JP6120428B2

JP6120428B2 - 分化誘導用組成物

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Publication number: JP6120428B2
Application number: JP2016516419A
Authority: JP
Inventors: 康一森本; 沙織國井; 衛山本; 伊藤　浩行; 浩行伊藤; 久保木　芳徳; 芳徳久保木
Original assignee: Kinki University
Current assignee: Kinki University
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: EP3138576A4; WO2015167004A1; US10155804B2; EP3138576B1; US20170051043A1; JPWO2015167004A1; EP3138576A1

Description

本発明は、分化誘導用組成物に関する。

コラーゲンは、真皮、靭帯、腱、骨および軟骨などを構成するタンパク質の１つであって、多細胞生物の細胞外マトリクスの主成分である。研究が進むにつれて、コラーゲンが様々な生理機能を有していることが明らかになり、現在も、コラーゲン分子の新たな生理機能を見出すための研究や、コラーゲン分子の新たな用途を見出すための研究が進められている。

現在までの研究によって、１つのコラーゲン分子は３つのポリペプチド鎖によって構成されており、これら３つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成することによって、１つのコラーゲン分子が形成されていることが明らかになっている。

螺旋構造を形成するための各ポリペプチド鎖内の領域は、トリプルヘリカルドメインと呼ばれ、当該トリプルヘリカルドメインは、特徴的なアミノ酸配列を有している。具体的に、トリプルヘリカルドメインは、「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ」にて示されるアミノ酸配列が繰り返し連続して出現するという特徴的なアミノ酸配列を有している。なお、上述した３つのアミノ酸からなるアミノ酸配列において、グリシン以外のアミノ酸、つまりＸおよびＹは、様々なアミノ酸であり得る。

コラーゲン分子のアミノ末端および／またはカルボキシル末端（換言すれば、コラーゲン分子を構成している各ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシル末端）には、コラーゲンの主たる抗原部位であるテロペプチドが存在する。当該テロペプチドは、コラーゲン分子を構成する各ポリペプチド鎖内において、上述したトリプルヘリカルドメインよりもアミノ末端側および／またはカルボキシル末端側に存在している。

プロテアーゼなどの酵素を用いて処理することによりコラーゲン分子からテロペプチドを部分的に切除すると、コラーゲン分子の抗原性を低く抑えられることが知られている。このようなテロペプチドが部分的に切除されたコラーゲン分子をアテロコラーゲンと呼ぶ。

現在までの研究によって、コラーゲン、アテロコラーゲン、および、プロテアーゼによるこれらの分解物、が様々な生理機能を有していることが明らかになり、当該生理機能に基づいたコラーゲン、アテロコラーゲン、および、プロテアーゼによるこれらの分解物の様々な用途が開発されている（例えば、特許文献１および２参照）。

特許文献１では、コラーゲンまたはアテロコラーゲンをプロテアーゼ（例えば、ペプシンおよびアクチニダインなど）で処理した分解物を、止血用の医療用材料として用いる技術が開示されている。更に具体的に、特許文献１では、まず、キハダマグロの皮部に対してペプシン処理を施して、アテロコラーゲンを含有している水溶液を取得し、更に、当該水溶液に塩化ナトリウムを加えることによって、アテロコラーゲンを沈殿および回収している。なお、アテロコラーゲンを沈殿物として回収する際に、塩化ナトリウムは、上清と共に除去されることになる。そして、特許文献１では、沈殿物として回収されたアテロコラーゲンに対してアクチニダインによる分解処理を施して分解物を得、当該分解物を、止血用の医療用材料として用いている。

一方、特許文献２では、コラーゲンまたはアテロコラーゲンをプロテアーゼで処理した分解物を、動脈硬化症および動脈硬化症に起因する疾患の予防または治療のための組成物として用いる技術が開示されている。更に具体的に、特許文献２では、ミネラルを除去した後のコラーゲンをプロテアーゼによって分解して得られるコラーゲンの分解物を、動脈硬化症および動脈硬化症に起因する疾患の予防または治療のための組成物として用いる技術が開示されている。

上述したように、コラーゲンおよびアテロコラーゲンをプロテアーゼによって分解する場合には、塩濃度が低い条件下にて分解することが一般的である。そして、このような塩濃度が低い条件下におけるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物のアミノ酸配列は既に決定されており、そのアミノ酸配列は、非特許文献１などに開示されている。

ＷＯ２００４／０２０４７０（２００４年３月１１日公開）日本国公開特許公報「特開２００１−３１５８６号公報（２００１年２月６日公開）」

S. Kunii et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.285, No.23, pp.17465-17470, June4, 2010 K. Morimoto et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol.68, pp.861-867, 2004

上述したように、コラーゲン、アテロコラーゲン、および、これらの分解物の生理機能に関する研究が進んでいるが、これらの生理機能の全てが解明されているわけではない。

これらが有する新たな生理機能を見出すことは、医療分野、食品分野、化粧品分野および基礎研究分野などの様々な分野の発展に大きく寄与できるものと考えられる。

本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む分化誘導用組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定の構造を有するコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物が、細胞の分化を誘導する能力を有していることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明の分化誘導用組成物は、上記課題を解決するために、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む、細胞の分化を誘導するための分化誘導用組成物であって、上記分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいることを特徴としている。

本発明は、細胞の分化を誘導することができるという効果を奏する。

本発明は、多くの細胞の分化を誘導することができるという効果を奏する。

本発明は、速く細胞の分化を誘導することができるという効果を奏する。

本発明は、細胞の分化を維持することができるという効果を奏する。

（ａ）は、本発明の実施例の分解物によって誘導された、マウス骨芽細胞前駆細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サブクローン４のスフェロイドの顕微鏡写真であり、（ｂ）は、アテロコラーゲンによって誘導された、マウス骨芽細胞前駆細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サブクローン４の顕微鏡写真である。本発明の実施例の分解物によって誘導された、マウス線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３のスフェロイドの顕微鏡写真を示す。本発明の実施例の分解物と接触させた市販の培養用プレートを用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示す。市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンと接触させた培養用プレートを用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示す。コラーゲンの分解物と接触させていない培養用プレートを用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示す。市販のＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅＤｉｓｈ（ＳＣＩＶＡＸ社）を用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示す。様々な種類の培養用プレートを用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示す。本発明の実施例の分解物と接触させた市販の培養用プレートを用いた場合の細胞の元素分析の結果を示すグラフである。市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンと接触させた培養用プレートを用いた場合の細胞の元素分析の結果を示すグラフである。コラーゲンの分解物と接触させていない培養用プレートを用いた場合の細胞の元素分析の結果を示すグラフである。本発明のコラーゲンの分解物の骨形成能を示す写真である。本発明のコラーゲンの分解物とラット骨髄間葉系幹細胞との混合物の骨形成能を示す写真である。市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンの骨形成能を示す写真である。市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンとラット骨髄間葉系幹細胞との混合物の骨形成能を示す写真である。本発明の実施例における、細胞の長期培養の結果を示す写真である。本発明の実施例における、ヒト間葉系幹細胞を軟骨細胞へ分化誘導させる試験の結果を示す写真である。本発明の実施例における、ヒト間葉系幹細胞を軟骨細胞へ分化誘導させる試験の結果を示す写真である。本発明の実施例における、マウスＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞を脂肪細胞へ分化誘導させる試験の結果を示す写真である。本発明の実施例における、Ｃ６細胞をグリア細胞へ分化誘導させる試験の結果を示す写真である。本発明の実施例における、ヒト間葉系幹細胞を神経細胞へ分化誘導させる試験の結果を示す写真である。（ａ）および（ｂ）は、本発明の実施例において、骨断片と各酵素とを接触させた後、１１日間静置した写真である。本発明の実施例の骨断片分解物によって誘導された、ヒト骨髄間葉系幹細胞ＭＳＣのスフェロイドの顕微鏡写真を示す。

本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。

本明細書にて「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。

〔１．分化誘導用組成物〕
本実施の形態の分化誘導用組成物は、細胞の分化を誘導するための組成物であって、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を主成分として含み、上記分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいるものである。つまり、上記分解物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの全体を含んでいてもよいし、トリプルヘリカルドメインの一部分を含んでいてもよい。

更に具体的に、本実施の形態の分化誘導用組成物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む分化誘導用組成物であって、
コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ_６とＧとの間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、Ｘ_６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_７との間の化学結合、または、Ｘ_１４とＧとの間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ_１とＹ_２との間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、を含む分化誘導用組成物である。

また、本実施の形態の分化誘導用組成物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む分化誘導用組成物であって、以下のものであってもよい、
コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、および、Ｘ_６とＧとの間の化学結合から選択される何れか１つの化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、Ｘ_６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_７との間の化学結合、および、Ｘ_１４とＧとの間の化学結合から選択される何れか１つの化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ_１とＹ_２との間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、を含む分化誘導用組成物である。

（１）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−（配列番号１）：
（２）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｇ−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｇ−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｇ−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｇ−（配列番号１４）：
（３）−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｇ−Ｙ_４−Ｙ_５−Ｇ−Ｙ_６−Ｙ_７−Ｇ−Ｙ_８−Ｙ_９−Ｇ−（配列番号１３）：
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ_１〜Ｘ_１４およびＹ_１〜Ｙ_９は、任意のアミノ酸である）。

以下に、各構成について詳細に説明する。

本実施の形態の分化誘導用組成物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を主成分として含んでいる。

分解物の材料になるコラーゲンおよびアテロコラーゲンは特に限定されず、周知のコラーゲンおよびアテロコラーゲンであればよい。

分解物の材料になるコラーゲンとしては、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒト、ラットまたはマウスなど）、鳥類（例えば、ニワトリなど）、または、魚類（例えば、サメ、コイ、ウナギ、マグロ（例えば、キハダマグロ）、ティラピア、タイ、サケなど）のコラーゲンを用いることができる。

