TW202244264A - 基於植物之脂質組合物及用於產生該組合物之方法 - Google Patents

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Abstract

提供一種基於植物之脂質組合物，其包含非常高含量之DHA以及至少一種其他長鏈多不飽和脂肪酸(通常為脂肪酸酯)。該組合物通常含有低含量之EPA及棕櫚酸。該組合物可藉由習知處理方法自單一來源獲得，且具有改良之穩定性特性。

Description

基於植物之脂質組合物及用於產生該組合物之方法
本文中所揭示之實施例係關於富集二十二碳六烯酸之新型脂質組合物。該等組合物包含具有許多健康益處之多不飽和脂肪酸之混合物。該等組合物可提供營養益處，且潛在地可自可擴展且可持續之單一來源獲得。其亦具有增強之氧化穩定性。
ω-3長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)被廣泛認為係用於人類及動物健康之重要化合物。此等脂肪酸可自膳食來源獲得，或在較小程度上藉由亞麻油酸(LA，18：2ω-6)或α-亞麻油酸(ALA，18：3ω-3)脂肪酸之轉化獲得，其全部被視為人類膳食中之必需脂肪酸。
自營養觀點觀之，最重要的ω-3脂肪酸可能為α-次亞麻油酸、二十碳五烯酸(「EPA」；20：5n-3)及二十二碳六烯酸(「DHA」；22：6n-3)。DHA為一種LC-PUFA，其對腦及眼睛之發育係重要的。攝入ω-3多不飽和脂肪酸亦可能有助於預防冠狀動脈疾病。醫學研究清楚地指示，此等脂肪酸具有有益的健康態樣，諸如改善心血管及免疫功能且減少癌症、糖尿病及高血壓。臨床結果已表明，每週膳食攝入5.5g ω-3多不飽和脂肪酸可能與原發性心跳驟停風險降低50%有關。因此，含有ω-3多PUFA之油出於醫藥及營養目的而需求很高。
通常，隨著碳-碳雙鍵之數目或不飽和程度增大，脂肪酸之氧化穩定性明顯降低。遺憾地，ALA、EPA及DHA全部為傾向於容易氧化之多不飽和脂肪。EPA(具有5個碳-碳雙鍵)比ALA顯著更易於氧化；DHA(具有6個碳-碳雙鍵)比EPA更易於氧化。因此，增大ω-3含量傾向於降低許多產品之保質期。對於包括大量EPA或DHA之油，此等問題變得特別嚴重。
US 2015/223483揭示具有改良之氧化穩定性之基於菜籽油之摻合物。藉由添加一或多種添加劑達成穩定性。
US 2011/0027443揭示含有油酸、亞麻油酸、α次亞麻油酸及LC-PUFA之特定摻合物之油脂組合物，其具有改良之香味特徵。US 2004/209953揭示主要含有LC-PUFA之單甘油酸酯及二甘油酯之營養產品。US 5,130,061描述使用轉酯化及蒸餾方法自原油萃取DHA。US 9,040,730描述含有PUFA之脂質混合物之純化，以便減少組合物中非所要固醇之量。在此等情況中之每一者中，使用魚或微生物油作為獲得特定摻合物之源材料。
國際專利申請案第WO 2013/185184號揭示用於產生多不飽和脂肪酸之乙酯的方法。
國際專利申請案第WO 2015/089587號及美國專利申請案第US 2015/0166928號揭示包含ω-3與ω-6脂肪酸之混合物的種植植物脂質組合物。遺傳修飾之菜籽描述於WO 2017/218969及WO 2017/219006中。
國際專利申請案第WO2011039776號揭示含有高純DHA之組合物。美國專利申請案第US 2011/0033595號揭示含有高組合比例之DHA及EPA的產物。
在本說明書中對明顯先前已出版文獻之列舉或論述不一定應 視為承認所述文獻為目前先進技術之一部分或為公共常識。
根據本發明之第一態樣，提供一種基於植物之脂質組合物，其包含：
(i)二十二碳六烯酸(22：6n-3)，其量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約86重量%；及
(ii)第二多不飽和脂肪酸，其量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約3重量%，其中該第二多不飽和脂肪酸為該組合物中第二最豐富的多不飽和脂肪酸；
其中該二十二碳六烯酸及該第二多不飽和脂肪酸各自獨立地以脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯或脂肪酸酯之鹽的形式提供。
該等脂質組合物在本文中稱為「本發明之組合物」。
本發明係關於含有高含量二十二碳六烯酸(DHA)之脂質組合物，其形式為游離脂肪酸、鹽、酯或酯之鹽。已發現此等組合物可自可持續來源獲得，諸如種植植物來源。亦已發現其具有改良之儲存穩定性特徵，此可藉由儲存期間由氧化引起的劣化之減少來證明。DHA尤其被公認為對於人類及動物健康重要的化合物。此等組合物可用於飼料、類藥劑營養品、化妝品及其他化學組合物中，且其可用作中間體及活性醫藥成分。
本發明之組合物中之脂肪酸含量可使用熟習此項技術者已知之常規方法判定。此等方法包括結合參考標準之氣相層析(GC)(例如根據實例中揭示之方法)。在特定方法中，在GC分析之前將脂肪酸轉化為甲酯或乙酯。此類技術描述於實例中。層析圖中之尖峰位置可用於識別每種特定脂肪酸，且每一峰值下之面積求積分以判定量。如本文中所使用， 除非另有說明，否則樣本中特定脂肪酸之百分比藉由計算該脂肪酸之層析圖中曲線下面積作為層析圖中脂肪酸總面積之百分比來判定。此基本上對應於重量百分比(w/w)。可藉由GC-MS確認脂肪酸之身分標識。
除非另外指定，否則在此上下文中提及二十二碳六烯酸及「DHA」係指ω3形式之二十二碳六烯酸，即在脂肪酸之甲基端起第三碳-碳鍵中具有不飽和(碳-碳雙鍵)之二十二碳六烯酸。可互換使用之速記形式包括「22：6n-3」及「22：6ω-3」。
更一般而言，術語「多不飽和脂肪酸」及「PUFA」係指包含至少兩個碳-碳雙鍵之脂肪酸。術語「長鏈多不飽和脂肪酸」及「LC-PUFA」係指在其碳鏈中包含至少20個碳原子及至少兩個碳-碳雙鍵之脂肪酸，且因此包括VLC-PUFA。如本文中所使用，術語「非常長鏈多不飽和脂肪酸」及「VLC-PUFA」係指在其碳鏈中包含至少22個碳原子及至少三個碳-碳雙鍵之脂肪酸。通常，脂肪酸之碳鏈中的碳原子數係指未分支碳鏈。若碳鏈分支，則碳原子數不包括側基中之碳原子數。
長鏈多不飽和脂肪酸可為ω3(「ω-3」)脂肪酸，即，在脂肪酸之甲基端起第三碳-碳鍵中具有不飽和(碳-碳雙鍵)之脂肪酸。或者，其可為ω6(「ω-6」)脂肪酸，即，在脂肪酸之甲基端起第六碳-碳鍵中具有不飽和(碳-碳雙鍵)之脂肪酸。儘管可能存在其他不飽和模式，但ω6且特別是ω3形式在本發明之上下文中特別相關。
本發明之組合物包含至少兩種不同的多不飽和脂肪酸，包括DHA及至少一種其他多不飽和脂肪酸。DHA為該組合物中存在的最豐富的脂肪酸(按重量計，相對於該組合物之總脂肪酸含量)。該組合物中第二最豐富的脂肪酸(按重量計，相對於該組合物之總脂肪酸含量)在本文中稱為「第二多不飽和脂肪酸」或「第二PUFA」。
該DHA及第二PUFA可各自以脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯或脂肪酸酯之鹽的形式存在。
如本文中所使用，術語「脂肪酸」係指飽和或不飽和之羧酸(或有機酸)，常常具有長脂族尾部。通常，脂肪酸具有長度為至少8個碳原子、更特定言之長度為至少12個碳之碳-碳鍵合鏈。大多數天然存在之脂肪酸具有偶數個碳原子，因為其生物合成涉及具有兩個碳原子之乙酸鹽。脂肪酸可處於游離狀態(非酯化)(在本文中稱為「游離脂肪酸」)，或處於酯化形式，諸如為烷基酯、三酸甘油酯之部分、二醯基甘油酯之部分、單醯基甘油酯之部分、醯基-CoA(硫代酯)鍵結或其他鍵結形式，或其混合物。脂肪酸可酯化為磷脂，諸如磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯甘油、磷脂醯環己六醇或二磷脂醯甘油形式，但較佳將其酯化為烷基酯，尤其酯化為乙酯。為避免疑義，除非另有陳述，否則術語「脂肪酸」涵蓋游離脂肪酸、脂肪酸酯及此等中之任一者之鹽。除非另有陳述，否則與特定脂肪酸相關聯之定量值係指存在之脂肪酸之量(基於重量計算)，而與其存在之形式(例如，游離酸或酯)無關。
