CN102516402A - 糖链衍生物的制造方法、结构解析方法、以及糖链衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及糖链衍生物的制造方法，是从糖链混合物制造糖链衍生物的方法，其特征在于，具备下述工序：(a)在糖链混合物中的糖链上导入脂溶性基，得到糖链衍生物的混合物的工序，以及(b)将该糖链衍生物的混合物用5-羟色胺亲合柱色谱法处理的工序。

Description

糖链衍生物的制造方法、结构解析方法、以及糖链衍生物
本申请是中国专利申请号201010266780.6，申请日2006年7月19日，发明名称“糖链衍生物的制造方法、结构解析方法、以及糖链衍生物”的分案申请。
技术领域
本发明涉及来自糖链的混合物的糖链衍生物的制造方法、以及糖链的结构解析方法。进一步，涉及根据本发明的糖链衍生物的制造方法制造的新的糖链衍生物。
背景技术
糖蛋白质中的糖链认为具有保持蛋白质的立体结构、获得防止被蛋白酶的分解的抵抗性等作用。最近，逐渐地阐明了糖蛋白质中的糖链参与受精和分化、信号传导、癌化、蛋白质的细胞内输送和生理活性的调节等的生命现象。另外，还阐明了细胞表面的粘接分子和糖蛋白质性激素等的糖链与其功能的关系，总结了糖质科学公会(consortium)构想。现在，糖链功能研究的中心研究以影响其的生合成糖转移酶(糖链基因)为中心，如果考虑糖转移酶还根据基因组情报被保存，利用与其他蛋白质的协调作业，参与生命功能，还需要利用捕捉细胞、组织中表达的糖链的整体图像进行解析的结构糖组学(glyconomics)手法，进行糖链的功能解析。
糖链科学中的结构糖组学的作用是综合地解析在多数生命现象中担负重要作用的糖链识别机理，对功能糖组学是不可缺少的要素。作为结构糖组学所要求的技术的要素，有高综合性、高生产量、高感度以及高精度。
现在，作为糖蛋白质糖链的结构解析法，对从蛋白质切出的糖链进行荧光标记后，利用高效液相色谱(HPLC)或者质谱分析法(MS)的解析的方法成为利用质谱分析的快速技术进步的有力的手段(非专利文献1～4)，唾液酸糖链的分离中，逐渐地专门地利用阴离子交换色谱色谱(非专利文献5)。
【非专利文献1】Biomed Chromatogr.16：103-115(2002)
【非专利文献2】Anal Biochem.206：278-287(1992)
【非专利文献3】Biochem Soc Trans.21：121-125(1993)
【非专利文献4】Chem Rev.102：321-369(2002)
【非专利文献5】Biochim Biophys Acta.705：167-173(1982)
但是，对细胞或组织中的糖链综合解析的场合，由于存在唾液酸和岩藻糖等的非还原末端修饰的多样性和糖链的分枝这样的问题，不能充分地分离混合存在的糖链，不能得到满意的结果。特别地，如果使用离子交换色谱等，由于没有特异的分离能力，不仅不能获得充分的分离，而且分离操作后必须要进行脱盐处理，可以说并不是实用的方法。
因此，对这些的糖链不均一性情报有担心，同时迫切希望对细胞、组织可以详细进行特征糖链结构解析的实用的手法。
本发明的课题在于，提供从像细胞或者组织中的糖链那样混合存在的各种的糖链的状态分离、获取各糖链的手段。
另外，本发明课题在于，提供对于分离的各糖链化合物的结构进行解析的手段。
进一步，本发明的课题在于提供新的糖链衍生物。
发明内容
本发明涉及以下的发明。
1.糖链衍生物的制造方法，是从糖链混合物制造糖链衍生物的方法，其特征在于，包括下述工序：(a)在糖链混合物中的糖链上导入脂溶性基，得到糖链衍生物的混合物的工序、以及(b)将该糖链衍生物的混合物用5-羟色胺(serotonin)亲合柱色谱法进行处理的工序。
2.上述1记载的糖链衍生物的制造方法，其中在(b)工序之后具备(c)采用氨基柱或者酰氨基柱的正相色谱法进行处理的工序。
3.上述记载的糖链衍生物的制造方法，其中，在(c)工序之前，具备(d)用糖水解酶进行处理的工序。
