JPH10500283A

JPH10500283A - 生物学的防除バクテリア由来の殺真菌性毒素

Info

Publication number: JPH10500283A
Application number: JP7523512A
Authority: JP
Inventors: ジョーハンデルスマン; スーローラシロ; ジョンクラーディー; ハイインヒー
Original assignee: ウィスコンシンアラムニリサーチファンデーション
Priority date: 1994-03-08
Filing date: 1995-02-27
Publication date: 1998-01-13
Also published as: WO1995024126A1; US5852054A; US6034124A; EP0749274A1; EP0749274A4

Abstract

(57)【要約】植物の苗立ち枯れ及び根腐れを除去する為の、バチルス・セレウス株ATCC 53522によって産生される、以下の構造式を有する抗生物質。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的防除バクテリア由来の殺真菌性毒素相互関連出願この出願は、出願番号０７／８７８，８００（１９９２年５月５日出願）の一部継続出願であり、この一部継続出願は、出願番号０７／７５８，６４４（１９９１年９月１２日出願）の一部継続出願であり、この一部継続出願は、出願番号０７／１９４，３９９（１９８８年５月１６日出願）の分割出願であり、この分割出願は、出願番号０７／０７７，８５０（１９８７年７月２２日出願）の一部継続出願である。技術分野本発明は、植物の苗立ち枯れ及び根腐れを除去するのに当たり有用性が初めて見出された生物学的防除バクテリア由来の殺真菌性化合物に関する。技術分野の背景ある種の植物、例えばアルファルファ、大豆、インゲンマメ等は、所謂「苗立ち枯れ」及び「根腐れ」症状を呈する。苗立ち枯れ症状は、発芽後間もなくの苗木の脱水と、次に来る死をもたらす。根腐れ症状は、根及び茎の分散周辺での葉の黄化及び萎れ及び黄色から褐色への病変を含む。この病変は、結局、植物の減少する健康或いは死にも至る環状除皮及び次にくる根腐れへと導かれる。根腐れする植物はしばしば、乾燥及び餓死の症状と間違えられるその様な症状を示し始める。その様な植物は、植物の死の原因と間違えられる他の病原体の攻撃で、健康な植物より傷付き易い。苗立ち枯れ及び根腐れは、同じ菌及び特にフィトフトラ(Phytophtora)、ピチウム(Pythium)、アファノミセス(Aphanomyces)、リゾクトニア(Rhizoctonia)及びフサリウム(Fusarium)属による植物の感染が原因の２つの異なる症状の組合せに過ぎない。フィトフトラ・メガスペルマ f．sp. メディカギニス(Phytophthora megasp erma f．sp．medicaginis)（現在は、正式にはフィトフトラ・メディカギニス(P hytophthora medicaginis)として知られ、ここでは以下「Pmm 」と称する）は、土壌が、アルファルファが生育する場所の大部分が湿潤である時のアルファルファの苗立ち枯れ及び根腐れ両方の原因であり、フィトフトラ・メガスペルマ f．sp．グリシネア(Phytophthora megasperma f．sp．glycinea)は、湿潤生育条件下での大豆の根腐れの原因であることが分かっている。然しながら、列挙された他の属中の菌も、アルファルファ及び大豆を攻撃すると考えられる。インゲンマメの根腐れは、上に挙げた属の２つ以上の種類の菌の混合体に起因するものと考えられる。一般に、苗立ち枯れ及び根腐れの制御は、耐性植物を育種することで行われてきた。然しながら、苗立ち枯れ及び根腐れが作物損失の主たる原因である様な完全に耐性な栽培品種は開発されてきていない。このことは、長期にわたる湿潤生育条件下、或いは同じ作物が、同じ畑で繰り返し植えられる時に、特に、そうである。ある種の殺菌剤、例えばメタラキシル(metalaxyl)は、根腐れを部分的に制御する。然しながら、その様な殺菌剤は、極めて高価である。作物にとっては、例えばアルファルファ等では、それらの使用は、経済的に可能なものではない。また、殺菌剤に対する菌の耐性が急速に高められる。「生物学的防除」とは、第二の生物の使用による病原体防除と定義される。生物学的防除の機構は様々である。例えば、腸内バクテリアは、アルファルファの根腐れの生物学的防除でのそれらの有用性について試験されている。防除は、アルファルファの根の表面の空間での腸内バクテリアと菌との間の競合によって得られると考えられる。逆に、バクテリアの一種で産生される毒素は、病原体として明らかな他の種のバクテリアの防除に使用できるかも知れない。細菌産生抗生物質は、その様な毒素の例である。この毒素は、それを産生する種から単離出来、ペニシリン投与の一般的方法と同じ様にして、直接投与出来、或いはその種それ自身は、毒素をその場で産生する為の適当な環境下で投与してもよい。土壌居住バクテリアによって産生され、一度同定されたその様な毒素は、様々な他の領域で、抗真菌性又は抗生物質薬剤としての有用性を有するかも知れない。発明の簡単な要約本発明は、抗生物質毒素が、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)から単離された点に要約されるもので、この毒素は、ツビッターマイシンＡ(zwittermici n A）と名付けられ、以下において特徴付けられ、同定される。本発明は、更に第２の毒素、ここで抗生物質Ｂと名付けられる毒素が、バチルス・セレウスから単離された点に要約されるもので、以下において特徴付けられ、同定される。本発明は、殺真菌性及び細菌性病気の防除に対する新規な抗生物質、ツビッターマイシンＡ及び抗生物質Ｂの使用に関する。本発明のその他の目的、構成及び利点は、以下の説明から明らかとなるであろう。好適な実施態様の説明原バクテリア株は、植物の苗立ち枯れ及び根腐れを起こす菌種に対する生物学的防除を発揮する土壌から単離された。この株は、ＡＴＣＣ（American Type Cu lture Collection）に寄託され、ATCC 53522と命名され、以後「ATCC 53522」と称する。更に、或る種のATCC 53522の突然変異株は、ATCC 53522により提供されるものに匹敵する生物学的防除を提供する事が見出された。