KR20030034222A - 식물 질병을 제어하기 위한 스트렙토마이세스의 신규 균주 - Google Patents

식물 질병을 제어하기 위한 스트렙토마이세스의 신규 균주 Download PDF

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Abstract

어떤 특정 식물 병원체에만 항진균 활성을 나타내는 신규 항생제-생산Streptomyces종이 제공된다. 또한 NRRL 수납번호 B-30145의 식별 특성 모두를 가지는 항생제-생산Streptomyces종의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 진균 감염으로부터 식물을 치료 또는 보호하는 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 본 신규Streptomyces균주 및 이 균주 단독에 의해, 또는 다른 화학적 및 생물학적 살충제와의 조합으로 생산되는 항생제 및 대사산물을 포함하는 살균성 조성물에 관련된다.

Description

식물 질병을 제어하기 위한 스트렙토마이세스의 신규 균주 {A NOVEL STRAIN OF STREPTOMYCES FOR CONTROLLING PLANT DISEASES}
수년동안, 다양한 미생물이 식물 질병을 제어하는데에 유용한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 공지되었다. 재배 및 원예에서 중요한 다양한 식물 질병을 제어하기 위한 생물학적 살충제의 식별 및 개발의 분야에서 진보되어 왔음에도 불구하고, 사용 중인 대부분의 살충제는 여전히 합성 화합물이다. 많은 수의 이들 화학적 살균제는 EPA에 의하여 발암물질로서 분류되고 야생동물 및 다른 비-표적 종에 유독하다. 게다가, 병원체는 화학적 살충제에 대한 내성을 발달시킬 수 있다 (Schwinnet al., 1991).
생물학적 제어는 합성 화학적 살균제에 대해 매력적인 대안을 제공한다. 생물살충제 (살아있는 미생물 및 이들 미생물에 의해 자연적으로 생산되는 화합물)는 보다 더 안전하고, 보다 더 생물분해성이고, 개발비용이 더 적다.
스트렙토마이세스류 (streptomycetes)를 포함하는 악티노마이세스류 (actinomycetes)는 항진균 대사산물의 생산자로 공지된다 (Lechavalier and Waksman, 1962; Lechavalier, 1988). 몇몇 악티노마이세스-생산 항생제는 부란병제어를 위한 스트렙토마이신 및 테트라마이신과 같은 농업적 세팅에 평이하게 사용된다.
스트렙토마이세스류는 생체내 및 시험관내 모두에서 식물 병원체에 대항하는 활성을 예증하였다. Axelroodet al.(1996)은 미송 뿌리로부터 298개의 악티노마이세스류를 분리하였다. 이들 균주 중 대략 30%가 시험관 내에서 Fusarium, Cylindrocarpon, 및/또는 Pythium에 대항하는 항진균 활성을 예증하였다. Yuan 및 Crawford (1995)는Streptomyces lydicusWYEC108이 강력한 시험관내 항진균 활성 및 완두와 목화 씨를 가지고 한 포트 (pot) 시험에서 Pythium 뿌리 부패병의 저해를 나타냈다는 것을 보고하였다. Reddi 및 Rao (1971)는Streptomyces ambofaciens로 토마토에서의 Pythium 모잘록병 및 목화의 Fusarium wilt를 제어하였다. 리조크토니아 (rhizoctonia) 뿌리 부패병은Streptomyces hygroscopicusvar.geldanus(Rothrock and Gottlieb, 1984)에 의해 제어되었다. 이 저자들은 제어가 이 균주에 의해 생산되는 제자리 겔다나마이신 농도에 의조한다는 것을 보고하였다. 동일한 저자들은Streptomyces herbaricolor및Streptomyces coeruleofuscus에 의한Phytophthora megaspermavar.sojae로부터의 대두의 보호를 관찰하였다 (1984). Chamberlain 및 Crawford (1999)는S. hygroscopicus균주 YCED9에 의한 한지형잔디 진균류 병원체의 시험관내 및 생체내 길항작용을 관찰하였다. Crawford (1996)는 미국 특허 제 5,527,526 호에서 식물 병원체를 제어하기 위한 이 균주의 사용 특허를 얻었다. Suh (1998)는Rhizoctonia solani및Phytophthora capsici에 대항하여 활성인 두Streptomyces종의 특허를 얻었다.Fusarium종 및 다른 토양 병원체에 대항하는Streptomyces griseoviridis생성물은 Mycostop™으로서 시판된다.
발명의 개요
신규 항생제-생산Streptomyces종은 오직 어떤 특정 식물 병원체 상에서만 항진균 활성을 나타내는 것으로 제공된다. 또한 제공되는 것은, NRRL 수납 번호 B-30145의 모든 확인된 특성을 갖는 항생제-생산Streptomyces종의 유효량을 가하는 단계를 포함하는, 진균 감염으로부터 식물을 치료 또는 보호하는 방법이다. 본 발명은 또한 이 신규Streptomyces균주 및, 이 균주에 의해 생산되는 항생제 및 대사산물을 단독으로, 또는 다른 화학적 및 생물학적 살충제와의 조합으로 포함하는 살균성 조성물에 관련된다.
항생제-생산Streptomyces종은 전체 브로스 (broth) 배양물 내의 현탁액으로서 또는 항생제-생산Streptomyces종으로부터 얻어지는 항생제-함유 상청액으로서 제공될 수 있다. 또한 제공되는 것은 특이적 항진균 활성을 나타내는 신규 부탄올-가용성 항생제이다.
본 발명은 살충제의 분야에 있다.
도 1a는 활성 부분 6의 분석 HPLC 크로마토그람이다 (Microsorb C18, 10cm x 4.6mm, 100Å, 유속 1ml/분, 220nm에서 UV 검출, 아세토니트릴 + 0.05% TFA/물 + 0.05% 다음과 같은 구배: 0-30 분, 5 내지 65%; 30 내지 40 분, 65 내지 100%; 40 내지 45 분, 100%).
