TWI316943B - Method for producing collagen from mammalian animal skin - Google Patents

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1316943 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 ’特別是 本發明係關於一種從動物皮膚製備膠原蛋白的方 關於一種將有機酸缓衝溶液施加在動物皮膚上的方法。 【先前技術】 膠原蛋白是一種在哺乳類體内佔總蛋白質3〇%的物 严.C. Junqueira and j· Carneir〇，基礎組織學，^ > Lange Medical Publications, Los Altos, Calif. [i9831 **n 8主結雜蘭如4膚、峨軟骨及硬骨的 主要、，Ό構蛋白’其具有獨特之氨基酸組成和結構。重要的是，膠 原蛋白螺旋。卩位的主要結構在哺乳類動物種類之間變化極少。 來自哺乳類的膠原蛋白實際上是一個由數種細胞類型 ^蛋白質家族。在此蛋白質家族巾，縣蛋白之_可藉由^化 不同之型態與病理特徵、組織内的分佈以及其功能^加 Μ區分。 至少存在有十二種不同遺傳物質類型之膠原蛋白。其中最常 3類型，1類，*三股胜月太鏈所組成。其中兩股是相同的， α1，第三股則稱做α2。第I類膠原蛋白形成軟的（皮膚、肌 和，的（硬骨、象牙質）結缔組織的主要部位。第I!類膠原 則疋軟骨組織的主要膠原蛋白，其由三股α 1鏈所組成。第in 類膠原蛋白則由三股α丨鏈所組成，分佈於血管、傷σ及某些腫瘤。 2原蛋白的許多特性使其成為一種適合不同醫療用途、吸引 質，例如：植入、移植、器官替代物、組織等當物、玻璃 代物(Vitreous replacements)、整形美容外科、外科手術縫 :、手術傷口、燙傷敷料等等（請參見美國專利Nos. 5,106, 949, ^104,660, 5,081,106, 5,383,930, 4,485,095, 4,485,097, ^39,716, 4,546,500, 4,409,332, 4,604,346, 4,835,102, ’837,幻9, 3’800, 792, 3, 491，760, 3,113, 568, 3,471,598， 1316943 】，202, 566,及3,157, 524,所有皆以參考文獻方式併入本文；j. F Prudden, Arch. Surg., 89: 1046-1059 [1964]； E. E. Peacock = al. Anji. Surg·: 161: 238-247 [1965])。舉例而言：膠原 蛋白本身是一種相當弱的免疫原（immun〇gen)，至少有部分歸因於 ，障膠原蛋白結構中極具潛力的抗原決定物。其螺旋狀結構使其 能抵抗蛋自質分解(_：eQlysis)側。此外，它是—伽胞附著 的天然物質，並且是肌肉骨骼系統(muscul〇skeletal system)中 主要忍文張力負荷的成份。因此，廣泛的努力投入製造適合醫療 用途的膠原蛋白以及獸醫方面的應用。 μ 膠原蛋白可以許多形式製備，藉由各種不同的方法由各種不 同的組織獲得。其中最想要的一種是「天然的」（native)膠原蛋 白，其具有許多獨特的性質，包含：低抗原性及抗酵素分解性。 分離良好的分散天然膠原蛋白（diSpersed native c〇uagen)在 化妝品、食品及製藥工業實際與極具潛力的應用上具有一個廣泛 的運用範圍。 八 然而，儘管具有許多重要的優點，商業上成功的膠原蛋白為 主的物質被侷限於少數利用膠原蛋白獨特性質的特殊產物。缺乏 商業上可獲得的膠原蛋白為主的物質與生物科技產品之主要原因 包含.