BR112020026051A2 - composição de lipídio à base de vegetal, e, processo para a produção de uma composição de lipídio. - Google Patents

composição de lipídio à base de vegetal, e, processo para a produção de uma composição de lipídio. Download PDF

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Abstract

Trata-se de uma composição de lipídio à base de vegetal que compreende níveis muito elevados de DHA, juntamente com pelo menos um outro ácido graxo poli-insaturado de cadeia longa (tipicamente como ésteres de ácido graxo). Tipicamente, a composição contém baixos níveis de EPA e ácido palmítico. A composição pode ser obtida a partir de uma única fonte por métodos de processamento convencionais e tem propriedades de estabilidade aprimoradas.

Description

1 / 51 COMPOSIÇÃO DE LIPÍDIO À BASE DE VEGETAL, E, PROCESSO
PARA A PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE LIPÍDIO CAMPO DA INVENÇÃO
[001] As modalidades divulgadas neste documento se referem a novas composições de lipídio que são enriquecidas com ácido docosa- hexaenoico. As composições compreendem uma mistura de ácidos graxos poli-insaturados com vários benefícios para a saúde. As composições podem fornecer benefícios nutricionais e são, potencialmente, obtidas a partir de uma única fonte, que é tanto escalonável quanto sustentável. As mesmas também têm uma estabilidade aprimorada à oxidação.
ANTECEDENTES
[002] Os ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa ômega 3 (LC-PUFAs) são amplamente reconhecidos como compostos importantes para a saúde humana e animal. Esses ácidos graxos podem ser obtidos a partir de fontes dietéticas ou, em menor grau, pela conversão de ácidos graxos linoleico (LA, 18:2ω-6) ou α-linolênico (ALA, 18:3ω-3), todos considerados ácidos graxos essenciais na dieta humana.
[003] De um ponto de vista nutricional, os ácidos graxos ômega 3 mais importantes são, provavelmente, o ácido α-linolênico, ácido eicosapentaenoico ("EPA"; 20:5n-3) e ácido docosa-hexaenoico ("DHA"; 22:6n-3). O DHA é um LC-PUFA, o qual é importante para o desenvolvimento do cérebro e dos olhos. A ingestão de PUFAs ômega 3 também pode ajudar a prevenir doenças coronárias. Estudos médicos indicam claramente que esses ácidos graxos têm aspectos benéficos à saúde, como funções cardiovasculares e imunológicas aprimoradas e redução de câncer, diabetes e pressão alta. Os resultados clínicos demonstraram que uma ingestão dietética de 5,5 g de PUFAs ômega 3 por semana pode estar associada a uma redução de 50% no risco de parada cardíaca primária. Consequentemente, o óleo que contém PUFAs ômega 3 tem tido alta
2 / 51 demanda para fins farmacêuticos e dietéticos.
[004] Geralmente, a estabilidade oxidativa de um ácido graxo diminui notavelmente à medida que o número de ligações duplas de carbono- carbono ou o grau de insaturação aumenta. Infelizmente, ALA, EPA e DHA são gorduras poli-insaturadas que tendem a oxidar facilmente. O EPA (com 5 ligações duplas de carbono-carbono) está, significativamente, mais sujeito à oxidação do que o ALA; o DHA (com 6 ligações duplas de carbono-carbono) está ainda mais sujeito à oxidação do que o EPA. Como consequência, aumentar o teor de ômega 3 tende a reduzir a vida útil de muitos produtos. Esses problemas se tornam particularmente agudos com óleos, incluindo quantidades significativas de EPA ou DHA.
[005] O documento nº US 2015/223483 divulga mesclas à base de óleo de canola que têm estabilidade oxidativa aprimorada. A estabilidade é alcançada pela adição de um ou mais aditivos.
[006] O documento nº US 2011/0027443 divulga composições de gordura e óleo que contêm mesclas específicas de ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolênico e LC-PUFAs com um perfil de sabor aprimorado. O documento nº US 2004/209953 divulga produtos nutricionais que contêm, predominantemente, monoglicerídeos e diglicerídeos de LC- PUFAs. O documento nº US 5.130.061 descreve o uso de processos de transesterificação e de destilação para extrair DHA de óleos brutos. O documento nº US 9.040.730 descreve a purificação de misturas de lipídio que contêm PUFAs para reduzir a quantidade de esteróis indesejáveis na composição. Em cada um desses casos, peixes ou óleos microbianos são usados como a matéria-prima a partir da qual mesclas específicas são obtidas.
[007] O pedido de patente internacional no WO 2013/185184 divulga processos para a produção de ésteres etílicos de ácidos graxos poli- insaturados.
[008] O pedido de patente internacional no WO 2015/089587 e o
3 / 51 pedido de patente no US 2015/0166928 divulga composições de lipídio de plantas que compreendem uma mistura de ácido graxo ômega 3 e ômega 6. A canola geneticamente modificada é descrita no documento nº WO 2017/218969 e no documento nº WO 2017/219006.
[009] O pedido de patente internacional nº WO2011039776 descreve composições que contêm DHA altamente puro. O pedido de patente EUA nº US 2011/0033595 divulga produtos que contêm DHA e EPA em uma alta proporção combinada.
[0010] A listagem ou discussão de um documento aparentemente publicado anteriormente neste relatório descritivo não deve ser necessariamente interpretada como um reconhecimento de que o documento faz parte do estado da técnica ou que é de conhecimento geral comum.
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO
[0011] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecida uma composição de lipídio à base de vegetal que compreende: (i) ácido docosa-hexaenoico (22:6n-3) em uma quantidade de pelo menos cerca de 86% em peso do teor de ácido graxo total da composição; e (ii) um segundo ácido graxo poli-insaturado em uma quantidade de pelo menos cerca de 3% em peso do teor de ácido graxo total da composição, em que o segundo ácido graxo poli-insaturado é o segundo ácido graxo poli-insaturado mais abundante na composição; em que o ácido docosa-hexaenoico e o segundo ácido graxo poli-insaturado são, cada um, independentemente fornecidos sob a forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo.
[0012] As ditas composições de lipídio são referidas neste documento como as "composições da invenção".
4 / 51
[0013] A presente invenção se refere a composições de lipídio que contêm níveis elevados de ácido docosa-hexaenoico (DHA), seja sob a forma de um ácido graxo livre, um sal, um éster ou um sal de um éster. Constatou-se que essas composições podem ser obtidas a partir de fontes sustentáveis, como fontes de plantas. Também foi constatado que as mesmas têm um perfil de estabilidade de armazenamento aprimorado que é evidenciado por meio de uma redução na degradação por oxidação durante o armazenamento. O DHA, em particular, é reconhecido como um composto importante para a saúde humana e animal. Essas composições podem ser utilizadas em alimentos, produtos nutracêuticos, cosméticos e outras composições químicas, e podem ser úteis como intermediários e ingredientes farmacêuticos ativos.
[0014] Os níveis de ácido graxo nas composições da invenção podem ser determinados com o uso de métodos de rotina conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Tais métodos incluem cromatografia gasosa (GC) em conjunto com padrões de referência, por exemplo, de acordo com os métodos divulgados nos exemplos. Em um método particular, os ácidos graxos são convertidos em ésteres metílico ou etílico antes da análise por GC. Essas técnicas são descritas nos Exemplos. A posição de pico no cromatograma pode ser usada para identificar cada ácido graxo particular e a área sob cada pico integrada para determinar a quantidade. Tal como utilizado neste documento, a menos que indicado o contrário, a porcentagem de ácido graxo particular em uma amostra é determinada calculando-se a área sob a curva no cromatograma para esse ácido graxo como uma porcentagem da área total para ácidos graxos no cromatograma. Isso corresponde, essencialmente, a uma porcentagem em peso (p/p). A identidade dos ácidos graxos pode ser confirmada por GC-MS.
[0015] As referências ao ácido docosa-hexaenoico e "DHA", nesse contexto, são, salvo indicação ao contrário, referências a forma ω3 de ácido docosa-hexaenoico, que é o ácido docosa-hexaenoico com uma dessaturação
5 / 51 (ligação dupla de carbono-carbono) na terceira ligação de carbono-carbono da extremidade metila do ácido graxo. As formas abreviadas que podem ser usadas alternadamente incluem “22:6n-3” e “22:6ω-3”.
[0016] De forma mais geral, os termos "ácido graxo poli-insaturado" e "PUFA" se referem a um ácido graxo que compreende pelo menos duas ligações duplas de carbono-carbono. Os termos "ácido graxo poli-insaturado de cadeia longa" e "LC-PUFA" se referem a um ácido graxo que compreende pelo menos 20 átomos de carbono e pelo menos duas ligações duplas de carbono-carbono em sua cadeia de carbono e, portanto, incluem VLC-PUFAs. Tal como utilizado neste documento, os termos "ácido graxo poli-insaturado de cadeia muito longa" e "VLC-PUFA" se referem a um ácido graxo que compreende pelo menos 22 átomos de carbono e pelo menos três ligações duplas de carbono-carbono em sua cadeia de carbono. Normalmente, o número de átomos de carbono na cadeia de carbono do ácido graxo se refere a uma cadeia de carbono não ramificada. Se a cadeia de carbono for ramificada, o número de átomos de carbono exclui aqueles nos grupos laterais.
[0017] Os ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa podem ser ácidos graxos ω3 ("ômega 3"), ou seja, ácidos graxos com uma dessaturação (ligação dupla de carbono-carbono) na terceira ligação de carbono-carbono da extremidade metila do ácido graxo. Os mesmos podem, alternativamente, ser ácido graxo ω6 ("ômega 6"), ou seja, ácidos graxos com uma dessaturação (ligação dupla de carbono-carbono) na sexta ligação de carbono-carbono da extremidade metila do ácido graxo. Embora outros padrões de insaturação possam estar presentes, as formas ω6 e, particularmente, ω3 são, particularmente, relevantes no contexto da presente invenção.
[0018] As composições da invenção compreendem pelo menos dois ácidos graxos poli-insaturados diferentes, incluindo DHA e pelo menos um outro ácido graxo poli-insaturado. DHA é o ácido graxo mais abundante presente na composição (em peso em relação ao teor de ácido graxo total da
6 / 51 composição). O segundo ácido graxo mais abundante na composição (em peso em relação ao teor de ácido graxo total da composição) é referido neste documento como o "segundo ácido graxo poli-insaturado" ou "segundo PUFA".
[0019] O DHA e o segundo PUFA podem, cada um, estar presentes sob a forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo.
[0020] Conforme usado neste documento, o termo "ácido graxo" se refere a um ácido carboxílico (ou ácido orgânico), muitas vezes com uma longa cauda alifática, saturada ou insaturada. Normalmente, os ácidos graxos têm uma cadeia ligada de carbono-carbono de pelo menos 8 átomos de carbono de comprimento, mais particularmente pelo menos 12 carbonos de comprimento. A maioria dos ácidos graxos de ocorrência natural tem um número par de átomos de carbono porque sua biossíntese envolve acetato, que tem dois átomos de carbono. Os ácidos graxos podem estar em um estado livre (não esterificado), referido neste documento como um "ácido graxo livre", ou em uma forma esterificada, como um éster alquílico, parte de um triglicerídeo, parte de um diacilglicerídeo, parte de um monoacilglicerídeo, acil-CoA (tio-éster) ligado ou, de outra forma, ligado, ou uma mistura dos mesmos. O ácido graxo pode ser esterificado como um fosfolipídio, como as formas de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol ou difosfatidilglicerol, embora preferencialmente seja esterificado como um éster alquílico, especialmente como um éster etílico. Para evitar dúvidas, salvo indicação ao contrário, o termo "ácido graxo" abrange ácidos graxos livres, ésteres de ácido graxo e sais de qualquer um dos mesmos. Salvo indicação ao contrário, os valores quantitativos associados a ácidos graxos particulares se referem à quantidade (calculada com base no peso) desse ácido graxo que está presente, independentemente da forma (por exemplo, éster ou ácido livre) em que está
7 / 51 presente.
[0021] Cada ácido graxo na composição também pode ser fornecido independentemente sob a forma de um sal de um ácido graxo, por exemplo, um sal alcalino ou sal alcalino-terroso. Os sais particulares que podem ser mencionados incluem sais de lítio e sais de cálcio. Esses sais têm potenciais benefícios medicinais adicionais ou oferecem melhorias na capacidade de processamento. Da mesma forma, um éster de ácido graxo pode ser fornecido sob a forma de um sal de um éster de ácido graxo. Qualquer combinação de ácidos graxos sob a forma de ácidos graxos livres, sais, ésteres ou sais de ésteres pode estar presente nas composições da invenção. Com isso, é dito que, a título de exemplo, o DHA pode estar presente, predominantemente, como um éster etílico, o ALA (se presente) pode estar presente, predominantemente, como um sal de cálcio de um éster metílico e o segundo PUFA pode estar presente, predominantemente, como um ácido graxo livre.
