BRPI0610201A2 - método para a purificação de anticorpos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a método para a purificação de imunoglobulinas através de cromatografia de troca de íon que é descrito. O método cromatográfico usa uma resina de troca de íon fraca e um processo de eluição de etapa única para a purificação de uma imunoglobulina. Adicionalmente um método para a determinação da concentração de sal para a eluição de etapa única de uma imunoglobulina a partir de uma resina de troca de íon é descrito.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA A PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de purificação de poli-peptídeo. Um novo método para a purificação de imunoglobulinas com umaresina de troca de íon é descrito aqui. Ao mesmo tempo um método para adeterminação rápida de condições de purificação é dado.

Antecedentes da Invenção

Proteínas e especialmente imunoglobulinas desempenham umpapel importante no portfolio médico de hoje. Para aplicação humana cadasubstância terapêutica tem que satisfazer critérios distintos. Para assegurara segurança de agentes biofarmacêuticos a seres humanos, ácidos nucléi-cos, vírus e proteínas de célula hospedeiro, que causariam dano severo, têmque ser removidos especialmente. Para satisfazer a especificação regulado-ra uma ou mais etapas de purificação têm que seguir o processo de fabrica-ção. Dentre outros, pureza, produtividade total e rendimento desempenhamum papel importante na determinação de um processo de purificação apro-priado.

Métodos diferentes são bem estabelecidos e amplamente usa-dos para purificação de proteína, tal como cromatografia por afinidade comproteínas microbianas (por exemplo, cromatografia de afinidade de proteínaA ou proteína G), cromatografia de troca de íon (por exemplo, troca de cátion(resinas de carboximetila), troca de ânion (resinas de amino etila) e troca demodo misto), absorção tiofílica (por exemplo, com beta-mercaptoetanol eoutros ligantes SH), cromatografia de interação hidrofobica ou de absorçãoaromática (por exemplo, com fenil-sepharose, resinas aza-arenofílicas ouácido m-aminofenilborônico), cromatografia de afinidade com quelato de me-tal (por exemplo, com material de afinidade de Ni(ll) e Cu(ll), cromatografiade exclusão de tamanho e métodos eletroforéticos (tal como eletroforese degel, eletroforese capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102).

Necina, R. e outros, Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698, des-creveram a captura de anticorpos monoclonais humanos diretamente a partirde sobrenadante de cultura através de meios de troca de íon exibindo densi-dade de carga alta. No WO 89/05117 é descrito um método para a purifica-ção de imunoglobulinas produto submetendo diretamente o meio de culturacelular a um tratamento com troca de cátion. Uma purificação em uma etapade anticorpos IgG monoclonais de ascites de camundongo é descrita porDanielsson, A. e outros, J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88.

Uma combinação de métodos, isto é, uma precipitação de ácidocaprílico e cromatografia de troca de íon, foi usada por Raweerith, R. e ou-tros (J. Immun. Meth. 282 (2003) 63-72) como meio para fracionar anticorpode antídoto de cavalo digerido com pepsina F(ab')2. No WO 2003/102132 acombinação de uma etapa de purificação de não-afinidade e uma filtragemde fluxo tangencial de alto desempenho é descrito para a purificação de pro-teínas. A combinação de duas etapas de cromatografia de afinidade é rela-tada no WO 92/19973.

Follman, D.K. e Fahrner, R.L. relataram uma avaliação fatorialde processos de purificação de anticorpo usando três etapas de cromatogra-fia sem proteína A (J. Chrom. A 1024 (2004) 79-85). Mhatre, R. e outros, (J.Chrom. A 707 (1995 225-231) exploraram a purificação de anticorpo defragmentos Fab através de cromatografia de troca de cátion e eluição comgradiente de pH.

O WO 94/00561 relata anticorpos anW-rhesus monoclonais hu-manos e linhagens de célula produzindo os mesmos. Um método para purifi-cação de um polipeptídeo através de cromatografia de troca de íon é relata-do no WO 2004/024866 onde uma lavagem de gradiente é usada para sepa-rar um polipeptídeo de interesse de um ou mais contaminantes. Schwarz, A.e outros (Laborpraxis 21 (1997) 62-66) relatam a purificação de anticorposmonoclonais com uma coluna CM-HyperD.

O WO 2004/076485 relata um processo para purificação de anti-corpo através de cromatografia de proteína A e troca de íon. Na EP 0 530447 um processo para purificação de anticorpos monoclonais IgG através deuma combinação de três etapas cromatográficas é relatado. A remoção deproteína A de preparações de anticorpo é relatada na US 4.983.722.

O WO 95/16037 relata a purificação de anticorpos monoclonaisbiespecíficos anti-EGF-R/anti-CD3 a partir de hibridoma híbrido realizadaatravés de uma cromatografia de troca de cátion de proteína A. A separaçãode monômeros de anticorpo de seus multímeros através do uso de cromato-grafia de troca de íon é relatada na EP 1 084 136. A US 5.429.746 refere-seà aplicação de cromatografia de combinação de cromatografia de interaçãohidrofóbica para a purificação de proteínas de molécula de anticorpo.

Sumário da Invenção

Deste modo é o objetivo da presente invenção prover um outrométodo para a purificação de imunoglobulinas recombinantemente produzi-das e para a separação de espécies de imunoglobulina monoméricas e mul-timéricas.

A presente invenção prove um método para purificação de umaimunoglobulina, onde o método compreende as etapas que seguem:

a) provisão de uma solução compreendendo uma imunoglobuli-na, uma substância tampão e opcionalmente um sal;

b) trazer a solução e um material de troca de íon fraca em conta-to sob condições com o que a imunoglobulina se liga ao material de troca deíon fraca;

c) recuperação da imunoglobulina a partir do material de trocade íon fraca em uma etapa única usando uma solução compreendendo umasubstância tampão e um sal.

A invenção prove ainda um método para determinação da con-centração de um sal para eluição de um polipeptídeo a partir de um materialde cromatografia de troca de íon em uma processo de purificação de etapaúnica, compreendendo as duas etapas que seguem:

a) uma etapa compreendendo as subetapas que seguem:

a1) provisão de uma solução compreendendo um polipeptídeo,uma substância tampão e opcionalmente um sal;

a2) trazer uma primeira alíquota da solução contendo o polipep-tídeo e o material de troca de íon em contato sob condições com o que opolipeptídeo se liga ao material de troca de íon;

a3) recuperação do polipeptídeo a partir do material de troca deíon através do uso de uma solução compreendendo uma substância tampãoe um sal com o que a concentração do sal é aumentada linearmente;

a4) determinação da concentração de partida do sal onde a pri-meira fração do polipeptídeo começa a eluir a partir da coluna de troca deíon;

b) etapa dois compreendendo as subetapas que seguem

b1) trazer uma segunda alíquota da solução contendo o polipep-tídeo e o material de troca de íon em contado sob condições com o que opolipeptídeo se liga ao material de troca de íon;

b2) recuperação do polipeptídeo a partir do material de troca deíon através do uso de um método de eluição de três etapas, através do que

i) a concentração de sal da primeira etapa de eluição é calculadacomo a soma do produto da concentração de partida do sal conforme deter-minado na etapa a4) e do número total de cátions monovalentes diferentesde hidrogênio denotado na fórmula molecular do sal edo produto da concentração do sal de tampão e do número total de cátionsmonovalentes diferentes de hidrogênio denotado na fórmula molecular do saltampão;

ii) a concentração de sal da segunda etapa de eluição é o produ-to da concentração de sal da primeira etapa de eluição e um fator entre 1,25 e1,35;

iii) a concentração de sal da terceira etapa de eluição é o produ-to da concentração de sal da primeira etapa de eluição e um fator entre 1,50e 1,70;

com o que os fatores das etapas ii) e iii) são determinados como segue: emuma concentração de partida entre 10 mM e 40 mM os fatores são 1,35 e1,70, respectivamente, em uma concentração de partida entre 40 mM e 70mM os fatores são 1,30 e 1,60, respectivamente, e em uma concentração departida de mais de 70 mM os fatores são 1,25 e 1,50, respectivamente.b3) determinação em qual subetapa do método de eluição detrês etapas da etapa b2) o polipeptídeo é eluído a partir da coluna de trocade íon deste modo determinando a concentração do sal para eluição de umpolipeptídeo a partir de um material de cromatografia de troca de íon em umprocesso de purificação de etapa única.

Descrição Detalhada da Invenção

Esses termos são usados no presente pedido de acordo com adefinição que segue:

O termo "resina de troca de íon" ou "material de troca de íon"conforme usado no presente pedido significa uma matriz de peso molecularalto imóvel que carrega substituintes carregados covalentemente ligados.Para neutralidade de carga geral contra-íons não-covaíentemente ligadossão ligados a ela. O "material de troca de íon" tem a habilidade em trocarseus contra-íons não-covalentemente ligados por íons similarmente carrega-dos da solução circundante. Dependendo da carga de seus contra-íons per-mutáveis a "resina de troca de íon" é referida como uma resina de troca decátion ou como resina de troca de ânion. Dependendo da natureza do grupocarregado (substituinte) a "resina de troca de íon" é referida como, por e-xemplo, no caso de resinas de troca de cátion, resina de ácido sulfônico (S)ou resina de carboximetila (CM). Dependendo da natureza química do gru-po/substituinte carregado a "resina de troca de íon" pode adicionalmente serclassificada como resina de troca de íon forte ou fraca, dependendo da resis-tência do substituinte carregado covalentemente ligado. Por exemplo, resi-nas de troca de cátion forte têm um grupo de ácido sulfônico como substitu-inte carregado, resinas de troca de cátion fraca têm um grupo carboxílico, depreferência um grupo carboximetila, como substituinte carregado, e resinasde troca de ânion fraca têm um grupo dietilaminoetila como substituinte car-regado.

