TWI320788B - Method for the purification of antibodies - Google Patents

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1320788 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於多肽純化之領域。本文描述一種以離子交 換樹脂純化免疫球蛋白之新賴方法。同時提供一種用於快 速測定純化條件之方法。 、 【先前技術】 蛋白質’尤其是免疫蛋白在如今之醫學領域中扮演著 重要的作f對於人類應用而言，每—種醫藥物質均須滿 足不同之標準◎為確保生物藥劑對人類核酸之安全性，尤 八須移除可引起嚴重危害之病毒及宿主細胞蛋白質。為符 合質量管理規格標準’在製造製程之後須進行一或多個純 化步驟。其中，純度、產量及產率在測定適當純化方法中 扮演著重要作用。 已建立完善之不同方法且廣泛用於蛋白質純化，諸如微 生物蛋白質之親和力層析法（例如，蛋白質入或蛋白質G親 和力層析法）、離子交換層析法（例如，陽離子交換（羧曱基 樹脂）、陰離子交換（胺基乙基樹脂）及混合模式交換）、$ 硫吸附（例如，以Ρ-髄基己酵及其他811配位體）、疏水性交 互作用或芳族吸附層析法（例如，以苯基_瓊脂糖、氮雜親 砂性樹脂或間胺基笨基_酸）、金屬螯合劑親和力層析法 (例如，以Ni(II)-及Cu(II)·親和力材料）、尺寸排阻層析法 及電泳方法（諸如凝膠電泳法、毛細電泳法） (Vijayalakshmi > M.A. > Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) 〇 I09799.doc 1320788

Necina，R.等人，Bi〇technol. Bioeng. 60(1998)689-698報 導了藉由展現高電荷密度之離子交換介質直接自細胞培養 上清液捕獲人類單株抗體。在W0 89/05 157中，報導了一 種藉由直接使細胞培養基接受陽離子交換處理來純化產物 免疫球蛋白之方法。Danielsson，A.等人，J. Immun. Meth. 1 15 (1988)，79-88描述了對於來自小鼠腹水之單株1gG抗 體的單步驟純化。

Raweerith，R.等人（J. Immun. Meth. 282(2003)63-72)使用 方法組合，意即辛酸沉澱與離子交換層析法，作為用於分 餾胃蛋白酶消化之馬抗蛇毒素F(ab·)2抗體之方法。在WO 2003/1 02132中，報導了用於純化蛋白質之非親和力純化 步驟與高效切向流式過濾之組合。在WO 92/19973中報導 了兩種親和力層析步驟之組合。

Follman, D.K.及Fahrner，R.L·報導了使用三個層析步驟 而不使用蛋白質A之抗體純化方法的因子篩檢（J. Chrom. A 1024 (2004) 79-85)。Mhatre，R.等人（J. Chrom. A 707 (1995) 225-231)探索了藉由陽離子交換層析法及pH梯度溶 離來純化抗體Fab片段。 WO 94/00561報導了人類單株抗恆河猴抗體及產生其之 細胞株。WO 2004/024866中報導了一種藉由離子交換層析 法純化多肽之方法，其中使用梯度洗滌以自一或多種污染 物解析感興趣之多肽。Schwarz，A.等人（Laborpraxis 21 (1997) 62-66)報導了以CM-HyperD管柱純化單株抗體。 WO 2004/076485報導了一種藉由蛋白質A及離子交換層 I09799.doc 1320788 析法純化抗體之方法。在EP 0 530 447中報導了—種用於 藉由三個層析步驟之組合純化IgG單株抗體之方法。仍 4,983,722中報導了自抗體製劑移除蛋白質八。 W0 95/關7報導了 |^蛋白fA陽離子交換層析法進 行自雜種融合瘤純化抗EGF_R/抗⑽雙特異性單株抗體。 P _ U6中報導了藉由❹離子交換層析法將抗體 早體自其多聚體中分離。us 5,429,746係關於應用疏水性 交互作用層析法組合層析法以純化抗體分子蛋白質。 【發明内容】 因此’本發明之目標在於提供另一種用於純化重组產生 之免疫球蛋白及分離單體及多聚體免疫球蛋白物種之方 法。 本發明提供—種純化免疫球蛋白之方法，其中該方法包 含以下步驟： u 提供包含免疫球蛋白、緩衝物質及視情況之鹽之:容 液； 合 b)在免疫球蛋白結合至弱離子交換材料之條件下使該溶 液與該弱離子交換材料相接觸； 0藉由使用包含緩衝物質及鹽之溶液經單—步驟自該弱 離子交換材料回收免疫球蛋白。 〃 本發明進—步提供—種測定用於以單-步驟純化方法自 離子交換層析材料溶離多肽之鹽濃度的方法，其包 兩個步驟： 下 a)步驟1，其包含以下子步驟： 109799.doc al)提供包含多狀、緩衝物質及視情況之鹽之溶液. a2)在多狀結合至離子交換材料之條件下使含有該多肽 之第厂等分溶液與該離子交換材料相接觸； a3)错由使用包含緩衝物質及鹽之溶液自離子交換材料 回收多肽，藉此線性增加鹽之濃度； Γ)測定多肽之第—館份開始自離子交換管柱溶離時該 鹽之起始濃度； b)步驟2，其包含以下子步驟： bi)在多肽結合至離子交換材料之條件下使含有該多 狀之第二等分溶液與該離子交換材料相接觸； 吻藉由使用三步驟之溶離方法自該離子交換材料回 收多肽，藉此 1)第一溶離步驟中之鹽濃度計算為 步驟a4)中測定之鹽之起始濃度與該鹽分子式中 表不之不同於氫之單價陽離子總數之乘積 與 緩衝鹽之濃度與該緩衝鹽分子式中表示之不同於 氫之單價陽離子總數之乘積的總和； ϋ)第二溶離步驟之鹽濃度為第一溶離步驟之鹽濃 度與1.25至1.35之間之因子的乘積； iii)第三溶離步驟之鹽濃度為第一溶離步驟之鹽濃 度與1.50至1.70之間之因子的乘積； 藉此步驟ii)及iii)中之因子如下判定：當起始濃度在 1〇爪肘與4〇111]\4之間時，該等因子分別為135與17〇， :Γ3= 農度在40 m_7°mM之間時，該等因子分別 ^ z、1.60,且當起始濃度大於70 11^時，該等

子分別為I.25H :)判定多狀在步驟b2)之三步驟溶離方法中之哪_子 f 離子交換管柱溶離，藉此測定用於以單一步驟 法自離子父換層析材料溶離多肽之鹽的漠度。 。申請案中根據以下定義使用該等術語： 料"矣-申” ^所用之術語”離子交換樹脂"或"離子交換材 暂。7F具有共價結合之帶電取代基的固定高分子量基 入，,；斤有電中性而言，無共價結合之抗衡離子與其結 口。’’離子交換材料"具有將其未經共價結合之抗衡離子與 周圍洛液中之類似帶電離子進行交換之能力。視其可交換 抗衡離子之電何而^，"離子交換樹脂”稱為陽離子交換樹 脂或陰一離子交換樹脂。視帶電基團(取代基)之性質而定， 子父換柯知稱為（例如在陽離子交換樹脂之情況下）磺 s夂樹月曰（S)或幾甲基樹脂（CM)。視帶電基團/取代基之化學 性質而定’ ”離子交換樹脂"可視共價結合帶電取代基之強 度而額外分為強或弱離子交換樹脂。例如，強陽離子交換 樹脂具有磺酸基作為帶電取代基，弱陽離子交換樹脂具有 羧基（較佳為羧甲基）作為帶電取代基，且弱陰離子交換樹 脂具有二乙胺基乙基作為帶電取代基。 陽離子交換樹脂可以不同名稱購自多個公司，諸如Bi0_ Rex ^ Macro-Prep CM(購自 Biorad Laboratories > Hercules，CA，USA)、弱陽離子交換劑wcx 2(購自 109799.doc 1320788