これらのバクテリアは、実質的に純粋培養物に得られる。「実質的に純粋」な培養物とは、培養物の再生を妨げるに十分な量のその他のバクテリア種を含まないバクテリアの培養物を意味する。更に、生物学的防除は、このバクテリア株により産生される毒素で発揮される事が見出された。 ATCC 53522、その「防御」突然変異株として以下に定義されるもの、それらによって産生される抗生物質、バクテリア又はそれらの抗生物質を含む接種物、バクテリア又はそれらの毒素を利用する苗立ち枯れ及び根腐れから植物を保護する方法は同時出願の対象である。上澄み液及び他のバクテリアのいない液中に見出される特定の分子、化合物及びATCC 53522又はその防御突然変異株の培養物から取り出された培地は、以下に定義される「防御抗生物質」である事が見出された。これらの化合物は、ATCC 53522又はその防御突然変異株の培養物の源とは、特定化出来る程に独立性のあるものとして特徴付けられた。この2 つの化合物は、ここでは新造語として「ツビッターマイシンＡ(zwittermicin A)」及び「抗生物質Ｂ(antibiotic B)」と称する。バチルス・セレウス ATCC 53522 の培養からの上澄み液からの他の画分は、Pmm 遊走子(zoospores)を溶解する可能性を有する生理活性が見出されたが、以下に示される通り、このズーリシン(zoolysin)活性画分は、抗生物質の抗真菌活性を持たない。前節で引用した生物学的防除の存在を検証出来る方法は、以下に詳細に述べられる「植物保護検定」である。苗立ち枯れ及び根腐れの原因となる菌の「生物学的防除」は、ATCC 53522の効果的な量、生物学的防除を示すその突然変異株、それにより産生される抗真菌性毒素、バチルス・セレウス抗生物質、又は他の化合物又は分子が、土壌又は保護されるべき植物の直接近傍の他の生育培地に置かれる時、苗立ち枯れ又は根腐れの症状の、統計的に顕著な減少が生起すれば、存在するとみなされる。苗立ち枯れ及び根腐れを攻撃するのに「効果的な量」とは、症状が目に見えて顕著に減少する事となるに十分な量である。明らかに、若しバクテリア又は毒素又は他の化合物の量が、定義された様に十分な量でなければ、そのバクテリア、毒素又は化合物は、苗立ち枯れ及び根腐れの原因となっている菌に生物学的防除を発揮する事は出来ない。 ATCC 53522及び生物学的防除を発揮出来るその突然変異株は、「保護」バクテリアとして時に集合的に引用する。バチルス・セレウス抗生物質及びその様な生物学的防除を発揮出来る他の毒素は、「保護」化合物又は毒素と称することがある。有効量の保護バクテリア、それらの毒素、又はバチルス・セレウス抗生物質で処理された種、苗、成熟植物を初めとする植物は、根腐れ又は苗立ち枯れから「保護されたもの」として呼ぶこととする。 ATCC 53522は、ウイスコンシンのアーリントン及びマーシュフィールドにあるウイスコンシン実験農場大学の畑から得たアルファルファの根と付随する土壌、及びウィスコンシンのベローナ及びクロスプレインにある２つの個人農場から単離された５００バクテリア株の１つである。根は１ｃｍの断片に切断し、各断片を、殺菌蒸留水１０ｍｌ中に入れた。根の断片及び水を、次いでビブラ−セル25 0 ワット超音波装置(Vibra-Cell 250 watt sonicator)(Sonics and Materials,I nc.社製，Danbury，Connecticut)で20％最大出力で超音波処理した。超音波処理は、１５秒間続けた。超音波処理した混合物は、次いで殺菌蒸留水で希釈し、希釈溶液をペトリ平板中のトリプチケース・ソイ・アガー(trypticase soy agar) （以後「TSA 」と称する）上に置き、希釈平板を作った。TSA は、30g/l のtryp ticase soy broth(以後「TSB 」と称する)(BBL Microbiology Systems，Inc.，C ockeysville，Marylandから得た)及び15g/l の寒天を含む。TSA 及びTSB は、当該技術分野で公知の通常のバクテリア培地である。希釈平板は、28℃で２日間培養された。それぞれの根のサンプルの為に、バクテリアコロニーが、最も高い数の識別コロニーを有する希釈平板から選択された。平板上のそれぞれの目視識別形態のコロニーの１つを殺菌輪で試料採取し、新しいTSA 培養平板上に置き、他のバクテリアによる汚染のない平板中でコロニーを発育させた。28℃での２日間培養後、単独コロニーを、得られたバクテリア増殖から選択し、TSA 斜面培養基(slant)を接種するのに使用した。得られた斜面培養を、４℃で貯蔵し、それらを、以下に述べる植物保護検定でスクリーンした。 500 の異なる斜面培養物がこの方法で得られた。簡単に説明したこの単離方法の結果では、これら500 の培養物のいずれもが即時子孫(immediate sibligs)であるということは極めて考えにくかった。然しながら、500 より少ない分離バクテリア種が単離された。例えば、数多くの異なる培養物が、そのコロニーが、AT CC 53522として同定された培養物を含むバチルス・セレウスの外観を有するバクテリアから得られた。然しながら、これら培養物のそれぞれは、異なる根の断片から得られ、その根の断片は、それ自身４つの異なる地方の畑から得られた。従って、単独株が、２以上の斜面培養物中に存在した可能性は非常に低い。この事は、500 の培養物の１つだけの中のATCC 53522の外観で確認される。ここに開示された方法により得られた培養単離物のそれぞれは、Pmm に起因する苗立ち枯れからアルファルファの苗木を保護するそれらの能力に対してスクリーンされた。最初のスクリーニングは、園芸品種イロクイス(Iroquois)(Pmmによって攻撃され易い事で知られている)で行った。１グラムのイロクイスアルファルファの種を1 8M 硫酸に10分間浸けた。この種を、次いで２リットルの殺菌蒸留水で洗浄し、2 8℃で24時間震盪した。次に種皮をピンセットで手で取り除き、この種を、殺菌した湿潤バーミキュライト５mlを含む試験管中に播いた。３つの実生を、それぞれの試験管に播いた。実生を播いた二日後に、それぞれの試験管は、試験されるバクテリア単離物の３日令培養物の３mlを接種された。これらの培養物は、TSB で飽和まで成長させられて、胞子を形成した。次いで、各試験管は、直ちにPmm の1000の遊送子を接種された。 Pmm 遊送子は、エス・エイミラー(S．A．