NO20101800A1 - Metode for anrikning av marin olje - Google Patents
Metode for anrikning av marin olje Download PDFInfo
- Publication number
- NO20101800A1 NO20101800A1 NO20101800A NO20101800A NO20101800A1 NO 20101800 A1 NO20101800 A1 NO 20101800A1 NO 20101800 A NO20101800 A NO 20101800A NO 20101800 A NO20101800 A NO 20101800A NO 20101800 A1 NO20101800 A1 NO 20101800A1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- oil
- lipase
- hydrolysis
- omega
- fatty acids
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 84
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 claims abstract description 128
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 111
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 106
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 105
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 103
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 103
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 103
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 102
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 claims description 47
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 39
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 39
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 39
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 39
- 241000222175 Diutina rugosa Species 0.000 claims description 38
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 24
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 23
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 claims description 21
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 16
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 claims description 15
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 claims description 12
- 235000021281 monounsaturated fatty acids Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000000526 short-path distillation Methods 0.000 claims description 11
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 10
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 10
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 5
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 4
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 claims description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 3
- 241000235402 Rhizomucor Species 0.000 claims description 3
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 241001474374 Blennius Species 0.000 claims description 2
- 241000251729 Elasmobranchii Species 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 235000019476 oil-water mixture Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 claims description 2
- 108010079522 solysime Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 abstract description 105
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 abstract description 3
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 161
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 80
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 80
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 80
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 80
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 80
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 80
- 230000004044 response Effects 0.000 description 43
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 40
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 33
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 32
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 32
- 229940012843 omega-3 fatty acid Drugs 0.000 description 22
- 229940119224 salmon oil Drugs 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000006014 omega-3 oil Substances 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 14
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 14
- 150000002759 monoacylglycerols Chemical class 0.000 description 13
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 12
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 12
- 235000021294 Docosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- YUFFSWGQGVEMMI-JLNKQSITSA-N (7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCC(O)=O YUFFSWGQGVEMMI-JLNKQSITSA-N 0.000 description 10
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 8
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 6
- 230000009021 linear effect Effects 0.000 description 6
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 241000228147 Penicillium camemberti Species 0.000 description 5
- 235000002245 Penicillium camembertii Nutrition 0.000 description 5
- 241000303962 Rhizopus delemar Species 0.000 description 5
- 241000235545 Rhizopus niveus Species 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 5
- 229940013317 fish oils Drugs 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N delta1-THC Chemical compound C1=C(C)CC[C@H]2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3[C@@H]21 CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000013386 optimize process Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- -1 Fatty acids methyl ester Chemical class 0.000 description 2
- 241000179532 [Candida] cylindracea Species 0.000 description 2
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000239366 Euphausiacea Species 0.000 description 1
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 1
- 241000276457 Gadidae Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000006136 alcoholysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 231100000317 environmental toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 1
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 1
- 238000004508 fractional distillation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000199 molecular distillation Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 description 1
- 239000010773 plant oil Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000000194 supercritical-fluid extraction Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
Abstract
Foreliggende oppfinnelse beskriver en enzymatisk metode for å oppkonsentrere omega-3 PUFA-innhold i marine oljer egnet for storskala applisering, og likeledes en marin olje anriket med omega-3 polyumettede fettsyrer og deres anvendelse.
Description
OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å konsentrere omega-3 polyumettede fettsyrer som er en del av acylglyseroler i en olje med lipasekatalysert hydrolyse, og likeledes et marint oljekonsentrat og anvendelse av olje-konsentratet.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Marine oljer anerkjennes generelt som nyttige og/eller preventive for menneskers og dyrs helse på grunn av deres høye innhold av polyumettede fettsyrer (heretter «PUFA»), spesielt omega-3 fettsyrene eikosapentaensyre (20:5 n-3; EPA) og dokosaheksaensyre (22:6 n-3; DHA). Positive effekter av omega-3-fettsyrer har blitt rapportert for et antall tilstander så som kardiovaskulære sykdommer, aterosklerose, flere typer cancere, dyslipidemia, hypertensjon, diabetes, obesitet, inflammatoriske sykdommer, neurologiske/neuropsykiatriske forstyrrelser, astma og reumatoid artritt.
Videre, dagens kunnskap viser klart at EPA og DHA har forskjellige roller i deres totale effekter på menneske- og dyrehelse. DHA, som er en hovedkomponent i nervevev, er vital for vekst og utvikling av spedbarn og oppvoksende dyr generelt, spesielt for deres syn og kognitive funksjoner. I tillegg til andre effekter har foring av DHA blitt vist å resultere i en signifikant reduksjon i blodtrykk og hjerterytme. Det samme ble ikke vist for EPA. EPA, på den andre side, som kvantitativt er hoved-forbindelsen av omega-3 PUFA, har antiinflammatoriske effekter på grunn av dets regulatoriske funksjon i genuttrykking. En nylig meta-analyse viste at signifikant forbedring av sinnsstemning i pasienter med depresjon ble oppnådd utelukkende med EPA.
Således, ikke kun innholdet av omega-3 fettsyrer i oljer er av viktighet for dets senere verdi og applikasjon, men også den kvantitative sammensetning av omega-3-fettsyrene og likeledes deres innbyrdes forhold, dvs. EPA/DHA.
Oljer som inneholder omega-3 PUFA ekstraheres hyppig fra villfangede marine ressurser så som fisk og krill. Imidlertid, marine oljer kan også oppnås fra marine organismer i oppdrett, så som oppdrettsfisk. I de siste år har anvendelse av plante-oljer av terrestrisk opprinnelse, som i hovedsak ikke omfatter noe omega-3 fettsyrer, økt i for for akvakulturproduksjon, spesielt for salmonider så som atlantisk laks. Siden laks er avhengig av å motta disse fettsyrer med dietten, så vil fisk som fores en lav mengde omega-3 fettsyrer også lagre et redusert innhold av disse fettsyrer i deres lipider.
Olje oppnådd fra disse fisker vil således ha et lavere omega-3 fettsyreinnhold, som reduserer verdien av disse oljer for applikasjoner så som for human og animalsk konsumpsjon, farmasøytiske sammensetninger, funksjonelle for og helseprodukter. Dette er en hovedbekymring innen fiskeoppdrettsindustrien idet man effektivt anvender disse oljer fra oppdrettsfisk. Applikasjoner av oljer oppnådd fra oppdretts-dyr er imidlertid foretrukket på grunn av deres generelle lave grad av kontaminasjon med miljøgifter og deres stabile kvalitet sammenlignet med oljer oppnådd fra vill fangst.
Det har blitt gjort forsøk for å øke innholdet av omega-3 polyumettede fettsyrer (PUFA) for å overkomme ulempene nevnt over. De tilgjengelige fremgangsmåter for å konsentrere/anrike PUFA inkluderer adsorpsjonskromatografi, fraksjonert eller molekylær destillasjon, enzymatisk spalting, lavtemperatur krystallisering, super-kritisk fluidekstrahering og kompleksering med urea. Kun et fåtall av disse fremgangsmåter er egnet for storskalaprosesser, og hver av disse teknikker har sine fordeler og ulemper. I dag er der fortsatt en utfordring i å utvikle kostnadseffektive fremgangsmåter for produksjon av PUFA-konsentrater for å møte det voksende behov for omega-3 fettsyrer og for å kunne anvende lavkonsentrerte råmaterialer som fra oppdrettsfisk.
Sammen med alkoholyse, er lipasekatalysert hydrolyse en av de mest benyttede enzymatiske reaksjoner, for formålet å øke omega-3-konsentrasjonen i en fiskeolje. Med lipasekatalysert hydrolyse økes mengden av omega-3 fettsyrer i acylglyseroler (anrikes) i relasjon til den totale mengde av fettsyrer som er tilstede i acylglyserolene.
Hovedegenskapen med lipasekatalyserte prosesser skyldes fettsyre (FA) selektiviteten til lipasene, siden de fleste av disse diskriminerer mot PUFA og fortrinnsvis hydrolyserer mettede og monoumettede fettsyrer (SFA og MUFA) bundet i acylglyserolene. Mettede og monoumettede fettsyrer frigjøres således som frie fettsyrer under den lipasekatalyserte hydrolyse. Den enzymatiske prosess følges vanligvis av en separasjonsprosess så som membranfiltrering eller molekylær kompleksering hvor de hydrolyserte frie fettsyrer fjernes og en olje oppnås som har en acylglyserolfraksjon med et økt/anriket innhold av omega-3 fettsyrer.
Selektiviteten av lipasene blir typisk redusert under prosessen siden tilgjengeligheten av SFA og MUFA til slutt blir redusert, noe som fører til tap av PUFA, for eksempel av EPA.
Noen lipaser kan også diskriminere mellom EPA og DHA, som muliggjør produksjon av omega-3 PUFA-konsentrater med dominans av DHA eller EPA. Lipasen fra Candida rugosa (også benevnt som Candida cylindracea) er kjent som en lipase som kan diskriminere mellom forskjellige omega-3 fettsyrer.
Selv om en stor mengde arbeid har blitt utført i 80-årene og 90-årene i det siste århundre, så er det fremdeles behov for et selektivt og effektivt system for å konsentrere omega-3 fettsyrer i fiskeolje med lavt innhold av PUFA, spesielt med det formål å forbedre den kommersielle forsyning av omega-3 fettsyrer. Således, der er et behov for mer effektive prosesser for å kunne oppnå det høyest mulige PUFA-innhold i fiskeproduktet.