更に具体的に、分解物の材料になるコラーゲンとしては、上記哺乳類または鳥類の真皮、腱、骨または筋膜などに由来するコラーゲン、あるいは、上記魚類の皮膚または鱗などに由来するコラーゲンを用いることができる。

分解物の材料になるアテロコラーゲンとしては、上記哺乳類、鳥類または魚類のコラーゲンをプロテアーゼ（例えば、ペプシンなど）によって処理して得られる、コラーゲン分子のアミノ末端および／またはカルボキシル末端からテロペプチドが部分的に除去されているアテロコラーゲンを用いることができる。

これらのなかでは、ニワトリ、ブタ、ヒトまたはラットのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを分解物の材料として好ましく用いることができ、ブタまたはヒトのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを分解物の材料として更に好ましく用いることができる。

また、分解物の材料として魚類のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることにより、材料を簡便に、安全に、かつ大量に入手可能であり、ヒトに対してより安全なコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を実現することができる。

なお、分解物の材料として魚類のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いる場合には、サメ、コイ、ウナギ、マグロ（例えば、キハダマグロ）、ティラピア、タイまたはサケのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることが好ましく、マグロ、ティラピア、タイまたはサケのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることが更に好ましい。

分解物の材料としてアテロコラーゲンを用いる場合、熱による変性温度が、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上であるアテロコラーゲンを用いることが好ましい。例えば、分解物の材料として魚類のアテロコラーゲンを用いる場合、マグロ（例えば、キハダマグロ）またはコイなどのアテロコラーゲンは熱変性温度が２５℃以上であるので、これらのアテロコラーゲンを用いることが好ましい。

上記構成であれば、本実施の形態の分化誘導用組成物の変性温度を、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上に調節することができる。その結果、上記構成であれば、貯蔵時の安定性、利用時の安定性に優れた分化誘導用組成物を実現することができる。

分解物の材料になるコラーゲンおよびアテロコラーゲンは、周知の方法によって入手することができる。例えば、哺乳類、鳥類または魚類のコラーゲンに富んだ組織をｐＨ２〜４程度の酸性溶液に投入することによって、コラーゲンを溶出することができる。更に、当該溶出液にペプシンなどのプロテアーゼを添加して、コラーゲン分子のアミノ末端および／またはカルボキシル末端のテロペプチドを部分的に除去する。更に、当該溶出液に塩化ナトリウムなどの塩を加えることによって、アテロコラーゲンを沈殿させることができる。

本実施の形態の分化誘導用組成物は、上述したコラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ_６とＧとの間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
上述したコラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、Ｘ_６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_７との間の化学結合、または、Ｘ_１４とＧとの間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
上述したコラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ_１とＹ_２との間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、を含んでいる：
（１）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−：
（２）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｇ−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｇ−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｇ−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｇ−：
（３）−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｇ−Ｙ_４−Ｙ_５−Ｇ−Ｙ_６−Ｙ_７−Ｇ−Ｙ_８−Ｙ_９−Ｇ−：
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ_１〜Ｘ_１４およびＹ_１〜Ｙ_９は、任意のアミノ酸である）。

本明細書において「トリプルヘリカルドメイン」とは、「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ」（ＸおよびＹは任意のアミノ酸）にて示されるアミノ酸配列が、少なくとも３個以上、より好ましくは少なくとも８０個以上、より好ましくは少なくとも３００個以上、連続するアミノ酸配列を含むドメインであって、螺旋構造の形成に寄与するドメインを意図する。

トリプルヘリカルドメイン内で化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する複数種類のポリペプチド鎖のうちの何れのポリペプチド鎖であってもよい。

例えば、化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、α１鎖、α２鎖、α３鎖のうちの何れであってもよい。

化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、上述したポリペプチド鎖のなかではα１鎖またはα２鎖の少なくとも一方であることが好ましい。

化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、上述したポリペプチド鎖のなかではα１鎖であることが更に好ましい。

コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を酵素処理によって作製すれば、容易に特定のポリペプチド鎖のみで切断を生じさせることができる。

コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物は、３つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成しているものであってもよい。あるいは、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物は、３つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成していないもの、または、３つのポリペプチド鎖が部分的に螺旋構造を形成していないものであってもよい。なお、３つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成しているか否かは、公知の方法（例えば、円偏光二色スペクトル）によって確認することができる。

コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物は、基本的に３つのポリペプチド鎖を含んでいるが、３つのポリペプチド鎖のうちの１つのポリペプチド鎖にて化学結合の切断が生じていてもよいし、３つのポリペプチド鎖のうちの２つのポリペプチド鎖にて化学結合の切断が生じていてもよいし、３つのポリペプチド鎖の全てにて化学結合の切断が生じていてもよい。

３つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成している場合には、複数の螺旋構造体によって、網目状の会合体が形成されていてもよいし、線維状の会合体が形成されていてもよい。

本明細書において、網目状とは、水素結合または静電的相互作用、ファンデルワールス結合などによって分子が連なって立体的な網目をつくり、当該網目の間に隙間ができている構造を意図する。本明細書において、線維状とは、水素結合または静電的相互作用、ファンデルワールス結合などによって分子が連なって形成された略直線状の構造を意図する。また、本明細書において、会合体とは、同種の分子が共有結合によらないで２分子以上が相互作用して結合し、１つの構造単位となっているものを意図する。網目状または線維状の会合体が形成されているか否かは、電子顕微鏡にて観察することによって確認することができる。

コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物は、架橋構造を有するものであってもよい。例えば、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖とが、螺旋構造と螺旋構造とが、または、ポリペプチド鎖と螺旋構造とが、架橋剤によって架橋されていてもよい。

上記架橋構造は、周知の架橋方法によって形成することができる。例えば、化学架橋する方法、熱処理により架橋する方法、紫外線等放射線照射により架橋する方法などが挙げられる。

化学架橋に用いる架橋剤としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性カルボジイミド化合物、エピクロロヒドリン、ビスエポキシジエチレングリコールなどのジエポキシ化合物、ＮａＢＨ_４などが挙げられる。

架橋剤の濃度は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物に対して、好ましくは１０^−３〜１０質量％である。好ましくは、５〜４０℃にて、３〜４８時間、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物と架橋剤とを接触させることにより、架橋構造を形成することができる。

紫外線により架橋する場合、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物に、例えば、室温にて、紫外線ランプなどにより紫外線を３〜４８時間程度照射することによって、架橋構造を形成することができる。

熱架橋する場合は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を、減圧下にて、好ましくは１１０〜１６０℃程度の温度で、３〜４８時間程度加熱することによって、架橋構造を形成することができる。

架橋構造を有するコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物は、耐コラゲナーゼ性、および、強度が向上しているという利点を有している。

コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物は、必要に応じて、所望の化学修飾を施されていてもよい。化学修飾の種類としては、例えば、アシル化、ミリスチル化、ポリエチレングリコール修飾などを挙げることができる。

例えば、アシル化の一種であるサクシニル化を施した分解物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物と無水コハク酸とを、リン酸緩衝液などの中性ｐＨの溶媒中で反応させて得ることができる。サクシニル化することにより、中性ｐＨの溶媒に対する分解物の溶解度を向上させることができる。

また、ポリエチレングリコール修飾を施した分解物は、塩化シアヌルで活性化したポリエチレングリコールと、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物とを反応させることにより、得ることができる。

上述したコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物では、上述したトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ_６とＧとの間の化学結合が切断されている；
（１）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−：
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ_１〜Ｘ_６は、任意のアミノ酸である）。

また、上述したコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物では、上述したトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、Ｘ_６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_７との間の化学結合、または、Ｘ_１４とＧとの間の化学結合が切断されている；
（２）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｇ−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｇ−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｇ−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｇ−：
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ_１〜Ｘ_１４は、任意のアミノ酸である）。

また、上述したコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物では、上述したトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ_１とＹ_２との間の化学結合が切断されている；
（３）−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｇ−Ｙ_４−Ｙ_５−Ｇ−Ｙ_６−Ｙ_７−Ｇ−Ｙ_８−Ｙ_９−Ｇ−
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｙ_１〜Ｙ_９は、任意のアミノ酸である）。

上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列のトリプルヘリカルドメイン内における位置は、特に限定されない。例えば、上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列は、トリプルヘリカルドメインの内部に存在していてもよいが、トリプルヘリカルドメインのアミノ末端に存在していることが好ましい（換言すれば、上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列の中の最もアミノ末端側に配置されている「Ｇ」が、トリプルヘリカルドメインの中の最もアミノ末端側に配置されている「Ｇ」と一致することが好ましい）。

上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列がトリプルヘリカルドメインの内部に存在している場合、当該（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列の具体的な位置は特に限定されない。当該（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１個以上、５個以上、１０個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上、２００個以上、２５０個以上または３００個以上の「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ」（ＸおよびＹは任意のアミノ酸）が連続するアミノ酸配列が存在していてもよい。また、当該（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、１個以上、５個以上、１０個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上、２００個以上、２５０個以上または３００個以上の「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ」（ＸおよびＹは任意のアミノ酸）が連続するアミノ酸配列が存在していてもよい。

上記Ｘ_１〜Ｘ_６の各々は、任意のアミノ酸であり得、アミノ酸の種類は特に限定されない。また、Ｘ_１〜Ｘ_６の各々は、少なくとも一部が同じ種類のアミノ酸であってもよいし、全てが異なる種類のアミノ酸であってもよい。

例えば、Ｘ_１〜Ｘ_６の各々は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンのうちの何れであってもよい。