[0022] Os "ácidos graxos saturados" não contêm quaisquer ligações duplas ou outros grupos funcionais ao longo da cadeia. O termo "saturado" se refere a hidrogênio, em que todos os carbonos (exceto o grupo ácido carboxílico [-COOH]) contêm tantos hidrogênios quanto possível. Em outras palavras, a extremidade ômega (ω) está conectada a três átomos de hidrogênio (CH3-) e cada carbono da cadeia está conectado a dois átomos de hidrogênio (-CH2-). O termo "ácido graxo total" inclui ácidos graxos em todas as formas, sejam eles saturados ou insaturados, ácidos livres, ésteres e/ou sais.
[0023] O termo "cerca de", como utilizado neste documento quando se refere a um valor mensurável, como uma quantidade de um composto, peso, tempo, temperatura e semelhantes, refere-se a variações de 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou mesmo de 0,1% da quantidade especificada.
[0024] As composições da invenção que podem ser mencionadas incluem aquelas que contêm uma alta concentração de ácidos graxos ômega 3, muitos dos quais são as denominadas “gorduras essenciais” que são
8 / 51 consideradas particularmente importantes para a saúde humana. Os ácidos graxos ômega 3 podem ter efeitos benéficos sobre os níveis de colesterol HDL, apoiar o desenvolvimento do cérebro em jovens e, comprovadamente, beneficiar a saúde mental. Esses ácidos graxos são, geralmente, considerados precursores de eicosanoides com propriedades anti-inflamatórias. Composições particulares da invenção que podem ser mencionadas incluem aquelas em que a quantidade total de ácidos graxos poli-insaturados ômega 3 na composição de lipídio é pelo menos de cerca de 90%, como pelo menos de cerca de 95%, em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0025] Os ácidos graxos ômega 6 também são considerados importantes para a saúde humana. Em particular, certos ácidos graxos ômega 6 são “gorduras essenciais” necessárias para uma boa saúde, mas o corpo é incapaz de sintetizá-los. No entanto, foi demonstrado que as gorduras ômega 6 são precursoras dos eicosanoides com mais propriedades pró-inflamatórias, e, portanto, quando muitos desses eicosanoides são produzidos, eles podem aumentar a inflamação e as doenças inflamatórias. Assim, pode ser desejável minimizar a quantidade de tais ácidos graxos nas composições de lipídio. É geralmente aceito que a razão entre ácidos graxos ômega 6 e ômega 3 na dieta deve ser de 4:1 ou menos. No entanto, a dieta ocidental normal geralmente contém uma proporção maior de ácidos graxos ômega 6. As composições de lipídio da presente invenção contêm, vantajosamente, quantidades relativamente baixas de ácidos graxos ômega 6, enquanto simultaneamente contêm quantidades relativamente elevadas dos ácidos graxos ômega 3 mais benéficos. Em uma modalidade, a quantidade total de ácidos graxos poli- insaturados ômega 6 na composição é, no máximo, de cerca de 5% em peso do teor de ácido graxo total da composição. Em outra modalidade, a razão entre o peso total de ácidos graxos poli-insaturados ômega 3 e o peso total de ácidos graxos poli-insaturados ômega 6 na composição é pelo menos de cerca de 10:1. Em uma outra modalidade, a razão entre o peso total de ácidos
9 / 51 graxos poli-insaturados ômega 3 e o peso total de ácidos graxos poli- insaturados ômega 6 na composição é pelo menos de cerca de 20:1.
[0026] As composições de lipídio que contêm ácidos graxos poli- insaturados de cadeia longa são normalmente obtidas a partir de fontes marinhas (por exemplo, peixes, crustáceos), fontes de algas ou plantas (por exemplo, linho ou echium). A matéria de partida orgânica é, primeiro, processada para extrair o óleo (geralmente referido como o óleo “bruto”) contido na mesma. No caso de sementes de plantas, por exemplo, as sementes são trituradas para liberar o óleo que é, então, separado da matéria sólida por filtração e/ou decantação. Os óleos brutos, geralmente, contêm níveis de ácidos graxos poli-insaturados que são muito baixos para serem úteis (por exemplo, como produtos nutricionais), portanto, o enriquecimento é necessário. Quando falta o óleo bruto em um ou mais componentes essenciais, é frequentemente comum mesclar óleos brutos ou enriquecidos de fontes múltiplas (por exemplo, de peixes e algas) para obter a composição desejada. Alternativamente, o enriquecimento pode ser alcançado pelo processamento do óleo bruto para remover componentes indesejados (por exemplo, componentes que afetam deleteriamente a cor, o odor ou a estabilidade do produto, ou ácidos graxos indesejados), enquanto maximiza os níveis dos componentes de ácidos graxos desejados.
[0027] As composições da presente invenção são, vantajosamente, obtidas a partir de uma única fonte. O uso de uma única fonte facilita o processamento eficiente e econômico do óleo bruto e a fabricação das composições de lipídio da invenção. Pela frase "obtido a partir de uma única fonte" (ou "obtido a partir de uma única fonte"), quer se dizer que a composição de lipídio pode ser obtida a partir de um ou mais organismos de uma única classe taxonômica. Em uma modalidade particular, a composição de lipídio não é derivada de múltiplos organismos em diferentes classes taxonômicas. Por exemplo, as composições de lipídio podem não ser mesclas
10 / 51 de óleos obtidos a partir de uma combinação de peixes e algas, ou uma combinação de peixes e plantas. Em vez disso, as composições de lipídio da invenção (ou os óleos "brutos" a partir dos quais as composições podem ser obtidas por técnicas de enriquecimento, como transesterificação, destilação e cromatografia) são obtidas a partir de uma única população de organismos, por exemplo, uma única fonte de matéria vegetal ou vegetação. Para evitar dúvidas, a frase "obtido a partir de uma única fonte" não exclui o uso de vários organismos da mesma espécie como uma fonte da composição de lipídio ou óleo "bruto", isto é, o uso de vários peixes, estoques de algas, plantas ou sementes de plantas que são da mesma espécie. Os ditos organismos múltiplos são, de preferência, todos da mesma espécie, ou da mesma linha de reprodução, ou da mesma variedade de planta, ou do mesmo estoque ou lote de produção.
[0028] Em composições de lipídio particulares da invenção, o DHA está presente em uma quantidade de pelo menos cerca de 87% (como de pelo menos cerca de 88%) em peso do teor de ácido graxo total da composição. Outras composições particulares que podem ser mencionadas incluem aquelas que contêm DHA em uma quantidade de pelo menos cerca de 90% em peso do teor de ácido graxo total da composição. Em composições de lipídio particulares da invenção, o DHA está presente em uma quantidade de até cerca de 96% (como de até cerca de 95%) em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0029] Constatou-se, vantajosamente, que as composições de lipídio da invenção contêm um alto nível de DHA em relação à quantidade de EPA presente. Portanto, em uma modalidade, a razão em peso entre ácido docosa- hexaenoico e ácido eicosapentaenoico nas composições de lipídio é pelo menos de cerca de 50:1. Em outras modalidades, a razão em peso entre ácido docosa-hexaenoico e ácido eicosapentaenoico nas composições de lipídio pode ser superior a cerca de 100:1, como superior a cerca de 30:1 e, mais
11 / 51 particularmente, superior a cerca de 500:1.
[0030] Favoravelmente, a quantidade de EPA nas composições pode ser relativamente baixa. Em modalidades particulares, as composições de lipídio contêm até cerca de 1% de, mais particularmente até cerca de 0,5%, EPA em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0031] As composições da invenção contêm um segundo ácido graxo poli-insaturado em uma quantidade de pelo menos cerca de 3% em peso do teor de ácido graxo total da composição. O dito segundo ácido graxo poli- insaturado é identificável como sendo o segundo ácido graxo poli-insaturado mais abundante na composição. O segundo PUFA pode ser qualquer PUFA (ou sal, éster ou sal de um éster do mesmo), como um PUFA ômega 3 (por exemplo, ETA, EPA, SDA ou DPA). Em modalidades particulares, o dito segundo PUFA é um ácido graxo poli-insaturado ômega 3 C:20-24 que contém pelo menos 4 insaturações. É particularmente preferencial que o segundo PUFA seja ácido eicosatetraenoico (ETA; 20:4n-3) (ou um sal, éster ou sal de um éster do mesmo).
[0032] Em composições de lipídio particulares da invenção, o segundo PUFA (por exemplo, ETA) está presente em uma quantidade de cerca de 3% a cerca de 12% em peso do teor de ácido graxo total da composição. Outras composições particulares que podem ser mencionadas incluem aquelas que contêm o segundo PUFA (por exemplo, ETA) em uma quantidade de cerca de 4% a cerca de 10% (de cerca de 5% a cerca de 8%) em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0033] Em uma modalidade, a composição da invenção contém, ainda, ácido α-linolênico (ALA) em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 4% em peso do teor de ácido graxo total da composição. O ALA é uma gordura essencial importante para a saúde humana ou animal adequada. Em tais modalidades adicionais, a composição contém ALA em uma quantidade de cerca de 0,3% a cerca de 4%, mais particularmente de cerca de 0,5% a
12 / 51 cerca de 2%, em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0034] Portanto, uma composição de lipídio à base de vegetal particular da invenção que pode ser mencionada é aquela que compreende: (i) ácido docosa-hexaenoico (22:6n-3) em uma quantidade de cerca de 86% em peso do teor de ácido graxo total da composição; (ii) um segundo ácido graxo poli-insaturado em uma quantidade de pelo menos cerca de 3% em peso do teor de ácido graxo total da composição, em que o segundo ácido graxo poli-insaturado é o segundo ácido graxo poli-insaturado mais abundante na composição; e (iii) ácido α-linolênico (18:3n-3) em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 4% em peso do teor de ácido graxo total da composição; em que o ácido docosa-hexaenoico, o segundo ácido graxo poli-insaturado e o ácido α-linolênico são, cada um, independentemente fornecidos sob a forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo.
[0035] As composições da invenção contêm até cerca de 0,5% de ácido palmítico (16:0) em peso do teor de ácido graxo total da composição. Em modalidades particulares, as composições contêm até cerca de 0,1% de, mais particularmente até cerca de 0,05%, ácido palmítico em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0036] As composições da invenção também podem conter outros ácidos graxos ômega 3 (além de DHA e do segundo PUFA), como ácido docosapentaenoico (DPA; 22:5n-3) e/ou ácido estearadônico (SDA; 18:4n-3). Em uma modalidade particular, a composição contém DPA em uma quantidade de pelo menos cerca de 0,1%, particularmente de pelo menos cerca de 0,2%, em peso do teor de ácido graxo total da composição. Em tais modalidades, o DPA pode estar presente em uma quantidade de até cerca de
13 / 51 1%, mais particularmente de até cerca de 0,5%, em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0037] Preferências e opções para um determinado aspecto, recurso ou modalidade da invenção devem, a menos que o contexto indique de outra forma, ser consideradas como divulgados em combinação com quaisquer e todas as preferências e opções para todos os outros aspectos, recursos e parâmetros da invenção. Por exemplo, as quantidades particulares de DHA, o segundo PUFA e o ALA (se presente) indicados nas passagens anteriores são divulgadas em todas as combinações.
[0038] Uma composição de lipídio particular que pode, portanto, ser mencionada é aquela que compreende: (i) ácido docosa-hexaenoico (22:6n-3) em uma quantidade de cerca de 86% em peso do teor de ácido graxo total da composição; (ii) ácido eicosatetraenoico (20:4n-3) em uma quantidade de pelo menos cerca de 3% em peso do teor de ácido graxo total da composição, em que o dito ácido eicosatetraenoico é o segundo ácido graxo poli-insaturado mais abundante na composição; e (iii) ácido α-linolênico (18:3n-3) em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 4% em peso do teor de ácido graxo total da composição; em que o ácido docosa-hexaenoico, o segundo ácido eicosatetraenoico e o ácido α-linolênico são, cada um, independentemente fornecidos sob a forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo.
[0039] Nas composições da invenção, o DHA, o ALA (se presente) e o segundo PUFA podem estar, independentemente, presentes sob a forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo. Em uma modalidade particular, esses componentes assumem, cada um, a mesma forma, por exemplo, eles podem estar todos sob
14 / 51 a forma de um ácido graxo, todos sob a forma de um sal de ácido graxo, todos sob a forma de um éster de ácido graxo ou todos sob a forma de um sal de um éster de ácido graxo. Quando os componentes estão sob a forma de um sal de ácido graxo, éster ou sal de um éster, então os componentes podem estar sob a forma do mesmo sal, éster ou sal do éster. Por exemplo, o DHA, o ALA (se presente) e o segundo PUFA podem ser fornecidos sob a forma de um éster etílico do ácido graxo.