Videre, kjente fremgangsmåter anvendt for å konsentrere oljer omfattende omega-3 er i hovedsak fokusert på en økning i det totale omega-3 PUFA-innhold. Fremgangsmåter som anvender lipaser i oppkonsentreringsprosessen diskriminerer generelt ikke mellom forskjellige omega-3 fettsyrer så som EPA og DHA.
For tiden mangler man enkle, milde og samtidig sterkt selektive og likeledes kostnads- og tidseffektive fremgangsmåter som er appliserbare i en industriell skala for dette formål.
Som en konsekvens av problemet angitt over, er formålet med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en enkel, mild, effektiv og samtidig sterkt selektiv fremgangsmåte for å forbedre fiskeoljer med lipasekatalysert hydrolyse, som kan anvendes i en industriell storskala for å oppnå omega-3 PUFA i høyere utbytter og renheter ved lavere kostnader enn i eksisterende fremgangsmåter.
Videre, et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for å oppkonsentrere omega-3 PUFA i oljer hvor innholdet av EPA og DHA er balansert i det finale produkt.
SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN
I samsvar med et første aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å konsentrere omega-3 polyumettede fettsyrer i acylglyseroler i en olje med lipasekatalysert hydrolyse, hvor
- oljen blandes med en vandig løsning,
- en lipase, som selektivt hydrolyserer mettede og monoumettede fettsyrer bundet til nevnte acylglyseroler og diskriminerer i sin hydrolytiske aktivitet mot omega-3 polyumettede fettsyrer, tilsettes til olje-vann-blandingen i en konsentrasjon på 3-5,5 vekt% basert på mengden av olje.
Fortrinnsvis, fraksjonene av frie fettsyrer og acylglyserol separeres etter hydrolyse, og den lipasekatalyserte hydrolyse av acylglyserolfraksjonen repeteres.
I en foretrukket utførelse er lipasen en mikrobiell lipase, fortrinnsvis fra arter valgt blant Pseudomonas, Candida, Rhizopus, og Rhizomucor.
Mer fortrinnsvis er lipasen valgt blant Candida rugosa, Burkholderia cepacia, og Rhizopus oryzae.
Fortrinnsvis, inkuberingstemperaturen i den lipasekatalyserte hydrolyse er i området av ca. 30-50°C.
Fortrinnsvis, vann-til-olje-forholdet i den lipasekatalyserte hydrolyse er i området 2:1 til 5:1 (vol/vekt).
Det er også foretrukket at inkuberingstiden i den lipasekatalyserte hydrolyse er mellom 2 timer og 8 timer.
Nevnte omega-3 polyumettede fettsyrer kan velges blant DHA, EPA og/eller DPA.
Det er også foretrukket at nevnte lipase diskriminerer i sin aktivitet mellom EPA og
DHA.
Foretrukne hydrolysereaksjonsbetingelser er som følger:
- vann-til-olje-forholdet er i området 2:1 til 5:1 (vol/vekt),
- inkuberingstemperaturen er i området av ca. 30-50°C, og
- inkuberingstiden er mellom 2 timer og 4 timer.
I en spesielt foretrukket fremgangsmåte tilsettes lipasen i en konsentrasjon på ca. 3% basert på vekt av mengden av olje, og hydrolysebetingelsene er som følger:
- inkuberingstemperatur er ca. 45°C,
- vann-til-olje-forholdet er ca. 3:1 (vol/vekt),
- inkuberingstiden er mellom 2 og 4 timer.
Videre, en fremgangsmåte er foretrukket hvor lipasen tilsettes i en konsentrasjon på ca. 3-4 vekt% basert på mengden av olje, og hydrolysebetingelsene er som følger:
- inkuberingstemperatur er ca. 30°C,
- vann-til-olje-forholdet er i området av ca. 2,5-5:1 (vol/vekt),
- inkuberingstiden er ca. 4 timer.
Fortrinnsvis, nevnte olje som skal oppkonsentreres er en marin olje oppnådd fra en fisk, et skalldyr, en bakterie, en makroalge og/eller en mikroalge.
Mer foretrukket, oljen er oppnådd fra én eller flere fiskearter valgt blant laksefisk, torskefisk, clupeider, scromboider, og elasmobranch, som kan være villfanget eller oppdrettsfisk.
I en ytterligere foretrukket fremgangsmåte er oljen fra et marint dyr i oppdrett som omfatter en redusert mengde av omega-3 polyumettede fettsyrer sammenlignet med en olje oppnådd fra den samme art i vill form.
Fortrinnsvis, nevnte olje har et innhold av polyumettede fettsyrer på ikke mer enn 16 mol% ved starten av oppkonsentreringsprosessen.
I en foretrukket fremgangsmåte separeres acylglyserolfraksjonen som omfatter de konsentrerte omega-3 polyumettede fettsyrer fra de frie fettsyrer etter den enzymatiske hydrolyse, fortrinnsvis ved anvendelse av en «short path distillation».
Separasjonen kan omfatte følgende trinn:
- separasjon av oljer og vannfase med sentrifugering, og
- mating av oljefasen til en short path destillasjonsenhet i en hastighet på 2 ml/min under 10"<3>mbar vakuum, hvor matingstanken er innstilt ved 35°C, kondensatoren ved 45°C, og evaporatoren ved 145°C.
I et andre aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse et konsentrat av marin olje som har et anriket innhold av omega-3 polyumettede fettsyrer i acylglyserolfraksjonen som kan oppnås med en fremgangsmåte i samsvar med et av avsnittene over.
I samsvar med et tredje aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse et konsentrat av en marin olje som har et anriket innhold av omega-3 polyumettede fettsyrer i acylglyserolene, hvor minst 33 mol% av fettsyrene i acylglyserolene er omega-3 polyumettede fettsyrer og EPA/DHA-forholdet er 0,4 eller mer.
Fortrinnsvis, minst 55 mol% av fettsyrene i acylglyserolene er omega-3 polyumettede fettsyrer, og EPA/DHA-forholdet er 0,3 eller mer.
Fortrinnsvis, det er foretrukket av oljen er en fiskeolje, og mer foretrukket fra en laksefisk i oppdrett.
Fortrinnsvis, DHA-innholdet i acylglyserolene økes med en faktor på minst 3,5 i en lipasekatalysert omega-3 oppkonsentreringsprosess, som har ett hydrolysetrinn og med en faktor på minst 3,9 i en repetert hydrolyse.
Fortrinnsvis, EPA-innholdet i acylglyserolene økes med en faktor på minst 1,5 i en lipasekatalysert omega-3 oppkonsentreringsprosess som har ett hydrolysetrinn, og med en faktor på minst 2 dersom hydrolysen repeteres.
Fortrinnsvis, innholdet av polyumettede fettsyrer i acylglyserolene økes med en faktor på minst 2,4 i en lipasekatalysert oppkonsentreringsprosess som har ett hydrolysetrinn, og men en faktor på minst 3 i en repetert hydrolyse.
Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et konsentrat av en marin olje i samsvar med et av avsnittene over, samt en ingrediens i et for, et funksjonelt for, et helseprodukt, en kosmetikksammensetning, eller en farmasøytisk sammensetning.
Foretrukne utførelser er definert i de medfølgende krav. Det skal anerkjennes at egenskaper av oppfinnelsen beskrevet i ovennevnte kan kombineres i enhver kombinasjon uten å avvike fra oppfinnelsens ramme.
BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Utførelser av oppfinnelsen vil nå bli beskrevet, ved hjelp av eksempler med referanse til de medfølgende figurer, hvor;
Figur 1 viser tidsforløpet av hydrolysereaksjoner katalysert med forskjellige lipaser fra Penicillium camembertii (PC), Rhizomucorjavanicus (RJ), Rhizopus niveus (RN), Rhizopus delemar (RD), Burkholderia cepacia (BC), Rhizopus oryzae (RO), Candida rugosa (CR) og Rhizomucor miehei (RM). Figur 2 viser forandringer i totalt omega-3 PUFA-innhold relatert til hydrolysegrad (HD, %) under hydrolyser katalysert med lipaser fra Burkholderia cepacia (BC), Rhizopus oryzae (RO) og Candida rugosa (CR). Figur 3 viser forhold mellom hydrolysegrad (HD, %) og hydrolyseresistent verdi (HRV, %) for (A) EPA og (B) DHA ved anvendelse av lipaser fra Burkholderia cepacia (BC), Rhizopus oryzae (RO) og Candida rugosa (CR). Figur 4 viser hovedeffekten av (A) temperatur av total omega-3; (B) reaksjonstid på EPA/DHA; (C) enzymmengde (%) på OA/total omega-3 i lipasekatalysert hydrolyse av lakseolje katalysert med en lipase fra Candida rugosa. DHA, dokosaheksaensyre; EPA, eikosapentaensyre; OA, oljesyre. Figur 5 viser respons-overflate-plot som viser effekten av temperatur og reaksjonstid på total omega-3 respons med en fast enzymmengde ved 3% mens forholdet mellom olje- og vannfaser var lik 1 (lipase fra Candida rugosa). Figur 6 viser respons-overflate-plot som viser effekten av enzymmengde og vann-til-olje-forhold på EPA/DHA-responsen med en bestemt temperatur på 30°C og reaksjonstid på 41 (lipase fra Candida rugosa). Figur 7 viser respons-overflate-plott som viser effekten av enzymmengde og vann-til-olje-forhold på OA/total omega-3-respons ved en bestemt temperatur på 30°C og tid på 41 (lipase fra Candida rugosa). Figur 8 viser tidsforløpet av forandring i total omega-3 PUFA-innhold under hydrolyse i forskjellige fiskeoljer (lipase fra Candida rugosa). Figur 9 viser lipidklassesammensetninger av produkt og rest etter applisering av prosessen for storskalahydrolyse etterfulgt av short path destillasjon av det hydrolyserte produkt. MG = monoacylglyseroler, DG = diacylglyseroler, TG = triacylglyseroler, FFA = frie fettsyrer (lipase fra Candida rugosa). Figur 10 viser en sammenligning av fettsyreprofiler av substrat, rest og destillasjons-fraksjoner etter enzymatisk hydrolyse og short path destillasjon (lipase fra Candida rugosa). Figur 11 viser forandringer i fettsyreinnhold i acylglyserolen (•, o) og FFA (■, □) fraksjoner oppnådd med enkelttrinns (fylte symboler) og repetert (ikke-fylte symboler) hydrolyse gjennom reaksjonene (lipase fra Candida rugosa).