製備純膠原蛋白的高昂成本、分離之膠原蛋白的變異性以 及處理、儲存膠原蛋白的種種困難。 、 申請人驚訝地發現了一種極為簡單、可應用在動物皮膚上的 技術；其能夠便宜地製造高產量之天然可溶性膠原蛋白（native soluble collagen)與分散之不可溶膠原蛋白（dispersed insoluble collagen)，同時克服或至少避免之前所遭遇之問題。 特別是，申請人已經發現藉由適合的有機酸緩衝溶液處理動物皮 膚，可增加酵素作用下可溶性天然膠原蛋白（enzymaticauy solubilised native collagen)的產量。 【發明内容】 6 1316943 峨/S疋/角度而S，本發明在於提供一個從動物皮膚製備 膠原A白的方法，其包括將—種有賊麟溶液施加在該皮 一段充足的時間以抽取膠原蛋白之步驟。 ’本發明之另""目的在於提供作為醫療用途以 及適用於-般外科、皮膚科、口腔醫學、整職建外科、神經外 mi:眼科、泌尿科、血管外科、獸醫醫學及其他相關領域 生物科技產品之磬原蛋白。 較佳的縣蛋自是天財溶性膠原蛋自及分散良好之天 原蛋白。 熟知韻技藝人士將瞭解本文所揭露之方法將適用於從任 動物皮膚上抽取獅蛋白。然而，本剌__於自哺乳動物 綱偶蹄目（Artiodactyla)、兔形目（L聊卿⑻、誓齒目 (Rodentia)、奇蹄目（Periss〇dactyla)、食肉目（Carniv⑽)及有 袋目（Marsupialia)之動物皮膚抽取膠原蛋白。更好的動物皮 取自-群選自包含羊(Gvine)、牛(bGvine)、山羊(caprine)、馬 (equine)、豬(porcine)與有袋類(marsupia〇動物身上。最好是 綿羊(sheep)的皮膚。 有機酸緩衝錄可包含任何§知合剌有鑛。較佳的有機 酸緩衝溶液包括一種水溶液或懸浮液，其含有一種或多種酸，係 選自由醋酸、檸檬酸、丙酮酸、乳酸或甲酸所組成之族群。更好 的有機酸緩衝溶液由溶於水的冰醋酸所組成，其邱值在3 間。甚至更好的有機酸緩衝溶液其pH值在3· 2到4 5之間。最好的 有機酸緩衝溶液pH值則在4. 0到4. 2之間。 一旦有機酸緩衝溶液被運用在動物皮膚上，它可以被允許培 養-段充分的時間使羊毛或毛髮能夠鬆散或被去除。較佳的培養 在溫度20到40°C之間進行8到27小時。然後將動物皮膚切碎 (chopped)或剁碎(minced)成小碎片。 較佳的處理是，將辦翻碎的皮膚和械酸_溶液在未 解離狀·4下混合成懸浮液’並且置於温刻到赃之峨拌培養。 1316943 較佳的處理是將皮膚在具有—種❹種蛋白分解酵素存在下培 養。更好的是，蛋自分解酵素是選自—由ESPERASE@ (N_zymes、 Bagsvaerd、丹麥）、ALCALASP(Nov〇zymes、Bagsvaerd、丹麥）、 DURAZYM® (Novozymes、Bagsvaerd、丹麥）與SAVINASE® (Novo^m+es、Bagsvaerd、丹麥）、MAXATASE® (Gist-Brocades、 Delft、荷蘭）、MAXACAL®(Gist-Brocades、DelfW^®)、PR〇PERASF® (Gist-Brocades^ Delft ) .MAXAPEM^ (Gist-Brocadfs

Delft、荷蘭）以及胃蛋白分解酵素(pepsin)組成之族群。最好 胃蛋白分解酵素。 /將皮膚碎片置於有機酸緩衝溶液及蛋白分解酵素懸浮液培養 之後，離心並且/或者過濾此懸浮液並將可溶性(s〇luble)膠原蛋 白及/或分散(dispersed)之膠原蛋白移除。 將膠原蛋自麟麟碎絲末狀。替代観及獅的方法是 將膠原蛋白再次散佈在有機酸中，藉由Silyer et al•於美國專 利No、4, 703,108所揭露的冷凍乾燥方法將此分散物⑻邠奶㈣ 用來形成膠原蛋白基質（c〇llagenmatrix)或海綿狀載體 (sponge) ° 基於更進一步的考量，純化的膠原蛋白可以包括附加的化合 物，包含但不限疋於抗微生物劑(antimicr〇biais)、抗病毒劑 (antwirals)、生長因子（growth fact〇rs)、抗脫水化合物

