KR100967778B1

KR100967778B1 - 항체의 정제 방법

Info

Publication number: KR100967778B1
Application number: KR1020077027285A
Authority: KR
Inventors: 로베르토 팔켄스테인; 버카드 콜브; 마리아 세발드
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2005-05-25
Filing date: 2006-05-23
Publication date: 2010-07-05
Also published as: EP1888636B2; ES2373402T5; US20170183394A1; MX2007014269A; NO345362B1; DK1888636T3; US11034754B2; KR20080017322A; JP2008542218A; JP4852602B2; ATE525087T1; EP2261252A2; TWI391399B; BRPI0610201B1; FI1888636T4; BRPI0610201B8; EP1888636A2; US9631007B2; BRPI0610201A2; PL1888636T3

Abstract

이온 교환 크로마토그래피에 의해 면역글로불린을 정제하는 방법이 기술되어 있다. 크로마토그래피 방법은 면역글로불린의 정제를 위해 약이온 교환 수지 및 단일 단계 용출 공정을 이용한다. 또한, 이온 교환 수지로부터 면역글로불린의 단일 단계 용출을 위한 염 농도를 측정하는 방법도 기술되어 있다.

Description

항체의 정제 방법{METHOD FOR THE PURIFICATION OF ANTIBODIES}

본 발명은 폴리펩타이드 정제 분야에 관한 것이다. 이온 교환 물질을 사용하여 면역글로불린을 정제하는 새로운 방법을 본원에서 기술한다. 동시에, 정제 조건의 신속한 결정 방법도 제공된다.

단백질 및 특히 면역글로불린은 오늘날의 의료 포트폴리오에서 중요한 역할을 한다. 인간에 적용하기 위해, 모든 약학 물질은 분명한 기준을 충족시켜야 한다. 인간에 대한 생물약제의 안전성을 보장하기 위해, 심각한 유해를 야기할 핵산, 바이러스 및 숙주 세포 단백질은 특별히 제거되어야 한다. 규제 내역을 충족시키기 위해, 하나 이상의 정제 단계가 제조 공정에 이어져야 한다. 무엇보다, 순도, 처리량 및 수율은 적절한 정제 공정을 결정하는데 중요한 역할을 한다.

다양한 방법들, 예를 들면, 미생물 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피(예: 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예: 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(예: 아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환), 친티오성(thiophilic) 흡착(예: 베타-머캅토에탄올 및 다른 SH 리간드 사용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예: 페닐-세파로즈, 아자-아레노필릭(aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산 사용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예: Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 사용), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예: 겔 전기영동, 모세관 전기영동)[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech., 75, 93-102, 1998]이 단백질 정제에 잘 확립되어 있으며 널리 사용되고 있다.

문헌 [Necina, R. et al., Biotechnol. Bioeng., 60, 689-698, 1998]은 고전하 밀도를 나타내는 이온 교환 매질에 의해 세포 배양 상등액으로부터 인간 단클론 항체를 직접 포착하는 것을 보고하였다. WO 89/05157 호에는 세포 배양 배지를 양이온 교환 처리에 직접 적용하여 생성물 면역글로불린을 정제하는 방법이 보고되어 있다. 마우스의 복수로부터 단클론성 IgG 항체의 1-단계 정제방법이 문헌 [Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth., 115, 79-88, 1988]에 기술되어 있다.

문헌 [Raweerith, R. et al., J. Immun. Meth., 282, 63-72, 2003]에서는 펩신-절단된 말의 안티베놈 F(ab')₂ 항체를 분별하기 위한 수단으로서, 방법들의 조합, 즉, 카프릴산 침전 및 이온 교환 크로마토그래피의 조합을 이용하였다. WO 2003/102132 호에는, 단백질 정제를 위한 비-친화성 정제 단계와 고성능 접선-흐름 여과의 조합이 보고되어 있다. 두 친화성 크로마토그래피 단계의 조합은 WO 92/19973 호에 기록되어 있다.

문헌 [Follman, D.K. and Fahrner, R.L., J. Chrom. A, 1024, 79-85, 2004] 은 단백질 A 없이 3단계의 크로마토그래피 단계를 사용하는 항체 정제 방법의 순차 검색을 보고하고 있다. 문헌 [Mhatre, R. et al., J. Chrom. A, 707, 225-231, 1995]은 양이온 교환 크로마토그래피 및 pH 구배 용출에 의한 항체 Fab 단편의 정제를 연구하였다.

WO 94/00561 호는 인간 단클론성 항-붉은털원숭이 항체 및 이를 생성하는 세포주를 보고하고 있다. 하나 이상의 오염물질로부터 문제의 폴리펩타이드를 분리하기 위해 구배 세척을 이용하는, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 폴리펩타이드를 정제하는 방법이 WO 2004/024866 호에 기록되어 있다. 문헌 [Schwarz, A. et al., Laborpraxis, 21, 62-66, 1997]은 CM-하이퍼D-컬럼을 사용한 단클론성 항체의 정제를 보고하고 있다.

WO 2004/076485 호는 단백질 A 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제 방법을 보고하고 있다. EP 0 530 447 호에는, 3단계 크로마토그래피 단계의 조합에 의해 IgG 단클론성 항체를 정제하는 방법이 보고되어 있다. 항체 제제로부터 단백질 A의 제거는 US 4,983,722 호에 보고되어 있다.

WO 95/16037 호는 단백질 A 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된 하이브리드 하이브리도마로부터 항-EGF-R/항-CD3 이중특이성 단클론 항체의 정제를 기록하고 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 그의 다량체로부터 항체 단량체를 분리하는 것이 EP 1 084 136 호에 보고되어 있다. US 5,429,746 호는 항체 분자 단백질의 정제에 소수성 상호작용 크로마토그래피 조합 크로마토그래피의 적용에 관한 것이다.

발명의 요약

따라서, 본 발명의 목적은 재조합에 의해 생성된 면역글로불린을 정제하고 단량체성 면역글로불린 종과 다량체성 면역글로불린 종을 분리하는 또 다른 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 면역글로불린의 정제 방법을 제공한다:

a) 면역글로불린, 완충 물질, 및 선택적으로 염을 포함하는 용액을 제공하고;

b) 상기 용액 및 약이온 교환 물질을 면역글로불린이 약이온 교환 물질에 결합하는 조건하에서 접촉시키고;

c) 완충 물질 및 염을 포함하는 용액을 사용하여 단일 단계로 약이온 교환 물질로부터 면역글로불린을 회수하는 단계.

본 발명은 또한 하기의 두 단계를 포함하는, 단일 단계 정제 공정에서 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩타이드를 용출하기 위한 염의 농도를 측정하는 방법을 제공한다:

(a) a1) 폴리펩타이드, 완충 물질 및 선택적으로 염을 포함하는 용액을 제공하고,

삭제

a2) 폴리펩타이드를 함유하는 상기 용액의 제 1 분취액과 이온 교환 물질을 폴리펩타이드가 이온 교환 물질에 결합하는 조건하에서 접촉시키고,

a3) 완충 물질 및 염을 포함하는 용액을 사용하되 염 농도를 선형으로 증가시켜 상기 이온 교환 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하고,

a4) 폴리펩타이드의 제 1 분획이 이온 교환 컬럼으로부터 용출되기 시작하는 염의 출발 농도를 측정함
을 포함하는 단계; 및

(b) b1) 폴리펩타이드를 함유하는 상기 용액의 제 2 분취액과 이온 교환 물질을 폴리펩타이드가 이온 교환 물질에 결합하는 조건하에서 접촉시키고;

삭제

b2) 제 1 용출 단계, 제 2 용출 단계 및 제 3 용출 단계로 구성된 3 단계 용출 방법으로서, i) 제 1 용출 단계의 염 농도가 단계 a4)에서 측정된 염의 출발 농도와 염의 분자식에 나타낸 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총수의 곱과, 완충 염의 농도와 완충 염의 분자식에 나타낸 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총수의 곱의 합으로서 계산되고, ii) 제 2 용출 단계의 염 농도가 제 1 용출 단계의 염 농도와 1.25 내지 1.35의 계수의 곱이고, iii) 제 3 용출 단계의 염 농도가 제 1 용출 단계의 염 농도와 1.50 내지 1.70의 계수의 곱이며, 제 2 용출 단계의 계수 및 제 3 용출 단계의 계수가 10 내지 40 mM의 출발 농도에서 각각 1.35 및 1.70이고, 40 내지 70 mM의 출발 농도에서 각각 1.30 및 1.60이며, 70 mM보다 높은 출발 농도에서 각각 1.25 및 1.50인 것으로서 측정되는, 3 단계 용출 방법을 이용하여 상기 이온 교환 물질로부터 폴리펩타이드를 회수하고,
b3) 단계 b2)의 3 단계 용출 방법의 어느 단계에서 폴리펩타이드가 이온 교환 컬럼으로부터 용출되는지를 확인하여, 단일 단계 정제 방법에 있어서 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩타이드를 용출하기 위한 염 농도를 측정함

을 포함하는 단계.