Miller)(1982)[(“Cytological an d Biochemical Factors Involved in the Susceptible，Host Resistant and No n-host Resistant Interactions of Alfalfa with Phytophthora megasperma”P h．D．thesis，University of Wisconsin]の方法で作られた。この方法で、Pmm のコロニーのサンプルは、その上で成長できる寒天培地に移された。通常のV8培地が使用され、これは水800ml 中、200ml V8野菜ジュース、2.5gのCaCO₃及び15g の寒天から成る。然しながら、菌類の成長を促進する通常のトマトジュース寒天又はニンジン寒天の様な寒天培地で十分である。菌類コロニーの試料は、24℃ で４日間、次いで28℃で更に３日間培養された。成長したPmm のコロニーが発生した。コロニーの周りの寒天は、寒天の切除で形成される「堀」で周りを取り囲まれたコロニー上の成長菌類で邪魔されていない寒天部分を残す為に切除された。この堀は、切除されていない寒天の水準まで、殺菌水で充たされた。この平板は、16℃で１時間培養され、それから水を置き換え、平板を、16℃で更に５時間培養した。遊送子を、菌類から堀の水の中に解き放した。水の中の遊送子の濃度は、血球計算盤で測定し、この水のサンプルを追加の殺菌水で16℃で希釈し、遊送子の最終濃度を10000/mlとした。遊送子の添加後、その植物を含む試験管を、24℃で、５日間、12光周期で培養し、この時の植物を、苗立ち枯れの症状で評価した。Pmm 及び園芸品種イロクイスの使用で、全ての対照植物は一様に死んだ。この様に、植物がともかく生き残ったと言うことは、使用したバクテリア単離物で発揮された生物学的防除の証明であった。生物学的防除に対して最少量の効果を示した全てのバクテリアは、その様な防除の整合性を検証する為に同じ方法で再試験された。ここに述べたスクリーニング方法は、以下で更に一般的に開示される植物保護検定の特別な例である。上述のウイスコンシンの４つの現場からの500 単離物の内、ATCC 53522株だけが、少なくとも20の分離供試体で証明された様に、イロクイスアルファルファにおいて、Pmm の生物学的防除を発揮する為の一様な能力を有すると同定された。防除の程度は、スクリーニング方法の条件下でその様な制御に置かれているアルファルファの苗木が、Pmm に曝された事のないアルファルファの苗木とはっきりと区別出来ない程度である。ATCC 53522は、生理試験、そのコロニー形態、及びその芽胞サイズ、形状及び位置から、バチルス・セレウスと分類された。この様に、ATCC 53522は、アセトインを産生し、グルコース液(glucose broth)から酸を形成し、澱粉を加水分解し、嫌気性寒天で成長する。これらの特徴は、コロニー形態、及びATCC 53522で観察される芽胞サイズ、形状及び位置と共に、バチルス・セレウスの独特な特徴として、R．E．Buchanan及びN．E．Gibons共著(1974) の“Bergey's Manual of Determinative Bacteriology，8th Edition，pp．532- 535 で引用される。バチルス・セレウスは、土壌中では珍しい細菌ではない。然しながら、抗真菌活性を示すバチルス・セレウス株は、今まで殆ど聞いたことがない。本発明者は、全く別々のソースから得たバチルス・セレウスの２つの既知の株を独自に試験し、それらのいずれもが、ATCC 53522の抗真菌性を示さない事を見出した。次に、更に以下で論じられる様に、抗生物質産生の為の他の畑の単離物をスクリーンする為の方法が考案され、他のその様な株が、今や容易に発見出来る。独自のスクリーニングでは、然しながら、この単離方法で検討された500 の根を共同したバクテリアの多くは、多分バチルス・セレウスであり、事実、それらの多くはAT CC 53522と同じコロニー形態を有するが、それら他の株のいずれもが、ATCC 535 22の抗真菌性を示さなかった。S．Wakayama，et al．(1984)(“Antimicrob.Agen ts Chemother.”，26，939-940)は、バチルス・セレウス株の抗真菌活性を述べている。然しながら、抗真菌性抗生物質の殆どはバチルスサブチルス(Bacillus subtilis)から作られ、このものは、ATCC 53522とは容易に区別出来る。ATCC 53 522で造られる抗真菌性毒素は、その毒素が低分子量のものであり、異なる溶解性を有するものとして引用されたバチルス・セレウスについて報告された株とは相違する。更に、ATCC 53522は、それが嫌気的に生育するのに対して報告された株は嫌気的に生育しないと報告されたバチルス・セレウスとは相違する。従って、この２つのバチルス・セレウス株は、同じではなく、それらの毒素は同じではない事が明らかである。以下は、植物保護検定についての記述であり、これによりバクテリア、抗生物質等の試験物質は、苗立ち枯れ又は根腐れの症状の原因となる菌類に対する生物学的防除を発揮するその能力を試験される。保護されるべき植物の種子は、菌に起因する苗立ち枯れ又は根腐れの存在する植栽培地に播かれる。この植栽培地は、その様な菌、バーミキュライト及び水の中、又は種子の中又はその上に存在する菌を伴う水の中のバーミキュライトを含む湿潤土壌か、或いは、種子が生育し、菌が自由に発育出来る他の植栽培地のいずれであってもよい。バクテリア、抗生物質又はその他の試験物質は、少なくとも種子の極近傍に置かれる。その様な置き方は、可溶性試験物質又は試験されているバクテリアの可溶性浸出物が、それが生育するにつれて種子と実際に接触状態にあれば、種子の「極近傍」にあるものと理解される。好ましくは、種子は試験物質で被覆され、試験物質が種子に関してその様に使用される時は、以後「種子接種物」と称する。種子を被覆する方法は、当業者にとって一般に公知のもので、バクテリアを殺すか、或いは種子接種物に含まれる毒素又は他の物質を破壊するのに十分に苛酷な条件を要求しない通常の方法が適当である。保護されるべき植物種子は、バクテリアのブロス培養に浸され、徹底的にそれと混合され、そのバクテリア懸濁液で種子の表面を被覆する。種子は、次いで無菌で、好ましくは殺菌ペトリ平板の様な殺菌表面上の層状のフローフード(laminar flow hood)の中に置く事によって乾燥され、乾燥種子接種物被覆種子となる。