TWI251465B - A novel strain of streptomyces for controlling plant diseases - Google Patents

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TWI251465B
TWI251465B TW090124009A TW90124009A TWI251465B TW I251465 B TWI251465 B TW I251465B TW 090124009 A TW090124009 A TW 090124009A TW 90124009 A TW90124009 A TW 90124009A TW I251465 B TWI251465 B TW I251465B
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Randy Jay Mccoy
Cai-Yao Yuan
Denise Carol Manker
Jimmy Ensio Orjala
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Description

1251465
本發明係屬生物殺蟲劑之範_。 數年來已知不同的微生物顯現出生物活性而可用於控制 植物疾病。雖然在鑑定及發展生物殺蟲劑以用於控制各式 重要之農藝及園藝之植物疾病，已有所進步，但大部分使 用合成化合物殺蟲劑。美國環保署將許多化學殺眞菌劑列 爲致癌物質，並對野生動物及非標的生物種具有毒性。除 此，病原可發展對化學殺蟲劑的抗藥性（Schwinn等，1991)。 相對於合成化學殺眞菌劑，生物防治提供引人之另一種 4擇。生物殺蟲劑（活的生物體及由這些生物體天然產生之 化合物）較爲安全、較可生物降解，且研發上較不昴貴。 放射菌類，包括鏈黴菌類，已知可產生抗眞菌代謝物 (Lechavalier及 Waksman，1962 ; Lechavalier, 1 988)。慣常使 用於農業操作上之數種鏈黴菌類生產之抗生素，如用於防 治火燒病（fire blight)之鏈黴素及土黴素。 已證明鏈黴菌類在對抗植物病原在體外及體外皆有活性 。Axelrood等（1996)由美國大松樹（Douglas-fir)根部分離到 2 98株鏈黴菌。已證明約30%這些菌株在體外具有對抗鐮孢 囷（Fusarium)、柱胞菌（Cylindrocarpon)及 / 或腐霉菌 (Pythium)之抗眞菌活性。Yuari 及 Crawford (1995)報導 Streptomyces lydicus WYEC108具強烈抗眞菌活性且在小 盆試驗中可抑制豆類及棉花種子之腐霉菌所引起之根腐病 ° Reddi 及 Rao (1 97 1)以 Streptomyces ambofaciens var. -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 x 297公釐） 1251465 A7 B7 五、發明説明（2 ) g e 1 d a n u s控制蕃蘇倒伏病及棉花萎调病（F u s a r i u m w i 11)。 Rhizoctonia根腐病可以 Streptomyces hygroscopicus var. geldanus控制（Rothroch及 Gottieb，1 9 84)。這些作者的報導 ，控制係依靠由此菌株產生之在原處geldanamycin濃度。相 同的作者亦見過 Streptomyces herbaricolor及 Streptomyces coeruleofuscus 可保護大豆免於 Phytophthora megasperma var. soja之感染（1984)。Crawford (1996)重排此菌株於控制 植物病原菌於美國第5,527,526號專利。Crawford ( 1 996) 在美國專利第5，5 2 7，5 2 6號中獲得使用此菌株控制植物病 原之專利。此獲得專利之（ 1 998)二鏈黴菌菌株可有效地對 抗立枯絲核菌（Rhizoctonia solani)及蘇科作物疫病菌 (Phytophthora capsici)。