Canti-dehydration compounds)、消毒劑(antis印tics)或其他適 合生化及/或獸醫用途的化合物。 【實施方式】 在救述本方法之前，必須瞭解的是本發明並不限定於所描述 之特定材料與方法，正如其可能有所改變。同時必須瞭解的是本 文中所使用的專有名詞目的只是為了描述特定之實施方式，而不 是用來限定本發明之實施範圍’實施範圍只由附加之申請專利範 圍所限制。必須注意的是在本文及附加之申請專利範圍中所使用 1316943

^有，文提狀躲刊㈣證目的在於贿及歡在該韻 ^單，形字彙a，an與如均内含複數形意義， 出。因ith，奧>&，丨Α.丨《 —

^報告可能與本發明相關之方法 並非先前發明所揭露者之授權。 本發明係關於從動物皮膚製備膠原蛋白的方法。特別是， 發明，供了製備適合生化、獸t及其他顧之膠縣自的方法。 、「動物」這個名詞在本文中代表任何可藉由本發明所揭露之方 法抽取膠原蛋白的祕。舉躺言：動物可能選自哺乳綱偶蹄目、 兔形目、齧齒目、奇蹄目、食肉目及有袋目之動物。 偶蹄目（Artiodactyls)包含將近150種現存種類，分佈於九 科.豬（豬科Suidae)、西貔(peccaries)(湍豬科Tayassuidae)、 河馬（河馬科Hipopotamidae)、駱駝(駱駝科Camelidae)、·鼷鹿 (chevrotains)(鼷鹿科Tragulidae)、長頸鹿與歐卡皮鹿(0kapi) (長頸鹿科Giraffidae)、鹿(鹿科Cervidae)、叉角羚(prongh〇rn) (叉角羚科Antilocapridae)以及牛(cattle)、綿羊(sheep)、山羊 (goat)、玲羊(antelope)(牛科Bovidae)。其中許多動物，例如： 山羊、綿羊、牛與豬具有非常相似的生物特性並且共有高度的基 因同源性(genomic homology)。更重要的是，眾所皆知某些動物 例如：山羊、綿羊、馬和驢子可以混種繁殖（interbreed)。 奇蹄目（Perissodactyla)是「奇趾」或「奇蹄」哺乳類動物， 包含犀牛(rhinos)、貘(tapirs)和馬。兔形目（Lag〇m〇n)ha)包含 家兔(rabbit)、野兔(hare)及其他齧齒類(r〇dent);而有袋目包 含大袋鼠(kangaroos)與小袋鼠(wallabies)。齧齒目（Rodentia) 1316943 包含大鼠(rat)、小鼠(mice)。 上遂所有動物族群成員的皮膚都由 成。表皮由數層所組成，代表發育的連續階段真 疋可消耗的外層，具有觸覺、保護及死 下層持續取代。當_老化及成孰，雜f續剝落並由 含㈣縣«蛋自 皮膚之保顧，時也是指？、蹄、毛髮及角H其不4成 而f皮位在表皮下方’是―層厚厚的結締組織，且有連社之肌 ίί=Γί佈。「結締组織由大量的膠原蛋白所2: 胁蛋白」絲麵纖維蛋白之細胞外家 Γ i；y of flbrous L 蛋白胜月太鍵「a鍵」彼此互相交織 1成此螺旋狀分子。這個名詞同時含有不同類型的谬原蛋白之 思’然較佳的類型為糾類和第ΙΠ膠原蛋白。「天然膠原蛋白」 jat 1 ve col lagen)則表示膠原蛋白之三股螺旋部位依然保持完 整。 如上所述，膠原蛋白螺旋部位的主要結構在各種哺乳類動物 之間變化極少。事實上，許多類型的膠原蛋白具有高度核酸及 氨基酸序觸源性。