도 1b는 1a에서 설명된 크로마토그람에서 14.755 분에 용리한 활성 피크의 UV 스펙트럼이다.
도 2a는 1a에서 설명된 동일한 조건 하에서 활성 부분 7의 분석 HPLC 크로마토그람이다.
도 2b는 2a에서 설명된 크로마토그람에서 16.146 분에 용리한 활성 피크의 UV 스펙트럼이다.
도 3은 방법 B에서 설명된 Diaion HP-20 레진 단계에서 유래된 메탄올 용리액의 C-8 HPLC 크로마토그람이다 (HP Zorbax Eclips XDB-C8 컬럼, 5㎛, 150 x 4.6mm, 유속 0.8 mL 분, 220nm에서 UV 검출, 챠트 속도 2mm/분. 용매 A, 25:5:70 아세토니트릴/메탄올/물. 용매 B, 65:5:30 아세토니트릴/메탄올/물. 구배: 0분에 100% A에서 20분에 걸쳐 3% B로 증가).
도 4는 정제 방법 A로부터 얻어진 반-순수 활성 대사산물의1H NMR 스펙트럼이다 (400 MHz, CD3OD).
도 5는 정제 방법 A로부터 얻어진 반-순수 활성 대사산물의13C NMR 스펙트럼이다 (100 MHz, CD3OD).
도 6은 정제 방법 B로부터 얻어진 피크 A의 LC ESI-MS (액체 크로마토그래피 전자스프래이 충격-질량 분석)이다 (Microsorb C18, 10cm x 4.6mm, 100Å, 유속 1ml/분, 아세토니트릴 + 0.02% TFA/물 + 0.05% 다음과 같은 구배: 0-30 분, 5 내지 65%; 30 내지 40 분, 65 내지 100%; 40 내지 45분, 100%).
본 발명은Alternaria,Phytophthora,Botrytis,Rhizoctonia및Sclerotinia와 같은 특정한 식물 병원체 상에만 항진균 활성을 갖는Streptomyces종 또는 그것의 돌연변이의 신규 균주를 제공한다. 본 신규 균주는 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약의 규정에 따라 수납 번호 B-30145로 1999년 7월 20일 NRRL에 기탁되었다. 본 발명은 또한 이러한 세균 균주 또는 항생제-포함 상청액 또는 이러한 세균 균주로부터 얻은 순수한 항생제를 이용하여 식물에서의 진균성 질병을 예방하고 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 염기 및 80℃에서 1시간의 열 처리에 대한 안정성 및 산 처리에 대한 불안정성을 갖는, 10,000 달톤 이하의 분자량을 가진 부탄올 가용성 항진균 항생제를 포함한다.
정의
단수형태는 문맥상 분명히 다르게 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 그것의 혼합물을 포함하는 다수의 세포를 포함한다.
용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하되, 다른 것들을 배제하지 않는 것을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는데에 사용될 때 "본질적으로 구성되는"은, 조합에 대하여 어떤 본질적인 중요성의 다른 요소를 배제하는 것을 의미해야 한다. 그러므로, 여기에서 정의된 것과 같이 본질적으로 요소로 구성되는 조성물은 분리 및 정제 방법으로부터 생긴 미량 오염물질 및 농업적으로 허용되는 담체를 배제하지 않는다. "구성되는"은 다른 성분 및 본 발명의 조성물을 가하는 실질적인 방법 단계의 미량 요소보다 더 많은 것을 배제하는 것을 의미해야 한다. 이들 이행 용어의 각각에 의해서 정의되는 구체예는 본 발명의 범위 내에 있다.
여기에서 사용될 때, "생물학적 제어"는 제 2의 생물체의 사용에 의한 병원체 또는 곤충의 제어로서 정의된다. 생물학적 제어의 공지된 기작은 뿌리의 표면 상에서 공간에 대한 진균의 외부-경쟁에 의해 뿌리 부패병을 제어하는 장내 세균을 포함한다. 항생제와 같은 세균성 독소는 병원체를 제어하는데에 사용되어 왔다. 독소를 분리하여 직접 식물에 가하거나 또는 세균 종을 투여하여 제자리에서 독소를 생산하도록 할 수 있다.
용어 "진균" 또는 "진균들"은 클로로필1이 없는 광범위한 진핵 포자-형성 생물체를 포함한다. 진균의 예는 효모, 사상균, 곰팡이, 녹병균 및 버섯을 포함한다.
용어 "세균"은 별개의 핵을 갖지 않는 어떤 원핵성 생물체를 포함한다.
"살충성"은 식물 해충의 사망률을 증가시키거나 성장률을 저해하는 물질의 능력을 의미한다.
"살균성"은 진균의 사망률을 증가시키거나 성장률을 저해하는 물질의 능력을 의미한다.
"항생제"는 미생물을 죽이거나 저해할 수 있는 어떠한 물질을 포함한다. 항생제는 미생물에 의해 또는 합성 과정 또는 반합성 과정에 의해 생산될 수 있다. 그러므로, 용어는 시클로헥시미드 또는 니스타틴과 같이, 진균을 저해하거나 죽이는 물질을 포함한다.
"항진균제"는 진균을 죽이거나 저해할 수 있는 어떤 물질을 포함한다.
용어 "배양"은 다양한 종류의 배지 상에서 또는 내에서의 미생물의 증식을지칭한다. "전체 브로스 배양물"은 세포 및 배지 모두를 함유한 액체 배양물을 지칭한다. "상청액"은 브로스에서 성장된 세포가 원심분리, 여과, 침전, 또는 업계에 공지된 다른 수단에 의하여 제거된 후 남아있는 액체 브로스를 지칭한다.
"유효량"은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상으로 투여될 수 있다. 치료 및 보호에 관하여, "유효량"은 진균성 또는 세균성 질병 상태의 진행을 개선, 안정화, 역전, 감속 또는 지연하기 충분한 양이다.