[0040] Em uma modalidade particular, o DHA, o ALA (se presente) e o segundo PUFA são fornecidos independentemente sob a forma de um sal de um éster de ácido graxo ou, mais particularmente, sob a forma de um éster de ácido graxo. As formas de ésteres de ácido graxo adequadas são conhecidas pelas pessoas versadas na técnica. Por exemplo, as formas de éster de ácido graxo que são nutricionalmente aceitáveis e/ou farmaceuticamente aceitáveis incluem ésteres etílicos, ésteres metílicos, fosfolipídios, monoglicerídeos, diglicerídeos e triglicerídeos de ácidos graxos. Podem ser necessárias diferentes formas de éster, dependendo do uso pretendido da composição de lipídio. Por exemplo, os triglicerídeos são particularmente adequados para uso em alimentos destinados ao consumo humano, especialmente consumo infantil, devido, em parte, ao sabor e à estabilidade dessas formas de éster ao tratamento térmico (que pode ser necessário para tais produtos alimentícios). Os ésteres etílicos são particularmente adequados para uso em suplementos dietéticos, uma vez que essas formas de éster podem ser fabricadas com eficiência e facilidade, e a conversão para uma forma de triglicerídeo não é necessária. Assim, em uma outra modalidade, o DHA, o ALA (se presente e o segundo PUFA são, cada um, independentemente fornecidos sob a forma de um éster etílico de ácido graxo ou como parte de um triglicerídeo.
[0041] Os triglicerídeos são ésteres derivados do glicerol e de três ácidos graxos. Como a presente invenção diz respeito a mesclas de ácidos graxos, os componentes de ácido graxo em tais triglicerídeos podem ser
15 / 51 misturados nas razões correspondentes. Isto é, embora uma mistura de diferentes moléculas de triglicerídeos possa estar presente em uma composição, o perfil geral de ácido graxo na composição é conforme definido nas reivindicações.
[0042] Os componentes de ácido graxo podem, alternativamente, estar presentes sob a forma de ácido graxo "livres", isto é, a forma -COOH do ácido graxo. No entanto, em composições particulares da invenção, as composições contêm níveis relativamente baixos de ácidos graxos nesta forma porque estão associados a um sabor desagradável (muitas vezes "ensaboado") e são menos estáveis do que os ácidos graxos que estão em uma forma esterificada. Os ácidos graxos livres são tipicamente removidos de óleos e composições de lipídio por meio de refinação alcalina ou física, por exemplo, de acordo com os processos discutidos em outro lugar neste documento. Assim, em uma modalidade, o teor de ácido graxo livre total nas composições de lipídio é inferior a 5% (como menos do que 3%, particularmente menos do que 2%) em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0043] Os ácidos graxos nas composições de lipídio da invenção são ácidos graxos de cadeia tipicamente linear (isto é, não ramificada). As composições da invenção que podem ser mencionadas incluem aquelas que contêm níveis muito baixos de ácidos graxos de cadeia ramificada e seus ésteres de modo que a composição seja essencialmente livre de ácidos graxos de cadeia ramificada e ésteres de ácido graxo de cadeia ramificada. Entende- se, através dos termos "níveis baixos", que a composição contém ácidos graxos de cadeia ramificada e ésteres de ácido graxo em uma quantidade de, no máximo, cerca de 0,1% em peso do total de ácidos graxos da composição.
[0044] As composições de lipídio da invenção também podem conter outros componentes (por exemplo, diferentes de ácidos graxos) que se originam do material de origem e que não são totalmente removidos durante o
16 / 51 processo de extração e enriquecimento. As identidades precisas desses outros componentes irão variar muito, dependendo do material de origem. Exemplos desses tais outros componentes incluem fitoesteróis (isto é, esteróis vegetais e estanóis vegetais) presentes como um esterol livre ou como um éster de esterol (como β-sitosterol, β-sitostanol, Δ5-avenasterol, campesterol, Δ5- estigmasterol, Δ7-estigmasterol e Δ7-avenasterol, colesterol, brassicasterol, chalinasterol, campesterol, campestanol e eburicol). Outros exemplos incluem antioxidantes, como tocoferóis e tocotrienóis. Assim, as composições de lipídio particulares da invenção que podem ser mencionadas incluem aquelas que contêm quantidades detectáveis de um ou mais fitoesteróis (como β- sitosterol). Esses esteróis podem estar presentes em pelo menos cerca de 0,01%, mas normalmente não mais do que cerca de 1%, em peso da composição de lipídio.
[0045] As composições da presente invenção são vantajosamente obtidas a partir de fontes de plantas (fontes "vegetais"). Pelo termo “à base de vegetais”, entende-se que pelo menos 70% em peso dos lipídios que estão presentes nas composições da invenção são obtidos a partir de fontes vegetais. As fontes vegetais incluem fontes de plantas, particularmente colheitas como cereais. Em pelo menos uma modalidade, os lipídios são obtidos a partir de uma colheita de óleo de semente, como Brassica, por exemplo, Brassica napus ou Brassica juncea. Para evitar dúvidas, no entanto, não é essencial que as composições sejam obtidas exclusivamente a partir de tais fontes, ou seja, uma proporção (por exemplo, de no máximo 30% em peso) dos lipídios nas composições da invenção pode ser obtida a partir de outras fontes, incluindo óleos marinhos (por exemplo, peixes ou crustáceos), óleos de algas e combinações dos mesmos. Em um exemplo, pelo menos 80%, como pelo menos 90%, em peso dos lipídios que estão presentes são obtidos a partir de fontes vegetais. Em composições particulares da invenção, essencialmente todos (isto é, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou cerca de 100%) dos
17 / 51 lipídios são obtidos a partir de fontes vegetais.
[0046] Em uma modalidade, as composições da invenção (e as composições farmacêuticas e alimentícias definidas a seguir) não são de origem animal (por exemplo, animal marinho). Ou seja, em tais modalidades, as composições de lipídio não contêm quaisquer componentes provenientes de animais, como peixes e crustáceos. As composições de lipídio nas quais nenhum componente é obtido a partir de um animal são consideradas vantajosas em termos de teor de lipídio e um perfil de estabilidade que pode ser alcançado seguindo procedimentos de refinamento e/ou enriquecimento padrão.
[0047] O uso de plantas como fonte de lipídios ou de ácido graxo oferece uma série de vantagens. Por exemplo, as fontes marinhas de óleos são conhecidas por conter níveis relativamente altos de contaminantes (como mercúrio, PCBs e alérgenos de peixes (por exemplo, parvalbuminas)) que não são encontrados em materiais vegetais. A sobrepesca histórica também esgotou os estoques de peixes e crustáceos (por exemplo, krill) de tal forma que os mesmos não são mais sustentáveis. A presente invenção, portanto, oferece uma composição de óleo de ácido graxo poli-insaturado de origem sustentável que contém níveis relativamente baixos de contaminantes indesejados.
[0048] Em uma modalidade particular, a composição da invenção é derivada de uma planta. As plantas das quais os óleos são obtidos são tipicamente culturas oleaginosas, como copra, semente de algodão, linho, palmiste, amendoim, colza, semente de soja e de girassol. As composições obtidas exclusivamente de plantas, portanto, podem ser referidas como óleos "vegetais" ou "composições de lipídio vegetais". As plantas adequadas a partir das quais as composições de lipídio da invenção podem ser obtidas são conhecidas pela pessoa versada na técnica e incluem Brassica sp., Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, Helianthus sp., Carthamus tinctorius, Glycine
18 / 51 max, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, Trifolium sp., Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Camelina sativa ou Crambe abyssinica. Uma fonte de planta particular que pode ser mencionada a este respeito é a Brassica sp.
[0049] Fontes adequadas (incluindo fontes marinhas, de algas e de plantas) podem ocorrer naturalmente ou podem ser geneticamente modificadas para aumentar sua capacidade de produzir ácidos graxos poli- insaturados de cadeia longa. Exemplos de fontes de planta que foram geneticamente modificadas para este propósito, isto é, que se originam de células de plantas recombinantes, são conhecidos pela pessoa versada na técnica e são divulgados nos pedidos de patente internacional nos PCT/AU2013/000639 (publicado como WO 2013/185184), PCT/AU2014/050433 (publicado como WO 2015/089587) e PCT/AU2015/050340 (publicado como WO 2015/196250). A canola geneticamente modificada é descrita no documento nº WO 2017/218969 e no documento nº WO 2017/219006. As divulgações em todas as publicações mencionadas neste documento são incorporadas a título de referência em sua totalidade.
[0050] As composições de lipídio da invenção podem ser obtidas diretamente a partir de uma fonte de ocorrência natural (por exemplo, um animal, algas e/ou uma planta). No entanto, normalmente é necessário processar os óleos obtidos de fontes naturais para enriquecê-los. Os processos de enriquecimento adequados são exemplificados nos Exemplos.
[0051] Fontes adequadas de composições de lipídio da invenção, ou óleos "brutos" que podem ser mesclados ou enriquecidos para produzir essas composições, incluem espécies marinhas, algas e plantas. Os processos para a obtenção de óleos de fontes marinhas são bem conhecidos na técnica.
[0052] Fontes de plantas (como fontes de oleaginosas) são
19 / 51 particularmente adequadas devido aos baixos níveis de certos contaminantes e à sustentabilidade superior, como discutido acima. Plantas como a Brassica sp. (por exemplo, canola) produzem sementes que podem ser processadas para obter óleo. EXTRAÇÃO DE ÓLEOS/LIPÍDIOS
[0053] Os métodos que são praticados rotineiramente na técnica podem ser usados para extrair, processar e analisar óleos produzidos por plantas e sementes. Normalmente, as sementes das plantas são cozidas, prensadas e o óleo é extraído para produzir óleo bruto. Esse óleo pode, por sua vez, ser degomado, refinado, branqueado e/ou desodorizado. Constatou-se que uma combinação de degomagem, refinação, branqueamento e desodorização é particularmente eficaz para a preparação de misturas de lipídio enriquecidas com DHA. Assim, em uma modalidade, a composição de lipídio é obtida a partir de um óleo de semente que foi degomado, refinado, branqueado e/ou desodorizado. No entanto, não é necessário que os óleos sejam processados dessa forma, a purificação e o enriquecimento adequados podem ser obtidos sem esses métodos.
[0054] Geralmente, as técnicas para esmagar sementes são conhecidas na técnica. Por exemplo, as oleaginosas podem ser temperadas borrifando-as com água para aumentar o teor de umidade para, por exemplo, 8,5%, e escamadas com o uso de um rolo liso com um ajuste de vão de 0,23 mm a 0,27 mm. Dependendo do tipo de semente, a água não pode ser adicionada antes do esmagamento. A extração também pode ser alcançada usando-se um processo de extrusão. O processo de extrusão pode ou não ser usado no lugar da escamação e, às vezes, é usado como um processo complementar antes ou depois da prensagem por parafuso.
[0055] Em uma modalidade, a maior parte do óleo de semente é liberada por esmagamento usando-se uma prensa de parafuso. O material sólido expelido da prensa de parafuso é, então, extraído com um solvente, por
20 / 51 exemplo, hexano, usando-se uma coluna rastreada por calor, após o que o solvente é removido do óleo extraído. Alternativamente, o óleo bruto produzido pela operação de prensagem pode ser passado por um tanque de decantação com um topo de drenagem de arame ranhurado para remover os sólidos que são expressos com o óleo durante a operação de prensagem. O óleo clarificado pode ser passado por um filtro de placa e estrutura para remover quaisquer partículas sólidas finas restantes. Se desejado, o óleo recuperado do processo de extração pode ser combinado com o óleo clarificado para produzir um óleo bruto mesclado. Uma vez que o solvente é removido do óleo bruto, as porções prensadas e extraídas são combinadas e submetidas aos procedimentos normais de processamento de óleo.
REFINAMENTO E PURIFICAÇÃO
[0056] Conforme usado neste documento, o termo "purificado", quando usado em conexão com lipídio ou óleo da invenção, normalmente significa que o lipídio ou óleo extraído foi submetido a uma ou mais etapas de processamento para aumentar a pureza do componente de lipídio/óleo. Por exemplo, as etapas de purificação podem compreender um ou mais dentre: degomagem, desodorização, descoloração ou secagem do óleo extraído. No entanto, como utilizado neste documento, o termo "purificado" não inclui um processo de transesterificação ou outro processo que altera a composição de ácido graxo do lipídio ou óleo da invenção de modo a aumentar o teor de DHA como uma porcentagem do teor de ácido graxo total. Expresso em outras palavras, a composição de ácido graxo do lipídio ou óleo purificado é essencialmente a mesma do lipídio ou óleo não purificado.
