NO345362B1 - Fremgangsmåte for rensing av antistoffer - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår området rensing av et monoklonalt antistoff fra aggregater derav.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Proteiner og spesielt immunglobuliner spiller en viktig rolle i dagens medisinske portefølje. For human anvendelse må hver farmasøytisk substans oppfylle særskilte kriterier. For å ivareta sikkerheten av biofarmasøytiske midler for mennesker må nukleinsyrer, virus og vertscelleproteiner, som ville forårsake skade, fjernes spesielt. For å oppfylle spesifikasjoner fastsatt av myndighetene må ett eller flere rensetrinn etterfølge fremstillingsprosessen. Blant annet spiller renhet, kapasitet og utbytte en viktig rolle ved bestemmelse av en passende rensingsmetode.

Forskjellige metoder er veletablerte og vanlig anvendt for proteinrensing, slik som affinitetskromatografi med mikrobielle proteiner (f.eks. protein A eller protein G affinitetskromatografi), ionebytterkromatografi (f.eks. kationbytter (karboksymetylresiner), anionbytter (aminoetyl-resiner) og ”mixed-mode exchange”), thiophil adsorpsjon (f.eks. med beta-merkaptoetanol og andre SH-ligander), hydrofob interaksjon eller aromatisk adsorpsjonskromatografi (f.eks. med fenyl-sefarose, aza-arenofile resiner, eller m-aminofenylboronsyre), metallchelat affinitetskromatografi (f.eks. med Ni(II)- og Cu(II)-affinitetsmateriale), størrelseseksklusjonskromatografi, og elektroforetiske metoder (slik som gelelektroforese, kapillærelektroforese) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

Necina, R. et al., Biotechnol. Bioeng.60 (1998) 689-698, rapporterte oppfanging av humane monoklonale antistoffer direkte fra cellekultursupernatanter ved ionebyttermedium som fremviser høy ladningstetthet. I WO 89/05157 blir det rapportert en metode for rensing av produkt immunglobuliner ved å underlegge cellekulturmediet direkte en kationbytter-behandling. En ettrinns rensing av monoklonale IgG antistoffer fra mus ascites er beskrevet av Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth.115 (1988), 79-88.

En kombinasjon av metoder, dvs. en kaprylsyre presipitering og ionebytterkromatografi, ble anvendt av Raweerith, R. et al. (J. Immun. Meth.282 (2003) 63- 72), som en metode for å fraksjonere pepsin-kløyvet hest antivenom F(ab')2-antistoff. I WO 2003/102132 er kombinasjon av et ikke-affinitets rensetrinn og en høykapasitet tangential-flow filtrering beskrevet for rensing av proteiner. Kombinasjonen av to affinitetskromatografitrinn er angitt i WO 92/19973.

Follman, D. K., og Fahrner, R.L., rapporterte en faktoriell screening av antistoffrensingsmetoder ved anvendelse av tre kromatografitrinn uten protein A (J.

Chrom. A 1024 (2004) 79-85). Mhatre, R. et al. (J. Chrom. A 707 (1995) 225-231), utforsket rensing av antistoff Fab-fragmenter ved kationbytterkromatografi og pH gradienteluering.

WO 94/00561 angir humane monoklonale anti-rhesus antistoffer og cellelinjer som produserer disse. En fremgangsmåte for rensing av et polypeptid ved ionebytterkromatografi er rapportert i WO 2004/024866 i hvilken en gradient vask blir anvendt for å oppløse et polypeptid av interesse fra én eller flere kontaminanter. Schwarz, A. et al. (Laborpraxis 21 (1997) 62-66), angir rensing av monoklonale antistoffer med en CM-HyperD-kolonne.

WO 2004/076485 angir en prosess for antistoff-rensing ved protein A og ionebytterkromatografi. I EP 0530 447 beskrives en metode for rensing av IgG monoklonale antistoffer ved en kombinasjon av tre kromatografiske trinn. Fjerning av protein A fra antistoffpreparater er rapportert i US 4,983,722.

WO 95/16037 rapporterer rensing av anti-EGF-R/anti-CD3 bispesifikke monoklonale antistoffer fra hybride hybridomer utført ved protein A kationbytterkromatografi. Separering av antistoff-monomerer fra dets multimerer ved anvendelse av ionebytterkromatografi er angitt i EP 1084 136. US 5,429,746 angår anvendelse av hydrofob interaksjonskromatografi kombinasjon kromatografi for rensing av antistoffmolekyl proteiner.

EP-A2 0 085 747 beskriver en prosess for rensing av immunglobulin G fra plasma eller en morkakeprøve.

DE-A1 34 30 320 beskriver en metode for rensing av immunglobulin fra Cohns fraksjoner II og III av plasmaprøver.

WO-A1 00/71142 beskriver en metode for å rense y-globulin fra Cohns fraksjoner av plasmaprøver.

Oppsummering av oppfinnelsen

Følgelig er formålet ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for rensing av et monoklonalt antistoff fra aggregater derav, hvor fremgangsmåten omfatter

a) tilveiebringe en løsning omfattende et monoklonalt antistoff, en buffersubstans;

b) å bringe løsningen og et svakt kationbyttermateriale i kontakt under betingelser hvor det monoklonale antistoff binder seg til det svake kationbyttermaterialet;

c) utvinning av det monomere monoklonale antistoffet fra det svake kationbyttermaterialet i et enkelt trinn ved anvendelse av en løsning omfattende et buffersubstans og et salt,

hvor fremgangsmåten omfatter rensing av det monoklonale antistoffet med protein A-affinitetskromatografi før trinn a);

hvor det svake kationbyttermaterialet er et karboksymetylsvakt kationbyttermateriale,

hvor det monoklonale antistoffet er et medlem av immunoglobulinklasse G, hvor løsningen i utvinnelsestrinnet c) har en pH-verdi på fra pH 4,5 til pH 5,5, hvor saltet i trinn c) er valgt fra gruppen bestående av natriumklorid, natriumsulfat, kaliumklorid, kaliumsulfat, salter av sitronsyre, salter av fosforsyre og blandinger av disse komponentene,

hvor buffersubstansen har et konsentrasjonsområde på mellom 5 mM og 100 mM.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Disse betegnelsene blir anvendt i foreliggende søknad i overensstemmelse med den følgende definisjonen:

Betegnelsen "ionebytterresin" eller "ionebyttemateriale" som anvendt i foreliggende søknad angir en immobil høymolekylvekts matriks som bærer kovalent bundne ladete substituenter. For samlet ladningsnøytralitet er ikke kovalent bundne motioner bundet dertil. "Ionebyttematerialet" har evne til å utveksle dets ikke kovalent bundne motioner mot likt ladete ioner fra den omgivende løsningen. Avhengig av ladningen av dets utbyttbare motioner blir "ionebytterresinen" referert til som kationbytterresin eller som anionbytterresin. Avhengig av karakteren av den ladete gruppen (substituent) blir "ionebytterresinen" referert til som, f.eks. i tilfelle av kationbytterresiner, sulfonsyre-resin (S), eller karboksymetyl-resin (CM). Avhengig av de kjemiske egenskapene av den ladete gruppen/substituenten kan "ionebytterresinen" i tillegg klassifiseres som sterk eller svak ionebytterresin, avhengig av styrken av den kovalent bundne ladete substituenten. For eksempel har sterke kationbytterresiner en sulfonsyregruppe som ladet substituent, svake kationbytterresiner har en karboksylgruppe, foretrukket en karboksymetylgruppe, som ladet substituent, og svake anionebytterresiner har en dietylaminoetylgruppe som ladet substituent.

