CN1974783B - 生物催化制备胶原蛋白肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物催化制备胶原蛋白肽的方法，该方法是在反应器中按有机溶剂与水的体积比为0.01～1∶1的比例配成水/有机溶剂双相反应介质，按胶原蛋白粉与反应介质的用量之比为0.01～10g∶1 ml加入胶原蛋白粉，按生物催化剂与胶原蛋白粉的重量比为0.001～10∶1的比例加入固定化水解酶，在温度为50～70℃、振荡速度为100～300 rpm、常压下反应0.5～48小时后，分离得到胶原蛋白肽。本发明克服了现有技术中步骤繁琐、酶容易失活、反应效率低、高温灭酶能耗大、酶蛋白易残留的缺点；具有成本低、反应条件温和、环境友好、反应过程简单可控、产物易从反应混合体系中分离的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物催化与生物合成领域，具体涉及一种在水/有机溶剂双相体系中生物催化制备胶原蛋白肽的方法。
背景技术
胶原蛋白是动物结缔组织中的主要成分，是动物体内含量最多、分布最广、具有免疫学性质的蛋白质，在动物的皮肤组织、骨骼等中含量尤为丰富。例如，猪皮的蛋白质含量高达26.4％，其中胶原蛋白就占了87.8％；鱼鳞、鱼皮中的粗胶原蛋白约占80％；动物骨骼中也富含该种蛋白质，约占有机物的70.0％-80.0％。然而，长期以来，这些富含胶原蛋白的动物组织多做为工业生产中的下脚料而被废弃，或利用率极低。如，畜产品加工后得到的骨头常制成骨粉作为饲料廉价出售，而一般水产加工中则将鱼鳞、鱼皮作为废弃物扔掉的，尤其是鱼鳞；一些水溶性胶原蛋白甚至直接随加工废液排走，不仅污染环境，而且造成了极大的资源浪费，因此，有必要对其进行深加工的研究，以期提高此类废弃物的附加值，化废为宝、减少环境污染。胶原蛋白肽是胶原蛋白水解后的产物，具有较高的消化吸收性，拥有极强的吸收性。近年来国内外的研究还表明，胶原多肽除了具有很高的营养特性外，依其结构和分子量的不同还具有许多特殊的生理功能，如保护胃粘膜和抗溃疡作用，抗过敏作用，抑制血压上升作用，促进骨形成作用、促进皮肤胶原代谢等作用，有些特殊氨基酸还具有防癌、防关节炎等功效。此外，胶原蛋白肽还具有良好的加工特性和保湿性。因而，它们在皮革业、影像业、制药业、糖果生产、生物医学原料、化妆品业和食品工业中有均有着良好的应用前景。
目前国内外制备胶原蛋白肽主要采用酶法，一般用碱性水溶液作为反应介质，酶粉、液体酶形式的单酶或者多种酶作为催化剂水解。这些方法目前普遍存在如下缺点：(1)步骤繁多，水解率低、能耗大、产物难分离；(2)反应中常采用盐浸泡、碱液浸泡、化学试剂处理、脂肪酶酶解-表面活性剂联合等方式来脱去组织中的脂肪，增加了后续产物提纯步骤的困难；(3)反应后多采用高温灭酶来中止反应，不仅增加能耗，且灭酶后难以分离去酶、酶利用率低，大大增加了该方法的经济成本和产物分离纯化的难度；(4)反应后大量碱废液的排放，会带来严重的环境污染问题。因此，研究开发胶原蛋白肽制备新工艺具有重大的现实意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的不足，提供一种环境友好、生产成本低、反应过程简单可控、产物易分离的水/有机溶剂双相体系中生物催化制备胶原蛋白肽的新方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种在水/有机溶剂双相体系中生物催化制备胶原蛋白肽的方法：在反应器中按有机溶剂与水的体积比为0.01～1∶1的比例配成水/有机溶剂双相反应介质，按胶原蛋白粉与反应介质的用量之比为0.01～10g∶1ml加入胶原蛋白粉，按生物催化剂与胶原蛋白的重量比为0.001～10∶1的比例加入生物催化剂固定化水解酶，在温度为50～70℃、振荡速度为100～300rpm、常压下反应0.5～48小时后，分离得到胶原蛋白肽。
所述固定化水解酶包括固定化蛋白酶，固定化脂肪酶和固定化酯酶，来源于Bacillus lichemiforms、Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilis，Rhizomucormiehei，Mucor miehei，Candida antarctica，Burkholderia cepacia，Thermoomyceslanuginosus，papaya latex，fig，liver，stomach或pancreas。
所述水不溶性有机溶剂选自饱和脂肪烃类、芳烃类、酯类、醚类和含4个以上碳原子醇类。具体是，所述饱和脂肪烃类溶剂包括丁烷溶剂；所述芳烃类溶剂包括甲苯溶剂；所述酯类溶剂包括辛酸乙酯溶剂；所述醇类溶剂包括辛醇溶剂；所述醚类溶剂包括石油醚溶剂。
分离胶原蛋白肽方法如下：反应混合物经过滤除去固定化水解酶，离心去除有机相，剩余溶液在50～70℃下进行真空旋转蒸发，所得的沉淀物用不同截留量的超滤膜或者纳滤膜分级分离可以得到具有不同分子量的胶原蛋白肽。
本发明的原理：采用水/有机溶剂双相体系，以固定化水解酶作为催化剂，催化胶原蛋白粉进行水解反应，得到胶原蛋白肽。
与现有的技术相比，本发明具有如下的优点：
(1)采用高效、高稳定性的生物催化剂固定化水解酶来催化胶原蛋白肽合成，克服了现有技术中酶容易失活，反应效率低的缺点；反应过程简单可控、产物易分离；
(2)反应终止采用过滤除酶的方法，简便迅速，克服了现有技术中高温灭酶能耗大、酶蛋白易残留等缺点；且固定化酶可反复使用，降低生产成本；
(3)利用了非水相酶催化的新技术，采用水/有机溶剂反应介质作为反应介质，酶促脱脂后的脂肪酸、甘油等物质可在反应过程中被萃取于有机相里，反应后可与有机溶剂一起经离心、旋转蒸发除去，简化了产物分离步骤，得到的产品杂质少；经蒸发除去的有机溶剂可以回收重复利用，降低了生产成本；
(4)反应条件温和，无含碱废液排放，环境友好。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