被覆種子が植栽培地に播かれると、試験物質は、種子の極近傍に居住する為にそれを同伴する。苗木の成長に十分な時間が経過した後で、苗立ち枯れの病状の発現後、播いた種子から発芽する苗木は、対照と比較して保護の視覚証明として評価される。苗立ち枯れの攻撃を受けやすいものとして知られるアルファルファの株では、12時間光周期で、24℃の成育室での２週間の成育時間は、苗木が、凡そ1000〜10000 のPmm の遊走子、或いは比較できる、苗立ち枯れの原因となる菌を含む試験管中で成育する時、苗立ち枯れの症状の発現には十分な期間であることが分かった。保護された種子は、感染していない種子から見た目では区別できない苗木となるが、保護されていない種子からの対照の苗木は死滅した。 ATCC 53522の保護突然変異株は、自然に、そして人工的に誘発された突然変異株の両方を含む。例えば、ATCC 53522は、抗生物質リファンピシン(rifampicin) 及びネオマイシン(neomycin)に対して一般に敏感である。然しながら、ATCC 535 22の自然突然変異株は単離され、それらの抗生物質の１つ又はその他の抗生物質に抵抗性を示した。これら突然変異株の或るものは、そのコロニーの外観で親の ATCC 53522から区別できる自然突然変異株同様に、以下に実施例で論じられ、そして、植物保護検定で、アルファルファ植物を保護する事が分かった。ATCC 535 22の他の突然変異株は、ATCC 53522を、以下の実施例で論じられる様な通常の方法で、突然変異誘発物質Ｎ−メチル−ニトロゴグアニジンに曝すことによって人工的に誘発された。これらの誘発突然変異株の大部分は、また植物保護検定で、アルファルファ植物を保護する事が分かった。種々の突然変異誘発研究は、ATCC 53522の培養で行われてきた。この培養は、ここで開示される生物学的防除検定で決定された通り、抗生物質の産生及び生物学的防除活性において不十分な突然変異株コロニーであった。これらの突然変異株コロニーは、また抗生物質産生において不十分であった。生物学的防除活性及び抗生物質蓄積の両方に対する突然変異株コロニーの分析は、生物学的防除が、ツビッターマイシンＡと抗生物質Ｂ両方の蓄積と関連ずけられるという解釈は、突然変異株からの裸のデータと一致する事を示した。残留疾病抑制活性は、検出できる抗生物質産生を欠く幾つかの株で検出され、その様な抑制活性は、遊走子溶菌活性又は他の薬剤に依拠する。この観察は、多くの生物学的防除バクテリアコロニーが、疾病抑制の為には複合戦略に依存し、そのデータは、抗生物質は必要であるが、培養の完全な生物学的防除にとっては十分ではないという事を示す事実と一致する。にも拘らず、抗生物質は、以下により詳細に述べる様に、バクテリア或いは殺真菌剤の防除の為の他の環境において、独立の有用性を有する。上述の通り、活性な、抗根腐れ毒素（ここでは、バチルス・セレウス抗生物質ツビッターマイシンＡ及び抗生物質Ｂとして同定された）は、ATCC 53522及び、植物保護検定で根腐れから植物を保護するそれらの能力によって特徴ずけられるその突然変異株によって産生される。この２つのバチルス・セレウス抗生物質は、成育培地から集める事が出来、その培地で、バクテリアは培養され、実質的に純粋な形態で調製された。バチルス・セレウス抗生物質の調製は、Pmm による根腐れの抑制に対して活性で有り得る様な妨害物質がなければ「実質的に純粋」と見なされる。この２つのバチルス・セレウス抗生物質は、苗立ち枯れ及び根腐れから植物を保護するのに効果的であり、それを産生するバクテリアから分離され、種子及び、根腐れ原因の菌を含む植栽培地に置かれた苗木に適用されても効果的である。以下において論ずる様に、この２つのバチルス・セレウス抗生物質の適用の有効性は、保護バクテリアを抗生物質で置き換えて、植物保護検定で証明可能である。この様に、本発明は、抗生物質のいずれか又は両方、及びいずれかのバチルス・セレウス抗生物質の有効量含む種子接種物を含む。上述の通り、バチルス・セレウス抗生物質は、それらが芽胞形成した培養に成長した培養培地からバクテリアをろ過する事によりATCC 53522及びその保護突然変異株から単離出来る。その他の通常の精製及び濃縮工程は、都合のよいもの又は望ましいものと考えられれば、毒素が、植物保護検定で証明される様な活性を残す限り採用してもよい。ここに述べたバチルス・セレウスからの両抗生物質は、バクテリアの培養及びその培養上澄み液から得られる抗生物質の濃縮によって、バチルス・セレウスATCC 53522の培養から容易に単離できる。この上澄み液は、カラムで分別し、次いで電気泳動で分離して生物学的防除活性を示す画分を同定する事が出来る。両抗生物質は、ニンヒドリン又は硝酸銀で染色する事が分かった。抗生物質ツビッターマイシンＡの化学式及び構造は、精力的に研究された。バチルス・セレウス抗生物質として最初に同定された分子の分子量は、500 〜1000 ダルトンと最初考えられた。次に精製された抗生物質で、現在ツビッターマイシンＡと称されるものの、質量分光分析による分子量測定では、約396 ダルトンの分子量を示した。抗生物質ツビッターマイシンＡは、非常に弱いアニオンではあるが、電場ではアニオン及びカチオンとして移動する。繰り返し実験では、抗生物質ツビッターマイシンＡは、植物保護検定によって様々な保護能力を試験された。試験（その内の幾つかは以下に論じられる）は、ツビッターマイシンＡ抗生物質が、他の菌種同様に、フィトフトラ(Phytophthora)及びクサレカビ属種(Pythi um)に対して有用な抗生物質能力を証明した事を示した。更に、抗生物質ツビッターマイシンＡは、また幾つかのバクテリア、特にエルウイニア・ヘルビコラ(Erwinia herbicola)、幾つかのシュードモナス(Pseudomonas)種及び幾つかの大腸菌株の成長を抑制する。ツビッターマイシンＡの化学構造は実験的に同定された。図１は、同定された分子の決定された化学構造を示す。この分子は、アミノポリオール抗生物質であり、バチルス種から単離された新種の抗生物質である。ツビッターマイシンＡは、非常に弱い酸であり、他のアミド含有化合物同様に、pH9.2 でアニオンとして移動する。抗生物質ツビッターマイシンＡは、分光分析的に検出出来るクロモフォレス(chromophores)を含有しないので、精製又は分別中の検出方法としては生体活性に依存するのが適当である。