EKSPERIMENTELL SEKSJON
Flere eksperimenter ble utført med det formål å utvikle en optimalisert prosess som kan anvendes i storskala for å oppkonsentrere (anrike) omega-3 PUFA i acylglyserolfraksjonen i en olje som inneholder omega-3 polyumettede fettsyrer med lipasekatalysert hydrolyse. Lipaser som anvendes i eksperimentene var alle lipaser som hydrolyserer mettede og monoumettede fettsyrer selektivt, og diskriminerer mot omega-3 polyumettede fettsyrer. Noen utvalgte lipaser, som er representative for denne gruppe lipaser, ble testet i eksperiment 1A og B for deres individuelle hydrolytiske potensiale i oppkonsentreringsprosessen.
Lipasen fra Candida rugosa med det beste hydrolyseresultat i eksperiment 1 ble valgt som en representativ kandidat for denne gruppe for optimalisering av prosess-betingelser for denne gruppe av lipaser med spesielt fokus på storskala-applikasjoner (eksperimenter 2-5). De hydrolyserte fettsyrer frigjøres som frie fettsyrer, som til slutt kan separeres fra acylglyserolfraksjonen som omfatter PUFA med differensiert fraksjonerings/separasjonsmetoder.
De påfølgende eksperimenter og prosesser beskriver bestemte utførelser av prosessen og prosessoptimalisering i samsvar med oppfinnelsen: Eksperiment 1: oppkonsentrering av PUFA- innhold i marine oljer med lipasekatalysert hydrolyse
Oppgradering av fiskeolje fra oppdrettslaks oppnådd fra forskjellige biprodukter ble utført med lipasekatalysert hydrolyse for å øke innhold av omega-3 polyumettede fettsyrer (PUFA). Lipasene som ble testet var lipaser som hydrolyserer mettede og monoumettede fettsyrer selektivt, og som diskriminerer mot omega-3 polyumettede fettsyrer.
Materialer og metoder
Lakseolje fra biprodukter av oppdrettslaks ble produsert i samsvar med den enzymatiske prosess ifølge Sorensen et. Al. (2004) som involverer hydrolyse av biprodukter med et proteaseenzym. Ikke-mobiliserte lipaser fra Penicillium camembertii (PC; 244.9 U/g), Rhizomucorjavanicus (RJ; 751.4 U/g), Rhizopus niveus (RN; 589.5 U/g), Rhizopus delemar (RD; 1092.5 U/g), Burkholderia cepacia (BC; tidligere kjent som Pseudomonas cepacia; 705.1 U/g), og Rhizopus oryzae (RO; 914.7 U/g) var fra Amano (Virginia, VA, USA) mens Candida rugosa lipase (CR; tidligere kjent som Candida cylindracea; 1489.2 U/g) ble innkjøpt fra Fluka (Buchs, Switzerland). Immobilisert lipase fra Rhizomucor miehei (RM; 282 U/g) var tilgjengelig fra Novozymes A/S (Bagsvaerd, Denmark). Fettsyre metylester standard ble innkjøpt fra Nu-Chek-Prep (Elysian, MN, USA). Alle andre reagenser og oppløsningsmidler som ble anvendt var fra Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) og av kromatografisk kvalitet.
Bestemmelse av enzymaktiviteter
Enzymaktiviteter ble bestemt med den japanske industristandardmetode (Japanese Industrial Standards Committee. Japanese Industrial Standard, JIS K601. 1988) ved å erstatte lakseolje for olivenolje. Frie fettsyrer (FFA) frigjort av hydrolysereaksjonen (30 min) ble titrert mot 0,5 N NaOH i nærvær av 1% metanolisk fenolftalinløsning. En enhet av enzymaktivitet (U) ble definert som mengden enzym som frigjorde 1 umol FA per min ved 37°C.
Screening av lipaser for lipasekatalysert hydrolyse av lakseolje
Tre gram lakseolje og 6 ml 150 mM fosfatbuffer (pH 7,0) ble plassert i en 15 ml ampulle og sonikert i 30 min. Substratblandingen ble deretter overført til en forseglet dobbelvegg glassreaktor av 25 ml volum og oppvarmet til 37°C under 700 rpm omrøring. Etter at substratene nådde reaksjonstemperatur ble lipase (40 U/g olje) tilsatt for å initiere reaksjonen. Prøver ble tatt ut periodisk for analyse. 20 ul prøve ble oppløst i 800 ul kloroform:metanol (2:1, vol/vol) og analysert med tynnsjiktkromatografi koblet med en flamme ioniseringsdetektor (TLC-FID) for å kvantifisere lipidklassene (triacylglyseroler, TG; diacylglyseroler, DG; monoacylglyseroler, MG; FFA, frie fettsyrer). 100 ul prøve ble blandet med 1 ml etanol og 1 ml destillert vann. Acylglyserolfraksjonen ble ekstrahert to ganger med 2 ml heksan etter forsåpning av FFA med tilsetning av 0,5 ml 0,5 M etanolisk KOH. Den etanoliske vannfase ble surgjort med 0,3 ml 2 M HCI, og FFA-fraksjonen ble ekstrahert med heksan tilsvarende. TLC-FID-analyse bekreftet at alle FFA var reservert i FFA-fraksjonen mens TG, DG og MG var kombinert i acylglyserolfraksjonen. Fraksjoner ble metylert i samsvar med AOCS-metoden Ce-1b 89 [15] og analysert med gasskromatografi
(GC).
Analyse av lipidklasse med TLC- FID
Prøver ble analysert med tynnsjiktkromatografi koblet med en flammeioniseringsdetektor (latroscan MK-6 s, Bechenheim, Germany). Alikvoter på 20 ul ble oppløst i 0,8 ml kloroform/metanol-blanding (2:1, vol/vol), og 1 ul fortynnet prøve ble applisert på silikabelagte Chromarod-kvartsstaver med en semiautomatisk prøveappliserer. Prøvene ble utviklet med et utviklingssystem av n-heksan, dietyleter og eddiksyre (45:25:1, vol/vol/vol). Stavene ble tørket i 2 min ved 120°C før analyse. Areal prosentandel av TG, DG, MG og FFA ble anvendt for beregning av produktutbytte. Hydrolysegrad defineres som (100-TG), %. Alle analyser ble utført i duplikat. De adopterte verdier er gjennomsnitt ved 95% konfidensgrense.
Fettsyrer metylester analyse med GC
FA-sammensetningene i fraksjoner ble undersøkt med gasskromatografi (Thermo Grace GC Ultra, USA) utstyrt med en autoprøvetaker, en flammeioniseringsdetektor og en Omegawax 250 fused silica kapillærkolonne (30 m x 0,25 med mer x 0,25 um film tykkelse; Supelco, Bellefonte, PA, USA). Helium ble anvendt som bæregass med en gjennomstrømningsrate på 1 ml/min. Et temperaturprogram ble innstilt som følger: økende fra 170°C til 215°C i en hastighet på 1°C/min, holdes ved 215°C i 15 min. Injektor- og detektortemperaturer ble innstilt ved 250°C og 270°C, respektivt. FAene ble identifisert ved å sammenligne deres retensjonstider med standardblandinger og uttrykt som vekt% etter korreksjon for detektorresponsfaktorer.
Resultater:
A. Hydrolyseeffektivitet
Tidsforløpet av hydrolysene for forskjellige lipaser er vist i figur 1. Hydrolysereaksjonen nådde likevekt for alle lipasene testet etter 12 til 241. Etter de første 30 minutter var HD (hydrolysegrad)-verdiene som ble oppnådd 11,97%, 19,68% og 9,42% for PC-, RJ- og RN-lipaser, respektivt. HD var 35,33%, 47,24%, 47,33% og 54,97%, respektivt, med lipasene fra CR, RM, BC og RO etter de første 30 min.
Der var ingen forhold observert mellom posisjonsspesifisitet og hydrolyseeffektivitet for lipasene. Foreksempel, HD-verdi oppnådd med CR-lipase (91,89%), som ikke har noen posisjonsspesifisitet, var lik den som ble oppnådd for RD-lipase (91,72%), som hydrolyserer s/7-1,3 posisjoner spesifikt. I tillegg, ingen forskjeller mellom immobiliserte og frie lipaser ble observert i termer av hydrolyseeffektivitet. RM, den eneste immobiliserte lipase som ble anvendt i forsøket, har et moderat HD-nivå.
B Evaluering av lipaser basert på omega- 3 PUFA- innhold i acylglyseroler og fettsyreselektivitet til lipaser
Tre av lipasene fra eksperiment 1A som har den høyeste grad av hydrolysegrad (opprinnelig fra CR, BC og RO) ble ytterligere undersøkt for deres effektivitet i å øke omega-3 PUFA-innhold i acylglyseroler i marine oljer.
