TW202110469A - 佛手柑發酵汁液用於製備改善皮膚老化組合物的用途 - Google Patents
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Abstract
一種佛手柑發酵汁液的用途，其用於製備一組合物。此組合物具有下列一種或多種功能：抑制黑色素、抗醣化以及減少膠原蛋白分解。並且，此佛手柑發酵汁液是由一佛手柑浸提液與及複數菌種進行一發酵所得。
Description
本發明是關於佛手柑發酵汁液，特別是關於佛手柑發酵汁液用於製備改善皮膚老化組合物的用途。
紫外線(UV)是造成皮膚老化的因素之一，其依波長可分為長波紫外線(UVA)、中波紫外線(UVB)、及短波紫外線(UVC)。已知，長波紫外線(UVA)、中波紫外線(UVB)可穿透皮膚的真皮層而對皮膚造成傷害，經常暴露於這些UV輻射下將引起皮膚黑色素生成、膠原蛋白流失而造成皮膚老化。
另一種造成皮膚老化的因素為醣化作用，其係指在無酵素的情況下，糖分子附加至蛋白質或脂質的緩慢化學反應，其最終生成醣化終產物(advanced glycated end products，AGEs)。醣化作用會影響膠原蛋白聚集形成纖維，而且醣化的膠原蛋白纖維變得僵硬而易脆，這些因素最終促成皮膚老化。
自有機及天然的飲食概念興起後，生技公司及食品業者積極投入關於天然植物的相關產品之研發。為使植物相關產品對身體健康助益有科學驗證的基礎，植物的活性成分分析及功效評估成為產品開發的重點項目。
有鑑於此，開發一種既提升多方改善皮膚老化的天然植物性新穎組合物，實有其必要。
本發明之目的為提供一種佛手柑發酵汁液的用途，其是用於製備用以改善肌膚老化的組合物，其中該佛手柑發酵汁液是由一佛手柑浸提液經由啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）及乙酸醋酸菌（Acetobacter aceti）進行一發酵所得。
在本發明的一實施例中，該改善肌膚老化為抑制黑色素、抗醣化或減少膠原蛋白分解或其組合。
在本發明的一實施例中，該抑制黑色素為減少黑色素瘤細胞株的自生黑色素及/或減少紫外光誘導黑色素瘤細胞株生成的黑色素。
在本發明的一實施例中，該紫外光為UVA。
在本發明的一實施例中，該減少膠原蛋白分解為抑制基質金屬蛋白酵素9(MMP9)之含量。
在本發明的一實施例中，該啤酒酵母相對於該佛手柑浸提液之添加量為0.01%-0.5%(v/v)，該乾酪乳桿菌相對於該佛手柑浸提液之添加量為0.01%-0.25%(v/v)，該乙酸醋酸菌相對於該佛手柑浸提液之添加量為1%-15%(v/v)。
在本發明的一實施例中，該發酵的時間為4-8天。
在本發明的一實施例中，該佛手柑發酵汁液的有效濃度為至少為2.5%(v/v)。
在本發明的一實施例中，該佛手柑發酵汁液的糖度為40±2。
綜上所述，根據本發明任一實施例的佛手柑發酵汁液，其可製備改善肌膚老化的組合物。換言之，前述之組合物具有下列一種或多種功能：抑制黑色素、抗醣化以及減少膠原蛋白分解。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t
檢驗（student'st
-test）進行分析。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。
關於本文中所使用之濃度符號「%」通常是指重量百分濃度，而濃度符號「vol%」通常是指體積百分濃度。
關於本文中所使用之「佛手柑」通常是指佛手柑果實。
佛手柑（Citrus medica var. sarcodactylis ），又名佛手果、佛手、五指柑，是柑橘屬枸櫞種的變種。佛手柑原產於中國、印度等亞洲地區。
依據本發明，有關微生物發酵反應的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，佛手柑發酵汁液是由佛手柑浸提液與及複數菌種進行一發酵所得。其中，在發酵過程中，相對於佛手柑浸提液，此些菌種包括0.01%-0.5%(v/v)的啤酒酵母、0.01%-0.25%(v/v)的乾酪乳桿菌及1%-15%的乙酸醋酸菌。
在一些實施例中，啤酒酵母可以是Saccharomyces cerevisiae，購自BCRC，寄存編號BCRC20271。在一些實施例中，乾酪乳桿菌可以Lactobacillus casei，購自BCRC，寄存編號BCRC910882。在一些實施例中，乙酸醋酸菌可以是Acetobacter aceti，購自BCRC，寄存編號BCRC11688。