Ciphergen，Fremont，CA，USA)、Dowex® MAC-3(購自 Dow化學品公司-液體分離’ Midland，MI ’ USA)、 Mustang C(購自 Pall Corporation，East Hills，NY， USA)、纖維素 CM-23、CM-32、CM-52、hyper-D 及 partisphere(購自 Whatman pic，Brentford，UK)、 Amberlite® IRC 76、IRC 747、IRC 748、GT 73(購自 Tosoh Bioscience GmbH ， Stuttgart， Germany)、CM 1500、CM 3000(購自 BioChrom Labs，Terre Haute，IN， USA)及 CM-SepharoseTM Fast Flow(購自 GE Healthcare-Amersham Biosciences Europe GmbH ， Freiburg ， Germany) ° 弱離子交換材料之帶電取代基較佳為至少約90%之叛酸 基團，大於90%之羧酸基團’或大於95%之羧酸基團。 在本申請案中可交替使用之術語”單步驟溶離，，及”單步 驟梯度溶離"表示一種方法’其中例如引起溶離（意即結合 化合物自材料溶解）之物質的濃度立即增加或降低，意即 在單一步驟中直接自起始值/含量達到最終值/含量。 "多肽”為一種由肽鍵連接之胺基酸殘基之聚合物，不管 其為天然產生或合成產生。少於約20個胺基酸殘基之多肽 稱為"肽"。 "蛋白質”為包含一或多個多肽鏈之巨分子或多於1〇〇個 胺基酸殘基之多肽鏈。蛋白質亦可包含非肽組份，諸如碳 水化合物基團。碳水化合物及其他非肽取代基可藉由於其 中產生蛋白質之細胞而添加至蛋白質中，且視細胞類型而 109799.doc 丄 2變。在本文中根據其胺基酸主鏈結構來定義蛋白質；通 常不指定諸如碳水化合物基團之取代基，但其仍可存在。 勺：本申請案中可交替使用之術語，，抗體"及”免疫球蛋白” 包含至少兩個輕多肽鏈及兩個重多肽鏈。每一重及輕多肽 句3有可變區（通常為多肽鏈之胺基末端部分），其含有 • #合結構域以供與抗原交互作用。每一重及輕多肽鏈亦均 夕肽鏈之恆疋區（通常為羧基末端部分），其可調節抗 _ 冑與佰主組織或包括免疫系統之各種細胞、典型補體系統

之某些吞噬細胞及第一組份（clq)之因子的結合。輕及重 多肽鏈一般為完整鏈，其每一者基本上由可變區（意即VL • 或Vh)及70整恆定區（意即，在輕多肽鏈之情況下為cL，或 . 在重多肽鏈之情況下為CHl、CH2、CH3且視情況之cH4)組 成。根據本發明之抗體的可變區可接枝至其他同型之恆定 區。例如，編碼丨-同型重鏈可變區之聚核苷酸可接枝至編 - 碼另一重鏈種類（或子類）之恆定區的聚核苷酸。 i 如本文所用之術語"抗體"或"免疫球蛋白"係指由一或多 種大體上由抗體基因編碼之多肽組成之蛋白質。所識別之 抗體基因包括不同之恆定區基因以及大量抗體可變區基 因。抗體可以多種形式存在’例如包括Fv、Fab及F(ab)2以 及單鏈（例如 ’ Huston，J.S.等人，PNAS USA 85 (1988) 5879-5883，Bird等人，Science 242 (1988) 423-426 ;及一 般而言 ’ Hood等人，immun〇i〇gy，Benjamin N.Y.，第 2版 (1984)及 Hunkapiller 及 Hood，Nature 323 (1986) 15-16)。 在一實施例中，根據本發明之抗體包含單株抗體及其片 109799.doc 12 1320788 段，例如經分離之重鏈或輕鏈，或僅由恆定區及其片段組 成之重鏈或輕鏈。 熟習此項技術者已知通用之層析方法及其使用。例如參 見，Chromatography，第 5版，A部分：Fundamentals and Techniques ， Heftmann， E.(編)， Elsevier Science Publishing Company ，New York，（1992) ; Advanced

Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences，Deyl， Z.(編），Elsevier Science BV， Amsterdam，The Netherlands，（1998) ; Chromatography Today，Poole，C. F.，及 Poole，S. K.，Elsevier Science Publishing Company，New York，（1991) ; Scopes，Protein Purification · Principles and Practice (1982) ； Sambrook， J.等人（編），Molecular Cloning : A Laboratory Manual ’ 第 二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989 ;或 Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F. M.等人（編），John Wiley & Sons, Inc.，New York o 本發明提供一種用於純化免疫球蛋白之方法，其中該方 法包含以下步驟： a) 提供包含免疫球蛋白、緩衝物質及視情況之鹽之溶 液； b) 在免疫球蛋白結合至弱離子交換材料之條件下使該溶 液與該弱離子交換材料相接觸； c) 藉由使用包含缓衝物質及鹽之溶液經單一步驟自該弱 109799.doc -13 - 離子交換材料回收免疫球蛋白。 一免疫球蛋白之純化方法通常包含多步驟層析部分。在第 步驟中，藉由親和力層析法，例如以蛋白質A將非免疫 球蛋白多肽及蛋白質自免疫球蛋白鶴份中分離出來。之後 了 ^仃離子交換層析法以分離個別免疫球蛋白種類並移除 痕里蛋白質A，其已自第一管柱共溶離。最後，需要第三 曰析步驟W自多聚體及相同種類之片段分離免疫球蛋白單 有時聚集體的1較大（5%或更大），且不可能在第三純 化步驟巾將其有效分離，因此需要進—步之純化步驟。 在重、.且產生特異性免疫球蛋白中，可無需用於分離不同 免疫球蛋白種類之分離步驟。因此，對於重組產生之免疫 球蛋白的總純化方法可減少至兩個層析步驟。 改良性蛋白質A溶離液通常經陽離子交換材料層析處 理，其pH值低於各自免疫球蛋白之等電點。 在本發明之時，在吾人之實驗室中可獲得^量之抗& 1R抗體（wo細別23872)及(抗腿2抗體（卿 99/57134)) ’且因此本發明例示為該兩種免疫球蛋白。同 樣丄本發明通常以免疫球蛋白來實踐。該例示性描述僅作 為貫例且非用於限制本發明。提供該等實例以助於理解本 發明，其真實料陳述於附加之中請專利範圍中。 本發明描述-種用於自聚集體及其片段分離免疫球蛋白 單體以及耗盡其他多肽雜f之純化方法。由實驗可見，該 ，化可藉由使用弱離子交換樹脂，較佳藉由制弱陽離 交換樹脂來達^如由強與弱離子交換材料之比較所例 109799.doc 14 1320788 示’弱離子交換材料提供對於單體與聚集體形式之免疫球 蛋白的分離（參見實例】及2及實例9及12) 〇 在本發明之一實施例中’緩衝材料（物質）之pH值為pH 3.0至pH 10.0，較佳為pH 3〇至pH 7 〇，更佳為pH 4 〇至口^^ 6.0且最佳為pH 4.5至pH 5.5。 在一實施例中，pH值在單一步驟中保持恆定，意即在單 一步驟中維持相同值。 本發明之另一較佳項目在於本發明之方法可應用於在pH 6·〇至PH 14之PH範圍内具有6.0或更高（pI > 6〇)之等電點 (pi)且因此具有淨正電荷之免疫球蛋白。 本發月之較佳實施例為純化IgG或IgE種類之免疫球蛋 白0 在本發明之較佳實施例中使用弱陽離子交換材料。 例示季乂佳採用漠度範圍介於5 mM至1 〇〇 mM之間之 緩衝材料。 —為自弱離子交換材料回收結合免疫球蛋白，增加緩衝液 /二液之電導率。此可藉由增加緩衝鹽濃度或藉由向緩衝 :液中添加其他鹽(所謂溶離鹽)來實現。較佳溶離鹽為檸 ‘酸鋼、氯化鈉、硫酸鈉、碟酸納、氯化卸、硫酸卸、磷 夂鉀以及檸檬酸及磷酸之其他鹽，以及該等組份之任何 。物{其較佳為檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及其混合 物。 與 250 引起〆合離之鹽的遭度較佳介於5 mM與500 mM之間，更 佳於5 mM與_蝴之間，且尤其較佳介於$ 109799.doc 1320788 mM之間。 本發明-另-較佳實施例為?丨起溶離之 物質之用it，尤其為檸檬酸及其鹽或磷酸…作為緩衝 本發明之方法較佳為層析或分批方法，尤心 分批溶離之方法。 八較佳為包含 本發明之另一較佳實施例 法 。 *於， 純化為早-步驟之純化方 ，，單-步驟，，表示-種方法，其中一或多 PH'離子強度、鹽滚度及/或層析流動自起*值：如 最終值，意即該等條件i $ ° 然身為 逐步變化。 L線&變化相比為增量變化，意即 本發明之又一較佳眚尬士 ㈣實〜例在於該方法包含在該方法 a)之前藉由蛋白質八親和力 /騍 步驟。 “斤去純化免疫球蛋白之額外 離—步提供_種測定用於以單—步驟純化方法自 離子父㈣析材料㈣多肽之鹽濃度的 兩個步驟： ，、匕3 U下 a)步驟1，其包含以下子步驟： al)提供包含多肽、緩衝物質及視情況之鹽之溶液. &2)在多狀結合至離子交換材料之條件下使含有該多狀 之第-等分溶液與該離子交換材料相接觸； 叫藉由使用包含緩衝物質及鹽之溶液自離子交換材料 回收多肽，藉此線性增加鹽之濃度； 叫測定多肽之第—鶴份開始自料交換管柱溶離時該 109799.doc 16, 1320788 鹽之起始濃度； b)步驟2’其包含以下子步驟： 多 回 bl)在多肽結合至離子交換材料之條件下使含有該 肽之第二等分溶液與該離子交換材料相接觸； 叫藉由使用三步驟之溶離方法自該離子交換 收多肽，藉此 i)第一溶離步驟中之鹽濃度計算為