Tabell 1 viser FA-innhold i acylglyserolfraksjonen i lakseolje etter 241 hydrolyse katalysert med de utvalgte lipaser. RO- og BC-lipaser resulterte i en moderat økning i omega-3 PUFA-innhold ved å øke verdien fra 13,77% til 17,88% og 14,52%, respektivt. CR-lipase, hadde den høyeste økning i omega-3 PUFA-innhold. Verdien ble økt med tilnærmet 50% (20,54%) etter 2 t og nådde 27,81 % ved slutten av 241 perioden. CR-lipase er tidligere kjent som et enzym for denne gruppe som har en høy hydrolyseeffektivitet og diskriminerer mot EPA og DHA. Lipasen hadde ingen posisjonsspesifisitet, hydrolyserer FAer ved alle sn-posisjoner virkårlig selv ved HD-nivåer så lave som 20%. På den andre side, den hadde en streng acylkjede-spesifisitet, resulterende i selektiv hydrolyse av SFA og MUFA i en langt høyere hastighet sammenlignet med omega-3 PUFA.
Figur 2 viser forandringer i totalt omega-3 PUFA-innhold relatert til HD under hydrolyse katalysert med lipaser CR, BC og RO. Forandringene i omega-3 PUFA-innhold var signifikant forskjellig selv om HD-verdiene var tilsvarende for alle lipasene ved slutten av 241. CR-lipasen resulterte i konstant økning i total omega-3 PUFA-innhold med økende HD over 40%. De andre lipasene viste en liten nedgang i total omega-3 PUFA over 50% HD.
Hydrolyseresistentverdien (HRV) ble beregnet i samsvar med Tanaka et al. (1993) som
Hvor GCa er innholdet av hver FA i den opprinnelige olje og GCber innholdet av hver FA i FFA-fraksjonen i produktet, som begge ble målt med GC (vekt%), og B er forholdet av FFA i den hydrolyserte olje, målt med TLC-FID (vol %). En høy HRV indikerer en høy resistens av FA interesse for hydrolyse.
HRV-verdier for EPA, DHA og OA ble beregnet for hydrolysereaksjonene katalysert med de testede lipaser. Figurer 3A, 3B og 3C viser forholdet mellom HRV og HD for EPA, DHA og OA, respektivt.
Alle lipasene som ble anvendt har en høy resistens mot hydrolyse av EPA ved det innledende trinn i reaksjonene (Figur 3A). Startende fra HD på tilnærmet 40%, så sank HRV jevnt inntil slutten av 241 perioden. HRV beregnet for EPA var den høyeste for CR-lipase inntil HD på 60% og ble redusert med økende hydrolyse. En tilsvarende trend ble observert for resistens av DHA mot hydrolyse (Figur 3B). HRV-mønsteret for OA (Figur 3C) var signifikant forskjellig sammenlignet med de for EPA og DHA. CR-lipase hadde den laveste verdi gjennom reaksjonen. Alle lipaser synes å ha en høy diskriminering mot hydrolyse av EPA og DHA, selv om forskjeller i grad av diskriminering ble observert mellom lipasene og også med hensyn til hydrolyse-tiden som ble anvendt.
Ved å vurdere HRV i relasjon til HD for EPA, DHA og OA, så avhenger konsentra-sjonen av omega-3 PUFA i lakseolje av diskrimineringen av lipasen mot EPA og DHA, og likeledes den selektive hydrolyse av monoumettede fettsyrer så som for OA, mål-FAen. I tillegg til disse individuelle karakteristika for hver lipase, så avhenger effektiviteten av lipasene på den andre side av de valgte reaksjonsbetingelser og likeledes kombinasjonen av reaksjonsbetingelser som vurderes å være viktig for effektiviteten av den lipasekatalyserte oppkonsentreringsprosess av oljer.
Eksperiment 2: Optimalisert prosess for oppkonsentrering av omega- 3 PUFA i en fiskeolje
Materialer og metoder:
Lakseolje fra biprodukter av oppdrettslaks ble produsert i samsvar med patentert enzymatisk prosess ifølge Sorensen et al. (2004; EP 1 575 374 B1) som involverer hydrolyse av biprodukter med et proteaseenzym. Hovedandelen av FA som finnes i substratet var oljesyresyre (OA) med en andel på 35,51%, mens omega-3 PUFA-innholdet var som følger: 4,8% EPA, 2,04% dokosapentaensyre (DPA), 6,93% DHA. Lipase fra Candida rugosa (64000 U/g) var tilgjengelig fra Meito Sangyo Co., Ltd.
(Tokyo, Japan). Fettsyre metylester standard ble innkjøpt fra Nu-Chek-Prep (Elysian, MN, USA). Alle andre reagenser og oppløsningsmidler som ble anvendt var fra Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) og av kromatografisk kvalitet.
Eksperimentell design
Sentral kompositt design (CCD) ble anvendt for optimaliseringsforsøkene. CCD er en 2k faktoriell design med stjerne- og senterpunkter. Stjerneavstanden ble valgt å være 1 for å tilveiebringe en face-centered CCD, siden områdene valgt for faktorene dekker det aktuelle areal, og således var det ikke nødvendig å ha ekstreme nivåer utover disse områder.
De følgende betingelser av temperatur, inkuberingstid, enzym konsentrasjon og vann-til-olje-forhold ble testet i reaksjonen:
- temperaturområde: 30-50°C
- inkuberingstid 4-81
- enzymmengde 3-8% (vekt), dvs. vekt basert på mengde olje
- vann-olje-forhold (vol/vekt): 1:1 - 5:1.
Oljemengden ble holdt konstant ved 3 g. Tjueåtte eksperimentelle settinger bestående av 4 senterpunkt ble generert med Modde 8.0.2 2 (Umetrics, Umeå, Sweden). Reaksjonsbetingelser og observerte responser er gitt i Tabell 2.
Fettsvremetvlesteranalvser med gasskromatografi
100 ul prøve ble blandet med 1 ml etanol og 1 ml destillert vann. Acylglyserolfraksjonen, bestående av triacylglyseroler (TG), diacylglyseroler (DG) og monoacylglyseroler (MG), ble ekstrahert to ganger med 2 ml heksan etter forsåpning av frie fettsyrer (FFA) ved tilsetning av 0,5 ml 0,5 M etanolisk KOH. Den etanoliske vannfase ble surgjort med 0,3 ml 2 M HCI, og FFA-fraksjonen ble ekstrahert med heksan-similaritet. Fraksjonene ble metylert i samsvar med AOCS-metoden Ce-1b (2007). FA-sammensetningene av fraksjonene ble undersøkt med gasskromatografi (GC)
(Thermo Trace GC Ultra, USA) utstyrt med en autosampler, en flammeioniseringsdetektor og en Omegawax 250 fusjonert silika kappilærkolonne (30 m x 0,25 mm x 0,25 um filmtykkelse; Supelco, Bellefonte, PA, USA). Helium ble anvendt som bærergass med gjennomstrømningsrate på 1 ml/min. Et temperaturprogram ble innstilt som følger: økende fra 170°C til 215°C med en hastighet på 1°C/min, holdes ved 215°C i 15 min. Injektor- og detektortemperaturer ble innstilt til 250°C og 270°C, respektivt. FAene ble identifisert ved å sammenligne deres retensjonstider med standardblandinger og uttrykt som vekt% etter korreksjon for detektorresponsfaktorer.
Statistiske analyser
Dataene ble analysert ved hjelp av RSM ved anvendelse av Modde 8.0.2. Avhengige variabler ble valgt til å være innhold av EPA, DPA og DHA i acylglyserolfraksjonen (total omega-3), forholdet EPA til DHA i acylglyserolfraksjonen (EPA/DHA), og forholdet OA til summen av EPA, DPA og DHA i FFA-fraksjonen (OA/total omega-3). Responsene ble først tilpasset til faktorer med multippel regresjon, og deretter ble modellene som ble generert anvendt for å evaluere effekten av forskjellige faktorer. Første- og andreordens koeffisienter ble generert med regresjonsanalyse (Tabell 3). Presisjonen i modellen ble evaluert med koeffisientbestemmelse ( R2), absolutt midlet avvik ( AAD) og en test for mangel på tilpasning fra analyse av varians (ANOVA). AAD ble beregnet som følger:
Yi. obsog y/,P/-er de observerte og predikerte responser, respektivt, og p er antallet eksperimentkjøringer. R<2>må være nært til 1,0 og AAD mellom predikerte og observerte data må være så liten som mulig.
Kvadratisk polynomiell regresjonsmodeller ble antatt for å predikere responsene. Modellen som ble foreslått for hver respons var:
hvor Y er responsen (total omega-3; EPA/DHA; OA/total omega-3), jS0er skjærings-punktet, jS/er første ordens modellkoeffisient, jS/,- er den kvadratiske koeffisient for/<*>variable, jS,y er interaksjonskoeffisienten for interaksjonen av variabler /' og j, X og Xs er de uavhengige variabler (Te, t, En, Wr). Fem ytterligere reaksjoner ble utført med de optimerte nivåer for å verifisere modellene med chi-kvadrat (x<2>) test. Reaksjonsbetingelser og responser, både prediktive og observerte, er gitt I Tabell 4. Storskalaproduksjon ble utført ved anvendelse av 200 g olje, der man etterligner de samme reaksjonsbetingelser som reaksjon 1 i Tabell 4.
