JP3495378B2 - カゼイノグリコペプチドの製造及び精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、種々の生理活性を有す
るカゼイノグリコペプチドの新規な製造方法並びにその
構成成分であるシアロ型−カゼイノグリコペプチド及び
アシアロ型−カゼイノグリコペプチドの新規な分離方
法、およびこれらの方法により得られるカゼイノグリコ
ペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ホエーはチーズやカゼインの製造工程で
全世界的に大量に生産されており、ラクトース、ホエー
タンパク質、ビタミン及びミネラルを含む、有用な食品
素材である。しかしながら、ホエーの利用は家畜飼料、
育児用調製粉乳、菓子材料及び飲料などへの「１次素
材」としての利用に限定されており、欧米ではその多く
が廃棄されて環境汚染に深刻な問題を投じている。

【０００３】チェダーチーズなどの熟成チーズの製造工
程で排出される甘性ホエー（ｓｗｅｅｔ ｗｈｅｙ）中
には、主要なタンパク質成分としてのβ−ラクトグロブ
リン及びαーラクトアルブミンの他に、レンネット処理
によりκ−カゼインから生じたカゼイングリコペプチド
（１０６−１０９残基、以下「ＣＧＰ」と略す）が含ま
れており、これはシアル酸を結合しているシアロ−ＣＧ
Ｐとシアル酸を結合していないアシアロ−ＣＧＰからな
る。ＣＧＰはカゼインやフレッシュチーズの製造工程で
排出される酸性ホエーには全く含まれていない。

【０００４】近年、牛乳タンパク質のプロテアーゼ消化
物から、続々と生物活性を有する“ｂｉｏａｃｔｉｖｅ
ｐｅｐｔｉｄｅｓ”が見い出されている。例えば、オ
ピオイドペプチドとしてのカゾモルフィンやカゾキシン
及びミネラルキャリアーとしてのカゼインホスホペプチ
ドである。ＣＧＰもまた、種々の生物活性を有する糖ペ
プチドであり、すでにインフルエンザウイルスに対する
抗活性、コレラトキシンに対する中和活性が知られてい
る。最近では、イヌの食欲を減少させる新しい活性が見
い出され（Ｓｔａｎ ＆ Ｇｒｏｉｓｍａｎ，Ｂｕｌｌ
ｅｔｉｎ ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９６，８８９（１９
８３））、食欲調節機構の解明に興味が持たれるととも
に、欧米では大きな問題である「肥満防止食品」の開発
等につながると注目されている。

【０００５】これまでに、ＣＧＰを製造する方法がいく
つか提案されている。例えば、カゼイン溶液からレンネ
ットカゼインカードを調製する際に得られる排出液を原
料とし、この排出液のｐＨを酸性にすることによって生
成する沈澱を除去し、得られた上澄みを脱塩処理してＣ
ＧＰを製造する方法（特開昭６３−２８４１９９号公
報）、ＣＧＰを含有する乳質原料物質をｐＨ４未満に調
整した後、分画分子量１０，０００〜５０，０００の膜
を用いて限外濾過処理を行って得られた濾過液を分画分
子量５０，０００以下の膜を用いて濃縮する方法（特開
平２−２７６５４２号公報）がある。また、酸カゼイン
を出発原料として粗ＣＧＰを調製し、これをセロトニン
カラムクロマトグラフィーを利用して精製することによ
って、シアロ型（シアル酸を結合する）−ＣＧＰを得る
方法も提案されている（日本農芸化学会講演要旨集６３
巻３号・ｐ．２５５／講演番号３Ｃｐ１５）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記従
来方法によってＣＧＰの製造若しくは精製を行う場合、
次のような問題点があり商業ベースの生産には適さなか
った。

【０００７】（１）カゼインのレンネット処理液を利用
する方法においては、普通のチーズホエーを原料とする
のと異なり、ＣＧＰを得るために他の成分を犠牲にする
など、商業ベースでみた場合、問題がある。

【０００８】（２）限外濾過膜を用いる方法において
は、膜処理のみでは高純度のＣＧＰが得られない。

【０００９】（３）セロトニンカラムは、シアル酸、特
にＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）に特異的
なアフィニテイーを持ち、シアル酸残基数に基づく分離
が可能である。しかし、ＣＧＰのマクロスケールでの分
取を考えると、カラムの吸着量は微量であり、かなり大
型のカラムを必要とすることが予想される。更に、カラ
ムからの溶出には５０ｍＭＮａＣｌの高塩濃度（緩衝）
液を用い、最終的なＣＧＰの精製には脱塩操作を行わな
ければならない。

