM 글리세린, 1%(w/v) SDS를 사용하여 행하였다. 최초의 1시간은 겔 1장당 5 mA로, 계속해서 10 mA로 겔 하변부까지 영동을 행하였다.

쿠마시 브릴리언트 블루 ( Coomassie Brilliant Blue ) 염색

SDS-Page 종료 후, 40%(v/v) 메탄올, 10%(v/v) 초산 / 0.2% Coomassie Brilliant Blue R250 중에서 단백질의 염색을 행하였다. 1시간 후, 메탄올:초산:물(=4:1:5)을 사용하여 탈색하였다.

웨스턴 블롯(Western Blot)

SDS-PAGE 후의 겔을 BIO-RAD제 세미드라이식 블로팅 장치(트랜스 블롯 SD셀)를 사용하여 겔 중의 단백 시료를 PVDF막으로 전사하였다. PVDF막은 미리 메탄올에 60초 침지한 후, 48 mM 트리스, 39 mM 글리신, 20% 메탄올(pH 9.0)에 1시간 침지한 것을 사용하고, 100 mA 정전류로 1시간 전압을 인가하여 전사를 행하였다. 전사 후, PVDF막을 5% 스킴 밀크 및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 블로킹 조작을 행한 후, 항 CD98 항체 5 ㎍을 포함하는 0.05% Tween 20/PBS(5 ㎖)를 첨가하여 하룻밤 반응시켰다. 반응 후, PVDF막을 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(20 ㎖)로 4회 세정한 후, HRP 표지 프로테인 A 5 ㎕를 포함하는 0.05% Tween 20/PBS(5 ㎖)를 첨가하여 1시간 반응시켰다. 반응 후, PVDF막을 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(20 ㎖)로 4회 세정하고, 0.05% DAB(3,3'-Diaminobenzidrine tetrahydrochloride)를 포함하는 100 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 0.0031% 과산화수소용액 20 ㎖를 첨가하여 발색시켰다.

N- glycanase F에 의한 겔내 소화

CBB 염색에 의해 밴드를 확인한 후 탈색액을 물로 치환하고, 목적하는 밴드를 잘라내어 에펜도르프 튜브(Ependorf tube)에 넣었다. 그 후 아세토니트릴 100 ㎕를 첨가하여 30분간 방치함으로써 겔을 탈수하고, 아세토니트릴을 제거한 후 2 units의 N-glycanase F를 포함하는 Tris-HCl buffer pH 7.5를 100 ㎕ 첨가하여 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하고 당사슬을 잘라내었다. 그 후, 추출액을 회수하고 추가로 물 200 ㎕를 첨가하여 30분간 교반하고 겔로부터 당사슬 혼합물을 얻었다.

이상과 같이 하여 얻어진 당사슬 혼합물에 상기 실시예 1과 동일하게 2-AA를 도입한 후, 세로토닌 친화성 칼럼 크로마토그래피로 처리하여, 각 당사슬 유도체 분획을 얻었다.

칼럼 크로마토그래피로의 분리결과를 도 11에 나타낸다.

얻어진 모노시알로 당사슬 유도체 분획 및 디시알로 당사슬 유도체 분획을 시알리다아제 처리한 후, 아미노 칼럼을 사용한 순상 HPLC로 분리하여 당사슬 유도체를 얻었다. HPLC 조건은 실시예 4와 동일하게 하였다. HPLC로의 분리결과를 도 12에 나타낸다.

얻어진 당사슬 유도체를 당사슬 가수분해 효소(시알리다아제, α-만노시다아제, β-갈락토시다아제, β-N-아세틸헥사미니다아제 등)를 적절히 작용시켜 상기 아미노 칼럼을 사용한 순상 HPLC로 분리한 후, 얻어진 분획을 동결건조한 후, MALDI-TOF MS로 분석함으로써 당사슬 유도체의 구조를 해석하였다.

얻어진 당사슬 유도체를 표 13~14에 나타낸다.

Claims

하기 표에 나타내어지는 당사슬 유도체[화학식 중, R⁴는 2-카르복시페닐기, 3-카르복시페닐기, 4-카르복시페닐기, p-에톡시카르보닐페닐기, 2-피리딜기, 기-Asn, 또는, 기-Asn-R⁵를 나타낸다. Asn은 아스파라긴기를 나타내고, R⁵는 카바메이트계 또는 아미드계 보호기를 나타내며, Ac는 아세틸기를 나타낸다].