舉例來說：比較人類(humans)、馬(_脱) 與鼠(murines)之膠原蛋白aipha i第η類核酸序列同源性至少 有88% ;人類和馬核酸序列同源性有93%，而老鼠(_纪)和馬 ，具^89%的序列同源性。人類和老鼠的核酸序列同源性為88 % (請參見：NCBI accession numbers U62528(Equine)， NM03315G(Human)， NMG31163(mouse) http://www.ncbi.nlni.nih.gov)。其他類型的膠原蛋白則具有相 似程度的氨基酸同源性。舉例來說：豬(p〇r c i ne)的膠原蛋白a丨pha 1第1類和羊(ovine)的膠原蛋白alpha I第I類具有90%的核酸 序列同源性（請參見：NCBI accession numbers AF29287 (Ovine), AF201723 (Porcine) http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。 1316943 從上述許多動物共有的血統和生物性來看，相似的型態亦即 皮膚構造、許多種類例如：牛、羊、鼠和豬的膠原蛋白氨基酸與 核酸序列的高度同源性，熟知該項技藝人士將瞭解本文所揭露 之方法將適用於所有動物。 一旦動物被選用來抽取膠原蛋白，其皮膚將被移除。任何習 知用來移除動物皮膚的方法皆可使用。此外，該皮膚可以取自任 何年齡的動物身上；然而，較佳的實施方式是採用小於14週的羔 羊。 ”、 移除之皮膚可以立即使用在本發明所揭露的方法中，或者存 放士低於2(TC，較佳的是4°C到2(TC之間。然而，必須瞭解的是在 本乾圍之外的溫度下延長儲存，對於所抽取之膠原蛋白的質和量 可能會有不好的影響。 ' 、在較佳的實施方式中，一種或多種以有機酸為基質的緩衝溶 液被施加在新鮮（fresh)動物皮膚之肌肉面（flesh side)。本文中 所使用之「新鮮」（fresh)代表的意義是：動物皮膚自移除後不超 過一天使用，較好是不超過12個小時使用，甚至更好是在移除 λ!、β寺内使用。 # ^佳的有機酸緩衝溶液是乳酸緩衝溶液、醋酸緩衝溶液、檸 檬，緩衝溶液、丙_嫌娜液、帽_毅或是其混合者。丁 但是，其他習知的有機酸緩衝溶液也可使用。 、較佳的有機酸緩衝溶液之pH值調整到PH 3-5之間，甚至最好 =醋酸納、擰檬酸鈉、丙酮酸納、氫氧化納、碳酸氫鈉和碳酸鈉、 鉀鹽及其相似物調整在3· 2到4. 6之間。 •V縣ΐ一特別優先考慮的實施方式中，緩衝溶液係由一種水溶液 二予液所組成’其含有一或多種醋酸、乳酸或曱酸與鹼金屬（包 ’呂）或鹼金屬鹽混合而成。礦物質與有機酸之混合物也可以使 枯-Ϊ好的緩衝溶液是由4〇%(W/w)溶於水之冰醋酸所組成，其PH 糟添加約20%無水醋酸鈉或所需要的氫氧化鈉調整至較佳的 1316943 pH值pH (4. 0-4. 2)。 施加有機酸缓衝溶液可以利用任何習知的方法。舉例來說： 有機酸缓衝溶液可以藉由喷霧、塗、沾濕或其他相似方法施加在 皮膚上。較好的方法是以每張皮膚50-100毫升左右的比例塗上有 機酸緩衝溶液。假如有機酸緩衝溶液是用作沾濕液(dip)或皮膚是 被浸泡（immersed)在有機酸緩衝溶液中，則可將有機酸緩衝溶液 以水稀釋十倍。 施加之後，動物皮膚可以在溫度2〇到4(TC之間培養8到27小 時。同時培養時的相對濕度較好是充分足夠，以使動物皮膚不至 於枯乾。舉例而言：應該使用相對濕度大於6〇%，較佳的是 80%，甚至更好是大於90%。 、 基於不希望被牽扯到任何特殊理論或假設，申請人相信在抽 取這個階段使用有機酸緩衝溶液不僅可以鬆開羊毛和毛髮，還能 實質分解(substantial digestion)存在皮膚中之葡萄糖胺聚糖 (gljc〇samin〇glyCans，GAGs)。