組合物中之每種脂肪酸亦可獨立地以脂肪酸之鹽的形式提供，例如鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽。可提及之特定鹽包括鋰鹽及鈣鹽。此等鹽具有潛在之額外藥用益處或提供可處理性改良。類似地，脂肪酸酯可以脂肪酸酯之鹽的形式提供。呈游離脂肪酸、鹽、酯或酯之鹽的形式之脂肪酸之任何組合可存在於本發明之組合物中。藉此，吾人意謂，為了舉例，DHA可主要作為乙酯存在，ALA(若存在)可主要作為甲酯之鈣鹽存在，且第二PUFA可主要作為游離脂肪酸存在。
「飽和脂肪酸」沿鏈不含任何雙鍵或其他官能團。術語「飽和」係指氫，其中所有的碳(除了羧酸[-COOH]基團之外)含有儘可能多 之氫。換言之，ω端附接至三個氫原子(CH3-)，且鏈內之每一碳附接至兩個氫原子(-CH2-)。術語「總脂肪酸」包括所有形式之脂肪酸，不管其為飽和或不飽和的、游離酸、酯及/或鹽。
當提及諸如化合物之量、重量、時間、溫度等之可量測值時，術語「約」如本文中所使用係指指定量之20%、10%、5%、1%、0.5%或甚至0.1%之變化。
可提及之本發明組合物包括含有高濃度ω-3脂肪酸之組合物，其中之許多者為被認為對人類健康特別重要之所謂「必需脂肪」。ω-3脂肪酸可對HDL膽固醇含量具有有益作用，支持年輕人之大腦發育，且已被證明有益於心理健康。此等脂肪酸通常被認為係具有抗炎特性之類廿烷酸之前驅體。可提及之本發明之特定組合物包括其中脂質組合物中ω-3多不飽和脂肪酸之總量為組合物之總脂肪酸含量的至少約90重量%，諸如至少約95重量%。
ω-6脂肪酸亦被認為對人體健康係重要的。詳言之，某些ω-6脂肪酸為良好健康所必需之「必需脂肪」，但身體無法合成其。然而，已證明ω-6脂肪酸為具有更強促發炎特性之類廿烷酸之前驅體，且因此當產生過多此等類廿烷酸時，其可增大發炎及發炎性疾病。因此，可能需要使脂質組合物中此類脂肪酸之量最小化。通常認為飲食中ω-6與ω-3脂肪酸之比率應為4：1或更低。然而，正常之西方膳食通常含有較高比例之ω-6脂肪酸。本發明之脂質組合物有利地含有低量之ω-6脂肪酸，同時含有高量更有益之ω-3脂肪酸。在一個實施例中，組合物中ω-6多不飽和脂肪酸之總量為組合物之總脂肪酸含量的至多約5重量%。在另一實施例中，組合物中ω-3多不飽和脂肪酸之總重量與ω-6多不飽和脂肪酸之總重量之比率為至少約10：1。在另一實施例中，組合物中ω-3多不飽和脂肪酸之總 重量與ω-6多不飽和脂肪酸之總重量之比率為至少約20：1。
含有長鏈多不飽和脂肪酸之脂質組合物通常自海洋來源(例如魚、甲殼動物)、藻類來源或種植植物來源(例如，亞麻或藍薊)獲得。首先處理起始有機物以萃取其中所含之油(通常稱為「原」油)。例如，在種植植物種子之情況下，擠壓種子以釋出油，接著藉由過濾及/或傾析將其與固體物質分離。原油常常含有多不飽和脂肪酸，其含量過低以致不能使用(例如，作為營養產品)，因此需要富集。在原油缺乏一或多種必需組分之情況下，通常將來自多種來源(例如，來自魚及藻類)之原油或富油摻合在一起以獲得所需組合物。或者，可藉由處理原油以移除非所需組分(例如，有害地影響產品之顏色、氣味或穩定性之組分，或非所需脂肪酸)，同時使所需脂肪酸組分之含量最大化來達成富集。
本發明之組合物有利地可自單一來源獲得。單一來源之使用促進了對原油之有效且經濟之處理以及本發明之脂質組合物之製造。藉由片語「可自單一來源獲得」(或「自單一來源獲得」)，吾人意謂脂質組合物可自單一分類學類別之一或多種生物獲得。在一特定實施例中，脂質組合物並非衍生自不同分類學類別之多種生物。例如，脂質組合物可不為由魚與藻類之組合或魚與種植植物之組合獲得之油之摻合物。實情為，本發明之脂質組合物(或可藉由富集技術，諸如轉酯化、蒸餾及層析，自其獲得該等組合物之「原」油)可自單一生物群體獲得，例如單一來源之種植植物物質或植被。為避免疑義，片語「可自單一來源獲得」並不排除使用同一物種之多種生物作為脂質組合物或「原」油之來源，即使用同一物種之多種魚類、藻類、種植植物或種植植物種子。該等多種生物較佳全部為相同物種，或來自相同育種系，或相同種植植物品種，或相同生產種群或批次。
在本發明之特定脂質組合物中，DHA之存在量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約87重量%(諸如至少約88重量%)。可提及之進一步特定組合物包括含有的DHA的量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約90重量%的彼等組合物。在本發明之其他實施例中，DHA之存在量為該組合物之總脂肪酸含量的至多約96重量%(諸如至多約95重量%)。
已有利地發現本發明之脂質組合物相對於存在的EPA之量含有高含量之DHA。因此，在一個實施例中，脂質組合物中的二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸之重量比為至少約50：1。在進一步之實施例中，脂質組合物中的二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸之重量比可超過約100：1，諸如大於約30：1，且最特定言之大於約500：1。
有利地，組合物中EPA之量可非常低。在特定實施例中，脂質組合物含有占組合物之總脂肪酸含量的至多約1重量%，更特定言之至多約0.5重量%之EPA。
本發明之組合物含有第二多不飽和脂肪酸，其量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約3重量%。該第二多不飽和脂肪酸可識別為該組合物中之第二最豐富的多不飽和脂肪酸。第二PUFA可為任何PUFA(或其鹽、酯或酯之鹽)，諸如ω-3 PUFA(例如，ETA、EPA、SDA或DPA)。在特定實施例中，該第二PUFA為含有至少4個不飽和度之C：20-24 ω-3多不飽和脂肪酸。尤其較佳地，該第二PUFA為二十碳四烯酸(ETA；20：4n-3)(或其鹽、酯或酯之鹽)。
在本發明之特定脂質組合物中，該第二PUFA(例如，ETA)之存在量為該組合物總脂肪酸含量總脂肪酸含量的約3重量%至約12重量%。可提及之進一步特定組合物包括含有的第二PUFA(例如，ETA)的量為該組合物之總脂肪酸含量的約4重量%至約10重量%(約5重量%至約 8重量%)的彼等組合物。
在一個實施例中，本發明之該組合物進一步含有α-次亞麻油酸(ALA)，其量為該組合物之總脂肪酸含量的約0.1重量%至約4重量%。ALA為對於適當人類或動物健康重要的必需脂肪。在進一步之此類實施例中，該組合物含有ALA，其量為該組合物之總脂肪酸含量的約0.3重量%至約4重量%，更特定言之約0.5重量%至約2重量%。
因此，可提及的本發明之特定基於植物的脂質組成物為包含以下之組合物：
(i)二十二碳六烯酸(22：6n-3)，其量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約86重量%；
(ii)第二多不飽和脂肪酸，其量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約3重量%，其中該第二多不飽和脂肪酸為該組合物中第二最豐富的多不飽和脂肪酸；及
(iii)α-次亞麻油酸(18：3n-3)，其量為該組合物之總脂肪酸含量的約0.1重量%至約4重量%；
其中該二十二碳六烯酸、該第二多不飽和脂肪酸及該α-次亞麻油酸各自獨立地以脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯或脂肪酸酯之鹽的形式提供。
本發明之組合物含有占組合物之總脂肪酸含量的至多約0.5重量%之棕櫚酸(16：0)。在特定實施例中，組合物含有占組合物之總脂肪酸含量的至多約0.1重量%、更特定言之至多約0.05重量%之棕櫚酸。
本發明之組合物亦可含有其他ω-3脂肪酸(除了DHA及第二PUFA之外)，諸如二十二碳五烯酸(DPA；22：5n-3)及/或十八碳四烯酸(SDA；18：4n-3)。在一特定實施例中，該等組合物含有的DPA的量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約0.1重量%，特定言之至少約0.2重 量%。在此類實施例中，DPA的存在量可為該組合物之總脂肪酸含量的至多約1重量%，更特定言之至多約0.5重量%。