Streptomyces griseoviridis對抗鐮 孢菌及其他土壤病原之產物現以MycostopTM販售於市場 上。 發明概要 m 提供一種新的可生產抗生素之鏈黴菌（Strept〇myces sp.) ’其對某些特定植物病原呈現抗眞菌的活性。亦提供一種 治療或保謾植物免於受眞菌感染的方法，包括施用有效量 之可生產抗生素之鏈黴菌（具所有NRRL登綠號B-3〇145i 相同特性）。本發明亦與殺眞菌組合物有關，其獨含有此新 的鏈黴菌菌株及抗生素及由此菌株生產之代謝產物，或人 併含有其他化學藥品及生物殺蟲劑。 生產抗生素之鏈黴菌屬可以懸浮於整個培養液中或由整 個生產抗生素之鏈黴菌屬之培養液所得之上層液，提供之 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1251465 A7 B7 五、發明説明（3 ) 。亦提供新的，顯現專一抗眞菌活性，溶於丁醇之抗生素 ，及分離新的溶於丁醇之抗生素之方法。 附圖之簡述 圖1 A爲活性德分6之高效液相層析分析圖譜（Microsorb C18，i〇cmx4.6mm，ΙΟΟΑ，流速1毫升/分鐘，在波長220 納米作紫外線偵測，乙腈+ 0.05 % TF A/水+ 〇.〇5 %梯度： 〇·30分鐘，5-65% ; 30-40分鐘，65-100% ; 40-45分鐘，ι〇0%)。 圖1Β爲UV光譜之有效圖學在1Α所述之分析圖譜的 14 · 7 5 5分鐘所析出。 圖2 A爲活性餾分7之高效液相層析分析圖譜，條件如1 a。 圖2B爲UV光譜之有效圖峰在2A所述之分析圖譜的 1 6 · 1 4 6分鐘所析出。 圖3爲C-8高效液相層析分析圖譜，甲醇由Diaion HP-20 樹脂（如方法B所述之步驟）析出（HP Zorbax Eclips XDB-C8 管柱，5微米，15〇χ4.6 mm，流速0_8毫升/分鐘，在波長220 納米作紫外線偵測，圖表速度chart speed 2 mm/分鐘。溶劑 A，25 ·· 5 ·· 70乙腈/甲醇/水。溶劑B，65 ·· 5 ·· 30乙腈/甲醇/ 水。梯度：0分鐘時之100% A，超過20分鐘後，增加至3 % B。 圖4爲純化方法A所得之半純活性代謝物之1 Η核磁共振 圖譜（100 MHz，CD3OD)。 圖5爲純化方法A所得之半純活性代謝物之13C核磁共振 圖譜（100 MHz，CD3〇D)。 圖6爲由純化方法B所得圖峰A之液體層析ESI-質譜 (Liquid Chromatography ElectroSpray Impact-Mass Spectrum) -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1251465
”包含”-詞意指組合物及方法中包括列舉之組成物，但 並不排除他者。當使用”主要由···所組成，，來定義組合物及 万法時’應、意指不包括任何組合中主要顯著之其他組成物 。因此，組合物主要由組成物所組成，在此應定義爲應不 排除由分離及純化方法而來之微量污染物與農業上可接受 《載劑、。’，由...所組成，，應意指排除不只其他成分之微量元 素，及實際方法步驟以施用本發明之組合物。每一臨時用 *吾足義之具體實施例屬本發明之範轉。 、 在此所用之”生物防治”定義爲使用第二種生物體控制病 原菌及昆蟲。已知生物防治之機制，包括經與眞菌競爭根 邵表面之空間以控制根腐之腸内菌。可分離細菌毒素，如 抗生素，可直接施用至植物上，或施用細菌種而其可於原 處產生毒素。 ' "眞菌"或”眞菌類”一詞包括許多種類之有核、含孢子而 無葉綠體之生物體。眞菌的例子包括酵母菌、黴菌（m〇id、 mildrew)、鏽病眞菌及蕈。 ’’細菌”包括任何無明顯細胞核之原核生物。 ’’殺蟲π意指物質可增加植物害蟲之死亡率或抑制其生長 速率之能力。 " 杀又具菌物貝可增加眞菌之死亡率或抑制眞菌生長速率 之能力。 抗生素包括可殺死或抑制微生物之物質。抗生素可由 微生物製造，為經合成或半合成之方式。但是包括可抑制 或殺化具菌I物質，如放線菌酮（cycl〇heximide)*製黴菌 -8 - 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(210X 297公爱)
裝 訂 •'4 i251465 A7