移除GAGs造成膠原蛋白結構開啟， 接著有助於存在後續階段膠原蛋白的酵素溶解(enzymic solubilisation)。 (0040)當提及移除gag時，在本文中所使用之「實質的」 (^stantial)和「實質地」（substantially)表示相對於動物皮 =巧存在GAG的量。在初步培養_結束時，在有機酸緩衝溶 液存在下較好是高湖％ ’甚至更好是高麵％ 於90%以騎;tGAG分解。 〇培養ΐ，羊毛或毛髮以機械或手工方式移除以製造一個去除 右’此後稱之為「毛皮」(Pelt)。假如此羊毛或毛髮具 有I濟仏值，可將之乾燥並打包；或者只是丟棄。 然後將毛^機械或手工枝切下（f leshed)。贿毛皮含有 平毛，將被移除並丟棄。然後將毛皮切碎(ch_ed)或 ^ ^小碎片。任何能夠將毛皮打碎之裝置皆可以使 用匕括·工業用碎肉機、研磨機或食物處理機。 12 1316943 接著將毛皮碎片加到非解離性溶液(n〇n_denaturing solution)中以製成一懸浮液(SUSpensi〇n)。非解離性溶液包含一 有機，緩衝溶液，懸浮液放置在非解離性狀態下培養。本文中所 用之非解離性狀,％」（non-denaturing conditions)代表膠原蛋 白之二股螺旋結構被保存下來。因此，在一較佳之實施方式中， 所使用之有機酸緩衝溶液較好是在溫度25〇c以下pH 2左右。 分在一較佳實施方式中’有機酸緩衝溶液包含醋酸、乳酸、甲 酸，其混合。有機酸緩衝溶液之濃度可介於〇. 〇以到〇. 5M之間，較 好是在0· 1M到〇· 05M之間。較好的酸是濃度介於〇.謂和〇. 0现之醋 酸，。 毛皮碎片和非解離性溶液的比例分別可以在1〇 :丨到丨咖：i 之間^一旦製成懸浮液’較好是緩慢攪拌。攪拌程度依懸浮液中 毛皮碎片大小而定；然而，較佳的攪拌是足以輕輕地移動毛皮碎 片。同時懸浮液較好放在〇到3(Tc之間培養至少一個小時。在一較 佳實施方式中，培養可允許長達7天；然而，培養時間長短將由pH 值、溫度與毛皮類型來決定。 ^在一特別優先考慮的實施方式中，蛋白分解酵素被添加到懸 浮液中。可購得或已經知道的有非常多種適合的蛋白分解酵素。 舉例來說：適合的蛋白分解酵素有枯草桿菌蛋白分解酵素 (subtilisins)，係取自枯草桿菌（B. subtilis)和B. licheniformis的特別品系（subtilisinBPN及BPN，）。一種合適的 蛋白分解酵素來自桿菌（Bacillus)之一支品系，在pH 8-12之間具 有最大/舌性，由丹麥的Novo Industries A/S公司（此後稱之為 「Novo」）以ESPERASE R之名研發並販賣之。這種酵素與其他類 似(analogous)酵素的製備方式已經在GB1，243, 784中有所描述。 其他適合的蛋白分解酵素包括：來自Novo的ALCALASER、 DURAZYMR和SAVINASEIR，以及來自 Gist-Brocades公司的 MAXATASER^MAXACALR>PR〇PERASER^MAXAPEMR(protein engineered

Maxacal) °蛋白分解酵素還包含改良之細菌絲胺酸蛋白分解酵素 13 1316943 (serine proteases)，例如：1987年4月28曰提出申請，歐洲專利 申請號87 303761· 8專利案尹所敘述者（特別是第17、以及兕頁部 分），以及在1986年10月29日公告之歐洲專利申請號丨⑽，4〇4，