図１で例示の構造は、本来の分子、そのアセチル化誘導体及び加水分解生成物について、NMR 及び質量分析により決定された。この構造は正しいものと考えるが、分子の全体の化学特性又は構造に影響を及ぼす事なく、小さな残基の僅かな置き間違えのある可能性はある。上述の通り、この分子は、明らかに線状のアミノポリオールで、カチオンであり、非常に弱い酸である事が分かる。図１に開示の構造は、その解釈と一致し、正確な分子構造であると考えられる。この点で、抗生物質Ｂは、不完全な構造が知られる。抗生物質Ｂは、また生物学的防除検定で抑制活性を示す。抗生物質Ｂは、またpH7.0 でCM−セファデックス(CM-sephadex)又はアンバーライトIRC-50に結合し、pHが10.0以上に上昇すると溶離する。抗生物質Ｂの染色性及び核磁気共鳴プロフィールは、それがアミノグルコシドである事を示す。抗生物質Ｂは、ツビッターマイシンＡより抗真菌性及び抗菌性活性について、僅かに狭いペクトルを有するが、にも拘らず、広い抗真菌性及び抗菌性効力をかなりに示す。以下の実施例で示す通り、ツビッターマイシンＡ及び抗生物質Ｂは共に、様々な病原性菌類及びバクテリアに対して顕著な活性を有する。またデータが示す通り、別々に有用な抗生物質であるばかりでなく、それらはまた、互いに組合せて使用する時は、或る種の共働活性(synergistic activities)を有する。この抗生物質は、バチルス・セレウスATCC 53522の培養によって調製出来るが、広く様々な他のバチルス・セレウス培養からも等しく回収出来る。以下の記述は、ATCC 53522を用いて最初に単離した様な植物保護活性を試験する為に開発された植物保護検定である。その同じ検定は、生物学的防除活性の為の他の候補のバチルス・セレウス株を試験する為に使用出来ると考えられるし、それらの株は、またここに述べた抗生物質ツビッターマイシンＡ又は抗生物質Ｂの１つ又は両方を造るものと考えられる。抗生物質は、それらを産生するバクテリアコロニー、例えば微生物の芽胞形成コロニーからの上澄み液を回収する事によるATCC 53522から容易に単離される。上述の様な上澄み液は、カラムで分別出来、次いで生物学的防除活性を示す画分を同定する為に、電気泳動で分離出来る。高電圧ペーパー電気泳動を使用して、ツビッターマイシンＡ及び抗生物質Ｂの様なここで同定された２つの分子は、繰り返し、容易に回収出来る。pH9.2 で、高電圧ペーパー電気泳動(HVPE)は、２スポットを生成し、これは生物学的防除活性と関連づけられる。第１のスポットは、ツビッターマイシンＡに関連し、オレンジＧと比較して0.30の相対易動度(R_f) を有する。抗生物質Ｂスポットは0.032 の R_f を有する。同じHVPE法をpH1.7 で行うと、ツビッターマイシンＡ及び抗生物質Ｂの相対易動度は、それぞれ R_f -1 .042 及び-0.909である。以下に開示する様に、ツビッターマイシンＡ及び抗生物質Ｂは共に、多くの菌及びまた幾つかのバクテリア、病原体に対して広範な抗生物質活性を有する。この活性は、植物病原体のみならず、有力な哺乳動物病原体にまで広がる。個々の病原体の毒性レベルは、有意な範囲にわたって変化する事が、以下のデータから示される。従って、特定の病原体を防除するのに必要な量は、以下に述べられるタイプのin vitro研究で実験的に決定出来る。その様な研究を基にして、「効果的量」は、特定の目標微生物に対して決定出来る。実施例１アルファルファを使用するATCC 53522の植物保護検定アルファルファで以て、ATCC 53522の保護能力を試験する為に、植物保護検定の応用として、上述のスクリーニング方法を繰り返した。使用したアルファルファの栽培品種はイロクイスであった。使用した菌はPmm であった。１ｇの種子を、18Ｍの硫酸に10分間浸し、２リットルの殺菌蒸留水中で洗浄し、10mlの殺菌蒸留水中に入れ、28℃で24時間震盪した。その後、種子被膜をピンセットで除去し、この苗を５mlの湿潤バーミキュライトを含む試験管に植えた。３つの苗をそれぞれの試験管に植えた。２日後、各試験管を、飽和まで、TSB で成長したATCC 535 22の３日令培養物の0.3ml で接種した。その後、各試験管を、Pmm の1000の遊走子で接種した。植物は、次いで７日間、12時間光周期で、24℃で培養され、そこで植物の生育力を評価した。対照苗は全て死んだ。ATCC 53522で処理した苗の殆どは、Pmm に曝されていない普通の苗の外観を呈していた。実施例２大豆でのATCC 53522の植物保護検定アルファルファの種子に代えて、バラエティーマッコール(variety McCall)の大豆を用い、Pmm の遊走子に代えて、フィトフトラ・メガスペルマ f．sp．グリシネア(Phytophthora megasperma f．sp．glycinea)の遊走子を用いて実施例１の方法を繰り返した。試験管への植え込みに代えて、大豆種子を、底に穴の空いた10mlプラスチックコーンに植え、このコーンを水皿の中に置いた。この苗を、遊走子で接種後、保護２週間試験した。10の対照苗の10が、菌によって殺された。ATCC 53522で処理した苗の全ては、健康で白い根で生き残った。実施例３ ATCC 53522 の野外試験栽培品種イロクイスのアルファルファ種子を、1.5%メチルセルロースのATCC 5 3522の懸濁液中で混合した。このバクテリアを、３日間、30℃で培養したTSA 平板上で培養した。この時間で、培養物は芽胞を形成した。次いで、この培養物を 1.5%メチルセルロース溶液の３ml中にすり落し、バクテリアの懸濁液を作った。１ｇのアルファルファ種子をこの懸濁液に加え、徹底的に混合した。次いで、この種子を、殺菌ペトリ平板上に押し広げ、層状のフローフード(laminar flowhoo d)中で一昼夜乾燥した。被覆した種子を、マーシュフィールド(Marshfield，Wis consin)で、直径0.3mの円形プロット(circular plots)に植えた。乾燥生育条件の為、植物の発現及びPmm 苗立ち枯れの形跡は共に乏しかった。にも拘らず、対照の、未処理プロットでの発現は、18% であり、これに対してバクテリアで処理された種子を植付けたプロット中では、発現は30% であった。殺菌剤メタラキシル（苗立ち枯れ用の通常の防除剤）で被覆した種子で、追加のプロットに植え付けた。このプロットでは、発現は29% であった。この様に、ATCC 53522は、メタラキシル同様に効果的にその畑でアルファルファを保護出来る事が明らかである。