素（nystatin) 〇 ::抗眞：’’包括可殺死眞菌或抑制其 培養菌"係指生物體於不同培 、，、、 液"#彳匕冬右 + · . ^ 之增殖。"完全培養 履係彳日^有細胞與培養基二者 餐 峰县养位i、、丄 °養硬。丨’上層液，丨係指去 生長万^口蚕夜中之細胞經離心、 田 知之方法移除，殘餘之培養液。…知该項技蟄者所 ”有效量"爲足以產生好的或所 、α赤少* m 乂叮奴結果的量。有效量可〜 j欢里馬足以改善、安定、 破屁改變、延緩或延遲眞菌性或 量。 I、田囷性疾病情況之進程的 "正對照組”意指已知具殺蟲活性之化合物。"正對照組" 包括但不限於，市售之化學殺蟲劑。”負對昭组已 不具殺蟲活性之化合物。負對照組的例子爲…酸乙： ”溶劑”包括任何可含有另一物質於溶液之液體。"溶劑可 萃取的”意指溶於溶劑之化合物及之後可由溶劑中分離出 來。溶劑例子包括但不限於，如乙酸乙酯之有機溶劑。 ”代謝物”意指任何具殺蟲活性之微生物其發酵過程之化 合物、物質或副產物。以上定義之抗生素爲可專一對抗微 生物之代謝物。 - "突變株”意指母菌株之變種，及獲得殺蟲活性較母菌株 表現者大之突變株或變種之方法。”母菌株"此定義爲發生 突變前之原始鏈霉菌株。爲獲此突變株，母菌株可用如N-甲基-N、硝基-N -亞硝基版、乙基甲基諷之化學物質處理咬 1251465 A7 ____ B7 五、發明説明（7 ) 咖嗎、X光或紫外線之照射或熟知該項技藝者所知之方法 〇 ’’組合物"指將活性分及其他化合物、載劑或無活性（如可 偵測劑或標籤或液體載劑）或活性（如佐劑）之成分。農業載 劑提供於下。 吾描述新的可生產抗生素之鏈黴菌NRRL第B-30145號及 對特定植物病原菌具抗眞菌活性之突變株。亦提供由培養 基及含培養基之組合物中所分離之上層液。另一方面，组 合物另含至少一種化學物質或生物殺蟲劑。 本發明亦提供由鏈黴菌所產生之代謝物。代謝物呈現可 對抗植物病原眞菌之活性，且爲熱、鹼安定、對酸不安定 、分子量小於1 0,000道爾頓。舉例中，代謝物之分子量 [M + H + ]介於約925至約865之間。 由鏈黴菌菌株所產生之一或更多之代謝物，UVk收在約 2 15納米至約22〇納米之間。代謝物可由同之分子組成，包 括但不限於，炔丙醇片段[c«H(〇H)]、與氧化合之次甲 基碳（X-CH-Y)或糖部分。舉例中，代謝物可含有至少二炔 丙醇片段、數個氧化合之次甲基碳（舉例來說，5至1〇)及/ 或糖4分。一者擇一地，鏈黴菌菌株所產生之一或更多之 代謝物可共享相同碳骨架，而氧化程度不同。 本發明亦提供抗眞菌組合物，其含由鏈黴菌菌株所產生 及分離之代謝物，依據之方法包括： ⑷將鏈黴菌菌株NRRL第B〇0145號及具與nrrl第 B-3〇145號相同特色之突變株的完全培養液，注入非離 -10-
1251465 A7 B7 五、發明説明（) 16S rRNA基因序列數據程序（Acculab Customer Handbook v. 1.0)描述如下。 16S rRNA基因係PCR由分離自細菌群體之基因體DNA增 殖而來。用作增殖之因子對應E. coli位置005及53 1。由多 餘之引子中純化增殖產物，並dNTP使用Micfocon 1〇〇 (Amicon)分子量截留膜，並將一部分產物在瓊脂膠跑以檢 查品質及數量。 16S rRNA增殖產物定序循環，以AmpliTaq FS DNA聚合 酶及驗性总香紅染料終止子進行。用Sephadex G-50旋轉管 柱（spin column)自定序反應中移除多餘之染料標記終止子 。以離心收集產物’眞空乾燥，在_ 2 0 °C下冷束直到預備填 充。樣品在甲醞胺/藍葡萄聚糖/ E D T A溶液中再懸浮，並在 填充前變性。在ABI Prism 377 DNA定序儀中、樣品進行電 泳。用PE/Applied Biosystem DNA編輯及裝配軟體分析數據 。一旦獲得序列，將用MicroSeqTM序列分析軟體將其與 PE/Applied Biosystem MicroSeqTM 資料庫比較。序列亦與