4.糖链的结构解析方法，是解析糖链混合物中的糖链的结构的方法，其特征在于，具备以下工序：(a)在糖链混合物中的糖链上导入脂溶性基，得到糖链衍生物的混合物的工序、(b)将该糖链衍生物的混合物用5-羟色胺亲合柱色谱法进行处理的工序、以及(e)用质谱分析法进行处理的工序。
5.上述记载的糖链的结构解析方法，其特征在于，在(b)工序之后，具备(c)通过采用氨基柱或者酰氨基柱的正相色谱法进行处理的工序。
6.上述记载的糖链的结构解析方法，其中，在(c)工序之前具备(d)用糖水解酶进行处理的工序。
7.上述4记载的糖链的结构解析方法，其中，质谱分析法是利用MALDI-TOF MS的质谱分析法。
8.后述的式(1)～(6)表示的糖链衍生物[式中R1表示2-羧基苯基、3-羧基苯基、4-羧基苯基、p-乙氧基羰基苯基、或者2-吡啶基。R2表示羟基、基-Asn或者基-Asn-R3。在此，Asn表示天冬酰胺基，R3表示氨基甲酸酯系或者酰胺系保护基。Ac表示乙酰基。]。
9.由式(1)～(6)表示的糖链衍生物衍生的癌标记物。
本发明人等经过深入研究，结果发现在糖链上导入脂溶性基成为糖链衍生物后，采用把对唾液酸有亲合性的5-羟色胺作为配基的亲合柱色谱法进行处理，由此可以进行无唾液酸糖链和唾液酸糖链的分离，还可以利用唾液酸残基的数目对唾液酸糖链中的单唾液酸、二唾液酸、三唾液酸以及四唾液酸糖链等进行分离。
进一步还发现，把利用该亲合柱色谱法分离的级分，分别供给使用氨基柱或者酰氨基柱的色谱，将分枝结构不同的糖链衍生物可以进行详细分离，可以大量地制造单一结构的糖链。
另外还发现，使分离的各糖链衍生物与适当的糖水解酶作用，供给采用氨基柱或者酰氨基柱的色谱进行分离，对得到的糖链衍生物用质谱分析法进行处理，由此可以高精度且综合地解析糖链结构，进而完成了本发明。
在本发明的制造方法中使用的糖链混合物的糖链没有特别的限制，包括天冬酰胺键合型糖链(N-葡糖甙键合型糖链)、mucin型糖链(O-葡糖甙键合型糖链)、游离型糖链、进一步还包括像糖链键合天冬酰胺那样的结合了氨基酸的糖链。
这些糖链也可以是利用化学的手法调制的糖链，例如，从天然的糖蛋白质由来的糖链在其非还原末端的糖残基随机欠失的糖链的混合物，优选使用这些糖链的混合物。此外，优选使用含有在糖链残基上具有唾液酸残基的糖链的糖链混合物。
作为天然糖链的混合物，可举出天然原料、例如乳汁、牛由来胎球蛋白、卵或者生体的组织或细胞由来的糖链混合物。特别地，使用癌组织或者癌细胞由来的糖链混合物可以期待特别浓厚兴趣的结果。
作为本发明中可以使用的天然糖链的混合物，可优选以下所示的糖链混合物，特别优选含有唾液酸糖链的糖链混合物。
可以使用下述获得的混合物，即，从该天然原料中利用公知的方法获得糖蛋白质以及/或者糖肽的混合物，使当该混合物与蛋白质分解酶等作用，切断肽部分，利用采用凝胶过滤柱或者离子交换柱等的色谱法进行精制获得的糖链键合天冬酰胺的混合物。
另外，可以使用下述获得的混合物，即，采用例如生体的组织或者细胞、特别是培养组织或培养细胞，将培养液中的组织或者细胞匀化，然后将离心分离获得的细胞膜级分，用2-巯基乙醇处理后，使作用于N-聚糖酶(glycanase)，得到的糖链的混合物。
另外，可以使用将培养组织或培养细胞匀化，采集离心分离的上清液获得的游离糖链的混合物。在这些的糖链之中由于含有作为中性糖链的高甘露糖型糖链和多种唾液酸糖链，所以适用于各种糖链的制造。
在获得的糖链的混合物中的糖链上导入脂溶性基使其成为糖链衍生物的混合物。
脂溶性基是与糖链的还原末端的开环醛、糖链键合天冬酰胺的天冬酰胺氨基或者羧基反应形成的、具有脂溶性的取代基，例如2-、3-或者4-羧基苯基氨基、p-乙氧基羰基苯基氨基、2-吡啶基氨基等作为通常荧光标记使用的取代基、或者9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基、叔-丁氧基羰基(BOC)基、苄基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙酰基等的作为氨基甲酸酯系或者酰胺系保护基使用的取代基。
这些脂溶性基的导入可以利用公知的方法进行导入，从操作的简便、得到的糖链衍生物的稳定性、激发光与水银光源或者激光光源对应等方面出发，可以优选使用2-羧基苯基氨基、Fmoc基或者BOC基。