Vene职s，其中所提到之一改良細菌絲胺酸蛋白分解酵素〇eHne proteolytic enzyme) ° 其他適合的蛋白分解酵素包括在EP 9〇915958 ·· 4專利案中， 亦即於腦年5⑽日公告之W〇 _6637中所敘述之驗性^胺酸 蛋白分解酵素(alkaline serine protease)。還適用於本發明的 有專利申請EP 251 446及W0 91/06637中描述的蛋白分解酵素、w〇 91/02792中描述之蛋白分解酵素BUps (pr〇tease BLAps)以及其 在WO 95/23221中所描述之變異種類。 八 依據分解所需的酵素種類及數量、使用條件，獲得最大產量 可溶性膠原蛋白的所需時間會有極大差異，從1天到10天不等。酵 素與毛皮的重量比例可以從丨：綱丨：圆（w/w)。胃蛋白分解 酵素是最優先考慮_素，其重量與毛皮重量的關為丨：1〇〇左 右。 培養後，可溶性膠原蛋白（s〇luble c〇iiagen)與分散之勝焉 蛋=(diSpersed collagen)可以透過離心或過滤分離之。利“ 心为離時’上清液含有溶解的膠原蛋白（solubilised c〇llagei〇， 沈殿部分則有分散之膠原蛋白。利用過遽分離時，可溶性 白則分佈在遽過液中。 岭解的顧蛋白（SQlubi丨ised eQllagen)可以翻任何已知 清液f重新獲得’包括：沈澱、過濾及其他類似方法。 的古:、十可溶性膠原蛋白（soluble collagen)進行沈澱是較好 昙j二鹽類，例如：氯化鈉可添加到上清液（濾過液）中直到 ^後在5到2Q% (W/V)之間，較好是。之後懸浮液可以離 沈殿將上清液丢棄。沈殿可以重新溶解於稀釋(〇. 1M)之 ^蛋^酸中（沈崎溶液之比例約為1 : 100)。之後可溶性膠 ’、(S〇luble collagen)可以加鹽再沈澱。沈澱可以再溶解於 14 1316943 稀釋駿中並進行離心。接著可以測量並調整上清液膠原蛋白至所 需濃度(從1到10 mg/ml)。膠原蛋白可 之(dissolved)膠原蛋白對水進行透析然後轉換成無水膠原蛋白 (dehydrated collagen) ° 這裡所使用之無水膠原蛋白」（dehydrated co 11 agen)指的 是利用任何該項技藝習知的方法將膠原蛋白去除水份。在較佳的 實施方式中，無水勝原蛋白是利用冷凍乾燥法 (lyophilization)、冷凍-乾燥(freeze_drying)或乾燥 (desiccation)所製得。 (0052)含有分散之膠原蛋白之懸浮液可以過滤以去除任何大顆 粒。過濾液中膠原蛋白可以調整至所需濃度並以此形式使用。或 者，可將分散之膠原蛋白以水清洗並乾燥（dried)之。 這裡所使用之「乾燥」（dried)指的是任何用來移除膠原蛋白 水分的方法。其意指此名詞包含，但不限於氣體乾燥(air_drying) 或冷凉·乾燥（freeze-drying)。 (0054)從上面敘述清楚得知：依照本發明所提供的方法之不同實 施方式所製得之膠原蛋白適合各種不同需要膠原蛋白之生物醫療 用途。據推論本發明之膠原蛋白可以用在多種設定及許多用途， 包含但不限於，膠原蛋白縫線、膠原蛋白軟組織取代物，包^傷 口及燒傷覆蓋物、動脈血管取代物、止血劑、藥物輸送基質、眼 科治療用的玻璃體取代物、牙髓病治療、細胞培養支架等等。更 進一步推論本發明之不同實施方式將在任何形式發現用途，包含 但不限定於纖維狀或薄膜狀(membrane)膜片（fiims)、囊袋、海 綿、縫線、水狀懸浮液以及組合物質。此外，依照本發明所製得 之膠原蛋白可以進一步依用途需要而改良以提供一個改良之生物 活化反應。同時推測除了膠原蛋白外，本發明之方法將應用在製 備其他生物分子上。 在本說明書中，「包括」(comprise)及其相似詞彙(comprising， comprises)，表示「包含但不限於」（includingbutn〇t limited 15 1316943 to) ’而且並不排除其他添加物、餅、整獻integ 現在將進一步藉由下列非限定實施例說明本發明。