更に、根腐れ症状は、その成長期が進行するにつれて、未処理の種子を有する対照プロット中で明らかとなった。根腐れ症状は、ATCC 53522で被覆した種子を植えたプロット中では現れなかった。実施例４ ATCC 53522 毒素の植物保護検定そのバクテリア属の培養の炉液で置き換えられたATCC 53522で、実施例１の方法を繰り返した。炉液は、２日令の、飽和したブロス培養物を、10,000ｇで、10 分間、遠心分離に掛け、次いで得られた上澄み液を、0.45μフィルターを通して二度ろ過して調製した。上澄み液は、バクテリアが、実施例１で報告された実験で適用された方法と全く同じに植物保護検定に適用する前に、−20℃で貯蔵した。処理されたアルファルファ苗対未処理苗で観察された保護効果は、実施例１で報告されたものと同一であった。この実施例で使用した炉液は、バチルス・セレウス抗生物質を含んでいた。実施例５ ATCC 53522 の自発突然変異体自発的に発生するATCC 53522の抗生物質抵抗突然変異体は、ATCC 53522が普通敏感な抗生物質を含む培地のATCC 53522のコロニーからの培養をプレーティングする事より単離された。幾つかの抵抗コロニーが発生した。それらを殺菌楊枝(t oothpick)でそれぞれ試料とし、抗生物質含有培地に戻した。この突然変異体を、次いで実施例１で述べた方法による植物保護検定で試験した。５つの突然変異体が発生し、これらはリファンピシン(rifampicin)に対して抵抗体であった。六番目に発生した突然変異体は、ネオマイシン(neomycin)に対して抵抗体であった。それぞれの突然変異体は、ATCC 53522と同様に、実施例１で適用した植物保護検定で、アルファルファ植物を効果的に保護した。実施例６ ATCC 53522 の誘発突然変異体 ATCC 53522の栄養生長細胞(vegetatively growing cells)の培養物を調製し、 10⁸細胞/ml の密度まで希釈した。この培養物を、室温で、30分間、１μｇ／ml のＮ−メチル−ニトロソグアニジンに曝して処理した。この細胞を、次いで水で洗浄し、希釈平板をTSA 上に調製した。Ｎ−メチル−ニトロソグアニジンでの処理は、元の培養物中のバクテリアの99% を殺した。この様に、生き残った生育可能なバクテリアそれぞれは、少なくとも１つの突然変異を含む事についての高い可能性を有する。別個のコロニーから得られた500 のバクテリアの内、490 は、実施例１の方法で試験した時、Pmm に対してアルファルファ植物を保護できた。実施例７自然株及び抗生物質欠乏突然変異体を以て、炉液画分活性を試験する事により、植物保護活性がバチルス・セレウス抗生物質に在る事を証明する為に、実施例１の検定方法を再度使用した。株Ｔ３０は、バチルス・セレウスATCC 53522からの抗生物質欠乏突然変異体である。この方法の結果は、以下の表１に示される。この結果は、植物保護活性が、バクテリアのバチルス・セレウス抗生物質個々にあり、抗生物質欠乏突然変異体には存在しない事を証明する。実施例８ファージＰ７の単離 ATCC 53522の培養物を、強く攪拌しながらトリピック大豆ブロス(trypic soy broth)中で生育した。バクテリアの対数増殖期(log-phase growth phase)中に、ミトマイシン C(mitomycin C)を、最終濃度１μｇ／mlの培地へ添加した。培養物中のバクテリアを、ミトマイシン Cの添加後、８〜９時間溶解した。ファージ粒子は、柔らかい寒天(0.4%)中で成長したATCC 53522の芝生上の培養物の一定部分をプレーティングすることにより、残留培養物から単離した。次いで個々のプラークを取り上げ、類似の副次培養(subculture)に再び戻した。Ｐ７ファージは、オーバーレイのクリーニングの為に、柔らかい寒天オーバーレイ上で、ATCC 5 3522の培養上の十分な溶解物をプレーティングする事により増殖された。オーバーレイは、平板から一般に除去され、寒天は、遠心分離で除去され、上澄み液は、更に使用の為貯蔵された。その後、上澄み液は、増殖と追加のファージＰ７を単離する事を続ける為に培養物上に再接種された。ファージＰ７の試料は、受理番号75237 でATCCに寄託された。実施例９その他の生物学的防除バクテリアの単離バチルス・セレウスの追加の個体群を、土壌、又は畑で成長した大豆及び、生育室の畑の土壌で生育したアルファルファ、大豆及びインゲンマメから回収した。この試料を、土壌、種子、子葉、小根又は冠部下0-1 、0-2 、2-3 、4-5 、又は9-10cm或いは根の最後のcmから取った１〜２ｃｍの根の断片の音波処理した試料で希釈平板した。この目的の為に、冠部を、土壌−空気界面にある植物の部分と定義し、土壌から取り除かれ時に、各植物の上に印を付けた。殺菌蒸留水の５ mlか10mlに置かれた植物材料を、次いで15秒間、250 W Vibra-sonicator(Sonics and Materials)の20% 出力で音波処理し、次いで殺菌蒸留水で連続的に希釈した。希釈液の一定部分(0.1ml)を、次いで半選択培地(semi-selective medium)の上でプレート化した。この半選択培地(Min IC)は、少数の非−バチルスバクテリアがその上で成長し、それによってバチルス・セレウスの検出の為の半選択を行うので使用した。この半選択培地は、１リットル当り、2.0gの(NH₄)SO₄、6.0gの KH₂PO₄、14.0g のK₂HPO₄、0.2gのMgSO₄-7H₂O、0.25mgのMnSO₄-H₂O 、1.0gのトリナトリウムサイトレート-2H₂O 、0.1gのチアミンハイドロクロライド、2.0gのL- グルタミン酸及び5.0gの酸加水分解カゼイン（シグマ）を含む。オートクレーブ処理後、10mlの殺菌50%(ｗt/vol)グルコース溶液及び10mlの殺菌FeCl₃-6H₂O(4.0 mg/ml)を添加した。この半選択培地は、また12.5μg/mlのポリミキシン(polymyx in)B−サルフェート、50μg/mlのアンピシリン(ampicillin)、及び100 μg/mlのシクロヘキシミドで接種された。畑から集められたバチルス・セレウス単離物は、半選択培地でスクリーンされた。バチルス・セレウスのコロニーは、半選択培地でのそれらの独特のコロニー形態、即ち大きくて、平らで、しわの寄った、クリーム又はオレンジに着色したコロニーによって識別できた。