乂驟a4)中測疋之鹽之起始濃度與該鹽分子式中 表示之不同於氫之單價陽離子總數之乘積 緩衝鹽之濃度與該緩衝鹽分子式中表示之不同於 氫之單價陽離子總數之乘積的總和； …第二溶離步驟之鹽；農U帛-㈣步驟之鹽濃 度與1.25至Ι·35之間之因子的乘積；

Hi)第三溶離步驟之鹽濃度為第一溶離步驟之鹽濃 度與1.50至1.70之間之因子的乘積； 幻 /輝…及ln)中〜㈡丁如卜列定.W咫始濃度 與40mM之間時，該等因子分別為〗^與〗川 虽起始濃度在40 mM與70 mM之間時，該等因子分戈 為^30與]·60，且當起始濃度大於70 mM時，該等g 子分別為1.25與1.50 ; b3)判定多肽在步驟b2)之三步驟溶離方法中之哪—子 ㈣自離子交換管柱溶離’藉此敎用於以單 純 v. ,, ^ 法自離子交換層析材料溶離多肽之鹽的濃度。 109799.doc

-17- ^ S 步驟叫之因子界定了已南實驗所測定之範圍。該 非絕對值，而僅為目標值。可維持！ 之偏差。 本發明描述一種測定用於以單一步驟之用於“ 質材料純化纽之純化方法自離子交換層析 之鹽濃度的方法。 夕耿 自離子交換樹脂開始溶離多狀（較佳為免疫球蛋白）之曲 ^三步驟溶離方法之第二最優化步_提供了基礎。用辰 於溶離步驟之近似緩衝液/鹽濃度計算如下： 第一溶離步驟之鹽濃度等於 第-被加數，由線性增加之鹽梯度所測定之自離子交 換管柱開始溶離之鹽濃度與引起溶離之鹽分子式中表 示之不同於氫之單價陽離子總數之乘積， 第二被加數，緩衝鹽之濃度與該緩衝鹽分子式中表示 之不同於氫之單價陽離子總數之乘積的總和； 第一 /合離步驟之鹽濃度等於第一溶離步驟之鹽濃度與 1.25至1.35之間之因子的乘積； 第一,合離步驟之鹽濃度等於第一溶離步驟之鹽濃度與 1_50至1.70之間之因子的乘積。 濃度計算步驟中所包括之因子說明了濃度水平之間之間 隔且視起始’辰度來調節。當起始濃度較小時，意即介於⑺ mM與40 mM之間時，該等因子分別為i 35及！ 7〇，當為介 於40福與7〇 mM之間之中等起始濃度時，該等因子分別 為1.30及1.60，且當為大於7〇 之高起始濃度時該等 109799.doc •18· 1320788 因子分別為1.25及1.5G»該等因子界定了已由實驗所測定 之範圍。言亥等值非絕對值，而僅為目標值。可維持ι〇%之 偏差。 在計算中須考慮緩衝鹽，因為如實例3中所概述，自離 子交換樹脂溶離蛋白質可藉由在層析期間改變緩衝鹽濃度 來實現。若缓衝鹽濃度在層析期間保持恆定或與引起溶離 之鹽之起始濃度相比較小，則在計算期間可忽略以降低複 雜性。 在一實施例中，引起溶離之鹽非緩衝鹽，且步驟b2i)之 鹽濃度為由步驟a4)中之線性增加鹽梯度所測定之自離子 交換管柱開始溶離之鹽濃度與引起溶離之鹽分子式中表示 之不同於氫之單價陽離子總數的乘積。 將基於實例4以抗比-丨汉抗體來例示計算。如實例3所測 定，當起始濃度為由10 mM之緩衝液濃度及5 mM來自線性 梯度之貢獻組成之15 mM檸檬酸鈉時，該三個步驟計算如 下： •步驟一之目標濃度計算為3〇 mM(5 mM*2+1〇 mM*2) 擰檬酸納 詳言之：5 (起始濃度）乘以2(檸檬酸為三價酸，採 用二納鹽形式；因此分子式中存在兩個不同 於氫之單價陽離子）加上10 mM(緩衝鹽濃度） 乘以2(檸檬酸為三價酸，採用二鈉鹽形式； 因此分子式中存在兩個不同於氫之單價陽離 子） I09799.doc -19· 1320788 •步驟二之目標濃度計算為40 5 mM(30 mM * i 35)檸檬 酸鈉 詳言之：30 mM檸檬酸鈉為步驟一之濃度，將其乘以 1·35(起始濃度為15γώμ，因此選擇因子1.35) -步驟三之目標濃度計算為51 mM(3〇 mM *丨7〇)檸檬 酸鈉

詳言之·· 30 mM檸檬酸鈉為步驟一之濃度，將其乘以 170(起始濃度為15 mM，因此選擇因子1.70) 由實驗可見，在一較佳實施例中，藉由使用弱離子交換 材料，尤其較佳使用弱陽離子交換材料來達成該純化。 本發明之一較佳實施例在於多肽為免疫球蛋白，尤其較 佳為IgG或IgE種類之免疫球蛋白。 在本發明之一實施例中，緩衝材料（物質）ipH值為pH 3.0至pH 10.0，較佳為pH 3 〇至pH 7 〇，更佳為pH 4 〇至阳 6.0且最佳為pH 4.5至pH 5.5。

