TW469345B - Quantitative method of LDL cholesterol - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 6 9 3 4 5 ΑΊ __Β7五、發明説明（1 ) 技版領盤_ 本發明為關於不需要離心分離、電泳等之分離操作， 且以少量試料經由簡便之操作卽可以良好效率將低比重 贈蛋白質（Low Density Lipoprotein;LDL)中之瞻固醇 及LDL以外之脂蛋白質中之臛固醇予以分级定量之方法。 背景疫Ji.. 瞧固醇等之脂質為經由與血清中之脱輔基蛋白結合* 而形成脂蛋白。脂蛋白依據其物理上性狀之不囘，而被 分類成乳糜徹粒、超低比重脂蛋白質（Very Low Density ,Lipoprotein, VLDL),低比重脂蛋白質（Low Density Lipr〇protein;LDL)、高比重脂蛋白質（High Density LiP〇P「otein;HDL)等。此些脂蛋白質中，已知LDL為引 起動脈硬化之原因物質之一。 於免疫學上，LDL中之臛固醇值已被證明與動脈硬化 性疾病的發病頻率強烈相關，若可經日常簡便之方法測 定LDL之膽固醇，則於臨床上極為有用。 先前之LDLSI固酵之測定方法已知有例如依超離心分 離將LDL與其他之睢蛋白質分離後，用於膽固醇测定之 方法.和依電泳分離後進行脂質之染色，並測定其呈色 強度之方法。然而，此些方法均具有操作繁雜，無法處 理多數檢體等之間題，而在日常上幾乎無法使用。又， 亦己知會在擔體上設置結合LDL以外脂蛋白質之抗體，並 分取與試料混合後未結合之部分，測定此部分中之膽固 醇之方法，此方法不能稱為較先前二種方法適於作為曰 -3 - I- I-I- I I 1 - I-1-衣 j I n . I- - . . (請先聞讀背面之注意事項再一Γ'-本頁) 本紙張尺度逋用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（2Ι0Χ297公釐） A746 93 45 67 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 五、發明説明（2) 常上測定之方法，且由於在測定操作中包含手動進行之 工程，故難以自動化，於多數檢體之處理上依然為不適 合。 另一方面，不使用離心分離、電泳等物理性分雜手段 而將試料中之脂蛋白質分级定量之方法，已知有控制HDL 與其他之脂蛋白質，卽乳糜撤粒、VLDL及LDL之賸固酵 測定所用之酵素（主要為膽固醇氣化酶及膽固醇酯酶）之 反應性，導向僅有HDL臛固醇酵素反應並定量之方法， 例如，若依據特開平7-301636號公報，其掲示經由使用 界面活性劑及糖化合物，僅測定HDL瞧固醇之方法，若 依據特開平6-242110號公報，其掲示經由令必須測定之 脂蛋白質以外之脂蛋白質凝集，抑制其與酵素之反喔性 ，而僅檢測出測定對象之脂蛋白質中的瞻固醇之方法。 此些方法雖然因為可適用於自動分析機並可將令工程自 動化而極為有用，但到底僅止於HDL及HDL以外之脂蛋白 質的分级定量，更進一步對於LDL與VLDL及乳糜徹粒則 無法分级定量。因此，此些技術，對所諝不使用分離手 段而可_SLDL臛固醇之目的中，則無法適用。 又，於特開平7 -2808 12號公報中，掲示令LDL—巨凝 集後，將其他之脂蛋白質中的臛固酵導入不參與LDL定 量之条统中，於LDL之凝集溶解後經由令LDL膽固醇反應 而進行定量之方法。然而，於此公報中亦與先前所述之 二値專利公開公報同樣地，對於LDL膽固醇測定上所絶 對不可或缺之LDL與VLDL和/或乳糜微粒之分鈒定量的 -4 _ (請先閱讀背面之注項再i .