除非上下文另有指示，否則本發明之給定態樣、特徵或實施例之偏好及選項應被視為已與本發明之所有其他態樣、特徵及實施例之任何及所有偏好及選項組合地加以揭示。例如，在先前段落中指示之特定量之DHA、第二PUFA及ALA(若存在)以所有組合揭示。
因此，可提及之特定脂質組合物為包含以下各者之組合物：
(i)二十二碳六烯酸(22：6n-3)，其量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約86重量%；
(ii)二十碳四烯酸(20：4n-3)，其量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約3重量%，其中該二十碳四烯酸為該組合物中第二最豐富的多不飽和脂肪酸；及
(iii)α-次亞麻油酸(18：3n-3)，其量為該組合物之總脂肪酸含量的約0.1重量%至約4重量%；
其中該二十二碳六烯酸、該二十碳四烯酸及該α-次亞麻油酸各自獨立地以脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯或脂肪酸酯之鹽的形式提供。
在本發明之組合物中，該DHA、該ALA(若存在)及該第二PUFA可獨立地以脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯或脂肪酸酯之鹽的形式存在。在一特定實施例中，此等組分各自採用相同形式，例如其可全部為脂肪酸形式、全部為脂肪酸鹽形式、全部為脂肪酸酯形式或全部為脂肪酸酯之鹽的形式。在組分為脂肪酸鹽、酯或酯之鹽的形式的情況下，則該等組分可為相同鹽、酯或酯之鹽的形式。例如，該DHA、該ALA(若存在)及該第二PUFA可以脂肪酸之乙酯的形式提供。
在一特定實施例中，該DHA、該ALA(若存在)及該第二 PUFA獨立地以脂肪酸酯之鹽或最特定言之，以脂肪酸酯之形式提供。合適脂肪酸酯形式為熟習此項技術者所已知。例如，營養上可接受及/或醫藥學上可接受之脂肪酸酯形式包括脂肪酸之乙酯、甲酯、磷脂、單甘油酸酯、二甘油酯及三甘油酯。取決於脂質組合物之預期用途，可能需要不同之酯形式。例如，三甘油酯特別適用於供人類消費，尤其供嬰兒消費之食物，部分原因在於此等酯形式味道及對於熱處理(此可能係此類食品所必需的)之穩定性。乙酯特別適用於膳食補充劑，因為此等酯形式可有效且容易地製造，且不需要轉化成三酸甘油酯形式。因此，在另一實施例中，該DHA、該ALA(若存在)及該第二PUFA各自獨立地以脂肪酸乙酯之形式提供或提供為三酸甘油酯之部分。
三酸甘油酯係衍生自甘油及三種脂肪酸之酯。由於本發明係關於脂肪酸之摻合物，因此此類三酸甘油酯中之脂肪酸組分可以對應比率混合。即，儘管組合物中可存在不同三酸甘油酯分子之混合物，但組合物中之總脂肪酸分佈如申請專利範圍中所界定。
或者，脂肪酸組分可以「游離」脂肪酸之形式，即脂肪酸之-COOH形式，存在。然而，特別是在本發明之組合物中，該等組合物含有相對低含量之此形式之脂肪酸，因為其與令人不愉快之(通常為「皂」)味道相關聯，且比酯化形式之脂肪酸穩定性差。通常藉助於鹼或實體精煉自油及脂質組合物中移除游離脂肪酸，例如根據本文其他處論述之方法。因此，在一個實施例中，脂質組合物中之總游離脂肪酸含量小於組合物之總脂肪酸含量的5重量%((諸如小於3重量%，特定言之小於2重量%)。
本發明之脂質組合物中之脂肪酸通常為直(即，不分支)鏈脂肪酸。可提及之本發明組合物包括含有非常低含量之分支鏈脂肪酸及其 酯之組合物，使得該組合物基本上不含分支鏈脂肪酸及分支鏈脂肪酸酯。藉由術語「低含量」，吾人意謂組合物含有的分支鏈脂肪酸及脂肪酸酯的量為組合物之總脂肪酸之至多約0.1重量%。
本發明之脂質組合物亦可含有來源於源材料且在萃取及富集過程期間未完全移除之其他組分(例如，除脂肪酸之外)。彼等其他組件之精確身分標識將取決於源材料而有很大差異。此類其他組分之實例包括作為游離固醇或固醇酯存在之植物固醇(即，種植植物固醇及種植植物固烷醇)(諸如β-植固醇、β-穀固醇、△5-燕麥固醇、菜油固醇、△5-豆固醇、△7-豆固醇及△7-燕麥固醇、膽固醇、菜子固醇、海綿固醇、菜油固醇、菜油固烷醇及齒孔醇)。其他實例包括抗氧化劑，諸如生育酚及生育三烯酚。因此，可提及之本發明之特定脂質組合物包括含有可偵測量之一或多種植物固醇(例如β-植固醇)之脂質組合物。此類固醇可以脂質組合物之至少約0.01重量%，但通常不超過約1重量%存在。
本發明之組合物有利地可自種植植物來源(「植物」來源)獲得。藉由術語「基於植物」，吾人意謂至少70重量%之存在於本發明之組合物中的脂質係自植物來源獲得。植物來源包括種植植物來源，特別是諸如穀物之作物。在至少一個實施例中，脂質獲自籽油作物，諸如蕓薹屬(Brassica)，例如西洋油菜(Brassica napus)或芥菜(Brassica juncea)。然而，為避免疑義，組合物不必單獨自此類來源獲得，即，本發明之組合物中之脂質之比例(例如，至多30重量%)可自其他來源獲得，包括海洋(例如，魚或甲殼動物)油、藻油及其混合物。在一個實例中，存在之脂質之至少80重量%，諸如至少90重量%係自植物來源獲得。在本發明之特定組合物中，基本上所有(即，至少95%、至少99%，或約100%)脂質係自植物來源獲得。
在一個實施例中，本發明之組合物(及下文界定之飼料及藥物組合物)並非動物(例如，海洋動物)來源。即，在此類實施例中，脂質組合物不含任何來自諸如魚及甲殼動物之動物的組分。認為其中無自動物獲得之組分的脂質組合物在脂質含量方面係有利的，且在標準精煉及/或富集程序之後可達成穩定性特徵。
使用種植植物作為脂質或脂肪酸來源提供數個優點。例如，已知油之海洋來源含有較高含量之污染物(諸如汞、PCB及魚過敏原(例如小白蛋白))，此等污染物在種植植物材料中未發現。歷史性之過度捕撈亦耗盡了魚及甲殼動物(例如，磷蝦)之種群，使其不再具有可持續性。因此，本發明提供一種可持續來源之多不飽和脂肪酸油組合物，其含有相對低含量之非所需污染物。
在一特定實施例中，本發明之組合物衍生自種植植物。自其獲得油之種植植物通常為油籽作物，諸如椰子、棉籽、亞麻、棕櫚仁、花生、菜籽籽、大豆及葵花籽。因此，排他性地自種植植物獲得之組合物可稱為「植物」油或「植物脂質組合物」。可自其獲得本發明之脂質組合物的合適種植植物為熟習此項技術者所已知，且包括蕓薹屬物種(Brassica sp.)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、亞麻子(Linum usitatissimum)、向日葵物種(Helianthus sp.)、紅花草(Carthamus tinctorius)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、高粱(Sorghum bicolor)、蜀黍(Sorghum vulgare)、燕麥(Avena sativa)、車軸草屬物種(Trifolium sp.)、油棕(Elaesis guineenis)、本氏菸草(Nicotiana benthamiana)、大麥(Hordeum vulgare)、狹葉羽扇豆(Lupinus angustifolius)、水稻(Oryza sativa)、光稃稻(Oryza glaberrima)、亞麻薺(Camelina sativa)或深海兩節薺(Crambe abyssinica)。就此而言 可提及之特定種植植物來源為蕓薹屬物種。
合適來源(包括海洋、藻類及種植植物來源)可為天然存在的，或可經遺傳修飾以增強其產生長鏈多不飽和脂肪酸之能力。為此目的進行遺傳修飾之種植植物來源之實例，即源自重組種植植物細胞之種植植物來源之實例為熟習此項技術者所已知，且在以下國際專利申請案中揭示PCT/AU2013/000639(公開為WO 2013/185184)、PCT/AU2014/050433(公開為WO 2015/089587)及PCT/AU2015/050340(公開為WO 2015/196250)。遺傳修飾之菜籽描述於WO 2017/218969及WO 2017/219006中。本文中提及的所有公開案之揭示內容以全文引用之方式併入。
本發明之脂質組合物可直接自天然存在之來源(例如動物、藻類及/或種植植物)獲得。然而，通常需要處理自天然存在之來源獲得的油以使其富集。合適之富集方法在實例中例示。