Resinas de troca de cátion estão disponíveis sob nomes diferen-tes de uma pluralidade de companhias tal como Bio-Rex, Macro-Prep CM(disponíveis da Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA), trocador de cátionfraco WCX 2 (disponível da Ciphergen, Fremont, CA, USA), Dowex® MAC-3(disponível da Dow Chemical Company - separações de líquido, Midland,Ml, USA), Mustang C (disponível da Pall Corporation, East Hills, NY, USA),Cellulose CM-23, CM-32, CM-52, hyper-D e partisphere (disponíveis daWhatman pie, Brentford, Reino Unido), Amberlite® IRC 76, IRC 747, IRC748, GT 73 (disponíveis da Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Alemanha),CM 1500, CM 3000 (disponíveis da BioChron Labs, Terre Haute, IN, USA) eCM-Sepharose® Fast Flow (disponível da GE Healthcare - Amersham Bios-cience Europe GmbH, Freiburg, Alemanha).

De preferência, os substituintes carregados do material de trocade íon fraca são pelo menos cerca de 90% de grupos de ácido carboxílico,mais de 90% de grupos de ácido carboxílico ou mais de 95% de grupos deácido carboxílico.

Os termos "eluição em etapa única" e "eluição com gradiente deetapa única", que são usados intercomutavelmente no presente pedido, sig-nificam um método onde, por exemplo, a concentração de uma substânciacausando eluição, isto é, a dissolução de um composto ligado à partir de ummaterial, é aumentada ou diminuída de uma vez, isto é, diretamente de umvalor/nível de partida para um valor/nível final, isto é, em uma etapa única.

Um "polipeptídeo" é um polímero de resíduos de aminoácidounidos por ligações peptídeo, seja produzido naturalmente ou sinteticamen-te. Polipeptídeos de menos do que cerca de 20 resíduos de aminoácido sãoreferidos como "peptídeos".

Uma "proteína" é uma macromolécula compreendendo uma oumais cadeias de polipeptídeo ou uma cadeia de polipeptídeo de mais de 100resíduos de aminoácido. Uma proteína pode também compreender compo-nentes não-peptídicos, tal como grupos carboidrato. Carboidratos e outrossubstituintes não-peptídicos podem ser adicionados a uma proteína atravésda célula onde a proteína é produzida, e vão variar com o tipo de célula. Pro-teínas são definidas aqui em termos de suas estruturas principais de amino-ácido, substituintes tal como grupos carboidrato são geralmente não especi-ficados, mas podem estar presentes contudo.

Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" que podem ser usadosintercomutavelmente no presente pedido compreendem pelo menos duascadeias de polipeptídeo leves e duas cadeias de polipeptídeo pesadas. Ca-da uma das cadeias de polipeptídeo pesada e leve contém uma região vari-ável (geralmente a porção amino terminal da cadeia de polipeptídeo) quecontém um domínio de ligação para interação com o antígeno. Cada umadas cadeias de polipeptídeo pesada e leve também compreende uma regiãoconstante (geralmente a porção terminal carboxila) que pode mediar a liga-ção do anticorpo a tecidos hospedeiros ou fatores incluindo várias células dosistema imune, algumas células fagocíticas e primeiro componente (C1q) dosistema de complemento clássico. Tipicamente, as cadeias de polipeptídeoleve e pesada são cadeias completas, cada uma consistindo essencialmenteem uma região variável, isto é, \A_ ou VH e uma região constante completa,isto é, de Cl no caso de uma cadeia de polipeptídeo leve ou de Ch1 , Ch2,Ch3 e opcionalmente Ch4 no caso de uma cadeia de polipeptídeo pesada.

As regiões variáveis do anticorpo de acordo com a invenção podem ser en-xertadas em regiões constantes de outros isotipos. Por exemplo, um polinu-cleotídeo codificando a região variável de uma cadeia pesada do isotipo 1pode ser enxertado no polinucleotídeo codificando a região constante deuma outra classe de cadeia pesada (ou subclasse).

Conforme aqui usado, o termo "anticorpo" ou "imunoglobulina"refere-se a uma proteína consistindo em um ou mais polipeptídeos substan-cialmente codificados por genes de anticorpo. Os genes de anticorpo reco-nhecidos incluem os genes de região constante diferentes bem como os ge-nes de região variável de anticorpo miríades. Anticorpos podem existir emuma variedade de formas, incluindo, por exemplo, Fv, Fab e F(ab)2 bemcomo cadeias simples (por exemplo, Huston, J.S. e outros, PNAS USA 85(1988) 5879-5883; Bird e outros, Science 242 (1988) 423-426; e, em geral,Hood e outros, Immunology, Benjamin N.Y., 2a edição (1984) e Hunkapiller eHood, Nature 323 (1986) 15-16). Em uma modalidade anticorpos de acordocom a presente invenção compreendem anticorpos monoclonais e seusfragmentos, por exemplo, cadeias pesadas ou leves isoladas, ou cadeiaspesadas ou leves apenas consistindo em regiões constantes bem comoseus fragmentos.

Métodos cromatográficos gerais e seu uso são conhecidos deuma pessoa versada na técnica. Vide, por exemplo, Chromatography, 5a e-dição, Parte A: Fundamentais and Techniques, Heftmann, E. (ed), ElsevierScience Publishing Company, Nova York, (1992); Advanced Chromatogra-phic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevir Sci-ence, B.V., Amsterdan, Países Baixos (1998); Chromatography Today, Poo-le, CF. e Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, Nova York(1991); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (1982); Sambro-ok, J. e outros, (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edi-ção, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989;ou Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. e outros, (eds.),John Wiley and Sons, Inc., Nova York.

A presente invenção prove um método para purificação de umaimunoglobulina, onde o método compreende as etapas que seguem:

a) provisão de uma solução compreendendo uma imunoglobuli-na, uma substância tampão e opcionalmente um sal;

b) trazer a solução e um material de troca de íon fraca em conta-to sob condições com o que a imunoglobulina se liga ao material de troca deíon fraca;

c) recuperação da imunoglobulina a partir do material de trocade íon fraca em uma etapa única através do uso de uma solução compreen-dendo uma substância tampão e um sal.

O processo de purificação de imunoglobulinas em geral compre-ende uma parte cromatografica multietapa. Na primeira etapa, polipeptídeose proteínas não-imunoglobulina são separados da fração de imunoglobulinaatravés de uma cromatografia de afinidade, por exemplo, com proteína A.

Em seguida uma cromatografia de troca de íon pode ser realizada para se-parar as classes de imunoglobulina individuais e para remover traços de pro-teína A, que foi co-eluída da primeira coluna. Finalmente, uma terceira etapacromatografica é necessária para separar monômeros de imunoglobulina demultímeros e fragmentos da mesma classe. Algumas vezes a quantidade deagregados é alta (5% ou mais) e não é possível separá-los eficientementena terceira etapa de purificação necessitando de etapas de purificação adi-cionais.

Com a produção recombinante de imunoglobulinas específicas,a etapa de separação para a separação de classes de imunoglobulinas dife-rentes é dispensável. Deste modo, o processo de purificação geral de imu-noglobulinas recombinantemente produzidas pode ser reduzido a duas eta-pas cromatográficas.

O eluato de proteína A condicionado é em geral cromatografi-camente processado em um material de troca de cátion em valores de pHabaixo do ponto isoelétrico da respectiva proteína imunoglobulina.

O anticorpo anti-IL-1 R (WO 2005/023872) e Herceptin®, um anti-corpo anti-HER2 (WO 99/57134), estavam disponíveis em quantidades sufi-cientes nos laboratórios da requerente no momento da invenção e então apresente invenção é exemplificada com essas duas imunoglobulinas. Damesma maneira a invenção é em geral praticável com imunoglobulinas. Estadescrição exemplificada é feitas apenas a título de exemplo e não a título delimitação da invenção. Esses exemplos são providos para auxiliar na com-preensão da presente invenção, cujo verdadeiro escopo é apresentado nasreivindicações apensas.

A presente invenção descreve um método de purificação para aseparação de monômeros de imunoglobulina a partir de agregados e frag-mentos bem como a depleção de outras impurezas do polipeptídeo. Comopode ser visto a partir do experimento, esta purificação é obtida através douso de resinas de troca de íon fraca, de preferência através do uso de resi-nas de troca de cátion fraca. Conforme exemplificado através de compara-ção de materiais de troca de íons forte e fraca o material de troca de íon fra-ca prove uma separação de formas monoméricas e agregadas das imuno-globulinas (vide exemplos 1 e 2 e exemplos 9 e 12).