例如，采用2-氨基苯甲酸，在氰基硼氢化钠或者二甲基氨基化硼等的还原剂的存在下，使其与糖链反应，由此可以成为氨基醛糖醇衍生物。
另外，例如采用9-芴基甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯，在碳酸氢钠存在下，使与糖链键合天冬酰胺反应，可以在天冬酰胺的氨基导入氨基甲酸酯样上键合的Fmoc基。
根据以上的操作，可以得到导入了脂溶性基的糖链衍生物的混合物。
把获得的糖链衍生物的混合物用5-羟色胺亲合柱色谱法进行分离。
本发明中的5-羟色胺亲合柱色谱法可以采用把与唾液酸具有亲合性的5-羟色胺作为配基的亲合柱。
作为5-羟色胺亲合柱，可以将5-羟色胺固定在填充剂上制成，也可以采用市售的柱。作为市售的柱，可举出LA-5-羟色胺柱(株式会社J-オイルミルズ制)等。
色谱的分离条件可以适当设定，如果举出其一例，采用荧光检测器，设定激发波长350nm、荧光波长425nm，流速0.5ml/min、流动相使用超纯水和醋酸铵水溶液，进行直线梯度洗脱，可以达到分离。
通过5-羟色胺亲合柱色谱法，将糖链衍生物的混合物，根据糖链衍生物的唾液酸残基的数目可以进行分离，没有唾液酸残基的无唾液酸糖链衍生物最早洗脱，接着按单唾液酸糖链衍生物、二唾液酸糖链衍生物这样地与唾液酸残基的数目增加成比例地进行分离洗脱。
把利用以上的5-羟色胺亲合柱分离的糖链衍生物，用采用聚合物基质的氨基柱或者二氧化硅基质的酰氨基柱的正相HPLC进行处理，由此可以很好地进行糖链衍生物间的分离。所谓正相色谱法，是将氨基、氨基丙基、丙烯酰胺基等极性固定相作为填充剂使用的色谱法，其特征在于，根据相对于试料成分的固定相-流动相的试料成分的分配度的差别达到分离。基本上是基于糖链的亲水性而分离的模式，还可以优选用在结合了唾液酸的糖链的异构体的分离中。另外，还可以利用在采用稀酸或者唾液酸苷酶处理的无唾液酸型的糖链的分离中。
作为使用的聚合物基质的氨基柱，是将把氨基结合在聚乙烯醇系基材凝胶等的聚合物上的固定相作为填充剂使用的柱子，可以使用自制的柱子、也可以使用市售的柱子。
作为市售的氨基柱，可举出Asahi Shodex NH2P-50 4E(昭和电工株式会社制)。
作为二氧化硅基质的酰氨基柱，是将把丙烯酰胺等的酰胺基与把二氧化硅作为固定相的填充剂进行化学键合而导入的柱子，可以使用自制的柱子、也可以使用市售的柱子。
作为市售的酰氨基柱，可举出TSK-GEL Amide-80(TOSOH Corp制)。
色谱的分离条件进行适宜地设定，如果举出其一例，通过采用荧光检测器，激发波长350nm、荧光波长425nm，流速1ml/min，流动相采用含有醋酸的乙腈和醋酸以及含有三乙胺的水溶液，进行线性梯度洗脱可以进行分离。
以上那样分离获得的糖链衍生物通过采用糖水解酶、利用质谱分析法进行分析，可以将其糖链结构解析。
作为糖水解酶，可以采用公知的酶，例如可举出唾液酸酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶(acetylglucosamidase)、岩藻糖苷酶等。
作为质谱分析方法，利用采用现有公知的质谱分析法的质谱分析装置进行，近年特别优选采用用于糖链分析的MALDI-TOF MS进行测定。
为了解析糖链结构，与特定的糖水解酶作用后，通过采用聚合物基质的氨基柱或者二氧化硅基质的酰氨基柱的正相HPLC处理，将得到的级分质谱分析，考虑到消失的质量分和水解酶的特性，可以通过进一步反复该操作进行糖链结构解析。
获得的糖链衍生物通过将其脂溶性基除去，可以人工容易地且大量地获得各种的糖链。
脂溶性基的除去可以使用现有公知的方法。
例如，2-羧基苯基氨基的除去通过在醋酸中与过氧化氢在室温进行反应而达到，可以容易地作为游离型糖链回收。
另外，Fmoc基的除去通过在N，N-二甲基甲酰胺中、糖链衍生物中加入吗啉进行反应来达到，为了除去BOC基，通过与弱酸反应来达到。