但° 瞭解的是，下列實施例僅用於闡明本發明而已，不^^1、 發明之射。舉例來說，雖歸數實施例使_羊 須瞭解的是本發啊以制在本文所揭露之其他動 疋 含，舉個例子：牛、豬及有袋類皮膚。 月 ^ 實施例一自錦羊皮膚抽取第丨類及第ΠΙ膠原蛋白 自當地屠宰場屠殺後，立即取得新鮮、5公分左右 諾(merino)綿羊皮膚。該皮膚以冷凍容器運送到實驗室。、 機巧切下(fleshed)之後，倾上_毫升的有機酸緩衝溶 所使用的緩衝溶液是40%溶於水之冰醋酸並以氫氧化納調整至邱 皮膚在35°C、相對濕度85%中培養16小時。羊毛以手工移 並修剪掉任何皮膚上殘留之毛髮。所得到之毛皮稱重約丨.2公斤、。 之^毛皮以水清洗並以工業用食物處理機切成小碎片。 接著將切碎之毛皮加到包括〇. 醋酸之非解離性溶液。毛皮 ^所使用之非解雜溶液的比例為5〇 : 1(w/w)。將胃蛋白分解 ί I1:20f)以胃？白分解酵素對組織為1:副的比例加入懸浮 液中。懸浮液放在5°C培養7天’不定時給予授拌。 養過後，懸洋液以1MGG满心⑼分鐘。得到含有溶解的 ，原蛋白（solutn 1 ised odI lagen)之上驗與含有分散之膠原蛋 白之沈;殿。 添加_貞（—b㈤J_1G% (_)卩沈殿可溶性膠原蛋白。 =斤產生之_浮液’保留沈财·棄上清液。沈舰沈殿對醋酸 1 . 100的比例重新溶解於稀釋之(〇. 1M)醋酸中。所產生之溶液進 ^離心。溶解之(dissolved)膠原蛋白對水進行透析，其間更換水 數次，直到達成所要之鹽類濃度，之後進行冷凍乾燥。 利用這套程序可獲得30公克經胃蛋白分解酵素分解之可溶性 1316943 膠原蛋白，其具有市面上可購得之牛膠原蛋白相當的純度。產生 之可溶性膠原蛋白由95%第I類和5%第in膠原蛋白所組成。根 據羥脯胺酸(hydroxyproline)含量估計約有27〇公克分散之膠原 蛋白同時生成。 ^ 實施例二自炁羊皮膚抽取第I類及第III膠原蛋白 進杆自，(㈣的展羊，亦即小於12至14週之恙羊皮膚 f订實鉍例一之流程。所生成多於50%的膠原蛋白以可容於酸的 夕原蛋白形式（acid s〇iubie c〇iiagen)被抽取。發 .釦 III膠原蛋白的比例分別為·比·。取>現伽和第 【圖式簡單說明】 盔 【主要元件符號說明】 17

Claims (1)

1316943 十、申請專利範圍· 1. 一種自一哺乳類動物皮膚製備膠原蛋白的方法，該方法包括步 驟： (a) 將一有機酸缓衝溶液藉由喷霧、塗、沾濕或其他相似方法施 加在該皮膚上並將該皮膚培養一段充足的時間使覆著之羊毛或毛 髮能夠鬆開； (b) 將該皮膚切碎或剁碎成小碎片以製備多片皮膚碎片； (c) 自該等皮膚碎片抽取該膠原蛋白。 2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該動物皮膚係移除自選 自一群由羊、牛、山羊、馬、豬及有袋類組成之動物。 3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中施加該有機酸緩衝 溶液至該皮膚之步驟包括施加有機酸緩衝溶液到該動物皮膚之肌 肉面。 4. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該有機酸緩衝溶液 之pH值在3到5之間。 5. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該有機酸緩衝溶液 之pH值在3· 2到4. 5之間。 6. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該有機酸緩衝溶液 包括一種水溶液或懸浮液，其含有一種或多種酸，係選自由醋酸、 檸檬酸、丙酮酸、乳酸或曱酸所組成之族群。 