Em uma modalidades da invenção, o valor do pH do materialtampão (substância) é de a partir de pH 3,0 a pH 10,0, de preferência de apartir de pH 3,0 a pH 7,0, com mais preferência de a partir de pH 4,0 a pH6,0 e com mais preferência de a partir de pH 4,5 a pH 5,5.

Em uma modalidade o valor do pH é mantido constante na etapaúnica, isto é, ele é mantido no mesmo valor na etapa única.

Um outro item preferido da presente invenção é que o métododa presente invenção é aplicável a imunoglobulinas que têm um ponto isoe-létrico (pl) de 6,0 ou mais (pl > 6,0) e então têm uma carga positiva líquidana faixa de pH partindo de pH 6,0 a pH 14.

Uma modalidade preferida da invenção é a purificação de umaimunoglobulina da classe IgG ou IgE.

Um material de troca de cátion fraca é usado em uma modalida-de preferida da presente invenção.

Um material tampão é de preferência empregado em uma faixade concentração entre 5 mM e 100 mM conforme exemplificado.

Para a recuperação das imunoglobulinas ligadas a partir do ma-terial de troca de íon fraca a condutividade do tampão/solução é aumentada.Isto pode ser realizado ou através de uma concentração de sal de tampãomaior ou através da adição de outros ais, os chamados sais de eluição, àsolução tampão. Sais de eluição preferidos são citrato de sódio, cloreto desódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de po-tássio, fosfato de potássio, bem como outros sais de ácido cítrico e ácidofosfórico, e qualquer mistura desses componentes. Especialmente preferidossão citrato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio e suas misturas.

A concentração do sal, causando a eluição, está de preferênciana faixa entre 5 mM e 500 mM, com mais preferência entre 5 mM e 400 mMe especialmente preferido entre 5 mM e 250 mM.

Uma outra modalidade preferida da invenção é o uso do sal,causando a eluição, ao mesmo tempo que a substância tampão, especial-mente com ácido cítrico e seus sais ou ácido fosfórico e seus sais.

O método da presente invenção é de preferência um métodocromatográfico ou em batelada, especialmente preferido é um método com-preendendo uma eluição em batelada.

Uma outra modalidade preferida da presente invenção é que apurificação é um processo de purificação de etapa única.

Uma "etapa única" significa um processo onde uma ou maiscondições, por exemplo, o pH, a resistência iônica, concentração de um sale/ou o fluxo de uma cromatografia, é/são mudados todos de uma vez a partirde um valor de partida para um valor final, isto é, as condições são mudadasincrementalmente, isto é, em etapas, em contraste com mudança linear.

Ainda uma modalidade preferida da presente invenção é que ométodo compreende a etapa adicional de purificação de imunoglobulina a-través de uma cromatografia de afinidade de proteína A antes da etapa a) dométodo.

A presente invenção prove ainda um método para determinaçãoda concentração de um sal para eluição de um polipeptídeo a partir de ummaterial de cromatografia de troca de íon em um processo de purificação deetapa única, compreendendo as duas etapas que seguem:

a) etapa um compreendendo as subetapas que seguem

a1) provisão de uma solução compreendendo um polipeptídeo,uma substância tampão e, opcionalmente, um sal;

a2) trazer uma primeira alíquota da solução contendo o polipep-tídeo e o material de troca de íon em contato sob condições com o queo po-lipeptídeo se liga ao material de troca de íon;

a3) recuperação do polipeptídeo a partir do material de troca deíon através do uso de uma solução compreendendo uma substância tampãoe um sal, com o que a concentração do sal aumentou linearmente;

a4) determinação da concentração de partida do sal onde a pri-meira fração do polipeptídeo começa a eluir a partir da coluna de troca deíon;

b) etapa dois compreendendo as subetapas que seguem

b1) trazer uma segunda alíquota da solução contendo o polipep-tídeo e um material de troca de íon em contato sob condições com o que opolipeptídeo se liga ao material de troca de íon;

b2) recuperação do polipeptídeo a partir do material de troca deíon através do uso do método de eluição de três etapas, com o quei) a concentração de sal da primeira etapa de eluição é calculadacomo a soma do produto da concentração de partida do sal conforme deter-minado na etapa a4) e o número total de cátions monovalentes diferentes dehidrogênio denotado na fórmula molecular do sal

e

do produto da concentração do sal tampão e o número total de cátions mo-novalentes diferentes de hidrogênio denotado na fórmula molecular do saltampão;

iii) a concentração de sal da segunda etapa de eluição é o pro-duto da concentração de sal da primeira etapa de eluição e um fator entre 1,25 e 1,35;

iii) a concentração de sal da terceira etapa de eluição é o produ-to da concentração de sal da primeira etapa de eluição e um fator entre 1,50e 1,70;

com o queos fatores das etapas ii) e iii) são determinados como segue: emuma concentração de partida entre 10 mM e 40 mM os fatores são 1,35 e1,70, respectivamente, em uma concentração de partida entre 40 mM e 70mM os fatores são 1,30 e 1,60, respectivamente, e em uma concentração departida de mais de 70 mM os fatores são 1,25 e 1,50, respectivamente.

b3) determinação em qual subetapa do método de eluição detrês etapas da etapa b2) o polipeptídeo é eluído da coluna de troca de íondeste modo determinando a concentração do sal para eluição de um poli-peptídeo a partir de um material de cromatografia de troca de íon em umprocesso de purificação de etapa única.

Os fatores da etapa b2) definem uma faixa que foi determinadaexperimentalmente. Esses valores não são valores absolutos mas meramen-te um valor-alvo. Um desvio de 10% pode ser mantido.

A presente invenção descreve um método para determinação daconcentração de um sal para eluição de um polipeptídeo a partir de um ma-terial de cromatografia de troca de íon em um processo de purificação deetapa única para a purificação de polipeptídeos a partir de outro material pro-teináceo.A concentração, na qual a eluição do polipeptídeo, de preferên-cia de uma imunoglobulina, a partir da resina de troca de íon começa, provea base para a segunda etapa de otimização b), um método de eluição detrês etapas. As concentrações de tampão/sal aproximadas para a eluição emetapa são calculadas como segue:

- a concentração de sal da primeira etapa de eluição é igual àsoma de como primeiro somatório (summand) o produto da concentração dosal, na qual a eluição da coluna de troca de íon começa conforme determi-nado com o gradiente de sal em aumento linear, e o número total de cátionsmonovalentes diferentes de hidrogênio denotado na fórmula molecular do salcausando a eluição

e

como segundo somatório o produto da concentração do sal tampão e o nú-mero total de cátions monovalentes diferentes de hidrogênio denotado nafórmula molecular do sal tampão;

- a concentração de sal da segunda etapa de eluição é igual aoproduto da concentração de sal da primeira etapa de eluição e um fator entre1,25 e 1,35;

- a concentração de sal da terceira etapa de eluição é igual aoproduto da concentração de sal da primeira etapa de eluição e um fator den-tre 1,50 e 1,70.

O fator incluído no cálculo das etapas de concentração é res-ponsável pelo intervalo entre os níveis de concentração e é ajustado depen-dendo da concentração de partida. Em concentrações de partida pequenas,isto é, entre 10 mM e 40 mM, os fatores são 1,35 e 1,70, respectivamente,em concentrações de partida médias entre 40 mM e 70 mM os fatores são1,30 e 1,60, respectivamente e em concentrações de partida altas de maisde 70 mM os fatores são 1,25 e 1,50 respectivamente. Esses fatores defi-nem uma faixa que foi determinada experimentalmente. Esses valores nãosão valores absolutos mas meramente um valor-alvo. Um desvio de 10%pode ser mantido.

O sal tampão tem que ser registrado no cálculo porque é possí-vel, conforme mostrado no Exemplo 3, que a eluição de uma proteína a par-tir de uma resina de troca de íon possa ser afetada por uma mudança daconcentração de sal tampão durante a cromatografia. Se a concentração desal tampão for mantida constante durante a cromatografia ou for pequenacomparado com a concentração declarada do sal que causa a eluição, elepode ser negligenciado durante o cálculo para reduzir a complexidade.

Em uma modalidade o sal que causa a eluição não é o sal tam-pão e a concentração de sal da etapa b2i) é o produto da concentração dosal, na qual a eluição da coluna de troca de íon começa conforme determi-nado com o gradiente de sal crescente linear na etapa a4), e o número totalde cátions monovalentes diferentes de hidrogênio denotado na fórmula mo-lecular do sal que causa a eluição.

O cálculo será exemplificado com base no exemplo 4 com o an-ticorpo IL-1R. Com uma concentração de partida de 15 mM de citrato de só-dio, conforme determinado no exemplo 3, consistindo em uma concentraçãode tampão a 10 mM e uma contribuição de 5 mM a partir do gradiente linear,as três etapas são calculadas como segue:

- a concentração-alvo para etapa um é calculada ser 30 mM (5mM*2 + 10 mM*2) de citrato de sódio em detalhe: 5 mM (concentração departida) multiplicado por dois (ácido cítrico é um ácido trivalente, empregadocomo sal dissódico; deste modo dois cátions monovalentes diferentes dehidrogênio estão presentes na fórmula molecular) mais 10 mM (concentra-ção de sal tampão) multiplicado por dois (ácido cítrico é um ácido trivalente,empregado como sal dissódico; deste modo dois cátions monovalentes dife-rentes de hidrogênio estão presentes na fórmula molecular)

- a concentração-alvo para etapa dois é calculada ser 40,5 mM(30 mM * 1,35) de citrato de sódio em detalhe: citrato de sódio a 30 mM é aconcentração da etapa um multiplicada por 1,35 (a concentração de partidaé 15 mM, portanto valor 1,35 é selecionado)

- a concentração-alvo para etapa três é calculada ser 51 mM (30mM * 1,70) de citrato de sódio em detalhe: citrato de sódio a 30 mM é a con-centração da etapa 1 multiplicada por 1,70 (a concentração de partida é 15mM, portanto fator 1,70 é selecionado)

Como pode ser visto a partir dos experimentos esta purificação éconseguida em uma modalidade preferida através do uso de um material detroca de íon fraca, especialmente de preferência de um material de troca decátion fraca.