Resultater og diskusjon
Modelltilpasning
Hovedformålet med studiet var å konsentrere/anrike omega-3 PUFA-innholdet i acylglyserolfraksjonen ved å frigjøre resten av FAene gjennom lipasekatalysert hydrolyse. Responsene som ble oppnådd fra den eksperimentelle design er gitt i Tabell 2. R2 og >A/AD-verdier av modellen generert basert på total omega-3-respons var 0,94 og 2,76, respektivt. ANOVA (data ikke vist) viste også at sannsynligheten for regresjon i modellen var signifikant (P<0,001), noe som bekrefter at modellen var statistisk god, og at den ikke hadde noen mangel i tilpasning (P>0,05). I samsvar med regresjonskoeffisientene (Tabell 3), var den mest signifikante lineære effekt ved signifikansnivå på 95% temperaturen. Videre, den kvadratiske effekt av temperatur og likeledes interaksjon av temperatur med de andre tre faktorer hadde signifikante effekter på responsen. Figur 4A viser hovedeffekten av temperatur på totalt omega-3-innhold. Som antydet av den positive lineære effekt og negative kvadratiske effekt av temperatur på responsen, eksisterer det en optimumsverdi for faktoren, som er lokalisert i området 40-50°C. Temperatur spiller en viktig rolle i enzymatiske reaksjoner, i hovedsak ved å bestemme reaksjonshastigheten. Selv om økt temperatur forbedrer den hydrolytiske hastighet, kan den også lede til termal deaktivering av lipasen. Videre, økt temperatur resulterer i større grad i oksidasjon av PUFA, som også kan være en forklaring på den lavere hastighet i økning i det
totale omega-3 PUFA-innhold ved forhøyet temperatur. For å ha et balansert innhold av EPA og DHA i produktet, ble reaksjonsforholdene også optimalisert for EPA/DHA-respons. Responser oppnådd fra den eksperimentelle design er gitt i Tabell 2. R2 og/A/AD-verdier av modellen var 0,86 og 4,57, respektivt.
ANOVA (data ikke vist) viste også at sannsynligheten for regresjonen av modellen var signifikant (P<0,001), noe som betyr at modellen var statistisk god, og at den ikke hadde noen mangel på tilpasning ved 95% signifikansnivå. Regresjonsanalyse (Tabell 3) viste at alle faktorene med unntak av vann-til-olje-forholdet hadde signifikante lineære effekter på EPA/DHA-responsen (P<0,05). Ingen av de kvadratiske effekter var statistisk signifikante, mens interaksjonen mellom enzymmengde og vann-til-olje-forhold hadde en signifikant effekt på responsen. Figur 4B viser hovedeffekten av tid på EPA/DHA-responsen. Kort reaksjonstid var ikke tilstrekkelig til å ha en fornuftig grad av hydrolyse. Etter 41 reaksjon (reaksjon 9 i Tabell 2), var 82,3% av det innledende TAG ikke-hydrolysert (data ikke vist), noe som forklarer hvorfor EPA/DHA-verdien (0,63) var nærmere enn opprinnelig verdi, og faktisk var den høyeste verdi som ble oppnådd. Det ble antydet at hydrolysereaksjonen katalysert av Candida rugosa lipase foregår i to trinn: TG-molekylene uten DHA ble hydrolyser! ved tidligere trinn i reaksjonen. Idet reaksjonen utvikler seg, hydrolyseres DHA-inneholdende-TG-molekyler også noe som reduserer i hurtigere klarning av EPA sammenlignet med DHA. Temperatur og tid har tilsvarende effekter på responsen: Jo høyere nivået var, jo lavere var EPA/DHA-verdien, som var et resultat av den hurtigere hydrolyse av EPA sammenlignet med DHA, noe som bekreftes av den høyere økning av EPA-nivå i FFA-fraksjonen sammenlignet med DHA (data ikke vist).
Oljesyre var den dominante FA i lakseoljesammensetningen, med 35,51% andel, som skyldes foret som gis til oppdrettslaks. Således, OA ble valgt som mål-FA for fjerning fra oljen. Monitorering av forholdet mellom OA og total omega-3 PUFA frigjort til FFA-fraksjonen med hydrolyse muliggjør sammenligning av selektiviteten av lipasen mot disse FAer. Responsene som ble oppnådd fra den eksperimentelle design er gitt i Tabell 2. R<2->og AAD-verdier i modellen var 0,9 og 4,73, respektivt. ANOVA (data ikke vist) viste at sannsynligheten for regresjon av modellen var signifikant (P<0,001), noe som bekrefter at modellen var statistisk god, og at den ikke hadde noen mangel på tilpasning ved 95% signifikant nivå. I samsvar med regresjonskoeffisientene (Tabell 3), hadde alle faktorene signifikante lineære effekter for OA/total omega-3-respons ved et signifikantnivå på 95%. Ingen av de kvadratiske effekter var statistisk signifikant, mens interaksjonen mellom temperatur og enzymmengde og likeledes mellom enzymmengde og vann-til-olje-forhold hadde signifikante effekter på responsen. Figur 4C viser hovedeffekten av enzymmengde på OA/total omega-3-nivå. Siden den lineære effekt av enzymmengden var negativ, mens den kvadratiske effekt av den var positiv, så eksisterer det et optimalt nivå for faktoren, som er i området 3-5,5%. Tilgjengelighet av enzym øker med øket enzymmengde, og således, selektiviteten av den hydrolytiske reaksjon reduseres, noe som resulterer i hydrolyse av omega-3 PUFA og likeledes OA. Imidlertid, ytterligere økning av enzymmengden hadde ingen ytterligere effekt på responsen, siden reaksjonsmedium var mettet med enzym.
Analyse av responsoverflateplot
Effektene av interaksjoner mellom undersøkte faktorer ble visualisert ved å variere to faktorer innen det eksperimentelle området, mens de andre to faktorer holdes ved konstante verdier for å maksimere responsene. Den mest signifikante interaksjons- effekt på total omega-3 var mellom temperatur og tid. Figur 5 er responsoverflateplot som indikerer effekten av temperatur og tid på total omega-3-respons. Enzymmengde og vann-til-olje-forhold er faste i deres laveste nivåer, på grunn av at øking av begge disse faktorer resulterte i en redusert respons. Total omega-3-innhold ble doblet ved det laveste nivå av faktorene, og økte med økende reaksjonstid gjennom det området som ble undersøkt. Temperatur hadde også en positiv effekt på responsen; imidlertid, den negative kvadratiske effekt av temperatur ble signifikant ved nivåer høyere enn 40°C, som resulterte i en forsiktig nedgang i total omega-3-innhold. Dette antas å være et resultat av den reduserte lipaseaktivitet ved for høye temperaturer. Omega-3-innhold av substratet kan økes over 32,5% med en temperatur på 40-50°C ved en 4-t reaksjon mens enzymmengden var 3% og vektforholdet mellom olje- og vannfasene var lik 1.
Figur 6 viser responsoverflateplot som indikerer effekten av enzymmengde og vann-til-olje-forhold på EPA/DHA-nivå, mens de to andre faktorer holdes fast i deres laveste nivåer, siden økning av begge disse faktorer resulterte i en redusert respons. Ingen av kombinasjonene i designområdene resulterte i en tilsvarende EPA/DHA-verdi men den for lakseolje, som var 0,7. Hydrolysegrad øker med økende vann-til-olje-forhold, på grunn av tilgjengelig interfase mellom substratene. EPA er mer utsatt for hydrolyse sammenlignet med DHA, som er avbildet med redusert EPA/DHA-nivå ved vann-til-olje-forhold høyere enn 3. Imidlertid, siden den lineære effekt av enzymmengde er langt mer signifikant enn den av vann-til-olje-forhold, var EPA/DHA-responsen sterkt avhengig av mengden enzym. Ved å øke enzymmengden ble reaksjonshastigheten forsterket, noe som resulterte i hurtigere hydrolyse av EPA, og således reduserte EPA/DHA-verdien. EPA/DHA-verdi kunne opprettholdes over 0,55 med 2-5 vann-til-olje-forhold og 3-6% enzymmengde ved en 4-t-reaksjon ved 30°C.
Respons overflateplot representerende interaksjonseffekten av enzymmengde og vann-til-olje-forhold på OA/total omega-3, mens temperatur og tid holdes fast ved deres laveste nivåer, er gitt i Figur 7. Det høyeste nivå for responsen ble oppnådd idet enzymmengden var 3%, og ble redusert idet mengden av enzym økte. Dette resultat skyldes en høyeste tilgjengelighet av enzym i medium, og således, redusert selektivitet av hydrolytisk reaksjon, resulterende i hydrolyse av omega-3 PUFA og likeledes OA. Videre, FA-selektiviteten av Candida rugosa lipase antas å være påvirket av øket FFA-innhold i medium ved forhøyet innhold av vann, som et resultat av den økte hydrolytiske hastighet og likeledes den samtidige esterifisering av frigjort FFA, som var OA i foreliggende tilfelle. Disse fenomener vil også føre til redusert OA/total omega-3-nivå idet vannet i medium var mer enn 3 ganger olje. En rimelig selektiv prosess, med et OA/total omega-3-nivå i FFA-fraksjonen over 9, kan oppnås med en 4-timers reaksjon katalysert med 3-4% lipase med 2,4-5 ganger vann basert på olje ved 30°C.
Optimalisering av reaksjonsbetingelser og storskalaprosessering
En x<2->test som benytter fem ytterligere eksperimentelle sett valgt fra de gitte områder av reaksjonsbetingelsene ble utført for å undersøke presisjonen i modellene som er etablert (Tabell 4). x<2->testen for total omega-3, EPA/DHA, og OA/total omega-3-responser indikerte at der var ingen signifikante (P<0,05) forskjeller mellom de observerte og predikerte verdier siden x<2->verdiene var lang lavere enn cutoff-punktet (9,488) ved a = 0,05 og frihetsgrad = 4. Således, modellene ble vist å være prediktive for responsene.