【００１０】一方、チーズの製造工程で副産物として大
量に生産されるチーズホエーからＣＧＰを安価にかつ工
業的規模で調製する方法は、大量に混在する他成分の影
響で、未だ確立していなかった。

【００１１】更に、前記精製方法よりも優れたシアロ−
ＣＧＰ及びアシアロ−ＣＧＰの分離精製方法も確立して
いなかった。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、各分野で需
要が見込まれるＣＧＰの工業的な調製方法とともに、シ
アリダーゼ（ＥＣ３．２．１．１８）に対する基質とし
てのシアロ−ＣＧＰとエンド−α−Ｎ−アセチルガラク
トサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．９７）に対する基質
としてのアシアロ−ＣＧＰの効率的な分離精製方法を確
立すべく鋭意研究を重ねた。その結果、ＣＧＰを含有す
るチーズホエー等を出発物質とし、ホエータンパク質を
熱凝固した後、アルコール処理、イオン交換クロマトグ
ラフィーによる処理などを施すことによって、高濃度の
ＣＧＰを工業的規模で製造することができることを見い
出した。また、このようにして得られたＣＧＰをピーナ
ッツレクチンアフィニティークロマトグラフィーにかけ
ることによって、シアロ−ＣＧＰとアシアロ−ＣＧＰに
分離できることをも見い出した。本発明はこのような知
見に基づいて完成したものである。

【００１３】すなわち、本発明は、ＣＧＰを含有するチ
ーズホエー、ホエータンパク質、ホエーミネラル等を出
発物質とし、この出発物質のｐＨを３〜６に調整し、加
熱・冷却してアルコール（エタノールが好ましい）を添
加後、一定時間静置した混合物を遠心分離し、上澄み液
をイオン交換クロマトグラフィーにかけて吸着・溶離し
て得られた液を濃縮することを特徴とするＣＧＰの製造
方法および当該方法により得られるＣＧＰである。

【００１４】更に、本発明は、上記の製造方法で得られ
たＣＧＰをレクチンアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーにより、シアロ−ＣＧＰ及びアシアロ−ＣＧＰに
分離することを特徴とするＣＧＰの精製方法並びに当該
方法により得られるＣＧＰである。レクチンには、ピー
ナッツレクチン、マッシュルームレクチン、ヒママメＲ
ＣＡ₆₀レクチンなどがあるが、ピーナッツレクチンが特
に好ましい。

【００１５】以下に、本発明の基礎となった実験を記す
ことによって、本発明を更に詳細に説明する。

【００１６】

【実験例】材料と方法 （材料） 出発物質としては、ホルスタインーフリージアン乳牛の
乳から製造した市販の甘性チーズホエー粉末（四ツ葉乳
業株式会社製、以下「ＣＷＰ」と略す）を用いた。イオ
ン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ ６５０Ｍ（トーソー株式会社製）を使用した。
ＣＧＰの精製に用いるアフィニティークロマトグラフィ
ーの充填剤としては、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈ
ｙｐｏｇｏｅａ）レクチン（ＰＮＡ）−セファロース４
Ｂ（アガロースゲル１ｍｌ中に５．０ｍｇのＰＮＡを含
有、豊年製油株式会社製）を入手した。ＨＰＬＣによる
ＣＷＰとＣＧＰの分析に際して対照として用いたＣＧＰ
は、本発明者らが先に報告した方法により調製した（Ｓ
ａｉｔｏ，Ｔ．，Ｔ．Ｉｔｏ，ａｎｄ Ｓ．Ａｄａｃｈ
ｉ．１９８０．ウシ初乳から得たＮ−アセチルグルコサ
ミン含有テトラサッカライドの化学的構造．Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．６７３：４８７；
Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｔ．Ｉｔｏｈ，Ｓ．Ａｄａｃｈｉ，
Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，ａｎｄ Ｔ．Ｕｓｕｉ．１９８１．
ウシ初乳κ−カゼインから得られた中性及び酸性糖鎖の
化学構造．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ．６７８：２５７； Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｔ．Ｉｔｏ
ｈ，Ｓ．Ａｄａｃｈｉ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，ａｎｄ
Ｔ．Ｕｓｕｉ．１９８２．分娩時に採取したウシ初乳κ
−カゼインから単離した新しいヘキササッカライド．Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７１９：３
０９）。α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）及びβ−ラ
クトグロブリン（β−Ｌｇ）はシグマ（Ｓｉｇｍａ）社
（米国）から、ウシ血清免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は
バイオプロダクツ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）社（ベル
ギー）からそれぞれ購入した。