Uma modalidade preferida da invenção é que o polipeptídeo éuma imunoglobulina, especialmente de preferência uma imunoglobulina daclasse IgG ou IgE.

Em uma modalidade da invenção, o valor do pH do materi-al/substância tampão é de a partir de pH 3,0 a pH 10,0, de preferência de apartir de pH 3,0 a pH 7,0, com mais preferência de a partir de pH 4,0 a pH6,0 e com mais preferência de a partir de pH 4,5 a pH 5,5.

Um outro item preferido da presente invenção é que o métododa presente invenção é aplicável a imunoglobulinas que têm um ponto isoe-létrico (pl) de 6,0 ou mais (pl > 6,0) e então têm uma carga positiva líquidana faixa de pH partindo de pH 6,0 a pH 14.

O material/substância tampão é de preferência empregado emuma faixa de concentração entre 5 mM e 100 mM conforme exemplificado.

Para a recuperação das imunoglobulinas ligadas a partir do ma-terial de troca de íon a condutividade do tampão/solução é aumentada. Istopode ser realizado ou através de uma concentração de sal tampão maior ouatravés da adição de outros sais, os chamados sais de eluição, à soluçãotampão. Sais de eluição preferidos são citrato de sódio, cloreto de sódio,sulfato de sódio, fosfato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio,fosfato de potássio, bem como outros sais tal como ácido citrico e fosforico,e qualquer mistura desses componentes.

Especialmente preferidos são citrato de sódio, cloreto de sódio,cloreto de potássio e qualquer mistura deles.

A concentração do sal, que causa a eluição, está de preferênciana faixa entre 5 mM e 500 mM, com mais preferência entre 5 mM e 400 mMe especialmente de preferência entre 5 mM e 250 mM.

Uma outra modalidade preferida da invenção é o uso do sal, quecausa eluição, ao mesmo tempo que a substância tampão, especialmentecom ácido cítrico e seus sais ou ácido fosfórico e seus sais.

O método da presente invenção é de preferência um métodocromatográfico ou em batelada, especialmente preferido é um método com-preendendo uma eluição em batelada.

Uma outra modalidade preferida da presente invenção é que apurificação é um processo de purificação em etapa única.

Uma modalidade ainda preferida da presente invenção é que ométodo compreende a etapa adicional de purificação da imunoglobulina a-través de cromatografia por afinidade de uma proteína A antes da etapa a)do método.

Os exemplos e figuras que seguem são providos para auxiliar nacompreensão da presente invenção, cujo verdadeiro escopo é mostrado nasreivindicações apensas. É compreendido que modificações podem ser feitasnos procedimentos mostrados sem se afastar do espírito da invenção.

Descrição das Figuras

Figura 1 - Eluição em etapa única de anticorpo anti IL-1R a partirde resina de troca de cátion forte SP-Sepharose; formas monoméricas e a-gregadas do anticorpo receptor não são separadas e eluem como um pico.

Figura 2 - Eluição em etapa única de anticorpo IL-1 R a partir deresina de troca de cátion fraca CM-Toyopearl; formas monoméricas e agre-gadas do anticorpo receptor são parcialmente separadas e eluem como umpico principal compreendendo a forma monomerica da imunoglobulina e umsegundo pico, compreendendo formas monomerica e agregada da imuno-globulina bem como proteína A.

Figura 3 - Eluição com gradiente linear de anticorpo anti IL-1 R apartir da resina de troca de cátion fraca CM-Toyopearl com citrato de sódioem pH 5,0; formas monoméricas e agregadas do anticorpo receptor são par-cialmente separadas e eluem em uma concentração de partida de citrato desódio de 15 mM como um pico principal compreendendo a forma monomeri-ca da imunoglobulina e como um segundo pico, compreendendo uma mistu-ra de forma monomerica, formas agregadas da imunoglobulina, e proteína A.A análise SEC das duas frações é inserida no cromatograma de troca deíon. No pico principal agregados estão ausentes. Em contraste no segundopico formas agregadas da imunoglobulina estão presentes.

Figura 4 - Eluição com gradiente de três etapas de anticorpo IL-1R a partir da resina de troca de cátion fraca CM-Toyopearl com citrato desódio em pH 5,0; formas monomericas e agregadas do anticorpo receptorsão parcialmente separadas e eluem como um pico principal compreenden-do a forma monomerica da imunoglobulina em uma concentração de citratode sódio de 34 mM e um segundo pico compreendendo formas monomeri-cas e agregadas da imunoglobulina bem como proteína A em uma concen-tração de citrato de sódio de 44 mM.

Figura 5 - Eluição com gradiente de etapa única de anticorpoanti IL-1R a partir da resina de troca de cátion fraca CM-Sepharose com 150mM de cloreto de sódio em pH 5,5; formas monomericas e agregadas doanticorpo receptor são separadas e eluem como um pico principal compre-endendo a forma monomerica da imunoglobulina e como um segundo picocompreendendo formas monomericas e agregadas da imunoglobulina bemcomo proteína A.

Figura 6a - Perfil de eluição em CM-Sepharose fast flow; doispicos podem ser identificados: um pico principal, correspondendo ao anticor-po anti IL-1R monomérico, e um segundo pico menor, que contém principal-mente agregados e outras impurezas.

Figura 6b - Perfil de eluição de anticorpo anti IL-1R em uma SP-sepharose fast flow; um pico pode ser identificado, o qual contém imunoglo-bulinas monomericas, agregados e outras impurezas que não foram separa-das nesta coluna.

Figura 7a - Eluição com gradiente de etapa única de anticorpoanti IL-1R a partir de resina de troca de cátion fraca CM-Sepharose com clo-reto de sódio a 100 mM em pH 5,5.

Figura 7b - Eluição com gradiente de etapa única de anticorpoanti IL-1R a partir da resina de troca de íon fraca CM-Sepharose com cloretode sódio a 150 mM em pH 5,5.Figura 7c - Eluição com gradiente de etapa única de anticorpoanti IL-1R a partir da resina de troca de íon fraca CM-Sepharose com cloretode sódio a 200 mM em pH 5,5.

Figura 8a - Eluição com gradiente de etapa única de anticorpoanti IL-1 R a partir da resina de troca de cátion fraca CM-Sepharose com clo-reto de sódio a 150 mM em pH 4,0.

Figura 8b - Eluição com gradiente de etapa única de anticorpoanti IL-1 R a partir da resina de troca de cátion fraca CM-Sepharose com clo-reto de sódio a 150 mM em pH 6,0.

Etapa 9a - Eluição em etapa única de anticorpo anti IL-1 R a par-tir de resina de troca de cátion fraca CM-Sepharose; cromatografia de exclu-são de tamanho (SEC) do material de partida mostrando ambas formas mo-nomericas e agregadas da imunoglobulina.

Figura 9b - Eluição em etapa única de anticorpo anti IL-1 R a par-tir de resina de troca de cátion fraca CM-Sepharose; formas monomericas eagregadas do anticorpo receptor são parcialmente separadas e eluem comoum pico principal compreendendo a forma monomérica da imunoglobulina ecomo um segundo pico, compreendendo formas monomericas e agregadasda imunoglobulina bem como outra proteína. Nesta figura, a cromatografiade exclusão de tamanho do primeiro pico (principal) é mostrada. Apenas umpico é eluído a partir da coluna SEC, que é a imunoglobulina monomérica.

Figura 9c - Eluição em etapa única de anticorpo anti IL-1 R a par-tir de resina de troca de cátion fraca CM-Sepharose; formas monomericas eagregadas do anticorpo receptor são parcialmente separadas e eluem comoum pico principal compreendendo a forma monomérica da imunoglobulina eum segundo pico, compreendendo formas monomericas e agregadas daimunoglobulina bem como outra proteína. Nesta figura a cromatografia deexclusão de tamanho do segundo pico é mostrada. No cromatograma, pelomenos três picos podem ser vistos, equivalentes a formas monomericas eagregadas da imunoglobulina e outra proteína.

Figura 10 - Eluição em etapa única de anticorpo anti-HER-2 apartir da resina de troca de cátion forte SP-Sepharose; formas monomericase agregadas do anticorpo não são separadas e eluem como um pico.

Figura 11 - Eluição com gradiente linear de anticorpo anti-HER-2a partir da resina de troca de cátion fraca CM-Sepharose com cloreto de só-dio em tampão de citrato de sódio em pH 5,5; formas monoméricas e agre-gadas do anticorpo são parcialmente separadas e eluem com uma concen-tração de partida de 80 mM de cloreto de sódio como um pico principal com-preendendo a forma monomérica da imunoglobulina; as formas monoméricae agregada eluem como mistura no alargamento {"tailinçf') do pico principaljunto com a proteína A.