7·如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該有機酸緩衝溶液係由 40% (w/w)溶於水之冰醋酸所組成。 1316943 8.如申請專利範圍第7撕述之方法，其巾該有機酸麟溶液之邱 值在4· 0到4. 2之間。 9·如申請專機圍第1或2撕述之方法，其巾該有機酸緩衝溶液 是以每張皮膚50-100毫升的比例施加。 10. 如申請專利範圍第i或2項所述之方法，其中該步驟⑷係在溫 度20到40°C之間進行6到48小時。 11. 如申請專概圍⑽項職之綠，其巾軸物皮膚在該步驟 (b)之前去除毛髮。 12·如申請專纖圍糾項所述之方法，其中該動物皮膚之殘餘肉 塊在該步驟(b)之前係以機械或手工去除。 13. 如申μ專利㈣第12項所述之方法，其中該步驟⑹包括在非 解離狀悲下’財機酸緩衝溶液混合該動物皮膚碎片以形成懸浮 液。 14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該有機酸係選自由醋 酸、乳酸及曱酸所組成之族群。 15·如申1專利雄第14項所述之方法，其巾該有機酸减度介於 0.1至0· 05Μ之醋酸。 16·如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該皮膚利及有機酸 係置於溫度0到3〇。〇之間攪拌培養。 Π·如申請專利範圍第則所述之方法，其中該懸浮液進一步包含 一或多種蛋白分解酵素。 19 1316943 18.如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該蛋白分解酵素係選 自由 ESPERASE® (Novozymes、Bagsvaerd、丹麥）、ALCALASE® (Novozymes、Bagsvaerd、丹麥）、DURAZYM® (Novozpies、 Bagsvaerd、丹麥）與SAVINASE® (Novozymes、Bagsvaerd、丹麥）、 MAXATASE® (Gist-Brocades、Delft、荷蘭）、MAXACAL® (Gist-Brocades、Delft、荷蘭）、PR〇PERASE®(Gist-Brocades、 Delft、荷蘭）、MAXAPEM® (Gist-Brocades、Delft、荷蘭）以 及胃蛋白分解酵素所組成之族群。 19·如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該蛋白分解酵素是胃 蛋白分解酵素。 20·如申請專利範圍第丨或2項所述之方法，其進一步包括一分離步 驟。 21. 如申請專利棚第2G項所述之方法，其中該分離步驟包含離心 及/或過齡驟’其巾可雜_蛋自和分散之縣蛋白是分離 的。 22. 如申睛專利範圍第21項所述之方法，其中該分離步驟包含離心 步驟’其上清液含有溶解的膠原蛋白。 23. 如申請專利棚項所述之方法，財該分離步驟包含過遽 步驟’其過濾液含有可溶性膠原蛋白。 %如申請專利範圍第22或23項所述之方法，其中該可溶性膠原蛋 白係利用鹽類而沈澱。 20 1316943 25. 如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該鹽類添加到最後濃 度在5到20%(w/v)之間。 26. 如申請專利範圍第24項所述之方法’其中該鹽類添加到最後濃 度為10%。 27. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該膠原蛋白為冷涞 乾燥之膠原蛋白。 21