糖链是糖链键合天冬酰胺的场合，通过与无水肼反应后乙酰化的方法，在碱性水溶液中加热回流后乙酰化的方法等，可以除去天冬酰胺残基。
该糖链类，在医药品开发等领域中非常有用，可举出例如癌的疫苗合成，将得到的糖链类组合利用化学反应或糖转移酶的反应等键合新的糖残基而衍生物化，可以开发新的疫苗。
本发明人等通过本发明的结构解析方法以及制造方法，成功地分离出在各种癌细胞中迄今为止没有发现的下述式(1)～(6)表示的糖链。
Figure BDA0000102128460000071
Figure BDA0000102128460000081
[式中R1表示2-羧基苯基、3-羧基苯基、4-羧基苯基、p-乙氧基羰基苯基、或者2-吡啶基。R2表示羟基、基-Asn或者基-Asn-R3。这里Asn，表示天冬酰胺基，R3表示氨基甲酸酯系或者酰胺系保护基。Ac表示乙酰基。]
这些新的糖链认为是在癌细胞中特异表达的物质，将这些糖链作为癌标记物可以利用。
例如，制作与这些癌细胞中的特异的糖链特异识别的多克隆抗体或者单克隆抗体，利用免疫学的手法进行检测该糖链而达到。
多克隆抗体可以将该糖链或者该糖链的半抗原与蛋白质等的高分子化合物(载体)键合的键合体作为抗原，对小鼠、仓鼠、豚鼠、鸡、大鼠、兔子、狗、山羊、绵羊、牛等的哺乳动物进行免疫致敏，从该哺乳动物采集血液，可以调制含有多克隆抗体的抗血清。
单克隆抗体例如通过调制从由抗体产生细胞和骨髓瘤细胞株的细胞融合获得的杂交瘤得到。培养这样得到的杂交瘤，精制产生的单克隆抗体即可。
附图的简单说明
图1表示实施例1获得的糖链衍生物的亲合柱色谱图。
图2表示实施例2获得的糖链衍生物的亲合柱色谱图。
图3表示实施例3获得的糖链衍生物的HPLC的色谱图。
图4表示实施例3获得的糖链衍生物的HPLC的色谱图。
图5表示实施例3获得的糖链衍生物的HPLC的色谱图。
图6表示实施例3获得的糖链衍生物的HPLC的色谱图。
图7表示实施例3获得的糖链衍生物的HPLC的色谱图。
图8表示实施例4获得的糖链衍生物的亲合柱色谱图。
图9表示实施例5获得的糖链衍生物的HPLC的色谱图。
图10表示实施例6获得的糖链衍生物的亲合柱色谱图。
图11表示实施例7获得的糖链衍生物的亲合柱色谱图。
图12表示实施例7获得的糖链衍生物的HPLC的色谱图。
具体实施方式
以下表示参考例以及实施例，本发明并不受到下述实施例的限定。
实施例1利用5-羟色胺亲合色谱分离来自人血清[1-酸性糖蛋白质(AGP)]的糖链
将来自人血清的AGP(シグマアルドリツチジヤパン制)1mg溶解在20mM磷酸缓冲溶液(pH 7.5)50μl中，加入N-glycanase F(2单位，4μl)，在37℃反应12小时。反应后在100℃煮沸3分钟，回收离心分离后的上清。
在回收的上清中加入分别使2-氨基苯甲酸(2-AA)和氰基硼氢化钠为3％地溶解在2％硼酸、4％醋酸钠混液(500μl)中的溶液100μl，在80℃反应1小时。把反应混合物用50％甲醇水溶液平衡化的Sephadex LH-20柱(0.7cm i.d.，30cm)进行分级，采用分光光度计(日立制、F-4010型)，利用激发波长335nm、荧光波长410nm测定各级分，把最初洗脱出的荧旋光性级分回收，作为糖链衍生物的混合物。
把得到的混合物供给5-羟色胺亲合柱色谱柱，得到分离的糖链衍生物。采用亲合柱色谱法的分离结果如图1所示。
5-羟色胺亲合柱色谱法的条件
柱：LA-Serotonin柱(4.6×150mm，Japan Oil mills制)
泵：JASCO PU-980型
流速：0.5ml/min
检测器：JASCO FP-920型荧光检测器
激发波长：350nm
荧光波长：425nm
流动相：溶液A采用超纯水、溶液B采用40mM醋酸铵水溶液。
梯度条件：试料注入后，2分钟为溶液B 5％，37分钟后醋酸铵浓度30mM，进行线性梯度洗脱，其后10分钟醋酸铵浓度40mM的进行。
予以说明，5-羟色胺亲合色谱的分离条件在以下的实施例也相同。
实施例2(人癌细胞由来糖链利用5-羟色胺亲合色谱的分离)
细胞培养