实施例1
把0.5g胶原蛋白粉、0.5mg来源于papaya latex的固定化蛋白酶和50ml水/丁烷(100∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于30℃、100rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应3h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在50℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用超滤膜6000膜和5000膜分级分离可以得到分子量在6000～5000Da的胶原蛋白肽。
实施例2
把0.5g胶原蛋白粉、0.5mg来源于Bacillus lichemiforms的固定化脂肪酶和50ml水/辛醇(1∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于60℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应12h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在50℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用不同截留量的超滤膜5000膜和2000膜分级分离可以得到分子量在5000～2000Da的胶原蛋白肽。
实施例3
把0.5g胶原蛋白粉、5mg来源于Bacillus amyloliquefaciens的固定化蛋白酶和10ml水/甲苯(100∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于50℃、300rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应0.5h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在70℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用超滤膜2000膜和1000膜分级分离可以得到分子量在2000～1000Da的胶原蛋白肽。
实施例4
把0.5g胶原蛋白粉、5mg来源于Bacillus subtilis的固定化酯酶和10ml水/辛酸乙酯(10∶1)两相介质中，置于70℃、250rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应0.5h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在70℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用截留分子量为800和1000的纳滤膜分级分离可以得到分子量在800～1000Da的胶原蛋白肽。
实施例5
把0.5g胶原蛋白粉、50mg来源于Rhizomucor miehei的和5ml水/丁醇(1∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于50℃、150rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应24h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在70℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用截留分子量为700～800的纳滤膜分离可以得到分子量在700～800Da的胶原蛋白肽。
实施例6
把0.5g胶原蛋白粉、50mg来源于Mucor miehei的固定化脂肪酶和5ml水/甲苯(100∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于40℃、200rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应30h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在70℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用截留分子量为400～500的纳滤膜分级分离可以得到分子量在400～500Da的胶原蛋白肽。
实施例7
把0.5g胶原蛋白粉、100mg来源于pancreas的固定化蛋白酶和1ml水/石油醚(50∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于50℃、150rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应48h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在50℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用截留分子量为150～200的纳滤膜分离可以得到分子量在150～200Da的胶原蛋白肽。
实施例8
把0.5g胶原蛋白粉、100mg来源于stomach的固定化蛋白酶和1ml水/庚醇(1∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于70℃、250rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应0.5h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在70℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用截留分子量为80～100的纳滤膜分离可以得到分子量在80～100Da的胶原蛋白肽。