【００１７】（分析方法）後記のＣＧＰの単離（予備実
験I〜V）、アフィニティークロマトグラフィーによるシ
アロ−ＣＧＰ及びアシアロ−ＣＧＰの分離並びにアシア
ロ−ＣＧＰの調製に際しては、次のような分析方法及び
分析条件を採用した。

【００１８】１２％ＴＣＡに溶ける総（粗）タンパク質
及び非タンパク質窒素（ＮＰＮ）は、ミクロケルダール
（ｍｉｃｒｏ−Ｋｊｅｌｄａｈｌ）法（Ｎファクター＝
６．３８）によって定量した。中性糖の含有量はフェノ
ール−Ｈ₂ＳＯ₄反応（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．，Ｋ．Ａ．Ｇ
ｉｌｌｅｓ，Ｊ．Ｋ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｐ．Ａ．Ｒｅ
ｂｅｒｓ，ａｎｄ Ｆ．Ｓｕｍｉｔｈ．１９５６．糖類
及び関連物質の比色定量法．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２
８：３５０）により、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸：以下「ＮＡＮＡ」と略す）はアミノフ（Ａｍｉｎ
ｏｆｆ）の方法（Ａｍｉｎｏｆｆ，Ｄ．１９６１．Ｎ−
アセチルノイラミン酸の諸定量方法及びそれらの唾液ム
コイド類の加水分解物への応用．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
８１：３８４）によりそれぞれ測定した。ＣＧＰの糖組
成はクランプら（Ｃｌａｍｐ ｅｔａｌ）の方法（Ｃｌ
ａｍｐ，Ｊ．Ｒ．，Ｇ．Ｄａｗｓｏｎ，ａｎｄ Ｌ．Ｈ
ｏｕｇｈ．１９６７．グリコペプチド類及びグリコプロ
テイン類中の６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース（Ｌ−フ
コース）、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、２−ア
セトアミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミン）及びＮ−アセチルノイラミン
酸（シアル酸）の同時定量．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４８：３４２）を利用してガスク
ロマトグラフィー（以下「ＧＬＣ」と略す）によって分
析した。メタノール分解及びＧＬＣは、上記（材料）の
項で述べたＨＰＬＣによるＣＷＰとＣＧＰの分析に際し
て用いた条件と同じ条件で行った。

【００１９】種々のｐＨ条件におけるＣＷＰの加熱は、
密栓した中ビンの中で１０％（ｗ／ｖ）溶液により９８
℃で１時間行った。ＣＷＰ溶液のｐＨ調整は、１ＮＨＣ
ｌ又は１ＮＮａＯＨを用いて行った。遠心分離は９００
０Ｇで３０分間実施し、変性タンパク質成分を除去し
た。

【００２０】上澄み液中におけるペプチド成分のイオン
交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ ６５０Ｍカラム（１．６×２０ｃｍ）を用いて、
炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）の０．０２
−１．０モル濃度勾配により行った。溶出液は、ペプチ
ド（２１０ｎｍ）及びヘキソース（４９０ｎｍ）をチェ
ックした。ＣＧＰフラクションは、減圧下で２度蒸発濃
縮させてアンモニウム塩を除去し、次いで凍結乾燥し
た。

【００２１】（逆相高速液体クロマトグラフィー）ＣＷ
Ｐ及びＣＧＰの分析は、日立モデル６３８−３０クロマ
トグラフを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣ）によって実施した。このクロマトグラフ
には、日立ＵＶ検出器、ヒューレット−パッカード積分
器モデル３３９０Ａ及びアサヒパックＯＤＰ−５０カラ
ム（ポリマー上Ｃ₁₈、粒子径５μｍ、６．０×２５０ｍ
ｍ、旭化学工業株式会社製）が備え付けられている。移
動相としては、０．０５％ＴＦＡを含有する１０％及び
６０％アセトニトリル（ＣＨ₃ＣＮ）水溶液を用いた。
分析は、５０℃の温度下、３０分（０．５ｍｌ／分）又
は６０分（０．３ｍｌ／分）に渡って、１０から６０％
のＣＨ₃ＣＮ勾配で行った。カラム溶出液はペプチドを
検出するため２１０ｎｍでモニターした。