采用人肾上腺癌细胞ACHN、人肺癌细胞A549、人胃癌细胞MKN45以及人组织血细胞性淋巴瘤U937。通过ACHN以及A549预先在50℃加热30分钟，将非灭活的含有牛血清[NEWBORN CALF SERUM(NCS)、シグマアルドリツチジヤパン制]10％的DMEM(Dulbecco′s ModifiedEagle Medium、シグマアルドリツチジヤパン制)，U937以及MKN45采用含有10％NCS的RPMI-1640(シグマアルドリツチジヤパン制)，在5％CO2存在下，在37℃在组织培养皿中培养。除去了U937的细胞在80％铺满状态下，将培养中的细胞用等张化磷酸缓冲液(PBS)洗涤后，加入胰蛋白酶溶液，在37℃处理5分钟后，回收剥离的细胞，用PBS洗涤后传代培养。
细胞膜级分的调制
为了调制细胞膜级分，采用80％铺满状态的细胞，利用刮削器(scraper)，从培养器回收。回收的细胞用PBS洗涤后，在含有1％的蛋白酶抑制剂的10mM Na2HPO4(pH7.5)中使用玻璃匀浆机匀浆后，使浓度为1×108cell/5ml，加入含有0.5M的蔗糖的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)10ml，在4℃、3000rpm 15分钟离心分离后回收上清，然后，在4℃、19000rpm离心分离，将得到的沉淀作为细胞膜级分。
从细胞膜级分游离糖链
在细胞膜级分(1×107cell)中加入1％SDS溶液40μl，加入2-巯基乙醇，使其为1％后，在100℃的沸腾水浴上加热5分钟，由此进行可溶化。将含有膜级分的溶液冷却到室温，加入NP-40，使其为1％，加入磷酸缓冲液(pH7.5)，使终浓度为20mM。进一步，加入N-glycanaseF 4μl(2单元、Roche diagnostics制)，在37℃下培养一晚，在100℃的沸腾水浴上煮沸5分钟，加入95％乙醇，使其终浓度为75％，然后在4℃、15000rpm下离心分离，将上清减压干固，作为细胞膜由来的糖链。
在调制完的各细胞膜由来的糖链中与上述实施例1相同地导入2-AA后，用5-羟色胺亲合柱色谱法处理，得到各糖链衍生物级分。采用柱色谱的分离结果表示在图2中。
实施例3(采用正相型酰氨基柱分离癌细胞由来的糖链以及结构解析)
把实施例2得到的各级分的癌细胞由来的糖链衍生物(相当1×107cell)溶解在20mM醋酸缓冲液(pH5.0)20μl中，加入唾液酸酶4μl(2mU，マルキンバイオ制)，在37℃反应24小时。反应后在100℃煮沸3分钟，回收离心分离后的上清。
将得到的上清供给采用酰氨基柱的正相HPLC，分取出糖链衍生物。用HPLC分离结果表示在图3～7中。
HPLC条件
柱：TSK-GEL Amide-80(TOSOH CORPORATION，Japan；4.6×250mm)
柱温度：40℃
泵：JASCO PU-980型
流速：1ml/min
检测器：JASCO FP-920型荧光检测器
激发波长：350nm
荧光波长：425nm
流动相：溶液A采用含有0.2％醋酸的乙腈溶液，溶液B采用含有0.1％醋酸以及0.1％三乙胺的水溶液。
梯度条件：试料注入后2分钟间溶液B为30％，60分后溶液B为65％，进行线性梯度洗脱。
利用糖水解酶和质谱分析法的结构解析
将U937由来的峰31的糖链衍生物溶解在20mM柠檬酸缓冲液(pH 3.5)20μl中，加入β-半乳糖苷酶1μl(25mU、生化学工业社制)，在37℃反应24小时。反应后在100℃沸煮3分钟，回收离心分离后的上清。将得到的上清供给采用酰氨基柱的正相HPLC，将得到的级分的一部分利用MALDI-TOF MS分析。结果，得到分子量2718的糖链衍生物(a)。
将该糖链衍生物(a)溶解在20mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)20μl中，加入β-N-乙酰己糖胺酶(acetylhexaminidase)1μl(10mU，生化学工业社制)，在37℃反应24小时。反应后在100℃沸煮3分钟，回收离心分离后的上清，将得到的上清与上述相同地分析，结果，得到分子量1906的糖链衍生物(b)。