本發明之另一較佳項目在於本發明之方法可應用於在pH 6-〇至pH I4之pH範圍内具有6 〇或更高（p]^6 〇)之等電點 (Pi)且因此具有淨正電荷之免疫球蛋白。 如例示，較佳採用濃度範圍介於5 mM至1〇〇 mM之間 緩衝材料。 狗目離子交換材料 w 口队、口 〇凡仪冰赏臼，增加緩福 心液之電導率。此可藉由增加緩衝鹽濃度或藉由向緩 '' '、八他鹽（所謂溶離鹽）來貫現。較佳溶離雎* 酸鈉、氣斗右η I ^ 虱化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氣化鉀、硫酸鉀、 109799.doc -20- /00 2 ’以及檸檬酸及磷酸之其他鹽，以及該等组份之任何混 。物。尤其較佳為捧檬酸納、氣化納、氣化_及其任 合物。 引起'合離之鹽的濃度較佳介於5 mM與500 mM之間，更 佳介於5 mM與400 mM之間，且尤其較佳介於5福與25〇 mM之間。 本心明之另一較佳實施例為引起溶離之鹽同時作為緩衝 物質之用途’尤其為檸檬酸及其鹽或磷酸及其鹽。 本發明之方法較佳為層析或分批方法，尤其較佳為包含 分批溶離之方法。 本發明之另一較佳實施例在於純化為單一步驟之純化方 法。 本發明之又一較佳實施例在於該方法包含在該方法步驟 a)之别藉由蛋白質A親和力層析法純化免疫球蛋白之額外 步驟。 【實施方式】 提供如下實例及圖示以助於理解本發明，其真實範疇陳 述於附加申請專利範圍中。應瞭解，在不偏離本發明之精 神下’可對所陳述之程序進行修正。 實驗部分 材料： 將IgG4免疫球蛋白抗IL-ir抗體（下文稱為免疫球蛋白， WO 2005/023 872)於第一步驟中以蛋白質a親和力層析法純 化。在酸性條件下（10 mM檸檬酸鈉緩衝液，pH值3 〇±〇 5) 109799.doc •21 - 進行自蛋白質A管柱之溶離。在過濾步驟之前，將含有免 疫球蛋白之餾份的pH值以濃縮（例如，〖M)pH 9〇之缓衝 溶液（例如，三-羥甲基-胺基-甲烷（TRIS)或磷酸鹽緩衝液） 調節至pH 5.0。蛋白質A溶離液為蛋白質濃度介於5 mg/ml 與15 mg/ml之間之溶液且以檸檬酸鈉緩衝。該材料在下文 稱為改良性蛋白質A溶離液，其經製備以負載於陽離子交 換樹脂上。 實例1 在該比較性實例中描述一種以強陽離子交換樹脂及單一 步驟溶離進行之離子交換層析法。 層析條件： 樹脂： SP-瓊脂糖 動速率：1 60 cm/h 卞何. 10 mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5 〇 負載· 最大20 g蛋白質/L凝膠基質 洗滌步驟：10 mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5 〇 溶離·· 含有10〇 mM氯化鈉之25 檸檬酸鈉緩衝液， 調節至pH 5.0 將改良性蛋白質A溶離液應用於含有強陽離子交換樹脂 (SP瓊知糖）之層析管柱。在160 cm/h之流動速率下之負載 步驟之後，將管柱以平衡緩衝液（1〇管柱體積）洗滌。將結 β免疫球蛋白以單一步驟溶離方法溶離，藉此保持pH值恆 定且藉由添加氣化鈉改變（增加）電導率。 圖1中呈現抗IL-1R抗體於強陽離子交換樹脂sp•瓊脂糖

S 109799.doc -22- 1320788 上之陽離子交換層析之溶離層析圖。溶離為以氣化鈉進行 之單一步驟替代溶離，其不改變層析系統之ρΗ值。單體及 聚集體免疫球蛋白分子未經分離，且因此以此方法，不可 藉由與負載材料相比降低溶離液中之聚集體含量而獲得純 化β 實例2 在該實例中描述一種以弱陽離子交換樹脂及單一步驟溶 離進行之離子交換層析法。 為達成單體與聚集體形式免疫球蛋白之分離，採用弱陽 離子交換樹脂。使用該種樹脂，藉由分佈溶離增加電導率 伴隨有該樹脂上之特定pH轉變（即使當溶離緩衝液之pH保 持怪定時）。該效應使得便於區分（例如）單體免疫球蛋白與 聚集體形式。此外，其他雜質，如痕量宿主細胞蛋白質或 蛋白質A’可自單體平均餾份有效分離而無顯著產率損 失。

層析條件： 樹月曰· CM-Toyopearl 流動速率：160 cm/h 平衡： mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5.0 負載： 最大20 g蛋白質/L凝膠基質 洗蘇 溶離 1 0 mM棒樣酸納緩衝液，調節至pH 5.0 含有1 0 0 mΜ氣化納之2 5 mΜ捧樣酸納緩衝液， 調節至pH 5.0 將改良性蛋白質A溶離液應用於含有弱陽離子交換樹脂 109799.doc .23- 13207祕 (CM-T〇yopearl)之層析管柱。在16〇 cm/h之流動速率下之 負載步称之後，將管柱以平衡緩衝液⑽管柱體積）洗務。 將結合免疫球蛋白以單—步驟溶離方法溶離，藉此保持移 動相中之pH值值疋且藉由添加氯化鈉改變電導率。 广令呈現以與實例】"目同之層析條件，但此次使用弱 陽離子交換樹腊（CM_TGyGpear】）之溶離概況。此時出現第 二峰’其為主峰之肩峰。此分離行為不同於強陽離子交換

樹脂（諸如SP-瓊脂糖）之分離行為。對對應於主峰及第二肩 峰之餾份的分析顯示’在肩峰餾份中存在顯著量之聚集 體。在主峰餾份中無可偵測之聚集體(亦參見圖9a至0。 實例3 層析法之最優化-第一步驟··線性濃度梯度 為最優化弱陽離子交換材料上之陽離子交換層析，實施 由二個步驟組成之最優化程序： 第步驟為使用緩衝鹽檸檬酸鈉之線性濃度梯度之層析 法。同樣’亦可能保持緩衝鹽之濃肢定且可能混合引起 免疫球蛋白溶離之鹽濃度的線性增加4兩種情況下，溶 液的電導率增加’而移動相之PH值不改冑。例如，適用於 溶離之鹽為氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氣化鉀、硫酸鉀、 ’#檬酸及其鹽以及該等組份之混合物。因此，調 節所應用之濃度為1G福至_ mM，以將電導率設定為介 於約1 milli S/cm至約5〇 miUi s/cm之範圍内。 層析條件：

CM-T〇y〇pear J 樹脂： 109799.doc -24· /05 流動速率 : 160 cm/h 平衡： 10mM擰檬酸鈉緩衝液，調節至pH5 〇 負载： 最大20 g蛋白質/l凝膠基質 洗滌： l〇mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH5 〇 溶離： 線性梯度；自調節至PH 5.0之1〇 mM檸檬酸鈉 緩衝液至調節至PH 5.0之1〇〇 mM檸檬酸鈉緩 衝液 將改良性蛋白質A溶離液應用於含有弱陽離子交換樹脂 (CM-Toyopeari)之層析管柱。在丨的cm/h之流動速率下之 負載步驟之後’將管柱以平衡緩衝液（1〇管柱體積）洗務。 將結合免疫球蛋白以線性梯度溶離方法溶離，藉此保持移 動相中之PH值但定。緩衝鹽擦樣酸納之濃度㈣管柱體積 自1〇 ^線性增加至⑽祕。在彡到最終擰檬酸鋼濃度之 後’繼續溶離額外之4〇管柱體積。 圖3中呈現抗江_職體之線性緩衝液梯度溶離之層析 圖。單體及聚集體形式之免疫球蛋白溶離為半分離蜂，於 15 mM擦檬酸鈉之濃度起始目於 辰度匙始且於55 檸檬酸鈉之濃度結 束。 自陽離子交換樹脂回收結合免 尤役竦蛋白取決於所應用溶 液之電導率。因此，認為在回收步 ^ ，驟期間，溶離溶液中所 存在緩衝鹽之陽離子須實顼白胆 貞貫現自％離子交換樹腊溶離免疫球 蛋白。移動相之電導率以及離子 洩度由浴液中之離子總數 :貫現。因此，在此須考慮所採用緩衝鹽及所採用引起溶 離之鹽的-個分子式中不同於氫之單價陽離子的數目。 109799.doc -25- 1320788 實例4 層析法之最優化-第二步驟：三步驟濃度梯度溶離 如實例3中所測定，自離子交換樹脂開始溶離免疫球蛋 白之遍度為第二最優化步驟（三步驟溶離方法）提供了義 礎。用於分佈溶離之近似緩衝液/鹽濃度計算如下： 土 •第一溶離步驟之鹽濃度等於 第—被加數，如以線性增加鹽梯度所測定之自離子交