【００２２】（アフィニティークロマトグラフィー）全
ＣＧＰは最終的には、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）−
セファロース４Ｂを用いたアフィニティークロマトグラ
フィーによって分画した。１０ｍＭリン緩衝液（ｐＨ
７．２）に溶解したＣＧＰ（５０ｍｇ）を、同じ緩衝液
で平衡させたＰＮＡカラム（２０ｍｌ）にかけた。シア
ロ−ＣＧＰはこのカラムに吸着されず、吸着したアシア
ロ−ＣＧＰは、０．２ＭのＤ−ガラクトース（Ｇａｌ）
又はラクトースを含む同じ緩衝液でカラムから溶出し
た。溶出液は、ペプチド（２１０ｎｍ）とシアル酸の存
在をチェックした。得られたシアロ−ＣＧＰ分画及びア
シアロ−ＣＧＰ分画は蒸留水中で透析し、次いで凍結乾
燥した。

【００２３】結果及び考察（ＣＧＰの単離）予備実験I
として、１０％（ｗ／ｖ）ＣＷＰ溶液を３つの異なるｐ
Ｈ条件（ｐＨ５．０，７．０及び９．０）で１時間加熱
（９８℃）し、次いで遠心分離（９０００Ｇ、３０分）
した。表１は、上澄液中の総タンパク質、ＮＰＮ及びホ
エータンパク質の含有率を示す。この表において、コン
トロールとはＣＧＰの１０％（ｗ／ｖ）溶液（ｐＨ５．
８，非加熱）である。ホエータンパク質の含有率は、総
タンパク質含有率からＮＰＮを差し引くことによって算
出した。ＮＰＮの含有率は３つのｐＨ条件下でほとんど
同じであった。上澄液中に残存するホエータンパク質の
含有量は、ｐＨ５で最も低かった（３．０１％）。ＣＧ
Ｐ単離に好適なｐＨ値は酸性のｐＨ範囲であった。

【００２４】

【表１】

【００２５】予備実験IIとして、１０％ＣＷＰ溶液を７
つの異なるｐＨ条件（ｐＨ１．０−７．０）で１時間加
熱（９８℃）し、次いで遠心分離した。上澄液中のＣＧ
Ｐ含有量は高速液体クロマトグラム上のピーク面積を比
較することによって求めた。図１は、ＣＷＰの０．１％
溶液（ｐＨ５．８、非加熱）及びＣＧＰ標準液（材料の
項を参照）の典型的なＨＰＬＣ溶出のピーク図を示す。
図１の（Ａ）は甘性チーズホエーの、（Ｂ）はＣＧＰ標
準液のクロマトグラムであり、これらは、２０μｌのサ
ンプル（０．１％）をカラム（アサヒパックＯＤＰ−５
０）にかけて得られたものである。図中の点線はＣＨ₃
ＣＮの濃度を示す。ＣＧＰはクロマトグラム上に５つの
ピーク（ピークＮｏ．１−５）を与え、他のホエータン
パク質であるＢＳＡ（ピークＮｏ．９）、α−Ｌａ（ピ
ークＮｏ．１０）及びβ−Ｌｇ（ピークＮｏ．１１）か
ら別個に溶出された。ＣＧＰのこのような複数ピーク
は、特に多くのＮＡＮＡ残基を有する結合糖鎖の微不均
一性（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）から生
じるものと考えられる（Ｄｏｉ，Ｈ．，Ｆ．Ｉｂｕｋ
ｉ，ａｎｄ Ｍ．Ｋａｎａｍｏｒｉ．１９７９．還元ウ
シκ−カゼインの微不均一性．Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃ
ｉ．６２：１９５；Ｖｒｅｅｍａｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｓ．Ｖ
ｉｓｓｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｓｌａｎｇｅｎ，ａｎｄ Ｊ．
Ａ．Ｍ Ｖａｎ Ｒｉｅｌ．１９８６．高速ゲル透過ク
ロマトグラフィーにより決定されたウシκ−カゼインフ
ラクションの特徴並びに炭水化物不含及び炭水化物含有
フラクション由来のキモシンによる遊離マクロペプチド
の速度論．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４０：８７）。表２
は、種々のｐＨで加熱した後の７つの上澄み液中におけ
るＣＧＰ含有率の変化を示す。表中のコントロールは１
０％（ｗ／ｖ）ＣＷＰ溶液（ｐＨ５．８、非加熱）を意
味する。表２のＣＧＰの値は、上澄液中に残存するタン
パク質に含まれるＣＧＰの相対百分率（ＨＰＬＣ分析に
より算出）を表す。ＣＧＰ含有率の最も高い比率（３
９．６０％）はｐＨ６．０で得られ、この値は元のＣＷ
Ｐに含まれていた値（１２．６７％）の約３倍であっ
た。