在一些實施例中，在發酵程序中，先添加0.01%-0.5%(v/v)的啤酒酵母以及0.01%-0.25%(v/v)的乾酪乳桿菌至佛手柑浸提液內，並將佛手柑浸提液與啤酒酵母與乾酪乳桿菌進行發酵2日至5日以形成第一初發酵汁液。換言之，0.01%-0.5%的啤酒酵母以及0.01%-0.25%(v/v)的乾酪乳桿菌與佛手柑浸提液混合成的第一混合液進行發酵2日至5日以形成第一初發酵汁液。在一些實施例中，第一混合液是在28℃-37℃下進行發酵。
於第一初發酵汁液形成後，再添加1%-15%(v/v)乙酸醋酸菌至第一初發酵汁液內，並將第一初發酵汁液與乙酸醋酸菌進行發酵2日至5日以形成第二初發酵汁液。換言之，1%-15%(v/v)乙酸醋酸菌與第一初發酵汁液混合成的第二混合液進行發酵2日至5日以形成第二初發酵汁液。在一些實施例中，第二混合液是在28℃-37℃下進行發酵。
於第二初發酵汁液形成後，過濾第二初發酵汁液以得到佛手柑發酵汁液。在第一示範例中，第二初發酵汁液的過濾步驟包括以200目數至400目數的網孔的濾網過濾第二初發酵汁液。在第二示範例中，第二初發酵汁液的過濾步驟包括在40℃至70℃下減壓濃縮及以200目數至400目數的網孔的濾網過濾第二初發酵汁液。在第三示範例中，第二初發酵汁液的過濾步驟包括在40℃至70℃下減壓濃縮及以200目數至400目數的網孔的濾網過濾第二初發酵汁液以得到一發酵原液，以及調整發酵原液的糖度（Degrees Brix）以形成佛手柑發酵汁液。
在一些實施例中，可透過添加55%-70%的賦形劑（excipient）來調整發酵原液的糖度。在一些實施例中，用以調整糖度的賦形劑可為異麥芽寡糖。
在一些實施例中，佛手柑發酵汁液的pH值為3.7±1.0，且佛手柑發酵汁液的糖度為40±2。
在一些實施例中，佛手柑浸提液是將敲碎後的佛手柑顆粒佛手柑與水以1：8-15的重量比例混合，再於80℃-95℃下浸提1小時以得到。在第一示範例中，佛手柑浸提液是由選自於台灣來源之佛手柑與水以1：8-15的重量比例混合，添加葡萄糖溶液將糖度調整為9，再於80℃-95℃下浸提1小時所得到。
在一些實施例中，原料混合液的滅菌程序可為將原料混合液在80℃至100℃下滅菌0.2小時至1小時，並將滅菌後的原料混合液冷卻至室溫（即25℃至30℃）以形成佛手柑發酵汁液。在一些實施例中，滅菌後的原料混合液可採取自然降溫的方式冷卻至室溫。
在一些實施例中，佛手柑發酵汁液具有改善肌膚老化之作用。在一些實施例中，改善肌膚老化可為抑制黑色素、抗醣化以及減少膠原蛋白分解或其組合。
除非文中有另外說明，於本說明書中所謂「肌膚」，係指一個體的肌膚，例如臉部肌膚或臉部之外部位的肌膚；所謂「肌膚老化」係指一個體受到外界因子或內在因子所導致的肌膚老化，外界因子可為紫外光、飲食習慣、作息習慣；內在因子可為壓力，肌膚老化可指任何型態的肌膚機能下降，包括肌膚暗沉、肌膚膠原蛋白流失；所謂「個體」係指哺乳動物，該哺乳動物可以係人類或非人動物（例如：狗、貓）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的佛手柑發酵汁液。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服地、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）、或含有醇的水性溶液（alcohol containing aqueous solution ）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用組合物。換言之，食用組合物包含特定含量的佛手柑發酵汁液。在一些實施例中，前述之食用組合物可為食品產品或食品添加物（food additive）。在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）或膳食補充品（dietary supplements）。
在一些實施例中，前述之食用組合物可以口服方式施予受體。其中，食用組合物的型態可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為化妝品或保養品。換言之，化妝品或保養品包含特定含量的佛手柑發酵汁液。
在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可為下列任一種型態：化妝水、凝膠、凍膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉餅、蜜粉、卸妝油、卸妝乳、洗面乳、沐浴乳、洗髮精、護髮乳、防曬乳、護手霜、指甲油、香水、精華液及面膜。在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可視需要更包含外用品可接受成分。在一些實施例中，外用品可接受成分可例如為乳化劑、滲透促進劑、軟化劑、溶劑、賦型劑、抗氧化劑、或其組合。