이들 용어들은 본 출원에서 하기의 정의에 따라 사용된다.

본 출원에서 사용된 바와 같이 용어 "이온 교환 수지" 또는 "이온 교환 물질"은 공유 결합된 하전된 치환체를 갖는 고정된 고분자량 매트릭스를 의미한다. 전체 전하 중성을 위해, 공유 결합되지 않은 상대 이온이 상기 물질에 결합된다. "이온 교환 물질"은 주위 용액의 유사하게 하전된 이온에 대해 그의 공유 결합되지 않은 상대 이온을 교환하는 능력을 갖는다. 그의 교환가능한 상대 이온의 전하에 따라, "이온 교환 수지"는 양이온 교환 수지 또는 음이온 교환 수지로 지칭된다. 하전된 기(치환체)의 성질에 따라, "이온 교환 수지"는, 예를 들면, 양이온 교환 수지의 경우, 설폰산 수지(S) 또는 카복시메틸 수지(CM)로 지칭된다. 하전된 기/치환체의 화학적 성질에 따라, "이온 교환 수지"는 또한 공유결합된 하전된 치환체의 강도에 따라 강 이온 또는 약 이온 교환 수지로 분류될 수 있다. 예를 들면, 강한 양이온 교환 수지는 하전된 치환체로서 설폰산기를 가지며, 약한 양이온 교환 수지는 하전된 치환체로서 카복실산기, 바람직하게는 카복시메틸기를 가지며, 약한 음이온 교환 수지는 하전된 치환체로서 다이에틸아미노에틸기를 갖는다.

양이온 교환 수지는 많은 회사로부터 다양한 명칭으로, 예를 들면, 바이오-렉스, 마크로-프레프 CM(Bio-Rex, Macro-Prep CM)(미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재의 바이오래드 래버러토리즈(Biorad Laboratories)에서 시판), 약한 양이온 교환기 WCX2(미국 캘리포니아주 프레몬트 소재의 사이퍼겐(Ciphergen)에서 시판), 다우엑스(Dowex, 등록상표) MAC-3(미국 미시간주 미들랜드 소재의 다우 케미칼 캄파니-리퀴드 세퍼레이션즈(Dow chemical company - liquid separations)에서 시판), 무스탕 C(Mustang C)(미국 뉴욕주 이스트 힐 소재의 폴 코포레이션(Pall Corp.)에서 시판), 셀룰로스 CM-23, CM-32, CM-52, 하이퍼-D 및 파티스페어(Partisphere)(영국 브렌트포드 소재의 와트만 피엘씨(Watman plc)에서 시판), 앰버라이트(Amberlite, 등록상표) IRC 76, IRC 747, IRC 748, GT 73(독일 스터트가르트 소재의 토소 바이오사이언스 게엠베하(Tosoh Bioscience GmbH), CM 1500, CM 3000(미국 인디애나주 테레 호테 소재의 바이오크롬 랩스(BioChrom Labs)에서 시판) 및 CM-세파로스(CM-Sepharose, 등록상표) 패스트 플로우(Fast Flow)(독일 프라이버그 소재의 지이 헬스케어 - 아머샴 바이오사이언시즈 유럽 게엠베하(GE Healthcare - Amersham Biosciences Europe GmbH))로 시판된다.

바람직하게, 약이온 교환 물질의 하전된 치환체는 약 90% 이상의 카복실산기, 90%보다 많은 카복실산기, 또는 95%보다 많은 카복실산기이다.

본 출원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "단일 단계 용출" 및 "단일 단계 구배 용출"은, 예를 들면, 용출을 야기하는 물질의 농도, 즉, 물질로부터 결합 화합물의 해리율이 즉시 상승하거나 저하되는, 즉, 바로 출발 값/수준으로부터 최종 값/수준으로, 즉, 단일 단계로 상승하거나 저하되는 방법을 나타낸다.

"폴리펩타이드"는 천연이든 또는 합성으로 생성된 것이든, 펩타이드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드를 "펩타이드"라 칭한다.

"단백질"은 100개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄 또는 하나의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 탄수화물기와 같은 비-펩타이드 성분을 포함한다. 탄수화물 및 다른 비-펩타이드 치환체는 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 부가될 수 있으며, 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 단백질은 본원에서 그의 아미노산 주쇄 구조와 관련하여 정의되며; 탄수화물기와 같은 치환체는 일반적으로 명시하지 않으나, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.

본 출원에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 2개 이상의 경쇄 폴리펩타이드 및 2개의 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 각각 항원과의 상호작용을 위한 결합 영역을 함유하는 가변 영역(일반적으로 폴리펩타이드 쇄의 아미노 말단 부분)을 함유한다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 각각 또한 숙주 조직, 또는 면역 시스템의 다양한 세포, 일부 식세포 및 전통적인 보체계의 제 1 성분(C1q)을 포함한 인자들에 대한 항체의 결합을 매개할 수 있는 불변 영역(일반적으로 카복시 말단 부분)을 포함한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드는 각각 필수적으로, 경쇄 폴리펩타이드의 경우 가변 영역, 즉, V_L 또는 V_H, 및 완전 불변 영역, 즉, C_L, 또는 중쇄 폴리펩타이드의 경우 C_H1, C_H2, C_H3 및 선택적으로 C_H4로 이루어진 완전한 쇄이다. 본 발명에 따른 항체의 가변 영역은 다른 아이소타입(isotype)의 불변 영역에 그라프트될 수 있다. 예를 들면, 1-아이소타입의 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또 다른 중쇄 부류(또는 아형)의 불변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 그라프트될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 실질적으로 항체 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진 단백질을 말한다. 인지된 항체 유전자는 다양한 불변 영역 유전자, 및 다양한 항체 가변 영역 유전자를 포함한다. 항체는, 예를 들면, Fv, Fab 및 F(ab)₂ 및 단일쇄를 포함하여 다양한 형태로 존재할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Huston, J.S., et al., PNAS USA 85, 5879-5883, 1988; Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988]; 및 일반적으로, 문헌 [Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition, 1984; and Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16, 1986] 참조). 한 태양에서, 본 발명에 따른 항체는 단클론성 항체 및 그의 단편, 예를 들면, 분리된 중쇄 또는 경쇄, 또는 불변 영역으로만 이루어진 중쇄 또는 경쇄, 및 그의 단편을 포함한다.

일반적인 크로마토그래피 방법 및 그의 사용법은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E.(ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, 1992; Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z.(ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, 1998; Chromatography Today, Poole, C.F., and Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York, 1991; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 1982; Sambrook, J., et al.(ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; or Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al.(eds), John Wiley & Sons, Inc., New York]을 참조하시오.

c) 완충 물질 및 염을 포함하는 용액을 이용하여 단일 단계로 약이온 교환 물질로부터 면역글로불린을 회수하는 단계.

면역글로불린의 정제 방법은 일반적으로 다단계 크로마토그래피 부분을 포함한다. 제 1 단계에서는, 비-면역글로불린 폴리펩타이드 및 단백질을, 예를 들면, 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 면역글로불린 분획으로부터 분리한다. 제 2 단계에서는, 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 개개 면역글로불린 부류를 분리시키고, 제 1 컬럼으로부터 공용출되는 미량의 단백질 A를 제거할 수 있다. 최종적으로, 제 3 단계 크로마토그래피는 단량체성 면역글로불린을 동일 부류의 다량체 및 단편으로부터 분리하는데 필수적이다. 때때로, 응집체의 양이 많아서(5% 이상) 세 번째 정제 단계에서 이들을 효율적으로 분리하는 것이 가능하지 않아서 추가의 정제 단계를 요하기도 한다.

특정 면역글로불린의 재조합 생산에 있어, 다양한 면역글로불린 부류의 분리를 위한 분리 단계는 생략할 수도 있다. 따라서, 재조합적으로 생산된 면역글로불린의 전체 정제 공정은 2개의 크로마토그래피 단계로 감소될 수 있다.