Kationbytterresiner er tilgjengelige under ulike navn fra en mengde selskaper slik som f.eks. Bio-Rex, Macro-Prep CM (tilgjengelig fra Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA), svak kationbytter WCX 2 (tilgjengelig fra Cipher-gen, Fremont, CA, USA), Dowex<® >MAC-3 (tilgjengelig fra Dow chemical company - liquid separations, Midland, MI, USA), Mustang C (tilgjengelig fra Pall Corporation, East Hills, NY, USA), Cellulose CM-23, CM-32, CM-52, hyper-D, og partisphere (tilgjengelig fra Whatman pic, Brentford, UK), Amberlite<® >IRC 76, IRC 747, IRC 748, GT 73 (tilgjengelig fra Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Tyskland), CM 1500, CM 3000 (tilgjengelig fra BioChrom Labs, Terre Haute, IN, USA) og CM-Sepharose<TM >Fast Flow (tilgjengelig fra GE Healthcare - Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Tyskland).

Foretrukket er de ladede substituentene av det svake ionebyttemateriale minst omtrent 90 % karboksylsyregrupper, mer enn 90% karboksylsyregrupper, eller mer enn 95 % karboksylsyregrupper. Betegnelsene "ettrinns eluering" og "ettrinns gradienteluering", som blir anvendt omvekslende i foreliggende søknad, angir en metode hvori f.eks. konsentrasjonen av en substans som bevirker eluering, dvs. dissosiasjon av en bundet forbindelse fra et materiale, økes eller reduseres på en gang, dvs. direkte fra en utgangsverdi/nivå til en endelig verdi/nivå, dvs. i et enkelt trinn.

Et "polypeptid" er en polymer av aminosyrerester forbundet av peptidbindinger, hva enten det er fremstilt naturlig eller syntetisk. Polypeptider med mindre enn ca.

20 aminosyrerester blir referert til som "peptider."

Et "protein" er et makromolekyl omfattende én eller flere polypeptidkjeder eller en polypeptidkjede på mer enn 100 aminosyrerester. Et protein kan også omfatte ikke-peptid-komponenter, slik som karbohydratgrupper. Karbohydrater og andre ikke-peptid-substituenter kan tilføyes til et protein ved cellen i hvilken proteinet blir produsert, og vil variere med typen av celle. Proteiner er definert heri i form av deres aminosyre ryggrad-strukturer; substituenter slik som karbohydratgrupper er generelt ikke angitt, men kan likevel være til stede.

Betegnelsene "antistoff" og "immunglobulin" som kan anvendes omvekslende i foreliggende søknad omfatter minst to lette polypeptidkjeder og to tunge polypeptidkjeder. Hver av de tunge og lette polypeptidkjedene inneholder en variabel region (generelt den aminoterminale delen av polypeptidkjeden) som inneholder et bindingsdomene for interaksjon med antigenet. Hver av de tunge og lette polypeptidkjedene omfatter også en konstant region (generelt den karboksyterminale delen) som kan mediere binding av antistoffet til vertens vev eller faktorer omfattende forskjellige celler av immunsystemet, noen fagocyttiske celler og en første komponent (CIq) av det klassiske komplementsystemet. Typisk er de lette og tunge polypeptidkjedene fullstendige kjeder, hver bestående hovedsakelig av en variabel region, dvs. VL eller VH, og en fullstendig konstant region, dvs. av CL i tilfelle av en lett polypeptidkjede eller av CH1, CH2, CH3 og eventuelt CH4 i tilfelle av en tung polypeptidkjede. De variable regionene av antistoffet ifølge oppfinnelsen kan være bundet til konstante regioner av andre isotyper. For eksempel kan et polynukleotid som koder for den variable regionen av en tung kjede av 1-isotypen bindes til polynukleotid som koder for den konstante regionen av en annen tung kjede klasse (eller subklasse).

Som anvendt her refererer betegnelsen "antistoff" eller "immunglobulin" til et protein bestående av ett eller flere polypeptider hovedsakelig kodet for av antistoffgener. De kjente antistoffgenene omfatter de ulike konstant region genene så vel som de utallige antistoff variabel region-genene. Antistoffer kan eksistere i mange forskjellige former, omfattende, for eksempel, Fv, Fab, og F(ab)2 så vel som enkeltkjeder (f.eks. Huston, J.S., et al., PNAS USA 85 (1988) 5879-5883; Bird et al., Science 242 (1988) 423-426; og, generelt, Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984) og Hunkapiller og Hood, Nature 323 (1986) 15-16). I én utførelsesform omfatter antistoffer ifølge oppfinnelsen monoklonale antistoffer og fragmenter derav, for eksempel isolerte tunge eller lette kjeder, eller tunge eller lette kjeder kun bestående av konstante regioner så vel som fragmenter derav.

Generelle kromatografiske metoder og anvendelser derav er kjent for fagfolk på området. Se for eksempel, Chromatography, 5. utgave, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, Nederland, (1998);

Chromatography Today, Poole, C. F., og Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Com- pany, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; eller Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for rensing av et monoklonalt antistoff fra aggregater derav, hvor fremgangsmåten omfatter

a) tilveiebringe en løsning omfattende et monoklonalt antistoff, en buffersubstans;

b) å bringe løsningen og et svakt kationbyttermateriale i kontakt under betingelser hvor det monoklonale antistoff binder seg til det svake kationbyttermaterialet;

c) utvinning av det monomere monoklonale antistoffet fra det svake kationbyttermaterialet i et enkelt trinn ved anvendelse av en løsning omfattende et buffersubstans og et salt,

hvor fremgangsmåten omfatter rensing av det monoklonale antistoffet med protein A-affinitetskromatografi før trinn a);

hvor det svake kationbyttermaterialet er et karboksymetylsvakt kationbyttermateriale,

hvor det monoklonale antistoffet er et medlem av immunoglobulinklasse G, hvor løsningen i utvinnelsestrinnet c) har en pH-verdi på fra pH 4,5 til pH 5,5, hvor saltet i trinn c) er valgt fra gruppen bestående av natriumklorid, natriumsulfat, kaliumklorid, kaliumsulfat, salter av sitronsyre, salter av fosforsyre og blandinger av disse komponentene,

hvor buffersubstansen har et konsentrasjonsområde på mellom 5 mM og 100 mM.

Foretrukket er fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor buffersubstansen er sitronsyre eller et salt derav eller fosforsyre eller et salt derav.

Foretrukket er fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 2, hvor fremgangsmåten er en kromatografisk eller en batchmetode.

Foretrukket er fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3, hvor pH-verdien holdes konstant i det enkelte trinn.

Foretrukket er fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor nevnte monoklonale antistoff har et isoelektrisk punkt (pl) på 6,0 eller mer (pI> 6,0).

Foretrukket er fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 5, hvor saltet som forårsaker eluering i trinn c) samtidig er buffersubstansen.