"포지티브 대조군"은 살충 활성을 갖는 것으로 공지된 화합물을 의미한다. "포지티브 대조군"은 시중 구입가능한 화학적 살충제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "네가티브 대조군"은 살충 활성을 갖지 않는 것으로 공지된 화합물을 의미한다. 네가티브 대조군의 예는 물 또는 에틸 아세테이트이다.
용어 "용매"는 용액 내에 또 다른 물질을 수용하는 어떤 액체를 포함한다. "용매 추출가능"은 용매에 용해된 다음 용매로부터 분리될 수 있는 어떤 화합물을 지칭한다. 용매의 예는 에틸 아세테이트 같은 유기 용매를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "대사산물"은 살충 활성을 갖는 미생물 발효의 어떤 화합물, 물질 또는 부산물을 지칭한다. 위에 정의된 것과 같은 항생제는 미생물에 대항하여 특히 활성인 대사산물이다.
용어 "돌연변이"는 친균주의 변체는 물론이고 살충 활성이 친균주에 의해 발현되는 것보다 훨씬 더 큰 돌연변이체 또는 변체를 얻기 위한 방법을 지칭한다. "친균주"는 여기에서 돌연변이유발 전의 원래Streptomyces균주로서 정의된다. 이러한 돌연변이를 얻기 위해 친균주는, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 에틸메탄술폰과 같은 화학물에 의해, 또는 감마, x-레이 또는 UV-방사를 이용한 방사에 의해, 또는 당업자들에게 주지된 다른 수단에 의해 처리될 수 있다.
"조성물"은 비활성 (예를 들어, 검출가능 약품 또는 표지 또는 액체 담체) 또는 활성 (예를 들어, 보조제)인, 담체 또는 조성물과 같이, 활성제 및 또다른 화합물의 조합을 의미하도록 의도된다. 농업적 담체의 예는 아래에 제공된다.
본 발명자들은 특정한 식물 병원체에만 항진균 활성을 갖는 NRRL No. B-30145의Streptomyces종 및 그 돌연변이의 신규 항생제-생산 균주를 설명한다. 또한 배양물로부터 분리된 상청액은 물론이고 배양물을 포함하는 조성물도 제공된다. 나아간 양태에서, 조성물은 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더욱 포함한다.
Streptomyces종 균주에 의해 생산되는 대사산물은 또한 본 발명에서 제공된다. 대사산물은 식물 병원체성 진균에 대항하는 활성을 나타내고 열 및 염기에 안정하고, 산에 불안정하고 10,000 달톤보다 작은 분자량을 갖는다. 예로서, 대사산물은 약 925에서 약 865 사이의 분자량 [M + H+]을 가질 수 있다.
Streptomyces종 균주에 의해 생산되는 하나 이상의 대사산물은 약 215 nm 에서 220 nm 사이의 UV 흡광도를 나타낸다. 대사산물은 프로파길 알콜 단편 [C=C-CH(OH)], 산화 메틴 탄소 (X-CH-Y) 또는 당 부분을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 분자에 포함된다. 예로서, 대사산물은 적어도 두 개의 프로파길 절편, 몇몇산화 메틴 탄소 (예를 들어, 5 내지 10) 및/또는 당 부분을 포함할 수 있다. 대안으로Streptomyces종 균주에 의해 생산되는 하나 이상의 대사산물은 동일한 탄소 골격을 공유할 수 있고 산화의 정도에서 상이할 수 있다.
본 발명은 또한:
(a)Streptomyces종 균주 NRRL No. B-30145 또는 NRRL No. B-30145의 확인된 특성 모두를 가진 그것의 돌연변이의 전체 브로스 배양물을 비-이온성 흡수 폴리머 레진 상에 로딩하는 단계;
(b) 알콜로 대사산물을 용리하는 단계;
(c) 항진균 활성을 나타내는 용리액의 부분에 대한 생물검정으로 단계 (b)의 용리액을 스크리닝하는 단계;
(d) 단계 (c)의 항진균 활성을 나타내는 용리액의 부분을 HPLC 컬럼 상에 로딩하는 단계; 및
(e) 유기 용매로 대사산물을 용리하는 단계;를 포함하는 방법에 따라 분리된,Streptomyces에 의해 생산된 대사산물을 포함하는 항진균 조성물을 제공한다.
방법은 단계 (b)에 앞서 물로 레진을 세척하는 단계 및 항진균 활성을 나타내는 부분을 선택하는 생물 검정으로 단계 (e)의 용리액을 스크리닝하는 단계를 더 포함할 수 있다.
단계 (a)의 전체 브로스 배양물은 동결 건조되어 비-이온성 흡수 폴리머 레진에 첨가하기에 앞서 수성 용액 (예를 들어, 물)으로 재현탁될 수 있다. 바람직한 구체예에서 레진에 첨가되는 전체 브로스 배양물은 무-균질화 세포 전체 브로스 배양물이다. 사용될 수 있는 비-이온성 흡수 폴리머 레진의 예는 Supelco Sepabead SP-207 또는 Supelco Dianon HP-20을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
단계 (b)에서 대사산물을 제거하는데에 사용된 용리액은 알콜 또는 수성 알콜의 구배가 될 수 있다. 예로서, 메탄올 또는 수성 메탄올의 구배가 용리액으로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 실시예 6).
단계 (c)의 생물검정은 항진균 활성을 평가하는 어떠한 검정도 될 수 있다. 이러한 생물검정의 예는 한천 확산 검정 또는 슬라이드 발아 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 생물검정은Monilinia fructicola및/또는Alternaria brassicicola를 가지고 한 발아 검정이 될 수 있다.