조절된 단백질 A 용출액은 일반적으로 각각의 면역글로불린 단백질의 등전점(pI) 미만의 pH 값에서 양이온 교환 물질 상에서 크로마토그래피 처리된다.

항 IL-1R 항체(WO 2005/023872 호), 및 항-HER2 항체(WO 99/57134 호)인 헤르셉틴(Herceptin, 등록상표)이 본 발명을 수행할 때 본 실험실에서 충분한 양으로 이용가능하였으므로, 본 발명은 이들 두가지 면역글로불린으로 예시한다. 또한, 본 발명은 일반적으로 면역글로불린을 사용하여 실행될 수 있다. 여기서 예시된 설명은 예로써만 수행되며 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 이들 예는 그 진정한 범주를 첨부한 청구의 범위에 나타낸 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다.

본 발명은 응집체 및 단편들로부터 단량체성 면역글로불린을 분리하고 다른 폴리펩타이드 불순물을 제거하기 위한 정제 방법을 기술한다. 실험에서 알 수 있듯이, 상기 정제는 약이온 교환 수지를 사용하여, 바람직하게는 약한 양이온 교환 수지를 사용하여 달성된다. 강이온 및 약이온 교환 물질의 비교에 의해 예시되듯이, 약이온 교환 물질은 단량체성 면역글로불린과 응집체의 분리를 제공한다(실시예 1 및 2 및 실시예 9 및 12 참조).

본 발명의 한 태양에서, 완충 재료(물질)의 pH 값은 pH 3.0 내지 pH 10.0, 바람직하게는 pH 3.0 내지 pH 7.0, 보다 바람직하게는 pH 4.0 내지 pH 6.0, 가장 바람직하게는 pH 4.5 내지 pH 5.5이다.

한 태양에서, pH 값은 단일 단계에서 일정하게 유지된다, 즉, 단일 단계에서 동일한 값으로 유지된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 점은, 본 발명의 방법이 6.0 이상(pI ≥ 6.0)의 등전점(pI)을 가짐으로써 pH 6.0에서 pH 14까지의 pH 범위에서 순 양전하를 갖는 면역글로불린에 적용가능하다는 것이다.

본 발명의 바람직한 태양은 IgG 또는 IgE 부류의 면역글로불린의 정제이다.

본 발명의 바람직한 태양에서는 약한 양이온 교환 물질이 사용된다.

완충 물질은 바람직하게는 예시된 바와 같이 5 내지 100 mM의 농도 범위로 사용된다.

약이온 교환 물질로부터 결합된 면역글로불린을 회수하기 위해 완충제/용액의 전도도를 증가시킨다. 이것은 증가된 완충 염 농도에 의해 또는 다른 염, 소위 용출 염을 완충액에 첨가함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 용출염은 시트르산 나트륨, 염화나트륨, 황산나트륨, 인산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 및 시트르산과 인산의 다른 염, 및 이들 성분들의 임의의 혼합물이다. 시트르산 나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨 및 그의 혼합물이 특히 바람직하다.

용출을 야기하는 염의 농도는 바람직하게는 5 내지 500 mM, 보다 바람직하게는 5 내지 400 mM, 특히 바람직하게는 5 내지 250 mM의 범위이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 태양은 완충 물질이면서 용출을 야기하는 염, 특히 시트르산 및 그의 염 또는 인산 및 그의 염을 사용하는 것이다.

본 발명의 방법은 바람직하게는 크로마토그래피 또는 배치 방법이며, 배치식 용출을 포함하는 방법이 특히 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 태양은 정제가 단일 단계 정제 공정이라는 것이다.

"단일 단계"는 하나 이상의 조건, 예를 들면, pH, 이온 강도, 염 농도, 및/또는 크로마토그래피의 흐름이 다 한꺼번에 출발 값으로부터 최종 값까지 변화되는 것, 즉, 조건들이 선형 변화와 대조적으로 점진적으로, 즉, 단계적으로 변화되는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 태양은 방법이 a) 단계전에 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 면역글로불린의 추가 정제 단계를 포함하는 것이다.

(a) a1) 폴리펩타이드, 완충 물질 및 선택적으로 염을 포함하는 용액을 제공하고;

삭제

a2) 폴리펩타이드를 함유하는 용액 제 1 분취액과 이온 교환 물질을 폴리펩타이드가 이온 교환 물질에 결합하는 조건하에서 접촉시키고,

a3) 완충 물질 및 염을 포함하는 용액을 이용하되, 염 농도를 선형으로 증가시켜 이온 교환 물질로부터 폴리펩타이드를 회수하고,

a4) 폴리펩타이드의 제 1 분획이 이온 교환 컬럼으로부터 용출되기 시작하는 염의 출발 농도를 측정함을
포함하는 단계; 및

(b) b1) 폴리펩타이드를 함유하는 용액 제 2 분취액과 이온 교환 물질을 폴리펩타이드가 이온 교환 물질에 결합하는 조건하에서 접촉시키고,

삭제

b2) 제 1 용출 단계, 제 2 용출 단계 및 제 3 용출 단계로 구성된 3 단계 용출 방법으로서, 제 1 용출 단계의 염 농도가 단계 a4)에서 측정된 염의 출발 농도와 염의 분자식에 나타낸 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총수의 곱과, 완충 염의 농도와 완충 염의 분자식에 나타낸 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총수의 곱의 합으로서 계산되고, ii) 제 2 용출 단계의 염 농도가 제 1 용출 단계의 염 농도와 1.25 내지 1.35의 계수의 곱이고, iii) 제 3 용출 단계의 염 농도가 제 1 용출 단계의 염 농도와 1.50 내지 1.70의 계수의 곱이며, 제 2 용출 단계의 계수 및 제 3 용출 단계의 계수가 10 내지 40 mM의 출발 농도에서 각각 1.35 및 1.70이고, 40 내지 70 mM의 출발 농도에서 각각 1.30 및 1.60이며, 70 mM보다 높은 출발 농도에서 각각 1.25 및 1.50인 것으로서 측정되는, 3 단계 용출 방법을 이용하여 이온 교환 물질로부터 폴리펩타이드를 회수하고,

b3) 단계 b2)의 3 단계 용출 방법의 어느 단계에서 폴리펩타이드가 이온 교환 컬럼으로부터 용출되는지를 확인하여, 단일 단계 정제 공정으로 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩타이드를 용출하기 위한 염 농도를 측정함
을 포함하는 단계.

단계 b2)의 계수들은 실험적으로 측정된 범위를 한정한다. 이들 값은 절대값이 아니며 단지 목표값이다. 10%의 편차가 유지가능하다.

본 발명은 다른 단백성 물질로부터 폴리펩타이드의 정제를 위한 단일 단계 정제 공정에서 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩타이드를 용출하기 위한 염의 농도를 측정하는 방법을 기술한다.

이온 교환 수지로부터 폴리펩타이드, 바람직하게는 면역글로불린의 용출이 개시되는 농도는 3 단계 용출 방법의 제 2 최적화 단계 b)에 대한 기준을 제공한다. 용출 단계에 대한 대략적인 완충제/염 농도는 다음과 같이 계산한다:

- 제 1 용출 단계의 염 농도는, 제 1 피가수(summand)로서 선형으로 증가하는 염 구배하에 측정할 때 이온 교환 컬럼으로부터 용출이 개시되는 염 농도와 용출을 야기하는 염의 분자식에 나타낸 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총수의 곱과, 제 2 피가수로서 완충 염의 농도와 완충 염의 분자식에 나타낸 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총수의 곱의 합과 같고;

- 제 2 용출 단계의 염 농도는 제 1 용출 단계의 염 농도와 1.25 내지 1.35의 계수와의 곱과 같고;

- 제 3 용출 단계의 염 농도는 제 1 용출 단계의 염 농도와 1.50 내지 1.70의 계수와의 곱과 같다.

농도 계산에 포함되는 계수는 농도 수준간의 차이를 고려하며 출발 농도에 따라 조정된다. 낮은 출발 농도, 즉, 10 내지 40 mM에서 계수는 각각 1.35 및 1.70이고, 40 내지 70 mM의 중간 출발 농도에서 계수는 각각 1.30 내지 1.60이고, 70 mM 이상의 높은 출발 농도에서 계수는 각각 1.25 내지 1.50이다. 이들 계수는 실험적으로 결정된 범위를 한정한다. 이들 값은 절대 값이 아니며 단지 목표값이다. 10%의 편차가 유지가능하다.