Figura 12 - Eluição com gradiente em três etapas de anticorpoanti-HER-2 a partir da resina de troca de cátion fraca CM-Sepharose comcloreto de sódio em tampão de citrato de sódio em pH 5,5; formas monomé-ricas e agregadas do anticorpo são separadas e eluem como um pico princi-pal compreendendo a forma monomérica da imunoglobulina em uma con-centração de cloreto de sódio de 80 mM e como um segundo pico compre-endendo formas monoméricas e agregadas da imunoglobulina bem comoproteína A em uma concentração de cloreto de sódio de 100 mM.

Figura 13 - Eluição com gradiente em etapa única de anticorpoanti-HER-2 a partir de resina de troca de cátion fraca CM-Sepharose com 80mM de cloreto de sódio em pH 5,5; a forma monomérica é eluída livre deformas agregadas; as formas agregadas eluem após uma segunda etapa decloreto de sódio para 120 mM como um segundo pico definido.

Figura 14 - Eluição com gradiente em etapa única de anticorpoanti-HER-2 a partir de resina de troca de cátion forte SP-Sepharose com 80mM de cloreto de sódio em pH 5,5; dois picos são obtidos: o pico 1 contémapenas Herceptina® monomérica, pico 2, que é eluído após uma segundaetapa de cloreto de sódio para 120 mM, contém uma quantidade grande deHerceptina® monomérica e agregados; o rendimento de Herceptina® nestaforma monomérica é menos do que 60%.

Parte Experimental

Material:

Um anticorpo anti IL-1R de imunoglobulina lgG4 (daqui em dian-te referido como imunoglobulina, WO 2005/023872) foi purificado em umaprimeira etapa com uma cromatografia por afinidade de proteína A. Eluição apartir da coluna da proteína A foi realizada sob condições ácidas (tampão decitrato de sódio a 10 mM, valor de pH de 3,0 ± 0,5). Antes da etapa de filtra-gem o valor do pH da fração contendo a imunoglobulina foi ajustado comuma solução tampão concentrada, por exemplo, 1M, de pH 9,0 (por exem-plo, tris-hidroximetil-amino metano (TRIS) ou tampão de fosfato) para pH5,0. O eluato da proteína A é uma solução com uma concentração de proteí-na entre 5 mg/ml e 15 mg/m e é tamponado com citrato de sódio. Este mate-rial é referido a seguir como eluato de proteína A condicionado, que é prepa-rado para carregamento em uma resina de troca catiônica.

Exemplo 1

Neste exemplo comparativo uma cromatografia de troca de íoncom uma resina de troca de cátion forte e uma eluição em etapa única é descrita.

Condições cromatoqráficas:

Resina: SP-Sepharose

Taxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,0

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Etapa de lavagem: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,0

Eluição: tampão de citrato de sódio a 25 mM com cloreto de sódio

a 100 mM, ajustado para pH 5,0

O eluato de proteína A condicionado foi aplicado a uma colunade cromatografia contendo uma resina de troca de cátion forte (SP-Sepharose). Após a etapa de carga em uma taxa de fluxo de 160 cm/h, acoluna foi lavada com tampão de equilíbrio (10 volumes de coluna). As imu-noglobulinas ligadas foram eluídas com um método de eluição em etapa úni-ca, com o queo valor do pH foi mantido constante e a condutividade foi vari-ada (aumentada) através da adição de cloreto de sódio.Na Figura 1 o cromatograma de eluição da cromatografia de tro-ca de cátion do anticorpo anti IL-1R na resina de troca de cátion forte SP-Sepharose é apresentado. A eluição é uma eluição de substituição de etapaúnica com cloreto de sódio sem alteração do valor do pH do sistema croma-tográfico. As moléculas de imunoglobulina monoméricas e agregadas nãosão separadas e então com este método nenhuma purificação através deredução do teor de agregado no eluato comparado com o material de cargapode ser obtida.

Exemplo 2

Neste exemplo uma cromatografia de troca de íon com uma re-sina de troca de cátion fraca e eluição em etapa única é descrita.

Para se obter uma separação de formas monoméricas e agre-gadas de uma imunoglobulina, uma resina de troca de cátion fraca foi em-pregada. Usando este tipo de resina um aumento da condutividade atravésde uma eluição em etapa é acompanhado por uma mudança de pH particu-lar na resina (mesmo quando o pH do tampão de eluição permanece cons-tante). Este efeito facilita a discriminação, por exemplo, entre imunoglobuli-nas monoméricas e formas agregadas. Ainda, outras impurezas, tal comotraços de proteínas de célula hospedeiro ou proteína A, podem eficientemen-te ser separadas da fração média monomerica, sem perda significante norendimento.

Condições cromatográficas:

Resina: CM-Toyopearl

Taxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,0

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Lavagem: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,0

Eluição: tampão de citrato de sódio a 25 mM com cloreto de sódio

a 100 mM, ajustado para pH 5,0

O eluato de proteína A condicionado foi aplicado à coluna decromatografia contendo uma resina de troca de cátion fraca (CM-Toyopearl).Após a etapa de carregamento em uma taxa de fluxo de 160 cm/h a colunafoi lavada com tampão de equilíbrio (10 volumes de coluna). As imunoglobu-linas ligadas foram eluídas com um método de eluição em etapa única, como queo valor do pH na fase móvel foi mantido constante e a condutividade foivariada através da adição de cloreto de sódio.

Na figura 2 o perfil de eluição com as mesmas condições croma-tográficas como no exemplo 1 mas desta vez com uma resina de troca decátion fraca, CM-Toyopearl, é apresentado. Aqui um segundo pico como umressalto do pico principal aparece. Este comportamento de separação é dife-rente daquele com resina de troca de cátion forte, tal como SP-Sepharose.

Uma análise de frações correspondendo ao pico principal e ao segundo picode ressalto mostrou uma quantidade significante de agregados estar presen-te na fração de pico de ressalto. Quaisquer agregados eram detectáveis nasfrações de pico principal (vide figuras 9a a c).Exemplo 3

Otimização do método cromatográfico - primeira etapa: gradientede concentração linear.

Para otimizar a cromatografia de troca de cátion em um materialde troca de cátion fraca um procedimento de otimização, que consiste emtrês etapas, foi posto em prática:

a primeira etapa é uma cromatografia usando um gradiente deconcentração linear do sal tampão, citrato de sódio. Melhor assim é possívelmanter a concentração do sal tampão constante e misturar uma concentra-ção linearmente crescente de um sal causando a eluição da imunoglobulina.

Em ambos casos a condutividade da solução aumentou sem uma alteraçãodo valor do pH da fase móvel. Sais adequados para eluição são, por exem-plo, cloreto de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio, cloreto de potássio,sulfato de potássio, fosfato de potássio, ácido cítrico e seus sais bem comomisturas desses componentes. As concentrações de a partir de 10 mM a500 mM, que são aplicadas, são ajustadas conseqüentemente para ajustar acondutividade na faixa de a partir de cerca de 1 mili S/cm a cerca de 50 miliS/cm.

Condições cromatográficas:Resina: CM-ToyopearlTaxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH5,0

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Lavagem: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH5,0

Eluição: gradiente linear; de a partir de tampão de citrato de sódioa 10 m, ajustado para pH 5,0, a tampão de citrato desódio a 100 mM, ajustado para pH 5,0O eluato de proteína A condicionado foi aplicado a uma colunade cromatografia contendo uma resina de troca de cátion fraca (CM-Toyopearl). Após uma etapa de carga em uma taxa de fluxo de 160 cm/h acoluna foi lavada com tampão de equilíbrio (10 volumes de coluna). As imu-noglobulinas ligadas foram eluídas com um método de eluição com gradien-te linear, com o queo valor de pH na fase móvel foi mantido constante. Aconcentração do sal tampão, citrato de sódio, foi aumentada linearmente de10 mM para 100 mM em 40 volumes de coluna. Após a concentração decitrato de sódio final ter sido atingida a eluição foi continuada por mais 40volumes de coluna.

Na figura 3 o cromatograma da eluição com gradiente linear doanticorpo anti IL-1R é apresentado. As formas monomérica e agregada daimunoglobulina eluem em um pico semi-separado em uma concentração decitrato de sódio a 15 mM e terminando em uma concentração de citrato desódio a 55 mM.

A recuperação da imunoglobulina ligada a partir da resina detroca de cátion é dependente da condutividade da solução aplicada. Destemodo os cátions do sal tampão presentes na solução de eluição durante aetapa de recuperação devem ser considerados como efetuando a eluição daimunoglobulina a partir da resina de troca de cátion. A condutividade bemcomo a resistência iônica da fase móvel são efetuadas pelo número total deíons na solução. Deste modo o número de cátions monovalentes diferentesde hidrogênio em uma fórmula molecular do sal tampão empregado e do saltampão empregado causando a eluição têm que ser considerado então.

Exemplo 4

Otimização do método cromatográfico - segunda etapa: eluiçãocom gradiente de concentração de três etapas.