【００２６】予備実験IIIとして、１０％ＣＷＰ溶液を
予備実験IIの場合と同じ方法で加熱し、次いで同じ容量
の冷エタノールを加えた。４℃で３時間静置した後、沈
澱物を遠心分離により除去し、上澄液に含まれる残存タ
ンパク質中のＣＧＰ比率をＨＰＬＣにより分析した。こ
の処理は、初乳から牛乳オリゴサッカライドを調製する
際に、母液からラクトースとホエータンパク質を除去す
るために、本発明者らの先の報文においてしばしば使用
している方法である（Ｕｒａｓｈｉｍａ，Ｔ．，Ｔ．Ｓ
ａｉｔｏ，Ｊ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ａｎｄ Ｈ．Ａｒ
ｉｇａ．１９８９．羊（Ｂｏｏｒｏｏｌａ ｄｏｒｓｅ
ｔ）の初乳から単離された新しいガラクトシルラクトー
ス含有α−グリコシド結合．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ．９９２：３７５； Ｕｒａｓｈｉｍ
ａ，Ｔ．，Ｔ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｈ．Ａｒｉｇａ，ａ
ｎｄ Ｔ．Ｓａｉｔｏ．１９８９．ウマ初乳から得られ
た中性オリゴサッカライドの構造決定．Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒ．Ｒｅｓ．１９４：２８０）。エタノール添加後の
７つのサンプル中におけるＣＧＰ比率の変化を表２に示
した。ＣＧＰの最も高い比率（８３．７６％）はやはり
ｐＨ６．０で得られ、その値は予備実験IIにおいてエタ
ノールを加えなかった場合の値（３９．６０％）より２
倍以上も高くなった。

【００２７】予備実験IVとして、１０％ＣＷＰ溶液を予
備実験IIの場合と同じ方法で加熱し、次いで同じ容量の
２４％ＴＣＡを加えた。遠心分離（９０００Ｇ、３０
分）後、上澄液を蒸留水（この際、蒸留水は数度取り替
えた）中で２日間透析し、それから、凍結乾燥した。種
々のｐＨで加熱したＣＷＰ由来ＣＧＰのシアル酸（ＮＡ
ＮＡ）含有率を表２に示す。ＮＡＮＡ含有率は、上述の
アミノフ（Ａｍｉｎｏｆｆ）の方法で定量した。ＣＧＰ
のＮＡＮＡ含有率は、ｐＨ６．０より高いｐＨで加熱し
ても変化しなかった。ｐＨ５．０及び４．０において
は、それぞれ２６．８７％及び７０．８２％のＮＡＮＡ
が遊離された。ＮＡＮＡの完全な遊離はｐＨ３．０以下
で起こった。したがって、本来のＣＧＰを得るための最
も好適なｐＨ条件及び全ＣＧＰをアシアロ型に変換させ
るための最も好適なｐＨ条件は、それぞれｐＨ６．０及
びｐＨ３．０であることが示唆された。

【００２８】

【表２】

【００２９】予備実験Vとして、１０％ＣＷＰ溶液をｐ
Ｈ６．０にして１時間加熱（９８℃）し、次いで遠心分
離（９０００Ｇ、３０分）した上澄み液のｐＨを１ＭＮ
Ｈ₄ＯＨで９．０に調整した後、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ ６５０Ｍを用いたイオン交換クロマトグラフ
ィーによって、得られた上澄液の５０μｌをカラム
（１．６×２０ｃｍ）にかけてペプチド及びタンパク質
成分の分画を実施した。この際、溶出は０．０２−１．
０Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ５．０）の濃度勾配法
によって行った。図２は、濃度勾配法を用いた溶出クロ
マトグラムを示す。点線は、用いた炭酸水素アンモニウ
ム濃度の濃度勾配を示す。白丸は２８０ｎｍにおける吸
光度（タンパク質）、黒丸は４９０ｎｍにおける吸光度
（ヘキソース）を表す。ラクトースはカラムに吸着され
なかった。カラムに吸着されたＣＧＰは、ヘキソースと
ＮＡＮＡの両方が有する２つのピーク部分に溶出され
た。ホエータンパク質は、０．３５Ｍよりも高い濃度の
炭酸水素アンモニウムによってＣＧＰピークに続いてカ
ラムから溶出された。ホエータンパク質からＣＧＰを分
離・回収するのに最も好適な炭酸水素アンモニウムの濃
度は０．３Ｍであると見られた。