GenBank及核醋體資料庫計畫（Ribosomal Database Project RDP)比車交。 16S rRNA定序之結果證明NRRL第B-30145爲屬鏈霉菌 屬。經定序結果’建議此菌株可能屬於S . m a s h U e n s i s (之前 爲Streptoverticillium mashuense)或相關之種類。最相酉己者 Streptomyces mashuensis ，才目酉己分數 98% 。 實例2 NRRL第B - 3 0 1 4 5號在體外培養時對抗植物病原菌之活性 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) " ' 1251465
發明説明（ή 使用—種不同體外測定方法試驗第Β_3〇 〖Μ號對抗 系歹！不同植物病原菌。洋菜（區域）擴散分析包括施用植 物病原菌孢子於瓊脂培養基表面上以製造整個生長面或使 用置於培養皿中心之菌絲瓊脂栓，其將生長並定殖於瓊脂 用及：連接具殳幫浦自瓊脂上移除直徑約Ό 之圓孔 。知NRRL·第B-30 145號之發酵樣品與已知之標準品及水一 I 加至每一圓孔中。在適於每一病原菌之環境條件下培 養平板一至四天。結果包括無病原菌生長於圓孔附近區域 或減少病原菌之生長於圓孔附近的量或無影響。記綠每一 區域之大小及形式。NRRL第B-30 145號在洋菜擴散分析之 、、、。果列於表1。洋菜擴散結果相異；在瓊脂之擴散可能被抑 制。 表1 :洋菜擴散（區域）分析中NRRL第B-3 0 1 45號對抗選擇植 物病原菌之活性 甘監鍵孢菌（Alternaria brassicicola) 典區域/低活性 灰霉菌(Botrytis cinerea) 低活性 桃褐腐病菌（Monilinia fructicola) 典區域 另口 科作物疫病菌（Phytophthora capsici) 中等活性 腐霉菌（Pythium sp·) 低活性 Colletotrichum acutatum 典區域 五·枯絲核菌（Rhizoctonia solani) 典區域 菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum) 典區域 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1251465 A7 B7 五、發明説明（12 *二種體外分析進行試驗NRRL第B_3G145㈣原範 載波片發芽分析。將不同稀釋倍率之NRRL第B_30l45,: 發酵樣品加添至載波片（25 mmx75 _具直徑18 _深= mm之凹槽），等體積之病原菌孢子與樣品混合。在密封一 塑膠盒中，室溫下，載波片整夜培養在濕的紙巾上。以= 合顯微鏡100倍數，觀察發酵樣品/孢子懸浮樣品，以測定 結果。通常結果包括缺乏病原菌繁殖芽之發芽或大大減少 發芽及/或生長。此外，病原菌孢子開始生長時會發生不筒 形式之畸形。NRRL第Β-30145號活性範圍列於表2。發酵樣 品在低濃度時，會發生孢子發芽完全被抑制。 裝 表2:載波片發芽分析中NRRL第Β-3 0 145號對抗選擇植物病 原菌之活性 無發芽 無發芽 無發芽 無發芽 甘藍鏈孢菌（Alternaria brassicicola)
Alternaria dauci 灰霉菌（Botrytis cinerea) 桃褐腐病菌（Monilinia fructicola) 實例3 NRRL在植物生物鑑定試驗中對抗植物病原菌之活性 試驗NRRL第B-30 145號對抗蕃茄晚疫病（Phytophth〇ra infestans)、蕃茄早疫病（Alternaria solani)、灰霉病（Bortrytis cinerea)、草皮褐斑病（Rhizoctoina sp.)、花生白.絹病 (Sclerotinia minor)。所有試驗皆是在實驗室中經控制之環 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱） 1251465 A7 ___ B7 五、發明説明（13 ) 境下進行，在一般商業之溫室條件下由種子生長而來之植 物材料。 蕃 ％ 晚疫病-Phytophthora infestans 在1 6 C黑暗中，病原菌生長於培養基之裸麥瓊脂培養基 中。用水充滿平板，收集孢子囊，並挖出菌絲移出孢子囊 。將孢子囊懸浮液通過棉布，計數並調整爲1 ·〇 X丨〇4。以書 家油漆噴霧器（40 psi)噴灑NRRL第B-30 145號並流過第三 至五葉齡期之蕃茄苗。經處理之小苗在濕溫下風乾至少二 小時，然後以手握噴灑器輕輕噴灑孢子囊懸浮液於蕃茄苗 之上表面，培養。