更に具体的には、Ｘ_１〜Ｘ_６のうち、Ｘ_１、Ｘ_３およびＸ_５が同じアミノ酸であり、その他が別のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_１〜Ｘ_６のうち、Ｘ_１、Ｘ_３およびＸ_５からなる群から選択される少なくとも１つがプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_１がプロリンであり、Ｘ_２〜Ｘ_６が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_１およびＸ_３がプロリンであり、Ｘ_２、Ｘ_４〜Ｘ_６が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_１、Ｘ_３およびＸ_５がプロリンであり、Ｘ_２、Ｘ_４およびＸ_６が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_１、Ｘ_３およびＸ_５がプロリンであり、Ｘ_２が側鎖に硫黄原子を含むアミノ酸（例えば、システインまたはメチオニン）または側鎖に水酸基を含むアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン）であり、Ｘ_４およびＸ_６が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_１、Ｘ_３およびＸ_５がプロリンであり、Ｘ_２が側鎖に硫黄原子を含むアミノ酸（例えば、システインまたはメチオニン）であり、Ｘ_４が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）または側鎖に水酸基を含むアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン）であり、Ｘ_６が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_１、Ｘ_３およびＸ_５がプロリンであり、Ｘ_２が側鎖に硫黄原子を含むアミノ酸（例えば、システインまたはメチオニン）であり、Ｘ_４が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）または側鎖に水酸基を含むアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン）であり、Ｘ_６が側鎖に塩基を含むアミノ酸（例えば、アルギニン、リシンまたはヒスチジン）であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_１、Ｘ_３およびＸ_５がプロリンであり、Ｘ_２がメチオニンであり、Ｘ_４がアラニンまたはセリンであり、Ｘ_６がアルギニンであってもよい。

上記（２）にて示されるアミノ酸配列では、Ｘ_１〜Ｘ_６の各々は、上述したＸ_１〜Ｘ_６と同じ構成であり得る。Ｘ_７〜Ｘ_１４の具体的な構成について、以下に説明する。

上記Ｘ_７〜Ｘ_１４の各々は、任意のアミノ酸であり得、アミノ酸の種類は特に限定されない。また、Ｘ_７〜Ｘ_１４の各々は、少なくとも一部が同じ種類のアミノ酸であってもよいし、全てが異なる種類のアミノ酸であってもよい。

例えば、Ｘ_７〜Ｘ_１４の各々は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンのうちの何れであってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１２およびＸ_１３が同じアミノ酸であり、その他が別のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１２およびＸ_１３からなる群から選択される少なくとも１つがプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８およびＸ_９がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８、Ｘ_９およびＸ_１０がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０およびＸ_１２がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１２およびＸ_１３がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１２およびＸ_１３がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、Ｘ_７が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）であり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１２およびＸ_１３がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、Ｘ_７およびＸ_１１が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）であり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１２およびＸ_１３がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、Ｘ_７およびＸ_１１が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）であり、Ｘ_１４が親水性でありかつ非解離性の側鎖を有するアミノ酸（セリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン）であってもよい。

更に具体的には、Ｘ_７〜Ｘ_１４のうち、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１２およびＸ_１３がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、Ｘ_７がロイシンであり、Ｘ_１１がアラニンであり、Ｘ_１４がグルタミンであってもよい。

上記（３）にて示されるアミノ酸配列は、トリプルヘリカルドメインのアミノ末端に位置している。つまり、Ｙ_３とＹ_４との間に位置しているＧは、トリプルヘリカルドメイン内の最もアミノ末端側に位置しているグリシンを示している。そして、Ｙ_１、Ｙ_２およびＹ_３は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する複数種類のポリペプチド鎖内において、トリプルヘリカルドメインよりもアミノ末端側に位置しているアミノ酸を示している。

上記Ｙ_１〜Ｙ_９の各々は、任意のアミノ酸であり得、アミノ酸の種類は特に限定されない。また、Ｙ_１〜Ｙ_９の各々は、少なくとも一部が同じ種類のアミノ酸であってもよいし、全てが異なる種類のアミノ酸であってもよい。

例えば、Ｙ_１〜Ｙ_９の各々は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンのうちの何れであってもよい。

更に具体的には、Ｙ_３がプロリンであり、Ｙ_１およびＹ_２が任意のアミノ酸であってもよい。

更に具体的には、Ｙ_３がプロリンであり、Ｙ_１およびＹ_２が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）または側鎖に水酸基を含むアミノ酸（ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン）であってもよい。

更に具体的には、Ｙ_３がプロリンであり、Ｙ_１がアラニンまたはセリンであり、Ｙ_２がバリンであってもよい。

このとき、Ｙ_４〜Ｙ_９の具体的な構成は、特に限定されないが、Ｙ_４とＸ_１とが同じアミノ酸であり、Ｙ_５とＸ_２とが同じアミノ酸であり、Ｙ_６とＸ_３とが同じアミノ酸であり、Ｙ_７とＸ_４とが同じアミノ酸であり、Ｙ_８とＸ_５とが同じアミノ酸であり、Ｙ_９とＸ_６とが同じアミノ酸であってもよい。

従来のコラーゲン、および、アテロコラーゲンは、ヒトの体温に近い温度では溶け難い。

一方、本発明に用いるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物は、ヒトの体温に近い温度でも液体状であり得る。それ故に、本実施の形態の分化誘導用組成物をヒトの組織（例えば、骨、脂肪、軟骨、神経）などに用いれば、当該分化誘導用組成物と組織とが馴染み易い。

また、本発明に用いるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物は、従来のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物と比較して、ゲル化し始める濃度が高い。それ故に、従来のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物がゲル化する濃度と同じ濃度の本発明に用いるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を、常温にて安定して保存できる。それ故に、本実施の形態の分化誘導用組成物を、常温にて安定して保存できる。

本発明に用いるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物では、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ_６とＧとの間の化学結合が切断されている。

本発明に用いるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物では、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、Ｘ_６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_７との間の化学結合、または、Ｘ_１４とＧとの間の化学結合が切断されている。

また、本発明に用いるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物では、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ_１とＹ_２との間の化学結合が切断されている。

上記切断は、適宜所望の方法によって行うことができる。

例えば、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを、化学合成法によって作製することが可能である。なお、化学合成法としては、一般的な周知の化学合成法を用いることが可能である。

また、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンをコードするＤＮＡを周知のタンパク質発現ベクターに挿入する。そして、当該タンパク質発現ベクターを所望の宿主（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など）に導入した後、当該宿主内で、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの発現を誘導する。これによって、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを作製することも可能である。

また、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ（例えば、システインプロテアーゼ））によって分解することによって上記切断を行うことも可能である。

上記切断を行う方法の詳細については、後述する。

〔２．コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む分化誘導用組成物の製造方法〕
本実施の形態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む分化誘導用組成物の製造方法は、
Ａ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ_６とＧとの間の化学結合を切断する、切断工程、または、
Ｂ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、Ｘ_６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_７との間の化学結合、または、Ｘ_１４とＧとの間の化学結合を切断する、切断工程、または、
Ｃ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ_１とＹ_２との間の化学結合を切断する、切断工程、を含む製造方法である。

また、本実施の形態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む分化誘導用組成物の製造方法は、以下の切断工程を含む製造方法であってもよい。つまり、
Ｄ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、および、Ｘ_６とＧとの間の化学結合から選択される何れか１つの化学結合を切断する、切断工程、または、
Ｅ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、Ｘ_６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_７との間の化学結合、および、Ｘ_１４とＧとの間の化学結合から選択される何れか１つの化学結合を切断する、切断工程、または、
Ｆ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ_１とＹ_２との間の化学結合を切断する、切断工程。

（１）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−：
（２）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｇ−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｇ−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｇ−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｇ−：
（３）−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｇ−Ｙ_４−Ｙ_５−Ｇ−Ｙ_６−Ｙ_７−Ｇ−Ｙ_８−Ｙ_９−Ｇ−：
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ_１〜Ｘ_１４およびＹ_１〜Ｙ_９は、任意のアミノ酸である）。

以下に、各構成について詳細に説明する。なお、本発明のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物自体については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。

上記切断工程は、（１）〜（３）にて示されるアミノ酸配列の特定の箇所の化学結合を切断する工程であればよく、具体的な構成は特に限定されない。

上記切断工程は、実際にトリプルヘリカルドメイン内の化学結合を切断して、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を作製する工程であってもよい（例えば、酵素法）。

また、既にトリプルヘリカルドメイン内の化学結合が切断されているコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を作製する工程（例えば、化学合成法、組み換えタンパク質の発現）を本願における「切断工程」の概念に含めることもできる。

以下に、上述した切断工程の詳細を説明する。

〔２−１．酵素法に基づく切断工程〕
酵素法に基づく切断工程を採用する場合には、例えば、以下のように切断工程を構成することができる。

上記切断工程は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ（例えば、システインプロテアーゼ））によって分解することによって行うことが可能である。

上記酵素としては特に限定されないが、例えば、システインプロテアーゼを用いることが好ましい。

システインプロテアーゼとしては、塩基性アミノ酸量よりも酸性アミノ酸量の方が多いシステインプロテアーゼ、酸性領域の水素イオン濃度において活性であるシステインプロテアーゼを用いることが好ましい。

このようなシステインプロテアーゼとしては、カテプシンＢ［ＥＣ３．４．２２．１］、パパイン［ＥＣ３．４．２２．２］、フィシン［ＥＣ３．４．２２．３］、アクチニダイン［ＥＣ３．４．２２．１４］、カテプシンＬ［ＥＣ３．４．２２．１５］、カテプシンＨ［ＥＣ３．４．２２．１６］、カテプシンＳ［ＥＣ３．４．２２．２７］、ブロメライン［ＥＣ３．４．２２．３２］、カテプシンＫ［ＥＣ３．４．２２．３８］、アロライン、カルシウム依存性プロテアーゼなどを挙げることが可能である。

これらの中では、パパイン、フィシン、アクチニダイン、カテプシンＫ、アロラインまたはブロメラインを用いることが好ましく、パパイン、フィシン、アクチニダイン、カテプシンＫを用いることが更に好ましい。