換管柱開始溶離時之鹽濃度與引起溶離之鹽分子式= 所表示之不同於氫之單價陽離子總數之乘積， 與 第一被加數，緩衝鹽之濃度與該緩衝鹽分子式中所^ 示之不同於氫之單價陽離子總數之乘積的總和； -第二溶離步驟之鹽濃度等於第一溶離步驟之鹽濃度多 1.25至1.35之間之因子的乘積；

-第三溶離步驟之鹽濃度等於第一溶離步驟之鹽濃度病 UO至1_7〇之間之因子的乘積。 /農度計算步驟中所包括之因子說明了濃度水平之間之間 心且視起始濃度來調節。當起始濃度較小時，意即介於“ 福與40 mM之間時’該等因子分別為135及！ 7〇,當為介 於4〇福與70福之間之中等起始濃度時’該等因子分別 為1.30及1.6〇，且當* 士认、 田為大於70 高起始濃度時，該 因子分別為1.25及1.50。 值 該等因子界定了已由實驗所敎之範I該等值非絕對 ，而僅為目標值。可維持Ίο%之偏差。 109799.doc -26 - 1320788 在4异中須考慮緩衝雎， 二n 鹽因為如實例3中所概述，自離 子父換树脂溶離蛋白質 濃度來實現。若缓— 析期間改變緩衝鹽 濃度在層析期間保持Μ或與起始 浪度相比較小（S鹽濃度 低複雜性。 /❶）財“期間可忽略以降 如貫例3所測定，當起始濃度為由10 mM之緩衝液濃产 及5 mM來自線性梯许夕Λ 士， 又之貝獻組成之15 mM檸檬酸鈉時，該

三個步驟可計算如不： _步驟1之目標濃度計算為3〇 mM(5 mM*2+1〇福*2)檸 檬酸納 詳5之· 5 mM(起始濃度）乘以2(檸檬酸為三價酸，採 用二鈉鹽形式；因此分子式中存在兩個不同 於氫之單價陽離子）加上10 mM(缓衝鹽濃度） 乘以2(檸檬酸為三價酸，採用二鈉鹽形式； 因此分子式中存在兩個不同於氫之單價陽離 子） ' _^驟2之目1濃度計算為4〇.5111]\/[(3〇11114*1.3 5)檸檬 酸鈉 詳&之· 30 mM檸檬酸鈉為步驟1之濃度，將其乘以 1-35(起始濃度為15rnM，因此選擇因子1.35) 步驟3之目標濃度計算為51 mM(30 mM * 1.70)檸檬 酸納 詳言之：30 mM擰檬酸鈉為步驟1之濃度’將其乘以 170(起始濃度為15mM，因此選擇因子1.70) 109799.doc •27· 1320788 層析條件： 料月曰. CM-Toyopearl 流動速率：WO cm/h 平衡： 負載： 洗滌： 溶離：

1 0 mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5 〇 最大20 g蛋白質/L凝膠基質 1 0 mM檸檬酸納緩衝液，調節至pH 5 〇 步驟1 : 34mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH5 〇 步驟2 : 44mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH5〇 步驟3 : 54mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH5 〇 將改良性蛋白質A溶離液應用於含有弱陽離子交換樹脂 (CM-T〇yopearl)之層析管柱。在16〇 cm/h之流動速率下之 負載步驟之後’將管柱以平衡緩衝液（1〇管柱體積）洗務。 將結合免疫球蛋白以分步梯度溶離方法（=其中溶離鹽之濃 度自起始值/水平逐步改變至最終值/水平之方法）溶離，藉 此保持移動相中之pH錄定。將緩衝鹽檸檬酸鋼之濃度在

第一步驟中自起始條件之10 mM增加至34 mM，在第二步 驟中增加至44 mM，且在最終步驟中增加至54賴。每= 增加鹽濃度之後’使H)管柱體積之溶離緩衝液在下—步驟 之前通過該管柱。在達到最終檸檬酸鈉濃度之後，繼續溶 離額外10管柱體積。 圖4中呈現三步驟梯度溶離抗a_iR抗體之溶離概況。單 體免疫球蛋白在第一步驟餾份中溶離且聚集體在第二步驟 餾份中溶離。 實例5 109799.doc •28- 1320788 層析法之最優化-第三步驟：以氣化鈉進行之單一步驟溶離 最優化程序之最終步驟改為單一步驟溶離方法（=其中溶 離鹽濃度自起始值立即改變為最終值之方法）^為此目 的’層析法之pH自5.0增加至5.5。該pH轉變改良了自蛋白 質A之分離，此係由於蛋白質八具有低於55之等電點。此 外，溶離鹽自檸檬酸納改為氯化鈉’檸檬酸鈉進一步用作

緩衝鹽。在進行此層析之後，已以該等館份進行額外分析 ⑽A、宿主細胞蛋白質、蛋白質A含量及wlc_ms進行之 糖基化圖案）。 層析條件： 樹脂： CM-瓊脂糖 流動速率：160 cm/h 平衡 負載 10 mM檸檬酸鈉，調節至pH 5 5 最大20 g蛋白質/L凝膠基質

調節至 10 mM擰檬酸鈉，調節至pH 5.5 含有150 mM氣化鈉之10爪“檸檬酸鈉 pH 5.5 將改良性蛋白質A溶離液應用於含有弱陽離子交換樹脂 (CM-瓊脂糖）之層析管柱。在16〇 cm/h之流動速率下之負 載步驟之後，將管柱以平衡緩衝液（1〇管柱體積）洗滌。將 結合免疫球蛋白以單一步驟梯度溶離方法（=其中溶離鹽之 濃度自起始值立即改變至最終值之方法）溶離，藉此保持 移動相中之pH值恆定。將緩衝鹽檸檬酸鈉之濃度保持恆定 且混合150 mM氣化鈉。在鹽濃度增加之後，使15管柱體 109799.doc •29- 積之溶離緩衝液通過該管柱以溶離結合免疫球蛋白。 圖5中呈現了以氯化鋼進行之單一步驟溶離的溶離層析 圖。單一步驟梯度層析法實現了主要單體餾份與聚集體/ 蛋白質A餾份之解析。單體免疫球蛋白之產率大於8〇〇/。^ 產率甚至可能大於95%。 實例6 以強陽離子交換樹脂（sp_瓊脂糖快速流）與以弱陽離子交換 樹脂（CM-違脂糖快速流）進行之分離的比較 對強sp-瓊脂糖快速流交換劑與CM-瓊脂糖快速流進行 比較。根據實例5進行兩次重複實驗（在圖6&及b中僅展示 來自每一管柱之一者）並進行額外分析（DNA、宿主細胞蛋 白質、蛋白質A含量，及以LC_MS進行之糖基化圖案）。 分析方法： 尺寸排阻層析法：樹脂：TSK 3000(Tosohaas) 管柱： 300 X 7.8 mm 流動速率：0.5 ml/min 緩衝液：含有250 mM氯化卸之200 mM磷酸鉀，調節至pH 7.0 DNA-臨限系統：例如參見 Merrick，H AHawlhschek，g，

Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403 蛋白質A ELISA :將微量滴定盤之孔塗覆以衍生自雞之多 株蛋白質A-IgG。結合之後，藉由以樣 本緩衝液洗蘇而移除未反應抗體《對於 蛋白質A結合而言，向孔中添加界定之 109799.doc 1320788