培養之小苗置於注滿水之固體底盤，然 後以塑膠圓頂覆蓋以保持葉片濕潤。在2(rc，光照週期14 小時，覆以塑膠圓頂連續培養4天。依據疾 5 小苗，。爲無症狀，5爲測葉片爲病菌所繁殖。晚疫= 一般例列於表3。 表3 : NRRL第B_30145號處理蕃益苗對抗晚疫病菌 Phytophthora infestans之結果 處理 平均D.I. 1-4 990702樣品 1.1 1.0 0.5 2.0 1.0 990709樣品 1.1 1.0 2.0 1.0 0.5 990825樣品 1.3 1.5 1.0 1.5 1.0 9909 1 3樣品 1.0 1.0 Ί A 上· (J 1.5 0.5 Quadris 30 ppm 0.1 0 0.5 0 0 水 4.3 4.0 4.0 5.0 4.0 -16- 1251465 A7 B7 五、發明説明（14 ) 樣品爲NRRL第B-30 1 45號不同的發酵液 D.I.疾病指數（Disease Index) 蕃力口 早疫病- Alternaria solani 病原菌起初生長於市售Difco之馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養 基（PDA)，在22-25°C，14小時光照下，直到整個平板被覆 蓋。然後將眞菌與瓊脂培養基切成丨〇 mm2小方塊，並將眞 菌朝上置於特別之產孢培養基上（s _培養基：2 〇公克蔗糖、 20公克碳酸鈣、20公克Bacto瓊脂每公升）。S-培養基平板上 注薄層水，在22-25°C，14小時光照下，培養2-3天，直到 病原菌完全產孢。然後將水注入平板，瓊脂方塊自平板上 挖出。將懸浮液通過棉布，計數孢子並調整爲1 〇 X 1 〇5。畫 家油漆噴霧器（40 psi)噴灑直至並流過第三至五葉齡期之 蕃％苗第三至第五葉齡之蕃茄苗，如前所述。經處理之小 苗，使其乾燥，然後以孢子懸浮液培養。小苗置於底盤， 並以如前述覆蓋之，25°C、14小時光照週期下培養。依據 之前疾病分級0 - 5評等小苗。一般試驗之結果列於表4。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董） 1251465 A7 B7 五、發明説明（15 表4 ·· NRRL第B-30U5號處理蕃祐苗對抗早疫病菌 Alternaria solani之結果 綠 重複組 試驗-1 990216樣品 1.0 2.0 0.5 0.5 Quadris 60 ppm 1.8 1.5 2.5 1.5 水 4.0 3.0 4.0 5.0 試驗-2 990216樣品 1.1 1.5 1.0 1.0 1.0 水 4.5 5.0 4.0 4.0 5.0 D.I·疾病指數（Disease Index) 胡椒灰霉病-Botrytis cinerea 病原菌起初生長於標準馬鈐薯葡萄糖瓊脂培養基（pDA) ，在22 C，14小時光照下，直到整個平板被覆蓋（7_9天）。 將平板注水以收集孢子，然後輕輕地以小鏟挖出孢子。將 孢子懸浮液通過棉布，計數並調整爲1.5 X丨〇6。胡椒苗生長 至第四至第六葉齡，畫家油漆噴霧器噴灑（如前所述）發酵 樣品至葉片上層。培養經處理之小苗，置於底盤，並覆以 塑膠圓頂。底盤置於2 0°C下，連續黑暗達2.5天。依據之前 疾病分級0 - 5評等小苗。二種典型試驗之結果述於表5。 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1251465 A7 B7 五、發明説明（16 ) 水 理蕃茄 〇 1.5 1,0 4.0 5.0 5.0 D.I·疾病指數（Disease Index) 表 5 : NRRL 第 B-30 145 號處 cinereai之活性 處理 平均D.I. 試驗-1 9902 16 樣品 1.4
Break 20 ppm 〇」 水 4.0 試*驗_ 2 990216 樣品 1.9