上述した酵素は、公知の方法によって入手することができる。例えば、化学合成による酵素の作製；細菌、真菌、各種動植物の細胞または組織からの酵素の抽出；遺伝子工学的手段による酵素の作製；などによって入手することができる。勿論、市販の酵素を用いることも可能である。

コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって分解することによって切断工程を行う場合には、例えば、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法にしたがって切断工程を行うことができる。以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法は、あくまでも切断工程の一例であって、本発明は、これら（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法に限定されない。

なお、以下の（ｉ）および（ｉｉ）の方法は、（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列の特定の箇所の化学結合を切断するために用いられる方法の一例であり、以下の（ｉｉｉ）の方法は、（３）にて示されるアミノ酸配列の特定の箇所の化学結合を切断するために用いられる方法の一例である。

（ｉ）高濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。

（ｉｉ）高濃度の塩と接触させた後の酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法。

（ｉｉｉ）低濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。

上述した（ｉ）の方法の具体例としては、例えば、高濃度の塩を含む水溶液中で、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法を挙げることができる。

上述した（ｉｉ）の方法の具体例としては、例えば、高濃度の塩を含む水溶液と酵素とを予め接触させ、その後、当該酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法を挙げることができる。

上述した（ｉｉｉ）の方法の具体例としては、例えば、低濃度の塩を含む水溶液中で、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法を挙げることができる。

上記水溶液の具体的な構成としては特に限定されないが、例えば、水を用いることが可能である。

上記塩の具体的な構成としては特に限定されないが、塩化物を用いることが好ましい。塩化物としては、特に限定されないが、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌまたはＭｇＣｌ_２を用いることが可能である。

上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は特に限定されないが、高いほど好ましいといえる。例えば、当該濃度は、２００ｍＭ以上であることが好ましく、５００ｍＭ以上であることがより好ましく、１０００ｍＭ以上であることがより好ましく、１５００ｍＭ以上であることがより好ましく、２０００ｍＭ以上であることが最も好ましい。

上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度の上限値は、特に限定されないが、例えば２５００ｍＭであり得る。塩の濃度が２５００ｍＭよりも高くなると、タンパク質の多くが塩析してしまい、その結果、酵素によるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解効率が低下する傾向を示す。一方、塩の濃度が２５００ｍＭ以下であれば、酵素によるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解効率を高くすることができる。

したがって、上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は、２００ｍＭ以上２５００ｍＭ以下であることが好ましく、５００ｍＭ以上２５００ｍＭ以下であることがより好ましく、１０００ｍＭ以上２５００ｍＭ以下であることがより好ましく、１５００ｍＭ以上２５００ｍＭ以下であることがより好ましく、２０００ｍＭ以上２５００ｍＭ以下であることが最も好ましい。

上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度が高いほど、酵素によるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの切断箇所の特異性を上げることができる。その結果、本発明に用いるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を、より均一で、かつ、生理活性が高いものにすることができる。

上記低濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は特に限定されないが、低いほど好ましいといえる。例えば、当該濃度は、２００ｍＭよりも低いことが好ましく、１５０ｍＭ以下であることがより好ましく、１００ｍＭ以下であることがより好ましく、５０ｍＭ以下であることがより好ましく、略０ｍＭであることが最も好ましい。

上記水溶液（例えば、水）に溶解させるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの量は特に限定されないが、例えば、１０００重量部〜１００００重量部の水溶液に対して、１重量部のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを溶解させることが好ましい。

上記構成であれば、水溶液に対して酵素が加えられた場合、当該酵素とコラーゲンまたはアテロコラーゲンとを効率よく接触させることができる。そして、その結果、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって効率よく分解することができる。

上記水溶液に加える酵素の量は特に限定されないが、例えば、１００重量部のコラーゲンまたはアテロコラーゲンに対して、１０重量部〜２０重量部の酵素を加えることが好ましい。

上記構成であれば、水溶液中の酵素の濃度が高いので、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって効率よく分解することができる。

水溶液中でコラーゲンまたはアテロコラーゲンと酵素とを接触させるときの他の条件（例えば、水溶液のｐＨ、温度、接触時間など）も特に限定されず、適宜、設定することができるが以下の範囲であることが好ましい。

１）水溶液のｐＨは、ｐＨ２．０〜７．０が好ましく、ｐＨ２．５〜６．５が更に好ましい。水溶液のｐＨを上述した範囲に保つために、水溶液に対して周知のバッファーを加えることが可能である。上記ｐＨであれば、水溶液中にコラーゲンまたはアテロコラーゲンを均一に溶解することができ、その結果、酵素反応を効率よく進めることができる。

２）温度は特に限定されず、用いる酵素に応じて温度を選択すればよい。例えば、当該温度は、１５℃〜４０℃であることが好ましく、２０℃〜３５℃であることがより好ましい。

３）接触時間は特に限定されず、酵素の量、および／または、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの量に応じて接触時間を選択すればよい。例えば、当該時間は、１時間〜６０日間であることが好ましく、１日間〜７日間であることがより好ましく、３日間〜７日間であることがさらに好ましい。

なお、水溶液中でコラーゲンまたはアテロコラーゲンと酵素とを接触させた後、必要に応じて、ｐＨを再調整する工程、酵素を失活させる工程、および、不純物を除去する工程からなる群より選択される少なくとも１つの工程を経てもよい。

また、上記不純物を除去する工程は、物質を分離するための一般的な方法によって行うことができる。上記不純物を除去する工程は、例えば、透析、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、または、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどによって行うことができる。

上述したように、切断工程は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素によって分解することによって行うことが可能である。このとき、分解されるコラーゲンまたはアテロコラーゲンは、生体組織中に含有された状態のものであってもよい。つまり、切断工程は、生体組織と酵素とを接触させることによって行うことも可能である。

生体組織としては、特に限定されず、その例として哺乳類または鳥類の真皮、腱、骨または筋膜、あるいは、魚類の皮膚または鱗を用いることができる。

高い生理活性を維持し、かつ、多量にコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を得るという観点からは、生体組織として骨を用いることが好ましい。

生体組織として骨を用いる場合、酸性条件下で骨と酵素とを接触させることが好ましい。例えば、上記酸性条件としては、好ましくはｐＨ２．５〜６．５、更に好ましくはｐＨ２．５〜５．０、更に好ましくはｐＨ２．５〜４．０、最も好ましくはｐＨ２．５〜３．５である。

より具体的に、本発明のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、上記システインプロテアーゼと骨とを接触させることによって、該骨に含まれるコラーゲンと、上記システインプロテアーゼとを接触させることが好ましい。

また、本発明のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、２００ｍＭ以上の濃度の塩の存在下にて、骨と、システインプロテアーゼとを接触させることが好ましい。

また、本発明のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、２００ｍＭ以上の濃度の塩と接触させた後のシステインプロテアーゼと、骨とを接触させることが好ましい。

また、本発明のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、２００ｍＭよりも低い濃度の塩の存在下にて、骨と、システインプロテアーゼとを接触させることが好ましい。

〔２−２．化学合成法〕
化学合成法に基づく切断工程を採用する場合には、例えば、以下のように切断工程を構成することができる。

まず、周知のデータベースから、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する各ポリペプチド鎖のアミノ酸配列の情報を入手する。なお、当該ポリペプチド鎖は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのタイプに応じて適宜選択すればよく、１種類のポリペプチド鎖であってもよく、複数の種類のポリペプチド鎖であってもよい。

次いで、上記ポリペプチドの中から、切断されるべき化学結合を含むポリペプチド鎖および切断されるべき化学結合の位置を決定するとともに、当該化学結合が切断されたと想定したときの、所望のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を決定する。

最後に、決定されたアミノ酸配列にしたがって、所望のポリペプチド鎖を周知の化学合成法によって合成する。

以上のようにして、切断工程を実施することができる。

本実施の形態の分化誘導用組成物の製造方法は、上述した切断工程以外の工程を含むことも可能である。

例えば、本実施の形態の分化誘導用組成物の製造方法は、所望のポリペプチド鎖を周知の化学合成法によって合成した後で、合成されたポリペプチド鎖を精製する工程を含んでいてもよい。なお、当該精製は、適宜、周知のカラムを用いて行えばよい。

本実施の形態の分化誘導用組成物の製造方法は、所望のポリペプチド鎖と、他のポリペプチド鎖とを混合する工程を含んでいてもよい。なお、他のポリペプチド鎖としては特に限定されず、同様に化学結合が切断されているポリペプチド鎖であってもよいし、化学結合が切断されていないポリペプチド鎖であってもよい。

〔２−３．組み換えタンパク質の発現に基づく切断工程〕
組み換えタンパク質の発現に基づく切断工程を採用する場合には、例えば、以下のように切断工程を構成することができる。

次いで、上記ポリペプチドの中から、切断されるべき化学結合を含むポリペプチド鎖および切断されるべき化学結合の位置を決定するとともに、当該化学結合が切断されたと想定したときの、所望のポリペプチド鎖のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を決定する。

次いで、所望のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡを周知のタンパク質発現ベクターに挿入する。そして、当該タンパク質発現ベクターを所望の宿主（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など）に導入した後、当該宿主内で、化学結合が切断された後のポリペプチド鎖を発現させる。

以上のようにして、切断工程を実施することができる。

例えば、本実施の形態の分化誘導用組成物の製造方法は、宿主内で、所望のポリペプチド鎖を発現させた後で、発現したポリペプチド鎖を精製する工程を含んでいてもよい。なお、当該精製は、適宜、周知のカラムを用いて行えばよい。

〔３．分化誘導用組成物の用途〕
本実施の形態の分化誘導用組成物は、細胞が分化することを誘導するものである。

更に具体的に、本実施の形態の分化誘導用組成物は、骨（具体的には、骨芽細胞）、脂肪、軟骨、神経などに細胞が分化することを誘導するものである。

本実施の形態の分化誘導用組成物中には、分化誘導活性を有する主成分として、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物が含まれている。

本実施の形態の分化誘導用組成物中に含まれる、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物の量は特に限定されないが、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物の量が多いほど、分化誘導効果が高いので、好ましい。