本發明之脂質組合物之合適來源，或可混合或富集以產生彼等組合物之「原」油包括海洋物種、藻類及種植植物。自海洋來源獲得油之方法在此項技術中是眾所周知的。
如上文所論述，由於特定污染物之低含量及優良之可持續性，種植植物來源(諸如油籽來源)特別適合。諸如蕓薹屬物種(例如，芥花)之種植植物產生可經處理以獲得油之種子。
油/脂質之萃取
在此項技術中常規地實踐之技術可用於萃取、處理及分析由種植植物及種子產生之油。通常，將種植植物種子煮熟、壓榨並進行油萃取以產生原油。該油可接著脫膠、精煉、漂白及/或除臭。已發現脫膠、精煉、漂白及除臭之組合對於製備富含DHA之脂質混合物特別有效。因此， 在一個實施例中，脂質組合物係自已脫膠、精煉、漂白及/或除臭之籽油獲得。然而，沒有必要以此種方式處理油，且可在無此等方法之情況下達成適當純化及富集。
通常，用於擠壓種子之技術在此項技術中係已知的。例如，可藉由用水噴射油籽來使油籽回火以將水分含量提高至例如8.5%，且使用具有0.23mm至0.27mm之間隙設定的光滑輥進行壓片。取決於種子之類型，在擠壓之前可能不添加水。亦可使用擠出方法達成萃取。可使用或不使用擠出方法代替壓片，且有時用作螺旋壓榨之前或之後的附加製程。
在一實施例中，藉由使用螺旋壓榨機擠壓來釋出大部分籽油。接著使用熱追蹤柱用溶劑(例如己烷)萃取自螺旋壓榨機排出之固體材料，之後自所萃取之油中移除溶劑。或者，藉由壓榨操作產生之原油可通過具有開槽線排放頂部之沈澱槽，以移除在壓榨操作期間被吸出油之固體。澄清之油可通過板框式過濾器以移除任何殘留之精細固體顆粒。若需要，自萃取過程回收之油可與澄清之油組合以產生摻合原油。一旦自原油移除溶劑，便將壓榨與萃取之部分組合並對其進行正常油處理程序。
精煉及純化
如本文中所使用，術語「純化」當與本發明之脂質或油結合使用時通常意謂所萃取之脂質或油已經受一或多個處理步驟以提高脂質/油組分之純度。例如，純化步驟可包含以下中之一或多者：脫膠、除臭、脫色或乾燥所萃取之油。然而，如本文中所使用，術語「純化」不包括轉酯化過程或改變本發明之脂質或油之脂肪酸組合物之另一過程，以便增大DHA含量占總脂肪酸含量的百分比。換言之，純化之脂質或油之脂肪酸組合物基本上與未純化之脂質或油之脂肪酸組合物相同。
種植植物油一旦自種植植物來源萃取，便可使用一或多種以 下方法精煉(純化)，特別是使用脫膠、鹼精煉、漂白及除臭之組合。合適方法為熟習此項技術者所已知(例如，WO 2013/185184中揭示之方法)。
脫膠為精煉油之早期步驟，其主要目的為自油中移除大部分磷脂。在70至80℃下向原油添加通常含有磷酸之2%之水導致伴有痕量金屬及顏料的大部分磷脂之分離。移除之不溶性材料主要為磷脂與三醯甘油之混合物。可藉由向粗製籽油中添加濃磷酸以將不可水合之磷脂轉化為可水合形式並螯合存在之微量金屬來執行脫膠。藉由離心使膠與籽油分離。
鹼精煉係用於處理原油之精煉製程中之一者，有時亦稱為中和。其通常在脫膠之後且在漂白之前。脫膠之後，可藉由添加足量之鹼溶液來處理籽油，以滴定所有游離脂肪酸及磷酸，並移除由此形成之皂。合適之鹼性材料包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、氫氧化鋰、氫氧化鈣、碳酸鈣及氫氧化銨。鹼精煉通常在室溫下進行，且移除游離脂肪酸溶離份。藉由離心或藉由萃取至皂之溶劑中來移除皂，並用水洗滌中和之油。若需要，可用諸如鹽酸或硫酸之合適酸中和油中任何過量之鹼。
漂白為一種精煉製程，其中在漂白土(0.2至2.0%)存在下及無氧條件下藉由在具有氮氣或蒸氣的情況下或在真空中操作，將油在90至120℃加熱10至30分鐘。漂白經設計以移除非所需顏料(類胡蘿蔔素、葉綠素等)，且該過程亦移除氧化產物、痕量金屬，硫化合物及痕量皂。
除臭為在高溫(約180℃)及低壓(0.1至1mm Hg)下對油及脂肪之處理。此通常藉由以約0.1毫升/分鐘/100毫升籽油之速率將蒸氣引入至籽油中來達成。在噴灑約30分鐘之後，使籽油在真空下冷卻。此處理改良籽油之顏色且移除了大部分揮發性物質或有氣味之化合物，包括任何剩餘之游離脂肪酸、單醯基甘油及氧化產物。
冬化為一種有時用於油之商業生產之方法，用於藉由在低於 室溫之溫度下結晶來將油與脂肪分離成固體(硬脂酸甘油酯)及液體(油精)溶離份。其最初應用於棉籽油以產生無固體產物。其通常用於降低油之飽和脂肪酸含量。
轉酯化
原油通常含有三醯甘油(TAG)形式之所需脂肪酸。轉酯化為一種可用於在TAG內及TAG之間交換脂肪酸或將脂肪酸轉移至另一種醇上以形成酯(諸如乙酯或甲酯)之方法。在本發明之實施例中，使用化學方式達成轉酯化，通常涉及強酸或鹼作為催化劑。乙醇鈉(在乙醇中)為用於經由轉酯化形成脂肪酸乙酯之強鹼之實例。該方法可在環境溫度或高溫(例如，高達約80℃)下進行。
在本發明之其他實施例中，使用一或多種酶(特定言之，已知可用於例如在甘油酯中水解酯鍵之脂肪酶)達成轉酯化。該酶可為脂肪酶，其對於三醯甘油酯上之脂肪酸為位置特異性的(sn-1/3或sn-2特異性)，或對一些脂肪酸優先於其他脂肪酸。可提及之特定酶包括Lipozyme 435(可購自Novozymes A/S)。該過程通常在環境溫度下執行。該方法通常在對應於所需酯形式的過量醇(例如，藉由使用乙醇以便形成脂肪酸之乙酯)存在下執行。
蒸餾
分子蒸餾為自原油中移除大量揮發性較強之組分(諸如飽和脂肪酸)之有效方法。蒸餾通常在例如低於約1毫巴之減壓下執行。接著可選擇溫度及時間以在少數蒸餾時間(例如1至10小時)之後在餾出物與殘餘物之間達成約50：50之分配。用於產生本發明之脂質組合物之典型蒸餾溫度在120℃至180℃之範圍內，特定言之在145℃至160℃之範圍內。
可執行多次蒸餾，當餾出物與殘餘物之間達到大致50：50之分配時， 認為每次蒸餾完成。連續蒸餾之使用降低了總產率，然而，兩次蒸餾可產生最佳結果。
層析
層析為用於分離LC-PUFA混合物之各種組分的有效方法。其可用於增大混合物內一或多種較佳LC-PUFA之濃度。層析分離可在各種條件下達成，但其通常涉及使用固定床層析系統或模擬移動床系統。
固定床層析系統係基於以下概念：將要分離組分(通常與溶離劑一起)之混合物經由含有展現對流體之高滲透性的多孔材料填料(固定相)之蒸鎦塔滲濾。混合物之每種組分之滲濾速度取決於該組分之物理特性，使得組分連續且選擇性地自蒸餾塔排出。因此，一些組分傾向於強固定至固定相，且因此將更加延遲，而其他組分傾向於弱固定且在短時間後自蒸鎦塔排出。
模擬移動床系統由數個含有吸附劑之個別蒸餾塔組成，該等蒸餾塔串聯連接在一起並藉由週期性地移位混合物及溶離劑注射點以及系統中的分離之組分收集點來操作，藉此總體效果為模擬含有固體吸附劑移動床之單一蒸鎦塔之操作。因此，模擬移動床系統由蒸餾塔組成，如在習知固定床系統中，其含有固體吸附劑之固定床(溶離劑通過該等固定床)，但在模擬移動床系統中，操作為模擬連續逆流移動床。
在此等方法中使用之蒸餾塔通常含有二氧化矽(或經改質二氧化矽)作為固定相之基礎。流動相(溶離劑)通常為高極性溶劑混合物，常常含有一或多種質子溶劑，諸如水、甲醇、乙醇等，以及其混合物。可藉由熟習此項技術者調整溶離劑流動速率以最佳化分離過程之效率，其中較慢流動速率通常增強組分之分離且促進含有非常高含量之單一脂肪酸的組合物之獲得。可重複層析分離以達成類似純度增強。LC-PUFA之偵測方 法為熟習此項技術者所已知，且包括UV-vis吸收方法以及折射率偵測方法。
因此，根據本發明之第二態樣，提供一種用於產生本發明之脂質組合物之方法，該方法包含：提供脂肪酸乙酯之混合物；對該混合物進行層析分離過程。本發明亦係關於可藉由此等方法獲得之脂質組合物。合適之層析分離條件包括本文中所描述的彼等條件。
例如，可用於層析分離之特定特定流動相為甲醇與水之混合物(例如，88%甲醇/水)，但此在分離期間改變(例如，增大甲醇含量)以提高效率。可使用之特定固定相為基於二氧化矽之固定相，諸如Deltaprep C18蒸鎦塔。可對所獲得的溶離份執行分析HPLC或熟習此項技術者已知的任何其他合適技術，以識別含有高濃度DHA且因此含有本發明之脂質組合物的溶離份。
在本發明之第二態樣之一實施例中，藉由例如根據上文描述的方法中之任一者對基於植物之脂質油進行轉酯化及蒸餾來獲得脂肪酸乙酯之混合物。基於植物之脂質油可自本文揭示之或此項技術中原本已知之任何種植植物，特別是油籽獲得。在轉酯化及蒸餾之前，可視情況執行使用脫膠、鹼精煉、漂白及/或除臭對基於植物之脂質油之精煉。
