BR122013013171B1 - Composição compreendendo cepa isolada de streptomyces - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO CEPA ISOLADA DE STREPTOMY-CES".

Dividido do PI0114192-9, depositado em 27.09.2001.

Campo da Invenção A presente invenção é do campo de biopesticida.

Fundamento da Invenção Durante vários anos, sabe-se que vários microorganismos e-xibem atividade biológica a fim de ser útil para controlar doenças de plantas. Embora progresso tenha sido feito no campo de identificação e desenvolvimento biológico de pesticidas para controlar várias doenças de plantas de importância horticultura! e agronômica, a maioria dos pesticidas em uso são ainda compostos sintéticos. Muitos desses fungicidas químicos são classificados como carcinógenos pela EPA e são tóxicos para animais selvagens e outras espécies não-alvo. Além disso, os pató-genos podem desenvolver resistência aos pesticidas químicos (Schwinn e outros, 1991). O controle biológico oferece uma alternativa atrativa para fungicidas químicos sintéticos. Os biopesticidas (organismos vivos e os compostos natural mente produzidos por esses organismos) podem ser seguros, mais biodegradáveis, e menos onerosos para desenvolver.

Os actinomicetos, incluindo os estreptomicetos, são produtores conhecidos de metabólitos antifúngicas (Lechavaiier e Waksman, 1962; Le-chavalier, 1988). Vários antibióticos produzidos por actinomicetos são rotineiramente empregados em um ambiente agrícola tal como estreptomicina e terramícina para o controle de fire blight.

Os estreptomicetos têm demonstrado ambas atividades in vitro e in vivo contra patógenos. Axelrood e outros (1996 isolaram 298 actinomicetos de raiz de pinheiro Douglas. Aproximadamente 30% dessas cepas demonstraram atividade antifúngica contra Fusarium, Cylindrocarpon, e/ou Py-thium in vitro. Yuan e Crawford (1995) reportaram que Streptomyces lydicus WYEC108 mostrou ambas atividades antifúngica in vitro forte e inibição de deterioração da raiz por Pythium em testes em potes com sementes de algodão ou ervilha. Ressi e Rao (1971) controlaram o apodrecimento devido a umidade por Pythium em tomates e perda de Fusarium de algodão com s-treptomyces ambofaciens. A decomposição da raiz por Rhizoctonia foi controlada por streptomyces hygroscopicus var. geldanus (Rothrock e Gottlieb, 1984). Esses autores relataram que o controle foi dependente da concentração de geldanamicina in situ produzida por esta cepa. Os mesmos autores também observaram proteção de soja de Phytophthora megasperma var. sojae por Streptomyces herbaricolor e streptomyces coeruleofuscus (1984). Chamberlain e Crawford (1999)observaram antagonismo in vitno e in vivo de patógenos fúngicas de pasto por cepa YCED9 S. hygroscopicus. Crawford (1996) patenteou o uso desta cepa para controlar patógenos na patente US n° 5.527.526. Tal (1998) patenteou 2 Streptomyces sp. que foram ativas contra Rhizoctonia solani e Phytophthora capsici. Um produto de Streptomyces griseoviridis contra Fusarium spp. e outros patógenos do solo está no mercado como Mycostop®.

Sumário da Invenção Um novo antibiótico produzido por Streptomyces sp. é fornecido o qual exibe atividade antifúngica somente em certos patógenos de planta específicos. Também fornecido é um método para tratar ou proteger as plantas de infecções fúngicas compreendendo aplicar uma quantidade eficaz de um antibiótico produzido por Streptomyces sp. tendo todas as características de identificação de Número de Acessão NRRL B-30145. A invenção também refere-se a composições fungicidas compreendendo esta nova cepa de S-treptomyces e os antibióticos e metabólitos produzidos por esta cepa ou sozinha ou em combinação com outros pesticidas biológicos e químicos. O antibiótico produzido por Streptomyces sp. pode ser fornecido como uma suspensão em uma cultura de caldo total ou como um sobrena-dante contendo antibiótico obtido a partir de uma cultura de caldo total de um antibiótico contendo Streptomyces sp. Também fornecido é um novo antibiótico solúvel em butanol que exibe atividade antifúngica específica e um processo para isolar o novo antibiótico solúvel em butanol.