[0057] Os óleos vegetais podem ser refinados (purificados) uma vez extraídos da fonte de planta, com o uso de um ou mais dentre os seguintes processos e, particularmente, com o uso de uma combinação de degomagem, refinação alcalina, branqueamento e desodorização. Os métodos adequados são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica (por exemplo, aqueles
21 / 51 divulgados no documento nº WO 2013/185184).
[0058] A degomagem é uma etapa inicial no refinamento de óleos e seu objetivo principal é a remoção da maioria dos fosfolipídios do óleo. Adição de cerca de 2% de água, tipicamente que contém ácido fosfórico, de 70 a 80 ºC para o óleo bruto resulta na separação da maioria dos fosfolipídios acompanhados por vestígios de metais e pigmentos. O material insolúvel removido é principalmente uma mistura de fosfolipídios e triacilgliceróis. A degomagem pode ser realizada pela adição de ácido fosfórico concentrado ao óleo de semente bruto para converter fosfatídeos não hidratáveis em uma forma hidratável e para quelar metais menores que estão presentes. A goma é separada do óleo de semente por meio de centrifugação.
[0059] O refinamento alcalino é um dos processos de refinamento para o tratamento do óleo bruto, às vezes também conhecido como neutralização. Geralmente ocorre após a degomagem e antes do branqueamento. Após a degomagem, o óleo de semente pode ser tratado pela adição de uma quantidade suficiente de uma solução alcalina para titular todos os ácidos graxos livres e ácido fosfórico, e remover os sabões então formados. Os materiais alcalinos adequados incluem hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de lítio, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio e hidróxido de amônio. O refinamento de alcalino é normalmente realizado à temperatura ambiente e remove a fração de ácido graxo livre. O sabão é removido por meio da centrifugação ou por meio da extração em um solvente para o sabão, e o óleo neutralizado é lavado com água. Se necessário, qualquer excesso de alcalino no óleo pode ser neutralizado com um ácido adequado, como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico.
[0060] O branqueamento é um processo de refinamento no qual os óleos são aquecidos de 90 a 120 ºC por 10 a 30 minutos na presença de uma terra branqueadora (0,2 a 2,0%) e na ausência de oxigênio, operando-se com
22 / 51 nitrogênio ou vapor ou em vácuo. O branqueamento é projetado para remover pigmentos indesejados (carotenoides, clorofila, etc.), e o processo também remove produtos de oxidação, metais vestigiais, compostos de enxofre e vestígios de sabão.
[0061] A desodorização é um tratamento de óleos e gorduras a uma alta temperatura (por exemplo, cerca de 180 ºC) e a baixa pressão (0,1 a 1 mmHg). Isto é tipicamente alcançado pela introdução de vapor no óleo de semente a uma taxa de cerca de 0,1 ml/minuto/100 ml de óleo de semente. Após cerca de 30 minutos de aspersão, deixa-se que o óleo de semente esfrie sob vácuo. Este tratamento aprimora a cor do óleo de semente e remove a maioria das substâncias voláteis ou compostos odoríferos, incluindo quaisquer ácidos graxos livres remanescentes, monoacilgliceróis e produtos de oxidação.
[0062] A adaptação a baixas temperaturas é um processo, às vezes, usado na produção comercial de óleos para a separação de óleos e gorduras em frações sólidas (estearina) e líquidas (oleína) por cristalização em temperaturas subambientes. Foi aplicado originalmente ao óleo de semente de algodão para produzir um produto sem sólidos. É normalmente usado para diminuir o teor de ácidos graxos saturados dos óleos.
TRANSESTERIFICAÇÃO
[0063] Os óleos brutos, geralmente, contêm os ácidos graxos desejados sob a forma de triacilgliceróis (TAGs). A transesterificação é um processo que pode ser usado para trocar os ácidos graxos dentro e entre os TAGs ou para transferir os ácidos graxos para outro álcool para formar um éster (como um éster etílico ou um éster metílico). Em modalidades da invenção, a transesterificação é alcançada com o uso de meios químicos, tipicamente envolvendo um ácido ou base forte como um catalisador. O etóxido de sódio (em etanol) é um exemplo de uma base forte usada para formar ésteres etílicos de ácido graxo por meio da transesterificação. O
23 / 51 processo pode ser realizado à temperatura ambiente ou à temperatura elevada (por exemplo, até cerca de 80 ºC).
[0064] Em outras modalidades da invenção, a transesterificação é alcançada com o uso de uma ou mais enzimas, particularmente lipases que são conhecidas por serem úteis para hidrolisar ligações de éster, por exemplo, em glicerídeos. A enzima pode ser uma lipase que é específica da posição (sn- 1/3 ou sn-2 específica) para o ácido graxo no triacilglicerídeo, ou que tem uma preferência por alguns ácidos graxos em relação a outros. Enzimas particulares que podem ser mencionadas incluem Lipozyme 435 (disponível junto à Novozymes A/S). O processo é, normalmente, realizado à temperatura ambiente. O processo é, tipicamente, realizado na presença de uma quantidade em excesso do álcool correspondente à forma de éster desejada (por exemplo, usando-se etanol para formar ésteres etílicos dos ácidos graxos).
DESTILAÇÃO
[0065] A destilação molecular é um método eficaz para remover quantidades significativas dos componentes mais voláteis, como os ácidos graxos saturados, dos óleos brutos. A destilação é, tipicamente, realizada sob pressão reduzida, por exemplo, abaixo de cerca de 1 mbar. A temperatura e o tempo podem, então, ser escolhidos para alcançar uma divisão de aproximadamente 50:50 entre o destilado e o resíduo após um tempo de destilação de algumas (por exemplo, 1 a 10) horas. As temperaturas de destilação típicas usadas na produção das composições de lipídio da presente invenção estão na região de 120 ºC a 180 ºC, particularmente entre 145 ºC e 160 ºC.
[0066] Múltiplas destilações podem ser realizadas, com cada destilação sendo considerada completa quando uma divisão de aproximadamente 50:50 entre o destilado e o resíduo for alcançada. O uso de destilações sucessivas reduz o rendimento geral, no entanto, duas destilações
24 / 51 podem produzir resultados ideais.
CROMATOGRAFIA
[0067] A cromatografia é um método eficaz para separar os vários componentes das misturas de LC-PUFA. Pode ser usada para aumentar a concentração de um ou mais LC-PUFAs preferenciais dentro de uma mistura. A separação cromatográfica pode ser alcançada sob uma variedade de condições, mas, normalmente, envolve o uso de um sistema cromatográfico de leito estacionário ou um sistema de leito móvel simulado.
[0068] Um sistema cromatográfico de leito estacionário é baseado no seguinte conceito: uma mistura cujos componentes devem ser separados é (normalmente junto com um eluente) induzida a percolar através de uma coluna que contém um empacotamento de um material poroso (a fase estacionária) exibindo uma alta permeabilidade para fluidos. A velocidade de percolação de cada componente da mistura depende das propriedades físicas daquele componente para que os componentes saiam da coluna sucessiva e seletivamente. Assim, alguns dos componentes tendem a se fixar fortemente à fase estacionária e, portanto, serão mais atrasados, enquanto outros tendem a se fixar fracamente e sair da coluna após um curto período.
[0069] Um sistema de leito móvel simulado consiste em uma série de colunas individuais que contêm adsorvente que são conectadas em série e que são operadas deslocando-se periodicamente a mistura e os pontos de injeção de eluente e, também, os pontos de coleta de componentes separados no sistema em que o efeito geral é simular a operação de uma única coluna que contém um leito móvel do adsorvente sólido. Assim, um sistema de leito móvel simulado consiste em colunas que, como em um sistema de leito estacionário convencional, contêm leitos estacionários de adsorvente sólido através do qual o eluente é passado, mas, em um sistema de leito móvel simulado, a operação é tal que simula um leito móvel de contracorrente contínua.
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[0070] As colunas usadas nesses processos, normalmente, contêm sílica (ou uma sílica modificada) como base para a fase estacionária. A fase móvel (eluente) é, tipicamente, uma mistura de solvente altamente polar, muitas vezes que contém um ou mais solventes próticos, como água, metanol, etanol e semelhantes, bem como misturas dos mesmos. A taxa de fluxo do eluente pode ser ajustada pela pessoa versada na técnica para otimizar a eficiência do processo de separação com taxas de fluxo mais lentas geralmente aumentando-se a separação dos componentes e facilitando-se a obtenção de composições que contêm níveis muito elevados de um único ácido graxo. A separação cromatográfica pode ser repetida para atingir um aumento de pureza semelhante. Os métodos de detecção para LC-PUFAs são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e incluem métodos de absorção de UV-vis, bem como métodos de detecção de índice de refrativo.
[0071] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é, portanto, fornecido um processo para a produção de uma composição de lipídio da invenção, cujo processo compreende fornecer uma mistura de ésteres etílicos de ácido graxo; submeter a dita mistura a um processo de separação cromatográfica. A presente invenção também se refere a composições de lipídio que podem ser obtidas por tais processos. As condições de separação cromatográficas adequadas incluem aquelas descritas neste documento.
[0072] Por exemplo, uma fase móvel particular que pode ser usada na separação cromatográfica é uma mistura de metanol e água (por exemplo, metanol/água em 88%), embora isso possa ser alterado (por exemplo, para aumentar o teor de metanol) durante o processo de separação para melhorar a eficiência. Uma fase estacionária particular que pode ser usada é uma fase estacionária à base de sílica, como uma coluna Deltaprep C18. HPLC analítico, ou qualquer outra técnica adequada conhecida pela pessoa versada na técnica, pode ser realizada nas frações obtidas para identificar aquelas que contêm altas concentrações de DHA e, portanto, contêm as composições de
26 / 51 lipídio da invenção.
[0073] Em uma modalidade do segundo aspecto da invenção, a mistura de ésteres etílicos de ácido graxo é obtida por transesterificação e destilação de um óleo de lipídio à base de vegetal, por exemplo, de acordo com qualquer um dos processos descritos anteriormente. O óleo de lipídio à base de vegetal pode ser obtido a partir de qualquer uma das plantas, particularmente as sementes oleaginosas, divulgadas neste documento ou de outra forma conhecidas na técnica. Antes da transesterificação e da destilação, o refinamento do óleo de lipídio à base de vegetal com o uso de degomagem, refinamento alcalino, branqueamento e/ou desodorização pode ser opcionalmente realizado.
OUTROS MÉTODOS DE ENRIQUECIMENTO
[0074] As composições de lipídio da presente invenção são úteis como ingredientes farmacêuticos ativos (APIs) ou como precursores (ou "intermediários") para APIs que podem ser obtidos a partir dos mesmos por meio de enriquecimento adicional. Essas composições seriam, ainda, enriquecidas nos níveis de PUFAs benéficos, como DHA e/ou ALA.
[0075] A concentração de ácidos graxos poli-insaturados em um óleo pode ser aumentada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, cristalização por resfriamento, formação de complexos com o uso de ureia, extração de fluido supercrítico e complexação de íons de prata. A formação de complexos com ureia é um método simples e eficiente para reduzir o nível de ácidos graxos saturados e monoinsaturados no óleo. Inicialmente, os TAGs do óleo são divididos em seus ácidos graxos constituintes, geralmente sob a forma de ésteres de ácido graxo. Esses ácidos graxos livres ou ésteres de ácido graxo, que geralmente não são alterados na composição de ácido graxo pelo tratamento, podem, então, ser misturados com uma solução etanólica de ureia para a formação do complexo. Os ácidos graxos saturados e monoinsaturados, facilmente, complexam com a ureia e
27 / 51 cristalizam no resfriamento e podem ser, subsequentemente, removidos por filtração. A fração não complexada com ureia é, portanto, enriquecida com ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa.
PRODUTOS
[0076] As composições de lipídio da presente invenção são óleos a granel. Ou seja, a composição de lipídio foi separada da matéria-prima (por exemplo, sementes de plantas) da qual parte ou todo o lipídio foi obtido).
[0077] As composições de lipídio da presente invenção podem ser utilizadas como alimentos. Ou seja, as composições da invenção podem ser fornecidas sob uma forma disponível oralmente. Para os fins da presente invenção, "alimentos" incluem qualquer alimento ou preparação para consumo humano que, quando ingerido pelo corpo, serve para nutrir ou acumular tecidos ou fornecer energia; e/ou mantém, restaura ou apoia o estado nutricional adequado ou a função metabólica. Os alimentos incluem composições nutricionais para bebês e/ou crianças pequenas, como, por exemplo, fórmulas infantis. No caso de alimentos, os ácidos graxos podem ser fornecidos sob a forma de triglicerídeos a fim de minimizar, ainda mais, quaisquer sabores desagradáveis e maximizar a estabilidade.