단계 (d)에서 사용될 수 있는 HPLC 컬럼의 예는 C-18 또는 C-8을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. HPLC 컬럼으로부터 대사산물을 제거하는데에 사용될 수 있는 유기 용매의 예는 아세토니트릴-물 구배 (예를 들어, 실시예 6)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
대사산물은 또한 담체 또는 대안으로, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 갖는 조성물로서 조제될 수 있다.
본 발명 내에 있는 조성물의 양호한 분산 및 부착을 성취하기 위해, 분산 및 부착을 촉진하는 성분을 갖는 전체 브로스 배양물, 상청액 및/또는 대사산물/항생제를 조제하는 것이 유리할 수 있다. 적당한 조제물은 당업자들에게 공지될 것이다 (습윤성 분말, 과립 등, 또는 적당한 배지등에 미세캡슐화될 수 있는 것, 수성 유동물 및 수성 현탁액과 같은 액체, 및 유제). 다른 적당한 조제물은 당업자들에게공지될 것이다.
균주, 배양물, 현탁액 및 분리된 대사산물은 식물, 과실 및 뿌리에 활성 조제물의 유효량을 가함으로써 진균 감염으로부터 식물, 과실 및 뿌리를 보호 또는 치료하는데에 유용하다. 조제물은Alternaria solani, Botrytis cinerea, Rhizoctonia종,Sclerotinia종, 및Phytophthora종으로 구성된 군으로부터 선택되는 진균에 의해 야기되는 감염을 치료 또는 예방하는데에 특히 적당하다.
여기에 인용된 모든 특허 및 공보는 참고문헌으로서 수록된다. 이들에 대한 전체 도서목록 언급은, 청구 범위의 바로 앞에 명세서의 끝에서 찾을 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하도록 제공된다. 이 실시예는 제한하는 것으로서 구성되는 것이 아니다.
실시예 1
균주 NRRL No. B-30145의 특성 결정
NRRL No. B-30145는 16S rRNA 서열분석에 기초하여 확인하였다. 16S rRNA 유전자 데이터 서열을 생성하는데에 이용된 프로토콜 (Acculab Customer Handbook v. 1.0)은 하기와 같이 설명된다.
16S rRNA 유전자는 세균 콜로니로부터 분리한 게놈 DNA에서 PCR 증폭한다. 증폭에 사용된 프라이머는E. coli위치 005 및 531에 상응한다. 증폭 생성물은 Microcon 100 (Amicon) 분자량 컷-오프 (cut-off) 막을 사용하여 과량의 프라이머 및 dNTPs로부터 정제하고 아가로오스 겔 상에 생성물의 일부를 전기영동함으로써질 및 양에 대해 조사한다.
16S rRNA 증폭 생성물의 사이클 서열분석은 AmpliTaq FS DNA 중합효소 및 dRhodamine 염료 종결제를 사용하여 수행한다. 과량의 염료-표지 종결제는 Sephadex G-50 스핀 컬럼을 이용하여 서열분석 반응물로부터 제거하였다. 생성물은 원심분리로 수집하고, 진공 하에서 건조하여 로딩할 때까지 -20℃에서 냉동한다. 샘플은 포름아미드/블루 덱스트란/EDTA의 용액에 재-현탁하고 로딩에 앞서 변성시킨다. 샘플을 ABI Prism 377 DNA Sequencer 상에서 전기영동한다. PE/Applied Biosystem's DNA 편집 및 집합 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석한다. 일단 얻으면, MicroSeq™ 서열분석 소프트웨어를 이용하여 PE/Applied Biosystem's MicroSeq™ 데이터베이스와 서열을 비교한다. 또한 GenBank 및 Ribosomal Database Project (RDP)와도 서열을 비교한다.
16S rRNA 서열분석의 결과는 NRRL No. B-30145를Streptomyces종으로서 확인하였다. 서열분석 결과에 의해 제시된 것과 같이, 이 균주는S. mashuensis종 (전에는Streptoverticillium mashuense) 또는 관련 종에 속할 수 있다. 최고의 매치는 98%의 매치 스코어를 갖는Streptomyces mashuensis이었다.
실시예 2
시험관내 배양에서 식물 병원체에 대항하는 NRRL No. B-30145의 활성 (구역 검정)
두 개의 상이한 시험관내 검정을 이용하여 상이한 식물 병원체의 정렬에 대항해서 NRRL No. B-30145를 시험하였다. 한천 확산 (구역) 검정은 한천 배지의 표면 위에 식물 병원체 포자를 가하여 완전한 론 (lawn) 성장을 생성하거나 또는 성장하여 한천을 콜로니화할 페트리 디쉬의 중앙에 위치한 균사체의 한천 플러그를 이용하는 것으로 구성된다. 진공 펌프에 부착된 피펫을 이용하여 한천으로부터 지름 약 7.0 mm의 환상 웰을 제거한다. NRRL No. B-30145의 발효 샘플을 공지된 표준 및 물 대조군과 함께 각 웰에 첨가한다. 각 병원체에 도움되는 환경 조건 하에서 3 내지 4 일동안 플레이트를 인큐베이션한다. 결과는 웰 주위에 병원체 성장이 없는 구역 또는 웰 주위에 병원체 성장이 크게 감소된 양 또는 영향 없음으로 구성된다. 구역의 크기 및 타입은 각 샘플에 대하여 기록한다. 한천 확산 검정에서의 NRRL No. B-30145에 대한 결과는 표 1에 나타난다. 한천 확산 내에서의 결과는 가변성이었고; 한천을 통한 확산은 저해될 수 있다.