【００３０】上記したＣＷＰからＣＧＰを単離するため
の予備実験I〜Vの結果から、最良の単離条件として図３
に示すような処理手順が得られた。

【００３１】（アフィニティークロマトグラフィーによ
るシアロ−ＣＧＰ及びアシアロ−ＣＧＰの分離）κ−カ
ゼインから調製したＣＧＰは、通常ジサッカライド鎖
（Ｇａｌ−β−１−３−ＧａｌＮＡｃ）を有する少量の
アシアロ−ＣＧＰを含む（Ｄｏｉ，Ｈ．，Ｆ．Ｉｂｕｋ
ｉ，ａｎｄ Ｍ．Ｋａｎａｍｏｒｉ．１９７９．還元ウ
シκーカゼインの不均質性．Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．
６２：１９５）。ＣＧＰの糖鎖部分は一般に微不均質性
を有しており、中性アシアロ−ＣＧＰは、単離工程中で
は産出されない。

【００３２】ＣＧＰは最終的には、ＰＮＡレクチンを用
いたアフィニティークロマトグラフィーによって分画さ
れる。すなわち、図３に示した処理手順によって全ＣＧ
Ｐを得、このＣＧＰ５０ｍｇを１０ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）１０μｌに溶解したものをＰＮＡレクチ
ン−セファロース４Ｂカラムにかけて分画する。分画の
結果を図４に示す。図４は、レクチンカラムからのＣＧ
Ｐの溶出パターンを示す。図中の矢印は、同じ緩衝液に
溶解した０．２Ｍ Ｄ−ガラクトースの添加を意味し、
白丸は２１０ｎｍにおける吸光度（ペプチド）を、黒丸
は５４９ｎｍにおける吸光度（シアル酸）をそれぞれ表
す。フラクションIは非吸着成分であり、ＮＡＮＡ、Ｇ
ａｌ及びＧａｌＮＡｃを含んでいた。フラクションIIは
０．２ＭＤ−Ｇａｌでカラムから溶出された成分であ
り、ＧａｌとＧａｌＮＡｃのみを含んでいた。これらの
成分はＨＰＬＣによって分析された。図５は典型的なＨ
ＰＬＣクロマトグラムを示す。ＣＧＰ（図５Ａ）は５つ
のピークからなり、これらのピークは、アシアロ−ＣＧ
Ｐである最初のピーク（図５Ｂ、図４のフラクションI
I）及びシアロ−ＣＧＰである続く４つのピーク（図５
Ｃ、図４のフラクションI）に分離された。従来のクロ
マトグラフ技術によっては、シアロ−ＣＧＰとアシアロ
−ＣＧＰの完全な分離は成功せず、この問題点はレクチ
ンアフィニティークロマトグラフィーの導入によって解
決された。

【００３３】全ＣＧＰ中におけるアシアロ−ＣＧＰの比
率は、ＨＰＬＣ分析によれば約１０％未満であると定量
された。本発明方法によって得られたシアロ−ＣＧＰと
アシアロ−ＣＧＰの純度はいずれも９０％以上であり、
ＨＰＬＣ及びＧＬＣ分析によれば、ホエータンパク質も
ラクトースもこれらの中には検出されなかった。

【００３４】（アシアローＣＧＰの調製）アシアロ−Ｃ
ＧＰの調製はまた、ＣＷＰ溶液をｐＨ３．０にして９８
℃で１時間加熱し、以下ＣＧＰの単離の場合と同じ操作
を施すことによっても行える。この条件でＮＡＮＡはＣ
ＧＰから完全に遊離した（表２を参照）。このようにし
て得たアシアロ−ＣＧＰは、ＨＰＬＣにかけると、図５
Ｂに示すようにアシアロ−ＣＧＰのピークとしてただ１
つのピークのみを与えた。アシアロ−ＣＧＰの全収量
は、１００ｇのＣＷＰから約１ｇであった。

【００３５】以下に本発明の実施例を掲げるが、これら
は本発明を何ら限定するものではない。

【００３６】

【実施例１】１００ｇのＣＷＰを蒸留水に加えて１０％
（ｗ／ｖ）溶液１リットルを作製した。この１０％溶液
を１ＮＨＣｌでｐＨ６．０に調整し、９８℃で１時間加
熱した。加熱終了後、この溶液を４℃に冷却し、５０％
エタノールを１リットル加えて、４℃で３時間静置し
た。次いで、この溶液を９０００Ｇで３０分間遠心分離
して沈澱物を除去した。残った上澄み液を１ＮＮＨ₄Ｏ
ＨでｐＨ９．０に調整し、０．０２−１．０Ｍの炭酸水
素アンモニウム濃度勾配法を用いてＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏ
ｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラムクロマトグラフにかけた。
次いで、吸着したＣＧＰを０．３Ｍの炭酸水素アンモニ
ウムを用いて溶出した。ＣＧＰを含む溶出液を常法によ
り減圧下で濃縮した後、凍結乾燥しＣＧＰ粉末を得た。
ＣＧＰの収量は１．１ｇであった。