実施例10 推定の生物学的防除剤のスクリーニングこの方法で単離された生物学的防除剤は、次いで、互いに強い相互関係を持つことが分かっていて、生物学的防除活性が可能で、ツビッターマイシンＡ毒素を産生するバチルス・セレウス株を同定出来る３つのアッセイの使用に基づいて、選択基準に掛けられた。１つのアッセイは、Ｐ７ファージによる感染に対する候補株の感染性に基づく。第２のテストは、エルウイニア・ヘルビコラ(Erwinia h erbicola)を使用する実験室的生物学的防除研究に基礎を置く。第３の研究は、ツビッターマイシンＡそれ自身の産生の為の、実際の染色分析である。これらのアッセイの全ては、完全ではないが、十分に相互関連性がある。然しながら、Ｐ７に感染し得るものである事が分かっているものを除くそれぞれの株は、エルウイニア抑制の為のポジティブを試験し、抗生物質産生に対して染色した。全体として又は単独に行ったこれらの検定の結果は、実際の植物での生物学的防除研究で検証される。ファージ敏感選択性(phage sensitivity selection)は、次のプロトコルを使用して行った。ファージＰ７の高滴定濃度試料（10⁹pfu/ml以上）は、感染したブロス培養又は前の実施例で述べたバチルス・セレウス ATCC 53522 の頂上寒天オーバーレーのいづれかから調製した。細胞は、遠心分離で除去され、上澄み液がろ過された（0.2 μ又は0.45μフィルター）。ファージ試料は、滴定され、冷蔵庫に貯蔵した。別に、候補の微生物の培養物が、50% トリプシン・ソイ・アガー(TSA)で成長された。この生育は、培養平板から掻き取られ、少量の50% トリプシン・ソイ・ブロス(TSB)に懸濁し、３mlの溶融50%TS 頂上寒天(0．4%寒天)に添加し、50%TSAの平板上に広げた。高滴定ファージストックの小滴（大きさで凡そ10マイクロリットル）を、平板上に置いた。この平板を、一昼夜、28℃で培養した。この培養物に導入されたファージの小滴が透明帯を形成すれば、この株は、ファージに対して敏感であるとして計算した。エルウイニア・ヘルビコラ抑制の為の実験室的生物学的防除検定は次の様にして行った。エルウイニア培養物を、震盪させながら50%TSBで、一昼夜、28℃で成長させた。このエルウイニア細胞を、試験管の底に鎮静化せしめ、エルウイニアのストックを、２週間程度、冷蔵庫に貯蔵した。テストの為の候補バチルス・セレウス株は、震盪させながら50%T SBで、28℃で、２〜３日間成長させた。このエルウイニアストック試験管の頂上からの15マイクロリットルを、試験管を震盪させることなしに取り出し、殺菌水１ml中に入れた。このエルウイニア希釈液の85マイクロリットルを、次いで平板上の水寒天又は25% トリプチック・ソイ．アガーの上に広げた。殺菌コルクボーラーで４つの穴を平板上に空けた。凡そ100 マイクロリットルの候補バチルス・セレウス試験培養物を、平板上に空けたその穴のそれぞれに加えた。バチルス・セレウス培養物の周りのエルウイニア成長の抑制帯は、２〜３日で計算した。候補は、抑制帯が現れた時は陽性と計算した。ツビッターマイシンＡの産生の為の検定の為に、候補バチルス・セレウス培養物の培養は、上述の条件下に維持された。培養物は、完全に芽胞を形成し、胞子を除去する為に遠心分離にかけられた。上澄み液を、アンモニア形態で、ＣＭセファデックス・カチオン交換カラムにかけた。このカラムを、次いで緩衝液（６ mlの10mM N,Nビス(2−ヒドロキシエチル)２−アミノエタンスルホン酸、pH7.0 ）で洗浄した。結合毒素が若し存在すれば、10mMの３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸、pH 10.4 で溶離した。画分を集め、回転蒸発器で乾燥し、水に懸濁した。再懸濁した材料を濾紙上にスポットし、pH 1.7、300 ボルトで、15 分間、予備的高電圧ペーパー電気泳動(preparative high voltage paper electr ophoresis)に掛けた。電気泳動に掛けられた濾紙は、アセトン中の0.25% ニンヒドリンを含む溶液に浸して染色した。紙のこの板を乾燥し、スポットが見えるまで110 ℃で加熱した。ニンヒドリン染色スポットの発生は、抗生物質の産生を証明した。以下の表２は、単離された株を分析した結果を纏めたものである。この結果は、３つの実験室的試験、即ちＰ７感染性、エルウイニア抑制及び抗生物質検出が、互いに、然も生物学的防除活性で立派に相互関係にある事を示す。幾つかの株は、その試験の１つを果さず、未だ生物学的防除の可能性を有するが、１つ以上の検定を通過した各株は、生物学的防除活性を示した。故に、これらの検定は、単独でも集合的でも、新しい生物学的防除株を選択する為の有用な実験室的手段を提供する。実施例11 バチルス・セレウスATCC 53522培養物を、半強力トリプチケース・ソイ・ブロス(TSB)で成長させた。次いで、１リットルの、３日令の完全に芽胞した培養物を胞子を除去する為に遠心分離にかけ、この培養上澄み液を、2.0M NaH₂PO₄でp H7.0 に調整し、次いでアンバーライトIRC-50（シグマ）を含むカラム（2.2 cm x 30.0 cm）にかけた。このカラムを、5.0mM NH₄HPO₄/NH₃、pH7.0 で洗浄し、1. 0MNH₃、pH11.2で溶離した。凡そ30mlの材料を、pHが10以上に上昇した後にカラムから集め定量した。活性画分を、次いで高電圧電気泳動(HVPE)で、pH9.2 で精製した。電気泳動記録から、２つのスポットが、２つの抗生物質、ツビッターマイシンＡ及び抗生物質Ｂと同定された。ツビッターマイシンＡのスポットは、オレンジＧに比べて 0.30の相対易動度(R_f)を有していた。抗生物質Ｂのスポットは、0.032 の R_fを有していた。これらのスポットは溶離され、pH1.7 で、HVPEにかけられた。pH1. 7 では、抗生物質は、２−カチオン(ツビッターマイシンＡの R_f=-1.042 及び抗生物質Ｂの R_f=-0.909)類似の易動性を示した。別に、抗生物質活性を試験するために、精製したツビッターマイシンＡ及び抗生物質Ｂの検定に使用する為に、バクテリア及び菌病原性株のパネルを集めた。バクテリア株は、全て、ミューラー・ヒントン(Muller-Hinton(MH))ブロス（シグマ）中、pH7.3 で試験され、MHブロスは、３−（ｎ−モルフォリン）プロパンスルフォン酸（MOPs）で、pH8.0 に緩衝した。