其他富集方法
本發明之脂質組合物可用作API之活性醫藥成分(API)或前驅體(或「中間體」)，其可藉助於進一步富集而由此獲得。此類組合物將進一步富集諸如DHA及/或ALA之有益PUFA之含量。
油中多不飽和脂肪酸之濃度可藉由此項技術已知之各種方法增大，諸如冷凍結晶、使用脲之錯合物形成、超臨界流體萃取及銀離子錯合。利用脲形成複合物為降低油中飽和及單不飽和脂肪酸含量之簡單而有 效之方法。最初，油之TAG被分成其構成性脂肪酸，通常以脂肪酸酯之形式。脂肪酸組合物通常未因處理而改變之此等游離脂肪酸或脂肪酸酯接著可與脲之乙醇溶液混合以形成錯合物。飽和及單不飽和脂肪酸易與脲錯合且在冷卻時結晶出來，且可隨後藉由過濾而移除。因此，非脲錯合之溶離份富含長鏈多不飽和脂肪酸。
產物
本發明之脂質組合物為散裝油。即，脂質組合物已自獲得部分或全部脂質之來源物質(例如，種植植物種子))中分離。
本發明之脂質組合物可用作飼料。即，本發明之組合物可以口服形式提供。出於本發明之目的，「飼料」包括用於人類消費之任何食物或製劑，其在攝入體內時用於滋養或增強組織或供應能量；及/或維持、恢復或支持適當之營養狀態或代謝功能。飼料包括用於嬰兒及/或幼兒之營養組合物，例如嬰兒配方食品。在飼料之情況下，脂肪酸可以三酸甘油酯之形式提供，以進一步減少任何令人不愉快的味道並使穩定性最大化。
飼料包含本發明之脂質組合物，視情況與合適載劑一起。術語「載劑」以其最廣泛之意義使用，以涵蓋可能具有或不具有營養價值之任何組分。如熟習此項技術者將瞭解，載劑必須適合在飼料中使用(或以足夠低之濃度使用)，使得其對消耗飼料之生物體無不利之影響。
飼料組合物可呈固體或液體形式。另外，該組合物可包括在此項技術中眾所周知的針對特定用途所需量之可食用多量養分、蛋白質、碳水化合物、維生素及/或礦物質。此等成分之量將取決於組合物意欲與正常個體一起使用抑或與具有特殊需要之個體(諸如患有代謝障礙等之個體)一起使用而變化。
具有營養價值之合適載劑之實例包括多量養分，諸如可食用 脂肪(例如椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑油、大豆油及甘油單酯及甘油二酯)、碳水化合物(例如葡萄糖、可食用乳糖及水解澱粉)及蛋白質(例如大豆蛋白質、電滲析乳清、電滲析脫脂牛奶、牛奶乳清或此等蛋白質之水解產物)。
可添加至本文揭示之飼料中之維生素及礦物質包括例如鈣、磷、鉀、鈉、氯、鎂、錳、鐵、銅、鋅、硒、碘及維生素A、E、D、C及B錯合物。
本發明之脂質組合物可用於醫藥組合物中。此類藥物組合物包含本發明之脂質組合物，視情況與一或多種藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑一起，其為熟習此項技術者所已知。合適之賦形劑、稀釋劑或載劑包括磷酸鹽緩衝鹽水、水、乙醇、多元醇、潤濕劑或乳液，諸如水/油乳液。該組合物可為液體或固體形式，包括作為溶液、懸浮液、乳液、油或粉末。例如，該組合物可為錠劑、膠囊、囊封凝膠、可攝入液體(包括油或溶液)或粉末、乳液或局部軟膏或乳膏之形式。藥物組合物亦可作為靜脈內製劑而提供。
適用於飼料及藥物組合物之特定形式包括含有液體之膠囊及囊封凝膠。
在使用之前，本發明之脂質組合物可與其他脂質或脂質混合物(特別是基於植物之脂肪酸酯及脂肪酸酯混合物)混合。本發明之脂質組合物可與一或多種選自由以下組成之群的一或多種額外組分一起提供：抗氧化劑(例如生育酚((諸如α-生育酚或γ-生育酚)或參雙鍵生育酚)、穩定劑及界面活性劑。α-生育酚及γ-生育酚兩者皆為各種種植植物籽油中之天然存在的組分，包括菜籽油。
亦可能需要包括等張劑，例如糖、氯化鈉等。除此類惰性稀 釋劑之外，該組成物亦可包括佐劑，諸如濕潤劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調味劑及芳香劑。除本發明之脂質組合物之外，懸浮液亦可包含懸浮劑，諸如乙氧基化異硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇及脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂-瓊脂及黃蓍或此等物質之混合物。
可使用此項技術中熟知之技術製備諸如錠劑及膠囊之固體劑型。例如，根據本文揭示之方法產生的脂肪酸可用習知錠劑基質(諸如乳糖、蔗糖及玉米澱粉)結合黏合劑(諸如阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠)、崩解劑(諸如馬鈴薯澱粉或褐藻酸)及潤滑劑(諸如硬脂酸或硬脂酸鎂)來製成錠劑。膠囊可藉由將此等賦形劑連同相關之脂質組合物及視情況選用之一或多種抗氧化劑一起併入明膠膠囊中來製備。
本發明之藥物組合物之可能給藥途徑包括例如經腸(例如，口服及直腸)及不經腸。例如，液體製劑可口服或經直腸施予。另外，均質混合物可完全分散在水中，在無菌條件下與生理學上可接受之稀釋劑、防腐劑、緩衝劑或推進劑混合以形成噴霧劑或吸入劑。
本發明之脂質組合物指示為藥劑。根據本發明之另一態樣，提供一種本發明之組合物，其包括上文描述之藥物組合物中之任一者以用作醫藥。
本發明之脂質組合物可提供通常與長鏈多不飽和脂肪酸相關聯之數個益處。例如，本發明之脂質組合物及上文描述之醫藥組合物可用於治療或預防心血管疾病、防止心血管疾病患者死亡、降低總體血清膽固醇含量、降低高BP、增大HDL：LDL比率、減少三酸甘油酯，或降低脂蛋白元-B含量，如可使用熟習此項技術者所熟知的測試加以判定。因此，亦揭示使用本發明之脂質組合物治療(或預防)上述疾病及病況之方法。
如本文中所使用，術語「治療(treatment、treat及treating)」 係指與未採取措施時可能發生之情況相比，逆轉、緩解、抑制如本文所描述之疾病或病症之進展，或延遲、消除或減少如本文所描述之病症或疾病之發生或發作。如本文中所使用，術語「預防(prevent、prevention及preventing)」係指降低獲得或產生給定病況之風險，或減少或抑制未患病之受試者之復發或該病況。
特定脂肪酸之典型劑量為0.1mg至20g，每日服用1至5次(每日至多100g)，且特定言之在每日約10mg至約1、2、5或10g之範圍內(一次或多次服用)。如此項技術中已知，最低約300毫克/日之脂肪酸，尤其是LC-PUFA係合乎需要的。然而，應瞭解，任何量之脂肪酸都將對受試者有益。
當用作藥物組合物時，待施用於患者之脂質組合物之劑量可由一般熟習此項技術者判定，且取決於各種因素，諸如患者之體重、患者之年齡、患者之總體健康狀況、患者之既往病史、患者之免疫狀況等。
本發明之組合物為易於獲得之組合物，其可具有改良之穩定性特徵且可含有脂肪酸之混合物，其中ω-3與ω-6脂肪酸之相對比例對人類健康特別有益。可使用熟習此項技術者已知之各種方法評估穩定性。此類方法包括Rancimat方法、丙醛形成之評估(特別適用於ω-3脂肪酸)、己醛形成之評估(特別適用於ω-6脂肪酸)、「過氧化值」方法(例如，使用AOCS官方方法Cd 8-53)及「對甲氧基苯胺值」方法(例如，使用AOCS官方方法Cd 18-90)。在實例中展示，本發明之組合物可自起始混合物獲得，該等起始混合物與參考摻合物(在主要LC-PUFA方面具有類似組合物但含有大量之動物(魚)來源之脂質)相比並不展示增強之穩定性特徵。
與先前技術中已知之脂質組合物相比，本發明之組合物亦可 具有以下優點：其可更有效、毒性更小、藥效更長、產生之副作用更少、更容易吸收，及/或具有較佳藥物動力學概況(例如，更高之口服生物可用性及/或更低之清除率)，及/或具有其他有用之藥理學、物理或化學特性。
藉由以下實例說明本發明，其中：
圖1展示菜籽油及參考油之丙醛釋出資料(在轉酯化、蒸餾及層析之後)，其表明本文中所描述的菜籽油之改良之穩定性；及
圖2展示菜籽油及參考油之丙醛釋出資料(在RBD精煉、轉酯化、蒸餾及層析之後)，其表明本文中所描述的菜籽油之改良之穩定性。
實例
實例1-自種子萃取DHA菜籽油
揭示於美國專利公開案第US 2018/0016590 A1號中之各種芥花作為夏季作物生長。收穫種子，且接著在擠壓前在室溫下儲存。