【００３７】

【実施例２】実施例１で製造したＣＧＰ０．５ｇを１０
ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００μｌに溶解し
たものを、同じ緩衝液で平衡化したピーナッツレクチン
−セファロース４Ｂカラム（２００ｍｌ）にのせて、更
にこの緩衝液で溶出した。溶出液の２１０ｎｍ（ペプチ
ド）及び５４９ｎｍ（シアル酸）における吸光度をチェ
ックしながら、両者のピークを有するフラクションを集
めた（シアロ−ＣＧＰ含有）。吸光度のピークがほぼ０
になった後に、この緩衝液に０．２ＭのＤ−ガラクトー
スを添加して、引き続きカラムに加えて、２１０ｎｍの
吸光度を有すフラクションを集めた（アシアロ−ＣＧＰ
含有）。得られたそれぞれのフラクションを蒸留水中で
２日間透析した後、凍結乾燥してシアロ−ＣＧＰ粉末及
びアシアロ−ＣＧＰ粉末を得た。

【００３８】なお、本発明においてピーナッツレクチン
をＣＧＰ精製へ応用した糖質化学的背景は次の通りであ
る。

【００３９】ピーナッツレクチンは、種子より調製され
た糖鎖をもたないタンパク質であり、Ｄ−Ｇａｌ残基に
対して親和性をもつが、特にＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡ
ｃ部分を強く認識する。この２糖部分を認識する他のレ
クチンとしては、マッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ
ｂｉｓｐｏｒｕｓ）レクチン及びヒママメ（Ｃａｓｔｏ
ｒ ｂｅａｎ）ＲＣＡ₆₀レクチンがあるが、親和性はピ
ーナッツレクチンが最も強い。

【００４０】ＣＧＰはキモシン（レンニン、レンネッ
ト）消化により生じたκ−カゼインフラグメントであ
る。また、ＣＧＰに結合する糖鎖は、元のκ−カゼイン
に結合する糖鎖と同一である。この糖鎖の中で主要な糖
鎖は３糖であり、この化学構造（ＮｅｕＮＡｃα２−３
Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）は既に本発明者らが明ら
かにしている（Ｔ．Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，１０２３（１９８
０））。現在では、この異性体である３糖（Ｇａｌβ１
−３［ＮｅｕＮＡｃα２−６］ＧａｌＮＡｃ）及びシア
ル酸がさらに結合した４糖（ＮｅｕＮＡｃα２−３Ｇａ
ｌβ１−３［ＮｅｕＮＡｃα２−６］ＧａｌＮＡｃ）の
存在が知られている。ピーナッツレクチンは、このよう
なシアル酸を糖鎖末端に持つ酸性糖鎖は認識せず、結合
させるためにはシアリダーゼなどで処理してシアル酸を
除去することが必要である。しかしながら、これらの糖
鎖にはさらに微視的な不均一性が存在し、シアル酸を結
合しない中性２糖糖鎖（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）
も存在する。この糖鎖の存在割合は、全糖鎖の１０％以
下と推定される。また、ＣＧＰに結合する糖鎖は１本で
はなく、複数の糖鎖の結合することが知られている。ピ
ーナッツレクチンは、この２糖の中性糖鎖を１本でも持
つＣＧＰは吸着することになる。仮に、１本の中性２糖
と１本の酸性３糖を結合するＣＧＰは、セロトニンクロ
マトグラフィーでは吸着し、シアロ−ＣＧＰとして回収
されることになる。しかしながら、ピーナッツレクチン
クロマトグラフィーではこのＣＧＰは吸着除去され、シ
アロ−ＣＧＰには含まれないことから、本発明による製
造方法の方が優れていると考えられる。

【００４１】ＣＧＰは、インフルエンザウイルスに対す
る抗活性、細菌毒素に対する中和活性、イヌの食欲減少
作用など種々の生物活性を有している。更に、ＣＧＰは
Ｏ−グリコシド型の糖鎖のみを結合し、Ｎ−型糖鎖を結
合していないため、糖質分解酵素の理想的な基質であ
る。例えば、シアリダーゼの基質として、高度に精製さ
れた「シアロ−ＣＧＰ」は極めて有用である。現在シア
リダーゼの基質として広く利用されているシアリルラク
トース（ＮｅｕＮＡｃα２−３（６）Ｇａｌβ１−４Ｇ
ｌｃ）は、ウシ初乳由来であるため、高価でありかつ低
分子過ぎる。シアリダーゼは多くの種類があり、基質特
異性研究としてシアロ−ＣＧＰなどの高分子精製基質が
是非必要であると考えられる。また、エンド−α−Ｎ−
アセチルガラクトサミニダーゼ研究の基質には、現在高
価なチログロブリンなどが用いられているが、安価な
「アシアロ−ＣＧＰ」が極めて有用な基質と考えられ
る。従って、ＣＧＰ，シアロ−ＣＧＰ，アシアロ−ＣＧ
Ｐは今後、食品化学、生物化学、医学、薬学などの分野
において、需要が増大するものと予想される。