进一步，将糖链衍生物(b)用β-半乳糖苷酶处理，结果，得到分子量1582的糖链衍生物(c)。
根据以上的结果，判断出峰31为下述式表示的糖链衍生物。
Figure BDA0000102128460000141
相同地，峰35的糖链衍生物也用β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶、然后用β-半乳糖苷酶，判断出是下述式表示的糖链衍生物。
Figure BDA0000102128460000142
对于其它的峰的衍生物，也适当采用水解酶，进行MALDI-TOF MS分析等，将相当于图3～7所示的峰的糖链结构表示在表1～5中。予以说明，表1～14中的分子量表示在糖链还原末端结合2-氨基苯甲酸的状态下的分子量(MW)，记号表示以下的物质。
Gal：D-半乳糖、GlcNAc：N-乙酰己糖胺、
Man：D-甘露醇、Fuc：岩藻糖、2-AA：2-氨基苯甲酸、NeuAc：唾液酸。
这里，在糖链还原末端结合了2-氨基苯甲酸的糖链，例如，下式表示的糖链部分结构表示成-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-2-AA。
Figure BDA0000102128460000151
装置采用Voyager DE-PRO(PE Biosystems，Framingham，MA)，通过线性/阴离子模式，在加速电压20kV、栅极电压96.3％、停滞时间(Delay time)1000nsec、透镜偏移量(Lens Off set)1.25、激光强度(氮激光)2700下测定。混合水中溶解的样品0.5μL和2，5-二羟基苯甲酸(DHB)的20mg/mL甲醇溶液0.5μL，干燥后，作为测定用试样使用。
【表1】
Figure BDA0000102128460000161
【表2】
Figure BDA0000102128460000171
【表3】
【表4】
Figure BDA0000102128460000191
【表5】
Figure BDA0000102128460000201
实施例4(细胞内存在的游离糖链1)
将人胃癌细胞MKN45用PBS洗涤后，使浓度为1×108cell/5ml，采用玻璃匀浆机在含有1％的蛋白酶抑制剂的10mM Na2HPO4(pH7.5)中匀浆后，加入含有0.5M蔗糖的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)10ml，在4℃、3000rpm下离心分离15分钟后，收集上清，进一步在4℃、19000rpm离心分离，将其上清减压干固，得到游离型糖链混合物。
在得到的游离型糖链混合物中，与实施例1记载的方法相同地导入2-AA，得到游离型糖链衍生物的混合物，用5-羟色胺亲合柱色谱法分级，得到游离型糖链衍生物。
利用亲合柱色谱法的分离结果表示于图8。
将得到的各级分通过采用氨基柱的正相HPLC分离，得到游离型糖链衍生物。
HPLC条件
柱：Asahi Shodex NH2P-504E(Sho wa
Denko，Tokyo，Japan；4.6×250mm)
柱温度：50℃
泵：JASCO PU-980型
流速：1ml/min
检测器：JASCO FP-920型荧光检测器
激发波长：350nm
荧光波长：425nm
流动相：溶液A采用含有2％醋酸的乙腈溶液，溶液B采用含有5％醋酸以及3％三乙胺的水溶液。
梯度条件：试料注入后，2分钟溶液B为30％，80分后溶液B为95％，进行线性梯度洗脱，直到100分钟，将溶液B保持为95％。
将得到的游离型糖链衍生物适当与糖水解酶(唾液酸酶、α-甘露糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶等)作用，通过采用上述氨基柱的正相HPLC分离后，将得到的级分冷冻干燥后，通过MALDI-TOF MS分析，对游离型糖链衍生物的结构进行解析。
予以说明，用α-甘露糖苷酶的处理通过下述进行，即，把糖链衍生物溶解在20mM柠檬酸缓冲液(pH4.5)20μl，加入α-甘露糖苷酶2μl(10mU，生化学工业社制)，在37℃反应24小时，反应后在100℃煮沸3分钟，回收离心分离后的上清。用其它的糖水解酶的处理如前述实施例中的记载相同。得到的糖链衍生物表示于表6以及7中。