樣本體積》樣本中存在之蛋白質A由雞 抗體結合且滞留於盤之孔中。培育之後 移除樣本溶液且洗滌各孔。之後添加雞 衍生之多株抗蛋白質A_IgG生物素共軛 物及抗生蛋白鏈菌素過氧化酶共軛物以 供偵測。在進一步洗滌步驟之後，添加 基質溶液，導致形成有色反應產物。顏 色之強度與樣本十之蛋白質A含量成比 例。在界定時間之後，停止反應且量剛 吸光度。 宿主細胞蛋白質（HCP)ELISA : 將微量滴定盤之孔壁塗覆以血清白蛋白 與抗生蛋白鏈菌素之混合物。將山羊衍 生之抗HCP多株抗體結合至該微量滴定 盤之孔壁。在洗滌步驟之後，以不同遭 度之HCP校正序列及樣本溶液培育微量 滴定盤之不同孔。培育之後，藉由以緩 衝溶液洗滌而移除未結合之樣本材料。 為進行偵測，以抗體過氧化酶共軛物培 育各孔以偵測結合宿主細胞蛋白質。藉 由以ABTS培育且於405 nm下偵測來偵測 固定之過氧化酶活性。 層析條件： 樹脂 · ’ CM•瓊脂糖；SP-瓊脂糖 109799.doc

-31 - S 1320788 流動速率·· 1 60 cm/h 平衡： 10 mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5.5 負載： 最大20 g蛋白質/L凝膠基質 洗滌： 10 mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5.5 溶離·’ 含有150 mM氣化納之10 mM捧檬酸納緩衝液， 調節至pH 5.5 在圖6a及6b中呈現弱與強陽離子交換樹脂之溶離層析圖 之比較。使用弱陽離子交換樹脂（圖6a)達成了單體抗IL-1R 抗體自其他雜質之分離。在相同條件下，以強陽離子交換 樹脂（圖6b)不可能分離。收集並分析對應於該等峰之餾 份。列於表1中之分析結果顯示，以弱陽離子交換樹脂， 聚集體及其他雜質可自免疫球蛋白製劑有效耗盡。 表1呈現之資料顯示，以弱陽離子交換樹脂可能將單體 抗IL-1R抗體自聚集體形式抗體分離。此外，可耗盡DNA 雜質及蛋白質A雜質。 表1 :溶離液之分析：SP-瓊脂糖與CM-瓊脂糖之比較，呈 現兩種不同分離之結果 分析物 改良性蛋白 質A溶離液 SP-瓊脂糖溶離液 CM-瓊脂糖溶離液 單一峰 峰1 峰2 蛋白質A 之量 介於20與50 ng/mg之間 31 ng/mg 26 ng/mg 7.5 ng/mg 11 ng/mg 1638 ng/mg 550 ng/mg HCP 介於20與120 ng/mg之間 3.88 ng/mg 3.98 ng/mg 3.13 ng/mg 3.27 ng/mg 946 ng/mg 1424 ng/mg DNA 介於2800與’ 3500 pg/mg 之間 36 pg/mg 16 pg/mg 157 pg/mg 131 pg/mg 1918 pg/mg 1222 pg/mg 聚集體 存在 存在 存在 不存在 不存在 大量存在 大量存在 質量分析 SP-與CM-瓊脂糖之間未發現差異 109799.doc -32 - 比較性實例-不同電導率下之溶離 層析條件： 樹脂： CM-瓊脂糖 流動速率：160 cm/h 平衡 負載 洗滌 溶離 1 0 mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5.5 最大20 g蛋白質/L凝膠基質 1 0 mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5.5 含有100 mM、150 mM或200 mM氯化鈉之1〇 mM擰檬酸納緩衝液，調節至pH 5.5 將改良性蛋白質A溶離液應用於含有弱陽離子交換樹脂 (CM-緩知糖）之層析管柱。在wo cm/h之流動速率下之負 載步驟之後，將管柱以平衡緩衝液（丨〇管柱體積）洗滌。將 結合免疫球蛋白以單一步驟梯度溶離方法溶離，藉此保持 移動相中之pH值恆定。將緩衝鹽檸檬酸鈉之濃度保持恆定 且在三次不同操作中分別與100 mM ' 15〇 mM及200 mM氣 化鈉混合。在鹽濃度增加之後，使15管柱體積之溶離緩衝 液通過該管柱以溶離結合免疫球蛋白。該等溶離層析圖顯 示於圖7a至c中。 使用150 mM氯化鈉及200 mM氣化鈉作為溶離鹽濃度已 獲得良好分離。 實例8 比較性實例-不同pH值下之溶離 層析條件： I09799.doc -33- 1320788 樹脂： CM-瓊脂糖 流動速率 • 160 cm/h 平衡： 10 mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5.5 負載： 最大20 g蛋白質/L凝膠基質 洗滌： 10 mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5.5 溶離： 含有150 mM氣化鈉之10 mM擰檬酸鈉緩衝液， 調郎至pH 4.0或6.0 將改良性蛋白質A溶離液應用於含有弱陽離子交換樹脂 (CM-瓊脂糖）之層析管柱。在16〇 cm/h之流動速率下之負 載步驟之後，將管柱以平衡緩衝液（1〇管柱體積）洗滌。將 結合免疫球蛋白以單一步驟梯度溶離方法溶離，藉此保持 移動相中之pH值分別恆定為pH 4.0或6.0。將緩衝鹽檸檬酸 鈉之/辰度保持恆定且與丨5 〇 mM氯化鈉混合。在鹽濃度增 力之後使1 5管柱體積之溶離緩衝液通過該管柱以溶離結 σ免疫球蛋白β 5亥等溶離層析圖顯示於圖仏及匕中。 在PH 4.0下，該免疫球蛋白形成聚集體之趨勢增加。但 CM-瓊脂糖可將此較大量聚集體分離為兩個峰。 實例9 以強陽離子交換樹脂（SP•璦腊糖）層析分離單株抗職_2抗 體（WO 99/57134) 下文以Herceptin®(單株抗HER_2抗體）進—步例示本發 明。 以陽離子交換層析法於SP_瑗脂糖（強陽離子交換樹脂）上 進行Herceptin®之純化。在本發明之標準條件下，意即例 109799.doc -34- 丄 νυ/88 氣化鈉進行之分步溶離，未實現單體與聚集體形式抗 體之分離（圖10)。 層析條件： 樹脂： SP-瓊脂糖 流動速率：160 cm/h

平衡： 負載： 洗滌： 溶離： 25 mM 2·嗎啉基乙磺酸、50 mM氣化鈉，調節 至 pH 5.6 最大20 g蛋白質/l凝膠基質 25 mM 2-嗎啉基乙磺酸' 50 mM氣化鈉，調節 至 pH 5.6 25 mM 2-嗎啉基乙磺酸、95 mM氯化鈉，調節 至 pH 5.6

將單株抗HER-2抗體（下文稱為Herceptin®)在第一步驟 中以蛋白質A親和力層析法純化。在酸性條件下（1〇 檸 椽酸鈉緩衝液，PH值為3·0±0·5)進行自蛋白質A管柱之溶 離。在過濾步驟之前，將含有抗體之餾份的pH值以濃三_ 羥甲基-胺基-甲烷（TRIS)緩衝液調節至pH 5 6。蛋白質A溶 離液為蛋白質濃度在5 mg/ml與15 mg/ml之間之溶液且以 檸檬酸鈉緩衝。 將改良性蛋白質A溶離液應用於含有強陽離子交換樹脂 (瓊知糖）之層析官柱。在160 cm/h之流動速率下之負載 步驟之後，冑管柱w平衡緩衝液（1〇管柱體積）洗務。將結 。免疫球蛋白以單-步称溶離方法溶離，藉此保持pH值恆 定且藉由（逐步）增加氯化鈉濃度而改變電導率。該溶離層 109799.doc