使用Kern Kraft KK80螺旋壓榨機擠壓272kg種子以產生DHA油。將榨油機軸環加熱器溫度設定為恆溫器上之最大設定溫度。初始環境溫度及扼流圈溫度為20℃，且將抗流器距離設定為73.92mm。在不停止榨油機直至所有種子被擠壓之情況下，饋送種子，同時連續地收集油及粉。
在整個壓榨過程中監測螺旋鑽之旋轉速度、粉及排出之油的溫度。270kg之擠壓時間為4小時，此係67.5kg/hr之產出率。獲得87.2kg(32%)原油之產率。在過濾以移除細粉之後，產率為77.2kg(28%)。
實例2-參考摻合油
純魚油含有低含量之ALA脂肪酸及顯著更高含量之EPA及DHA。參考油摻合物(在本文中稱為「粗製三酸甘油酯參考共混油」或類似者)經設計以在組合物上與實例1中獲得之經過濾之DHA菜籽油儘可能類似。此藉由(a)將DHA之總含量與DHA菜籽油中之總含量相匹配且(b)匹配DHA/(ALA+EPA)之比率來完成。此係藉由共混富含DHA之魚油(鮪)、富含ALA之油(亞麻籽油)及標準菜籽油來達成的。所得參考摻合油亦具有與DHA菜籽油類似之總ω-3含量。
實例3-粗製DHA菜籽油及參考摻合物之脂肪酸組合物
分析經過濾之原油及參考摻合油之脂肪酸組合物。結果如下所示。
Figure 111127405-A0101-12-0025-1
Figure 111127405-A0101-12-0026-2
實例4-油穩定性評估
使用分別在實例1及2中描述之粗製DHA菜籽油及參考摻合物執行酸敗儀(Rancimat)穩定性研究。該方法涉及使用Metrohm 743 Rancimat在90℃下之標準程序測試約2.5g測試材料。
下表概述在90℃下自此等油獲得之結果。一式兩份地執行實驗。
Figure 111127405-A0101-12-0026-3
DHA菜籽油展示出始終比參考油更差之穩定性。
實例5-粗製菜籽DHA油之化學轉酯化
向裝有機械攪拌器之乾燥氮氣沖洗Buchi CR101化學反應器中添加純乙醇(12.5L)及在實例1中獲得之粗製三酸甘油酯菜籽油(「DHA菜籽油」)(5.00kg)，並攪拌混合物。
上述混合物中添加用進一步純乙醇(2.5L)沖洗至反應器中的乙醇鈉(150g)，並在環境溫度下繼續攪拌16小時。自混合物中取出之樣本記錄之1H NMR頻譜指示反應完成。
對5.22kg粗製菜籽DHA油執行轉酯化程序。向所得粗製反應混合物中添加40至60℃沸點石油精(石油精，10L)及水(10L)，並藉由充分混合將混合物用10%鹽酸謹慎地酸化至pH值7(總共需要870mL，Merck Universal指示條，pH值為0至14)。
將所得混合物在反應器中靜置，之後形成2相。移除石油精層，且進一步用石油精(3×5L)萃取水層。使組合石油精層返回至反應器，且在真空中蒸發至低體積(約10L)。將所得濃溶液自反應器中排出，用無水硫酸鎂(約1kg)乾燥，過濾且在真空中濃縮，得到黃色油狀物(5.13kg)。
實例6-粗製參考摻合油之化學轉酯化
向裝有機械攪拌器之乾燥氮氣沖洗Buchi CR101化學反應器中添加純乙醇(12.5L)及根據實例2獲得之粗製三酸甘油酯參考摻合油(5.00kg)，並攪拌混合物。
上述混合物中添加用進一步純乙醇(2.5L)沖洗至反應器中的乙醇鈉(150g)，並在環境溫度下繼續攪拌16小時。對樣本記錄之1H NMR頻譜指示極少或無反應發生。進一步向混合物中添加乙醇鈉(57g)，並繼續攪拌。
在額外5小時之後，樣本之1H NMR頻譜指示反應完成75%。進一步向混合物中添加乙醇鈉(60mL的21%乙醇溶液)，並繼續攪拌3日，此後反應完成。
自粗製參考摻合物化學轉酯化之實例產物隔離
對5.17kg粗製參考摻合油執行轉酯化程序。向所得粗製反應混合物添加石油精(15L)及水(3.3L)，且藉由充分混合將混合物用10%鹽酸謹慎地酸化至pH值7(總共需要910mL)。
將所得混合物在反應器中靜置，之後形成2相。移除石油精層，且進一步用石油精(2×7.5L)萃取水層。使組合石油精層返回至反應器，且在真空中蒸發至低體積(約10L)。將所得濃溶液自反應器中排出，用無水硫酸鎂(約1kg)乾燥，過濾且在真空中濃縮，得到黃色油狀物(5.39kg)。
實例7-轉酯化菜籽油之蒸餾
用於藉由真空蒸餾移除揮發性較強之脂肪酸乙酯(FAEE)混合物組分之標準程序
來自粗製菜籽DHA(在實例5中獲得)之粗製脂肪酸乙酯(FAEE)在以下條件下進行蒸餾。藉由使經轉酯化之原油經由仍在真空下之Pope 2吋(50mm)刮膜來達成藉由蒸餾之分離，該真空配備有2×1000ml收集燒瓶，收集餾出物及殘餘物。各自針對脂肪酸組合物進行分析。
藉由Edwards 3旋轉泵供應真空，並藉由ebro真空計VM2000量測真空。
藉由Cole-Palmer Instrument Company easy-load II蠕動泵以4mL/min將油饋送至蒸餾器中，蒸餾器馬達設定為325rpm，使用水冷凝器冷凝餾出物。繼續饋送，直至一個或另一接收器燒瓶充滿為止。
在此等條件下蒸餾粗製菜籽DHA FAEE，加熱帶最初設定為147℃。目的係獲得50：50分配之餾出物：殘餘物。在實驗的前30至45分鐘期間，加熱帶之溫度升高至154℃，以增大蒸餾之油之比例，接著使蒸餾器平衡。在半小時之後，加熱帶之溫度在半小時內向下調整至149℃。 蒸餾之其餘部分在149℃下進行。蒸餾之總時間為350分鐘。再次在標準條件下藉由蒸餾移除來自上述蒸餾之一部分殘餘物的揮發性較強之組分，同時將加熱帶之溫度設定為149℃。蒸餾之總時間為95分鐘。
Figure 111127405-A0101-12-0029-4
實例8-轉酯化粗製參考摻合物衍生之FAEE之蒸餾
來自粗製參考摻合物(實例6中獲得)之粗製脂肪酸乙酯(FAEE)在與先前實例中所示相同之條件下進行蒸餾。
在此等標準條件下蒸餾粗製參考摻合物FAEE，加熱帶最初設定為152℃。目的係獲得50：50分配之餾出物：殘餘物。在20分鐘之後，將加熱帶之溫度設定為154℃，以增大餾出物之流量。再過一小時後，將加熱帶溫度調整至153℃，且接著在接下來的一小時內調整至152℃。對於蒸餾之最後一小時，將加熱帶溫度設定為153℃。蒸餾之總時間為380分鐘。再次在標準條件下藉由蒸餾移除來自上述蒸餾之殘餘物的揮發性較強的組分。目的係獲得50：50分配之餾出物：殘餘物。蒸餾主要在加熱帶設定為150至151℃之條件下執行。蒸餾之總時間為195分鐘。
Figure 111127405-A0101-12-0029-5
實例9-菜籽衍生之FAEE之層析分離
製備型HPLC
實例7中所獲得之脂肪酸乙酯(FAEE)(即，已自粗製菜籽DHA獲得並使用轉酯化及蒸餾加以處理)在以下條件下進行層析分離。將包含Waters Prep 4000系統、具有10ml環路之Rheodyne注射器、300×40mm Deltaprep C18蒸鎦塔、Waters 2487雙波長偵測器及圖表記錄器之製備型HPLC系統用88%甲醇/水流動相以70mL/min平衡。偵測器設定為215nm及2.0吸光度單位全標度，圖表以6cm/hr執行。
將1.0g FAEE油溶於最少量之88%甲醇/水中，並經由Rheodyne注射器注射至蒸鎦塔上。一旦在約7分鐘後出現溶劑前端，便收集約250mL溶離份。
在140分鐘內收集總共43個溶離份。在85分鐘之後，流動相改變為90%甲醇/水。在105分鐘之後，流動相改變為94%甲醇/水。在110分鐘之後，流動相改變為100%甲醇。在收集最終溶離份之後，以70ml/min用100%甲醇另外洗滌蒸鎦塔1小時。對所有溶離份執行分析HPLC，且組合主要含有DHA的溶離份(產率：22%)。
分析HPLC
使用包含Waters 600E泵控制器、717自動取樣器、2996光電二極體陣列偵測器及2414折射率偵測器之HPLC系統進行樣本分析。分析在150×4.6mm Alltima C18蒸鎦塔上使用等度90%甲醇/水或95%甲醇/水在1.0mL/min下作為流動相加以執行。以Waters Empower 3軟件執行資料收集及處理。
實例10-參考摻合物衍生之FAEE之層析分離
參考摻合物(實例8中獲得)之經蒸餾脂肪酸乙酯(FAEE)在與先前實例中所示相同之條件下進行層析分離
在130分鐘內收集總共43個溶離份。在75分鐘之後，流動相改變為 90%甲醇/水。在95分鐘之後，流動相改變為95%甲醇/水。在110分鐘之後，流動相改變為100% MeOH。在收集最終溶離份之後，以70ml/min用100%MeOH另外洗滌蒸鎦塔1小時。對所有溶離份執行分析HPLC，且組合主要含有DHA的溶離份(產率：約20%)。