A concentração, na qual a eluição da imunoglobulina a partir daresina de troca de íon começa, conforme determinado no exemplo 3, prove abase para a segunda etapa de otimização, um método de eluição de trêsetapas. As concentrações de tampão/sal aproximadas para a eluição emetapas são calculadas como segue:

- a concentração de sal da primeira etapa de eluição é igual à soma decomo primeira somatório o produto da concentração do sal, naqual a eluição a partir da coluna de troca de íon começa conforme determi-nado com o gradiente de sal em aumento linear, e o número total de cátionsmonovalentes diferentes de hidrogênio denotado na fórmula molecular do salque causa eluição

e

como segundo somatório o produto da concentração do sal tam-pão e o número total de cátions monovalentes diferentes de hidrogênio de-notado na fórmula molecular do sal tampão;

- a concentração de sal da segunda etapa de eluição é igual aoproduto da concentração de sal da primeira etapa de eluição e um fator entre 1,25 e 1,35;

- a concentração de sal da terceira etapa de eluição é igual aoproduto da concentração de sal da primeira etapa de eluição e um fator entre 1,50 e 1,70.

O fator incluído no cálculo das etapas de concentração é res-ponsável pelo intervalo entre os níveis de concentração e é ajustado depen-dendo da concentração de partida. Em concentrações de partida pequenas,isto é, entre 10 mM e 40 mM, os fatores são 1,35 e 1,70, respectivamente,em concentrações de partida média entre 40 mM e 70 mM os fatores são1,30 e 1,60, respectivamente, e em altas concentrações de partida de maisdo que 70 mM os fatores são 1,25 e 1,50 respectivamente.

Os fatores definem uma faixa que foi determinada experimen-talmente. Esses valores não são valores absolutos mas meramente um va-lor-alvo. Um desvio de 10% pode ser mantido.

O sal tampão tem que ser registrado no cálculo porque é possí-vel conforme mostrado no exemplo 3 que a eluição de uma proteína de umaresina de troca de íon pode ser efetuada por uma mudança na concentraçãode sal tampão durante a cromatografia. Se a concentração de sal tampão formantida constante durante a cromatografia ou for pequena comparada coma concentração de partida (< 15% da concentração de sal) ele pode ser ne-gligenciado durante o cálculo para reduzir a complexidade.

Com uma concentração de partida de 15 mM de citrato de sódio,conforme determinado no exemplo 3, consistindo em uma concentração detampão de 10 mM e uma contribuição de 5 mM a partir do gradiente linear,as três etapas podem calculadas como segue:

- a concentração-alvo para a etapa 1 é calculada ser 30 mM (5mM*2 + 10 mM*2) de citrato de sódio em detalhe: 5 mM (concentração departida) multiplicado por dois (ácido cítrico é um ácido trivalente, empregadocomo sal de dissódio; deste modo dois cátions monovalentes diferentes dehidrogênio estão presentes na fórmula molecular) mais 10 mM (concentra-ção do sal tampão) multiplicados por dois (ácido cítrico é um ácido trivalente,empregado como sal de dissódio; deste modo dois cátions monovalentesdiferentes de hidrogênio estão presentes na fórmula molecular)

- a concentração-alvo para a etapa 2 é calculada ser 40,5 mM(30 mM*1,35) de citrato de sódio em detalhe: 30 mM de citrato de sódio é aconcentração da etapa 1 multiplicada por 1,35 (a concentração de partida é 15 mM, portanto como fator 1,35 é selecionado)

- a concentração-alvo para a etapa 3 é calculada ser 51 mM (30mM * 1,70) de citrato de sódio em detalhe: 30 mM de citrato de sódio é aconcentração da etapa 1 multiplicados por 1,70 (a concentração de partida é 15 mM, portanto como fator 1,70 é selecionado)

Condições cromatográficas:

Resina: CM-Toyopearl

Taxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,0

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Lavagem: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,0

Eluição: etapa 1: tampão de citrato de sódio a 34 mM, ajustado para pH 5,0

etapa 2: tampão de citrato de sódio a 44 mM, ajustado para pH 5,0

etapa 3: tampão de citrato de sódio a 54 mM, ajustado para pH 5,0

O eluato de proteína A condicionado foi aplicado a uma colunade cromatografia contendo uma resina de troca de cátion fraca (CM-Toyopearl). Após a etapa de carga em uma taxa de fluxo de 150 cm/h a co-luna foi lavada com tampão de equilíbrio (10 volumes de coluna). As imuno-globulinas ligadas foram eluídas com um método de eluição com gradientede etapa única (= um método onde a concentração do sal de eluição é mu-dada em etapas a partir de um valor/nível de partida para um valor/nível fi-nal), com o que o valor do pH na fase móvel foi mantido constante. A con-centraçao do sal tampão, citrato de sódio, foi aumentada de 10 mM comocondição de partida para 34 mM na primeira etapa, para 44 mM na segundaetapa e para 54 mM na etapa final. Após cada aumento da concentração desal dez volumes de coluna do tampão de eluição foram passados pela colu-na antes da próxima etapa. Após uma concentração de citrato de sódio finalter sido atingida a eluição foi continuada por mais 10 volumes de coluna.

Na figura 4 o perfil de eluição da eluição com gradiente em trêsetapas de anticorpo anti IL-1R está presente. A imunoglobulina monoméricaelui na fração da primeira etapa e os agregados eluem na fração da segunda

etapa.

Exemplo 5

Otimização do método cromatográfico - terceira etapa: eluiçãode etapa única com cloreto de sódio.

A etapa final do procedimento de otimização é a adaptação a ummétodo de eluição de etapa única (= um método onde a concentração do salde eluição é mudada de uma vez a partir do valor de partida para um valorfinal). Para este propósito o pH da cromatografia é aumentado para 5,0 a5,5. Esta mudança de pH melhora a separação da proteína A, pelo fato deque a proteína A tem um ponto isoelétrico abaixo de 5,5. Adicionalmente osal de eluição é mudado de citrato de sódio, que é usado mais como um saltampão, para cloreto de sódio. Análises adicionais foram realizadas (DNA,proteína de célula hospedeiro, teor de proteína A e padrão de glicosilaçãocom LC-MS) com as frações após esta rodada cromatográfica.

Condições cromatográficas:

Resina: CM-Sepharose

Taxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,0

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Lavagem: citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,0

Eluição: citrato de sódio a 10 mM com cloreto de sódio a 150 mM,ajustado para pH 5,5

O eluato de proteína A condicionado foi aplicado a uma colunade cromatografia contendo uma resina de troca de cátion fraca (CM-Sepharose). Após a etapa de carga em uma taxa de fluxo de 160 cm/h acoluna foi lavada com tampão de equilíbrio (10 volumes de coluna). As imu-noglobulinas ligadas foram eluídas com um método de eluição com gradien-te de etapa única (= um método onde a concentração do sal de eluição émudada de uma vez partir de um valor de partida para um valor final), com oque o valor do pH na fase móvel foi mantido constante. A concentração dosal tampão, citrato de sódio, foi mantida constante e 150 mM de cloreto desódio foram misturados. Após o aumento da concentração de sal quinze vo-lumes de coluna todo tampão de eluição foram passados pela coluna paraeluir a imunoglobulina ligada.

O cromatograma de eluição da eluição de etapa única com clo-reto de sódio é apresentado na figura 5. A cromatografia de gradiente deetapa única efetua a separação da fração monomérica principal e da fraçãode agregado/proteína A. O rendimento da imunoglobulina monomérica émais de 80%. Rendimento de ainda mais de 95% é possível.

Exemplo 6

Comparação entre a separação com uma resina de troca de cá-tion forte (SP-Sepharose fast flow) e uma resina de troca de cátion fraca(CM-Sepharose fast flow).

Uma comparação entre o trocador SP-Sepharose ff forte e CM-Sepharose ff foi feita. Experimentos foram realizados de acordo com o e-xemplo 5 em duplicatas (apenas um de cada coluna é mostrada nas figuras6a e 6b) e análises adicionais foram realizadas (DNA, proteína de célulahospedeiro, teor de proteína A e padrão de glicosilação com LC-MS).

Métodos Analíticos:

Cromatografia de Exclusãode Tamanho: resina: TSK 3000 (Tosohaas)coluna: 300 x 7,8 mmtaxa de fluxo: 0,5 ml/mintampão: fosfato de potássio a 200 mM contendo clo-reto de potássio a 250 mM, ajustado para pH7,0

Sistema de limiar de DNA: vide, por exemplo, Merrick, H., e Hawlits-check, G., Biotech Fórum Europe 9 (1992)398-403

ELISA de DNA: As cavidades de uma placa de microtitulação são revestidascom uma proteína policlonal A-lgG derivada de galinha. Após ligação anti-corpo não-reagido é removido através de lavagem com tampão de amostra.Para ligação de proteína A um volume de amostra definido é adicionado àscavidades. A proteína A presente na amostra é ligada ao anticorpo de gali-nha e retida nas cavidades da placa. Após a incubação a solução de amos-tra é removida e as cavidades são lavadas. Para detecção são adicionadossubseqüentemente conjugado de anti-proteína A-lgG biotina policlonal deri-vado de galinha e um conjugado de peroxidase estreptavidina. Após umaetapa de lavagem adicional solução de substrato é adicionada resultando naformação de um produto de reação colorido. A intensidade da cor é propor-cional ao teor de proteína A da amostra. Após um tempo definido a reação éparada e a absorbância é medida.