本頁) -丄 訂 本紙張尺度適用中搏國家標準（CNS ) Μ规格（210X297公釐） A7 Π 93 45 五、發明説明（3 ) 解決方法則完全未提示。又，由於測定上所必要之反應 工程數多，故無法適用於一般的自動分析裝置，使其利 用價值亦有極被限定之問題。 如此，先前所知之技術，不僅無法不進行分離操作地 有效測定LDL膽固醇，且亦不存在指示其可能性之資料c 因此，本發明之目的為提供，無霈離心分離、電泳等 前處理之必要性，且可於簡便操作下以良好效率潮定， 並適用於各種自動分析機之LDL膽固醇的分级定童法。 發朋..之_.掲i.._ 於如此情事下，本發明者等進行專心研究，結果發現 若於溶解睹蛋白質之特定界面活性劑存在下與瞻固醇測 定用酵素試藥進行度應，則可令HDL及VLDL中之膽固醇 反應加速且另一方面令LDL中之臏固醇反應顯著變慢， 而使HDL中及VLDL中之腹固醇反應為較LDL中之瞻固醇反 應先達終結，故經由適當的遘擇㈣定點，即可分级測定 LDLS1固酵，且亦可適用於自動分析裝置，因而完成本 發明。 即，本發明為提供LDL瞻固醇之定量方法，其特擞為 對血清添加選自聚氣乙烯伸烷基苯基醚及聚氧乙烯伸烷 基三苄基苯基醚之界面活性劑，及膽固醇潮定用酵素試 藥，令脂蛋白質中的HDL中及VLDL中之膽固醇優先反應 後，测定其後之臛固醇反應量。 又，本發明為提供LDL膽固醇之定量方法，其特徴為 對血清添加選自聚氣乙烯伸烷基苯基醚及聚氣乙烯伸烷 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---„--.-----^------訂------城--- (請先閱讀背面之注意事項再t 本頁) < 經濟部中央標準扃員工消費合作社印製 28;?;;； # kti： 半 Ί A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明 ( 4 ) 1 1 基 三 苄 基 苯 基 醚 之 界 面 活 性 劑 N 對 V L D L比對 L D L顯示 更 1 I 1 強 結 合 親 和 性 之 物 質 > 及 膽 固 醇 m 定 用 酵素 試 藥 ,令脂 1 1 蛋 白 質 中 的 HDL中及V LD L中之膽固醇優先反應後. 其 後 請 先 1 1 測 定 膽 固 醇 之 反 應 量 〇 閱 讀 1 I 再 者 » 本 發 明 為 提 供 LDL臛固醇之定量用套組， 其 含 fl 之 ! 有 選 自 聚 氣 乙 烯 伸 烷 基 筆 基 m 及 聚 氣 乙 烯伸 烷 基 三苄基 注 意 畫 1 1 苯 基 m 之 界 面 活 性 劑 及 膽 固 醇 m 定 用 酵素 試 藥 〇 項 再 填 ί 又 再 者 贅 本 發 明 為 提 供 該 定 量 用 套 組 ,其 再 含 有對VLDL 寫 本 fcb 對 LDL顯示更強結合親和性之物質。 頁 w 1 j [®Ι caa 早 說 明 ! I 第 1 圖 為 示 出 實 施 例 1 中 依 據 本 發 明 方法 之 LD .L 膽 固醇 1 1 測 定 值 * 與 依 據 超 離 心 分 離 法 之 LDL膽固醇測定值之 相關 1 訂 1 Ϊ 性 之 圖 示 〇 第 2 圖 為 示 出 實 施 例 2 中 依 據 本 發 明 方法 之 LDL膽 固 1 1 醇 測 定 值 • 與 依 據 超 離 心 分 離 法 之 L D L臛固醇測定值 之 1 1 相 關 性 之 圃 示 〇 1 1 第 3； 圖 為 示 出 實 施 例 3 中 依 據 本 發 明 方法 之 LDL臛 固 1 醇 測 定 值 與 依 據 超 離 心 分 離 法 之 LD L膽固醇測定值 之 | 相 關 性 之 圖 示 〇 I Ul 發 明 Μ 伴 形 m 1 1 本 發 明 