Storskalahydrolyse ble utført ved å selektere reaksjonsbetingelser slik at alle responsene som ble undersøkt ble predikert til å være maksimale (Tabell 4). Analysene av produktet bekreftet at modellene fremdeles var prediktive idet reaksjonene var skalert opp med~67 ganger. Det finale produkt inneholdt 33,32% total omega-3 PUFA-innhold med et EPA/DHA-nivå på 0,49, og hydrolysene var rimelig selektive som avbildet med det høye (7,96)-nivå av OA/total omega-3 i FFA-fraksjonen.
Konklusjoner
Candida rugosa lipase, som et eksempel som representerer lipaser som selektivt hydrolyserer mettede og monoumettede fettsyrer bundet til nevnte acylglyseroler og diskriminerer i sin hydrolytiske aktivitet mot omega-3 polyumettede fettsyrer, øker signifikant innholdet av omega-3 PUFA i substratet. Ved vurdering av totalt innhold av omega-3 PUFA, og likeledes forholdet mellom disse (EPA/DHA) i produktet og forholdet av totalt OA til total omega-3 PUFA frigjort med hydrolysen, ble optimale betingelser valgt som følger: 45°C temperatur, 4 timers tid, 3% lipase (basert på oljemengde), 3,16 ganger vann (vekt/vekt, basert på oljeinnhold). Totalt omega-3 PUFA-innhold i produktet som ble oppnådd ved gitte betingelser ble øket fra 13,77% til 33,01%. EPA/DHA-forhold var akseptable (0,48), mens forholdet OA til total omega-3 PUFA i FFA-fraksjonen var signifikant høyt (9,53). Applisering av optimale betingelser til en storskalaproduksjon resulterte også i lignende resultater, noe som bekrefter anvendeligheten av de genererte modeller for en industriell prosess i samsvar med foreliggende oppfinnelse.
Således har søker overraskende vært i stand til å vise at følgende kombinasjon av prosessparametere er spesielt effektivt i omega-3 PUFA konsentrasjonsprosessen i en industriell skala: 1) Temperatur - inkuberingstemperatur mellom 30 og 50°C, fortrinnsvis mellom 40 og 50°C.
2) Lipasekonsentrasjon:
- lipase tilsatt i en konsentrasjon av minst 3-5,5 vekt% basert på mengde olje. 3) Vann-olje-forhold - et vann-olje-forhold på 2-5:1.
4) Reaksjonstid
- reaksjonstiden bør være minst 2 timer, fortrinnsvis i området 2-8 timer.
Den mest optimale og foretrukne prosess for å konsentrere omega-3 fettsyrer i oljer, spesielt i en storskalaprosess anvender følgende betingelser:
- lipasen tilsettes i en konsentrasjon på minst 3 vekt% basert på mengde olje,
- inkuberingstemperaturen er ca. 45°C.
- vann-til-olje-forholdet er ca. 3,16:1 (vol/vekt),
- inkuberingstiden er mellom 2 timer og 4 timer.
Det er foretrukket at lipasen er fra Pseudomonas, Candida, Rhizopus eller Rhizomucor. Fortrinnsvis lipase fra Candida rugosa, Burkholderia cepacia og Rhizopus oryzae, imidlertid er den mest foretrukne lipasen fra Candida rugosa. De undersøkte lipaser tilhører gruppen lipaser som selektivt hydrolyserer mettede og monoumettede fettsyrer bundet til nevnte acylglyseroler og diskriminerer i deres hydrolytiske aktivitet mot omega-3 polyumettede fettsyrer. Selv om optimaliserings-forsøket har blitt basert på lipasen fra Candida rugosa som den mest lovende representative for denne gruppe, er det antatt at optimaliseringsbetingelsene også vil være nyttige i lipasekatalysert omega-3 fettsyreanrikingsprosesser med andre lipaser som tilhører denne gruppe.
Prosessen er spesielt egnet idet det anvendes en industrielt appliserbar storskalaprosess på grunn av dets milde og samtidig kostnads- og tidseffektive egenskaper. Eksperiment 3: Lipasekatalysert hydrolyse av fiskeolje fra forskjellige kilder Lakseolje oppnådd i samsvar med den enzymatiske prosess beskrevet av Sorensen et al. (2004) involverer hydrolyse av biprodukter med et proteaseenzym, pelagisk olje oppnådd fra sild ( Clupea harengus) og to typer kommersielt tilgjengelig fiskeoljer (fra EPAX, Norge) ble hydrolyser! ved anvendelse av Candida rugosa lipase i samsvar med de foretrukne betingelser i eksperiment 2 (3% lipase, inkuberingstemperatur 45°C, vann-til-olje-forhold på ca. 3,16:1 (vol/vekt), og inkuberingstid på 4 timer). Fettsyresammensetninger av substrater er gitt i tabell 5.
Lipasekatalysert hydrolyse
Tre gram olje og 9,5 ml destillert vann ble plassert i en forseglet dobbelvegget glassreaktor på 25 ml volum og oppvarmet til 45°C under omrøring ved 300 rpm. Etter at substratene nådde reaksjonstemperaturen, ble lipase (3 vekt% basert på mengde olje) tilsatt for å initiere reaksjonen. Prøver ble periodevis tatt for analyse.
Lipidklasseanalyse med TLC-FID
20 ul prøve ble oppløst i 800 ul kloroform:metanol (2:1, vol/vol) og analysert med tynnsjiktkromatografi koblet med en flammeioniserende detektor (TLC-FID) for å kvantifisere lipidklassene (triacylglyseroler, TG; diacylglyseroler, DG; monoacylglyseroler, MG; frie fettsyrer, FFA).
Fettsyre metylester analyser med GC
100 ul prøve ble blandet med 1 ml etanol og 1 ml destillert vann. Acylglyserolfraksjon ble ekstrahert to ganger med 2 ml heksan og FFA ble forsåpet ved tilsetning av 0,5 ml 0,5 M etanolisk KOH. Den etanoliske vannfase ble surgjort med 0,3 ml 2 M HCI, og FFA-fraksjonen ble ekstrahert med heksan tilsvarende. TLC-FID-analyser bekreftet at alle FFA var reservert i FFA-fraksjonen mens TG, DG og MG ble kombinert i acylglyserolfraksjonen. Fraksjoner ble metylert i samsvar med AOCS-metoden Ce-1b 89 og analysert med gasskromatografi (GC) etter tilsetning av indre standard (17:0).
Resultater
Tidsforløpet for hydrolyse av fiskeoljer er gitt i Figur 8. Detaljert informasjon om reaksjonsproduktene er gitt i Tabeller 6 og 7. Den høyeste økning i omega-3 PUFA-innhold ble oppnådd i lakseolje. Verdien økte fra 16,36% til 38,71%, som korrespon-derer til en~2,4 ganger økning. Optimaliserte reaksjonsbetingelser resulterte i en
~1,75 gangers økning av omega-3 PUFA i den pelagiske olje. Hydrolysehastigheten ble observert til å være lavere for pelagisk olje enn for lakseolje som angitt med den langsommere økning i FFA-nivå (Tabell 6). Siden EPAX 1050 allerede har et svært høyt innhold av omega-3 PUFA, var enzymet ikke i stand til å katalysere hydrolyse i et signifikant nivå (Tabell 7). Omega-3 PUFA-innholdet av EPAX 3000 ble øket fra
36,54% til 52,25% for de optimaliserte betingelser (a~1,43-gangers økning). Tilsvarende, høyt innledende innhold av omega-3 PUFA resulterte i lavere hydrolyse, og således lavere konsentrasjon (Tabell 7).
EPA/ DHA- forhold av produktene
EPA/DHA-forholdet i lakseoljen var 0,67 innledningsvis (Tabell 8). Forholdet ble redusert til 0,44 ved slutten av 4 timers inkuberingsreaksjon. Det oppnådde EPA/DHA-forhold i foreliggende oppfinnelse vurderes å være tilfredsstillende for det tiltenkte formål og finale produkt til tross for en kort reaksjonstid som anvendt i foreliggende oppfinnelse. Det eneste substrat med et innledende EPA/DHA-forhold høyere enn 1 var EPAX 3000, som ikke ble redusert signifikant etter 41 reaksjon.
Tidligere forsøk for å konsentrere oljer som omfatter omega-3 har i hovedsak fokusert på en økning av det totale omega-3 PUFA-innhold og ikke et balansert EPA- og DHA-innhold. De beskrevne forsøk på å konsentrere omega-3 PUFA med lipase diskriminerte generelt ikke mellom EPA og DHA. Således, den lipase-katalyserte hydrolyse resulterte ofte i noe tap av EPA, dersom man ikke benyttet selektiv lipase så som fra Pseucfomonas-familien eller lipasen fra Candida rugosa ifølge foreliggende oppfinnelse.
Mekanismen som ligger til grunn for diskriminering mellom EPA og DHA av lipasene av Pseudomonas og Candida rugosa avhenger av strukturene til disse FAer. Molekylkonformasjon i c/s karbon-karbon-dobbeltbindinger i omega-3 PUFA, spesielt EPA og DHA, forårsaker sterisk hindring og resulterer i avbøyning av FA-kjedene, som bringer de terminale metylgrupper svært nær esterbindingene. På grunn av denne steriske hindringseffekt, kan ikke enzymatisk aktive seter nå esterkoblingen i disse FAer med deres glyserol backbones, som resulterer i beskyttelse av EPA og DHA fra lipasekatalysert hydrolyse. DHA, som har en dobbeltbinding mer, er mer resistent til hydrolyse sammenlignet med EPA. Således, EPA/DHA-forholdet reduseres under hydrolyse sammenlignet med utgangsmaterialet, som også beskrevet i litteraturen.