Break 20 ppm 〇.8 4.5 苗對抗灰霉病菌Botrytis 重複組 1.5 1.5 1.5 1.0 0 0 0.5 0 4.0 4.0 3.0 5.0 1.5 2.0 2.0 2.0 0.5 4.0 皁皮褐斑病-Rhizoctonia sp. 將二耄升足發酵樣品加至6格盆中的每一小格中，每格中 種有一個月大之草皮苗（硬莖雜草Bentgrass)。將4 mm， 天大之絲核菌Rhizoctonia sp.菌絲栓置於土壤表面下。每一 處理重複6次。培養之小盆置於塑膠盤，並覆以塑膠圓頂。 塑膠盤置於燈架（16小時/每天）下，室溫下培養。培養5_6 天後汗估疾病嚴重性，並與水處理之控制組比較。結果顯 示NRRL第B-30 145號對抗絲核菌Rhiz〇ct〇nia的活性受到抑 制（表6)。 -19- 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格（210 X 297公爱) 1251465 A7 B7 五、發明説明（17 ) 表6: NRRL第B-30145號對絲核菌Rhizoctonia sp.所引起之 草皮褐斑病之效率 處理 稀釋倍數 重複1 重複2 重複3 重複4 重複5 重複6 30145 lx +* + + + + + 30145 l/2x + + + + + + 水 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 症狀輕微，’’+++'’=症狀嚴重 花生白絹病- Sclerotinia minor 第一 2葉期之花生苗，以NRRL第B-30 1 45號處理，在經處 理之植物乾燥後，將4 mm大之菌絲栓置於每一莖底部。在 結露槽（dew chamber)中培養植物2天，在置於密封於覆蓋之 圓頂的塑膠盤前。膠盤置於燈架（1 6小時/每天）下，室溫下 培養1 0天。與水處理之控制組比較，評估疾病嚴重性。結 果顯示NRRL第B-30 145號lx完全培養液對Sclerotinia m i η 〇 r的具控制之活性（表7)。 表7 : NRRL第B-3 0 1 45號對花生白絹病之效率 處理 稀釋倍數 重複1 重複2 重複3 30145 lx +/- 0 +/- 30145 l/2x ++ ++ + 30145 l/4x 0 Ηh ++ 水 +++ +++ +++ *”+/-”表強烈之抑制， "+++”表症另大嚴重。 0表無感染， π+π表症狀輕微， -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1251465 A7 ----- B7 五、發明説明（21 ) 洛硬梯度洗滌：（1) 20 : 80甲醇/水（200毫升），（2) 4〇 6〇 甲醇/水（20〇毫升），（3)6〇:4〇甲醇/水（毫升），⑷8〇: 2〇甲醇/水（200毫升），甲醇（2〇〇毫升 、生，鑑定之結果（以桃褐腐病菌Monilinia fructlc〇la及/ 或甘監鏈格菌AlternarU brassicic〇la作發芽分析）指出所有 餘分都具活性。4 留分個別地在十八石夕垸連結之石夕膠 (ODS) HPLC其使用乙腈 / 甲醇 /水（T〇s〇HASS 〇ds_8〇ts ; 微米2 1 ·5 X 3 0 cm溶劑系統：溶劑A :乙腈/甲醇/水25 • 5 · 65 ;落劑B :乙腈/甲醇/水65 : 5 : 3〇。梯度·· 〇分鐘 開始時爲溶劑A並維持25分鐘。在5〇分鐘内，溶劑β增加至 35%。流速=6·〇毫升/分鐘）。所有之餾分所得之HpLc量變 曲線大致相同，活動落在二區域：圖峰A(時間55_63分鐘） 及圖峰B(時間65-70分鐘）。以反相HPLC管柱（phen〇menex Luna Phenyl-Hexyl; 5微米，250 X 10 _。溶劑系統：溶劑 A :乙腈/甲醇/水25 : 5 : 65 ;溶劑β :乙腈/甲醇/水65 : 5 ' :30。梯度：〇分鐘開始時爲溶劑A並維持15分鐘。在乃分 名里内，；谷劑B增加至2 5 %。流速=2.0毫升/分鐘）。分離一主 要之成分；但是，分析HPLC分析指出高uv吸收之污染物 與活性代謝物共溶析。因此可污染物使用另一純化方法（ 方法B)。 另外，均質化之無細胞完全培養液通過非離子性高分子 樹脂（Supelco Diaion HP-20)，以水洗滌，然後是甲醇洗務 。甲S手析出液進一步以反相HPLC (HP Zorbax Eclipse -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1251465 A7 B7 五、發明説明（23 ) 其經所附加之專利申請範圍描述。 參考文獻