[0078] Os alimentos compreendem uma composição de lipídio da invenção opcionalmente em conjunto com um carreador adequado. O termo "carreador" é usado em seu sentido mais amplo para abranger qualquer componente que pode ou não ter valor nutricional. Como a pessoa versada na técnica observará, o carreador deve ser adequado para uso (ou usado em uma concentração suficientemente baixa) em um alimento de modo que não tenha efeito deletério sobre um organismo que consome o alimento.
[0079] A composição do alimento pode estar sob a forma sólida ou líquida. Além disso, a composição pode incluir macronutrientes comestíveis, proteínas, carboidratos, vitaminas e/ou minerais em quantidades desejadas para um uso particular, como são bem conhecidos na técnica. As quantidades
28 / 51 destes ingredientes irão variar dependendo se a composição se destina ao uso com indivíduos normais ou para uso com indivíduos com necessidades especializadas, como indivíduos que sofrem de distúrbios metabólicos e semelhantes.
[0080] Exemplos de carreadores adequados com valor nutricional incluem macronutrientes, como gorduras comestíveis (por exemplo, óleo de coco, óleo de borragem, óleo fúngico, óleo de corrente negra, óleo de soja e mono- e diglicerídeos), carboidratos (por exemplo, glicose, lactose comestível e amido hidrolisado) e proteínas (por exemplo, proteínas de soja, soro eletrodialisado, leite desnatado eletrodialisado, soro de leite ou os hidrolisados dessas proteínas).
[0081] Vitaminas e minerais que podem ser adicionados ao alimento divulgado neste documento incluem, por exemplo, cálcio, fósforo, potássio, sódio, cloreto, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, selênio, iodo e vitaminas A, E, D, C, e o complexo B.
[0082] As composições de lipídio da presente invenção podem ser utilizadas em composições farmacêuticas. Tais composições farmacêuticas compreendem a composição de lipídio da invenção opcionalmente em conjunto com um ou mais excipientes, diluentes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis, que são conhecidos pela pessoa versada na técnica. Excipientes, diluentes ou carreadores adequados incluem solução salina tamponada com fosfato, água, etanol, polióis, agentes umectantes ou emulsões, como uma emulsão de água/óleo. A composição pode estar sob a forma líquida ou sólida, incluindo uma solução, suspensão, emulsão, óleo ou pó. Por exemplo, a composição pode estar sob a forma de um comprimido, cápsula, gel encapsulado, líquido ingerível (incluindo um óleo ou solução) ou pó, emulsão, ou pomada ou creme tópico. A composição farmacêutica também pode ser fornecida como uma preparação intravenosa.
[0083] As formas particulares adequadas para alimentos e para
29 / 51 composições farmacêuticas incluem cápsulas que contém líquido e géis encapsulados.
[0084] As composições de lipídio da invenção podem ser misturadas com outros lipídios ou misturas de lipídio (particularmente ésteres de ácido graxo à base de vegetal e misturas de ésteres de ácido graxo) antes do uso. As composições de lipídio da invenção podem ser fornecidas em conjunto com um ou mais componentes adicionais selecionados a partir do grupo que consiste em um antioxidante (por exemplo, um tocoferol (como alfa-tocoferol ou gama-tocoferol) ou um tocotrienol), um estabilizador e um tensoativo. Alfa-tocoferol e gama-tocoferol são ambos componentes de ocorrência natural em vários óleos de sementes de plantas, incluindo óleos de canola.
[0085] Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, como açúcares, cloreto de sódio e semelhantes. Além de tais diluentes inertes, a composição também pode incluir adjuvantes, como agentes umectantes, agentes emulsionantes e de suspensão, agentes adoçantes, agentes aromatizantes e agentes perfumantes. As suspensões, além das composições de lipídio da invenção, podem compreender agentes de suspensão, como álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto ou misturas dessas substâncias.
[0086] As formas de dosagem sólidas, como comprimidos e cápsulas, podem ser preparadas usando-se técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, os ácidos graxos produzidos de acordo com os métodos divulgados neste documento podem ser comprimidos com bases de comprimidos convencionais, como lactose, sacarose e amido de milho em combinação com ligantes, como acácia, amido de milho ou gelatina, agentes desintegrantes, como amido de batata ou ácido algínico, e um lubrificante como ácido esteárico ou estearato de magnésio. As cápsulas podem ser preparadas incorporando-se esses excipientes em uma cápsula de gelatina juntamente
30 / 51 com a composição de lipídio relevante e, opcionalmente, um ou mais antioxidantes.
[0087] As vias de administração possíveis das composições farmacêuticas da presente invenção incluem, por exemplo, enteral (por exemplo, oral e retal) e parenteral. Por exemplo, uma preparação líquida pode ser administrada por via oral ou retal. Além disso, uma mistura homogênea pode ser completamente dispersa em água, misturada sob condições estéreis com diluentes, conservantes, tampões ou propelentes fisiologicamente aceitáveis para formar um spray ou inalante.
[0088] As composições de lipídio da invenção são indicadas como farmacêuticas. De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição da invenção, incluindo qualquer uma das composições farmacêuticas descritas acima, para uso como produto farmacêutico.
[0089] As composições de lipídio da invenção podem fornecer uma série de benefícios que são tipicamente associados a ácidos graxos poli- insaturados de cadeia longa. Por exemplo, as composições de lipídio da invenção e as composições farmacêuticas descritas acima podem ser utilizadas no tratamento ou na prevenção de doenças cardiovasculares, proteção contra morte em pacientes com doenças cardiovasculares, redução dos níveis de colesterol sérico geral, redução da PA elevada, aumento na proporção de HDL:LDL, redução de triglicerídeos ou redução dos níveis de apolipoproteína-B, como pode ser determinado usando testes que são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica. Consequentemente, métodos de tratamento (ou prevenção) das doenças e condições listadas acima usando as composições de lipídio da invenção também são divulgados.
[0090] Tal como utilizado neste documento, os termos "tratamento", "tratar" e "que trata" se referem a reverter, aliviar, inibir o progresso de uma doença ou distúrbio como descrito neste documento, ou retardar, eliminar ou reduzir a incidência ou início de um distúrbio ou doença como descrito neste
31 / 51 documento, em comparação com o que ocorreria na ausência da medida tomada. Tal como utilizado neste documento, os termos "prevenir", "prevenção" e "que previne" se referem à redução do risco de adquirir ou desenvolver uma determinada condição, ou a redução ou inibição da recorrência da dita condição em um sujeito que não está doente.
[0091] Uma dosagem típica de um ácido graxo particular é de 0,1 mg a 20 g, tomada de uma a cinco vezes por dia (até 100 g por dia) e está particularmente na faixa de cerca de 10 mg a cerca de 1, 2, 5, ou 10 g por dia (tomados em uma ou múltiplas doses). Como conhecido na técnica, um mínimo de cerca de 300 mg/dia de ácido graxo, especialmente LC-PUFA, é desejável. No entanto, será observado que qualquer quantidade de ácido graxo será benéfica para o sujeito.
[0092] Quando usada como uma composição farmacêutica, a dosagem da composição de lipídio a ser administrada ao paciente pode ser determinada por uma das pessoas de habilidade comum na técnica e depende de vários fatores, como peso do paciente, idade do paciente, saúde geral de o paciente, história anterior do paciente, estado imunológico do paciente, etc.
[0093] As composições da invenção são composições prontamente obtidas que podem ter um perfil de estabilidade aprimorado e que podem conter uma mistura de ácidos graxos em que as proporções relativas de ácido graxo ômega 3 e ômega 6 são particularmente benéficas para saúde humana. A estabilidade pode ser avaliada usando-se uma variedade de métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Tais métodos incluem o método Rancimat, a avaliação da formação de propanal (particularmente apropriado para ácidos graxos ômega 3), a avaliação da formação de hexanal (particularmente apropriado para ácidos graxos ômega 6), o método de “valor de peróxido” (por exemplo, usando o método oficial AOCS Cd 8-53) e o método do “valor de p-anisidina” (por exemplo, usando o método oficial AOCS Cd 18-90). É mostrado nos Exemplos que as composições da invenção
32 / 51 são obtidas a partir de misturas de partida que não mostram um perfil de estabilidade aprimorado em comparação com as mesclas de referência (as mesclas de referência com uma composição semelhante em termos dos principais LC-PUFAs, mas que contêm uma quantidade significativa de lipídio de origem animal (peixe)).
[0094] As composições da invenção também podem ter a vantagem de poderem ser mais eficazes do que, serem menos tóxicas do que, serem mais duradouras, serem mais potentes do que, produzirem menos efeitos laterais do que, serem mais facilmente absorvidas do que e/ou terem um melhor perfil farmacocinético (por exemplo, maior biodisponibilidade oral e/ou depuração mais baixa) do que, e/ou terem outras propriedades farmacológicas, físicas ou químicas úteis sobre as composições de lipídio conhecidas na técnica anterior.
[0095] A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos, nos quais:
[0096] A Figura 1 mostra dados de liberação de propanal para o óleo de canola e óleo de referência (após a transesterificação, destilação e cromatografia), demonstrando a estabilidade aprimorada do óleo de canola descrito neste documento; e
[0097] A Figura 2 mostra os dados de liberação do propanal para o óleo de canola e o óleo de referência (após o refinamento, transesterificação, destilação e cromatografia de RBD), demonstrando a estabilidade aprimorada do óleo de canola descrito neste documento.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 - EXTRAÇÃO DE ÓLEO DE CANOLA COM DHA DE
SEMENTES
[0098] Canola de uma variedade divulgada na publicação de patente dos EUA nº US 2018/0016590 A1 foi cultivada como uma safra de verão. A semente foi colhida e, em seguida, armazenada à temperatura ambiente antes do esmagamento.
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[0099] 272 kg da semente foram esmagados para produzir óleo com DHA usando-se uma prensa de parafuso Kern Kraft KK80. A temperatura do aquecedor de colar de expelidor foi definida para a temperatura máxima definida no termostato. A temperatura ambiente inicial e a temperatura de estrangulamento eram de 20 ºC e a distância de estrangulamento foi fixada em 73,92 mm. A semente foi usada para alimentar o óleo contínuo e a coleta de farinha sem parar o expelidor até que toda a semente fosse esmagada.
[00100] A velocidade de rotação da broca, a temperatura da farinha e o óleo expelido foram monitorados durante a prensagem. O tempo de esmagamento foi de 4 horas para 270 kg, que é uma taxa de transferência de 67,5 kg/h. Foi obtido um rendimento de 87,2 kg (32%) de óleo bruto. Após filtrar para remover os pós finos, o rendimento foi de 77,2 kg (28%). EXEMPLO 2 - ÓLEO DE MESCLA DE REFERÊNCIA
[00101] O óleo de peixe puro contém baixos níveis de ácido graxo ALA e níveis significativamente mais altos de EPA e DHA. Uma mescla de óleo de referência (referida neste documento como "óleo de mescla de referência de triglicerídeo bruto" ou semelhante) foi projetada para ser tão semelhante quanto possível em composição ao óleo de canola com DHA filtrado obtido no Exemplo 1. Isso foi feito (a) combinando-se o nível total de DHA com o do óleo de canola com DHA e (b) combinando-se a razão de DHA/(ALA + EPA). Isso foi alcançado através da mescla de um óleo de peixe rico em DHA (atum), um óleo rico em ALA (óleo de linhaça) e óleo de canola padrão. O óleo de mescla de referência resultante também tem um teor total de ômega 3 semelhante ao óleo de canola com DHA. EXEMPLO 3 - COMPOSIÇÕES DE ÁCIDO GRAXO DO ÓLEO DE
CANOLA COM DHA BRUTO E MESCLA DE REFERÊNCIA
[00102] As composições de ácido graxo do óleo bruto filtrado e do óleo de mescla de referência foram analisadas. Os resultados são mostrados abaixo.
34 / 51 Óleo de canola com DHA bruto Óleo de referência bruto (% em Ácido graxo (% em peso) peso) Palmítico C16:0 4,3 9,6 Esteárico C18:0 1,9 3,8 Oleico C18:1n9c 39,4 30,6 Cis-vacênico C18:1n7c 3,6 2,0 Linoleico C18:2n6c 7,8 11,5 GLA C18:3n6 0,1 0,1 ALA C18:3n3 21,9 21,2 Araquídico C20:0 0,7 0,4 SDA C18:4n3 2,2 0,2 Gondoico C20:1n9c 1,4 0,8 Beênico C22:0 0,3 0,2 ETA C20:4n3 1,0 0,1 Erúcico C22:1n9c 0,0 0,1 EPA C20:5n3 0,4 1,7 DPA3 C22:5n3 0,9 0,4 DHA C22:6n3 10,2 9,8 Outros 4,0 7,6 EXEMPLO 4 - AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DO ÓLEO
[00103] Um estudo de estabilidade Rancimat foi realizado usando-se o óleo de canola com DHA bruto e a mescla de referência descrita nos Exemplos 1 e 2, respectivamente. O método envolveu a testagem de cerca de 2,5 g de material de teste usando-se os procedimentos padrão para um Metrohm 743 Rancimat a 90 ºC.