Breve Descrição das Figuras A figura 1A é o cromatograma de HPLC analítico de fração ativa 6. (Microsorb C18, 10cm x 4,6 mm, 100Â, taxa de fluxo 1 ml_/ minuto, detecção de UV em 220 nm, acetonitrila + 0,05% de TFA/ água + 0,05% de gradiente como segue: 0-30 minutos, 5-65%; 30-40 minutos, 65-100%; 40-45 minutos, 100%). A figura 1B é o espectro UV do pico ativo eluindo em 14,755 minutos no cromatograma descrito em 1A. A figura 2A é o cromatograma de HPLC analítico de fração ativa 7 sob as mesmas condições descritas em 1A. A figura 2B é o espectro UV do pico ativo eluindo em 16,146 minutos no cromatograma descrito em 2A. A figura 3 é o cromatograma de HPLC C-8 do eluato de metanol da etapa da resina HP-20 descrita no método B. (coluna HP Zorbax Eclips XDB-C8, 5 μηη, 150 x 4,6mm, taxa de fluxo 0,8 mL/minuto, detecção de UV em 220nm, velocidade do mapa 2mm/minuto. O solvente A, 25:5:70 acetonitrila/ metanol/ água. O solvente B, 65:5:30, acetonitrila/ metanol/ água. Gradiente: 100% de A em 0 minutos aumentado para 3% de B em 20 minutos). A figura 4 é o espectro 1H RMN (400 MHz, CD3OD) do metabóli-to ativo semipuro obtido a partir do método A de purificação. A figura 5 é o espectro 13C RMN (100 MHz, CD3OD) do metabó-lito ativo semipuro obtido a partir do método A de purificação. A figura 6 é o LC ESI-EM (Impacto EletroSpray de Cromatografia Líquida- Espectro de Massa) de Pico A obtido a partir do método B de purificação. (Microsorb C18, 10 cm x 4,6 mm, 100Â, taxa de fluxo 1mL/minuto, acetonitrila + 0,02% de TFA / água + 0,02% de gradiente como segue: 0-30 minutos, 5-65%; 30-40 minutos, 65-100%; 40-45 minutos, 100%).

Figura 7 é o LC ESI-EM (Impacto de EletroSpray e Cromatografia Líquida- Espectro de Massa) de Pico B obtido a partir do método B de purificação. (Microsorb C18, 10 cm x 4,6 mm, 100Â, taxa de fluxo 1 mL/minuto, acetonitrila + 0,02% de TFA/ água + 0,02% de gradiente como segue: 0-30 minuto, 5-65%; 30-40 minutos, 65-100%; 40-45 minutos, 100%).

Descrição Detalhada A presente invenção fornece uma nova cepa de Streptomyces sp. ou mutantes destes atividade antifúngica somente em patógenos de planta específicos tal como Alternaria, Phytophthora, Botrytis, Rhizoctonia e Sclerotinia. Esta nova cepa foi depositada com o NRRL em 20 de julho de 1999 sob as provisões do Tratado de Budapest no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para o Propósito de Procedimento de Patente sob o número de Acessão B-30145. A invenção também inclui métodos de prevenir e tratar doenças fúngicas em plantas empregando tais cepas bactericidas ou sobrenadantes contendo antibiótico ou antibióticos puros obtidos de tais cepas bactericidas. A invenção também inclui um antibiótico antifúngica solúvel em butanol com um peso molecular menor do que 10.000 dáltons, com resistência a base e ao tratamento a quente de 1 hora em 80°C e labilidade ao tratamento por ácido.

Definições A forma singular "um", "uma" e "o" inclui referências no plural a menos que o contexto claramente prescreva de outro modo. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo misturas destas. O termo "compreendendo" é pretendido significar que as composições e métodos incluem os elementos recitados, porém não excluindo outros. "Consistindo essencialmente em" quando empregado para definir composições e métodos, deveria significar excluir outros elementos de qualquer significância essencial à combinação. Desse modo, uma composição consistindo essencialmente nos elementos como definido aqui não excluiría traços contaminantes do método de isolação e purificação e veículos agricul-turalmente aceitáveis. "Consistindo em" deveria significar excluir mais do que trações de elementos de outros ingredientes e etapas de métodos subs-tânciais para aplicar as composições desta invenção. As modalidades definidas por cada desses termos de transição estão dentro do escopo desta invenção.

Como empregado aqui, "controle biológico" é definido como con- trole de um patógeno ou inseto pelo uso de um segundo organismo. Os mecanismos conhecidos de controle biológico incluem bactérias entéricas que controlam a decomposição da raiz competindo-se fungos pelo espaço na superfície da raiz. As toxinas bactericidas, tal como antibióticas, têm sido empregadas para controlar patógenos. A toxina pode ser isolada e aplicada diretamente na planta ou as espécies bactericidas podem ser administradas a fim de que elas produzam a toxina in situ. O termo "fungo" ou "fungos" inclui uma variedade de organismos carregando germes nucleados que são destituídos de clorofila. Os exemplos de fungos incluem levedura, mofo, míldio, rusts e cogumelos. O termo "bactérias" inclui qualquer organismo procariótico que não tenha um núcleo distinto. "Pesticida" significa a capacidade de uma substância aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de desenvolvimento de pestes nas plantas. "Fungicida" significa a capacidade de uma substância aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de desenvolvimento de fungos. "Antibiótico" inclui qualquer substância que seja capaz de matar ou inibir um microorganismo. Os antibióticos podem ser produzidos por um microorganismo ou por um processo sintético ou processo semi-sintético. O termo, portanto, inclui uma substância que inibe ou mata fungos por exemplo, cicloheximida ou nistatina. "Antifúngica" inclui qualquer substância que seja capaz de matar ou inibir o desenvolvimento dos fungos. O termo "cultura" refere-se a propagação de organismos sobre ou em veículos de vários tipos. "Cultura de caldo total" refere-se a uma cultura líquida contendo ambos os meios e células. "Sobrenadante" refere-se ao restante do caldo líquido quando as células desenvolvendo no caldo são removidas por centrifugação, filtração, sedimentação, ou outros meios bem conhecidos na técnica.

Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Em termos de tratamento e proteção, uma "quantidade eficaz" é aquela quantidade suficiente para melhorar, estabilizar, reverter, reduzir ou retardar a progressão dos estados de doença bactericidas e fúngicas. "Controle Positivo" significa um composto conhecido por ter atividade pesticida. Os "controles positivos" incluem, porém não estão limitados a pesticidas químicos comercialmente disponíveis. O termo "controle negativo" significa um composto conhecido por não ter atividade pesticida. Os e-xemplos de controles negativos são acetato de etila e água. O termo "solvente" inclui qualquer líquido que mantenha outra substância na solução. "Solvente extraível" refere-se a qualquer composto que dissolva em um solvente e que então possa ser isolado do solvente. Os exemplos de solventes incluem, porém não estão limitados a, solventes orgânicos tipo acetato de etila. O termo "metabólito" refere-se a compostos, substâncias ou subprodutos de uma fermentação de um microorganismo que tenha atividade pesticida. Os antibióticos como definidos acima é um metabólito especifi-cadamente ativo contra um microorganismo. O termo "mutante" refere-se a um variante da cepa parental bem como métodos para obter um mutante ou variante no qual a atividade pesticida seja maior do que aquela expressada pela cepa parental. A "cepa parental" é definida aqui como a cepa Streptomyces original antes da mutagê-nese. Para obter tais mutantes a cepa parental pode ser tratada com uma química tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, etilmetanossulfona, ou por irradiação empregando gamma, raio x, ou irradiação de UV, ou por outros meios bem conhecidos por aqueles praticantes na técnica.

Uma "composição" é entendida significar uma combinação de agente ativo e outros compostos, veículos ou composição, inerte (por exemplo, um agente detectável ou rótulo ou veículo líquido) ou ativo, tal como um adjuvante. Os exemplos de veículos agrícolas são fornecidos abaixo.

Descreveu-se uma nova cepa de produção de antibiótico de S-treptomyces sp. NRRL n° B-30145 e mutantes desta que têm atividade anti-fúngica somente em patógenos de planta específicos. Também fornecido é um sobrenadante isolado da cultura bem como uma composição compreendendo a cultura. Em um outro aspecto, a composição ainda compreende pelo menos um pesticida biológico ou químico.

Um metabólito produzido pela cepa Streptomyces sp. é também fornecido por esta invenção. O metabólito exibe atividade contra fungos patogênicos de planta e é estável na base e quente, é lábil ao ácido e tem um peso molecular menor do que 10.000 dáltons. Por modo de exemplo, o metabólito pode ter um peso molecular [Μ + H*] entre cerca de 925 a entre cerca de 865. O um ou mais metabólitos produzidos pela cepa Streptomyces sp. exibem absorção UV entre cerca de 215 nm e 220 nm. O metabólito pode ser compreendido de várias moléculas incluindo, porém não limitado a, segmentos de álcool de propargila [C=C-CH(OH)], carbonos de metina oxigenado (X-CH-Y) ou uma porção de açúcar. Por modo de exemplo, o metabólito pode compreender pelo menos dois segmentos de propargila, vários carbonos de metina oxigenados (por modo de exemplo, 5 a 10) e/ou uma porção de açúcar. Alternativamente, o um ou mais metabólitos produzidos pela cepa Streptomyces sp. pode compartilhar da mesma estrutura de carbono e diferir em grau de oxigenação. A presente invenção também fornece composições antifúngicas compreendendo um metabólito produzido por Streptomyces e isolado de acordo com um método compreendendo: (a) carregar uma cultura de caldo total de cepa Streptomyces sp. NRRL n° B-30145 ou mutantes destes tendo todas as características de i-dentificação de NRRL n° B-30145 em uma resina polimérica absorvente não-iônica; (b) eluir o metabólito com um álcool; (c) peneirar o eluato da etapa (b) com um bioensaio para frações do eluato exibindo uma atividade antifúngica; (d) carregar as frações do eluato exibindo atividade antifúngica da etapa (c) em uma coluna de HPLC; e (e) eluir o metabólito com um solvente orgânico. O método pode ainda compreender lavar a resina com água antes da etapa (b) e peneirar o eluato da etapa (e) com um bioensaio para selecionar as frações exibindo atividade antifúngica. A cultura de caldo total da etapa (a) pode ser seca por congelamento e novamente suspensa com uma solução aquosa (por exemplo, á-gua) antes de adicioná-la a resina polimérica absorvente não-iônica. Em uma modalidade preferida a cultura de caldo total adicionada à resina é uma cultura de caldo total livre de célula homogeneizada. Os exemplos de resina polimérica absorvente não-iônica que podem ser empregadas incluem, porém não estão limitados a, Supelco Sepabead SP-207 ou Supelco Diaon HP-20. O eluente empregado para remover o metabólito na etapa (b) pode ser um álcool ou um gradiente de álcool aquoso. Por modo de exemplo, metanol ou um gradiente de metanol aquoso podem ser empregados como o eluente (por exemplo, Exemplo 6). O bioensaio da etapa (c) pode ser qualquer ensaio que avalie a atividade antifúngica. Os exemplos de tais bioensaios incluem porém não estão limitados a, ensaio de difusão de ágar ou ensaio de germinação em lâminas. Por exemplo, o bioensaio pode ser um ensaio de germinação com Monilinia fructicola e/ou Alternaria brassicicola.