NRRL No. B-30145의 병원체 스펙트럼을 검사하기 위하여 수행된 제 2 타입의 시험관내 검정은 슬라이드 발아 검정이었다. 다양하게 희석한 NRRL No. B-30145의 발효 샘플을 유리 함몰 슬라이드 (지름 18 mm, 깊이 1.75 mm의 함몰을 갖는 25 mmx 75 mm)에 첨가하고 동 부피의 병원체 포자를 샘플과 혼합하였다. 하루밤동안 실온에서 밀봉된 플라스틱 상자 내의 젖은 페이퍼 타올 상에서 슬라이드를 인큐베이션 하였다. 100 X 배율에서 복합 현미경을 이용하여 발효 샘플/포자 현탁 샘플을 관찰함으로써 결과를 측정한다. 전형적인 결과는 병원체 번식체 발아의 결여 또는 크게 감소된 발아 및/또는 성장으로 구성된다. 더구나, 병원체 포자로부터 다양한 타입의 초기 성장 기형이 일어날 수 있다. NRRL No. B-30145의 활성 스펙트럼은 표 2에 나타난다. 포자 발아의 완전한 저해는 발효 샘플의 낮은 농도에서 일어났다.
실시예 3
식물 생물검정 시험에서 식물 병원체에 대항하는 NRRL의 활성
NRRL No. B-30145의 활성은 토마토 말기 마름병 (Phytophthora infestans), 토마토 초기 마름병 (Alternaria solani), 회색 곰팡이 (Botrytis cinerea), 잔디 황색 패치 (Rhizoctonia종) 및 땅콩 남방 마름병 (Sclerotinia minor)에 대항하여 시험하였다. 모든 실험은 전형적인 상업적 온실 조건 하에서 종자로부터 자란 식물 재료를 가지고 제어된 환경 하에서 수행하였다.
토마토 말기 마름병 - Phytophthora infestans
암지에서 16℃로 표준 페트리 디쉬 내의 호밀 한천 상에서 병원체를 키운다. 플레이트에 물을 부어 포자낭을 수집하고 균사체를 스크랩하여 포자낭을 걷어낸다. 포자낭 현탁액을 치즈천으로 통과시킨 후, 정량하고 1.0 x 104으로 조절한다. 40psi의 미술가용 에어브러쉬를 사용하여 3rd내지 5th엽 시기에 있는 토마토 묘목에 NRRL No. B-30145의 발효 샘플로 흘러내리도록 분무한다. 처리된 묘목은 적어도 2시간동안 실온에서 공기 건조되도록 한 다음 소형 분무기를 사용하여 토마토 묘목의 상부 표면에 가볍게 분무함으로써 포자낭 현탁액으로 접종한다. 접종된 묘목은 물로 채워진 굳은 바닥 플랫에 위치시킨 다음 플라스틱 돔으로 덮어서 잎의 습기를 유지한다. 계속해서 플라스틱 돔으로 덮은 플랫을 20℃에서 14-시간 광주기로 4일동안 인큐베이션한다. 그 다음 묘목을 0 내지 5의 질병 평가 스케일에 기초하여 평가하는데 0은 증상이 없는 것과 동일하고, 5는 75% 이상의 군엽이 병원체에 의해 콜로니화 되는 것이다. 말기 마름병 시험의 전형적인 예는 표 3에 나타난다.
토마토 초기 마름병 - Alternaria solani
병원체는 전체 플레이트를 덮을 때까지 우선 14-시간 광 하에서 22 내지 25℃로 시중 Difco 감자 덱스트로스 한천 (PDA) 상에서 키운다. 그 다음 진균 및 한천 배지를 대략 10mm2의 작은 사각형으로 절단하고 진균 면이 위를 향하도록 특수 포자형성 배지 (S-Medium: 리터 당 20g 수크로오스, 20g 탄산칼슘, 20g Bacto-한천)상에 위치시킨다. S-Media 플레이트를 물의 얇은 층으로 침수시키고 병원체의 전체 포자형성이 일어날 때까지 14-시간 광하에서 22 내지 25℃로 2 내지 3일 인큐베이션한다. 그 다음 플래이트를 물로 침수시키고 한천 사각형을 플래이트로부터 스크랩핑한다. 치즈천으로 현탁액을 통과시키고 포자를 정량하여 1.0 x 105으로 조절한다. 3rd내지 5th엽 시기에 있는 토마토 묘목을 앞에 설명한 것과 같이 미술가용 에어브러쉬를 사용하여 흘러 내릴 때까지 분무한다. 처리된 묘목이 건조되도록 한 다음 포자 현탁액으로 접종한다. 플랫에 묘목을 위치시키고 앞에 설명한 것과 같이 덮은 후 14-시간 광주기로 25℃에서 인큐베이션한다. 앞에 설명한 것과 같이 0 내지 5의 스케일에 기초하여 묘목을 평가한다. 전형적인 시험의 결과는 표 4에 나타난다.
후추 회색 곰팡이 - Botrytis cinerea
진균의 성장이 플레이트를 완전히 덮을 때까지 표준 PDA 상에서 22℃ 14-시간 광주기 하에서 병원체를 키웠다 (7 내지 9일). 물로 플레이트를 침수시켜 포자를 수집한 다음 압설기로 부드럽게 스크랩핑하여 포자를 걷어낸다. 치즈천으로 포자 현탁액을 통과시키고 정량한 후 1.5 x 106으로 조절한다. 4th내지 6th진엽 시기까지 후추 묘목을 키우고 발효 샘플은 앞에 설명한 것과 같이 미술가용 에어브러쉬를 사용하여 상부 잎 표면에 분무한다. 처리된 묘목을 접종시키고, 플랫에 위치시킨 후 플라스틱 돔으로 덮는다. 2.5일동안 연속적인 암기하에서 20℃에 플랫을 위치시킨다. 앞에 설명한 것과 같이 묘목을 0 내지 5 스테일로 평가한다. 표 5는 두 전형적인 시험의 결과를 서술한다.