[00104] A tabela abaixo resume os resultados obtidos com esses óleos a 90 ºC. Os experimentos foram realizados em duplicata. Óleo Tempo Óleo de canola com DHA 7 horas e 29 minutos 7 horas e 17 minutos Óleo de referência 10 horas e 26 minutos 10 horas e 11 minutos
[00105] O óleo de canola com DHA mostrou estabilidade consistentemente mais pobre do que o óleo de referência. EXEMPLO 5 - TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DE ÓLEO DE
CANOLA COM DHA BRUTO
[00106] A um reator químico Buchi CR101 seco limpado com nitrogênio equipado com um agitador mecânico foi adicionado etanol absoluto (12,5 l) e o óleo de canola de triglicerídeo bruto ("óleo de canola com DHA") obtido no Exemplo 1 (5,00 kg) e a mistura agitada.
[00107] À mistura acima foi adicionado etóxido de sódio (150 g) que foi enxaguado no reator com mais etanol absoluto (2,5 l), e a agitação
35 / 51 continuou durante 16 horas à temperatura ambiente. Um espectro de RMN de 1 H registrado em uma amostra retirada da mistura indicou que a reação estava completa.
[00108] O procedimento de transesterificação foi realizado em 5,22 kg de óleo de canola com DHA bruto. À mistura de reação bruta resultante foram adicionados destilados de petróleo com ponto de ebulição de 40 a 60 ºC (destilado de petróleo, 10 l) e água (10 l) e a mistura foi cuidadosamente acidificada para pH 7 com ácido clorídrico a 10% (870 ml necessário no total, tiras indicadoras Merck Universal, pH 0 a 14) com mistura completa.
[00109] Deixou-se que a mistura resultante repousasse no reator, após o qual 2 fases se formaram. A camada de destilado de petróleo foi removida, e a camada aquosa foi adicionalmente extraída com destilado de petróleo (3x5 l). As camadas de destilado de petróleo combinadas foram devolvidas ao reator e evaporadas in vacuo até um volume baixo (aproximadamente 10 l). A solução concentrada resultante foi drenada do reator, seca sobre sulfato de magnésio anidro (aproximadamente 1 kg), filtrada e concentrada in vacuo para proporcionar um óleo amarelo (5,13 kg). EXEMPLO 6 - TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DE ÓLEO DE
MESCLA DE REFERÊNCIA BRUTO
[00110] A um reator químico Buchi CR101 seco, limpado com nitrogênio equipado com um agitador mecânico, foi adicionado etanol absoluto (12,5 l) e o óleo de mescla de referência de triglicerídeo bruto obtido de acordo com o Exemplo 2 (5,00 kg) e a mistura foi agitada.
[00111] À mistura acima foi adicionado etóxido de sódio (150 g) que foi enxaguado no reator com mais etanol absoluto (2,5 l), e a agitação continuou durante 16 horas à temperatura ambiente. Um espectro de RMN de 1 H registrado em uma amostra indicou que pouca ou nenhuma reação ocorreu. Foi adicionado mais etóxido de sódio (57 g) à mistura e a agitação continuou.
[00112] Após 5 horas adicionais, um espectro de RMN de 1H de uma
36 / 51 amostra indicou que a reação estava 75% completa. Foi adicionado mais etóxido de sódio (60 ml de uma solução a 21% em etanol) à mistura e a agitação continuou durante 3 dias, tempo após o qual a reação estava completa.
EXEMPLO DE ISOLAMENTO DE PRODUTO DA TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DA MESCLA DE REFERÊNCIA BRUTA
[00113] O procedimento de transesterificação foi realizado em 5,17 kg de óleo de mescla de referência bruta. À mistura de reação bruta resultante foi adicionado destilado de petróleo (15 l) e água (3,3 l) e a mistura foi cuidadosamente acidificada a pH 7 com ácido clorídrico a 10% (910 ml necessário no total) com mistura completa.
[00114] Deixou-se que a mistura resultante repousasse no reator, após o qual 2 fases se formaram. A camada de destilado de petróleo foi removida, e a camada aquosa foi adicionalmente extraída com destilado de petróleo (2x7,5 l). As camadas de destilado de petróleo combinadas foram devolvidas ao reator e evaporadas in vacuo até um volume baixo (aproximadamente 10 l). A solução concentrada resultante foi drenada do reator, seca sobre sulfato de magnésio anidro (aproximadamente 1 kg), filtrada e concentrada in vacuo para proporcionar um óleo amarelo (5,39 kg). EXEMPLO 7 - DESTILAÇÃO DE ÓLEOS DE CANOLA
TRANSESTERIFICADOS PROCEDIMENTO PADRÃO PARA A REMOÇÃO DE COMPONENTES MAIS VOLÁTEIS DE MISTURAS DE ÉSTERES ETÍLICOS DE ÁCIDO GRAXO (FAEE) POR DESTILAÇÃO A VÁCUO
[00115] Os ésteres etílicos de ácido graxo bruto (FAEE) do DHA com canola bruto (obtido no Exemplo 5) foram submetidos à destilação nas seguintes condições. A separação por destilação foi alcançada passando-se o óleo bruto transesterificado através de um alambique de película limpa Pope
37 / 51 de 50 mm (2 polegadas) sob vácuo equipado com frascos de coleta de 2 x
1.000 ml que coletam o destilado e o resíduo. Cada um foi analisado quanto à composição de ácido graxo.
[00116] O vácuo foi abastecido com uma bomba rotativa Edwards 3 e o vácuo foi medido por um vacuômetro ebro VM2000.
[00117] O óleo foi usado para alimentar o alambique por meio de uma bomba peristáltica Cole-Palmer Instrument Company easy-load II a 4 ml/min com o motor do alambique ajustado para 325 rpm com condensador de água usado para condensar o destilado. A alimentação continuou até que um ou outro dos frascos receptores estivesse cheio.
[00118] O FAEE de DHA com canola bruto foi destilado sob essas condições com as bandas do aquecedor inicialmente definidas em 147 ºC. O objetivo era obter uma divisão 50:50 de destilado:resíduo. Durante os primeiros 30 a 45 minutos do experimento, a temperatura das bandas do aquecedor foi aumentada para 154 ºC para aumentar a proporção do óleo que destilou e o alambique permitiu o equilíbrio. Depois de meia hora, a temperatura das bandas do aquecedor foi ajustada durante meia hora para 149 ºC. O restante da destilação ocorreu a 149 ºC. O tempo total de destilação foi de 350 minutos. Uma porção do resíduo da destilação acima foi, novamente, submetida à remoção de componentes mais voláteis por meio da destilação sob as condições padrão com a temperatura das bandas do aquecedor ajustada para 149 ºC. O tempo total de destilação foi de 95 minutos. Destilação Alimentação Destilado Resíduo Primeiro 1.395,4 g 699,5 g 690,5 g Segundo 376,3 g 211,7 g 160,3 g EXEMPLO 8 - DESTILAÇÃO DE FAEE DERIVADO DA MESCLA DE
REFERÊNCIA BRUTO TRANSESTERIFICADO
[00119] Os ésteres etílicos de ácido graxo bruto (FAEE) da mescla de referência bruta (obtida no Exemplo 6) foram submetidos à destilação sob as mesmas condições que as mostradas no Exemplo anterior.
38 / 51
[00120] O FAEE proveniente de mescla de referência bruta de foi destilado sob essas condições padrão com as bandas do aquecedor inicialmente definidas para 152 ºC. O objetivo era obter uma divisão 50:50 de destilado:resíduo. Após 20 minutos, a temperatura das bandas do aquecedor foi ajustada para 154 ºC para aumentar o fluxo de destilado. Após mais uma hora, a temperatura das bandas do aquecedor foi ajustada para 153 ºC e, em seguida, para 152 ºC durante a hora seguinte. Para a última hora da destilação, a temperatura das bandas do aquecedor foi ajustada para 153 ºC. O tempo total de destilação foi de 380 minutos. O resíduo da destilação anterior foi, novamente, submetido à remoção de componentes mais voláteis por meio da destilação nas condições padrão. O objetivo era obter uma divisão 50:50 de destilado:resíduo. A destilação foi realizada, principalmente, com as bandas do aquecedor definidas em 150 a 151 ºC. O tempo total de destilação foi de 195 minutos. Destilação Alimentação Destilado Resíduo Primeiro 1.515,7 g 729,6 g 775,1 g Segundo 768,5 g 399,7 g 363,3 g EXEMPLO 9 - SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA DE FAEE
DERIVADO DE CANOLA HPLC PREPARATIVA
[00121] Os ésteres etílicos de ácido graxo (FAEE) obtidos no Exemplo 7 (isto é, que foram obtidos a partir do DHA com canola bruto e processados usando-se transesterificação e destilação) foram submetidos à separação cromatográfica sob as seguintes condições. Um sistema de HPLC preparativo que compreende um sistema Waters Prep 4000, injetor Rheodyne com ciclo de 10 ml, coluna Deltaprep C18 de 300 x 40 mm, detector de comprimento de onda duplo Waters 2487 e registrador gráfico foi equilibrado com 88% de fase móvel de metanol/água a 70 ml/min. O detector foi ajustado para 215 nm e 2,0 unidades de absorbância em escala completa e o gráfico executado a 6 cm/h.
39 / 51
[00122] 1,0 g de óleo de FAEE foi dissolvido em uma quantidade mínima de 88% de metanol/água e injetado na coluna através do injetor Rheodyne. Colheram-se fracções de, aproximadamente, 250 ml uma vez que a parte frontal do solvente apareceu após cerca de 7 minutos.
[00123] Um total de 43 frações foi coletado ao longo de 140 minutos. Após 85 minutos, a fase móvel foi mudada para 90% de metanol/água. Após 105 minutos, a fase móvel foi mudada para 94% de metanol/água. Após 110 minutos, a fase móvel foi mudada para 100% de metanol/água. Após as fracções finais terem sido coletadas, a coluna foi lavada durante mais 1 hora com 100% de metanol a 70 ml/min. HPLC analítica foi realizada em todas as frações, e as frações que contêm, predominantemente, DHA foram combinadas (rendimento: 22%).
HPLC ANALÍTICA
[00124] Um sistema de HPLC que compreende um controlador de bomba Waters 600E, amostrador automático 717, detector de matriz de fotodiodo 2996 e detector de índice de refração 2414 foi usado para a análise da amostra. A análise foi realizada em uma coluna Alltima C18 de 150 x 4,6 mm usando-se 90% de metanol/água isocrática ou 95% de metanol/água a 1,0 ml/min como fase móvel. A coleta e o processamento dos dados foram realizados no software Waters Empower 3. EXEMPLO 10 - SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA DE FAEE
DERIVADO DA MESCLA DE REFERÊNCIA
[00125] Os ésteres etílicos de ácido graxo bruto (FAEE) da mescla de referência (obtida no Exemplo 8) foram submetidos à separação cromatográfica sob as mesmas condições que as mostradas no Exemplo anterior.
[00126] Um total de 43 frações foi coletado ao longo de 130 minutos. Após 75 minutos, a fase móvel foi mudada para 90% de metanol/água. Após 95 minutos, a fase móvel foi mudada para 95% de metanol/água. Após 110
40 / 51 minutos, a fase móvel foi mudada para 100% de MeOH. Após as fracções finais terem sido coletadas, a coluna foi lavada durante mais 1 hora com 100% de MeOH a 70 ml/min. HPLC analítica foi realizada em todas as frações, e as frações que contêm, predominantemente, DHA foram combinadas (rendimento: aproximadamente 20%). EXEMPLO 11 - ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO PARA
OS ÓLEOS ENRIQUECIDOS
[00127] As composições de ácido graxo dos produtos obtidos nos Exemplos 9 e 10 foram analisadas. Os resultados são mostrados abaixo. Óleo de canola com DHA Óleo de referência Ácido graxo (% em peso) (% em peso) (Exemplo 9) (Exemplo 10) Palmítico C16:0 0,00 0,00 Esteárico C18:0 0,00 0,00 Oleico C18:1n9c 0,00 0,02 Cis-vacênico C18:1n7c 0,00 0,00 Linoleico C18:2n6c 0,60 1,76 GLA C18:3n6 0,01 0,00 ALA C18:3n3 0,71 1,89 Araquídico C20:0 0,03 0,02 SDA C18:4n3 0,00 0,00 Gondoico C20:1n9c 0,00 0,00 Beênico C22:0 0,06 0,00 ETA C20:4n3 5,30 0,70 Erúcico C22:1n9c 0,00 0,00 EPA C20:5n3 0,02 0,14 DPA3 C22:5n3 0,27 0,19 DHA C22:6n3 92,62 90,25 Outros 0,39 5,04 EXEMPLO 12 - AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DO ÓLEO EXPERIÊNCIA DE ESTABILIDADE DE ESPAÇO VAZIO GC-MS
[00128] A análise do espaço vazio foi realizada nos produtos enriquecidos descritos acima para avaliar as quantidades de propanal que são liberadas sob condições específicas. Níveis aumentados de liberação de propanal demonstram estabilidade reduzida para o material de teste. MÉTODO SPME (MICROEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA):
[00129] Fibra StableFlex PDMS/DVB de 65 µm selecionada (kit de fibra Supelco 57284-u)
[00130] As fibras foram condicionadas por 10 minutos antes do uso a
41 / 51 250 ºC em uma estação de condicionamento Triplus RSH
[00131] As amostras foram incubadas a 40 ºC durante 1 min antes da extração.