所 使 用 之 m 白 聚 氣 乙 烯 伸 院 基 苯基 m 及 聚氧乙 1 | m 伸 烷 基 三 苄 基 苯 基 m 之 界 面 活 性 劑 > 為溶 解 脂 蛋白質 1 1 之 界 面 活 性 劑 r 其 市 售 品 於 前 者 之 例 可 列舉 Em u 1 a g a n e 1 A - 60 (花王公司製） 等 » 而 δ 後 者 之 例 可 列 舉Em u 1 a g n e B66 1 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X 297公犛) 469345 A7 B7 經濟部十央橾隼局員工消費合作社印裝 五'發明説明（5) (花王公司製）等。此類界面活性劑可為單獨或組合2種 以上供使用，m其使用量為依化合物而異，並無特別限 制，但於必須蓮用試藥之分析装置中所欲的潮定時間内 ，令LDL膽固醇為以可被檢潮出之感度則通常使用〇.〇1 〜2重量％之濃度為較佳。 又，本發明之測定方法為在於對V L D L比對L D L顯示更 強結合親和性之物質存在下進行為較佳，特別於具有乳 糜之血清作為檢體時，若添加該物質進行測定則坷取得 良好之效果。此類物質可列舉聚陰離子、生成二價金靨 鹽之物質等，具體而言，聚陰離子者可列舉磷鎢酸及其 锞、葡聚糖硫酸、肝素等，而生成二價金騰鹽之物質可 列舉MsCI2、CaCl2、MnC丨2、NiCl2等之二價金屬之 氣化物、其水合物等。此些物質可單獨或組合2種以上 供使用，且其使用量為依物質之種類而異，並無特別限 制，但其度應終濃度，於聚陰離子之情形中為以使用 0.002〜10重量％,於生成二價金屬離子物質子情形中 為以使用0.01〜1重量％之範圍為較佳。 將界面活性劑及對VLDL比對LDL顯示更強結合親和性 之物質添加至檢體血清時，前者及後者與膽固醇剷定用 酵素試藥則另項添加、或者前者或後者之任一者輿另一 者及膽固醇測定用酵素試藥之混合物痼別添加、或混合 三者作成同一試藥添加均可。 膽固醇之測定方法，可使用任一種公知的酵素_定方 法，可列舉例如組合使用膽固醇酯酶及瞻固醇氣化酶作 -7 ~ —------豕— (請先閲讀背面之注意事項再(：本頁) 訂 -1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 16 9 3 4 5 Α7 Β7 經濟部中央標隼局貞工消費合作杜印製 五、發明説明（ο 為酵素試藥之方法，組合使用瞻固醇酯酶及膽固醇脱氫 酶作為酵素試藥之方法。其中，以組合使用瞻固醇酯酶 及瞭固醇氣化酶之方法為較佳。又此些將膽固醇測定用 酵素試藥添加後，最終檢測出膳固醇之方法並無待別限 制，可列舉例如將過氣化酶與色原體進一步組合進行吸 光度分析，將輔酶和過氣化氫直接檢測之方法等。 為了檢測L D L騰固醇之反應，乃必須潮定L D L以外之脂 蛋ή質中的膽固醇反應終了後之反應星，其可使用令於 一定時間梗應之LDL以外之脂蛋白質中之膽固醇反應大約 完成後，將進行之反曦依動力學地偵測之方法、和再於 促進L D L庋應之目的下所添加之另項反應促進劑所産生 之反應，以反應终點法測定之空白值予以校正之方法（ 2點法於2點法中所使用之反應促進劑，除了可使 用L D L以外脂蛋白質膽固醇反應所用之相同界面活性劑 以較高之濃度供使用以外，亦可使用其他種類之界面活 性劑。又，於2點法中，在L D L以外脂蛋白質中膽固醇 之反應時，将瞻固醇於其次工程中導入與LDL膽固醇定 量糸不相關之另外的反應条中，亦可僅檢測出LDL臛固 醇之反應。 尚，血清中存在的其他之脂蛋白質可列舉通常僅在攝 取食物後立卽出現之乳糜撤粒，此物質之反應性為與VLDL 大約相同。