表6以及7的游离型糖链是新的化合物，例如No.1的分子量1321的糖链衍生物是下述式表示的。
Figure BDA0000102128460000221
【表6】
Figure BDA0000102128460000231
【表7】
Figure BDA0000102128460000241
实施例5(存在于细胞内的游离糖链2)
代替人胃癌细胞MKN45，采用人T细胞淋巴瘤Jurkat27(导入糖链的细胞株)，除此以外，与实施例4相同地操作，得到游离型糖链混合物。
在得到的游离型糖链混合物中与实施例1记载的方法相同地导入2-AA，得到游离型糖链衍生物的混合物，用5-羟色胺亲合柱色谱法分级，得到游离型糖链衍生物。
将得到的各级分通过使用酰氨基柱的正相HPLC分离，得到游离型糖链衍生物。
HPLC条件
柱：TSK-GEL Amide-80(TOSOH CORPORATION，Japan；4.6×250mm)
柱温度：40℃
泵：JASCO PU-980型
流速：1ml/min
检测器：JASCO FP-920型荧光检测器
激发波长：350nm
荧光波长：425nm
流动相：溶液A采用含有0.1％醋酸的乙腈溶液、溶液B采用含有0.2％醋酸以及0.2％三乙胺的水溶液。
梯度条件：试料注入后2分钟，溶液B为30％，60分后溶液B达到65％，进行线性梯度洗脱。
用HPLC分离结果表示在图9中。
将得到的游离型糖链衍生物，与实施例4相同地操作，对游离型糖链衍生物的结构进行解析。得到的糖链衍生物表示于表8。
【表8】
Figure BDA0000102128460000251
实施例6(人子宫颈部癌细胞的糖链)
将人子宫颈部癌细胞HeLa预先在50℃加热30分钟，采用含有非灭活的NCS10％的DMEM进行培养。在80％铺满状态下，把培养中的细胞用PBS洗涤后，加入胰蛋白酶溶液，在37℃处理5分钟后，回收剥离的细胞，用PBS洗涤后传代培养，与实施例2记载的细胞膜级分的调制、从细胞膜级分游离糖链相同地进行处理，得到细胞膜由来的糖链混合物，与上述实施例1相同地导入2-AA后，用5-羟色胺亲合柱色谱法处理，得到各糖链衍生物级分。
采用柱色谱的分离结果表示在图10中。
将得到的无唾液酸基糖链衍生物级分、单唾液酸糖链衍生物级分以及二唾液酸糖链衍生物级分用唾液酸酶处理后，用采用氨基柱的正相HPLC分离，得到糖链衍生物。HPLC条件与实施例4相同。
将得到的糖链衍生物适当地与糖水解酶(唾液酸酶、α-甘露糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶等)作用，用采用上述氨基柱的正相HPLC分离后，将得到的级分冷冻干燥后，用MALDI-TOF MS分析，解析糖链衍生物的结构。
得到的糖链衍生物表示在表9～12中。
【表9】
无唾液酸基糖链衍生物
【表10】
单唾液酸糖链衍生物
【表11】
二唾液酸糖链衍生物-1
Figure BDA0000102128460000281
【表12】
二唾液酸糖链衍生物-2
Figure BDA0000102128460000291
实施例7(癌细胞特异性抗原CD98的糖链)
利用免疫沉降法调制CD98-HC
把蛋白质A-琼脂糖50μl(シグマアルドリツチジヤパン制)用PBS200μl洗涤后，加入PBS50μl以及10μg/10μl的抗CD98抗体，在室温反应60分钟。反应后，用PBS 1ml除去非吸附成分，得到抗CD98抗体固定化琼脂糖，抗CD98抗体固定化琼脂糖中，加入通过1％NP-40(400μl)溶化的HeLa细胞的膜级分(2×107cell)，采用旋转摇床，在4℃培养一晚。然后，用PBS 1ml洗涤，除去非吸附成分，离心分离后，在抗CD98抗体固定化琼脂糖中加入解离溶液(250mM Tris-HCl缓冲液pH6.8/4.6％SDS，20％丙三醇)和2-巯基乙醇的9∶1混液20μl，煮沸5分钟，在15000rpm下离心的上清作为CD98-HC，供给SDS-PAGE。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