例えば、本実施の形態の分化誘導用組成物中に、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物が、０．１重量％〜１００重量％含まれていてもよいが、その中でも５０重量％〜１００重量％含まれていることが好ましく、さらに９０重量％〜１００重量％含まれていることがより好ましく、１００重量％含まれていることが最も好ましい。

また、本実施の形態の分化誘導用組成物には、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物以外の構成が添加されていてもよい。これらの構成としては特に限定されず、適宜、所望の構成を添加することができる。

本発明は、以下のように構成することも可能である。

＜１＞本発明の分化誘導用組成物は、上記課題を解決するために、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む、細胞の分化を誘導するための分化誘導用組成物であって、上記分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいることを特徴としている。

＜２＞本発明の分化誘導用組成物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ_６とＧとの間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_３との間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、Ｘ_６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_７との間の化学結合、または、Ｘ_１４とＧとの間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ_１とＹ_２との間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、を含む、ことが好ましい。つまり、
（１）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−；
（２）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｇ−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｇ−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｇ−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｇ−；
（３）−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｇ−Ｙ_４−Ｙ_５−Ｇ−Ｙ_６−Ｙ_７−Ｇ−Ｙ_８−Ｙ_９−Ｇ−；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ_１〜Ｘ_１４およびＹ_１〜Ｙ_９は、任意のアミノ酸である）。

＜３＞本発明の分化誘導用組成物では、上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列は、上記トリプルヘリカルドメインのアミノ末端のアミノ酸配列であることが好ましい。

＜４＞本発明の分化誘導用組成物では、上記（１）〜（３）の何れかにて示されるアミノ酸配列における切断が、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのα１鎖内およびα２鎖内の少なくとも一方で行われていることが好ましい。

＜１．ブタ由来のα１鎖の切断における、塩濃度の影響＞
塩化ナトリウムの濃度が０ｍＭ、２００ｍＭ、１０００ｍＭ、１５００ｍＭまたは２０００ｍＭである５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。

アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、非特許文献２参照）。

次いで、塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ブタ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ブタ由来のＩ型コラーゲンを含む当該溶液と、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。

上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。

次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。

なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。

表１に、塩濃度が０ｍＭ、２００ｍＭ、１０００ｍＭ、１５００ｍＭまたは２０００ｍＭの場合のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。

表１に示すように、塩濃度が異なると、α１鎖内の切断箇所が異なることが明らかになった。より具体的には、塩濃度が低いと（例えば、０ｍＭ）、トリプルヘリカルドメインの外で切断が生じ、塩濃度が高いと（例えば、２００ｍＭ以上）、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。

塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所であった。

なお、塩濃度を変化させると、分解物中に含まれる、配列番号２にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号３にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、の比率が異なった。分解物を大量に調製しようとすると、塩濃度が２０００ｍＭを超えるとＮａＣｌが不溶化した。分解物を大量に調製する場合、塩濃度の上限値を５００ｍＭまたは８００ｍＭに設定することが好ましいと考えられる。

＜２．ラットおよびニワトリ由来のα１鎖の切断における、塩濃度の影響＞
塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。

アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。

次いで、塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ラット尾部由来のＩ型コラーゲン、または、ニワトリ皮部由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ラット尾部由来のＩ型コラーゲン、または、ニワトリ皮部由来のＩ型コラーゲンと、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した＜１＞の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ラット尾部由来のＩ型コラーゲン、および、ニワトリ皮部由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。

表２に、塩濃度が２０００ｍＭの場合のラット由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるラット由来のα１鎖の部分構造（塩濃度の欄が「−」であるデータを参照）を示す。

表３に、塩濃度が２０００ｍＭの場合のニワトリ由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるニワトリ由来のα１鎖の部分構造（塩濃度の欄が「−」であるデータを参照）を示す。

表２および３に示すように、異なる種に由来するα１鎖であっても、塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。

＜３．塩の種類に関する検討＞
ＭｇＣｌ_２の濃度が５００ｍＭである水溶液、および、ＫＣｌの濃度が２００ｍＭである水溶液を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。

上記水溶液の各々に対し、アクチニダインと、ブタ由来のＩ型コラーゲンとを混合した後、１０日以上、２０℃にて反応させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した＜１＞の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。

上述した分解物の各々をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、α１鎖の分解物を分離した。

表４に、ＭｇＣｌ_２の濃度が５００ｍＭである水溶液を用いた場合、および、ＫＣｌの濃度が２００ｍＭである水溶液を用いた場合のブタ由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるブタ由来のα１鎖の部分構造（塩濃度の欄が「−」であるデータを参照）を示す。

表４に示すように、異なる種類の塩であっても、トリプルヘリカルドメインの中で切断が生じることが明らかになった。

異なる種類の塩を用いた場合の切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所であった。

＜４．システインプロテアーゼの種類に関する検討＞
本実施例では、システインプロテアーゼの一種であるカテプシンＫを用いて、高塩濃度条件下におけるα１鎖の切断箇所を検討した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。

塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。

カテプシンＫを活性化するため、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、カテプシンＫを溶解し、４５分間、２５℃にて静置した。なお、カテプシンＫとしては、市販のものを利用した。

次いで、塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ニワトリ由来のＩ型コラーゲン、または、ブタ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。カテプシンＫを含む水溶液と、ニワトリ由来のＩ型コラーゲン、または、ブタ由来のＩ型コラーゲンを含む当該溶液と、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、ニワトリ由来のＩ型コラーゲン、および、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。

表５に、ブタ由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるブタ由来のα１鎖の部分構造（塩濃度の欄が「−」であるデータを参照）を示す。

表５に示すように、システインプロテアーゼの一種であるカテプシンＫであっても、塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。

また、表５に示すように、システインプロテアーゼの一種であるカテプシンＫの場合には、複数種類の切断箇所が確認された。

なお、ニワトリ由来のＩ型コラーゲンの分解物の場合、ニワトリ由来のα１鎖の分解物は、下記配列番号１１および１２に対応するニワトリ由来のα１鎖の分解物と、下記配列番号１０におけるアミノ末端から数えて１０番目の「Ｓ」と１１番目の「Ｇ」との間の化学結合が切断されたものに対応するニワトリ由来のα１鎖の分解物と、が確認された。

＜５．ブタ由来のα１鎖の切断における、透析塩濃度の影響＞
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、非特許文献２参照）。アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。

次いで、塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ブタ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ブタ由来のＩ型コラーゲンと、を３日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。また、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。

表６に、透析塩濃度が２０００ｍＭの場合のブタ由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるブタ由来のα１鎖の部分構造（塩濃度の欄が「−」であるデータを参照）を示す。

表６に示すように、透析塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。

＜６．ヒト由来のα１鎖の切断における、透析塩濃度の影響＞
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、非特許文献２参照）。アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。

次いで、塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）に対し、ヒト由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ヒト由来のＩ型コラーゲンと、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。また、ヒト由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。

表７に示すように、透析塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。

＜７．魚類由来のα１鎖の切断＞
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。

次いで、塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、魚類（具体的には、キハダマグロ）由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、魚類由来のＩ型コラーゲンと、を３日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した＜１＞の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、魚類由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。

次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖（魚類由来のＩ型コラーゲン）の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。

表８に、透析外液の塩濃度が２０００ｍＭの場合の、魚類由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。なお、表８に示すように、α１鎖（魚類由来のＩ型コラーゲン）の分解物としては２種類検出され、これらの分解物の各々のアミノ末端のアミノ酸配列として、配列番号１８および１９に示すアミノ酸配列を同定することに成功した。

＜８．ヒト由来のα２鎖の切断＞
＜４＞と同様にカテプシンＫを活性化するため、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、カテプシンＫを溶解し、４５分間、２５℃にて静置した。

次いで、塩を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対し、ヒト由来のＩ型コラーゲンを溶解した。カテプシンＫを含む水溶液と、ヒト由来のＩ型コラーゲンと、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、カテプシンＫとしては、上述した＜１＞の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ヒト由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。

次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα２鎖（ヒト由来のＩ型コラーゲン）の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。

表９に、反応液の塩濃度が２００ｍＭの場合の、ヒト由来のα２鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。

＜９．ニワトリ由来のα２鎖の切断＞
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。

次いで、塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ニワトリ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ニワトリ由来のＩ型コラーゲンと、を７日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した＜１＞の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ニワトリ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。

次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα２鎖（ニワトリ由来のＩ型コラーゲン）の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。

表１０に、透析外液の塩濃度が２０００ｍＭの場合の、ニワトリ由来のα２鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。

表に示すように、異なる種に由来するα１鎖またはα２鎖であっても、塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所であった。

＜１０．コラーゲンの分解物のスフェロイド誘導能に関する試験−１＞
上述したコラーゲンの分解物（塩濃度２００ｍＭにおける、ブタ由来のα１鎖の分解物）と接触させた、市販の培養用プレートを試験に用いた。

各培養用プレートに細胞（マウス骨芽細胞前駆細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サブクローン４）を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下にて培養を行った。

培養を開始してから所定の時間が経過した後の細胞を、顕微鏡にて観察した。

各細胞の顕微鏡写真を、図１〜７に示す。

具体的に、図１（ａ）および（ｂ）は、マウス骨芽細胞前駆細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サブクローン４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２５９３，住商ファーマインターナショナル株式会社）の顕微鏡写真を示す。

図１において、「ＰＨＣｏｌ」は、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンと接触させた培養用プレートの結果を示し、「ＬＡＳＣｏｌ」は、本実施例のコラーゲンの分解物と接触させた培養用プレートの結果を示している。

また、図１において、各図面に記載した時間は、培養時間を示している。

図１から明らかなように、本実施例のコラーゲンの分解物は、スフェロイド誘導能を有していることが明らかになった。

＜１１．コラーゲンの分解物のスフェロイド誘導能に関する試験−２＞
上述したコラーゲンの分解物（塩濃度２００ｍＭにおける、ブタ由来のα１鎖の分解物）と接触させた、市販の培養用プレートを試験に用いた。