ELISA de proteína de célula hospedeiro (HCP):

As paredes das cavidades de uma placa de microtitulação sãorevestidas com uma mistura de albumina de soro e estreptavidina. Um anti-corpo policlonal derivado de cabra contra HCP é ligado às paredes das cavi-dades da placa de microtitulação. Após uma etapa de lavagem cavidadesdiferentes da placa de microtitulação são incubadas com uma seqüência decalibragem HCP de concentrações diferentes e solução de amostra. Após aincubação material de amostra não-ligado é removido através de lavagemcom solução tampão. Para a detecção as cavidades são incubadas com umconjugado de anticorpo peroxidase para detectar proteína de célula hospe-deiro ligada. A atividade de peroxidase fixada é detectada através de incu-bação com ABTS e detecção a 405 nm.

Condições cromatográficas:

Resina: CM-Sepharose; SP-Sepharose

Taxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,5

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Lavagem: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,5

Eluição: tampão de citrato de sódio a 10 mM com cloreto de sódio

a 150 mM, ajustado para pH 5,5

Nas figuras 6a e 6b uma comparação entre o cromatograma deeluição de uma resina de troca de cátion fraca e uma forte está presente.Usando uma resina de troca de cátion fraca (figura 6a) uma separação doanticorpo anti IL-1R monomerico de outras impurezas é obtida. Com a resinade troca de cátion forte (figura 6) nenhuma separação é possível sob asmesmas condições. As frações correspondendo aos picos foram coletadas eanalisadas. Os resultados de análise, que são listados na tabela 1, mostramque com resinas de troca de cátion fraca agregados e outras impurezas po-dem ser eficazmente depletados da preparação de imunoglobulina.

Os dados apresentados na tabela 1 mostram que é possível se-parar com uma resina de troca de cátion fraca anticorpo anti IL-1R monome-rico de formas agregadas do anticorpo. Ainda impurezas de DNA e proteínaA podem ser depletadas.Tabela 1: Análise dos eluatos: comparação entre SP-Sepharose e CM-Sepharose, resultados de duas separações diferentessão apresentados

<table>table see original document page 32</column></row><table>Exemplo 7

Exemplo comparativo - eluição em condutividades diferentes

Condições de cromatografia:

Resina: CM-Sepharose

Taxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,5

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Lavagem: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,5

Eluição: tampão de citrato de sódio a 10 mM com cloreto de sódio

a 100 mM, 150 mM ou 200 mM, ajustado para pH 5,5

O eluato de proteína A condicionado foi aplicado a uma colunade cromatografia contendo uma resina de troca de cátion fraca (CM-Sepharose). Após a etapa de carga em uma taxa de fluxo de 160 cm/h, acoluna foi lavada com tampão de equilíbrio (10 volumes de coluna). As imu-noglobulinas ligadas foram eluídas com um método de eluição com gradien-te em etapa única, com o queo valor do pH na fase móvel foi mantido cons-tante. A concentração do sal tampão, citrato de sódio, foi mantida constantee em três rodadas diferentes cloreto de sódio a 100 mM, 150 mM e 200 mMrespectivamente foi misturado. Após o aumento da concentração de salquinze volumes de coluna do tampão de eluição foram passados através dacoluna para eluir a imunoglobulina ligada. Os cromatogramas de eluição sãomostrados nas figuras 7a a c.

Boas separações foram obtidas usando cloreto de sódio a 150mM e cloreto de sódio a 200 mM como concentração de sal de eluição.

Exemplo 8

Exemplo comparativo - eluição em valores de pH diferentes.

Condições cromatográficas:

Resina: CM-Sepharose

Taxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH5,5

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz emgelLavagem: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH5,5

Eluição: tampão de citrato de sódio a 10 mM com cloreto de sódioa 150 mM, ajustado para pH 4,0 ou 6,0

O eluato de proteína A condicionado foi aplicado a uma colunade cromatografia contendo uma resina de troca de cátion fraca (CM-Sepharose). Após a etapa de carga em uma taxa de fluxo de 160 cm/h, acoluna foi lavada com tampão de equilíbrio (10 volumes de coluna). As imu-noglobulinas ligadas foram eluídas com um método de eluição com gradien-te em etapa única, com o queo valor do pH na fase móvel foi mantido cons-tante em um pH 4,0 ou 6,0, respectivamente. A concentração do sal tampão,citrato de sódio, foi mantida constante e cloreto de sódio a 150 mM foi mistu-rado. Após o aumento da concentração de sal quinze volumes de coluna dotampão de eluição foram passados através da coluna para eluir a imunoglo-bulina ligada. Os cromatogramas de eluição são mostrados nas figuras 8a eb.

Em pH 4,0 é a tendência em formar agregados desta imunoglo-bulina aumentada. Mas a CM-Sepharose é capaz de separar esta quantida-de mais alta de agregados em dois picos.

Exemplo 9

Separação cromatografica de um anticorpo anti-HER2 monoclonal (WO99/57134) com uma resina de troca de cátion forte (SP-Sepharose)

A presente invenção é exemplificada mais a seguir com Hercep-tin®, um anticorpo anti-HER-2 monoclonal.

A purificação de Herceptin® com uma cromatografia de troca decátion em SP-Sepharose, uma resina de troca de cátion forte, foi realizada.Sob condições padrão da presente invenção, isto é, eluição em etapa com,por exemplo, cloreto de sódio, uma separação de formas monomericas eagregadas do anticorpo não é efetuada (figura 10).

Condições cromatográficas:Resina: SP-SepharoseTaxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: cido 2-morfolinoeanossulfônio a 25 mM, cloreto de sódioa 50 mM, ajustado para pH 5,6

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Lavagem: ácido 2-morfolinoeanossulfônio a 25 mM, cloreto de só-dio a 50 mM, ajustado para pH 5,6

Eluição: ácido 2-morfolinoeanossulfônio a 25 mM, cloreto de só-dio a 95 mM, ajustado para pH 5,6

O anticorpo monoclonal anti-HER-2 (daqui em diante referidocomo Herceptin®) foi purificado em uma primeira etapa com uma cromato-grafia de afinidade de proteína A. Eluição da coluna de proteína A é realiza-da sob condições ácidas (tampão de citrato de sódio a 10 mM, valor de pH3,0±0,5). Antes da etapa de filtragem o valor do pH da fração contendo oanticorpo é ajustado com um tampão de tris-hidroximetil-aminometano(TRIS) concentrado para pH 5,6. O eluato de proteína A é uma solução comuma concentração de proteína entre 5 mg/ml e 15 mg/ml e é tamponadocom citrato de sódio.

O eluato de proteína A condicionado foi aplicado a uma colunade cromatografia contendo uma resina de troca de cátion forte (SP-Sepharose). Após a etapa de carga em uma taxa de fluxo de 160 cm/h acoluna foi lavada com tampão de equilíbrio (10 volumes de coluna). As imu-noglobulinas ligadas foram eluídas com um método de eluição em etapa úni-ca, com o que o valor do pH foi mantido constante e a condutividade foi vari-ada pelo aumento (em etapas) da concentração de cloreto de sódio. O cro-matograma de eluição é mostrado na figura 10.

Nenhuma separação de formas monomérica e agregada do anti-corpo foi conseguida.

Exemplo 10

Otimização do método cromatográfico - primeira etapa: gradien-te de concentração linear.

Para melhorar a separação das duas frações as condições deseparação foram otimizadas de acordo com o procedimento conforme mos-trado com o anticorpo anti IL-1R.

Em contraste com o processo de otimização de anticorpo anti IL-1R um gradiente linear de um sal (eluição), isto é, de cloreto de sódio, foiusado ao invés de um gradiente da substância tampão. O cromatograma deeluição com gradiente de cloreto de sódio linear, que corresponde à primeiraetapa do procedimento de otimização, é apresentado na figura 11. Análiseconfirmou que o alargamento do pico principal é enriquecido com formasagregadas do anticorpo.

Condições cromatográficas:

Resina: CM-Sepharose

Taxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,5

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Lavagem: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,5

Eluição: gradiente linear; de tampão de citrato de sódio a 10 mM,ajustado para pH 5,5, a tampão de citrato de sódio a 10mM contendo cloreto de sódio a 400 mM, ajustado para pH5,5

O eluato de proteína A condicionado conforme descrito no e-xemplo 9 foi aplicado a uma coluna de cromatografia contendo uma resinade troca de cátion (CM-Sepharose). Após a etapa de carga em uma taxa defluxo de 160 cm/h a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio (10 volumesde coluna). As imunoglobulinas ligadas foram eluídas com um método deeluição com gradiente linear, com o que o valor do pH na fase móvel e aconcentração do sal tampão foram mantidos constantes. A concentração dosal de eluição, cloreto de sódio, foi aumentada linearmente de a partir de 0mM a 400 mM em 40 volumes de coluna. O cromatograma de eluição émostrado na figura 11.

A substituição da resina de troca de cátion forte por uma resinade troca de cátion fraca causou a separação de um segundo pico como umressalto do primeiro pico principal. Esta observação é similar à observaçãono caso de anticorpo IL-1R.