완충염은, 실시예 3에서 개략된 바와 같이 크로마토그래피동안 완충염 농도 변화에 의해 이온 교환 수지로부터 단백질의 용출이 수행될 수 있기 때문에 계산에 고려되어야 한다. 완충염 농도가 크로마토그래피동안 일정하게 유지되거나 또는 용출을 야기하는 염의 출발 농도에 비해 작은 경우, 복잡함을 줄이기 위해 완충염 농도는 계산시 무시할 수 있다.

한 태양에서, 용출을 야기하는 염은 완충염이 아니며, 단계 b2i)의 염 농도는 단계 a4)에서 선형으로 증가하는 염 구배하에 측정할 때 이온 교환 컬럼으로부터 용출이 개시될 때의 염 농도와 용출을 야기하는 염의 분자식에 나타낸 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총수의 곱이다.

계산은 항 IL-1R 항체를 사용한 실시예 4를 기준으로 예시된다. 실시예 3에서 측정한 바와 같이, 10 mM 완충제 농도 및 선형 구배로부터의 5 mM로 이루어진 15 mM 시트르산 나트륨의 출발 농도의 경우, 다음과 같은 3 단계로 계산한다:

- 단계 1의 목표 농도는 30 mM(5 mM * 2 + 10 mM * 2) 시트르산 나트륨인 것으로 계산된다: 상세하게, 5 mM(출발 농도)에 2(시트르산은 이나트륨염으로 사용된 3가 산이므로; 수소가 아닌 다른 2개의 1가 양이온이 분자식에 존재한다)를 곱한 값에, 10 mM(완충 염 농도)에 2(시트르산은 이나트륨염으로 사용된 3가 산이므로; 수소가 아닌 2개의 1가 양이온이 분자식에 존재한다)를 곱한 값을 더한 값이다;

- 단계 2의 목표 농도는 40.5 mM(30 mM * 1.35) 시트르산 나트륨인 것으로 계산된다: 상세하게, 30 mM 시트르산 나트륨은 단계 1의 농도에 1.35(출발 농도가 15 mM이므로 계수로 1.35를 선택한다)를 곱한 값이다;

- 단계 3의 목표 농도는 51 mM(30 mM * 1.70) 시트르산 나트륨인 것으로 계산된다: 상세하게, 30 mM 시트르산 나트륨은 단계 1의 농도에 1.70(출발 농도가 15 mM이므로 계수로 1.70을 선택한다)을 곱한 값이다.

실험에서 알 수 있듯이, 상기 정제는 바람직한 태양에서 약이온 교환 물질을 사용하여, 특히 바람직하게는 약한 양이온 교환 물질을 사용하여 달성된다.

본 발명의 바람직한 태양은 폴리펩타이드가 면역글로불린, 특히 바람직하게는 IgG 또는 IgE 부류의 면역글로불린이라는 것이다.

본 발명의 한 태양에서, 완충 재료/물질의 pH 값은 pH 3.0 내지 10.0, 바람직하게는 pH 3.0 내지 7.0, 보다 바람직하게는 pH 4.0 내지 6.0, 가장 바람직하게는 pH 4.5 내지 5.5이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 점은 본 발명의 방법이 6.0 이상(pI ≥ 6.0)의 등전점(pI)을 가지므로 pH 6.0에서 pH 14까지의 pH 범위에서 순 양전하를 갖는 면역글로불린에 적용가능하다는 것이다.

이온 교환 물질로부터 결합된 면역글로불린을 회수하기 위해 완충제/용액의 전도도를 증가시킨다. 이것은 증가된 완충 염 농도에 의해 또는 다른 염, 소위 용출 염을 완충액에 첨가함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 용출염은 시트르산 나트륨, 염화나트륨, 황산나트륨, 인산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 및 시트르산과 인산의 다른 염, 및 이들 성분들의 임의의 혼합물이다. 시트르산 나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨 및 그의 혼합물이 특히 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 태양은 완충 물질과 동시에 용출을 야기하는 염, 특히 시트르산 및 그의 염 및 인산 및 그의 염을 사용하는 것이다.

하기의 실시예 및 도면은 그 진정한 범위가 첨부된 청구의 범위에 나타나 있는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본 발명의 진의에서 벗어나지 않고 나타낸 절차에 변형이 이루어질 수 있음을 주지해야 한다.

도 1은 강한 양이온 교환 수지 SP-세파로스로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 용출로서; 단량체성 수용체 항체와 응집체가 분리되지 않고 하나의 피크로 용출된다.

도 2는 약한 양이온 교환 수지 CM-토요펄로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 용출로서; 단량체성 수용체 항체와 응집체가 부분적으로 분리되어, 단량체성 면역글로불린 형태를 포함하는 하나의 주 피크, 및 단량체성 면역글로불린, 응집체 및 단백질 A를 포함하는 제 2의 피크로서 용출된다.

도 3은 pH 5.0에서 시트르산 나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-토요펄로부터 항 IL-1R 항체의 선형 구배 용출로서; 단량체성 수용체 항체와 응집체가 부분적으로 분리되고, 15 mM의 시트르산 나트륨 출발 농도에서 단량체성 면역글로불린 형태를 포함하는 주 피크, 및 단량체성 면역글로불린 형태, 응집체 및 단백질 A의 혼합물을 포함하는 제 2 피크로서 용출된다. 두 분획의 SEC 분석결과를 이온 교환 크로마토그램에 삽입하였다. 주 피크에는 응집체가 존재하지 않는다. 대조적으로, 제 2 피크에는 면역글로불린의 응집된 형태가 존재한다.

도 4는 pH 5.0에서 시트르산 나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-토요펄로부터 항 IL-1R 항체의 3단계 구배 용출로서; 단량체성 수용체 항체와 응집체가 부분적으로 분리되고, 34 mM의 시트르산 나트륨 농도에서 단량체성 면역글로불린 형태를 포함하는 주 피크, 및 44 mM의 시트르산 나트륨 농도에서 단량체성 면역글로불린, 응집체 및 단백질 A를 포함하는 제 2 피크로서 용출된다.

도 5는 pH 5.5에서 150 mM 염화나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 구배 용출로서; 단량체성 수용체 항체와 응집체가 분리되고, 단량체성 면역글로불린을 포함하는 주 피크, 및 단량체성 면역글로불린, 응집체 및 단백질 A를 포함하는 제 2의 피크로서 용출된다.

도 6a는 CM-세파로스 고속 흐름상의 용출 프로필로서; 단량체성 항 IL-1R 항체에 상응하는 주 피크, 및 주로 응집체 및 다른 불순물을 함유하는 보다 작은 제 2 피크의 두 피크를 확인할 수 있다.

도 6b는 SP-세파로스 고속 흐름상의 항 IL-1R 항체의 용출 프로필로서; 단량체성 면역글로불린, 응집체 및 이 컬럼에서 분리되지 않은 다른 불순물을 함유하는 하나의 피크를 확인할 수 있다.

도 7a는 pH 5.5에서 100 mM 염화나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 구배 용출이다.

도 7b는 pH 5.5에서 150 mM 염화나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 구배 용출이다.

도 7c는 pH 5.5에서 200 mM 염화나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 구배 용출이다.

도 8a는 pH 4.0에서 150 mM 염화나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 구배 용출이다.

도 8b는 pH 6.0에서 150 mM 염화나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 구배 용출이다.

도 9a는 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 용출로서; 출발 물질의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 단량체성 면역글로불린 및 응집체 둘 다를 나타낸다.

도 9b는 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 용출로서; 단량체성 수용체 항체와 응집체가 부분적으로 분리되고, 단량체성 면역글로불린을 포함하는 하나의 주 피크, 및 단량체성 면역글로불린, 응집체 및 다른 단백질을 포함하는 제 2 피크로서 용출된다. 본 도면에는, 제 1(주) 피크의 크기 배제 크로마토그래피를 나타내었다. 하나의 피크만이 SEC-컬럼에서 용출되는데, 이것은 단량체성 면역글로불린이다.

도 9c는 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항 IL-1R 항체의 단일 단계 용출로서; 단량체성 수용체 항체와 응집체가 부분적으로 분리되고, 단량체성 면역글로불린을 포함하는 하나의 주 피크, 및 단량체성 면역글로불린, 응집체 및 다른 단백질을 포함하는 제 2 피크로서 용출된다. 본 도면에는, 제 2 피크의 크기 배제 크로마토그래피를 나타내었다. 크로마토그램에서는, 단량체성 면역글로불린, 응집체 및 다른 단백질에 상응하는 3개 이상의 피크를 볼 수 있다.