[00132] Extraídas por 1 min do frasco de espaço vazio
[00133] Espera-se que seja um bom método geral capaz de capturar uma ampla gama de componentes voláteis. MÉTODO GC:
[00134] GC termocientífica TRACE 1310
[00135] Coluna termocientífica TR-DIOXIN 5MS, diâmetro interno de 0,25 mm, 30 m de filme de 0,1 µm
[00136] Injeção dividida a 250 ºC, Split 83, 1,2 ml He/min
[00137] Rampa GC: 40 ºC em 1 min a 100 a 5 ºC/min, então a 300 ºC a 50 ºC/min
[00138] Foi usada uma coluna específica de MS genérica com boa sinergia para análise de espaço vazio. Uma rampa de temperatura inicial lenta foi empregada para maximizar a separação de voláteis antes de se elevar ao máximo para manter o desempenho da coluna. Injeções divididas foram empregadas para evitar a necessidade de resfriamento criogênico da entrada e aumentar a resolução da coluna.
[00139] A separação dos padrões foi dificultada por alguma sobreposição de pico, mas ainda pôde ser acomodada na quantificação. 3 resultados de calibração padrão (0,1; 0,01 e 0,01%), o íon molecular m/z 56 foi empregado para a detecção de propanal. O pico base em m/z 58 é usado para detectar hexanal. MÉTODO MS:
[00140] GC-MS termocientífica DFS de alta resolução
[00141] Baixa resolução (1.000), varredura completa 35 a 350 Da a 0,5 s/varredura
[00142] Padrões: - as diluições padrão de propanal e hexanal foram
42 / 51 feitas em ésteres etílicos de canola com DHA fornecidos. Estas misturas padrão foram, então, adicionadas a um volume de 540 µl em recipientes de espaço vazio de 20 ml.
[00143] A varredura completa foi empregada, permitindo o monitoramento de todos os produtos evoluídos, em vez de moléculas específicas. RESULTADOS DE ESTABILIDADE DO ESPAÇO VAZIO:
[00144] A tabela abaixo resume os resultados obtidos a partir do óleo de canola obtido no Exemplo 9 e do óleo de referência obtido no Exemplo 10 de T=0 a 2 dias. As amostras de teste foram retidas durante esse período à temperatura ambiente em uma caixa de luz e sob iluminação de tubo fluorescente. O íon molecular m/z 58 foi analisado, e o cromatograma de massa mostra claramente o surgimento de propanal em RT em 1,37 min. O desenvolvimento do propanal é quantificado na tabela abaixo e os dados são mostrados na Figura 1. O óleo de canola com DHA liberou quantidades substancialmente menores de propanal demonstrando a estabilidade aprimorada do óleo de canola em comparação com a referência. Ponto de tempo (dias) 0 2 Óleo de canola com DHA (ppm de propanal) 823,974 1.392,985 Óleo de referência (ppm de propanal) 1.149,539 2.318,177
[00145] O óleo de canola com DHA apresentou estabilidade superior à oxidação em comparação com o óleo de referência. EXEMPLO 13 - REFINAMENTO DE ÓLEO DE CANOLA COM DHA
[00146] Uma porção do óleo de canola obtido no Exemplo 1 foi refinada antes de ser submetido a enriquecimento adicional. O processo de refinamento envolveu degomagem, refinamento alcalino, branqueamento e desodorização.
DEGOMAGEM ÁCIDA
[00147] A degomagem é a remoção de fosfatídeos não hidratáveis e hidratáveis do óleo. O óleo bruto seco obtido no Exemplo 1 foi aquecido a 53
43 / 51 ± 2 ºC e 0,2% de uma solução de ácido cítrico a 50% foi adicionado. Após aproximadamente 30 minutos de mistura, 2,0% de água abrandada aquecida (53 ± 2 ºC) foram adicionados e misturados por aproximadamente 30 minutos. O óleo foi aquecido a 67 ± 3 ºC durante a espera e, em seguida, centrifugado. PRÉ-TRATAMENTO/REFINAMENTO DE ÁCIDO
[00148] Refinamento é a remoção de ácidos graxos livres após sua saponificação com soda cáustica para torná-los solúveis em água e sua posterior remoção por centrifugação. Uma etapa de pré-tratamento de ácido foi usada para continuar a hidratação dos fosfatídeos. O óleo degomado foi aquecido a 65 ± 5 ºC e 0,1% de ácido fosfórico a 85% foi adicionado e misturado por um total de 30 minutos. Após a adição de ácido e o tempo de espera, hidróxido de sódio 20 Be‘ (Baumé; 14,4% em p/p) foi adicionado para neutralizar os ácidos graxos livres mais um excesso de 0,05% (p/p). A soda cáustica e o óleo foram, então, misturados por mais 15 minutos. O óleo foi aquecido a 62 ± 2 º C durante a espera de 15 minutos e, em seguida, o óleo foi centrifugado.
TRATAMENTO COM TRISIL SÍLICA
[00149] Para posterior retirada dos sabonetes, foi realizado tratamento com trisil sílica, em níveis compatíveis com o branqueamento. O pré- tratamento com trisil foi combinado com a etapa de branqueamento. O óleo refinado foi aquecido a 68 ± 5 ºC e tratado com 0,3% de Trisil 300. O óleo/trisil foi misturado durante aproximadamente 15 minutos, e, então, o branqueamento continuou.
BRANQUEAMENTO
[00150] O óleo refinado foi tratado com argila adsortiva para a remoção de peróxidos, fosfatídeos, corpos coloridos e vestígios de sabão. Uma etapa de pré-tratamento de ácido foi usada para continuar a hidratação dos fosfatídeos. O óleo pré-tratado com trisil foi misturado com 0,2% (p/p) de
44 / 51 uma solução de ácido cítrico de 50%. Após 15 minutos de mistura, foi adicionado 2% (p/p) de argila de branqueamento Tonsil Supreme 126 FF. A mistura foi, então, aquecida a 90 ± 2 ºC sob vácuo e retida durante aproximadamente 30 minutos. O óleo foi resfriado a 60 ± 2 ºC, vácuo rompido com nitrogênio, 1,0 kg de auxiliar de filtro adicionado e filtrado. Vaso de pressão: vaso de pressão Cherry-Burrell de 500 l, camisa de vapor ou de água de resfriamento, toda construção em aço inoxidável 316 com impulsor e defletores para mistura, número de série da mfg nº E-227-94. Prensa de filtro: prensa de filtro de polipropileno Sperry de 609,6 mm (24”), filtro de 14,6304 cm3 (4,8 pés cúbicos) de capacidade, suportes de papel e de tecido foram usados.
DESODORIZAÇÃO
[00151] O óleo branqueado foi submetido à aspersão com vapor em alta temperatura e baixa pressão para remover componentes odoríferos, componentes de sabor e ácidos graxos livres adicionais. A cor também é reduzida pelo branqueamento por calor em temperaturas elevadas. A metade do óleo branqueado foi desodorizado a 180 ± 2 ºC por 60 min com vapor de aspersão a 1% e a composição de ácido graxo (FAC) foi monitorada. Vaso desodorizador (OD4): vaso de fabricação de cobre de 400 l classificado a vácuo, camisa de vapor ou de água de resfriamento, toda construção inoxidável 316. Uma ligeira diminuição do nível de DHA foi observada a 180 ºC com 60 min de espera. Em seguida, outra experiência foi conduzida a 180 ºC com 30 min de espera. O produto foi empacotado sob nitrogênio em baldes de plástico de HDPE de 20 l e armazenado em um refrigerador a 4 ºC. EXEMPLO 14 - REFINAMENTO DO ÓLEO DE MESCLA DE
REFERÊNCIA ORIGINAL
[00152] Uma porção da mescla de referência descrita no Exemplo 2 foi refinada antes de sofrer enriquecimento adicional. No processo de refinamento, a mescla de referência foi submetida a refinamento sob as
45 / 51 mesmas condições que as mostradas no Exemplo anterior. EXEMPLO 15 - COMPOSIÇÕES DE ÁCIDOS GRAXOS DO ÓLEO DE
CANOLA COM DHA E MESCLA DE REFERÊNCIA BRUTO RBD
[00153] As composições de ácidos graxos do óleo bruto filtrado RBD (do Exemplo 13) e do óleo de mescla de referência de RBD (do Exemplo 14) foram analisadas. Os resultados são mostrados abaixo. Óleo de canola com DHA bruto (% Óleo de referência bruto (% Ácido graxo em peso) em peso) Palmítico C16:0 4,23 9,22 Esteárico C18:0 2,52 3,89 Oleico C18:1n9c 42,90 31,62 Cis-vacênico C18:1n7c 3,01 1,96 Linoleico C18:2n6c 7,15 12,18 GLA C18:3n6 0,54 0,00 ALA C18:3n3 19,95 22,51 Araquídico C20:0 0,72 0,38 SDA C18:4n3 2,25 0,17 Gondoico C20:1n9c 1,28 0,71 Beênico C22:0 0,31 0,22 ETA C20:4n3 1,08 0,00 Erúcico C22:1n9c 0,00 0,00 EPA C20:5n3 0,47 1,67 DPA3 C22:5n3 0,96 0,41 DHA C22:6n3 9,33 9,20 Outros 3,32 5,86
[00154] Referências a "RBD" em conexão com os Exemplos (e as figuras anexas) significam que o produto em questão foi obtido direta ou indiretamente a partir dos produtos "refinados" do Exemplo 13 (para óleos de canola) e do Exemplo 14 (para mesclas de referência). EXEMPLO 16 - TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DE ÓLEO DE
CANOLA COM DHA RBD
[00155] A um reator químico Buchi CR101 seco limpado com nitrogênio equipado com um agitador mecânico foi adicionado etanol absoluto (12,5 l) e o óleo de canola com DHA de triglicerídeo refinado ("RBD") obtido no Exemplo 13 (5,00 kg) e a mistura agitada.
[00156] À mistura acima foi adicionado etóxido de sódio (150 g) que foi enxaguado no reator com mais etanol absoluto (2,5 l), e a agitação continuou durante 16 horas à temperatura ambiente. Um espectro de RMN de 1 H registrado em uma amostra retirada da mistura indicou que a reação estava
46 / 51 completa.
[00157] O procedimento de transesterificação foi realizado em aproximadamente 5 kg de óleo de canola com DHA RBD. À mistura de reação bruta resultante foram adicionados destilados de petróleo com ponto de ebulição de 40 a 60 ºC (destilado de petróleo, 10 l) e água (10 l) e a mistura foi cuidadosamente acidificada para pH 7 com ácido clorídrico a 10% (870 ml necessário no total, tiras indicadoras Merck Universal, pH 0 a 14) com mistura completa.
[00158] Deixou-se que a mistura resultante repousasse no reator, após o qual 2 fases se formaram. A camada de destilado de petróleo foi removida, e a camada aquosa foi adicionalmente extraída com destilado de petróleo (3x5 l). As camadas de destilado de petróleo combinadas foram devolvidas ao reator e evaporadas in vacuo até um volume baixo (aproximadamente 10 l). A solução concentrada resultante foi drenada do reator, secada sobre sulfato de magnésio anidro (aproximadamente, 1 kg), filtrada e concentrada in vacuo para proporcionar um óleo amarelo pálido claro (rendimento: 99%). EXEMPLO 17 - TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DE ÓLEO DE
MESCLA DE REFERÊNCIA RBD
[00159] A um reator químico Buchi CR101 seco, limpado com nitrogênio equipado com um agitador mecânico, foi adicionado etanol absoluto (12,5 l) e o óleo de mescla de referência de triglicerídeo RBD obtido de acordo com o Exemplo 14 (aproximadamente, 5 kg) e a mistura foi agitada.