Rensingsprosessen av immunglobuliner omfatter generelt en flertrinns kromatografisk del. I det første trinnet blir ikke-immunglobulin polypeptider og proteiner separert fra immunglobulinfraksjonen ved en affinitetskromatografi, f.eks. med protein A. Deretter kan en ionebytterkromatografi utføres for å skille de individuelle immunglobulinklassene og for å fjerne spor av protein A, som er koeluert fra den første kolonnen. Til slutt er et tredje kromatografitrinn nødvendig for å separere immunglobulin-monomerer fra multimerer og fragmenter av samme klasse. Noen ganger er mengden av aggregater høy (5 % eller mer) og det er ikke mulig å separere dem effektivt i det tredje rensetrinnet hvilket nødvendiggjør ytterligere rensetrinn.

Med rekombinant fremstilling av spesifikke immunglobuliner kan separeringstrinnet for separering av ulike immunglobulinklasser unngås. Følgelig kan den samlede renseprosessen for rekombinant fremstilte immunglobuliner reduseres til to kromatografitrinn.

Det kondisjonerte protein A-eluatet blir generelt kromatografisk prosessert på et kationbyttermateriale ved pH-verdier under det isoelektriske punktet for det respektive immunglobulin-proteinet.

Anti IL-1R-antistoffet (WO 2005/023872) og Herceptin<®>, et anti-HER2-antistoff (WO 99/57134), var tilgjengelig i tilstrekkelige mengder i vårt laboratorie ved tidspunktet for oppfinnelsen og derfor er foreliggende beskrivelse eksemplifisert med disse to immunglobulinene. Likeså er beskrivelsen generelt anvendelig med immunglobuliner. Disse eksemplene tilveiebringes for å bidra til forståelse av foreliggende oppfinnelse, av hvilken det riktige omfang er vist i de tilhørende kravene.

Foreliggende beskrivelse beskriver en fremgangsmåte for rensing for separering av immunglobulin-monomerer fra aggregater og fragmenter så vel som deplesjon av andre polypeptid-forurensninger. Som det kan sees fra eksperimentene blir denne rensingen oppnådd ved anvendelse av svake kationbytterresiner. Som eksemplifisert ved sammenligning av sterke og svake ionebyttematerialer gir det svake ionebyttematerialet en seperering av monomere og aggregerte former av immunglobulinene (se eksemplene 1 og 2 og eksemplene 9 og 12).

I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen er pH-verdien av buffermaterialet (substansen) på fra pH 4,5 til pH 5,5.

I én utførelsesform blir pH-verdien holdt konstant i enkelt-trinnet, dvs. den blir opprettholdt ved samme verdi i enkelt-trinnet.

Et annen foretrukket moment ifølge foreliggende oppfinnelse er at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet for immunglobuliner som har et isoelektrisk punkt (pl) på 6,0 eller mer (pi ≥ 6,0) og derfor har en netto positiv ladning i pH-området som starter med pH 6,0 til pH 14.

Buffermaterialet blir foretrukket anvendt i et konsentrasjonsområde på mellom 5 mM og 100 mM som eksemplifisert.

For gjenvinning av de bundne immunglobulinene fra det svake ionebyttematerialet blir konduktiviteten av bufferen/ løsningen økt. Dette kan utføres ved tilsetning av andre salter, såkalte elueringssalter, til bufferløsningen. Foretrukne elueringssalter er natriumklorid, natriumsulfat, kaliumklorid, kaliumsulfat, salter av sitronsyre, salter av fosforsyre og blandinger av disse komponentene. Spesielt foretrukket er natriumcitrat, natriumklorid, kaliumklorid og blandinger derav.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er en kromatografisk eller batchmetode, spesielt foretrukket er en fremgangsmåte omfattende en batch eluering.

En annen foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er at rensingen er en ettrinns renseprosess.

En "ettrinns" refererer til en prosess hvori én eller flere betingelser, for eksempel pH, ionestyrke, konsentrasjon av et salt, og/eller strømningen av et kromatografi, alle blir endret på en gang fra en utgangsverdi til en sluttverdi, dvs. betingelsene blir endret gradvis, dvs. trinnvis, i kontrast til en lineær endring. Fremgangsmåten omfatter trinnet med en rensing av immunglobulinet ved en protein A-affinitetskromatografi før trinn a) ifølge fremgangsmåten.

De følgende eksemplene og figurene tilveiebringes for å bidra til forståelse av foreliggende oppfinnelse, for hvilken det riktige omfang er vist i de tilhørende kravene.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 Ettrinns eluering av anti IL-1R antistoff fra sterk kationbytterresin SP-Sepharose; monomere og aggregerte former av reseptorantistoffet er ikke separert og eluerer som én topp.

Figur 2 Ettrinns eluering av anti IL-1R antistoff fra svak kationbytterresin CM-Toyopearl; monomere og aggregerte former av reseptorantistoffet er delvis separert og eluerer som én hovedtopp omfattende den monomere formen av immunglobulinet og som en andre topp, omfattende monomere og aggregerte former av immunglobulinet så vel som protein A.

Figur 3 Lineær gradient-eluering av anti IL-1R antistoff fra svak kationbytterresin CM-Toyopearl med natriumcitrat ved pH 5,0; monomere og aggregerte former av reseptorantistoffet er delvis separert og eluerer som en natriumcitrat utgangskonsentrasjon på 15 mM som en hoved topp omfattende den monomere formen av immunglobulinet og som en andre topp, omfattende en blanding av monomer form, aggregerte former av immunglobulinet, og protein A. SEC-analyse av de to fraksjonene er innsatt i ionebytter kromatogrammet. I hoved-toppen er aggregater fraværende. I motsetning til dette er aggregerte former av immunglobulinet til stede i den andre toppen.

Figur 4 Tretrinns gradienteluering av anti IL-1R antistoff fra svak kationbytterresin CM-Toyopearl med natriumcitrat ved pH 5,0; monomere og aggregerte former av reseptorantistoffet er delvis separert og eluerer som en hoved-topp omfattende den monomere formen av immunglobulinet ved en natriumcitrat-konsentrasjon på 34 mM og som en andre topp, omfattende monomere og aggregerte former av immunglobulinet så vel som protein A ved en natriumcitratkonsentrasjon på 44 mM.

Figur 5 Ettrinns gradienteluering av anti IL-1R antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose med 150 mM natriumklorid ved pH 5,5; monomere og aggregerte former av reseptorantistoffet er separert og eluerer som en hoved-topp omfattende den monomere formen av immunglobulinet og som en andre topp, omfattende monomere og aggregerte former av immunglobulinet så vel som protein A.

Figur 6a Elueringsprofil på en CM-Sepharose fast flow; to topper kan identifiseres: en hoved-topp, svarende til det monomere anti IL-1R-antistoffet, og en mindre andre topp, som hovedsakelig inneholder aggregater og andre forurensninger.

Figur 6b Elueringsprofil av anti IL-1R-antistoff på en SP-Sepharose fast flow;

det kan identifiseres én topp som inneholder monomert immunglobulin, aggregater og andre forurensninger som ikke har blitt separert på denne kolonnen.

Figur 7a Ettrinns gradienteluering av anti IL-1R-antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose med 100 mM natriumklorid ved pH 5,5.