도 10은 강한 양이온 교환 수지 SP-세파로스로부터 항-HER-2 항체의 단일 단계 용출로서; 단량체성 항체와 응집체가 분리되지 않고 하나의 피크로 용출된다.

도 11은 pH 5.5에서 시트르산 나트륨 완충액중 염화나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항-HER-2 항체의 선형 구배 용출로서; 단량체성 항체와 응집체가 부분적으로 분리되고, 80 mM 염화나트륨의 출발 농도하에 단량체성 면역글로불린을 포함하는 하나의 주 피크로서 용출되며; 단량체성 및 응집체는 단백질 A와 함께 주 피크의 말미에 혼합물로서 용출된다.

도 12는 pH 5.5에서 시트르산 나트륨 완충액중 염화나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항-HER-2 항체의 3단계 구배 용출로서; 단량체성 항체와 응집체가 분리되고, 80 mM 염화나트륨 농도에서 단량체성 면역글로불린을 포함하는 하나의 주 피크, 및 100 mM의 염화나트륨 농도에서 단량체성 면역글로불린, 응집체 및 단백질 A를 포함하는 제 2 피크로서 용출된다.

도 13은 pH 5.5에서 80 mM 염화나트륨하에 약한 양이온 교환 수지 CM-세파로스로부터 항-HER-2 항체의 단일 단계 구배 용출로서; 단량체는 응집체 없이 용출되고; 응집체는 120 mM까지 제 2 염화나트륨 단계 후 제 2의 명확한 피크로 용출된다.

도 14는 pH 5.5에서 80 mM 염화나트륨하에 강한 양이온 교환 수지 SP-세파로스로부터 항-HER-2 항체의 단일 단계 구배 용출로서; 다음의 두 피크가 수득된다: 피크 1은 단량체상 헤르셉틴(Herceptin, 등록상표)만을 함유하고, 120 mM까지 제 2 염화나트륨 단계 후 용출되는 피크 2는 고농도의 단량체성 헤르셉틴(등록상표) 및 응집체를 함유하며; 이러한 단량체성 헤르셉틴(등록상표)의 수율은 60% 미만이다.

실험 부분

재료:

제 1 단계에서 IgG4 면역글로불린 항 IL-1R 항체(이하에서 면역글로불린으로 지칭, WO 2005/023872 호)를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질 A 컬럼으로부터의 용출은 산성 조건(10 mM 시트르산 나트륨 완충제, pH 값 3.0 ± 0.5)하에서 수행하였다. 여과 단계 전에, 면역글로불린을 함유하는 분획의 pH 값을 pH 9.0의 농축된, 예를 들면, 1 M의 완충액(예를 들면, 트리스-하이드록시메틸-아미노-메테인(TRIS) 또는 포스페이트 완충액)을 사용하여 pH 5.0으로 조정하였다. 단백질 A 용출액은 5 내지 15 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 용액이며, 시트르산나트륨으로 완충시켰다. 이하, 상기 물질은 양이온 교환 수지상에 적재하기 위해 제조된, 조절된 단백질 A 용출액으로서 지칭된다.

실시예 1

본 비교 실시예에서는, 강한 양이온 교환 수지 및 단일 단계 용출을 이용한 이온 교환 크로마토그래피를 설명한다.

크로마토그래피 조건:

수지: SP-세파로스; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척 단계: pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: pH 5.0으로 조정된, 100 mM 염화나트륨 함유 25 mM 시트르산 나트륨 완충액.

조절된 단백질 A 용출액을 강한 양이온 교환 수지(SP-세파로스)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 단일 단계 용출 방법으로 용출시켰는데, 이때 pH 값은 일정하게 유지시키고 전도도는 염화나트륨을 첨가하여 변화(증가)시켰다.

도 1에, 강한 양이온 교환 수지 SP-세파로스 상에서 항 IL-1R 항체의 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 크로마토그램을 나타내었다. 용출은 크로마토그래피 시스템의 pH 값을 변화시키지 않고 염화나트륨 하에 단일 단계 치환 용출이다. 단량체성 면역글로불린 분자와 응집된 면역글로불린 분자가 분리되지 않아, 상기 방법으로는 적재된 물질에 비해 용출액중 응집체 함량의 감소에 의한 정제가 이루어질 수 없다.

실시예 2

본 실시예에서는, 약한 양이온 교환 수지 및 단일 단계 용출을 이용한 이온 교환 크로마토그래피를 설명한다.

단량체성 면역글로불린과 응집체를 분리하기 위해, 약한 양이온 교환 수지를 사용하였다. 상기 종류의 수지를 사용함으로써, 단계 용출에 의해 수지 상에 특정한 pH 이동에 의해 전도도의 증가가 달성되었다(심지어 용출 완충액의 pH가 일정하게 유지될 때에도). 상기 효과는, 예를 들면, 단량체성 면역글로불린과 응집체의 구분을 촉진한다. 또한, 미량의 숙주 세포 단백질 또는 단백질 A와 같은 다른 불순물을 수율에 심각한 손실 없이 단량체 평균 분획으로부터 효과적으로 분리할 수 있다.

크로마토그래피 조건:

수지: CM-토요펄; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척 단계: pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: pH 5.0으로 조정된, 100 mM 염화나트륨 함유 25 mM 시트르산 나트륨 완충액.

조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 수지(CM-토요펄)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 단일 단계 용출 방법으로 용출시켰는데, 이때 이동상의 pH 값은 일정하게 유지시키고 전도도는 염화나트륨을 첨가하여 변화시켰다.

도 2에, 약한 양이온 교환 수지, CM-토요펄을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1에서와 동일한 크로마토그래피 조건하에서의 용출 프로필을 나타내었다. 여기서 주 피크의 숄더(should)로서 제 2 피크가 나타난다. 이러한 분리 양태는 SP-세파로스와 같은 강한 양이온 교환 수지를 사용한 경우와 상이하다. 주 피크 및 제 2 숄더 피크에 상응하는 분획의 분석은 숄더 피크 분획에 상당량의 응집체가 존재함을 나타내었다. 주 피크 분획에서는 응집체가 검출되지 않았다(또한 도 9a 내지 9c 참조).

실시예 3

크로마토그래피 방법의 최적화 - 제 1 단계: 선형 농도 구배

약한 양이온 교환 물질상에서 양이온 교환 크로마토그래피를 최적화하기 위해, 3 단계로 이루어진 최적화 절차를 실시하였다.

제 1 단계는 완충 염, 시트르산 나트륨의 선형 농도 구배를 이용한 크로마토그래피이다. 완충 염 농도를 일정하게 유지하고 면역글로불린의 용출을 야기하는 염의 선형으로 증가하는 농도를 혼합할 수 있는 것이 바람직하다. 두 경우 모두에서 이동상의 pH 값의 변화없이 용액의 전도도가 증가된다. 용출에 적합한 염은, 예를 들면, 염화나트륨, 황산나트륨, 인산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 시트르산 및 그의 염, 및 이들 성분들의 혼합물이다. 적용되는 10 내지 500 mM의 농도를 그에 맞게 조정하여 약 1 내지 약 50 mS/cm 범위의 전도도로 맞춘다.

크로마토그래피 조건:

수지: CM-토요펄; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척 단계: pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: 선형 구배; pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액으로부터, pH 5.0으로 조정된 100 mM 시트르산 나트륨 완충액까지.

조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 수지(CM-토요펄)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 선형 구배 용출 방법으로 용출시켰는데, 이때 이동상의 pH 값은 일정하게 유지시켰다. 완충 염, 시트르산 나트륨의 농도를 40 컬럼 부피에 걸쳐 10 mM에서 100 mM로 선형으로 상승시켰다. 최종 시트르산 나트륨 농도에 이른 후, 용출을 추가로 40 컬럼 부피동안 지속하였다.

도 3에, 항 IL-1R 항체의 선형 완충 구배 용출의 크로마토그램을 나타내었다. 단량체성 면역글로불린 및 응집체는 15 mM 시트르산 나트륨의 농도에서 출발하여 55 mM 시트르산 나트륨의 농도로 종료되는 반-분리된 피크로 용출된다.