[00160] À mistura acima foi adicionado etóxido de sódio (150 g) que foi enxaguado no reator com mais etanol absoluto (2,5 l), e a agitação continuou durante 16 horas à temperatura ambiente. Um espectro de RMN de 1 H registrado em uma amostra indicou que pouca ou nenhuma reação ocorreu. Foi adicionado mais etóxido de sódio (57 g) à mistura e a agitação continuou.
[00161] Após 5 horas adicionais, um espectro de RMN de 1H de uma
47 / 51 amostra indicou que a reação estava 75% completa. Foi adicionado mais etóxido de sódio (60 ml de uma solução a 21% em etanol) à mistura e a agitação continuou durante 3 dias, tempo após o qual a reação estava completa.
EXEMPLO DE ISOLAMENTO DE PRODUTO DA TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DA MESCLA DE REFERÊNCIA RBD
[00162] O procedimento de transesterificação foi realizado em aproximadamente 5 kg de óleo de mescla de referência RBD. À mistura de reação bruta resultante foi adicionado destilado de petróleo (15 l) e água (3,3 l) e a mistura foi cuidadosamente acidificada a pH 7 com ácido clorídrico a 10% (910 ml necessário no total) com mistura completa.
[00163] Deixou-se que a mistura resultante repousasse no reator, após o qual 2 fases se formaram. A camada de destilado de petróleo foi removida, e a camada aquosa foi adicionalmente extraída com destilado de petróleo (2x7,5 l). As camadas de destilado de petróleo combinadas foram devolvidas ao reator e evaporadas in vacuo até um volume baixo (aproximadamente, 10 l). A solução concentrada resultante foi drenada do reator, secada sobre sulfato de magnésio anidro (aproximadamente, 1 kg), filtrada e concentrada in vacuo para proporcionar um óleo amarelo pálido claro (rendimento: 99%). EXEMPLO 18 - DESTILAÇÃO DE ÓLEOS DE CANOLA RBD
TRANSESTERIFICADOS PROCEDIMENTO PADRÃO PARA A REMOÇÃO DE COMPONENTES MAIS VOLÁTEIS DE MISTURAS DE ÉSTERES ETÍLICOS DE ÁCIDO GRAXO (FAEE) POR DESTILAÇÃO A VÁCUO
[00164] Os ésteres etílicos de ácido graxo (FAEE) do DHA com canola RBD (obtido no Exemplo 16) foram submetidos à destilação sob as seguintes condições. A separação por destilação foi alcançada passando-se o óleo bruto transesterificado através de um alambique de película limpa Pope de 50 mm
48 / 51 (2 polegadas) sob vácuo equipado com frascos de coleta de 2 x 1.000 ml que coletam o destilado e o resíduo. Cada um foi analisado quanto à composição de ácido graxo.
[00165] O vácuo foi abastecido com uma bomba rotativa Edwards 3 e o vácuo foi medido por um vacuômetro ebro VM2000.
[00166] O óleo foi usado para alimentar o alambique por meio de uma bomba peristáltica Cole-Palmer Instrument Company easy-load II a 4 ml/min com o motor do alambique ajustado para 325 rpm com condensador de água usado para condensar o destilado. A alimentação continuou até que um ou outro dos frascos receptores estivesse cheio.
[00167] O FAEE de DHA com canola RBD foi destilado sob essas condições com as bandas do aquecedor inicialmente definidas em 152 ºC para obter uma divisão 50:50 de destilado:resíduo. Uma porção do resíduo dessa destilação foi, novamente, submetida à remoção de componentes mais voláteis por meio da destilação sob as condições padrão com a temperatura das bandas do aquecedor ajustada para 152 ºC. O tempo total de destilação foi de aproximadamente 90 minutos. Destilação Alimentação Destilado Resíduo Primeiro 1.596,6 729,9 855,9 Segundo 851,3 503,5 343,1 EXEMPLO 19 - DESTILAÇÃO DE FAEE DERIVADO DE MESCLA DE
REFERÊNCIA RBD TRANSESTERIFICADA
[00168] Os ésteres etílicos de ácido graxo (FAEE) da mescla de referência RBD (obtida no Exemplo 17) foram submetidos à destilação sob as mesmas condições que as mostradas no Exemplo anterior.
[00169] O FAEE proveniente da mescla de referência RBD foi destilado sob essas condições padrão com as bandas do aquecedor inicialmente definidas em 152 ºC para obter uma divisão 50:50 de destilado:resíduo. O resíduo dessa destilação anterior foi, novamente, submetido à remoção de componentes mais voláteis por meio da destilação
49 / 51 nas condições padrão. O objetivo era obter uma divisão 50:50 de destilado:resíduo. A destilação foi realizada principalmente com as bandas do aquecedor ajustadas para 152 ºC. O tempo total de destilação foi de aproximadamente 200 minutos. Destilação Alimentação Destilado Resíduo Primeiro 1.195,1 674,7 504,6 Segundo 496,4 297,2 197,4 EXEMPLO 20 – SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA DE FAEE
DERIVADO DE CANOLA RBD
[00170] Os ésteres etílicos de ácido graxo (FAEE) obtidos no Exemplo 18 (isto é, que foram obtidos a partir do DHA com canola RBD e processados usando-se transesterificação e destilação) foram submetidos à separação cromatográfica sob as seguintes condições. Um sistema de HPLC preparativo que compreende um sistema Waters Prep 4000, injetor Rheodyne com ciclo de 10 ml, coluna Deltaprep C18 de 300 x 40 mm, detector de comprimento de onda duplo Waters 2487 e registrador gráfico foi equilibrado com 88% de fase móvel de metanol/água a 70 ml/min. O detector foi ajustado para 215 nm e 2,0 unidades de absorbância em escala completa e o gráfico executado a 6 cm/h.
[00171] 1,0 g de óleo de FAEE foi dissolvido em uma quantidade mínima de 88% de metanol/água e injetado na coluna através do injetor Rheodyne. Colheram-se fracções de, aproximadamente, 250 ml uma vez que a parte frontal do solvente apareceu após cerca de 7 minutos.
[00172] HPLC analítica foi realizada em todas as frações, e as frações que contêm, predominantemente, DHA foram combinadas (rendimento: aproximadamente 20%). EXEMPLO 21 – SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA DE FAEE
DERIVADO DE MESCLA DE REFERÊNCIA RBD
[00173] Os ésteres etílicos de ácido graxo bruto (FAEE) da mescla de referência RBD (obtida no Exemplo 19) foram submetidos à separação
50 / 51 cromatográfica sob as mesmas condições que as mostradas no Exemplo anterior.
[00174] HPLC analítica foi realizada em todas as frações, e as frações que contêm, predominantemente, DHA foram combinadas (rendimento: aproximadamente 20%). EXEMPLO 22 - ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO PARA
OS ÓLEOS RBD ENRIQUECIDOS
[00175] As composições de ácido graxo dos produtos obtidos nos Exemplos 20 e 21 foram analisadas. Os resultados são mostrados abaixo. Óleo de canola com DHA Óleo de referência Ácido graxo (% em peso) (% em peso) (Exemplo 20) (Exemplo 21) Palmítico C16:0 0,02 0,00 Esteárico C18:0 0,02 0,00 Oleico C18:1n9c 0,00 0,00 Cis-vacênico C18:1n7c 0,00 0,00 Linoleico C18:2n6c 2,40 7,28 GLA C18:3n6 0,06 0,00 ALA C18:3n3 1,02 1,19 Araquídico C20:0 0,03 0,00 SDA C18:4n3 0,03 0,00 Gondoico C20:1n9c 0,00 0,00 C20:4n6 0,00 3,66 Beênico C22:0 0,05 0,00 ETA C20:4n3 6,76 0,64 Erúcico C22:1n9c 0,00 0,00 EPA C20:5n3 0,04 0,00 DPA3 C22:5n3 0,32 0,00 DHA C22:6n3 88,27 81,12 Outros 0,99 6,11 EXEMPLO 23 - AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DO ÓLEO
[00176] A análise de espaço vazio foi conduzida nos produtos enriquecidos descritos nos Exemplos 20 e 21 de acordo com o método descrito no Exemplo 12.
[00177] A tabela abaixo resume os resultados obtidos a partir do óleo de canola RBD obtido no Exemplo 20 e do óleo de referência RBD obtido no Exemplo 21 de T=0 a 2 dias. As amostras de teste foram retidas durante esse período à temperatura ambiente em uma caixa de luz e sob iluminação de tubo fluorescente. O íon molecular m/z 58 foi analisado, e o cromatograma de massa mostra claramente o surgimento de propanal em RT em 1,37 min. O
51 / 51 desenvolvimento do propanal é quantificado na tabela abaixo, e os dados são mostrados na Figura 2. O óleo de canola com DHA liberou quantidades substancialmente menores de propanal demonstrando a estabilidade aprimorada do óleo de canola em comparação com a referência. Ponto de tempo (dias) 0 2 Óleo de canola com DHA (ppm de propanal) 0,000 706,232 Óleo de referência (ppm de propanal) 1.449,640 1.582,057
[00178] O óleo de canola com DHA apresentou estabilidade superior à oxidação em comparação com o óleo de referência.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição de lipídio à base de vegetal caracterizada pelo fato de que compreende: ácido docosa-hexaenoico (22:6n-3) em uma quantidade de pelo menos cerca de 86% em peso do teor de ácido graxo total da composição; e um segundo ácido graxo poli-insaturado em uma quantidade de pelo menos cerca de 3% em peso do teor de ácido graxo total da composição, em que o segundo ácido graxo poli-insaturado é o segundo ácido graxo poli-insaturado mais abundante na composição; em que o ácido docosa-hexaenoico e o segundo ácido graxo poli-insaturado são, cada um, independentemente fornecidos sob a forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo.
2. Composição de lipídio de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ácido docosa-hexaenoico (22:6n-3) está presente em uma quantidade de pelo menos cerca de 87% (por exemplo, até cerca de 96%) em peso do teor de ácido graxo total da composição.
3. Composição de lipídio de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a razão em peso entre ácido docosa- hexaenoico e ácido eicosapentaenoico na composição é de pelo menos 50:1.
4. Composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o segundo ácido graxo poli-insaturado é um ácido graxo poli-insaturado ômega 3 C:20-24 que contém pelo menos 4 insaturações.
5. Composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o segundo ácido graxo poli-insaturado está presente em uma quantidade de cerca de 3% a cerca de 12% em peso do teor de ácido graxo total da composição.
6. Composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo que a composição de lipídio à base de vegetal é caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, ácido α-linolênico (18:3n-3) em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 4% (como de cerca de 0,5 % a cerca de 2%) em peso do teor de ácido graxo total da composição.
7. Composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o ácido docosa- hexaenoico, o segundo ácido graxo poli-insaturado e o ácido α-linolênico (se presente) são, cada um, independentemente fornecidos sob a forma de um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo, como sob a forma de um éster etílico de ácido graxo ou como parte de um triglicerídeo.
8. Composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a quantidade de ácido palmítico na composição é inferior a cerca de 0,5% em peso do teor de ácido graxo total da composição.
9. Composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo que a composição de lipídio é caracterizada pelo fato de que é derivada de uma única fonte.
10. Composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo que a composição de lipídio é caracterizada pelo fato de que é derivada de uma planta.
11. Composição de lipídio de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a planta é uma semente oleaginosa, particularmente Brassica sp., Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, Helianthus sp., Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, Trifolium sp., Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Camelina sativa ou Crambe abyssinica.
12. Composição de lipídio de acordo com a reivindicação 10 ou 11, sendo que a composição de lipídio é caracterizada pelo fato de que é obtida a partir de um óleo de semente que foi degomado, refinado, branqueado e/ou desodorizado.
13. Composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo que a composição é caracterizada pelo fato de que é fornecida sob a forma de um comprimido, cápsula, gel encapsulado, líquido ou pó ingerível, emulsão ou uma pomada ou um creme tópico.
14. Composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, um ou mais componentes adicionais selecionados a partir do grupo que consiste em um antioxidante, um estabilizador e um tensoativo.
15. Composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de doença cardiovascular, proteção contra morte em pacientes com doença cardiovascular, redução dos níveis gerais de colesterol sérico, redução da pressão arterial elevada, aumento da razão HDL:LDL, redução dos triglicerídeos ou redução dos níveis de apolipoproteína-B.
16. Processo para a produção de uma composição de lipídio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, sendo que o processo é caracterizado pelo fato de que compreende fornecer uma mistura de ésteres etílicos de ácido graxo e submeter a dita mistura a um processo de separação cromatográfica, opcionalmente em que a mistura de ésteres etílicos de ácido graxo é obtida por transesterificação e destilação de um óleo de lipídio à base de vegetal.
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