잔디 황색 패치 - Rhizoctonia 종
2 ml의 발효 샘플을 한달된 잔디 묘목 (Bentgrass)의 6-세포 포트의 각 세포에 첨가하였다.Rhizoctonia종의 2 내지 3일된 배양물의 4 mm 균사체 플러그를 토양 표면 하에 위치시켰다. 각 처리는 6회 반복하였다. 접종된 포트를 플라스틱 플랫에 위치시키고 플라스틱 돔으로 덮었다. 플랫을 광 선반에 위치시키고 (16시간/일) 실온에서 배양하였다. 인큐베이션의 5 내지 6일 후 질병의 심각도를 평가하고 물로 처리한 대조군과 비교하였다. 결과는 NRRL No. B-30145가 Rhizoctonia에 대항하는 억압 활성을 갖는다는 것을 가리킨다 (표 6).
땅콩 남방 마름병 - Sclerotinia minor
제 1의 2-엽 시기에 있는 땅콩 묘목을 NRRL No. B-30145로 처리하고 처리한 식물을 건조시킨 후 4-mm 균사체 플러그를 각 줄기의 기부 상에 위치시킨다. 접종된 식물은 덮개 돔을 갖는 플라스틱 플랫에 위치시키기 전에 2일동안 고습도 챔버에서 인큐베이션 하였다. 실온에서 10일 동안 광 선반 (16시간/일)에서 플랫을 인큐베이션 하였다. 처리된 것과 물 대조군을 비교함으로써 질병의 심각도를 평가하였다. 결과 (표 7)는 1x의 NRRL No. B-30145 전체 브로스가Sclerotinia minor에 대항하는 약간의 제어 활성을 갖는다는 것을 가리킨다.
실시예 5
NRRL No. B-30145에 의해 생산되는 항진균성 대사산물
NRRL No. B-30145의 전체 브로스는 에틸 아세테이트, 부탄올 및 수성 부분으로 분할하였다. 각 부분은 포자 발아 검정에서Alternaria brassicicola에 대항하여 시험하였다.Alternaria포자는 40 μl의 샘플 및 20 μl의 병원체 포자를 함유한 함몰 현미경 슬라이드 내의 각 샘플의 존재에서 발아하였다. 대략 16 시간 후에 현미경 하에서 포자를 관찰하여 포자가 발아하였는가를 보았다. 물 대조군 (100%발아 및 성장 = 스코어 5)에 비교된 발아하지 않은 군 (스코어 0)은 시험되는 샘플의 활성을 가리킨다. 상이한 NRRL No. B-30145 부분을 가지고 한Alternaria발아 검정의 결과는 아래에 나타난다 (상기와 같이 평가한 0 내지 5 스코어).
대사산물은 분명히 부탄올 가용성 부분 내에 있고 에틸 아세테이트에서 손쉽게 추출가능하지 않는다. 대사산물의 다른 특성을 측정하였다. 분자는 10,000 분자량 컷 오프 필터를 통과하는 것으로 나타났고 이는 대사산물이 10,000 달톤보다 작다는 것을 가리킨다. 염기로 처리하거나 또는 1시간동안 80℃로 가열할 때 활성을 잃지 않는다. 산으로 처리할 때 활성을 잃는다 (Alternaria 에 대항하는 스코어가 0에서 5로 증가).
0.01% 트리플루오로아세트산 (TFA)을 갖는 아세토니트릴 (ACN)/물 구배를 사용한 실리카겔 (ODS) 플래쉬 크로마토그래피에 결합된 옥타데실실라인 상의 부탄올 추출물 부분으로 0.01% TFA를 갖는 50% 아세토니트릴/물로 용리한 활성 부분을 수득하였다. 부분은 활성에 대하여Alternaria발아 검정에서 시험하였다 (0 내지 5평가 스케일).
ODS HPLC로써 더욱 정제하여 0.02% TFA를 갖는 물 중 31% 아세토니트릴로의 등용매 용리로부터 두 개의 활성 성분 (부분 6 및 7)을 수득하였다.
활성 원소의 UV 스펙트럼을 포함하는, 0.01% TFA 플래쉬 크로마토그래피 부분을 가진 활성 50% 아세토니트릴/물의 HPLC 크로마토그람 및 활성 부분 6 및 7의 HPLC 크로마토그람은 도 1 및 2에 나타난다.
NRRL No. B-30145는 16S RNA 서열분석에 의해Streptomyces mashuensis와 가장 근접하게 매치된다. 전형적으로S. mashuensis와 연관된 항세균성 대사산물과는 달리, NRRL No. B-30145의 살균 활성은 부탄올로 추출가능하였다.S. mashuensis는 스트렙토마이신을 생산하는 것으로 공지되는데, 이는 수용성 항세균 화합물이다.S. mashuensis에 의해 생산되는 또다른 항생제는 모나조마이신 (Akasakiet al.1963)으로, 이는 NRRL No. B-30145의 살균 활성 부분이 그러는 것 같이 215 내지 220 nm에서 숄더 (shoulder)를 나타내지 않는다.
항진균성 화합물은 또한 밀접하게 관련된 및 가능한 동일 종Streptomyces griseocarneum(American Type Culture Collection)에서 발견되었다. 이 화합물은, 보라색 화합물로서 그에 상응하는 UV 스펙트럼이 NRRL No. B-30145의 활성 부분에서 나타나지 않는 포르피로마이신 (Claridge et al., 1986) 및, 그에 상응하는 UV 스펙트럼 또한 활성 부분에서 존재하지 않는Heptaenes trichomycin(Komori and Morimoto, 1989) 및griseocarnin(Campos et al., 1974)을 포함한다. 살균 활성 물질은 또한 뉴트라마이신이 아닌데, 이는 에틸 아세테이트로 추출가능하다 (Mitscher and Kunstmann, 1969).