양이온 교환 수지로부터 결합된 면역글로불린의 회수는 적용된 용액의 전도도에 따라 달라진다. 그러므로, 회수 단계동안 용출액중에 존재하는 완충 염의 양이온은 양이온 교환 수지로부터 면역글로불린의 용출에 영향을 미치는 것으로 간주해야 한다. 이동상의 전도도 및 이온 강도는 용액중 이온의 총수에 의해 영향받는다. 따라서, 사용된 완충 염 및 사용된 용출을 야기하는 염의 한 분자식중 수소가 아닌 1가 양이온의 수를 이때 고려해야 한다.

실시예 4

크로마토그래피 방법의 최적화 - 제 2 단계: 3 단계 농도 구배 용출

실시예 3에서 측정한 바와 같이 이온 교환 수지로부터 면역글로불린의 용출이 개시되는 농도는 3 단계 용출 방법의 제 2 최적화 단계를 위한 기준을 제공한다. 단계 용출에 대한 대략적인 완충제/염 농도는 다음과 같이 계산한다:

- 제 1 용출 단계의 염 농도는, 제 1 피가수로서 선형으로 증가하는 염 구배하에 측정할 때 이온 교환 컬럼으로부터 용출이 개시되는 염 농도와 용출을 야기하는 염의 분자식에 나타낸 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총수의 곱과, 제 2 피가수로서 완충 염의 농도와 완충 염의 분자식에 나타낸 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총수의 곱의 합과 같고;

농도 계산에 포함되는 계수는 농도 수준간의 차이를 고려하며 출발 농도에 따라 조정된다. 낮은 출발 농도, 즉, 10 내지 40 mM에서 계수는 각각 1.35 및 1.70이고, 40 내지 70 mM의 중간 출발 농도에서 계수는 각각 1.30 내지 1.60이고, 70 mM 이상의 높은 출발 농도에서 계수는 각각 1.25 내지 1.50이다.

계수는 실험적으로 결정된 범위를 한정한다. 이들 값은 절대 값이 아니며 단지 목표값이다. 10%의 편차가 유지가능하다.

완충염은, 실시예 3에서 개략된 바와 같이 크로마토그래피동안 완충염 농도 변화에 의해 이온 교환 수지로부터 단백질의 용출이 수행될 수 있기 때문에 계산에 고려되어야 한다. 완충염 농도가 크로마토그래피동안 일정하게 유지되거나 또는 용출을 야기하는 염의 출발 농도에 비해 작은 경우(염 농도의 15% 이하), 복잡함을 줄이기 위해 계산시 완충염 농도를 무시할 수 있다.

실시예 3에서 측정한 바와 같이, 10 mM 완충액 농도 및 선형 구배로부터의 5 mM로 이루어진 15 mM 시트르산나트륨의 출발 농도하에, 3 단계는 다음과 같이 계산할 수 있다:

크로마토그래피 조건:

수지: CM-토요펄; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척: pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: 단계 1: pH 5.0으로 조정된 34 mM 시트르산 나트륨 완충액; 단계 2: pH 5.0으로 조정된 44 mM 시트르산 나트륨 완충액; 단계 3: pH 5.0으로 조정된 54 mM 시트르산 나트륨 완충액.

조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 수지(CM-토요펄)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 단계 구배 용출 방법(= 용출 염의 농도를 출발 값/수준으로부터 최종 값/수준으로 단계적으로 변화시키는 방법)으로 용출시켰는데, 이때 이동상의 pH 값은 일정하게 유지시켰다. 완충 염, 시트르산 나트륨의 농도를 출발 조건으로서 10 mM로부터 제 1 단계에서 34 mM, 제 2 단계에서 44 mM, 및 최종 단계에서 54 mM로 상승시켰다. 각각의 염 농도 증가 후, 10 컬럼 부피의 용출 완충제를 다음 단계로 넘어가기 전에 컬럼에 통과시켰다. 최종 시트르산 나트륨 농도에 이른 후, 용출을 추가로 10 컬럼 부피동안 지속하였다.

도 4에, 항 IL-1R 항체의 3 단계 구배 용출의 용출 프로필을 나타내었다. 제 1 단계 분획에서 단량체성 면역글로불린이 용출되고, 응집체는 제 2 단계 분획에서 용출된다.

실시예 5

크로마토그래피 방법의 최적화 - 제 3 단계: 염화나트륨을 사용한 단일 단계 용출

최적화 절차의 최종 단계는 단일 단계 용출 방법(= 용출 염의 농도를 출발 값으로부터 최종 값으로 즉시 변화시키는 방법)의 변형이다. 이를 위해, 크로마토그래피의 pH를 5.0에서 5.5로 상승시킨다. 상기 pH 변화는 단백질 A가 5.5 미만의 등전점을 갖기 때문에 단백질 A로부터의 분리를 개선한다. 또한, 용출 염을 완충 염으로 계속 더 사용되는 시트르산 나트륨으로부터 염화나트륨으로 교체한다. 추가의 분석은 상기 크로마토그래피 수행후의 분획을 가지고 수행하였다(DNA, 숙주 세포 단백질, 단백질 A 함량 및 LC-MS에 의한 글라이코실화 패턴).

크로마토그래피 조건:

수지: CM-세파로스; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척: pH 5.0으로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: pH 5.5로 조정된, 150 mM 염화나트륨 함유 10 mM 시트르산 나트륨.

조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 수지(CM-세파로스)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 단일 단계 용출 방법(= 용출 염의 농도를 출발 값으로부터 최종 값으로 즉시 변화시키는 방법)으로 용출시켰는데, 이때 이동상의 pH 값은 일정하게 유지시켰다. 완충 염, 시트르산 나트륨의 농도는 일정하게 유지시키고 150 mM 염화나트륨을 혼합하였다. 염 농도의 증가 후, 15 컬럼 부피의 용출 완충제를 컬럼에 통과시켜 결합된 면역글로불린을 용출시켰다.

염화나트륨을 사용한 단일 단계 용출의 용출 크로마토그램을 도 5에 나타내었다. 단일 단계 구배 크로마토그래피는 주 단량체 분획 및 응집체/단백질 A 분획의 분해를 수행하였다. 단량체성 면역글로불린의 수율은 80% 이상이다. 95% 이상의 수율도 가능하다.

실시예 6

강한 양이온 교환 수지(SP-세파로스 고속 흐름) 및 약한 양이온 교환 수지(CM-세파로스 고속 흐름)를 사용한 분리의 비교

강한 SP-세파로스 고속 흐름 교환기 및 CM-세파로스 고속 흐름 사이의 비교를 수행하였다. 실험은 실시예 5에 따라 이중으로(각 컬럼으로부터 하나만 도 6a와 6b에 나타내었다) 수행하고, 추가의 분석을 수행하였다(DNA, 숙주 세포 단백질, 단백질 A 함량 및 LC-MS에 의한 글라이코실화 패턴).

분석 방법:

크기 배제 크로마토그래피: 수지: TSK 3000(토소하스(Tosohaas)); 컬럼: 300 x 7.8 mm; 유량: 0.5 ml/분; 완충제: pH 7.0으로 조정된, 250 mM 염화칼륨 함유 200 mM 인산칼륨.

DNA-임계-시스템: 예를 들면, 문헌 [Merrick, H. and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9, 398-403, 1992]을 참조하시오.

단백질 A ELISA:

마이크로 플레이트의 웰을 닭에서 유래된 다클론성 단백질 A-IgG로 코팅한다. 결합 후 샘플을 완충제로 세척하여 미-반응 항체를 제거한다. 단백질 A 결합의 경우, 제한된 샘플 부피를 웰에 가한다. 샘플에 존재하는 단백질 A는 닭 항체에 결합되어 플레이트의 웰에 남는다. 배양 후, 샘플 용액을 제거하고 웰을 세척한다. 검출을 위해 계속하여 치킨 유래 다클론성 항-단백질 A-IgG-비오틴 결합체 및 스트렙타비딘 퍼옥시다제 결합체를 가한다. 추가의 세척 단계 후 기질 용액을 가하여 착색된 반응 생성물을 생성한다. 색의 강도는 샘플의 단백질 A 함량에 비례한다. 한정된 시간 후 반응을 중단하고 흡광도를 측정한다.