各培養用プレートに細胞（マウス線維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３（ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２７６７，独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター））を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下にて培養を行った。

培養を開始してから所定の時間が経過した後の細胞を、顕微鏡にて観察した。顕微鏡写真を図２に示す。なお、図２において、「ＬＡＳＣｏｌ」は、本実施例のコラーゲンの分解物と接触させた培養用プレートの結果を示し、「ＣＰＣｏｌ」は、従来のコラーゲン分解物（ＷＯ２００４／０２０４７０参照）と接触させた培養用プレートの結果を示している。

図２から明らかなように、本実施例のコラーゲンの分解物は、従来のコラーゲンの分解物と比較して、早くスフェロイドを形成できるばかりでなく、大きなスフェロイドを形成できることが明らかになった。

＜１２．分化誘導能に関する試験−１＞
上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物と接触させた、市販の培養用プレート（マイクロ・ディッシュ３５ｍｍ（μ−Ｄｉｓｈ３５ｍｍ）未コーティング，Ｃａｔ．＃：ｉｂ８１１５１，日本ジェネティックス株式会社）を、試験に用いた。

また、対照試験としては、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲン（セルマトリックスＴｙｐｅ−ＩＣ，新田ゼラチン株式会社）と接触させた培養用プレート（ｉｂｉｄｉ μ−Ｄｉｓｈ３５ｍｍ未コーティング，Ｃａｔ．＃：ｉｂ８１１５１，日本ジェネティックス株式会社）、コラーゲンの分解物と接触させていない培養用プレート（ｉｂｉｄｉ μ−Ｄｉｓｈ３５ｍｍ表面処理ｉｂｉＴｒｅａｔ，Ｃａｔ．＃：ｉｂ８１１５６，日本ジェネティックス株式会社）、および、市販のＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ（登録商標）ＤｉｓｈＭＨパターン（Ｃａｔ．＃：ＮＣＤ−ＬＨ３５−５、ＳＣＩＶＡＸ社）の、３種類の培養用プレートを用いた。

以下に、試験方法および試験結果について説明する。

まず、上述した４種類の培養用プレートの各々に、基本培地（α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ）中に懸濁したマウス骨芽細胞前駆細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サブクローン４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２５９３，住商ファーマインターナショナル株式会社）を播種した。そして、当該培養用プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下にて、２４時間培養した。

２４時間の培養の後、培養用プレート内の基本培地を、骨芽細胞分化誘導培地（α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５０μｇ−アスコルビン酸／ｍＬ、３．５ｍＭ β−グリセロリン酸）に完全に置換した。

３日毎に、培養用プレート内の骨芽細胞分化誘導培地を、新鮮な骨芽細胞分化誘導培地に交換しながら、培養を続けた。

培養用プレート内の基本培地を骨芽細胞分化誘導培地に交換してから、１０日後、１４日後、２１日後に、アリザリンレッド染色キット（品番ＡＲＤ−Ａ１，株式会社ＰＧ）にてマウス骨芽細胞前駆細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サブクローン４を染色し、マウス骨芽細胞前駆細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サブクローン４の石灰化を確認した。なお、アリザリンレッド染色は、周知の方法にしたがって行った。

図３〜６に、アリザリンレッド染色の結果を示す。具体的に、図３には、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物と接触させた市販の培養用プレートを用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示し、図４には、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンと接触させた培養用プレートを用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示し、図５には、コラーゲンの分解物と接触させていない培養用プレートを用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示し、図６には、市販のＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅＤｉｓｈ（ＳＣＩＶＡＸ社）を用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示している。

図３に示すように、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物と接触させた市販の培養用プレートを用いた場合には、培養用プレート内の基本培地を骨芽細胞分化誘導培地に交換してから１０日が経過すると、スフェロイドの中心付近が赤く染まり、細胞の石灰化が確認された。

石灰化量は、分化誘導日数に伴って増加した。また、本願のスフェロイド以外の細胞では、石灰化が確認されなかった。つまり、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物が、細胞の石灰化を促進することが示された。

一方、図４〜６に示すように、対照試験である３種類の培養用プレートでは、培養用プレート内の基本培地を骨芽細胞分化誘導培地に交換してから２１日が経過しても、細胞が染色されなかった。つまり、対照試験である３種類の培養用プレートでは、培養用プレート内の基本培地を骨芽細胞分化誘導培地に交換してから２１日が経過しても、細胞の石灰化が観察されなかった。

特に、市販のＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅＤｉｓｈ（ＳＣＩＶＡＸ社）を用いた場合には、３日に１度の培地交換によって、多くの細胞が、培養用プレートから浮遊してしまった。そして、培養用プレート内の基本培地を骨芽細胞分化誘導培地に交換してから２１日が経過した後には、播種された細胞の略８〜９割が失われていた。更に、アリザリンレッド染色の処理の過程でも、多くの細胞が培養用プレートから浮遊して失われた。

＜１３．分化誘導能に関する試験−２＞
上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物と接触させた、市販の培養用プレートを、試験に用いた。

また、対照試験としては、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンと接触させた培養用プレート、市販の培養用プレート（ペプシン処理されたブタ腱由来Ｉ型コラーゲンと接触された培養用プレート：品番４０００−０１０，ＩＷＡＫＩサイテック社製）、および、コラーゲンの分解物と接触させていない培養用プレートを用いた。

以下に、試験方法および試験結果について説明する。

まず、上述した４種類の培養用プレートの各々に、骨髄細胞用培地（ＢＭＣＭ：Primary Cell Co., Ltd）中に懸濁したラット骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＣ０１：Primary Cell Co., Ltd）を播種した。そして、当該培養用プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下にて、２４時間培養した。

２４時間の培養の後、培養用プレート内の骨髄細胞用培地を、骨形成培地（ＯＧＣＭＯ：Primary Cell Co., Ltd）に完全に置換した。

３日毎に、培養用プレート内の骨形成培地を、新鮮な骨形成培地に交換しながら、培養を続けた。

培養用プレート内の骨髄細胞用培地を骨形成培地に交換してから、経時的に、アリザリンレッド染色にてラット骨髄間葉系幹細胞を染色し、ラット骨髄間葉系幹細胞の石灰化を確認した。なお、アリザリンレッド染色は、周知の方法にしたがって行った。

図７に、アリザリンレッド染色の結果を示す。具体的に、図７の「ＬＡＳＣｏｌ」は、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物と接触させた市販の培養用プレートを用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示し、図７の「ＰＨＣｏｌ」は、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンと接触させた培養用プレートを用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示し、図７の「ＰＨＣｏｌ（ＩＷＡＫＩ）」は、市販の培養用プレート（ＩＷＡＫＩサイテック社製）を用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示し、図７の「ＮｏｎＣｏａｔ」は、コラーゲンの分解物と接触させていない培養用プレートを用いた場合のアリザリンレッド染色の染色結果の写真を示している。

「ＬＡＳＣｏｌ」では、培地を交換してから９日後において、顕著に石灰化が認められた。このとき、顕微鏡にて観察すると、「ＬＡＳＣｏｌ」では、「ＰＨＣｏｌ（ＩＷＡＫＩ）」および「ＮｏｎＣｏａｔ」と比較して、培養用プレート上に存在する細胞の数が顕著に少なかった。このことは、「ＰＨＣｏｌ（ＩＷＡＫＩ）」および「ＮｏｎＣｏａｔ」と比較して、「ＬＡＳＣｏｌ」は、細胞数当たりの石灰化能が著しく高いことを示している。

また、「ＬＡＳＣｏｌ」では、培養時間の経過に伴って、培養用プレート全体の染色強度が著しく増強された（例えば、図７の「１２ｄａｙｓ」および「１５ｄａｙｓ」参照）。

一方、「ＰＨＣｏｌ」では、培養を開始してから３日経過すると、培養用プレートの表面上のペプシン処理されたＩ型コラーゲンが剥がれる傾向を示した。そして、「ＰＨＣｏｌ」では、培地を交換してから７日後および１０日後において、石灰化は認められなかった。

「ＰＨＣｏｌ（ＩＷＡＫＩ）」および「ＮｏｎＣｏａｔ」では、培地を交換してから６日後において、わずかに石灰化が認められ、培地を交換してから９日後には、石灰化が少し促進される傾向を示した。

＜１４．分化誘導能に関する試験−３＞
上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物と接触させた、市販の培養用プレート（ｉｂｉｄｉ μ−Ｄｉｓｈ（未コーティング），日本ジェネティックス株式会社）を、試験に用いた。

また、対照試験としては、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲン（セルマトリックスＴｙｐｅ−ＩＣ，新田ゼラチン株式会社）と接触させた培養用プレート（ｉｂｉｄｉ μ−Ｄｉｓｈ（未コーティング），日本ジェネティックス株式会社）、および、コラーゲンの分解物と接触させていない培養用プレート（ｉｂｉｄｉ μ−Ｄｉｓｈ（未コーティング），日本ジェネティックス株式会社）の、２種類の培養用プレートを用いた。

各培養用プレートに、ラット骨髄間葉系幹細胞を同数播種した。

各培養用プレート内の培地を、数日ごとに、骨芽細胞分化培地（プライマリーセル社製）に交換した。

播種してから１１日後に、グルタルアルデヒド液を用いて、各培養用プレート内の細胞を固定化した。

常法にしたがって細胞を脱水処理した後に、各培養用プレートを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（日立ハイテク株式会社製、ＳＵ３５００）にて観察するとともに、元素分析を行った。

図８〜１０に、元素分析の結果を示す。具体的に、図８は、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物と接触させた、市販の培養用プレートを用いた場合の元素分析の結果を示し、図９は、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンと接触させた培養用プレートを用いた場合の元素分析の結果を示し、図１０は、コラーゲンの分解物と接触させていない培養用プレートを用いた場合の元素分析の結果を示す。