Søker var i stand til å vise at ved anvendelse av prosessparametere ifølge foreliggende oppfinnelse, kan tap av spesifikke omega-3 fettsyrer begrenses og en konsentrert olje med et balansert EPA/DHA-forhold kunne oppnås.
Med unntak av kommersiell EPAX 1050 olje som er en olje med en svært høy konsentrasjon av DHA, førte applisering av den optimaliserte prosess ifølge foreliggende oppfinnelse i en klar økning av DHA (mol % fettsyrer i acylglyserolfraksjonen) med en faktor på ca. 1,5 til ca. 2,8 og av EPA med en faktor i området av ca. 1,3 til ca. 1,8. I alle disse tilfeller var anrikningen med DHA høyere enn med EPA. Dette er gyldig både med hensyn til de forskjellige fiskeoljer og pelagisk olje. Således, fremgangsmåten i samsvar med foreliggende oppfinnelse var spesielt egnet og fordelaktig for forbedring av DHA-innholdet i oljen. Best spesifikke anrikningsresultater med hensyn til DHA og EPA ble oppnådd for lakseolje oppnådd fra oppdrettsfisk, som tidligere var foret med en diett med et redusert innhold av omega-3 PUFA og som derfor hadde et redusert innhold av omega-3 PUFA sammenlignet med fisk foret en diett som er høy på omega-3 fettsyrer.
Konsentreringsprosessen ifølge foreliggende oppfinnelse resulterte i en anriknings-faktor på ca. 2,4 i lakseolje for omega-3 PUFA, ca. 1,8 for pelagisk olje og 1,4 for kommersiell EPAX 3000 oljer. Dette støtter videre hensiktsmessigheten av fremgangsmåten for anriking av marine oljer, spesielt av lakseolje og pelagisk olje med et redusert innhold av omega-3 PUFA.
Eksperiment 4: Oppkonsentrering av lakseolje ved anvendelse av fremgangsmåten for storskalahydrolyse etterfulgt av en short path destillasjon av produktet
Materialer og metoder
Lakseolje fra biprodukter av oppdrettslaks ble produsert i samsvar med den patenterte enzymatiske prosess ifølge Sorensen et al (2004) som involverer hydrolyse av biprodukter med et proteaseenzym. Som i de tidligere eksperimenter ble en lipase fra Candida rugosa (64000 U/g) anvendt.
Lipasekatalysert hydrolyse
To hundre gram lakseolje og 632 ml destillert vann (ved 3,16 vann-til-olje-forhold) ble plassert i en forseglet dobbeltvegget glassreaktor på 1 I volum og oppvarmet til 45°C under 300 rpm omrøring. Etter at substratene hadde nådd reaksjonstemperaturen ble 6 g lipase (3 vekt% basert på oljemengde) tilsatt for å initiere reaksjonen. Reaksjonen foregikk i 31. Substrater og enzymblanding ble sentrifugert to ganger ved 10000 rpm i 15 min for å separere olje fra både vann og lipase. På grunn av tap under denne prosess endte sentrifugeringen opp med 169 g produkt.
Short path destillasjon
100 g produkt ble matet til en short path destillasjonsenhet (KDL 5, UIC GmbH, Tyskland) i en hastighet på 2 ml/min under 10"<3>mbar vakuum. Matetanken, kondensator og evaporator ble innstilt ved 35°C, 45°C og 145°C, respektivt. Både rest- og destillatfraksjoner ble samlet for lipid klasse- og fettsyresammensetnings-analyser.
Lipidklasseanalyser med TLC- FID
Lipidklasseanalyser med TLC-FID ble utført som beskrevet i eksperiment 3.
Fettsyremetylesteranalyser med GC
Fettsyremetylesteranalyser med GC ble utført som beskrevet i eksperiment 2.
Resultater
Short path destillasjon ga 36,9 g rest og 61,5 g destillat, av 100 g matet. Tap under renseprosessen var kun 1,6 vekt%. Lipidklassesammensetning av produkt og rest er illustrert i Figur 9. FFA-nivå ble redusert fra 66,83% til 1,98% i det finale produkt. Destillatet var sammensatt av 99,35% FFA og 0,65% MG (ikke vist).
Sammenligning av fettsyreprofiler av lakseolje (substrat i hydrolysen), rest og destillatfraksjoner er gitt i Figur 10 og Tabell 9. Total PUFA, sammensetning av EPA, DPA og DHA, ble øket med 2,3 ganger. Målfettsyren for fjerning, oljesyre, var sterkt konsentrert i destillatfraksjonen, men resten hadde fremdeles OA i et nivå på 18,69%. 63% av innledende EPA og 91% av innledende DHA ble fjernet i resten, mens 20% av innledende OA fremdeles finnes i denne fraksjon.
Eksperiment 5. Repetert hydrolyse i lakseolje
En repetert hydrolyse (andre hydrolyse) ble utført på resten oppnådd fra short path destillasjon.
Tre gram av resten oppnådd fra Eksperiment 4 ble underlagt en ytterligere hydrolyse under de samme reaksjonsbetingelser som i den første hydrolyse. Reaksjonen fikk fortsette inntil FFA-nivået var tilnærmet 40%.
Resultater
Figur 11 sammenligner forandringene i FA-innhold i acylglyseroler og i FFA-fraksjoner oppnådd med et enkelt trinn og repetert hydrolyse gjennom reaksjonene. En sammenligning av innhold av hoved-FAer i substrat- og hydrolyseprodukter er gitt i Tabell 10. Totalt omega-3 PUFA-innhold ble ytterligere konsentrert til 50,58% med repetert hydrolyse. På den andre side, tap av omega-3 PUFA til FFA-fraksjonen økte også (Figur 11). På grunn av den reduserte tilgjengelighet av SFA og MUFA, ble DHA hydrolyser! til en viss grad i den andre hydrolyserunde, som resulterte i et øket omega-3 PUFA-innhold i FFA-fraksjonen oppnådd etter repeter! hydrolyse. Konsen-trasjonen som ble oppnådd var imidlertid mer enn 3 ganger det opprinnelige nivå. Således, tilleggsverdien av produktet ble ytterligere forbedret med repeter! hydrolysetilnærming.
Selv om forsøket som anvender optimaliserte betingelser i repeter! hydrolyse har blitt basert på lipase fra Candida rugosa som det mest lovende representative eksempel fra gruppen, så er det forventet at repetert hydrolyse under optimaliserte betingelser også vil være nyttig i lipasekatalysert omega-3 fettsyreanrikningsprosesser med andre lipaser som tilhører denne gruppe.
Definisjoner av termer og forkortelser:
DHA - dokosaheksaensyre (22:6 n-3)
DPA - dokosapentaensyre (22:5 n-3)
DG - diacylglyseroler
EPA - eikosapentaensyre (20:5 n-3)
FA - fettsyre
FFA - frie fettsyrer
MG - monoacylglyseroler
MUFA - monoumettet fettsyre
PUFA - polyumettet fettsyre
SFA - mettet fettsyre
TG - triacylglyseroler
Total omega-3 PUFA - refererer til summen av EPA, DPA og DHA
Fiskeolje - med fiskeolje menes en olje som har sitt opphav fra fisk som omfatter omega-3, polyumettede fettsyrer så som EPA og/eller DHA og/eller DPA.
Pelagisk olje - med pelagisk olje menes en olje som har sitt opphav fra en pelagisk fisk så som fra sild (Clupea harengus), hvor råmaterialet (for eksempel viscera etter filetering) prosesseres med en kjent fiskemel/fiskeolje-produksjonsmetode uten enzymatisk behandling.
Marin olje - med marin olje menes en fiskeolje eller oljer produsert fra andre dyr eller planter eller oljer produsert av mikroorganismer så som bakterier eller alger, som omfatter polyumettede fettsyrer så som EPA og/eller DHA og/eller DPA.
Marin/fiskeoljekonsentrat - med et oljekonsentrat menes en olje hvor mengden av omega-3 fettsyrer i acylglyserolfraksjonen av oljen har blitt øket (anriket, oppgradert, oppkonsentrert) i forhold til den totale mengde fettsyrer som utgjøres i nevnte acylglyserolfraksjon ved hjelp av en oppkonsentreringsprosess.
Lipase som diskriminerer i sin aktivitet mot visse fettsyrer - ved å diskriminere i sin aktivitet mot visse fettsyrer så som omega-3 fettsyrer menes at lipasen har en negativ selektivitet (eller lavere substrataffinitet) mot disse fettsyrer og fortrinnsvis hydrolyserer andre fettsyrer bundet i acylglyseroler, for eksempel de som ikke er omega-3 fettsyrer så som mettede og monoumettede fettsyrer.
Referanser
Sorensen S, Sandnes K, Hagen H, Pedersen K, 2004. Apparatus and method for hydrolysis of a protein containing raw material and application of the resulting hydrolysis products. (se også Europeisk Patent EP 1 575 374 B1).
Tanaka Y, Funada T, Hirano J, Hashizume R. Triglyceride specificity of Candida cylindraæa lipase - effect of docosahexaenoic acid on resistance of triglyceride to lipase. J Am Oil Chem Soc 1993; 70: 1031-4.
Claims (26)
1. Fremgangsmåte for å oppkonsentrere omega-3 polyumettede fettsyrer i acylglyseroler i en olje med lipasekatalysert hydrolyse, hvor
oljen blandes med en vandig løsning,
en lipase, som selektivt hydrolyserer mettede og monoumettede fettsyrer bundet til nevnte acylglyseroler og diskriminerer i sin hydrolytiske aktivitet mot omega-3 polyumettede fettsyrer, tilsettes til olje-vann-blandingen i en konsentrasjon på 3-5,5 vekt% basert på mengde olje.