숙주 세포 단백질(HCP) ELISA:

마이크로 플레이트의 웰의 벽을 혈청 알부민과 스트렙타비딘의 혼합물로 코팅한다. HCP에 대한 염소 유래 다클론성 항체를 마이크로 플레이트의 웰의 벽에 결합시킨다. 세척 단계 후 마이크로 플레이트의 여러 웰을 상이한 농도의 HCP 보정 서열 및 샘플 용액과 함께 배양한다. 배양 후 결합되지 않은 샘플 물질을 완충 용액으로 세척하여 제거한다. 검출을 위해 웰을 항체 퍼옥시다제 결합체와 함께 배양하여 결합된 숙주 세포 단백질을 검출한다. ABTS와 함께 배양하고 405 nm에서 검출하여 고정된 퍼옥시다제 활성을 검출한다.

크로마토그래피 조건:

수지: CM-세파로스; SP-세파로스; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척 단계: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: pH 5.5로 조정된, 150 mM 염화나트륨 함유 10 mM 시트르산 나트륨 완충액.

도 6a 및 6b에는, 약한 양이온 교환 수지 및 강한 양이온 교환 수지의 용출 크로마토그램의 비교를 나타내었다. 약한 양이온 교환 수지(도 6a)를 사용하여 다른 불순물로부터 단량체성 항 IL-1R 항체의 분리를 달성하였다. 강한 양이온 교환 수지(도 6b)를 사용한 경우에는 동일 조건하에서 분리가능하지 않았다. 피크들에 해당하는 분획들을 수집하여 분석하였다. 표 1에 나타낸 분석 결과는 약한 양이온 교환 수지를 사용하여 응집체 및 다른 불순물이 면역글로불린 제제로부터 효과적으로 제거될 수 있음을 보여준다.

표 1에 나타낸 데이터는 약한 양이온 교환 수지를 사용하여 항체의 응집체로부터 단량체성 항 IL-1R 항체를 분리하는 것이 가능함을 보여준다. 또한, DNA- 및 단백질 A-불순물도 제거할 수 있다.

실시예 7

비교 실시예 - 상이한 전도도에서의 용출

크로마토그래피 조건:

수지: CM-세파로스; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: pH 5.5로 조정된, 100 mM, 150 mM 또는 200 mM 염화나트륨 함유 10 mM 시트르산 나트륨.

조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 수지(CM-세파로스)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 단일 단계 구배 용출 방법으로 용출시켰는데, 이때 이동상의 pH 값은 일정하게 유지시켰다. 완충 염, 시트르산 나트륨의 농도는 일정하게 유지시키고, 3회의 다른 시행에서 100 mM, 150 mM 및 200 mM 염화나트륨을 각각 혼합하였다. 염 농도의 증가 후, 15 컬럼 부피의 용출 완충제를 컬럼에 통과시켜 결합된 면역글로불린을 용출시켰다. 용출 크로마토그램을 도 7a 내지 7c에 나타내었다.

용출 염 농도로 150 mM 염화나트륨 및 200 mM 염화나트륨을 사용하여 우수한 분리가 이루어졌다.

실시예 8

비교 실시예 - 상이한 pH 값에서의 용출

크로마토그래피 조건:

수지: CM-세파로스; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: pH 4.0 또는 6.0으로 조정된, 150 mM 염화나트륨 함유 10 mM 시트르산 나트륨.

조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 수지(CM-세파로스)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 단일 단계 구배 용출 방법으로 용출시켰는데, 이때 이동상의 pH 값은 pH 4.0 또는 6.0에서 각각 일정하게 유지시켰다. 완충 염, 시트르산 나트륨의 농도는 일정하게 유지시키고, 150 mM 염화나트륨을 혼합하였다. 염 농도의 증가 후, 15 컬럼 부피의 용출 완충제를 컬럼에 통과시켜 결합된 면역글로불린을 용출시켰다. 용출 크로마토그램을 도 8a 및 8b에 나타내었다.

pH 4.0에서 상기 면역글로불린의 응집체를 형성하는 경향이 증가되었다. 그러나, CM-세파로스는 상기 보다 고농도의 응집체를 2개의 피크로 분리할 수 있다.

실시예 9

강한 양이온 교환 수지(SP-세파로스)를 사용한 단클론성 항-HER-2 항체(WO 99/57134 호)의 크로마토그래피 분리

본 발명을 하기에서 헤르셉틴(등록상표), 단클론성 항-HER-2 항체를 사용하여 더 예시한다.

강한 양이온 교환 수지인 SP-세파로스 상에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 헤르셉틴(등록상표)의 정제를 수행하였다. 본 발명의 표준 조건, 즉, 예를 들면, 염화나트륨을 사용한 단계 용출하에, 단량체성 항체와 응집체의 분리는 이루어지지 않았다(도 10)

크로마토그래피 조건:

수지: SP-세파로스; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.6으로 조정된 25 mM 2-모폴리노에테인설폰산, 50 mM 염화나트륨; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척: pH 5.6으로 조정된 25 mM 2-모폴리노에테인설폰산, 50 mM 염화나트륨; 용출: pH 5.6으로 조정된, 25 mM 2-모폴리노에테인설폰산, 95 mM 염화나트륨.

1 단계에서 단클론성 항-HER-2 항체(이하에서 헤르셉틴(등록상표)로 칭한다)를 단백질 A 치환성 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질 A 컬럼으로부터의 용출을 산성 조건(10 mM 시트르산 나트륨 완충액, pH 값 3.0 ± 0.5)하에서 수행하였다. 여과 단계 전에, 항체를 함유하는 분획의 pH 값을 농축된 트리스-하이드록시메틸-아미노-메테인(TRIS) 완충액을 사용하여 pH 5.6으로 조정하였다. 단백질 A 용출액은 5 내지 15 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 용액이며, 시트르산 나트륨으로 완충시켰다.

조절된 단백질 A 용출액을 강한 양이온 교환 수지(SP-세파로스)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 단일 단계 용출 방법으로 용출시켰는데, 이때 pH 값은 일정하게 유지시키고, 전도도는 염화나트륨 농도의 (단계적) 증가에 의해 변화시켰다. 용출 크로마토그램은 도 10에 나타내었다.

단량체성 항체와 응집체의 분리는 이루어지지 않았다.

실시예 10

크로마토그래피 방법의 최적화 - 제 1 단계: 선형 농도 구배

두 분획의 분리를 개선하기 위해 항 IL-1R 항체를 사용하여 개략한 바와 같은 절차에 따라 최적화하였다.

항 IL-1R 항체 최적화 방법과 대조적으로, 완충 물질의 구배 대신 (용출) 염, 즉, 염화나트륨의 선행 구배를 이용하였다. 최적화 절차의 제 1 단계에 상응하는 선형 염화나트륨 구배 용출의 크로마토그램은 도 11에 나타내었다. 분석 결과 주 피크의 말미에 항체의 응집체가 증가됨이 확인되었다.

크로마토그래피 조건:

수지: CM-세파로스; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: 선형 구배; pH 5.5로 조정된, 10 mM 시트르산 나트륨 완충액으로부터 pH 5.5로 조정된, 400 mM 염화나트륨 함유 10 mM 시트르산 나트륨 완충액.

실시예 9에서 기술한 바와 같은 조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 수지(CM-세파로스)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 선형 구배 용출 방법으로 용출시켰는데, 이때 이동상의 pH 값 및 완충 염의 농도는 일정하게 유지시켰다. 용출 염, 염화나트륨의 농도를 40 컬럼 부피에 걸쳐 0 mM로부터 400 mM로 선형으로 상승시켰다. 용출 크로마토그램은 도 11에 나타내었다.

강한 양이온 교환 수지를 약한 양이온 교환 수지로 대체하여 제 1 주 피크의 숄더로서 제 2 피크의 분리가 야기되었다. 이러한 결과는 항 IL-1R 항체의 경우에서의 결과와 유사하다. 면역글로불린은 80 mM의 염화나트륨 농도에서 컬럼으로부터 용출되기 시작하였다.

실시예 11

실시예 10에서 측정한 바와 같이 도 11에 나타낸 크로마토그램에서 유도되듯이 면역글로불린이 용출되기 시작하는 출발 농도는 80 mM 염화나트륨이다. 제 2 최적화 단계를 위한 세 단계의 농도 계산에서, 완충제 농도는 낮고 크로마토그래피동안 일정하게 유지되기 때문에 무시할 수 있다.

염화 나트륨의 출발 농도는 80 mM이고, 염화나트륨은 그 분자식에 수소가 아닌 다른 하나의 양이온을 갖는다. 따라서, 3 단계 용출에 대한 농도는 각각 80 mM, 100 mM(= 80 mM에 1.25 곱한 값) 및 120 mM(= 80 mM에 1.50 곱한 값) 염화나트륨이다.