因此，卽使於血清中存在乳糜撤粒之情形中 ，因為藉由聚陰離子、生成二價金屬離子物質等之添加 ,故亦與VLDL同樣地可促進乳糜撤粒之反應性，而在 -8 - ---：--^-----—!.装-- (請先間讀背面之注意事項¾.4本頁) 訂 本紙張尺度適用中画國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） Α? Β7 鯉濟部中央樣隼局貝工消费合作社印裝 月説明（7 ) VLDL之反應終了時乳糜徹粒之反_亦達終了，故其後經 由測定膽固醇之反應量，乃可將LDL膽固醇分级定量。 實施例 其次，列舉實施例進一步説明本發明，怛本發明並非 限定於此。 實施例1 以正脂血清作為試料，依據本發明方法以曰立7 〇 70型 自動分析装置測定LDL臛固醇，並將此測定值與依超離 心分離法所得之測定值比較a其結果示於第1 。 卽，在檢體4撒升中，添加含有礤鎢酸鈉0.02重量％ 及MgCl2 · 6H2 0 0.02重量％之試藥300徹升。其次約 5分鐘後，添加含有Einulgane A-60(花王公司製）0.5重 鼉％、騰固醇酯酶lU/m丨、瞻固醇氣化酶lU/isl、過氣 化酶III / ml、4 -胺基安替比林（antipyMne)0,005重量％ 及Κ,Ν -二甲基間-甲苯胺0.04重量％之瞻固醇測定試藥 100徹升，並測定由第2試藥添加1分鐘至5分鐘後為 止之5 4 5 n m中吸光度之變化。 另一方商，超離心分離法為將血清於超離心機中 100,000g、離心2小時並除去上層。由所得之下層取出 1毫升，加入肝素（5000 USP簞位/毫升）溶液40撤升及 MgCl2 ΠΜ)溶液50撤升，並於5000迴轉下離心30分鐘取 得上清液。將超離心分離所得之下層溶液（含有L D L及H D L ) 、及加入肝素和MgCl2溶液所得之分餾上清液（含有HDL) 進行瞻固醇測定，並將兩者值之差值視為L D L瞻固醇值 -Θ -----^------- ^-- (請先閱讀背面之注意事項再一 本頁) 、?τ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 93 45 Α7 Β7 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印繁 五、發明説明（8 ) (參考文獻，Paul S.Bachorik等人，Clin.Chem.41/10 ,1414- 1420. 1 955 ) 〇 如第1圖所示，本發明方法儘管所使用之試料可為少 鼍，日可於簡便之操作下進行，但仍可取得與習知之超 離心分離法具有良好相關性之測定值。 宵施例2 以含有三酸甘油酯值高度上升之乳糜血清之檢體作為 試料，依據本發明方法以日立7070型自動分析裝置測定 L D L膽固醇，並將此測定值與依超離心分離法所得之測定 倌比較。其結果示於第2圖。 即，在檢體4徹升中，添加含有Emulgane B66(花王 公司製）0.5重量％、膽固醇醋酶〇.3ϋ/πι1、膽固醇氧化 酶0.3U/m!、過氣化酶0.311/nU及4 -胺基安替比林 0,002重鼉％之試藥300徹升。其次約5分鐘後，添加含 有Triton X-100 1重量二甲基間-甲苯胺0.04 重量％之試藥100撤升，並由第2試藥添加5分鐘後之 545n m趿光度減去第2試藥正要添加前之545ηιπ吸光度 (考慮試藥量之變化而進行校正），並測定其吸光度之變 化。 另一方面，超離心分離法為同實施例1賁施。 如第2圖所示，與實施例1同樣地，取得與習知之超 離心分離法之L D L膽固醇測定值具有良好相關性之測定 值。 / —1 0 一 (請先閱讀背面之注意事項再(·-本頁)