リゾビウム(Rhizobium)及びラクトバチルス(Lctobachillus)株の感染性試験は、L-ブロス(Mniatis，1982)で行った。特別の処理を必要とする他の株は、１μｇ／mlのビオチン(biotin)が添加されたMHブロスで成長したロードスプリリュウム(Rhodosprillum)及び、20μｇ／m lのスクロースが添加されたMHブロスで成長したクロストリジウム(Clostridium) であった。以下に述べられる菌株の感染性試験は、pH5.6 でポテトデキストローズアガー (PDA)で行われ、PDA は、MOPsでpH7.0 に緩衝した。バクテリア感染性試験の為に、最少抑制濃度(minimum inhubitory concentrat ion)(MICs)が、ブロス希釈法で決定された。接種物は、新鮮なブロス培養から調製し、凡そ5x10⁵CFU/ml の接種物濃度とする為に希釈した。抗生物質を、50μｇ／ml〜400 μｇ／mlの範囲で、２つの混ぜ合わせた希釈液に添加し、それぞれの試験管を１mlとした。培養物を、28℃で、24時間震盪しながら培養した（ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobachillus acidophilus)、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、リゾビウム・メリローテ(Rhizobium mel iloti)、リゾビウム・トロピシ(Rhizobium tropici)、ロードバクテル・スファロイデス(Rhodobacter spaeroides)、及びロードスピリリュウム・ラブラム(Rod ospirillum rubrum)に対しては48時間）。クロストリジウム・パストリアナム(C lostridium pasteurianum)を、嫌気性条件下で、殺菌鉱油３mlで培養物をオーバーレーし、次いで培養物を４日間、室温で成長させて試験した。MICsは、目に見える成長を阻止する最少抗生物質濃度として解釈された。ツビッターマイシンＡのMICsの50μｇ／mlでのバクテリアを、10μｇの漸増で、０〜50 μｇ／ml抗生物質で再試験した。最少殺菌性濃度(minimal bactericidal concen trations)(MBCs)は、目に見える成長のないそれぞれの試験培養からの0.1ml を、ミユラー・ヒントンアガー（シグマ化学社）平板上に広げることにより、各バクテリア株に対して決定した。28℃で24〜48時間の培養後、平板でのバクテリアの成長を計算した。遊走子菌は、次の様にして試験した。アファノミセス・オイテキス(Aphanomyces euteiches)(2x10⁴)、フィトフトラ・メディカギニス(Phytophthora medicaginis)(5x10⁴)、ピチウム・アファニーデルマータム(Pythium aphanidermatum)(1x10³)、及びピチウム・トルローサム( Pythium torulosum)(1x10³)の遊走子を、PDA 平板上に広げた。ウエルを、殺菌したコルクボーラーで寒天の中央に切った。精製した抗生物質を、ウエルの中にピペットで移し、平板を、室温で48時間培養した。抑制帯が、ウエルから可視成長まで測定された。この検定でのMICsは、抑制帯となった最少抗生物質濃度であった。カンジダ・ユティルス(Candida utilus)、サッカロミセス・セレビシエ(S accharomyces cerevisiae)、及びユスチラゴ・メイディス(Ustilago maydis)を同じ方法で試験し、凡そ１x10⁴CFUsを、PDA 平板上に広げた。ベンツリア・イナクワリス(Venturia inaequalis)を、２x10⁵の分生子を50%PDAの25ml中に混合して試験した。寒天を簡単に渦巻きにして、ペトリ平板中に注いだ。抗生物質の置き場所として、ウエルを平板中に切った。他の菌は、次の様にして、抗生物質感受性を試験した。 PDA平板を、平板中央のマイセリアプラークで培養した。ウエルを、プラークから５〜10mm、寒天の中に切った。精製した抗生物質(200μg)を、ウエルに置き、平板を室温で培養した。試験菌の様々な成長速度の為、２〜６日後に平板での成長を計算した。バクテリアに対する抗生物質ツビッターマイシンＡ及び抗生物質Ｂのin vitro 試験のデータは、以下の表３に列挙する。一方、菌病原体に対する試験で得られた結果は、以下の表４に列挙する。又、以下に示す表５は、ツビッターマイシンＡ及び抗生物質Ｂの結合活性を、この２つの抗生物質のそれぞれの種々の組合せで、大腸菌に対する評価を行った実験である。上記データが示す通り、本発明の抗生物質は、様々の病原菌に対して広範囲の活性を有し、また多くのバクテリア病原体に対して顕著な活性を有する。更に、大腸菌の研究から、本発明の抗生物質の作用は共働的であり、それらは、単独ではいずれも達成できない抑制水準を達成する為に、共同して作用するという事が明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:085） (72)発明者シロスーローラアメリカ合衆国ウィスコンシン州 53562 ミドルトンフェアザントレーン 6431 (72)発明者クラーディージョンアメリカ合衆国ニューヨーク州 14853‐1301 イサカケイユーガハイツロード 616 (72)発明者ヒーハイインアメリカ合衆国ノースカロライナ州 27514 チャペルヒルエフィサスチャーチロード 107‐1250

Claims

【特許請求の範囲】 1. バチルス・セレウス・ツビッターマイシンＡ抗生物質の実質的に純粋な調製物。 2. 該抗生物質が、バチルス・セレウス株ATCC 53522によって産生される、請求の範囲１項記載の調製物。 3. バチルス・セレウス・抗生物質Ｂの実質的に純粋な調製物。 4. 該抗生物質Ｂが、バチルス・セレウス株ATCC 53522によって産生される、請求の範囲３項記載の調製物。 5. バチルス・セレウス・ツビッターマイシンＡ抗生物質とバチルス・セレウス・抗生物質Ｂの実質的に純粋な調製物。 6. 該抗生物質が、バチルス・セレウス株ATCC 53522によって産生される、請求の範囲５項記載の調製物。 7. バクテリア宿主から分離された以下の化合物を含む組成物。 8. 該化合物が、バチルス・セレウス株ATCC 53522によって産生される、請求の範囲７項記載の組成物。