Figur 7b Ettrinns gradienteluering av anti IL-1R-antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose med 150 mM natriumklorid ved pH 5,5.

Figur 7c Ettrinns gradienteluering av anti IL-1R-antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose med 200 mM natriumklorid ved pH 5,5.

Figur 8a Ettrinns gradienteluering av anti IL-1R-antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose with 150 mM natriumklorid ved pH 4,0.

Figur 8b Ettrinns gradienteluering av anti IL-1R-antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose med 150 mM natriumklorid ved pH 6,0.

Figur 9a Ettrinns eluering av anti IL-1R-antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose; størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) av utgangsmaterialet viser både monomere og aggregerte former av immunglobulinet.

Figur 9b Ettrinns eluering av anti IL-1R-antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose; monomere og aggregerte former av reseptorantistoffet er parielt separert og eluerer som én hoved-topp omfattende den monomere formen av immunglobulinet og som en andre topp, omfattende monomere og aggregerte former av immunglobulinet så vel som annet protein. I denne figuren er størrelseseksklusjonskromatografi av den første (hoved) toppen vist. Kun én topp er eluert fra SEC-kolonnen, som er det monomere immunglobulinet.

Figur 9c Ettrinns eluering av anti IL-1R-antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose; monomere og aggregerte former av reseptorantistoffet er delvis separert og eluerer som én hoved-topp omfattende den monomere formen av immunglobulinet og som en andre topp, omfattende monomere og aggregerte former av immunglobulinet så vel som annet protein. I denne firguren er størrelseseksklusjonskromatografi av den andre toppen vist. I kromatogrammet kan minst tre topper ses, ekvivalent med

monomere og aggregerte former av immunglobulinet og annet protein.

Figur 10 Ettrinns eluering av anti-HER-2 antistoff fra sterk kationbytterresin SP-Sepharose; monomere og aggregerte former av antistoffet er ikke separert og eluerer som én topp.

Figur 11 Lineær gradienteluering av anti-HER-2 antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose med natriumklorid i natriumcitratbuffer ved pH 5,5; monomere og aggregerte former av antistoffet er delvis separert og eluerer med en utgangskonsentrasjon på 80 mM natriumklorid som én hoved-topp omfattende den monomere formen av immunglobulinet; de monomere og aggregerte formene eluerer som en blanding ved avslutningen av hoved-toppen sammen med protein A.

Figur 12 Tretrinns gradienteluering av anti-HER-2 antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose med natriumklorid i natriumcitratbuffer ved pH 5,5; monomere og aggregerte former av antistoffet er separert og eluerer som én hoved-topp omfattende den monomere formen av immunglobulinet ved en natriumkloridkonsentrasjon på 80 mM og som en andre topp omfattende monomere og aggregerte former av immunglobulinet så vel som protein A ved en natriumkloridkonsentrasjon på 100 mM. Figur 13 Ettrinns gradienteluering av anti-HER-2 antistoff fra svak kationbytterresin CM-Sepharose med 80 mM natriumklorid ved pH 5,5; den monomere formen blir eluert fra aggregerte former; de aggregerte formene eluerer etter et andre natriumklorid-trinn til 120 mM som en andre definert topp.

Figur 14 Ettrinns gradienteluering av anti-HER-2 antistoff fra sterk kationbytterresin SP-Sepharose med 80 mM natriumklorid ved pH 5,5; to topper blir oppnådd: topp 1 inneholder kun monomer Herceptin<®>, topp 2, som blir eluert etter et andre natriumklorid-trinn til 120 mM, inneholder en stor mengde av monomer Herceptin<® >og aggregater; utbyttet av Herceptin<® >i sin monomere form er mindre enn 60%.

Eksperimentell del

Materiale:

Et IgG4 immunglobulin anti IL-1R-antistoff (heretter referert til som immunglobulin, WO 2005/023872) ble renset i et første trinn med et protein A affinitetskromatografi. Eluering fra protein A-kolonnen ble utført under sure betingelser (10 mM natriumcitrat-buffer, pH-verdi 3,0 ± 0,5). Før filtreringstrinnet ble pH-verdien av fraksjonen inneholdende immunglobulinet justert med en konsentrert, f.eks.1 M, bufferløsning med pH 9,0 (f.eks. tris-hydroksymetyl-aminometan (TRIS) eller fosfatbuffer) til pH 5,0. Protein A-eluatet er en løsning med en proteinkonsentrasjon på mellom 5 mg/ml og 15 mg/ml og blir bufret med natriumcitrat. Dette materialet blir refererert til i det følgende som kondisjonert protein A-eluat, som blir fremstilt for lasting (”loading”) på en kationbytterresin.

Eksempel 1

I dette komparative eksemplet blir en ionebytterkromatografi med en sterk kationbytterresin og ettrinns eluering beskrevet.

Kromatografiske betingelser:

Resin: SP-Sepharose

Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,0 Lasting: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vasketrinn: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,0 Eluering: 25 mM natriumcitratbuffer med 100 mM natriumklorid, justert til pH 5,0

Det kondisjonerte protein A-eluatet ble applisert på en kromatografi-kolonne inneholdende en sterk kationbytterresin (SP-Sepharose). Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrium-buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en ettrinns elueringsmetode, hvorved pH-verdien ble holdt konstant og konduktiviteten ble variert (økt) ved tilsetning av natriumklorid.

I figur 1 er eluerings kromatogrammet for kationbytterkromatografi av anti IL-1R-antistoffet på den sterke kationbytterresinen SP-Sepharose presentert. Elueringen er en ettrinns erstatnings-eluering med natriumklorid uten endring av pH-verdien av det kromatografiske systemet. De monomere og aggregerte immunglobulinmolekylene er ikke separert og følgelig kan, ved denne metoden, ingen rensing ved reduksjon av aggregat-innholdet i eluatet sammenlignet med det lastede materialet oppnås.

Eksempel 2

I dette eksemplet blir en ionebytterkromatografi med en svak kationbytterresin og ettrinns eluering beskrevet.

For å oppnå separering av monomere og aggregerte former av et immunglobulin, ble en svak kationbytterresin anvendt. Ved anvendelse av denne type resin blir en økning av konduktiviteten ved en trinn eluering fulgt av et særskilt pH skift i resinen (selv når pH av elueringsbufferen forblir konstant). Denne effekten letter evnen til å skjelne f.eks. mellom monomere immunglobuliner og aggregerte former. Videre kan andre forurensninger, som spor av vertscelleproteiner eller protein A, effektivt separeres fra den monomere gjennomsnitt fraksjonen, uten signifikant tap av utbytte.

Kromatografiske betingelser:

Resin: CM-Toyopearl

Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,0 Lasting: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vask: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,0 Eluering: 25 mM natriumcitratbuffer med 100 mM natriumklorid, justert til pH 5,0

Det kondisjonerte protein A-eluatet ble applisert på en kromatografikolonne inneholdende en svak kationbytterresin (CM-Toyopearl). Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrerings-buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en ettrinns elueringsmetode, hvorved pH-verdien i den mobile fasen ble holdt konstant og konduktiviteten ble variert ved tilsetning av natriumklorid.