2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, hvor
fraksjonene av frie fettsyre og acylglyserol separeres etter hydrolysen, og den lipase-katalyserte hydrolyse av acylglyserolfraksjonen repeteres.
3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2, hvor lipasen er en mikrobiell lipase, fortrinnsvis fra en art valgt blant Pseudomonas, Candida, Rhizopus, og Rhizomucor.
4. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor lipasen er valgt blant Candida rugosa, Burkholderia cepacia og Rhizopus oryzae
5. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor inkuberingstemperaturen i den lipasekatalyserte hydrolyse er i området av ca. 30-50°C.
6. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav,karakterisert vedat vann-til-olje-forholdet i den lipasekatalyserte hydrolyse er i området 2:1 til 5:1 (vol/vekt).
7. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor inkuberingstiden i den lipasekatalyserte hydrolyse er mellom 2 timer og 8 timer.
8. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor nevnte omega-3 polyumettede fettsyrer er valgt blant DHA, EPA og/eller DPA.
9. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor nevnte lipase diskriminerer i sin aktivitet mellom EPA og DHA.
10. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor hydrolysebetingelsene er som følger: vann-til-olje-forholdet er i området 2:1 til 5:1 (vol/vekt), inkuberingstemperaturen er i området av ca. 30-50°C, og inkuberingstiden er mellom 2 timer og 4 timer.
11. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor lipasen tilsettes i en konsentrasjon på ca. 3 vekt% basert på mengde olje, og hydrolysebetingelsene er som følger: inkuberingstemperaturen er ca. 45°C, vann-til-olje-forholdet er ca. 3:1 (vol/vekt), inkuberingstiden er mellom 2 og 4 timer.
12. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor lipasen tilsettes i en konsentrasjon på ca. 3-4 vekt% basert på mengde olje, og hydrolysebetingelsene er som følger: inkuberingstemperaturen er ca. 30°C, vann-til-olje-forholdet er i området ca. 2,5-5:1 (vol/vekt), inkuberingstiden er ca. 4 timer.
13. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor nevnte olje som skal oppkonsentreres er en marin olje oppnådd fra en fisk, et skalldyr, en bakterie, en makroalge og/eller en mikroalge.
14. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor oljen oppnås fra én eller flere fiskearter valgt blant Salmonids, Gadoids, Clupeids, Scromboids, og Elasmobranchs, som kan være villfanget eller kan være oppdrettsfisk.
15. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor oljen er fra et oppdrettsmarindyr, som omfatter en redusert mengde omega-3 polyumettede fettsyrer sammenlignet med en olje oppnådd fra samme villart.
16. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor oljen har et innhold av polyumettede fettsyrer på ikke mer enn 16 mol % ved start av oppkonsentreringsprosessen.
17. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1 -16, hvor acylglyserolfraksjonen som omfatter den oppkonsentrerte omega-3 polyumettede fettsyrer separeres fra de frie fettsyrer etter den enzymatiske hydrolyse, fortrinnsvis ved anvendelse av en short path destillasjon.
18. Fremgangsmåte i samsvar med krav 17, hvor separasjonsprosessen omfatter følgende trinn: - separering av olje- og vannfase med sentrifugering, og - mating av oljefasen til en short path destillasjonsenhet i en hastighet på 2 ml/min under 10"<3>mbar vakuum, hvor matetanken innstilles ved 35°C, kondensatoren ved 45°C og evaporatoren ved 145°C.
19. Marint oljekonsentrat som har et anriket innhold av omega-3 polyumettede fettsyrer i acylglyserolfraksjonen som kan oppnås med en fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1 -18.
20. Marint oljekonsentrat som har en anriket innhold av omega-3 polyumettede fettsyrer i acylglyserolene, hvor minst 33 mol % av fettsyrene i acylglyserolene er omega-3 polyumettede fettsyrer og EPA/DHA-forholdet er 0,4 eller mer.
21. Marint oljekonsentrat i samsvar med krav 18, hvor minst 55 mol% av fettsyrene i acylglyserolene er omega-3 polyumettede fettsyrer og EPA/DHA-forhold er 0,3 eller mer.
22. Marint oljekonsentrat i samsvar med et av kravene 19-21, hvor oljen er en fiskeolje, fortrinnsvis fra en salmonid i oppdrett.
23. Marint oljekonsentrat i samsvar med krav 22, hvor DHA-innholdet i acylglyserolene har øket med en faktor på minst 2,5 i en lipasekatalysert omega-3 konsentreringsprosess som har ett hydrolysetrinn, og med en faktor på minst 3,9 i en repetert hydrolyse.
24. Marint oljekonsentrat i samsvar med et av kravene 19-23, hvor EPA-innholdet i acylglyserolene er øket med en faktor på minst 1,5 i en lipasekatalysert omega-3 konsentreringsprosess som har ett hydrolysetrinn, og med en faktor på minst 2 idet hydrolysen repeteres.
25. Marint oljekonsentrat i samsvar med et av kravene 19-24, hvor innholdet av polyumettede fettsyrer i acylglyserolene er øket med en faktor på minst 2,4 i et lipasekatalysert oppkonsentreringstrinn som har ett hydrolysetrinn og med en faktor på minst 3 i en repetert hydrolyse.
26. Anvendelse av et marint oljekonsentrat i samsvar med et av kravene 19-25, som en ingrediens for et for, et funksjonelt for, et helseprodukt, en kosmetikksammensetning, eller en farmasøytisk sammensetning.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20101800A NO20101800A1 (no) | 2010-12-23 | 2010-12-23 | Metode for anrikning av marin olje |
| PCT/NO2011/000354 WO2012087153A1 (en) | 2010-12-23 | 2011-12-22 | Enrichment of marine oils with omega-3 polyunsaturated fatty acids by lipase-catalysed hydrolysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20101800A NO20101800A1 (no) | 2010-12-23 | 2010-12-23 | Metode for anrikning av marin olje |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20101800A1 true NO20101800A1 (no) | 2012-06-25 |
Family
ID=46584529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20101800A NO20101800A1 (no) | 2010-12-23 | 2010-12-23 | Metode for anrikning av marin olje |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO20101800A1 (no) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11872201B2 (en) | 2018-06-21 | 2024-01-16 | Nuseed Nutritional Us Inc. | DHA enriched polyunsaturated fatty acid compositions |
-
2010
- 2010-12-23 NO NO20101800A patent/NO20101800A1/no not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11872201B2 (en) | 2018-06-21 | 2024-01-16 | Nuseed Nutritional Us Inc. | DHA enriched polyunsaturated fatty acid compositions |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | From microalgae oil to produce novel structured triacylglycerols enriched with unsaturated fatty acids | |
| RU2151788C1 (ru) | Рафинирование масляных композиций | |
| JP5204776B2 (ja) | Ｅｐａ濃縮油およびｄｈａ濃縮油の製造方法 | |
| WO2012087153A1 (en) | Enrichment of marine oils with omega-3 polyunsaturated fatty acids by lipase-catalysed hydrolysis | |
| DK2006389T3 (en) | Process for preparing concentrated polyunsaturated fatty acid oil | |
| EP2585570B1 (en) | Process for separating polyunsaturated fatty acids from long chain unsaturated or less saturated fatty acids | |
| Diao et al. | Preparation of diacylglycerol from lard by enzymatic glycerolysis and its compositional characteristics | |
| Chakraborty et al. | Preparation of eicosapentaenoic acid concentrates from sardine oil by Bacillus circulans lipase | |
| KR20130111233A (ko) | 리파아제에 의한 고도 불포화 지방산 함유 유지의 제조 방법 | |
| CA2685272A1 (en) | A polyunsaturated fatty acid (pufa) enriched marine oil comprising eicosapentaenoic acid (epa) and docosahexaenoic acid (dha), and a process of production thereof | |
| JP7365346B2 (ja) | リパーゼ加水分解反応を用いる高度不飽和脂肪酸含有グリセリドの製造方法 | |
| Aarthy et al. | A two step process for production of omega 3-polyunsaturated fatty acid concentrates from sardine oil using Cryptococcus sp. MTCC 5455 lipase | |
| JP5416861B2 (ja) | リパーゼによる高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法 | |
| Chen et al. | Enzymatic production of ABA-type structured lipids containing omega-3 and medium-chain fatty acids: effects of different acyl donors on the acyl migration rate | |
| Kamoun et al. | Fusarium verticillioides as a single-cell oil source for biodiesel production and dietary supplements | |
| Kahveci et al. | Upgrading of farmed salmon oil through lipase-catalyzed hydrolysis | |
| US20080248187A1 (en) | Mixture containing fatty acid glycerides | |
| Nagao et al. | Purification of conjugated linoleic acid isomers through a process including lipase-catalyzed selective esterification | |
| JP6175198B2 (ja) | Ｄｈａ含有グリセリド含有組成物の製造方法 | |
| Li et al. | Simultaneous preparation of edible quality medium and high purity diacylglycerol by a novel combined approach | |
| Li et al. | Preparation of highly pure n-3 PUFA-enriched triacylglycerols by two-step enzymatic reactions combined with molecular Distillation | |
| JP5753963B1 (ja) | 低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法および低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物 | |
| CA2751870A1 (fr) | Procede de production d'ester d'acide ricinoleique par transesterification enzymatique selective | |
| Baik et al. | Enrichment of stearidonic acid from echium oil via a two‐step lipase‐catalyzed esterification | |
| NO20101800A1 (no) | Metode for anrikning av marin olje |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC2A | Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application |