Os exemplos de uma coluna de HPLC que podem ser empregados na etapa (d), incluem, porém não estão limitados a, C-18 ou C-8. Os exemplos do solvente orgânico que podem ser empregados para remover o metabólito da coluna de HPLC incluem, porém não está limitado a, um gradiente de acetonitrila -água (por exemplo, Exemplo 6). O metabólito pode também ser formulado como uma composição, com um veículo ou alternativamente, com pelo menos um pesticida biológico ou químico. A fim de obter boa dispersão e adesão de composições na presente invenção, pode ser vantajoso formular a cultura de caldo total, sobre-nadante e/ou metabólito/ antibiótico com componentes que auxiliam na dispersão e adesão. As formulações adequadas serão conhecidas por aqueles versados na técnica (grânulos e pós umectáveis e outros ou podem ser mi-croencapsuladas em um meio adequado e outros, os líquidos tal como fluí-veis aquosos e suspensões aquosas, e concentrados emulsificáveis). Outras formulações adequadas serão conhecidas por aqueles versados na técnica. A cepa, cultura, sobrenadante e metabólito isolado são úteis para proteger ou tratar plantas, frutos, e raízes de infecções fúngicas, aplicando-se uma quantidade eficaz da formulação ativa na planta, fruta ou raiz. As formulações são particularmente adequadas para tratar ou prevenir infecções causadas por um fungo selecionado a partir do grupo consistindo em Alternaria solani, Botrytis cinerea, Rhizoctonia sp., Sclerotinia sp., e Phytoph-tora sp.

Todas as patentes e publicações citadas aqui são incorporadas por referência. As citações bibliográficas na íntegra para essas podem ser encontradas no final da especificação, imediatamente precedendo as reivindicações.

Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar a invenção. Esses exemplos não são para serem construídos como limitantes. EXEMPLOS Exemplo 1 Caracterização de Cepa NRRL n° B-30145 NRRL n° B-30145 foi identificado com base no seqüenciamento 16S rRNA. O protocolo empregado para gerar a seqüência de dados de gene 16s rRNA (Acculab Customer Handbook v. 1.0) é descrito como segue. O gene 16S rRNA é amplificado por PCR de DNA genômico isolado de colônias bacterianas. Os iniciadores empregados para a amplificação correspondem à E.coli nas posições 005 e 531. Os produtos de amplificação são purificados a partir do excesso de iniciadores e dNTPs empregando membranas de corte de peso molecular Microcon 100 (Amicon) e verificados quanto à qualidade e quantidade executando-se uma porção dos produtos em um gel de agarose. O seqüenciamento de ciclo dos produtos de amplificação 16s rRNA é realizado empregando terminadores de corante dRhodamine e poli- merase de DNA AmpliTaq FS. O excesso de terminadores rotulados com corante foi removido das reações de seqüenciamento empregando uma coluna de rotação Sephadex G-50. Os produtos são coletados por centrifuga-ção, secos sob vácuo e congelados em -20°C até que prontos para carregar. As amostras são novamente suspensas em uma solução de formamida/ dex-tran azul/ EDTA e desnaturadas antes do carregamento. As amostras são eletroforesadas em um seqüenciador de DNA ABI Prism 377. Os dados são analisados empregando programa de montagem e edição de DNA de PE/Applied Biosystem. Uma vez obtida, as seqüências são comparadas contra a base de dados MicroSeq® da PE/Applied Biosystem empregando o programa de análise de seqüência MicroSeq®. As seqüências são também comparadas com o Banco de Gene e Projeto de Base de Dados Ribossômi-cas (RDP). O resultado do seqüenciamento de 16s rRNA identificou NRRL n° B-30145 como uma Streptomyces sp. Esta cepa pode pertencer às espécies S. mashuensis (antigamente Streptoverticillium mashuense) ou uma espécie relacionada, como sugerido pelos resultados do seqüenciamento. A melhor adaptação foi Streptomyces mashuensis com um número de adaptação de 98%.

Exemplo 2 Atividade de NRRL n° B-30145 contra patógenos de planta em cultura in vitro (ensaio de zona). NRRL n° B-30145 foi testado contra um arranjo de diferentes patógenos de planta utilizando dois ensaios in vitro diferentes. O ensaio de difusão de ágar (zona) consiste em aplicar cada esporo de patógeno de planta sobre a superfície de um meio de ágar para criar uma grama perfeita de desenvolvimento ou utilizando ou utilizando um tampão de ágar micelial colocado no centro da placa petri que desenvolverá e colonizará o ágar. As cavidades circulares de aproximadamente 7,0 mm em diâmetro são removidas do ágar empregando uma pipeta fixada em uma bomba a vácuo. As amostras de fermentação de NRRL n° B-30145 são adicionadas a cada cavidade junto com verificações de água e padrões conhecidos. As placas são incubadas durante três a quatro dias sob condições ambientais conducente para cada patógeno. Os resultados consistem em uma zona de nenhum pa-tógeno desenvolvendo ao redor da cavidade ou uma quantidade grandemente reduzida de patógeno desenvolvendo ao redor da cavidade ou nenhuma afetação. O tamanho e tipo de zona são registrados para cada amostra. Os resultados para NRRL n° B-30145 em ensaios de difusão de ágar são apresentados na Tabela 1. Os resultados na difusão de ágar foram variáveis; a difusão através do ágar pôde ser inibida.