實例11-對富集油之脂肪酸組合物分析
分析實例9及10中獲得之產物之脂肪酸組合物。結果如下所示。
Figure 111127405-A0101-12-0031-6
Figure 111127405-A0101-12-0032-7
實例12-油穩定性評估
頂空GC-MS穩定性試驗
對上文所描述的富集產物進行頂空分析，以評估在特定條件下釋出之丙醛之量。增大之丙醛釋出含量表明測試材料之穩定性降低。
SPME(固相微萃取)方法：
精選65μm PDMS/DVB StableFlex纖維(Supelco纖維套件57284-u)
在使用之前將纖維在Triplus RSH調節站中在250℃下調節10分鐘
在萃取之前將樣本在40℃培育1分鐘。
自頂空小瓶萃取1分鐘
預期為能夠俘獲廣泛範圍的揮發性組分之良好通用方法。
GC方法：
Thermo Scientific TRACE 1310 GC
Thermo Scientific TR-DIOXIN 5MS蒸鎦塔、0.25mm內徑、30m膜0.1μm
分流注射250℃ Split 83，1.2ml He/min
GC斜變：以5℃/min自40℃ 1分鐘斜變至100℃，接著以50℃/min 斜變至300℃
使用具有良好協同作用之通用MS特異性蒸鎦塔用於頂空分析。使用緩慢之初始溫度斜變以最大化揮發物之分離，接著斜升至最大值以維持蒸鎦塔效能。使用分流注射以避免對入口之低溫冷卻要求並提高蒸鎦塔解析度。
標準品之分離受到一些峰值重疊之阻礙，但仍可在定量中得到滿足。對於3個標準校準結果(0.1、0.01及0.01%)，使用分子態離子m/z 56用於偵測丙醛。使用m/z 58處之基峰來偵測己醛。
MS方法：
Thermo Scientific DFS高解析度GC-MS
低解析度(1000)、全掃描35-350Da，每次掃描0.5s
標準：-將丙醛及己醛標準稀釋液製成供應的DHA菜籽乙酯。接著將此等標準混合物以540μl至20ml頂空小瓶之體積添加。
使用全掃描，從而允許監測所有演進之產物而非特定分子。
頂空穩定性結果：
下表概述自實例9中獲得之菜籽油及實例10中獲得之參考油自T=0至2日獲得之結果。在此週期期間，在燈箱及螢光管照明下，將測試樣本保持在環境溫度下。分析m/z 58分子態離子，且質譜圖清楚地展示在室溫下1.37分鐘出現丙醛。丙醛產生在下表中量化，且資料展示於圖1中。與參考相比，DHA菜籽油釋出顯著較低量之丙醛，表明菜籽油之改良之穩定性。
Figure 111127405-A0101-12-0033-17
與參考油相比，DHA菜籽油展示優良之氧化穩定性。
實例13-DHA菜籽油之精製
實例1中獲得的菜籽油之一部分在進行進一步富集之前進行精煉。精煉過程涉及脫膠、鹼精煉、漂白及除臭。
酸脫膠
脫膠為自油中移除不可水合及可水合之磷脂。將實例1中獲得的經乾燥原油加熱至53±2℃，且添加0.2%之50%檸檬酸溶液。在混合約30分鐘之後，添加2.0%經加熱(53±2℃)之軟化水並混合約30分鐘。在保持期間將油加熱至67±3℃，且接著離心。
酸預處理/精煉
精煉為在用苛性鹼皂化後移除游離脂肪酸以使其可溶於水且隨後藉由離心移除。使用酸預處理步驟來繼續磷脂之水合。將脫膠油加熱至65±5℃並添加0.1%之85%磷酸，並混合總共30分鐘。在酸添加及保持時間之後，添加20 Be'(Baumé；14.4%，w/w)氫氧化鈉以中和游離脂肪酸加0.05%(w/w)過量。接著將苛性鹼及油混合另外15分鐘。在15分鐘之保持期間將油加熱至62±2℃，且接著將油離心。
苯磺醯基二氧化矽處理
執行苯磺醯基二氧化矽處理以進一步移除皂，達到與漂白相容之含量。苯磺醯基預處理與漂白步驟組合。將精煉油加熱至68±5℃，並用0.3%之Trisyl 300處理。將油/苯磺醯基混合約15分鐘，且接著繼續漂白。
漂白
將精煉油用吸附性黏土處理，以移除過氧化物、磷脂、有色體及痕量皂。使用酸預處理步驟來繼續磷脂之水合。將用苯磺醯基預處理 之油與0.2%(w/w)之50%檸檬酸溶液混合。在混合15分鐘之後，添加2%(w/w)Tonsil Supreme 126 FF漂白黏土。接著將混合物在真空下加熱至90±2℃，並保持約30分鐘。將油冷卻至60±2℃，用氮氣打破真空，添加1.0kg助濾劑並過濾。壓力容器：500L Cherry-Burrell壓力容器，蒸氣或冷卻水套，全316不鏽鋼構造，具有用於混合之葉輪及擋板，製造系列# E-227-94。壓濾機：使用24"聚丙烯Sperry壓濾機，容量4.8立方呎之過濾器，紙及布支撐件。
除臭
將經漂白之油在高溫及低壓下用蒸氣噴灑以移除有氣味之組分、香味組分及額外游離脂肪酸。顏色亦藉由在高溫下之熱漂白而掉色。將一半經漂白油在180±2℃下用1%噴射蒸氣除臭60分鐘，並監測脂肪酸組合物(FAC)。除臭器容器(OD4)：400L Copersmithing真空額定容器，蒸氣或冷卻水套，全316不鏽鋼構造。在180℃下保持60分鐘，觀察到DHA含量略微降低。接著，在180℃下進行另一次試驗，保持30分鐘。將產物在氮氣下封裝於20L塑膠HDPE桶中，並儲存在4℃之冷卻器中。
實例14-原始參考摻合油之精製
實例2中描述的參考摻合物之一部分在進行進一步富集之前進行精煉。在精煉過程中，參考摻合物在與先前實例中所示相同之條件下進行精煉。
實例15-RBD粗製DHA菜籽油及參考摻合物之脂肪酸組合物
分析RBD過濾原油(實例13)及RBD參考摻合油(實例14)之脂肪酸組合物。結果如下所示。
Figure 111127405-A0101-12-0036-9
結合實例(及附圖)提及「RBD」意謂相關產物係直接或間接地自實例13(對於菜籽油)及實例14(對於參考共混物)之「精煉」產物獲得。
實例16-RBD菜籽DHA油之化學轉酯化
向裝有機械攪拌器之乾燥氮氣沖洗Buchi CR101化學反應器中添加純乙醇(12.5L)及在實例13中獲得之精煉(「RBD」)三酸甘油酯菜籽DHA油(5.00kg)，並攪拌混合物。
上述混合物中添加用進一步純乙醇(2.5L)沖洗至反應器中的乙醇鈉(150g)，並在環境溫度下繼續攪拌16小時。自混合物中取出之樣本記錄之1H NMR頻譜指示反應完成。
對約5kg之RBD菜籽DHA油執行轉酯化程序。向所得粗製反應混合物中添加40至60℃沸點石油精(石油精，10L)及水(10L)，並藉由充分混合將混合物用10%鹽酸謹慎地酸化至pH值7(總共需要870mL，Merck Universal指示條，pH值為0至14)。
將所得混合物在反應器中靜置，之後形成2相。移除石油精層，且進一步用石油精(3×5L)萃取水層。使組合石油精層返回至反應器，且在真空中蒸發至低體積(約10L)。將所得濃溶液自反應器中排出，用無水硫酸鎂(約1kg)乾燥，過濾且在真空中濃縮，得到淺黃色油狀物(產率：99%)。
實例17-RBD參考摻合油之化學轉酯化
向裝有機械攪拌器之乾燥氮氣沖洗Buchi CR101化學反應器中添加純乙醇(12.5L)及在實例14中獲得之RBD三酸甘油酯參考摻合油(約5kg)，並攪拌混合物。
上述混合物中添加用進一步純乙醇(2.5L)沖洗至反應器中的乙醇鈉(150g)，並在環境溫度下繼續攪拌16小時。對樣本記錄之1H NMR頻譜指示極少或無反應發生。進一步向混合物中添加乙醇鈉(57g)，並繼續攪拌。
在額外5小時之後，樣本之1H NMR頻譜指示反應完成75%。 進一步向混合物中添加乙醇鈉(60mL的21%乙醇溶液)，並繼續攪拌3日，此後反應完成。
自RBD參考摻合物化學轉酯化之實例產物隔離
對約5kg之RBD參考摻合油執行轉酯化程序。向所得粗製反應混合物添加石油精(15L)及水(3.3L)，且藉由充分混合將混合物用10%鹽酸謹慎地酸化至pH值7(總共需要910mL)。
將所得混合物在反應器中靜置，之後形成2相。移除石油精層，且進一步用石油精(2×7.5L)萃取水層。使組合石油精層返回至反應器，且在真空中蒸發至低體積(約10L)。將所得濃溶液自反應器中排出，用無水硫酸鎂(約1kg)乾燥，過濾且在真空中濃縮，得到淺黃色油狀物(產率：99%)。
實例18-轉酯化RBD菜籽油之蒸餾
用於藉由真空蒸餾移除揮發性較強之脂肪酸乙酯(FAEE)混合物組分之標準程序