I figur 2 presenteres elueringsprofilen med samme kromatografiske betingelser som i eksempel 1 men denne gangen med en svak kationbytterresin, CM-Toyopearl. Her fremkommer en andre topp som en skulder på hoved-toppen. Denne separerings-opptreden er forskjellig fra den med en sterk kationbytterresin, slik som SP-Sepharose. En analyse av fraksjoner svarende til hoved-toppen og til den andre skulder-toppen viste at en signifikant mengde av aggregater var til stede i skulder topp-fraksjonen. Ingen aggregater var detekterbare i hoved-toppfraksjonene (se også figurene 9a til c).

Eksempel 3

Optimalisering av den kromatografiske fremgangsmåten – første trinn: lineær konsentrasjonsgradient.

For å optimere kationbytterkromatografien på et svakt kationbytter-materiale ble det utført en optimaliseringsprosess, som består av tre trinn:

Det første trinnet er en kromatografi som anvender en lineær konsentrasjonsgradient av buffer-saltet, natriumcitrat. Like godt er det mulig å holde konsentrasjonen av buffer-saltet konstant og å blande inn en lineært økende konsentrasjon av et salt som bevirker eluering av immunglobulinet. I begge tilfeller blir konduktiviteten av løsningen økt uten en endring av pH-verdien av den mobile fasen. Salter egnet for eluering er f.eks. natriumklorid, natriumsulfat, natriumfosfat, kaliumklorid, kaliumsulfat, kaliumfosfat, sitronsyre og salter derav så vel som blandinger av disse bestanddelene. Konsentrasjonene på fra 10 mM til 500 mM, som blir anvendt, blir justert i samsvar for å fastsette konduktiviteten i området på fra omtrent 1 milli S/cm til omtrent 50 milli S/cm.

Kromatografiske betingelser:

Resin: CM-Toyopearl

Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,0

Last: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vask: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,0 Eluering: lineær gradient; fra 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,0, til 100 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,0

Det kondisjonerte protein A-eluatet ble applisert på en kromatografikolonne inneholdende en svak kationbytterresin (CM-Toyopearl). Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrerings buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en metode for lineær gradienteluering, hvorved pH-verdien i den mobile fasen ble holdt konstant. Konsentrasjonen av buffersaltet, natriumcitrat, ble økt lineært fra 10 mM til 100 mM over 40 kolonnevolumer. Etter at den siste natriumcitrat-konsentrasjonen var nådd ble eluering fortsatt i ytterligere 40 kolonnevolumer.

I figur 3 er kromatogrammet av den lineære buffer-gradientelueringen av anti IL-1R-antistoffet presentert. Den monomere og den aggregerte formen av immunglobulinet eluerer i en semi-frittliggende topp som starter ved en konsentrasjon på 15 mM natriumcitrat og ender ved en konsentrasjon på 55 mM natriumcitrat.

Utvinningen av det bundne immunglobulinet fra kationbytterresinen avhenger av konduktiviteten av den anvendte løsningen. Derfor må kationene av buffersaltet til stede i den eluerende løsningen under gjenvinningstrinnet anses som å bevirke elueringen av immunglobulinet fra kationbytterresinen. Konduktiviteten så vel som ionestyrken av den mobile fasen blir bevirket av det totale antallet av ioner i løsningen. Følgelig må antallet av monovalente kationer forskjellig fra hydrogen i én molekylformel av det anvendte buffersaltet og det anvendte saltet som bevirker eluering tas i betraktning herigjennom.

Eksempel 4

Optimalisering av den kromatografiske metoden – andre trinn: tretrinns konsentrasjonsgradient-eluering.

Konsentrasjonen, ved hvilken elueringen av immunglobulinet fra ionebytterresinen starter, som bestemt i eksempel 3, gir grunnlaget for det andre optimaliseringstrinnet, en tretrinns elueringsmetode. De omtrentlige buffer/saltkonsentrasjonene for trinn elueringen blir beregnet som følger:

- saltkonsentrasjonen av det første elueringstrinnet er lik summen av som første summand produktet av konsentrasjonen av saltet, ved hvilken elueringen fra ionebytterkolonnen starter som bestemt med den lineært økende saltgradienten, og det totale antallet av monovalente kationer forskjellig fra hydrogen angitt i molekylformelen av saltet som bevirker elueringen

og

som andre summand produktet av konsentrasjonen av buffer-saltet og det totale antallet av monovalente kationer forskjellig fra hydrogen angitt i molekylformelen for buffer-saltet;

- saltkonsentrasjonen av det andre elueringstrinnet er lik produktet av saltkonsentrasjonen av det første elueringstrinnet og en faktor på mellom 1,25 og 1,35;

- saltkonsentrasjonen av det tredje elueringstrinnet er lik produktet av saltkonsentrasjonen av det første elueringstrinnet og en faktor på mellom 1,50 og 1,70.

Faktoren inkludert i beregningen av konsentrasjonstrinnene gjør rede for intervallet mellom konsentrasjonsnivåene og blir justert avhengig av utgangskonsentrasjonen. Ved lave utgangskonsentrasjoner, dvs. mellom 10 mM og 40 mM, er faktorene 1,35 og 1,70 henholdsvis, ved middels utgangskonsentrasjoner på mellom 40 mM og 70 mM er faktorene 1,30 og 1,60 henholdsvis, og ved høye utgangskonsentrasjoner på mer enn 70 mM er faktorene 1,25 og 1,50 henholdsvis.

Faktorene definerer et område som har blitt bestemt eksperimentelt. Disse verdiene er ingen absolutte verdier men kun en mål-verdi. Et avvik på 10% er holdbart.

Buffer-saltet må gjøres rede for i beregningen fordi det er mulig som skissert i eksempel 3 at elueringen av et protein fra en ionebytterresin kan bevirkes ved en endring i buffersalt-konsentrasjonen under kromatografien. Dersom buffersaltkonsentrasjonen blir holdt konstant under kromatografien eller er lav sammenlignet med utgangskonsentrasjonen (≤15% av saltkonsentrasjonen) kan den neglisjeres under beregningen for å redusere kompleksiteten.

Med en utgangskonsentrasjon på 15 mM natriumcitrat, som bestemt i eksempel 3, bestående av en 10 mM buffer-konsentrasjon og et 5 mM bidrag fra den lineære gradienten, kan de tre trinnene beregnes som følger:

- mål-konsentrasjonen for trinn 1 blir beregnet til å være 30 mM (5 mM*2 10 mM*2) natriumcitrat

i detaljer: 5 mM (utgangskonsentrasjon) multiplisert med to (sitronsyre er en trivalent syre, anvendt som dinatriumsalt; derfor er to monovalente kationer forskjellig fra hydrogen til stede i molekylformelen) pluss 10 mM (buffersalt-konsentrasjon) multiplisert med to (sitronsyre er en trivalent syre, anvendt som dinatriumsalt; derfor er to monovalente kationer forskjellig fra hydrogen til stede i molekylformelen)

- mål-konsentrasjonen for trinn 2 er beregnet til å være 40,5 mM (30 mM * 1,35) natriumcitrat

i detaljer: 30 mM natriumcitrat er konsentrasjonen av trinn 1 multiplisert med 1,35 (utgangskonsentrasjonen er 15 mM, derfor er som faktor 1,35 valgt)