【００４２】

【発明の効果】本発明によれば、出発物質であるチーズ
ホエー、ホエータンパク質、ホエーミネラル等を特定の
ｐＨ値に調整して加熱し、冷却後アルコールを添加して
から、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー及び濃
縮の各操作を行うことにより、従来方法を使用した場合
よりも純度の高いＣＧＰを工業的に生産することが可能
となった。

【００４３】更に、このようにして得られたＣＧＰをレ
クチンアフィニティークロマトグラフィーを用いて分離
すると、アシアロ−ＣＧＰがカラムに吸着され、高純度
のシアロ−ＣＧＰを得ることができる。従来方法では、
シアロ−ＣＧＰをカラムに吸着させた後これを溶出して
いたが、精製シアロ−ＣＧＰのみを得る場合の調製効率
という観点からは、本発明方法の方が断然有利である。
なぜなら、本発明方法によれば１０％以下のアシアロ−
ＣＧＰ成分だけを除けば良いために、レクチンカラムの
規模を従来方法を用いる場合の約１／１０にスケールダ
ウンすることが可能となり、しかも、吸着成分は回収し
ないため他成分（この場合には溶出に用いるＤ−Ｇａ
ｌ）の混入するプロセスが無いからである。カラムに吸
着されたアシアロ−ＣＧＰは、チーズホエーをｐＨ３で
１時間加熱すれば容易に大量調製が可能であるから、わ
ざわざ回収しなくても済むというメリットがある。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａ及びＢは、甘性チーズホエー及びＣＧＰ標準
液をそれぞれ逆相高速液体クロマトグラフィーにかけて
得られた含有成分の保持時間と２１０ｎｍにおける吸光
度との関係を表す図である。

【図２】ｐＨ６．０で加熱したＣＷＰ溶液から得られた
上澄み液中に残存するホエータンパク質とＮＰＮのイオ
ン交換クロマトグラフィーによる溶出状態を表す図であ
る。

【図３】本発明の最も好ましいＣＧＰ製造工程を表す流
れ図である。

【図４】ＣＧＰをピーナッツレクチンアフィニティーク
ロマトグラフにかけて得られたシアロ−ＣＧＰ及びアシ
アロ−ＣＧＰの溶出状態を表す図である。

【図５】ＣＧＰをピーナッツレクチンアフィニティーク
ロマトグラフィーによって分画して得られた成分をそれ
ぞれ逆相高速液体クロマトグラフィーにかけて得られた
クロマトグラムで、Ａは図３に示した方法によって製造
した全ＣＧＰの、Ｂは図４のフラクションII（アシアロ
−ＣＧＰ）の、Ｃは図４のフラクションI（シアロ−Ｃ
ＧＰ）の保持時間と２１０ｎｍにおける吸光度との関係
をそれぞれ表す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−276542（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−225999（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−330100（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−284199（ＪＰ，Ａ) 日本農芸化学会誌，Ｖｏｌ．63，Ｎ ｏ．３（1989）Ｐ．575（３Ｃｐ15) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K A23L ＣＡＳ

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カゼイノグリコペプチドを含有するチー
   ズホエー、ホエー蛋白質、またはホエーミネラルを出発
   物質とし、この出発物質のｐＨを３〜６に調整し、加熱
   ・冷却してアルコールを添加後、一定時間静置した混合
   物を遠心分離し、上澄み液を弱陰イオン交換体を用いる
   イオン交換クロマトグラフィーにかけて吸着・溶離して
   得られた液を濃縮することを特徴とするカゼイノグリコ
   ペプチドの製造方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の製造方法で得られたカ
   ゼイノグリコペプチドをピーナッツレクチンアフィニテ
   ィーカラムクロマトグラフィーにより、シアロ−カゼイ
   ノグリコペプチド及びアシアロ−カゼイノグリコペプチ
   ドに分離することを特徴とするカゼイノグリコペプチド
   の精製方法。