凝胶电泳装置以及电源都使用Bio Rad制的。泳动凝胶采用7.5％凝胶。作为泳动缓冲液，使用25mM Tris，198mM甘氨酸，1％(w/v)SDS进行。最初的1小时每1枚凝胶在5mA，然后在10mA下进行泳动，直到凝胶下边部分。
考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)染色
SDS-Page结束后，用40％(v/v)甲醇，10％(v/v)醋酸/0.2％Coomassie Brilliant Blue R250中进行蛋白质的染色。1小时后，采用甲醇∶醋酸∶水(＝4∶1∶5)脱色。
蛋白质印迹法(Western Blot)
将SDS-PAGE后的凝胶用BIO-RAD制半干式印迹装置(trans blotSD cell)，将凝胶中的蛋白质试样转印到PVDF膜上。PVDF膜采用预先浸渍在甲醇中60秒，然后浸渍在48mM Tris，39mM甘氨酸，20％甲醇(pH9.0)中1小时的膜，用100mA定电流失加1小时电压，进行转印。转印后，将PVDF膜用含有5％脱脂乳以及0.05％ Tween 20的PBS掩蔽操作后，加入含有抗CD98抗体5μg的0.05％ Tween 20/PBS(5ml)，反应一晚。反应后，将PVDF膜用含有0.05％ Tween 20的PBS(20ml)洗涤4回后，加入含有HRP标记的蛋白质A 5μl的0.05％Tween 20/PBS(5ml)，反应1小时。反应后，将PVDF膜用含有0.05％Tween 20的PBS(20ml)洗涤4回，加入含有0.05％ DAB(3，3′-Diaminobenzidrine，tetrahydrochloride)的100mM Tris-HCl缓冲液pH7.5，0.0031％过氧化氢溶液20ml，使其发色。
利用N-glycanase F进行凝胶内消化
利用CBB染色确认条带后，将脱色液置换为水，切出目的物的条带，放入Eppendorf离心管中。然后，加入乙腈100μl，放置30分钟，由此将凝胶脱水，除去乙腈后，加入含有2单位的N-glycanase F的Tris-HCl缓冲液pH7.5100μl，在37℃培养一晚，切出糖链。然后，回收提取液，进一步加入水200μl，搅拌30分钟，从凝胶得到糖链混合物。
对以上那样得到的糖链混合物，用和上述实施例1相同地导入2-AA后，利用5-羟色胺亲合柱色谱法处理，得到各糖链衍生物级分。
采用柱色谱的分离结果表示在图11中。
将得到的单唾液酸糖链衍生物级分以及二唾液酸糖链衍生物级分用唾液酸酶处理后，用采用氨基柱的正相HPLC分离，得到糖链衍生物。HPLC条件与实施例4相同。用HPLC的分离结果表示在图12中。
得到的糖链衍生物适当地与糖链水解酶(唾液酸酶、α-甘露糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶等)作用，用采用上述氨基柱的正相HPLC分离后，将得到的级分冷冻干燥后，用MALDI-TOF MS分析，由此解析糖链衍生物的结构。
得到的糖链衍生物表示在表13～14中。
【表13】
Figure BDA0000102128460000321
【表14】
产业上的可利用性
根据本发明的方法，可以详细地对特别是细胞或者组织中的糖链混合物进行分离，可以综合地解析该糖链结构，由此可以寻求现有未知的糖链以及其功能，在今后的糖链研究中可以期待大的贡献。

Claims (1)

1.下表所示的糖链衍生物，
Figure FDA0000102128450000021
式中R4表示2-羧基苯基、3-羧基苯基、4-羧基苯基、对-乙氧基羰基苯基、或者2-吡啶基，基团-Asn或基团-Asn-R5，其中，Asn表示天冬酰胺基，R5表示氨基甲酸酯系或者酰胺系保护基，且Ac表示乙酰基。
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