- mål-konsentrasjonen for trinn 3 blir beregnet til å være 51 mM (30 mM * 1,70) natriumcitrat

i detaljer: 30 mM natriumcitrat er konsentrasjonen av trinn 1 multipliset med 1,70 (utgangskonsentrasjonen er 15 mM, derfor er som faktor 1,70 valgt)

Kromatografiske betingelser:

Resin: CM-Toyopearl

Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,0 Lasting: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vask: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,0 Eluering: trinn 1: 34 mM natriumcitratbuffer, justert til pH 5,0

trinn 2: 44 mM natriumcitratbuffer, justert til pH 5,0 trinn 3: 54 mM natriumcitratbuffer, justert til pH 5,0

Det kondisjonerte protein A-eluatet ble applisert på en kromatografikolonne inneholdende en svak kationbytterresin (CM-Toyopearl). Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrerings-buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en trinn gradientelueringsmetode (= en metode hvori konsentrasjonen av eluerings-saltet blir endret trinnvis fra en utgangsverdi/nivå til en endelig verdi/nivå), hvorved pH-verdien i den mobile fasen ble holdt konstant. Konsentrasjonen av buffersaltet, natriumcitrat, ble økt fra 10 mM som utgangskonsentrasjon til 34 mM i det første trinnet, til 44 mM i det andre trinnet, og til 54 mM i det siste trinnet. Etter hver økning av saltkonsentrasjonen ble ti kolonnevolumer av eluerings-bufferen passert gjennom kolonnen før neste trinn. Etter at den siste natriumcitrat-konsentrasjonen var nådd ble eluering fortsatt i ytterligere 10 kolonnevolumer.

I figur 4 presenteres elueringsprofilen for den tretrinns gradientelueringen av anti IL-1R-antistoff. Det monomere immunglobulinet eluerer i første trinn-fraksjonen og aggregatene eluerer i andre trinn-fraksjonen.

Eksempel 5

Optimalisering av den kromatografiske metoden – tredje trinn: ettrinns eluering med natriumklorid.

Det endelige trinnet i optimaliseringsmetoden er tilpasning til en ettrinns elueringsmetode (= en metode hvori konsentrasjonen av eluerings-saltet blir endret på én gang fra en utgangsverdi til en endelig verdi). For dette formål blir pH av kromatografiet økt fra 5,0 til 5,5. Denne pH-endringen forbedrer separering fra protein A, passende at protein A har et isoelektrisk punkt under 5,5. I tillegg blir eluerings-saltet endret fra natriumcitrat, som lengre fram blir anvendt som buffersalt, til natriumklorid. Ytterligere analyser har blitt foretatt (DNA, vertscelle-protein, protein A-innhold og glykosyleringsmønster med LC-MS) med fraksjonene etter denne kromatografiske kjøringen.

Kromatografiske betingelser:

Resin: CM-Sepharose

Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Lasting: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vask: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Eluering: 10 mM natriumcitrat med 150 mM natriumklorid, justert til pH 5,5

Det kondisjonerte protein A-eluatet ble applisert på en kromatografikolonne inneholdende en svak kationbytterresin (CM-Sepharose). Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrerings-buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en ettrinns gradienteluerings-metode (= en metode hvori konsentrasjonen av eluerings-saltet blir endret på én gang fra en utgangsverdi til en endelig verdi), hvorved pH-verdien i den mobile fasen ble holdt konstant. Konsentrasjonen av buffersaltet, natriumcitrat, ble holdt konstant og 150 mM natriumklorid ble tilsatt. Etter økningen av saltkonsentrasjonen ble femten kolonnevolumer av eluerings-bufferen passert gjennom kolonnen for å eluere det bundne immunglobulinet.

Eluerings-kromatogrammet av ettrinns elueringen med natriumklorid er presentert i figur 5. Det ettrinns gradient kromatografiet bevirker oppløsning av hoved monomer-fraksjonen og aggregat/protein A-fraksjonen. Utbyttet av monomert immunglobulin er mer enn 80 %. Til og med mer enn 95% utbytte er mulig.

Eksempel 6

Sammenligning mellom separering med en sterk kationbytterresin (SP-Sepharose fast flow) og en svak kationbytterresin (CM-Sepharose fast flow).

En sammenligning mellom den sterke SP-Sepharose ff veksleren og CM-Sepharose ff ble foretatt Forsøk ble utført ifølge eksempel 5 i duplikater (kun én fra hver kolonne er vist i figur 6a og b) og ytterligere analyser har blitt utført (DNA, vertscelleprotein, protein A-innhold og glykosyleringsmønster med LC-MS).

Analytiske metoder:

Størrelseseksklusjonskromatografi: resin: TSK 3000 (Tosohaas) kolonne: 300 x 7,8 mm strømningshastighet: 0,5 ml/min buffer: 200 mM kaliumfosfat inneholdende 250 mM kaliumklorid, justert til pH 7,0

DNA-terskel-system: se f.eks. Merrick, H., og Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403

Protein A ELISA: Brønnene i en mikttiterplate blir belagt med et polyklonalt protein A-IgG avledet fra kylling. Etter binding blir ikke-reagert antistoff fjernet ved vasking med prøve-buffer. For protein Abinding blir et definert prøve-volum tilsatt til brønnene. Protein A til stede i prøven blir bundet av kylling-antistoffet og holdt tilbake i brønnene i platen. Etter inkubering blir prøveløsningen fjernet og brønnene blir vasket. For deteksjon blir det deretter tilsatt et kylling-avledet polyklonal anti-protein A-IgG-biotin konjugat og et streptavidin peroksidase-konjugat. Etter et ytterligere vasketrinn blir substratløsning tilsatt hvilket resulterer i dannelse av et farget reaksjonsprodukt.

Intensiteten av fargen er proporsjonal med protein A-innholdet av prøven. Etter et definert tidsrom blir reaksjonen stoppet og absorbansen blir målt.

Vertscelleprotein (HCP) ELISA:

Veggene i brønnene av en mikrotiterplate blir belagt med en blanding av serumalbumin og streptavidin. Et geit-avledet polyklonalt antistoff mot HCP blir bundet til veggene i brønnene i mikrotiterplaten. Etter et vasketrinn blir forskjellige brønner i mikrotiterplaten inkubert med en HCP kalibrerings sekvens av forskjellige konsentrasjoner og prøveløsning. Etter inkuberingen blir prøvemateriale som ikke er bundet fjernet ved vasking med bufferløsning. For deteksjonen blir brønnene inkubert med et antistoff peroksidase-konjugat for å detektere bundet vertscelleprotein. Den fikserte peroksidaseaktiviteten blir detektert ved inkubering med ABTS og deteksjon ved 405 nm.

Kromatografiske betingelser:

Resin: CM-Sepharose; SP-Sepharose Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Lasting: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vask: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Eluering: 10 mM natriumcitratbuffer med 150 mM natriumklorid, justert til pH 5,5

I figurene 6a og 6b presenteres en sammenligning av eluerings kromatogrammet for en svak og en sterk kationbytterresin. Ved anvendelse av en svak kationbytterresin (figur 6a) blir en separering av det monomere anti IL-1R-antistoffet fra andre forurensninger oppnådd. Med den sterke kationbytterresinen (figur 6b) er ingen separasjon mulig under de samme betingelsene. Fraksjonene som svarer til toppene har blitt oppsamlet og analysert. Analyseresultatene, som er listet opp i tabell 1, viser at med den svake kationbytterresinen kan aggregater og andre forurensninger effektivt depleteres fra immunglobulin-preparatet.