Tabela 1: Atividade de NRRL n° B-30145 contra patógenos de planta selecionados no ensaio de difusão de ágar (zona).

Alternaria brassicicola Nenhuma zona/ Atividade fraca Botrytis cinerea Atividade fraca Monillnia fructicola Nenhuma zona Phytophthora capsici Atividade moderada Pythium sp. Atividade fraca Colletotrichum acutatum Nenhuma zona Rhizoctonia solani Nenhuma zona Sderotinia sclerotiorum Nenhuma zona O segundo tipo de ensaio in vitro realizado para testar o espectro de patógeno de NRRL n° B-30145 foi o ensaio de germinação em lâminas. As amostras de fermentação de NRRL n° B-30145 em várias diluições foram adicionadas aos opérculos de depressão de vidro (25 mm x 75 mm com 18 mm de depressão de diâmetro, 1,75mm de profundidade) e um volume igual de esporos de patógenos foi misturado com a amostra. Os opérculos foram incubados em toalhas de papel umedecidas em caixas plásticas seladas em temperatura ambiente durante a noite. Os resultados são determinados observando-se a amostra de fermentação/ amostra de suspensão de esporo empregando um microscópio de composto em 100X. Os resultados típicos consistem na perda de germinação do patógeno propagado ou desenvolvimento e/ou germinação grandemente reduzidos. Além disso, vários tipos de malformações do desenvolvimento inicial dos esporos de patógenos podem ocorrer. O espectro da atividade de NRRL n° B-30145 é apre- sentado na Tabela 2. A inibição completa da germinação de esporo ocorreu em concentrações baixas de amostras de fermentação.

Tabela 2. Atividade de NRRL n° B-30145 contra patógenos de planta selecionados no ensaio de germinação em lâminas.

Alternaria brassicicola Nenhuma germinação Alternaria dauci Nenhuma germinação Botrytis cinerea Nenhuma germinação Monilinia fructicola Nenhuma germinação Exemplo 3 Atividade de NRRL contra patógenos de planta em testes de bioensaio de planta.

Atividade de NRRL n° B-30145 foi testada contra late blight {Phytophthora infestans), eariy blight de tomate (Alternaria solani), mofo cinza (Botrytis cinerea), mosca marrom de grama (Rhizoctonia sp.), e pulgão do sul de amendoim (Sclerotinia minor). Todos os testes foram conduzidos em ambiente controlado no laboratório com desenvolvimento do material de planta de semente sob condições de estufa para plantas comerciais típicas. Late Blight do Tomate - Phytophthora infestans O patógeno é desenvolvido em ágar de centeio em placas patri padrão em 16°C no escuro. Os esporângios são coletados inundando-se a placa com água e raspando o micélio para expelir os esporângios. A suspensão esporangial é passada através de tecido de algodão, quantificada e ajustada para 1,0 x 104. As mudas de tomate no 3o a 5o estágio da folha são pulverizados para escorrer com a amostra de fermentação de NRRL n° B-30145 empregando um aerógrafo artístico em 275,79 KPa (40 psi). As mudas tratadas são permitidas secar ao ar em temperatura ambiente durante pelo menos duas horas, em seguida inoculadas com suspensão esporangial pulverizando-se levemente as superfícies superiores das mudas de tomate empregando um pulverizador manual. As mudas inoculadas são colocadas em superfícies de base sólida enchida com água e em seguida coberta com uma cúpula plástica para manter as folhas úmidas. As superfícies são incubadas em 20°C com um fotoperíodo de 14 horas durante 4 dias continua- mente cobertas pela cúpula plástica. As mudas são em seguida calculadas com base em uma escala de variação de doença de 0-5 com 0 igualando nenhum sintoma, e 5 igualando 75% ou mais das folhagens colonizadas pelo patógeno. Um exemplo típico de um teste de late blight é apresentado na Tabela 3.

Tabela 3. Resultados das mudas de tomate tratadas por NRRL n° B-30145, contra o patógeno late blight Phytophthora infestans.

Tratamento índice de doença médio Replicacões 1-4 Amostra 990702 1,1 1,0 0,5 2,0 1,0 Amostra 990709 1,1 1,0 2,0 1,0 0,5 Amostra 990825 1,3 1,5 1,0 1,5 1,0 Amostra 990913 1,0 1,0 1,0 1,5 0,5 Quadris 30ppm 0,1 0 0,5 0 0 Verificação de água 4,3 4,0 4,0 5,0 4,0 As amostras são fermentações diferentes de NRRL n° B-30145. D.l. é índice de doença ”Blight Earty" do Tomate - Alternaria solani O patógeno é primeiro desenvolvido no ágar de dextrose de batata Difco (PDA) em 22-25°C sob 14 horas diurnas até que toda a placa seja coberta. Os fungos no meio de ágar são em seguida cortados em pequenos quadrados de aproximadamente 10 mm de quadrado e os fungos são colocados no lado superior de um meio de esporulação especializado (S-Medium: 20 g de sacarose, 20 g de carbonato de cálcio, 20 g de Bacto-ágar por litro). As placas S-medium são inundadas com uma camada fina de água e incubadas 2-3 dias a 22-25°C por 14 horas na luz até que a esporulação do patógeno ocorra. Placas são então inundadas com água e os quadrados de ágar são raspados da palca. A suspensão é passada através de um tecido de algodão e os esporos são quantificados e ajustados para 1,0 x 105. As mudas de tomate no 3o e 5o estágio da folha são em seguida pulverizadas até escorrer empregando um aerógrafo artístico como descrito previamente. As mudas tratadas são permitidas secar e em seguida inoculadas com a suspensão de esporo. As mudas são colocadas em superfícies e cobertas como descrito previamente e incubadas em 25°C com um fotoperíodo de 14 horas. As mudas são calculadas com base em uma escala de 0-5 como previamente descrito. Os resultados de um teste típico são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4. Atividade de NRRL n° N-30145 contra o patógeno "earíy blight" da Alternaria solani.