크로마토그래피 조건:

수지: CM-세파로스; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: 단계 1: pH 5.5로 조정된, 80 mM 염화나트륨 함유 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 단계 2: pH 5.5로 조정된, 100 mM 염화나트륨 함유 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 단계 3: pH 5.5로 조정된, 120 mM 염화나트륨 함유 10 mM 시트르산 나트륨 완충액.

실시예 9에서 기술한 바와 같은 조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 수지(CM-세파로스)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 단계 구배 용출 방법으로 용출시켰는데, 이때 이동상의 pH 값 및 완충염, 시트르산 나트륨의 농도는 일정하게 유지시켰다. 용출 염, 염화나트륨의 농도를 출발 조건으로서 0 mM로부터 제 1 단계에서 80 mM, 제 2 단계에서 100 mM, 및 최종 단계에서 120 mM로 상승시켰다. 각각의 염 농도 증가 후, 특정 염화나트륨 농도를 갖는 10 컬럼 부피의 용출 완충제를 다음 농도 단계로 넘어가기 전에 컬럼에 통과시켰다. 최종 시트르산 나트륨 농도에 이른 후, 용출을 추가로 10 컬럼 부피동안 지속하였다. 용출 크로마토그램을 도 12에 나타내었다.

3 단계 용출 방법에서, 단량체성 항체는 80 mM의 염화나트륨 농도를 갖는 단계에서 용출된다. 크기 배제 분석 결과 단량체성 항체만이 용출됨을 확인하였다. 염화나트륨 농도를 제 2 단계에서 100 mM로 증가시킨 후, 응집체가 용출되었다(도 12).

실시예 12

크로마토그래피 조건:

수지: CM-세파로스; SP-세파로스; 유량: 160 cm/h; 평형: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 적재: 최대 20 g 단백질/겔 매트릭스 L; 세척: pH 5.5로 조정된 10 mM 시트르산 나트륨 완충액; 용출: pH 5.5로 조정된, 80 mM 염화나트륨 함유 10 mM 시트르산 나트륨.

실시예 9에서 기술한 바와 같은 조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 수지(CM-세파로스)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h 유량에서의 적재 단계 후, 컬럼을 평형 완충액(10 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 단일 단계 구배 용출 방법으로 용출시켰는데, 이때 이동상의 pH 값 및 완충 염의 농도는 일정하게 유지시켰다. 완충 염, 시트르산 나트륨의 농도는 일정하게 유지시키고 80 mM 염화나트륨을 혼합하였다. 염 농도의 증가 후, 15 컬럼 부피의 염화나트륨 함유 용출 완충제를 컬럼에 통과시켜 결합된 단량체성 항-HER-2 항체를 용출시켰다. 단량체성 항체와 응집체의 분리를 확인하기 위해, 단량체성 항체의 분리에는 필요하지 않은, 120 mM의 염화나트륨 농도까지의 제 2 단계를 수행하였다. 상기 제 2의 증가 후, 항체의 응집체가 컬럼으로부터 용출되었다. 용출 크로마토그램은 도 13에 나타내었다.

강한 양이온-교환 수지를 사용하여 동일한 방법을 수행하는 경우, 단량체성 항체와 응집체의 분리는 볼 수 있지만, 단량체성 항체의 상당한 손실이 관찰된다(약한 양이온 교환 컬럼상에서의 95% 이상에 비해 단지 약 60%의 수율)(도 14).

약한 양이온 교환 물질 상에서의 분리에 적합한 조건을 강한 양이온 교환 수지, SP-세파로스에 적용하는 것은 유리하지 않다. 두 분획은 분리될 수 있지만, 단량체성 항체의 수율은 60% 이하로 감소된다.

Claims

응집체 및 단편으로부터 IgG 또는 IgE 부류의 단량체성 면역글로불린을 정제하는 방법으로서,

a) 상기 면역글로불린, 및 시트르산 또는 그의 염, 또는 인산 또는 그의 염으로서 pH 값이 pH 3.0 내지 7.0인 완충 물질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;

b) 상기 용액과, 하전된 치환체로서 카복실기 또는 카복시메틸기를 갖는 양이온 교환 물질을 상기 면역글로불린이 상기 양이온 교환 물질에 결합하는 조건하에서 접촉시키는 단계; 및

c) 완충 물질 및 염을 포함하는 용액을 사용하여 단일 단계로 상기 양이온 교환 물질로부터 단량체성 면역글로불린을 회수하는 단계로서, 상기 염은 시트르산 나트륨, 염화나트륨, 황산나트륨, 인산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 및 시트르산과 인산의 다른 염, 및 이들 성분들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 단일 단계에서 pH 값이 일정하게 유지되는 단계

를 포함하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서,

크로마토그래피 또는 배치 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,

단계 c)에서 용액의 pH 값이 pH 3.0 내지 7.0인 것을 특징으로 하는 방법.
응집체 및 단편으로부터 IgG 또는 IgE 부류의 단량체성 면역글로불린을 단일 단계로 정제하는 과정에서, 하전된 치환체로서 카복실기 또는 카복시메틸기를 갖는 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 단량체성 면역글로불린을 용출하기 위한 염 농도를 측정하는 방법으로서,

하기 하위 단계 a1) 내지 a4)를 포함하는 단계 a):

a1) 상기 면역글로불린, 및 시트르산 또는 그의 염, 또는 인산 또는 그의 염으로서 pH 값이 pH 3.0 내지 7.0인 완충 물질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;

a2) 면역글로불린을 함유하는 상기 용액의 제 1 분취액과 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 상기 면역글로불린이 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합하는 조건하에서 접촉시키는 단계;

a3) 완충 물질 및 염을 포함하는 용액을 사용하되 염 농도를 선형으로 증가시켜 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 단량체성 면역글로불린을 회수하는 단계(여기서, 상기 염은 시트르산 나트륨, 염화나트륨, 황산나트륨, 인산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 및 시트르산과 인산의 다른 염, 및 이들 성분들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택됨); 및

a4) 상기 면역글로불린의 제 1 분획이 이온 교환 컬럼으로부터 용출되기 시작하는 염의 출발 농도를 측정하는 단계, 및

하기 하위 단계 b1) 내지 b3)를 포함하는 단계 b):

b1) 면역글로불린을 함유하는 상기 용액의 제 2 분취액과 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 상기 면역글로불린이 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합하는 조건하에서 접촉시키는 단계;

b2) 제 1 용출 단계, 제 2 용출 단계 및 제 3 용출 단계로 구성된 3 단계 용출 방법으로서,

i) 제 1 용출 단계의 염 농도가 단계 a4)에서 측정된 염의 출발 농도와 염의 분자식에 나타난 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총 수를 곱한 값과, 완충 염의 농도와 완충 염의 분자식에 나타난 수소 이외의 다른 1가 양이온의 총 수를 곱한 값의 합으로서 계산되고,

ii) 제 2 용출 단계의 염 농도가 제 1 용출 단계의 염 농도와 1.25 내지 1.35의 계수를 곱한 값이고,

iii) 제 3 용출 단계의 염 농도가 제 1 용출 단계의 염 농도와 1.50 내지 1.70의 계수를 곱한 값이며,

제 2 용출 단계의 계수 및 제 3 용출 단계의 계수가 10 내지 40 mM의 출발 농도에서 각각 1.35 및 1.70이고, 40 내지 70 mM의 출발 농도에서 각각 1.30 및 1.60이며, 70 mM보다 높은 출발 농도에서 각각 1.25 및 1.50인 것으로서 결정되는,

3 단계 용출 방법을 이용하여 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 단량체성 면역글로불린을 회수하는 단계; 및

b3) 단계 b2)의 3 단계 용출 방법의 어느 단계에서 단량체성 면역글로불린이 이온 교환 컬럼으로부터 용출되는지를 확인하여, 단일 단계의 정제 방법으로 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 단량체성 면역글로불린을 용출하기 위한 염 농도를 측정하는 단계

를 포함하되,

pH 값이 상기 단일 단계에서 일정하게 유지되는 방법.
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제 1 항에 있어서,

양이온 교환 물질이 면역글로불린의 등전점(pI) 미만의 pH 값에서 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서,

면역글로불린의 pI가 6.0 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

단계 c)에서 용출을 야기하는 염이 동시에 완충 물질인 것을 특징으로 하는 방법.