Dataene presentert i tabell 1 viser at det er mulig, med en svak kationbytterresin, å separere monomert anti IL-1R-antistoff fra aggregerte former av antistoffet. Videre kan DNA- og protein A-forurensninger depleteres.

Tabell 1: Analyse av eluatene: sammenligning mellom SP-Sepharose og CM-Sepharose, resultater av to forskjellige separeringer er presentert.

Eksempel 7

Komparativt eksempel - eluering ved forskjellige konduktiviteter.

Kromatografiske betingelser:

Resin: CM-Sepharose

Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Lasting: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vasketrinn: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Eluering: 10 mM natriumcitratbuffer med 100 mM, 150 mM eller 200 mM natriumklorid, justert til pH 5,5

Det kondisjonerte protein A-eluatet ble applisert på en kromatografikolonne inneholdende en svak kationbytterresin (CM-Sepharose). Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrerings-buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en ettrinns gradienteluerings-metode, hvorved pH-verdien i den mobile fasen ble holdt konstant. Konsentrasjonen av buffersaltet, natriumcitrat, ble holdt konstant og i tre forskjellige kjøringer ble 100 mM, 150 mM, og 200 mM natriumklorid henholdsvis blandet inn. Etter økningen av saltkonsentrasjonen ble femten kolonnevolumer av eluerings-bufferen passert gjennom kolonnen for å eluere det bundne immunglobulinet. Kromatogrammene for elueringen er fremvist i figurene 7a til c.

Gode separasjoner har blitt oppnådd ved anvendelse av 150 mM natriumklorid og 200 mM natriumklorid som konsentrasjon av eluerings-salt.

Eksempel 8

Komparativt eksempel - eluering ved forskjellige pH-verdier.

Kromatografiske betingelser:

Resin: CM-Sepharose

Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Lasting: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vask: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Eluering: 10 mM natriumcitratbuffer med 150 mM natriumklorid, justert til pH 4,0 eller 6,0.

Det kondisjonerte protein A-eluatet ble applisert på en kromatografikolonne inneholdende en svak kationbytterresin (CM-Sepharose). Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrerings-buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en ettrinns gradienteluerings-metode, hvorved pH-verdien i den mobile fasen ble holdt konstant ved pH 4,0 eller 6,0 henholdsvis. Konsentrasjonen av buffersaltet, natriumcitrat, ble holdt konstant, og 150 mM natriumklorid ble blandet inn. Etter økningen av saltkonsentrasjonen ble femten kolonnevolumer av eluerings-bufferen passert gjennom kolonnen for å eluere det bundne immunglobulinet. Eluerings kromatogrammene er fremvist i figurene 8a og b.

Ved pH 4,0 er tendensen til å danne aggregater av dette immunglobulinet økt. Men CM-Sepharose er i stand til å separere denne høyere mengden av aggregater i to topper.

Eksempel 9

Kromatografisk separering av et monoklonalt anti-HER-2-antistoff (WO 99/57134) med en sterk kationbytterresin (SP-Sepharose).

Foreliggende oppfinnelse blir ytterligere eksemplifisert i det følgende med Herceptin<®>, et monoklonalt anti-HER-2 antistoff.

Rensing av Herceptin<® >med en kationbytterkromatografi på SP-Sepharose, en sterk kationbytterresin, ble utført. Under standardbetingelser ifølge foreliggende oppfinnelse, dvs. trinn eluering med f.eks. natriumklorid, blir en separering av monomere og aggregerte former av antistoffet ikke bevirket (figur 10).

Kromatografiske betingelser:

Resin: SP-Sepharose

Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 25 mM 2-morfolinoetansulfonsyre, 50 mM natriumklorid, justert til pH 5,6

Lasting: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vask: 25 mM 2-morfolinoetansulfonsyre, 50 mM natriumklorid, justert til pH 5,6

Eluering: 25 mM 2-morfolinoetansulfonsyre, 95 mM natriumklorid, justert til pH 5,6

Det monoklonale anti-HER-2 antistoffet (heretter referert til som Herceptin<®>) ble renset i et første trinn med en protein A affinitetskromatografi. Eluering fra protein A-kolonnen blir utført under sure betingelser (10 mM natriumcitratbuffer, pH-verdi på 3,0 ± 0,5). Før filtreringstrinnet blir pH-verdien av fraksjonen inneholdende antistoffet justert med en konsentrert tris-hydroksymetyl-amino-metan (TRIS)-buffer til pH 5,6. Protein A-eluatet er en løsning med en proteinkonsentrasjon på mellom 5 mg/ml og 15 mg/ml og blir bufret med natriumcitrat.

Det kondisjonerte protein A-eluatet ble applisert på en kromatografikolonne inneholdende en sterk kationbytterresin (SP-Sepharose). Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrerings-buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en ettrinns eluerings-metode, hvorved pH-verdien ble holdt konstant og konduktiviteten ble variert ved (trinnvis) økning av natriumklorid-konsentrasjonen. Elueringskromatogrammet er fremvist i figur 10.

Ingen separering av monomere og aggregerte former av antistoffet ble oppnådd.

Eksempel 10

Optimalisering av den kromatografiske metoden - første trinn: lineær

konsentrasjonsgradient.

For å forbedre separering av de to fraksjonene har separeringsbetingelsene blitt optimalisert i overenstemmelse med fremgangsmåten som skissert med anti IL-1R-antistoffet.

I motsetning til anti IL-1R-antistoff optimaliseringsprosessen ble en lineær gradient av et (eluerings-) salt, dvs. av natriumklorid, anvendt i stedet for en gradient av buffersubstansen. Kromatogrammet av lineær natriumklorid-gradientelueringen, som korresponderer til det første trinnet av optimaliseringsmetoden, er presentert i figur 11. Analyse bekreftet at siste del av den største toppen er anriket med aggregerte former av antistoffet.

Kromatografiske betingelser:

Resin: CM-Sepharose

Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5

Last: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vask: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Eluering: lineær gradient; fra 10 mM natriumcitratbuffer, justert til pH 5,5, til 10 mM natriumcitratbuffer inneholdende 400 mM natriumklorid, justert til pH 5,5

Det kondisjonerte protein A-eluatet som beskrevet i eksempel 9 ble applisert på en kromatografikolonne inneholdende en svak kationbytterresin (CM-Sepharose). Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrerings-buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en lineær gradientelueringsmetode, hvorved pH-verdien i den mobile fasen og konsentrasjonen av buffersaltet ble holdt konstant. Konsentrasjonen av eluerings-saltet, natriumklorid, ble økt lineært fra 0 mM til 400 mM over 40 kolonnevolumer. Eluerings-kromatogrammet er fremvist i figur 11.

Erstatning av den sterke kationbytterresinen med en svak kationbytterresin forårsaket løsrivelse av en andre topp som en skulder av den første hoved-toppen. Denne observasjonen er lik observasjonen i tilfellet med anti IL-1R-antistoffet.