J 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（2丨0Χ297公釐） 十 6 9 3 4 5 kl B7 五、發明説明（9 酸 鎢 0 有 含 再 了 除 中 藥 試 1 第 於 中 2 传 3 施 例實 施於 實 依值 將定 ， 損 作之 操得 地所 樣法 同離 並分 藥心 試離 及超 體依 檢與 同值 相定 用測 使之 ，法 外方 以明 % 發 量本 重據 料 試 青 >vt 血 之 清 血 糜 «L 。有 圖含 3 用 第使 於使 示即 I * 結示 其所 。圖 較 3 比第 行如 進 之 法 離 分 0 心 值 離定 超測 之之 知性 習關 與相 得好 取良 ，為 地極 樣有 同具 1 值 例定 施測 實醇 與固 亦瞻 可 之 件 用 利 明 發 本 據 依i© 分 之 等 泳 電 、 離 分 心 離 要 需 不 可 πϋ 貝 以量 將定 率鈒 效分 好以 良予 以醇 可固 下膽 作的 操中 的質 便白 簡蛋 於脂 且之 ，他 作其 操與 醇 固 膽 之 中 廣 可 於 由 且 上 床 臨 於 故 置 裝 析 分 動 自 之 用 所 中 査 檢 床 臨。 於用 用有 適為 泛極 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .V5 經濟部中央標準局貞工消費合作社印袈 本紙張尺度適用中國國家標if ( CNS ) Λ4規格（210X 297公瘦）

Claims (1)

1. 奴正jMil A8 B8 , C8^ 93 45 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印制π 申請專利範圍 第86 105 194號「LDL膽固醇之定量方法」專利案 (90年5月8日修正） Λ申請專利範圍： 1. 一種低比重脂蛋白質膽固醇之定量方法，其特徵爲 對血淸添加選自聚氧乙烯伸烷基苯基醚及聚氧乙烯 伸烷基三苄基苯基醚之界面活性劑、及膽固醇醋酶 和膽固醇氧化酶組合之酵素試藥，或膽固醇酯酶和 膽固醇脫氫酶組合之酵素試藥，令脂蛋白質中之高 比重脂蛋白質中及超低比重脂蛋白質中的乳糜微粒 優先反應後，測定其後之膽固醇反應量。 2. —種低比重脂蛋白質膽固醇之定量方法，其特徵爲 對血淸添加選自聚氧乙烯伸烷基苯基醚及聚氧乙烯 伸烷基三苄基苯基醚之界面活性劑、對超低比重脂 蛋白質比對低比重脂蛋白質顯示更強結合親和性之 物質、及膽固醇酯酶和瞻固醇氧化酶組合之酵素試 藥，或膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶組合之酵素試 藥，令脂蛋白質中之高比重脂蛋白質中及超低比重 脂蛋白質中的膽固醇優先反應後，測定其後之膽固 醇反應量。 3. 如申請專利範圍第2項之低比重脂蛋白質膽固醇 之定量方法，其中對超低比重脂蛋白質比對低比重 脂蛋白質顯示更強結合親和性之物質爲聚陰離子或 生成二價金屬離子之物質。 4. 一種低比重脂蛋白質膽固醇之定量用套組，其爲含 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2]〇χ297公釐） <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂----- 線 S 93 4 5 cl ---------_____ 六、申請專利範圍 有選自聚氧乙烯仲烷基苯越醚及聚氧乙烯伸烷基三 ;基苯基醚之界面活性劑、及膽固醇酯酶和膽固醇 氧化酶組合之酵素試藥，或膽固醇酯酶和膽固醇脫 氫酶組合之酵素試藥。 5.如申請專利範圍第4項之定量用套組，其再含有 對超低比重脂蛋白質比對低比重脂蛋白質顯示更強 結合親和性之物質。 <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）