Tratamentos índice de Doença médio Replicacões Teste-1 Amostra 990216 1,0 2,0 0,5 0,5 Quadris 60 ppm 1,8 1,5 2,5 1,5 Verificação de água 4,0 3,0 4,0 5,0 Teste 2 Amostra 990216 1,1 1,5 1,0 1,0 1,0 Verificação de água 4,5 5,0 4,0 4,0 5,0 D.l. é índice de Doença Mofo Cinza da Pimenteira - Botrytis cinérea O patógeno é desenvolvido em PDA padrão sob um fotoperíodo de 14 horas em 22°C até que o desenvolvimento fungai tenha coberto completamente a placa (7-9 dias). Os esporos são coletados inundando-se a placa com água e em seguida gentilmente varrendo com uma espátula para expelir os esporos. A suspensão de esporo é passada através de um tecido de algodão e quantificada e ajustada para 1,5 x 106 As mudas de pimenta são desenvolvidas até o 4° a 6° estágio de folha verdadeira e amostras de fermentação são pulverizadas na parte superior da superfície das folhas empregando um aerógrafo artístico como previamente descrito. As mudas tratadas são inoculadas, colocadas em superfícies e cobertos com cúpulas plásticas. As superfícies são colocadas em 20°C sob escuridão contínua durante 2,5 dias. As mudas são calculadas em uma escala de 0-5 como previamente descritas. A Tabela 5 descreve resultados de dois testes típicos.

Tabela 5: Atividade de NRRL N0 B-30145 contra Brotrytis cinerea Tratamento índice de Doença Médio Replicacões Teste 1 Amostra 990216 1,4 1,5 1,5 1,5 1,0 Quebra 20 ppm 0,1 0 0 0,5 0 Verificação de água 4,0 4,0 4,0 3,0 5,0 Teste 2 Amostra 990216 1,9 1,5 2,0 2,0 2,0 Quebra 20ppm 0,8 0 1, 5 1, 0 0,5 Verificação de água 4,5 4,0 5,0 5,0 4,0 D.l. é índice da doença Mosca marrom da grama-Rhizoctonia sp Dois mL de amostra de fermentação foi adicionada à cada célula de um pote de pote de 6 células de mudas de grama de um mês de idade (Bentgrass). Um tampão micelial de 4mm de um uma cultura de 2-3 dias de idade de Rhizoctonia sp foi colocada na superfície do solo. Cada tratamento foi replicado 6 vezes. Os potes inoculados foram colocados em superfícies plásticas e cobertas com uma cúpula plástica. As superfícies foram colocadas em uma prateleira clara (16 horas/dia) e incubadas em temperatura ambiente. A gravidade da doença foi avaliada após 5-6 dias de incubação e compradas com o controle tratado por água. Os resultados indicaram que NRRL N0 B-30145 tem uma atividade supressiva contra Rhizoctonia (Tabela 6).

Tabela 6. A eficácia de NRRL N0 B-30145 em doenças de gramado causada por Rhizoctínia sp.

Trata- Fator de Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep4 Rep 5 Rep6 mento Diluição 30145 1x +* + + + + + 30145 1/2 x + + + + + + Água +++ +++ +++ +++ +++ +++ *- sintomas leves,"+++" = sintomas graves Pulgão do Sul do Amendoim-Sclerotinia minor As mudas de amendoim no primeiro estágio de duas folhas foram tratadas com NRRL N0 B-30145 e um tampão mycelial 4-mm na base de cada caule após as plantas tratadas à seco. As plantas inoculadas foram incubadas em uma câmara de orvalho durante 2 dias antes de serem colocadas em uma superfície plana selada com uma cúpula cobertora. A superfície foi incubada em uma prateleira clara (16 horas/dia) em temperatura ambiente durante 10 dias. A gravidade da doença foi avaliada comparando-se o tratado com o controle de água. Os resultados (Tabela 7) indicou caldo total NRRL N0 B-30145 em 1 x tem algumas atividades de controle contra Sclerotinia minor.

Tabela 7. A eficácia de NRRL N0 B-30145 no pulgão Sclerotinia do amendoim.

Fator de diluição Rep 1 Rep 2 Rep 3 Tratamento 30145 1x +/- 0 +/- 30145 1/2x ++ ++ + 30145 1/4x 0 ++ ++ Água +++ +++ +++ * "+/-" indicou forte supressão, 0 indica nenhuma infecção, "+" = sintomas leves,"+++" = sintomas graves.