S -35- 析圖顯示於圖1 0中。 未達成單體與聚集體形式抗體之分離。 實例10 層析法之最優化-第一步驟··線性濃度梯度 為改良兩種餾份之分離，已根據以抗IL_1R抗體概述之 程序最優化分離條件。 與抗IL-1R抗體最優化方法相比，使用線性梯度之（溶離） 鹽，意即氣化鈉，代替梯度緩衝物質。圖i 1中呈現對應於 最優化程序第一步驟之線性氯化鈉梯度溶離之層析圖。分 析證實，主峰尾部富集聚集體形式之抗體。 層析條件： 樹脂： CM-瓊脂糖 流動速率 平衡： 負載： 洗滌： 溶離：

：1 60 cm/h 10 mM擰檬酸鈉緩衝液， 最大20 g蛋白質/乙凝膠基 10 mM檸檬酸鈉緩衝液， 線性梯度；自調節至pH 緩衝液至調節至pH 5^之含有 調節至pH 5.5 質 調節至pH 5.5 5.5之1〇 mM擰檬酸鈉 400 mM氯化鈉之 1〒侔取奶硬衝液 將如實例9所述之改良性蛋白質 負A /合離液應用於含有弱 離子父換樹脂（CM-瓊脂糖）之層狀其心 ；層析管柱。在160 Cm/h之 動速率下之負載步驟之後，將管 s柱以千衡緩衝液（1〇管 體積)洗務。將結合免疫球蛋白以線性梯度溶離方法 離，措此保持移動相中之pH值及緩衝鹽濃度悝定。溶離 I09799.doc • 36 - 氯化鈉之浪度經4〇管柱體積自0 mM線性增加至400 mM。 該溶離層析圖顯示於圖11中》 、弱陽離子交換樹脂取代強陽離子交換樹脂導致第二峰 分離為第_±|久1 A Α 主峰之肩峰。該觀察類似於在抗IL_1R抗體情 况下之觀察。在8〇福之氣化納濃度下，免疫球蛋白開始 自管柱溶離。 實例11 層析法之最優化_第二步驟：三步驟濃度梯度溶離 如實例1 0中所測定且自圖丨丨呈現之層析圖得到之免疫球 蛋白開始溶離之起始濃度為80 mM之氣化鈉。為計算第二 最優化步驟之二個濃縮步驟，可忽略緩衝液濃度，因其較 低且在層析期間保持恆定。 氯化鈉之起始濃度為8〇 mM且氣化鈉在其分子式中具有 一不同於氫之陽離子。因此，三步驟溶離之濃度分別計算 為 80 mM、1〇〇 mM(= 8〇 mM乘以！ 25)及 12〇 mM(= 8〇 乘以1.50)氯化納。 層析條件： 樹脂： CM-瓊脂糖 流動速率：160 cm/h 平衡： 負載： 洗滌： 溶離： 10 mM檸檬酸鈉緩衝液，調節至pH 5 5 最大20 g蛋白質/L凝膠基質 10 mM檸檬酸鈉缓衝液，調節至pH 5 5 步驟1 :含有80 mM氯化鈉之1〇 檸檬酸鈉緩 衝液’調節至pH 5.5 I09799.doc -37· 1320788 步驟2 ,含有loo mM氣化鈉之1〇 檸檬酸鈉 緩衝液，調節至pH 5.5 v驟3.含有120 mM氯化鈉之1〇 mM檸檬酸鈉 緩衝液，調節至pH 5.5 將如實例9所述之改良性蛋白質八溶離液應用於含有弱陽 離子交換樹脂（CM4脂糖）之層析管柱。在副cm/h之流 動速率下之負載步驟之後’將管柱以平衡緩衝液（⑺管柱

體積）洗滌。將結合免疫球蛋白以分步梯度溶離方法溶 離’藉此保持移動相中之pH值及緩衝鹽檸檬義之濃度怪 H容離鹽氯化納之濃度在第—步驟中自起始條件之〇 福增加至80mM，在第二步驟中增加至⑽福，且在最 終步驟中增加至12G mMe在鹽濃度每次增加之後，使含 有指定氣化鈉濃度之10管柱體積之溶離緩衝液在下一濃縮 步驟之前通過該管柱。在達到最終檸檬酸鋼濃度之後，繼

續溶離額外之H)管柱體積。該溶離層㈣顯示於H 在三步驟溶離方法中，在氣化鋼濃度為⑼福之步驟中 溶離單體抗體。尺寸排阻分析證實，僅溶離單體抗體。在 氣化鈉濃度於第二步驟中增加至1〇〇福之後，溶離聚集 體形式（圖12)。 實例12 層析法之最優化-第三步驟：以氣化納進行之單一步驟溶離 層析條件： 樹脂： CM·瓊脂糖；SP-壤脂糖 流動速率：160cm/h I09799.doc •38· ^20788 平衡： mM檸檬酸鈉，調節至pH 5 5 負載： 最大20 g蛋白質/L凝膠基質 洗滌： 1〇 mM檸檬酸鈉，調節至1)11 5 5 溶離：含有80 mM氣化鈉之10 mM檸檬酸鈉，調節至 pH 5.5