來自RBD菜籽DHA(在實例16中獲得)之脂肪酸乙酯(FAEE)在以下條件下進行蒸餾。藉由使經轉酯化之原油經由仍在真空下之Pope 2吋(50mm)刮膜來達成藉由蒸餾之分離，該真空配備有2×1000ml收集燒瓶，收集餾出物及殘餘物。各自針對脂肪酸組合物進行分析。
藉由Edwards 3旋轉泵供應真空，並藉由ebro真空計VM2000量測真空。
藉由Cole-Palmer Instrument Company easy-load II蠕動泵以4mL/min將油饋送至蒸餾器中，蒸餾器馬達設定為325rpm，使用水冷凝器冷凝餾出物。繼續饋送，直至一個或另一接收器燒瓶充滿為止。
在此等條件下蒸餾RBD菜籽DHA FAEE，加熱帶最初設定 為152℃以獲得50：50分配之餾出物：殘餘物。再次在標準條件下藉由蒸餾移除來自此蒸餾之一部分殘餘物的揮發性較強之組分，同時將加熱帶之溫度設定為152℃。蒸餾之總時間為約90分鐘。
Figure 111127405-A0101-12-0039-10
實例19-轉酯化RBD參考摻合物衍生之FAEE之蒸餾
來自RBD參考摻合物(實例17中獲得)之脂肪酸乙酯(FAEE)在與先前實例中所示相同之條件下進行蒸餾。
在此等標準條件下蒸餾RBD參考摻合物FAEE，加熱帶最初設定為152℃以獲得50：50分配之餾出物：殘餘物。再次在標準條件下藉由蒸餾移除來自此蒸餾之殘餘物的揮發性較強的組分。目的係獲得50：50分配之餾出物：殘餘物。蒸餾主要在加熱帶設定為152℃之條件下執行。蒸餾之總時間為約200分鐘。
Figure 111127405-A0101-12-0039-11
實例20-RBD菜籽衍生之FAEE之層析分離
實例18中所獲得之脂肪酸乙酯(FAEE)(即，已自RBD菜籽DHA獲得並使用轉酯化及蒸餾加以處理)在以下條件下進行層析分離。將包含Waters Prep 4000系統、具有10ml環路之Rheodyne注射器、300×40mm Deltaprep C18蒸餾塔、Waters 2487雙波長偵測器及圖表記 錄器之製備型HPLC系統用88%甲醇/水流動相以70mL/min平衡。偵測器設定為215nm及2.0吸光度單位全標度，圖表以6cm/hr執行。
將1.0g FAEE油溶於最少量之88%甲醇/水中，並經由Rheodyne注射器注射至蒸鎦塔上。一旦在約7分鐘後出現溶劑前端，便收集約250mL溶離份。
對所有溶離份執行分析HPLC，且組合主要含有DHA之溶離份(產率：約20%)。
實例21-RBD參考摻合物衍生之FAEE之層析分離
RBD參考摻合物(實例19中獲得)之經蒸餾脂肪酸乙酯(FAEE)在與先前實例中所示相同之條件下進行層析分離。
對所有溶離份執行分析HPLC，且組合主要含有DHA之溶離份(產率：約20%)。
實例22-對富集RBD油之脂肪酸組合物分析
分析實例20及21中獲得之產物之脂肪酸組合物。結果如下所示。
Figure 111127405-A0101-12-0040-18
Figure 111127405-A0101-12-0041-13
實例23-油穩定性評估
根據實例12中描述的方法對實例20及21中所描述的富集產物進行頂空分析。
下表概述自實例20中獲得之RBD菜籽油及實例21中獲得之RBD參考油自T=0至2日獲得之結果。在此週期期間，在燈箱及螢光管照明下，將測試樣本保持在環境溫度下。分析m/z 58分子態離子，且質譜圖清楚地展示在室溫下1.37分鐘出現丙醛。丙醛產生在下表中量化，且資料展示於圖2中。與參考相比，DHA菜籽油釋出顯著較低量之丙醛，表 明菜籽油之改良之穩定性。
Figure 111127405-A0101-12-0042-14
與參考油相比，DHA菜籽油展示優良之氧化穩定性。
該代表圖無元件符號及其所代表之意義。

Claims (16)

  1. 一種基於植物之脂質組合物，其包含：
    (i)二十二碳六烯酸(22：6n-3)，其量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約86重量%；及
    (ii)第二多不飽和脂肪酸，其量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約3重量%，其中該第二多不飽和脂肪酸為該組合物中第二最豐富的多不飽和脂肪酸；
    其中該二十二碳六烯酸及該第二多不飽和脂肪酸各自獨立地以脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯或脂肪酸酯之鹽的形式提供。
  2. 如請求項1之脂質組合物，其中二十二碳六烯酸(22：6n-3)之存在量為該組合物之總脂肪酸含量的至少約87重量%(例如，至多約96重量%)。
  3. 如請求項1或請求項2之脂質組合物，其中該組合物中的二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸之重量比為至少50：1。
  4. 如前述請求項中任一項之脂質組合物，其中該第二多不飽和脂肪酸為含有至少4個不飽和度之C：20-24 ω-3多不飽和脂肪酸。
  5. 如前述請求項中任一項之脂質組合物，其中該第二多不飽和脂肪酸之存在量為該組合物之總脂肪酸含量的約3重量%至約12重量%。
  6. 如前述請求項中任一項之脂質組合物，其中該基於植物之脂質組合物進一步包含α-次亞麻油酸(18：3n-3)，其量為該組合物之總脂肪酸含量的約0.1重量%至約4重量%(諸如約0.5重量%至約2重量%)。
  7. 如前述請求項中任一項之脂質組合物，其中該二十二碳六烯酸、該第二多不飽和脂肪酸及該α-次亞麻油酸(若存在)各自獨立地以脂肪酸酯或脂肪酸酯之鹽的形式提供，諸如以脂肪酸乙酯之形式提供或提供 為三酸甘油酯之部分。
  8. 如前述請求項中任一項之脂質組合物，其中該組合物中棕櫚酸之量小於該組合物之總脂肪酸含量的約0.5重量%。
  9. 如前述請求項中任一項之脂質組合物，其中該脂質組合物係衍生自單一來源。
  10. 如前述請求項中任一項之脂質組合物，其中該脂質組合物係衍生自種植植物。
  11. 如請求項10之脂質組合物，其中該種植植物為油籽，特定言之為蕓薹屬物種(Brassica sp.)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、亞麻(Linum usitatissimum)、向日葵屬物種(Helianthus sp.)、紅花(Carthamus tinctorius)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、高粱(Sorghum bicolor)、蜀黍(Sorghum vulgare)、燕麥(Avena sativa)、車軸草屬物種(Trifolium sp.)、油棕(Elaesis guineenis)、本氏菸草(Nicotiana benthamiana)、大麥(Hordeum vulgare)、狹葉羽扇豆(Lupinus angustifolius)、水稻(Oryza sativa)、光稃稻(Oryza glaberrima)、亞麻薺(Camelina sativa)或深海兩節薺(Crambe abyssinica)。
  12. 如請求項10或請求項11之脂質組合物，其中該脂質組合物係自已脫膠、精煉、漂白及/或除臭之籽油獲得。
  13. 如前述請求項中任一項之脂質組合物，其中該組合物係以錠劑、膠囊、囊封凝膠、可攝入液體或粉末、乳液或局部軟膏或乳膏之形式提供。
  14. 如前述請求項中任一項之脂質組合物，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的額外組分：抗氧化劑、穩定劑及界面活性劑。
  15. 如前述請求項中任一項之脂質組合物，其用於治療或預防心血管疾病、防止心血管疾病患者死亡、降低總體血清膽固醇含量、降低高BP、增大HDL：LDL比率、減少三酸甘油酯，或降低脂蛋白元-B含量。
  16. 一種用於產生如請求項1至14中任一項之脂質組合物的方法，該方法包含提供脂肪酸乙酯之混合物，及對該混合物進行層析分離處理，視情況，其中該脂肪酸乙酯之混合物係藉由基於植物之脂質油的轉酯化及蒸餾而獲得。
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