Exemplo 5 Metabólito antifúngica produzido por NRRL N0 B-30145. O caldo total de NRRL N0 B-30145 foi dividido em acetato de etila, butanol e frações aquosas. Cada fração foi testada contra Alternaria brassicicola em um ensaio de germinação de esporo. Os esporos Alternaria foram germinados na presença de cada amostra em opérculo de microscópio de depressão contendo 40μΙ da amostra e 20μΙ de esporos do patógeno. Aproximadamente 16 horas após os esporos são observados em um microscópio para observar se eles têm germinado. Nenhuma germinação (número de 0) comparado com controle de água (100% de germinação e desenvolvimento = número de 5) indica atividade da amostra sendo testada. Os resultados do ensaio de germinação do Alternaria com frações NRRL N0 B-30145 diferentes são mostradas abaixo (número em uma avaliação de 0 à 5 como acima).

Fração Número Rep 1 Rep 2 Rep 3 Acetato de etila 3 nd 4 n-butanol 0 0,2 1 Aquoso 055 Caldo total 0 0,2 0 Verificação da água 5 5 5 O metabólito está claramente na fração solúvel de butanol e não está facilmente extratável em acetato de etila. Outras características do metabólito foram determinadas. A molécula foi mostrada ao passar através de um filtro de corte de peso molecular 10.000 indicando que o metabólito é menor do que 10.000 daltons. A atividade não foi perdida quando tratada com base ou sobre aquecimento à 80°C durante uma hora. A atividade foi perdida quando tratada com ácido (o número contra Alternaria aumentou de 0 a 5). A fracionamento do extrato de butanol em ligação de octadecilsi-lano em cromatografia flash de sílica-gel (ODS) empregando um gradiente de acetonitrila (ACN)/água com 0,01% de ácido de trifluoroacético (TFA) produziu uma fração ativa eluída com 50% de acetonitrila/água com 0,01% de TFA. As frações foram testadas em um ensaio de germinação de Alternaria para atividade (escala de avaliação de 0-5).

Fração Número ODS 10% de ACN 4 ODS 20% de ACN 5 ODS 50% de ACN 0,5 ODS 100% de ACN 5 Verificação da água 5 Além disso a purificação por HPLC ODS produziu 2 componentes ativos (Fração 6 e 7) de uma eluição isocrática com 31% de acetonitrila em água com 0,02% de TFA).

Fração Numero HPLCFr.1 5 HPLCFr.2 5 HPLCFr. 3-5 4 HPLC Fr.6 3 HPLC Fr.7 2 HPLCFr.8 5 HPLC Fr.9 5 Água verificada 5 A cromatograma da acetonitrila 50% ativo/água com 0,01% de fração croamtografia flash TFA e os cromatogramas HPLC das frações ativas 6 e 7, incluindo espctro UV dos princípios ativos, são mostrados nas Figuras 1 e 2. NRRL No.B-30145 mais estreitamente adaptou Streptomyces mashuensis por seqüenciamento 16S RNA. Ao contrário dos metabólitos antibactericidas tipicamente associados com S. mashuensis, a atividade fungicida de NRRL No.B-30145 foi extratável com butanol. S. mashuensis é conhecido por produzir estreptomicina, que é um composto bactericida solúvel em água. Outro antibiótico produzido por S. mashuensis, monazomicina (A-kasaki e outros, 1963), não exibe um rebaixo em 215-220 nm como as frações ativas fungicidas de NRRRL N0. B-30145.

Os compostos antifúngicas têm também sido constatados nas espécies possivelmente sinônimas e estreitamente relacionadas Streptomyces griseocameum (Coleção de Cultura Tipo Americana). Essas incluem porfiromicina (Claridge e outros, 1986), um composto púrpura aquele correspondente ao espectro UV não é observado na fração ativa de NRRL No.B-30145 e o Heptaenes trichomycin (Komori e Morimoto, 1989) e griseocamin (Campos e outros, 1974) aqueles correspondentes ao espectro UV não estão presentes na fração ativa. O fungicida ativo também não é neutramicina, que é extratável com acetato de etila (Mitscher and Kunstmann, 1969). Exemplo 6 Métodos adicionais para outra purificação do metabólito Antifúngica de NRRL N°B-30145.

Método A A cultura de caldo total secada por congelamento foi novamente suspensa em água (0,2 L) e carregada em uma coluna contendo uma resina polimérica não-iônica (Supelco Sepabead SP-207; 26 x 3,0 cm) equilibrado em água. A coluna foi lavada com água (200 mL) e então com um gradiente de metanol aquoso como segue: (1) 20:80 metanol/água (200 mL), (2) 40:60 metanol/água (200 mL), (3) 60:40 metanol/água (200mL), 80/20 metanol/água (200 mL), e (5) metanol (200 mL).