図８に示すように、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物と接触させた、市販の培養用プレートを用いた場合、強い「Ｃａ」および「Ｐ」のピークが観察された。このことは、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物が、細胞の石灰化を著しく促進したことを示している。

また、「Ｃａ」および「Ｐ」のピークに加えて「Ｎａ」のピークも観察されていることから、細胞が石灰化して生じた産物が、バイオアパタイトであることが示唆された。

一方、図９に示すように、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンと接触させた培養用プレートを用いた場合、弱い「Ｃａ」および「Ｐ」のピークしか観察されなかった。このことは、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンは、細胞の石灰化を促進する効果が低いことを示している。

また、図１０に示すように、コラーゲンの分解物と接触させていない培養用プレートを用いた場合、「Ｃａ」および「Ｐ」のピークは、ほとんど観察されなかった。このことは、細胞の石灰化が誘導されなかったことを示している。

＜１５．分化誘導能に関する試験−４＞
本実施例では、ｉｎｖｉｖｏにおける、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物の骨形成能力を試験した。以下に、試験方法および試験結果について説明する。

本試験に該当する動物実験の立案、および、実験動物の飼養と管理とについては、近畿大学動物実験規定に準じて実施した。

ラット（雄、ＳＰＦ、Ｋｗｌ：ＳＤ、１２週齢）の腹腔内にペントバルビタール（ネンブタール）を注射して、上記ラットに対して麻酔を施した。

ラットの体重を測定した。埋植前のラットの体重は、略４００ｇであった。

手術台にラットを固定した後、大腿部を剃毛し、剃毛された大腿部を消毒した。

４％のキシロカインを用いて、上記ラットの大腿部に対して局部麻酔を施した。

上記ラットの大腿部を切開して、骨を露出させた。具体的には、メスとハサミとを用いて、大腿部の皮膚と肉とを分離した。次いで、ピンセットとメスとを用いて骨膜を剥離した後、骨を露出させた。

脛骨の内側側副靭帯の付着部付近に、直径２．５ｍｍの穴を開孔した。なお、当該穴は、骨を貫通することなく、骨髄腔に達する程度の深さの穴であった。

上記穴の中に、凍結乾燥したコラーゲン分解物（略２〜３ｍｇ）、または、ｉｉ）凍結乾燥したコラーゲン分解物（２〜３ｍｇ）とラット骨髄間葉系幹細胞（骨形成培地にて１日間培養したラット骨髄間葉系幹細胞をＰＢＳ（−）にて洗浄したもの）との混合物、を配置した。また、対照試験として、穴を開孔したものの、当該穴に何も配置しなかったラットも用意した。

なお、上記コラーゲン分解物としては、ａ）上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物、または、ｂ）市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲン、を用いた。

皮膚の下の筋組織を、外科的に３〜５箇所程度縫合した。

抗生物質を含むＰＢＳ（−）を用いて患部を洗浄して、ラットに対して、化膿防止処置を施した。

切開された皮膚を縫合した後、患部を消毒した。

麻酔の覚醒後、ラットを一匹ずつ、隔離して飼育した。飼育環境を、空調システムにて室温２３±２℃、湿度５０％の条件下とし、飼料を、不断給餌とし、飲水は、自由摂取とした。

１５日間飼育した後、ラットを安楽死処置させた。

１０％ホルマリン溶液を用いて当該ラットの脚部を固定した後、上述した穴の近傍の組織を、周知の方法にしたがってヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）した。

ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）の結果を、図１１〜１４に示す。具体的に、図１１は、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物のみを穴の中に配置した場合の染色像を示し、図１２は、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物とラット骨髄間葉系幹細胞との混合物を穴の中に配置した場合の染色像を示し、図１３は、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンのみを穴の中に配置した場合の染色像を示し、図１４は、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンとラット骨髄間葉系幹細胞との混合物を穴の中に配置した場合の染色像を示している。

図１１および１２に示すように、「上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物のみ」および「上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物とラット骨髄間葉系幹細胞との混合物」を穴の中に配置した場合には、移植されたコラーゲンが生体に吸収されて消失しており、骨の再生が良好に誘導されていることが明らかになった。

なお、「上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物のみ」を穴の中に配置した場合と比較して、「上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物とラット骨髄間葉系幹細胞との混合物」を穴の中に配置した場合の方が、より良く骨の再生が誘導されていた。

一方、図１３および１４に示すように、「市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンのみ」および「市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンとラット骨髄間葉系幹細胞との混合物」を穴の中に配置した場合には、移植されたコラーゲンが穴の中に残っており（例えば、図中の枠内のスポンジ状の部分参照）、骨の再生が良好に誘導されていないことが明らかになった。

以下の表１１に、コラーゲン分解物を埋植する前のラットの体重（Ａ）、コラーゲン分解物を埋植してから１５日後（安楽死させる直前）のラットの体重（Ｂ）、体重の増加量（Ｃ）、および、体重の増加率（Ｄ）を示す。

なお、表１１において、「ＬＡＳＣｏｌ」は、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物のみを穴の中に配置した場合の結果を示し、「ＬＡＳＣｏｌ＋ｒＭＳＣ」は、上述した＜１＞に記載したコラーゲンの分解物とラット骨髄間葉系幹細胞との混合物を穴の中に配置した場合の結果を示し、「ＰＨＣｏｌ」は、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンのみを穴の中に配置した場合の結果を示し、「ＰＨＣｏｌ＋ｒＭＳＣ」は、市販のペプシン処理されたＩ型コラーゲンとラット骨髄間葉系幹細胞との混合物を穴の中に配置した場合の結果を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、穴を開孔したものの、当該穴に何も配置しなかった場合の結果を示している。

表１１に示すように、「ＬＡＳＣｏｌ」および「ＬＡＳＣｏｌ＋ｒＭＳＣ」における体重増加率は、他の試験結果の略２倍であった。

このことは、本実施例の分化誘導用組成物は、ラットの活動量および摂食量の健全性を保つことができ、細胞の分化の誘導によって、非常に好適であることを示している。

また、手術を一切行っていない通常飼育のラットの体重の平均増加量は、試験期間中において約１００ｇであるのに対し、「ＬＡＳＣｏｌ」および「ＬＡＳＣｏｌ＋ｒＭＳＣ」の場合は、表１１に示すように体重の平均増加量が９０ｇであった。従って、この比較からも、本実施例の分化誘導用組成物は、ラットの活動量および摂食量の健全性を保つことができ、骨の治癒具合が極めて良好であることを示している。

＜１６．分化誘導能に関する試験−５＞
上述したコラーゲンの分解物（塩濃度２００ｍＭにおける、ブタ由来のコラーゲンの分解物）と接触させた、市販の培養用プレートを試験に用いた。マウス線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）を１０％ＣＳＤＭＥＭ培地中に懸濁した後、上述した培養用プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。

試験結果を図１５に示す。図１５において、「ＬＡＳＣｏｌ」は、本実施例のコラーゲン分解物と接触させた培養用プレートの結果を示し、「ＮｏｎＣｏａｔ（Ｐｌａｓｔｉｃ）」は、市販のプラスチックプレートの結果を示し、「アテロコラーゲン」は、市販のアテロコラーゲンコートプレートの結果を示している。

図１５から明らかなように、培養１８日後、「アテロコラーゲン」および「ＮｏｎＣｏａｔ（Ｐｌａｓｔｉｃ）」では、細胞が、足場から離脱してシュリンクして死んだ。一方、「ＬＡＳＣｏｌ」では、細胞が、足場と接着したままでスフェロイドの形態を維持していた。

培養２５日後、「ＬＡＳＣｏｌ」にて培養した細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁株式会社）で蛍光染色することにより、細胞の生存を確認した。以上の結果から、本実施例のコラーゲン分解物は、細胞の長期培養に適していることが明らかになった。

上述したコラーゲンの分解物（塩濃度２００ｍＭにおける、ブタ由来のコラーゲンの分解物）と接触させた、市販の培養用プレートを試験に用いた。初代ヒト間葉系幹細胞（ＬＯＮＺＡ社）を当該細胞に専用の増殖培地（ＭＳＣＢＭ＋ＭＳＣＧＭ、ＬＯＮＺＡ社）中に懸濁した後、上述した培養用プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１日間培養し、当該細胞を培養プレート上に接着させた。

細胞が接着した後、培地の全量を骨芽細胞誘導培地（ＭＳＣＧＭ、ＬＯＮＺＡ社）に交換した。以後、３日毎に骨芽細胞誘導培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１５日間培養した。１５日後、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色（タカラバイオ）によって、初代ヒト間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化度を調べた。

試験結果を図１６に示す。図１６において、「ＬＡＳＣｏｌ」は、本実施例のコラーゲン分解物と接触させた培養用プレートの結果を示し、「アテロコラーゲン」は、市販のアテロコラーゲンコートプレートの結果を示し、「ＮｏｎＣｏａｔ（Ｐｌａｓｔｉｃ）」は、市販のプラスチックプレートの結果を示している。図１６から明らかなように、本実施例のコラーゲン分解物は、骨芽細胞への分化を著しく促進することが明らかになった。

細胞が接着した後、培地の全量を軟骨細胞誘導培地（ＧＩＢＣＯ）に交換した。以後、３日毎に軟骨細胞誘導培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１５日間培養した。１５日後、細胞が産生した軟骨基質をアルシアンブルー染色（ｐＨ２．５）（ナカライテスク株式会社、３７１５４−４４）で調べた。