A imunoglobulina começa a eluir a partir da coluna em uma con-centração de cloreto de sódio de 80 mM.

Exemplo 11

Otimização do método cromatográfico - uma segunda etapa:eluição com gradiente de concentração de três etapas.

A concentração de partida, na qual a imunoglobulina começa aeluir, conforme determinado no exemplo 10 e conforme derivado do croma-tograma apresentado na figura 11, é cloreto de sódio a 80 mM. Para o cálcu-lo das três etapas de concentração para a segunda etapa de otimização aconcentração de tampão pode ser negligenciada uma vez que ela é baixa emantida constante durante a cromatografia.

A concentração de partida do cloreto de sódio é 80 mM e cloretode sódio tem um cátion diferente de hidrogênio em sua fórmula molecular.Deste modo as concentrações para a eluição de três etapas são calculadasser 80 mM, 100 mM (= 80 mM multiplicados com 1,25) e 120 mM (=80 mMmultiplicados por 1,50) de cloreto de sódio respectivamente.

Condições cromatográficas:

Resina: CM-SepharoseTaxa de fluxo: 60 cm/h

Equilíbrio: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Lavagem: tampão de citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH

Eluição: etapa 1: tampão de citrato de sódio a 10 mM com cloretode sódio a 80 mM, ajustado para pH 5,5

etapa 2: tampão de citrato de sódio a 10 mM com cloretode sódio a 100 mM, ajustado para pH 5,5etapa 3: tampão de citrato de sódio a 10 mM com cloretode sódio a 120 mM, ajustado para pH 5,5O eluato da proteína A condicionado conforme descrito no e-xemplo 9 foi aplicado a uma coluna de cromatografia contendo uma resinade troca de cátion fraca (CM-Sepharose). Após a etapa de carga em umataxa de fluxo de 160 cm/h a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio (10volumes de coluna). As imunoglobulinas ligadas foram eluídas com um mé-todo de eluição de gradiente, com o que o valor do pH na fase móvel e aconcentração do sal tampão, citrato de sódio, foram mantidos constantes. Aconcentração do sal de eluição, cloreto de sódio, foi aumentada de 0 mMcomo condição de partida para 80 mM na primeira etapa, para 100 mM nasegunda etapa e para 120 mM na etapa final. Após cada aumento da con-centração de sal dez volumes de coluna do tampão de eluição com as con-centrações de cloreto de sódio especificadas foram passados pela colunaantes da próxima etapa de concentração. Após a concentração de citrato desódio final ter sido atingida a eluição foi continuada por mais 10 volumes decoluna. O cromatograma de eluição é mostrado na figura 12.

No método de eluição de três etapas o anticorpo monomerico éeluído na etapa com uma concentração de cloreto de sódio de 80 mM. Aná-lise de exclusão de tamanho confirmou que apenas anticorpo monomerico éeluído. Após a concentração de cloreto de sódio ter sido aumentada para100 mM na segunda etapa, as formas agregadas eluíram (figura 12).

Exemplo 12

Otimização do método cromatográfico - terceira etapa: eluiçãode etapa única com cloreto de sódio.

Condições cromatográficas:

Resina: CM-Sepharose; SP-Sepharose

Taxa de fluxo: 160 cm/h

Equilíbrio: citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,5

Carga: máx. 20 g de proteína/L de matriz em gel

Lavagem: citrato de sódio a 10 mM, ajustado para pH 5,5

Eluição: citrato de sódio a 10 mM com cloreto de sódio a 80 mM,ajustado para pH 5,5O eluato de proteína A condicionado conforme descrito no e-xemplo 9 foi aplicado a uma coluna de cromatografia contendo uma resinade troca de cátion fraca (CM-Sepharose). Após a etapa de carga em umataxa de fluxo de 160 cm/h, a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio (10volumes de coluna). As imunoglobulinas ligadas foram eluídas com um mé-todo de eluição com gradiente de etapa única, com o que o valor do pH nafase móvel e a concentração de sal tampão foram mantidos constantes. Aconcentração do sal tampão, citrato de sódio, foi mantida constante e cloretode sódio a 80 mM foi misturado. Após o aumento da concentração de salquinze volumes de coluna do tampão de eluição com cloreto de sódio forampassados pela coluna para eluir o anticorpo anti-HER-2 ligado em forma mo-nomérica. Para afirmar a separação de formas monoméricas e agregadas doanticorpo uma segunda etapa, que não é necessária para a preparação deanticorpos monoméricos, para uma concentração de cloreto de sódio de 120mM foi realizada. Após este segundo aumento as formas agregadas do anti-corpo eluíram da coluna. O cromatograma de eluição é mostrado na figura13.

Se o mesmo método for realizado com uma resina de troca decátion forte, uma perda significante de anticorpo monomerico é observada(rendimento de aproximadamente 60% apenas comparado com 95% e maisem uma coluna de troca de cátion fraca), embora a separação de forma mo-nomérica e agregada do anticorpo possa ser vista (figura 14).

Aplicação das condições adequadas para a separação em ummaterial de troca de cátion fraca para uma resina de troca de cátion forte,SP-Sepharose, não é benéfica. Embora as duas frações possam ser sepa-radas o rendimento do anticorpo monomerico é reduzido para 60% ou atémenos.Tabela 2: Análise dos eluatos: comparação entre SP-Sepharose e CM-Sepharose, resultados de duas separações diferentessão apresentados

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Claims (10)

1. Método para purificação de uma imunoglobulina, onde o mé-todo compreende:a) provisão de uma solução compreendendo uma imunoglobuli-na, uma substância tampão e opcionalmente um sal;b) trazer a solução e um material de troca de íon fraca em conta-to sob condições com o que a imunoglobulina se liga a um material de trocade íon fraca;c) recuperação da imunoglobulina a partir do material de trocade íon fraca em uma etapa única usando uma solução compreendendo umasubstância tampão e um sal.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o material de troca de íon fraca é um material de troca de cátionfraca.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e-2, caracterizado pelo fato de que a substância tampão é ácido cítrico ou umseu sal ou ácido fosforico ou um sal do mesmo.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo fato de que o método é um método cromatográfico ouem batelada.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que o sal na etapa c) é selecionado do grupoconsistindo em cloreto de sódio, sulfato de sódio, cloreto de potássio, sulfatode potássio, sais de ácido cítrico, sais de ácido fosforico e misturas dessescomponentes.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que a imunoglobulina é um membro da classe deimunoglobulina G ou E.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6, caracterizado pelo fato de que a solução na etapa de recuperação c) temum valor de pH de a partir de pH 3,0 a pH 7,0.

8. Método para determinação da concentração de um sal paraeluição de um polipeptídeo a partir de um material de cromatografia de trocade íon em um processo de purificação de etapa única compreendendo asduas etapas que seguem:a) etapa um compreendendo as subetapas que seguem:a1) provisão de uma solução compreendendo um polipeptídeo,uma substância tampão e opcionalmente um sal;a2) trazer uma primeira alíquota da solução contendo o polipep-tídeo e um material de troca de íon em contato sob condições com o queopolipeptídeo se liga ao material de troca de íon;a3) recuperação do polipeptídeo a partir do material de troca deíon através do uso de uma solução compreendendo uma substância tampãoe um sal, com o que a concentração do sal é aumentada linearmente;a4) determinação da concentração de partida do sal onde a pri-meira fração do polipeptídeo começa a eluir a partir da coluna de troca deíon;b) etapa dois compreendendo as subetapas que seguemb1) trazer uma segunda alíquota da solução contendo o polipep-tídeo e um material de troca de íon em contato sob condições com o que opolipeptídeo se liga ao material de troca de íon;b2) recuperação do polipeptídeo a partir do material de troca deíon através do uso de um método de eluição de três etapas, com o quei) a concentração de sal da primeira etapa de eluição é calculadacomo a soma deo produto da concentração de partida do sal conforme determi-nado na etapa a4) e o número total de cátions monovalentes diferentes dehidrogênio denotado na fórmula molecular do saleo produto da concentração do sal tampão e o número total decátions monovalentes diferentes de hidrogênio denotado na fórmula molecu-lar do sal tampão;ii) a concentração de sal da segunda etapa de eluição é o produ-to da concentração de sal da primeira etapa de eluição e um fator entre 1,25e 1,35;iii) a concentração de sal da terceira etapa de eluição é o produ-to da concentração de sal da primeira etapa de eluição e um fator entre 1,50 e 1,70;com o que os fatores das etapas ii) e iii) são determinados comosegue: em uma concentração de partida entre 10 mM e 40 mM os fatoressão 1,35 e 1,70, respectivamente, em uma concentração de partida entre 40mM e 70 mM os fatores são 1,30 e 1,60 respectivamente, e em uma concen-tração de partida de mais de 70 mM os fatores são 1,25 e 1,50 respectivamente;b3) determinação em qual subetapa do método de eluição detrês etapas da etapa b2) o polipeptídeo é eluído da coluna de troca de íondeste modo determinando a concentração de um sal para eluição de um po-lipeptídeo a partir de um material de cromatografia de troca de íon em umprocesso de purificação de etapa única.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o material de cromatografia de troca de íon é um material decromatografia de troca de íon fraca.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma imunoglobulina.