Immunglobulinene starter å eluere fra kolonnen ved en natriumkloridkonsentrasjon på 80 mM.

Eksempel 11

Optimalisering av den kromatografiske metoden – andre trinn: tretrinns konsentrasjonsgradienteluering.

Utgangskonsentrasjonen, ved hvilken immunglobulinet starter å eluere, som bestemt i eksempel 10 og som avledet fra kromatogrammet presentert i figur 11, er 80 mM natriumklorid. For beregning av de tre konsentrasjonstrinnene for det andre optimaliseringstrinnet kan bufferkonsentrasjonen neglisjeres ettersom den er lav og holdt konstant under kromatografien.

Utgangskonsentrasjonen av natriumklorid er 80 mM og natriumklorid har ett kation forskjellig fra hydrogen i sin molekylformel. Følgelig blir konsentrasjonene for den tretrinns elueringen beregnet til å være 80 mM, 100 mM (= 80 mM multiplisert med 1,25), og 120 mM (= 80 mM multiplisert med 1,50) natriumklorid henholdsvis.

Kromatografiske betingelser:

Resin: CM-Sepharose

Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Lasting: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vask: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Eluering: trinn 1: 10 mM natriumcitratbuffer med 80 mM natriumklorid, justert til pH 5,5

trinn 2: 10 mM natriumcitrat-buffer med 100 mM natriumklorid, justert til pH 5,5

trinn 3: 10 mM natriumcitrat-buffer med 120 mM natriumklorid, justert til pH 5,5

Det kondisjonerte protein A-eluatet som beskrevet i eksempel 9 ble applisert på en kromatografikolonne inneholdende en svak kationbytterresin (CM-Sepharose).

Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrerings-buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en trinn gradientelueringsmetode, hvorved pH-verdien i den mobile fasen og konsentrasjonen av buffersaltet, natriumcitrat, ble holdt konstant.

Konsentrasjonen av eluerings-saltet, natriumklorid, ble økt fra 0 mM som utgangsbetingelse til 80 mM i det første trinnet, til 100 mM i det andre trinnet og til 120 mM i det siste trinnet. Etter hver økning av saltkonsentrasjonen ble ti kolonnevolumer av elueringsbufferen med de angitte natriumkloridkonsentrasjonene passert gjennom kolonnen før neste konsentrasjonstrinn. Etter at den siste natriumcitrat-konsentrasjonen var nådd ble eluering fortsatt i ytterligere 10 kolonnevolumer. Eluerings-kromatogrammet er fremvist i figur 12.

I den tretrinns elueringsmetoden blir det monomere antistoffet eluert ved trinnet med en natriumkloridkonsentrasjon på 80 mM. Størrelseseksklusjonsanalyse bekreftet at kun monomert antistoff blir eluert. Etter at natriumkloridkonsentrasjonen ble økt til 100 mM i det andre trinnet, ble de aggregerte formene eluert (figur 12).

Eksempel 12

Optimalisering av den kromatografiske metoden – tredje trinn: ettrinns eluering med natriumklorid.

Kromatografiske betingelser:

Resin: CM-Sepharose; SP-Sepharose Strømningshastighet: 160 cm/t

Ekvilibrering: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Lasting: maks. 20 g protein/l gelmatriks

Vask: 10 mM natriumcitrat-buffer, justert til pH 5,5 Eluering: 10 mM natriumcitrat med 80 mM natriumklorid, justert pH 5,5

Det kondisjonerte protein A-eluatet som beskrevet i eksempel 9 ble applisert på en kromatografi kolonne inneholdende en svak kationbytterresin (CM-Sepharose). Etter lastings-trinnet ved en strømningshastighet på 160 cm/t ble kolonnen vasket med ekvilibrerings-buffer (10 kolonnevolumer). De bundne immunglobulinene ble eluert med en ettrinns gradientelueringsmetode, hvorved pH-verdien i den mobile fasen og konsentrasjonen av buffersaltet ble holdt konstant. Konsentrasjonen av buffersaltet, natriumcitrat, ble holdt konstant og 80 mM natriumklorid ble tilsatt. Etter økningen av saltkonsentrasjonen ble femten kolonnevolumer av elueringsbufferen med natriumklorid passert gjennom kolonnen for å eluere det bundne anti-HER-2 antistoffet i monomer form. For å bekrefte separering av monomere og aggregerte former av antistoffet ble et andre trinn, som ikke er nødvendig for fremstilling av monomere antistoffer, til en natriumkloridkonsentrasjon på 120 mM utført. Etter denne andre økningen blir de aggregerte formene av antistoffet eluert fra kolonnen. Eluerings-kromatogrammet er fremvist i figur 13.

Dersom den samme fremgangsmåten blir utført med en sterk kationbytterresin blir et signifikant tap av monomert antistoff observert (utbytte på omtrent 60 % kun sammenlignet med 95% og mer på en svak kationbytterkolonne), selv om separering av monomere og aggregerte former av antistoffet kan sees (figur 14).

Anvendelse av betingelsene egnet for separering på et svakt kationbyttermateriale for en sterk kationbytterresin, SP-Sepharose, er ikke fordelaktig. Selv om de to fraksjonene kan separeres blir utbyttet av det monomere antistoffet redusert til 60 % eller enda lavere.

Tabell 2: Analyse av eluatene: sammenligning av SP-Sepharose og CM-Sepharose, resultater av to forskjellige separasjoner er presentert.

Claims (6)

Patentkrav

1. Fremgangsmåte for rensing av et monoklonalt antistoff fra aggregater derav, hvor fremgangsmåten omfatter

a) tilveiebringe en løsning omfattende et monoklonalt antistoff, en buffersubstans;

b) å bringe løsningen og et svakt kationbyttermateriale i kontakt under betingelser hvor det monoklonale antistoff binder seg til det svake kationbyttermaterialet;

c) utvinning av det monomere monoklonale antistoffet fra det svake kationbyttermaterialet i et enkelt trinn ved anvendelse av en løsning omfattende en buffersubstans og et salt,

hvor fremgangsmåten omfatter rensing av det monoklonale antistoffet med protein A-affinitetskromatografi før trinn a);

hvor det svake kationbyttermaterialet er et karboksymetylsvakt kationbyttermateriale,

hvor det monoklonale antistoffet er et medlem av immunoglobulinklasse G, hvor løsningen i utvinnelsestrinnet c) har en pH-verdi på fra pH 4,5 til pH 5,5, hvor saltet i trinn c) er valgt fra gruppen bestående av natriumklorid, natriumsulfat, kaliumklorid, kaliumsulfat, salter av sitronsyre, salter av fosforsyre og blandinger av disse komponentene,

hvor buffersubstansen har et konsentrasjonsområde på mellom 5 mM og 100 mM.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor buffersubstansen er sitronsyre eller et salt derav eller fosforsyre eller et salt derav.

3. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 2, hvor fremgangsmåten er en kromatografisk eller en batchmetode.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3, hvor pH-verdien holdes konstant i det enkelte trinn.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor nevnte monoklonale antistoff har et isoelektrisk punkt (pl) på 6,0 eller mer (pI> 6,0).

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 5, hvor saltet som forårsaker eluering i trinn c) samtidig er buffersubstansen.