실시예 6
NRRL No. B-30145의 항진균성 대사산물의 나아간 정제를 위한 추가적 방법
방법 A
동결-건조된 전체 브로스 배양물을 물 (2.0L)에 재현탁하고 물에서 평형된 비-이온성 폴리머 레진 (Supelco Sepabead SP-207; 26 x 3.0 cm)을 함유한 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 물 (200 mL)로 세척한 다음 하기와 같은 수성 메탄올의 구배로 세척하였다: (1) 20:80 메탄올/물 (200 mL), (2) 40:60 메탄올/물 (200 mL), (3) 60:40 메탄올/물 (200 mL), 80:20 메탄올/물 (200 mL), 및 (5) 메탄올 (200 mL).
(Monilinia fructicola및/또는Alternaria brassicicola로 행한) 생물검정 결과는 모든 부분이 활성이었다는 것을 가리켰다. 각 부분은 아세토니트릴/메탄올/물을 이용하여 옥타데실실라인-결합 실리카겔 (ODS) HPLC 상에 개별적으로 부분화하였다 (TOSOHASS ODS-80TS; 10㎛, 21.5 x 30 cm. 용매 시스템: 용매 A: 아세토니트릴/메탄올/물 25:5:65, 용매 B: 아세토니트릴/메탄올/물 65:5:30. 구배: 용매 A로 0분에 시작하여 25분동안 홀딩. 그 다음 50분에 걸쳐 용매 B를 35%까지 증가. 유속=6.0 mL/분). 모든 부분은 두 구역: 피크 A(t~55 내지 63분) 및 피크 B (t~65 내지 70분)에 위치된 활성을 갖는 대략적으로 동일한 HPLC 프로파일을 나타내었다.
피크 B는 또다른 역상 HPLC 컬럼 상에서 더욱 부분화하였다 (Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl; 5 ㎛, 250 x 10 mm. 용매 시스템: 용매 A: 아세토니트릴/메탄올/물 25:5:65, 용매 B: 아세토니트릴/메탄올/물 65:5:30. 구배: 용매 A로 0분에서 시작하여 15분동안 홀딩. 그 다음 25분에 걸쳐 용매 B를 25%까지 증가. 유속 = 2.0 mL/분). 하나의 주된 성분을 분리하였으나, 분석 HPLC 분석이 활성 대사산물과 공동-용리된 고-UV 흡수 오염물질을 가리켰다. 그러므로, 대안적 정제 방법을 채택하였다 (방법 B).
방법 B
대안으로, 무-균질화 세포 전체 브로스 배양물을 비-이온성 폴리머 레진 (Supelco Diaion HP-20)으로 통과시키고, 물로 세척한 다음, 메탄올로 세척하였다. 메탄올 용리액을 역상 HPLC (HP Zorbax Eclipse XDB-C8; 5㎛, 150 x 4.6 mm. 용매 시스템: 용매 A: 아세토니트릴/메탄올/물 25:5:65, 용매 B: 아세토니트릴/메탄올/물 65:5:30. 구배: 용매 A로 0분에서 시작하여 20분에 용매 B를 3%로 증가시킴. 유속 = 0.8 mL/분)로써 더욱 분리하여 방법 A에서 관찰된 동일한 활성 피크를 얻었고 (피크 A 및 B) UV 및 MS 검출을 이용하여 분석 HPLC로써 확인하였다. HPLC 자취는 도 3에 나타난다.
NRRL No. B-30145의 활성 대사산물의 특성결정
방법 A로부터 얻어진 불순물 섞인 부분은 활성 대사산물의 성질에 대한 약간의 초기 정보를 제공하였다. LC MS는 분자량 [M+H+] = 892.6을 가리키고 UV 스펙트럼은 215 내지 220 nm에서 숄더를 표시한다. 1D 및 2D NMR은 적어도 2개의 프로파길 알콜 단편 [C=C-CH(OH)], 몇몇 산화 메틴 탄소 (X-CH-Y), 및 가능한 당 부분을 제시한다.1H 및13C NMR은 도 4 및 5에 각각 나타난다.
방법 B가 NMR 분석에 충분한 양을 제공하지 않았음에도 불구하고, 이 방법은 UV 및 MS 검출방법을 이용한 HPLC (옥틸 결합 실리카겔)에 의한 분석에 충분한 양에서 보다 선명한 피크를 산출하였다. 두 개의 주된 피크 (피크 A 및 B)는 방법 A를 이용하여 활성 대사산물로서 식별된 동일한 화합물에 매치되는 것으로 얻었다 (도 3 참조). 모든 화합물의 UV 스펙트럼은 215 내지 220 nm에서 숄더를 나타냈다. 피크 A의 LC MS는 다음의 분자량 [M+H+] = 866.5, 882.5, 및 898.4를 갖는 적어도 세 개의 화합물의 존재를 가리킨다 (도 6 참조). 이와 유사하게, 피크 B는 분자량 [M+H+] = 892.5, 908.5 및 924.5를 갖는 적어도 세 개의 화합물을 나타낸다 (도 7참조).
앞서 말한 발명이 이해의 명쾌함을 위한 예시 및 예로서 어느 정도 상세히 설명되고 있지만, 어떤 변화 및 변환이 실행될 것이라는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 그러므로, 설명 및 예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안될 것이며, 이는 첨부된 청구범위에 의해 서술된다.
(참고문헌)

Claims (48)

  1. Streptomyces종 균주 NRRL No. B-30145 및 NRRL No. B-30145의 확인된 특성 모두를 갖는 그것의 돌연변이의 분리된, 순수한 배양물.
  2. 제 1 항의 배양물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 상청액.
  3. 제 1 항의 배양물, 및 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 3 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 습윤성 분말, 과립, 수성 현탁액, 및 유제 및 미세캡슐화된 조제물로 구성된 군으로부터 조제되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 식물 병원체성 진균에 대항하는 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 제 1 항의Streptomyces종 균주에 의해 생산되는 대사산물.