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Claims (1)

  1. X、申請專利範圍 i•-種鏈黴菌（streptomyces sp.)菌株之經分離純培養菌， 其具有寄存於食品工業發展研究所（FIRDI)，編號CCRC 91〇178之痛株之所有辨識特徵，及得自該鏈黴菌菌株之 具抗真菌活性之突變株。 2. -種上層液，係由如中請專利範圍第ι項之培養菌中所分 離，其中該上層液呈現抗植物病原真菌活性，且在洋菜 擴政中不呈現抗絲核菌（^^2(^〇11^)活性。 3. -種抗真菌組合物，含有如巾請㈣範圍第旧 及載劑。 A _ 4.如申請專利範圍第3項之組合物，另含有至少一種化學性 或生物性殺蟲劑。 5·如申明專利乾圍第3項之組合物，其中該組合物係由選自 下列者調配而成：可濕性粉劑、粒劑、水性懸浮液及可 乳化濃縮液及微膠囊化調配物。 6. 一種由如申請專利豸圍第1項之鏈黴菌菌株所生產之可 /合於丁酉予之代謝物’其呈現抗植物病原真菌活性。 7·如申.月專利範圍第6項之代謝物，其中該代謝物對熱、鹼 為安疋對酉夂不安定，且分子量小於1〇,〇〇〇道爾頓。 8·如申請專利範圍第6項之代謝物，其中該代謝物含有一或 更多個選自下列所成群組之部分··與氧結合之 (X-CH-Y)及糖部分。 土火 9·如申請專利圍第6項之代謝物，其中減謝物具有介於 865·5及923.5道爾頓之分子量。 1〇·如申請專利範圍第9項之代里謝物，丨中該分子量係選自 73010-941027.doc 1251465 --——-- 六、申請專利範圍 A BCD 下列所成群組：865.5道爾頓、8頓、891 ^ ^ 〇Λ I·5道爾頓、897.4道爾891.5道爾頓、9G7.5道爾頓及阳 11. 如申請專利範圍第6項 爾頓。收介於出納来及220納；^物，其中該代謝物之卿12. ::真菌組合物，含有如申請專利範圍第6項之代謝物 13·如申請專利範圍第12項之組合物 性或生物性殺蟲劑。 14·如申請專利範圍第13項之組合物 自下列者調配而成：可濕性粉劑 可乳化濃縮液及微膠囊化調配物 15. -種保護或治療受真菌感染之植物、果實及根部之方 ’包括施用有效量之如申請專利範圍第1項之鍵徽菌菌 至該植物、果實或根部。 16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該感染係由選自 列所成群組之真菌所造成··蕃茄早疫病菌（Ahernariasolani)、灰黴病菌（B〇rtrytis cinera)、絲核菌 (Rhizoctonia sp·)、菌核菌屬（Sclerotinia sp.)及晚疫病 (Phytophthora sp.)。17·如申請專利範圍第15項之方法，其中鏈黴 (Streptomyces sp.)菌株CCRC 910178係以完全培養液 另含有至少一種化學 其中該組合物係由選 粒劑、水性懸浮液及 法 株 下 屬 菌 菌 用 18.如申請專利範圍第15項之方法，其中鏈徽 (Streptomyces sp.)菌株CCRC 9 101 78係以上層液施用 菌 73010-941027.doc -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1251465 A B c D 六、申請專利範圍 19_如申请專利範圍第15項之方法，其中鏈黴菌 (Strept〇myCeS SP.)菌株CCRC 910178以選自下列所成群 組之調配物施用：可濕性粉劑、粒劑、水性懸浮液、可 乳化濃縮液或微膠囊。 2〇·如申請專利範圍第15項之方法，另包括施用有效量之至 少一種化學性或生物性殺蟲劑。 2 1 ·種保羞或/σ療交真菌感染之植物、果實及根部之方法 ’此方法包括施用有效量之如申請專利範圍第6至i ι項中 任員所述之代謝物或申請專利範圍第12至14項中任一 項所述之組合物至該植物、果實或根部。 -3- 73010-941027.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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