Os resultados do Bioensaio (ensaio da germinação com Monili-nia fructicola e/ou Alternaria brassicicola) indicaram que todas as frações foram ativas. Cada fração foi individualmente fracionada em sílica-gel ligado por octadecilsilano (ODS) HPLC empregando uma acetonitrila/metanol/água (TOSOHASS ODS-80TS; 10μηι, 21,5 x 30 cm. O sistema de solvente A: acetonitrila/metanol/água 25:5:65, solvente B: acetonitrila/metanol/água 65:5:30. O gradiente: inicial em 0 minuto com solvente A e mantido durante 25 minutos. Então o solvente B aumentou para 35% durante 50 minutos. Fluxo = 6,0 mL/minuto). Todas as frações produziram aproximadamente o mesmo perfil de HPLC com a atividade localizada em duas regiões: pico A (t ~55-63 minutos) e pico B (t ~ 65-70 minutos). O pico B foi ainda fracionado em outra coluna HPLC de fase reversa (Phenomenex Luna Phenil-Hexyl; 5μιτι, 250 x 10 mm. Sistema de solvente: solvente A: acetonitrila/ metanol/água 25:5:65, solvente B: acetonitrila/metanol/água 65:5:30. Gradiente: inicial em 0 minuto com solvente A e permaneceu durante 15 minutos. Então o solvente B aumentou para 25% durante 25 minutos. Fluxo = 2,0 mL/minuto). Um componente maior foi isolado; entretanto, a análise HPLC analítica indicou um contaminante de absorção de UV elevado que co-eluiu com metabólito ativo. Conseqüentemente, um método de purificação alternativo foi empregado (método B).

Método B

Alternativamente, a cultura de caldo total livre de célula homogeneizada é passada através de uma resina polimérica não-iônica (Supelco Diaion HP-20), lavado com água, e então metanol. O metanol eluído é ainda separado por HPLC de fase reversa (HP Zorbax Eclipse XDB-C8; 5pm, 150 x 4,6 mm. Sistema de solvente: solvente A: acetonitrila/metanol/água 25:5:65, solvente B:acetonitrila/metanol/água 65:5:30. Gradiente: inicial em 0 minuto com solvente A e aumentou o solvente B para 3% em 20 minutos. Fluxo = 0,8 mL/minuto) para permitir os mesmos picos observados no método A (picos A e B) e confirmados por HPLC analítica empregando detecção EM e UV. Um traço de HPLC é mostrado na Figura 3.

Características de metabólitos ativos de NRRL N0 B-30145 Uma fração não pura obtida do método A forneceu alguma informação inicial de cerca da natureza do metabólito ativo. LC EM indicou um peso molecular [M + H+] = 892,6 e o espectro UV exibiu um rebaixo em 215-220 nm. 1D e 2D RMN sugere pelo menos 2 segmentos de álcool de por-pargila [C=C-CH(OH)], vários carbonos de metina oxigenados (X-CH-Y), e uma possível porção de açúcar. 1H e 13C RMN são mostrados nas Figuras 4 e 5 respectivamente.

Ainda que o método B não tenha fornecido quantidades suficientes para análise RMN, este método produziu picos limpadores em quantidades suficientes para análise por HPLC (sílica-gel ligado por octila) empregando métodos de detecção EM e UV. Os dois maiores picos (pico A e pico B) foram obtidos que adapta os mesmos compostos identificados como os metabólitos ativos empregando método A (observa Figura 3). O espectro UV de todos os compostos apresentou um rebaixo em 215-220 nm. O LC EM de pico A indicou a presença de em pelo menos três (3) compostos com os seguintes pesos moleculares [M+ + H+] = 866,5, 882,5, e 898,4 (observe figura 6). Similarmente, o pico B mostrou pelo menos três (3) compostos com pesos moleculares [Μ + H*] = 892,5, 908,5, e 924,5 (observe Figura 7).

Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes por modo de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, será evidente para aqueles versados na técnica que certas alterações e modificações serão praticadas.

Conseqüentemente, a descrição e exemplos não são construí- dos como limitantes do escopo da invenção, que é delineada pelas reivindicações anexas. REFERÊCIAS: Akasaki e outros, "Monazomicin, um novo antibiótico produzido por um etreptomyces," J. Antibiotics, vol. 16, pp 127-131 (1963).

Axelrood e outros, "Douglas-firrost- microorganismos associados com a decomposição com atividade inibidora em direção a patógenos de planta fúngica e patógenos bactericidas humanos." Can. J. Microbiol., vol. 42, pp. 690-700 (1996).

Campos e outros., "[Griseocarnin, um antibiótico antifúngica isolado de Streptoverticillium griseocameum (IA-7527)}", Ver Inst Antibiot (Recife), vol. 14 (1-2), pp. 91-100 (1974) (somente o sumário em Inglês).

Chamberlain and Crawford, Antagonista in vivo e in vitro de fungo de pasto patogênico por cepas de Streptomyces hygroscopicus YCED9 e WYE53," J of Industrial Microbiol Biotechnol, vol. 23, pp. 641-646 (1999).

Claridge e outros, "Novos análogos de mitomicina por biossínte-se direcionada", J. Antiobiotics vol. 39, pp. 437-446.

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Mitscher, L. A and Μ. P. Kunstmann, "A estrutura de neutramicina", Experientia vol. 25, pp. 12-3 (1969).

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REIVINDICAÇÃO

Claims (1)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) uma cepa isolada de Streptomyces sp. depositada com NRRL com No. de Acesso B-30145, e (ii) um veículo agrícola aceitável, que não resulte em uma mera diluição da referida cepa de Streptomyces sp.