  7. 제 6 항에 있어서, 대사산물은 열 및 염기에 안정하고, 산에는 불안정하고약 10,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  8. 제 6 항에 있어서, 대사산물은 약 925 내지 약 865 사이의 분자량 [M+H+]을 갖는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  9. 제 8 항에 있어서, 분자량은 866.5, 882.5, 898.4, 892.5, 908.5 및 924.5로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  10. 제 6 항에 있어서, 대사산물은 열 및 염기에 안정하고, 산에 불안정하고 약 925 내지 약 865 사이의 분자량 [M+H+]을 갖는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  11. 제 10 항에 있어서, 분자량은 866.5, 882.5, 898.4, 892.5, 908.5 및 924.5로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  12. 제 6 항에 있어서, 대사산물은 도 3에서 나타난 220 nm에서의 크로마토그람을 갖는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  13. 제 6 항에 있어서, 대사산물은 약 215 nm 및 약 220 nm 사이에서 UV 흡광도를 나타내는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  14. 제 6 항에 있어서, 대사 물질은 도 4에 나타난1H 핵 자기 공명 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  15. 제 6 항에 있어서, 대사 물질은 도 5에 나타난13C 핵 자기 공명 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  16. 제 6 항에 있어서, 대사산물은 프로파길 알콜 단편 [C=C-CH(OH)], 산화 메틴 탄소 (X-CH-Y) 또는 당 부분으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  17. 제 16 항에 있어서, 대사산물은 적어도 2 개의 프로파길 알콜 단편 [C=C-CH(OH)]을 포함하는 것을 특징으로 하는 대사산물.
  18. 제 6 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 대사산물 및 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 6 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 대사산물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물 및 담체.
  20. 제 18 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 19 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 18 항에 있어서, 조성물은 습윤성 분말, 과립, 수성 현탁액, 및 유제 및 미세캡슐화된 조제물로 구성된 군으로부터 조제되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 1 항의Streptomyces종의 유효량을 식물, 과실 또는 뿌리에 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물, 과실, 및 뿌리를 진균성 감염으로부터 보호 또는 치료하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 감염은Alternaria solani,Botrytis cinerea, Rhizoctonia종,Sclerotinia종 및Phytophthora종으로 구성된 군으로부터 선택되는 진균에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서,Streptomyces종 균주 NRRL No. B-30145가 전체 브로스 배양물로서 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서,Streptomyces종 균주 NRRL No. B-30145가 상청액으로서 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 23 항에 있어서, 식물 병원체성 진균에 대항하는 활성을 나타내는Streptomyces종 균주 NRRL No. B-30145의 대사산물이 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 식물 병원체성 진균에 대항하는 활성을 나타내는Streptomyces종 NRRL No. B-30145 균주의 하나 이상의 대사산물이 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 대사산물은 약 925 내지 약 865 사이의 분자량 [M+H+]을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 대사산물의 분자량은 886.5, 882.5, 898.4, 892.5, 908.5 및 924.5로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 27 항에 있어서, 대사산물은 열 및 염기에 안정하고, 산에 불안정하고 약925 내지 약 865 사이의 분자량 [M+H+]을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 분자량은 886.5, 882.5, 898.4, 892.5, 908.5 및 924.5로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 27 항에 있어서, 대사산물은 도 3에서 나타난 220 nm에서의 크로마토그람을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 27 항에 있어서, 대사산물은 약 215 nm 내지 220 nm 사이에서 UV 흡광도를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 27 항에 있어서, 대사 물질은 도 4에 나타난1H 핵 자기 공명 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 27 항에 있어서, 도 5에 나타난13C 핵 자기 공명 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 23 항에 있어서,Streptomyces종 균주 NRRL No. B-30145는 습윤성 분말, 과립, 수성 현탁액, 및 유제 및 미세캡슐화된 조제물로 구성된 군으로부터 선택되는 조제물로서 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 23 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제의 유효량을 적용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 27 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,Streptomyces종 균주 NRRL No. B-30145의 대사산물은 습윤성 분말, 과립, 수성 현탁액, 및 유제 및 미세캡슐화된 조제물로 구성된 군으로부터 선택되는 조제물로서 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 조제물은Streptomyces종 균주 NRRL No. B-30145의 하나 이상의 대사산물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. (a)Streptomyces종 균주 NRRL No. B-30145 또는 NRRL No. B-30145의 모든 확인된 특성을 갖는 돌연변이의 전체 브로스 배양물을 비-이온성 흡수 폴리머 레진 상으로 로딩하는 단계;
    (b) 알콜로 대사산물을 용리하는 단계;
    (c) 항진균 활성을 나타내는 용리액의 부분에 대한 생물검정으로 단계 (b)의 용리액을 스크리닝하는 단계;
    (d) 단계 (c)의 항진균 활성을 나타내는 용리액의 부분을 HPLC 컬럼 상으로로딩하는 단계; 및
    (e) 유기 용매로 대사산물을 용리하는 단계:
    를 포함하는 방법에 따라 분리된,Streptomyces에 의해 생산된 대사산물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
  42. 제 41 항에 있어서, 단계 (b)의 용리액은 메탄올 또는 수성 메탄올의 구배인 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제 41 항에 있어서, 단계 (c)의 생물검정은 한천 확산 검정 또는 슬라이드 발아 검정으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제 41 항에 있어서, 단계 (e)의 유기 용매는 아세토니트릴-물 구배인 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 식물, 과실 또는 뿌리에 제 41 항의 조성물의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진균 감염으로부터 식물, 과일, 및 뿌리를 보호 또는 치료하기 위한 방법.
  46. 제 41 항에 있어서, 감염은Alternaria solani,Botrytis cinerea, Rhizoctonia종,Sclerotinia종 및Phytophthora종으로 구성된 군으로부터 선택되는 진균에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 41 항에 있어서,Streptomyces종 균주 NRRL No. B-30145는 습윤성 분말, 과립, 수성 현탁액, 유제 또는 미세캡슐화로 구성된 군으로부터 선택되는 조제물로서 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 41 항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 또는 생물학적 살충제의 유효량을 적용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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