試験結果を図１７に示す。図１７において、「ＬＡＳＣｏｌ」は、本実施例のコラーゲン分解物と接触させた培養用プレートの結果を示し、「ＮｏｎＣｏａｔ（Ｐｌａｓｔｉｃ）」は、市販のプラスチックプレートの結果を示している。図１７から明らかなように、本実施例のコラーゲン分解物は、軟骨細胞分化に有効なスフェロイドを初代ヒト間葉系幹細胞が自発的に形成することを誘導し、更に、軟骨細胞への分化を示すアルシアンブルー染色陽性の軟骨基質の産生を促進することが明らかとなった。

上述したコラーゲンの分解物（塩濃度２００ｍＭにおける、ブタ由来のコラーゲンの分解物）と接触させた、市販の培養用プレートを試験に用いた。マウスＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６（理研ＢＲＣ）を増殖培地（１０％ＦＢＳＤＭＥＭ）中に懸濁した後、上述した培養用プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１日間培養し、当該細胞を培養プレート上に接着させた。

細胞が接着した後、培地の全量を新鮮な培地（１０％ＦＢＳＤＭＥＭ）に交換した。以後、同様に３日毎に培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で６日間培養した。

試験結果を図１８に示す。図１８において、「ＬＡＳＣｏｌ」は、本実施例のコラーゲン分解物と接触させた培養用プレートの結果を示し、「アテロコラーゲン」は、ペプシン処理コラーゲンの結果を示し、「酸可溶性コラーゲン」は、組織から酸抽出したコラーゲンを示し、「ＮｏｎＣｏａｔ（Ｐｌａｓｔｉｃ）」は、市販のプラスチックプレートの結果を示している．図１８から明らかなように、「ＬＡＳＣｏｌ」では、脂肪細胞への分化に有効なスフェロイドが自発的に形成され、脂肪細胞への分化が促進されていることが明らかとなった。

上述したコラーゲンの分解物（塩濃度２００ｍＭにおける、ブタ由来のコラーゲンの分解物）と接触させた、市販の培養用プレートを試験に用いた。ラットＣ６細胞（理研ＢＲＣ）を増殖培地（１０％ＦＢＳＤＭＥＭ）中に懸濁した後、上述した培養用プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養し、当該細胞を培養プレート上に接着させた。

試験結果を図１９に示す。図１９において、「ＬＡＳＣｏｌ」は、本実施例のコラーゲン分解物と接触させた培養用プレートの結果を示し、「ＮｏｎＣｏａｔ（Ｐｌａｓｔｉｃ）」は、市販のプラスチックプレートの結果を示している。図１９から明らかなように、「ＬＡＳＣｏｌ」では、グリア細胞への分化に有効な細胞突起が自発的に形成され、グリア細胞への分化が促進されていることが明らかとなった。

上述したコラーゲンの分解物（塩濃度２００ｍＭにおける、ブタ由来のコラーゲンの分解物）と接触させた、市販の培養用プレートを試験に用いた。初代ヒト間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を当該細胞に専用の増殖培地（ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉｕｍ（Ｃ-２８０１０）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）中に懸濁した後、上述した培養用プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２日間培養した。

培養２日後、培地の全量を神経細胞誘導培地（ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＮｅｕｒｏｇｅｎｉｃＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）（Ｃ−２８０１５）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）に交換した。以後、２日毎に神経細胞誘導培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で５日間培養した。５日後、位相差顕微鏡を用いて神経突起による細胞間ネットワークを観察することによって、初代ヒト間葉系幹細胞から神経細胞への分化度を調べた。

試験結果を図２０に示す。図２０において、「ＬＡＳＣｏｌ」は、本実施例のコラーゲン分解物と接触させた培養用プレートの結果を示し、「フィブロネクチン」は、市販のプレートにフィブロネクチンをマニュアルのとおりに塗布したプレートの結果を示し、「ＮｏｎＣｏａｔ（Ｐｌａｓｔｉｃ）」は、市販のプラスチックプレートの結果を示している。図２０から明らかなように、本実施例のコラーゲン分解物は、神経突起のネットワークを構築している神経細胞への分化を著しく促進することが明らかになった。

＜１７．骨からのコラーゲンの精製＞
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭの透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、非特許文献２参照）。アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。

次いで、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組み合わせにて、緩衝液と骨とを混合した。つまり、（ｉ）塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）とニワトリ尺骨（４５ｍｇ（湿重量））とを混合、（ｉｉ）塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５、３．０）とブタ脛骨（２０ｍｇ（乾重量））とを混合、または、（ｉｉｉ）塩を含む５０ｍＭ醋酸緩衝液（ｐＨ４．５、５．０、５．５）とブタ脛骨（２０ｍｇ（乾重量））とを混合、した。

アクチニダインを含む水溶液と、骨を含む上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の溶液と、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、コラーゲンの分解物を作製した。

対照として、以下の（ｉｖ）〜（ｖ）の組み合わせにて、緩衝液と骨とを混合した。つまり、（ｉｖ）ブタ・ペプシンを溶解した、塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）とニワトリ尺骨（４５ｍｇ（湿重量））とを混合、（ｖ）ブタ・ペプシンを溶解した、塩を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）とブタ脛骨（２０ｍｇ（乾重量））と、を混合、した。

ブタ・ペプシンを含む水溶液と、骨を含む上記（ｉｖ）〜（ｖ）の溶液と、を７日間以上、２０℃にて接触させて、コラーゲンの分解物を作製した。

典型的な実験例として、ｐＨ３．０の条件下でアクチニダインを用いた場合のコラーゲンの分解物の重量を測定したところ、４５ｍｇ（湿重量）のニワトリ尺骨から、１８．５ｍｇのコラーゲンの分解物を回収することに成功し（回収率４１％）、２０ｍｇ（乾重量）のブタの脛骨から、１５．４ｍｇのコラーゲンの分解物を回収することに成功した（回収率７７％）。

一方、ブタ・ペプシンを用いた場合のコラーゲンの分解物の重量を測定したところ、４５ｍｇ（湿重量）のニワトリ尺骨から、１．７ｍｇのコラーゲンの分解物を回収することに成功し（回収率３．８％）、２０ｍｇ（乾重量）のブタの脛骨から、０．２ｍｇのコラーゲンの分解物を回収した（回収率１．０％）。

回収率の差は歴然であり、更に、本実施例の方法で得られた骨由来の可溶化コラーゲンは、真皮由来のコラーゲンと同等の用途に用いることが考えられる。

骨や象牙質は、硬組織に分類され、真皮や腱のような軟組織とは異なり、コラーゲン、または、コラーゲンの分解物を回収するための原料としては、好ましくない原料であると考えられてきた。骨から３本鎖らせん構造を有するコラーゲンを抽出する方法は従来報告されておらず、骨を加熱変性処理して、骨からゼラチンを抽出するに止まっていた。

しかし驚くべきことに、本実施例の方法であれば、骨の固形分は完全に溶解し、大量のコラーゲンの分解物、および、骨マトリックスタンパク質を回収することに成功した。

図２１（ａ）および図２１（ｂ）に、骨断片と各酵素を接触後、１１日間静置した写真を示す。アクチニダインを用いた場合、消化されずに残っている骨断片が確認されなかった。一方、ペプシンを用いた場合、消化されずに残っている大きな骨断片が確認された。

分解物中に含まれる骨マトリックスタンパク質を、質量分析計を用いたペプチドマスフィンガープリント法により同定した。このようなコラーゲン以外の骨特有の有用な骨マトリックスタンパク質（例えば、オステオカルシンなど）も、骨組織を可溶化することで効率良く回収できることが確認でき、本実施例の方法であれば、有用な骨マトリックスタンパク質を含む分解物を作製できる。酵素が添加されていない緩衝液に沈めた骨は、全く可溶化せず、骨断片の形状も経時的に変化しなかった。

次いで、コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写された分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。

エドマン分析の結果、得られた分解物には、アミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列が、配列番号１４にて示すアミノ酸配列に対応する分解物、が含まれていることが明らかになった。

骨組織から調製したコラーゲンの分解物（ブタ脛骨由来のコラーゲンの分解物）と接触させた、市販の培養用プレートを試験に用いた。ヒト骨髄間葉系幹細胞ＭＳＣを増殖培地（ＭＳＣＧＭ）中に懸濁した後、上述した培養用プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１日培養して、当該細胞を培養用プレート上に接着させた。接着後の線維芽細胞の様子を図２２に示す。図２２から明らかなように、本実施例の骨由来コラーゲンの分解物は、線維芽細胞のスフェロイド形成を著しく促進した。

本発明は、分化誘導用組成物、食品添加剤、医療材料、化粧品材料、細胞または胚などを培養するための培養材料（例えば、培養装置（例えば、培養皿など）のコーティング材料、培地成分）などに利用することができる。

Claims

コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物を含む、細胞の分化を誘導するための分化誘導用組成物であって、
上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンは哺乳類由来または鳥類由来であり、
上記分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでおり、
上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、または、Ｘ_４とＧとの間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ_１とＸ_２との間の化学結合、Ｘ_２とＧとの間の化学結合、Ｘ_４とＧとの間の化学結合、ＧとＸ_７との間の化学結合、または、Ｘ_１４とＧとの間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ_１とＹ_２との間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、を含み、
上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列は、上記トリプルヘリカルドメインのアミノ末端のアミノ酸配列であることを特徴とする、分化誘導用組成物。
（１）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−；
（２）−Ｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｇ−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｇ−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｇ−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｇ−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｇ−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｇ−；
（３）−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｇ−Ｙ_４−Ｙ_５−Ｇ−Ｙ_６−Ｙ_７−Ｇ−Ｙ_８−Ｙ_９−Ｇ−；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ_１〜Ｘ_１４およびＹ_１〜Ｙ_９は、任意のアミノ酸である）。
上記（１）〜（３）の何れかにて示されるアミノ酸配列における切断が、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのα１鎖内およびα２鎖内の少なくとも一方で行われていることを特徴とする、請求項１に記載の分化誘導用組成物。
上記Ｘ_１、Ｘ_３およびＸ_５は、プロリンまたはヒドロキシプロリンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の分化誘導用組成物。