实施例9
把0.5g胶原蛋白粉、1000mg来源于fig的固定化蛋白酶和0.5ml水/辛酸乙酯(100∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于60℃、300rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应48h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在70℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用截留分子量为80～100的纳滤膜分离可以得到分子量在80～100Da的胶原蛋白肽。
实施例10
把0.5g胶原蛋白粉、1000mg来源于Pig liver的固定化酯酶和0.5ml水/己烷(100∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于60℃、300rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应48h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在50℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用截留分子量为80～100的纳滤膜分离可以得到分子量在80～100Da的胶原蛋白肽。
实施例11
把0.5g胶原蛋白粉、5000mg来源于Candida antarctica的固定化脂肪酶和0.1ml水/辛烷(50∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于60℃、300rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应48h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在70℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用截留分子量为80～100的纳滤膜分离可以得到分子量在80～100Da的胶原蛋白肽。
实施例12
把0.5g胶原蛋白粉、5000mg来源于Burkholderia cepacia的固定化脂肪酶和0.1ml水/戊烷(100∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于60℃、300rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应48h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在70℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用截留分子量为80～100的纳滤膜分离可以得到分子量在80～100Da的胶原蛋白肽。
实施例13
把0.5g胶原蛋白粉、100mg来源于Thermomyces lanuginosus cepacia的固定化脂肪酶和0.05ml水/丁醇(50∶1)两相介质放入具塞三角瓶中，置于60℃、300rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应48h后，过滤除去固定化蛋白酶，离心后去除有机相，剩余溶液在50℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用截留分子量为80～100的纳滤膜分离可以得到分子量在80～100Da的胶原蛋白肽。
Claims (2)
1.一种生物催化制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于：在反应器中，按有机溶剂与水的体积比为0.01～1∶1的比例配成水/有机溶剂双相反应介质，按胶原蛋白粉与反应介质的用量之比为0.01～10g∶1ml加入胶原蛋白粉，按生物催化剂与胶原蛋白粉的重量比为0.001～10∶1的比例加入生物催化剂固定化水解酶，在温度为50～70℃、振荡速度为100～300rpm、常压下反应0.5～48小时后，分离得到胶原蛋白肽；
所述固定化水解酶为来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniforms)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、梅褐毛霉(Mucor miehei)、南极假丝酵母(Candidaantarctica)、洋葱假单胞菌(Burkholderia cepacia)或嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)的固定化蛋白酶、固定化脂肪酶或固定化酯酶；
或者是所述固定化水解酶为来源于木瓜乳或无花果的固定化蛋白酶、固定化脂肪酶或固定化酯酶；
或者是所述固定化水解酶为来源于动物胃脏、动物肝脏或动物胰脏的固定化蛋白酶、固定化脂肪酶或固定化酯酶；
所述有机溶剂为丁烷、甲苯、辛酸乙酯、正辛醇或石油醚。
2.根据权利要求1所述的生物催化制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于所述的分离为反应混合物经过滤除去固定化水解酶，离心后去除有机相，剩余溶液在50～70℃下进行真空旋转蒸发，所得到的沉淀物用不同截留量的超滤膜或者纳滤膜分级分离可以得到具有不同分子量的胶原蛋白肽。
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