將如貫例9所述之改良性蛋白質A溶離液應用於含有弱陽 離子交換樹脂（CM-瓊脂糖）之層析管柱。在16〇 cm/h之流 動速率下之負載步驟之後，將管柱以平衡緩衝液（1〇管2 體積）洗滌。將結合免疫球蛋白以單一步驟梯度溶離方法 溶離，藉此保持移動相中之pH值及緩衝鹽之濃度恆定。緩 衝鹽檸檬酸鈉之濃度保持恆定且與8〇 mM氯化鈉混合。在 鹽濃度增加之後，使15管柱體積之含有氣化鈉之溶離緩衝 液通過該管柱以溶離單體形式之結合抗HER_2抗體。為確 定單體與聚集體形式抗體之分離，對12〇 mM之氣化鈉濃 度進打第二步驟，此步驟對於製備單體抗體並非必要。在 該第二次增加之後，聚集體形式之抗體自管柱溶離。該溶 離層析圖顯示於圖13中。 右以強陽離子交換樹脂進行相同方法，則觀察到單體抗 體之顯著知失（與弱陽離子交換管柱上之95%或更大相比， 產率僅為約60%) ’儘管可見單體與聚集體形式抗體之分離 (圖 14) 〇 將適用於在弱陽離子交換材料上分離之條件應用於強陽 離子交換樹脂SP-瓊脂糖係無益的。即使兩種餾份可分 離，但單體抗體之產率降低至60%或甚至更低。 l〇9799.doc •39· 1320788 表2 :溶離液之分析：SP-瓊脂糖與CM-瓊脂糖之比較，呈 現兩種不同分離之結果 分析物 改良性蛋白 質A溶離液 SP-瓊脂糖 CM-瓊脂糖 峰1 峰2 峰1 峰2 蛋白質A 之量 17 ng/mg <3.9 ng/mg 5.7 ng/mg <3.9 ng/mg <3.9 ng/mg 32.2 ng/mg 39.7 ng/mg HCP 3243 ng/mg 49.0 ng/mg 183.4 ng/mg 107.5 ng/mg 126.2 ng/mg 1247 ng/mg 988 ng/mg DNA 1615 pg/mg 830 pg/mg 2635 Pg/mg 319 pg/mg 682 Pg/mg 10554 pg/mg <9300 pg/mg 聚集體 (SEC) 0.97 % 0% 32% 0% 0% 15.2% 23.0% 【圖式簡單說明】 圖1抗IL-1R抗體自強陽離子交換樹脂SP-瓊脂糖之單一 步驟溶離；單體及聚集體形式之受體抗體未分離且溶離為 -〇 圖2抗IL-1R抗體自弱陽離子交換樹脂CM-Toyopearl之單 一步驟溶離；單體及聚集體形式之受體抗體經部分分離且 溶離為一包含單體形式免疫球蛋白之主峰，及包含單體及 聚集體形式免疫球蛋白以及蛋白質A之第二峰。 圖3抗IL-1R抗體自弱陽離子交換樹脂CM-Toyopearl以pH 5.0之檸檬酸鈉的線性梯度溶離；單體及聚集體形式之受 體抗體經部分分離且在1 5 mM之檸檬酸鈉起始濃度下溶離 為包含單體形式免疫球蛋白之主峰，及包含單體形式、聚 集體形式免疫球蛋白及蛋白質A之混合物的第二峰。將該 兩種餾份之SEC分析插入至離子交換層析圖。在主峰中不 存在聚集體。相反，在第二峰中存在聚集形式之免疫球蛋 白。 109799.doc -40- 1320788 圖4KIL-1R抗體自弱陽離子交換樹脂cm_t〇灣㈤以 5.0之檸檬酸鈉的三步驟梯度溶離；單體及聚集體形式之 受體抗體經部分分離且在34 mM之檸檬酸納濃度下溶離為 包含單體形式免疫球蛋白之主峰，及在44福之檸樣酸鋼 濃度下溶離為包含單體及聚集體形式免疫球蛋白以及蛋白 質A之第二峰。 圖5抗HR抗體自弱陽離子交換樹脂⑽·環脂糖以15〇 mM之pH 5.5氯化納的單一步驟梯度溶離；單體及聚集體 形式受體抗體經分離且溶離為包含單體形式免疫球蛋白之 主峰’及包含早體及聚集體形式免疫球蛋白以及蛋白質A 之第二峰。 圖6a CM-璦脂糖快逮流上之溶離概況 對應於單體抗IL-1R抗體之主蜂，及主要含有聚集體^ 他雜質之較小第二峰。 〃 圖SP-璦脂糖快速流上抗IL_1R抗體之溶離概況；—蜂 可識別為含有單體免疫球蛋白、聚集體及其他未經該管桎 分離之雜質。 圖7&抗IL_1R抗體自弱陽離子交換樹脂CM緩脂糖以_ mM之pH 5_5氯化鈉的單一步驟梯度溶離。 圖7bd1R抗體自弱陽離子交換樹脂CM-填脂糖以15〇 mM之ρΗ 5.5氣化鈉的單一步驟梯度溶離。 圖7c抗抗體自弱陽離子交換樹脂CM_€脂糖以2〇〇 mM之PH 5.5氯化鈉的單一步驟梯度溶離。 圖8a抗IL-1R抗體自弱陪雜7 n Μ 抑刼離子父換樹脂CM·瓊脂糖以15〇 109799.doc •41 - 1320788 mM之pH 4.0氣化鈉的單一步驟梯度溶離。 圖8WIL-1R抗體自弱陽離子交換樹脂CM·填脂糖以ΐ5〇 mM之ΡΗ6·〇氣化鈉的單一步驟梯度溶離。 圖9a抗IL-1R抗體自弱陽離子交換樹脂cm_^脂糖之單一 步驟溶離；起始物質之尺寸排阻層析法展示單體及聚集體 兩種形式之免疫球蛋白。 圖9b抗IL-1R抗體自㈣離子交換樹脂⑽壤脂糖之單 -步驟溶離；單體及聚集體形式之受體抗體經部分分離且 溶離為-包含單體形式免疫球蛋白之主峰，及包含單體及 聚集體形式免疫球蛋白以及其他蛋白質之第二峰。在該圖 中展示第一（主）峰之尺寸排阳思4_匕-4· . 尺了排阻層析法。gSEC_管柱僅溶離 一峰’其為單體免疫球蛋白。 圖9cwL-1R抗體自弱陽離子交換樹脂糖之 步驟溶離；單體及聚集體形式之受體抗體經部分分離且溶 離為-包含單體形式免疫球蛋白之主峰，&包含單體及聚 集體形式免疫球蛋白以及其他蛋白質之第二峰。在該圖中 展示第二峰之尺寸排阻層析法。在該層析圖中，至少 三個峰，纟等效於單體及聚集體形式之免疫球蛋 蛋白質。 Z、他 圖10抗HER-2抗體自強陽離子交換樹脂sp_環脂糖之單一 步驟溶離；單體及聚集體形式之抗體未經分離且溶離為— ίΐφ 〇 圖U抗腿_2抗體自弱陽離子交換樹脂CM-瓊脂糖 5·5之捧檬酸納緩衝液中之氯化鈉的線性梯度溶離；單體 109799.doc

-42· =聚集體形式之抗體經部分分離且以8G mM之氯化納起始 濃度溶離為-包含單體形式免疫球蛋白之主峰；單體及聚 集體形式與蛋白質A-起溶離為主峰尾部之混合物。

圖12抗舰_2抗體自弱陽離子交換樹脂cm環脂糖以 5·5之檸檬酸鈉緩衝液中之氣化鈉的三步驟梯度溶離；單 體及聚集體形式之抗體經分離且在8G瘦之氯化鈉濃度下 溶離為一包含單體形式免疫球蛋白之主峰，及在i〇〇 mM 之氯化鈉濃度下溶離為包含單體及聚集體形式免疫球蛋白 以及蛋白質A之第二峰。 圖13抗HER-2抗體自弱陽離子交換樹脂CM瓊脂糖以8〇 mM之pH 5.5氣化鈉的單一步驟梯度溶離；單體形式經溶 離，而無聚集體形式；聚集體形式在第二氣化鈉步驟之後 溶離至120 mM之第二界定峰。 圖14抗HER-2抗體自強陽離子交換樹脂sp_瓊脂糖以8〇 mM之pH 5.5氯化鈉的單一步驟梯度溶離；獲得兩個峰： 峰1僅含有單體Herceptin®，峰2在第二氣化鈉步驟之後溶 離至120 mM’其含有大量單體Herceptin®及聚集體；單體 形式Herceptin®之產率小於600/。。 109799.doc 43-

Claims (1)

1. I -------- I -------- 1320788 第095118030號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(98年8月) 十、申請專利範圍： Ip年汐月 i d ι· 一種從聚集體及片段純化免疫球蛋白之方法，其中該方 法包含： )提供包3免疫球蛋白及ρΗ 30至〗〇〇之緩衝物質之溶 液； ’ b)在該免疫球蛋白結合至弱陽離子交換材料之條件下， 使該溶液與該弱離子交換材料相接觸·及 :由使用包3 pH 3.G至10.G之緩衝物質及鹽之溶液經 單./驟自該弱陽離子交換材料回收該單體免疫球蛋 白， 其中該鹽具有介於5至500福間之濃度且係選自由棒檬 =、氣化納、硫酸納、氯化鉀、硫㈣、磷酸鉀、檸 檬酸及磷酸鹽及該等組份之任何混合物所組成之群. 且其中該單一步驟表示一種方法，其中 件自起始值突然變為最終值。 — a斤條 2. ^求：:之方法，其特徵在於該緩衝物質係轉 其鹽、或填酸或其鹽。 ^ 3. 如請求項1之方法，1胜外+ μ #丄 方法。 方法係層析或分批次 4. 如請求们之方法，其特徵在 類免疫球蛋白之成員。 疫球蛋白係〇類或£ 5. 2求項^之方法’其特徵在於該回收步驟c)中之 具有pH 3.0至ρϋ 7.0之pH值。 。灰 6·如請求項丨至5中任—項之 〃特徵在於該陽離子交 109799-9808l0.doc 丄⑽788 換物貝係於低於該免疫球蛋白之等電點之pH值下處理。 7·如請求項⑴中任一項之方法，其特徵在於阳值在該單 一步驟中保持恆定。 8.如請求項⑴中任—項之方法，其特徵在於該免疫球蛋 白具有6.0或更高（pQ6.0)之等電點（pi)。 月求項1至5中任一項之方，其特徵在於步驟⑷中弓| 起溶離之鹽同時為缓衝物質。 109799-980810.doc