實施例一：佛手柑發酵汁液的製備
首先，將採購自台灣嘉義的的佛手柑敲碎成佛手柑顆粒後與水以1:10的重量比（即，佛手柑為一倍重量，水為十倍重量）的比例混合均勻成佛手柑基液。接著，添加葡萄糖溶液將佛手柑基液的糖度調整為9.0°Bx，接著，將佛手柑基液於95℃下浸提1小時，得到佛手柑浸提液。
接著，於佛手柑浸提液中同時殖入0.1%啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（BCRC，寄存編號BCRC20271），以及0.05%的乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）（購自BCRC，寄存編號BCRC910882），並在約30℃下發酵3天，以得到第一初發酵汁液。接著，於第一初發酵汁液中殖入10%乙酸醋酸菌（Acetobacter aceti）（購自BCRC，寄存編號BCRC11688）並在約30℃下發酵3天，以得到第二初發酵汁液。
再將第二初發酵汁液在約60℃下進行減壓濃縮，並以目數200的網孔的濾網過濾，以得到發酵原液。最後，添加60%異麥芽寡糖至發酵原液後在約100℃下滅菌2小時，以得到佛手柑發酵汁液。
於此，分別對佛手柑浸提液、發酵原液以及佛手柑發酵汁液進行糖度檢測。其中，佛手柑原料混合液的糖度約為9.0°Bx，發酵原液的糖度約為3.5°Bx，以及佛手柑發酵汁液的糖度約為40°Bx。
實施例二：佛手柑浸提液（無發酵）的製備
將佛手柑敲碎成佛手柑顆粒後，取1重量份的佛手柑顆粒及10重量份的水混合成佛手柑基液。接著，添加葡萄糖溶液將佛手柑浸提原液的糖度調整為9.0°Bx，接著，將佛手柑浸提原液於95℃下浸提1小時，得到佛手柑浸提液。於此實施例所致製備的佛手柑浸提液與實施例一所述的佛手柑浸提液本質上相同，皆未經過發酵處理。
實施例三：評估佛手柑發酵汁液對於自生黑色素累積的調控
於此，所使用培養基為添加有10體積%胎牛血清蛋白（fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco）及1體積%盤尼西林-鏈黴素（penicillin/streptomycin，品牌：Gibco）的DMEM培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium；品牌：Gibco），以下稱基礎培養基。所使用的細胞株為小鼠黑色素瘤細胞株B16F10（購自美國典型培養物保存中心（ATCC），編號CRL-6475），以下稱B16F10細胞。
將B16F10細胞以每孔1.5×105
個細胞的細胞數接種於含有3mL基礎培養基的6孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養24小時。
在培養24小時後，將B16F10細胞分成4個組別：二個實驗組（實驗組A、實驗組B）、一個對照組以及一個控制組。移除各組別的基礎培養基，並更換成每孔3mL實驗培養基，然後置於37°C下接續培養48小時。其中，實驗組A的實驗培養基為含有0.25體積%實施例二所製備的佛手柑浸提液（未發酵處理）的基礎培養基。實驗組B的實驗培養基為含有0.25體積%實施例一所製備的佛手柑發酵汁液的基礎培養基。對照組的實驗培養基為含有0.25體積%麴酸（kojic acid）的基礎培養基。控制組的實驗培養基為單純的基礎培養基（即不含佛手柑浸提液，不含佛手柑發酵汁液，也不含麴酸）。
於培養48小時後，移除各孔中的實驗培養基並以1倍（1x）的磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS，品牌：Gibco）潤洗二次。於沖洗後，將胰蛋白酶（trypsin）加入至各孔中以處理細胞3分鐘。於3分鐘處理後，將各孔的懸浮的細胞個別收集於15mL離心管中，接而以400xg離心5分鐘以分離細胞沉澱物（cell pellet）與上清液。透過1xPBS再懸浮細胞沉澱物及離心反覆進行二次後，以200μL的1xPBS再懸浮細胞沉澱物，以得到細胞溶液。接著，將細胞溶液於液態氮中放置10分鐘，接而於室溫下靜置30分鐘進行解凍。在解凍完全之後，各離心管以12,000xg離心30分鐘。於30分鐘離心後，移除各離心管中上清液並添加入120μL 1N NaOH（配於ddH2
O）以與各離心管中的沉澱物進行混合。在混合均勻之後，將含有混合溶液的各離心管於60℃乾浴槽中靜置1小時。之後，從各離心管中取100μL混合溶液至96孔培養盤中並於405nm的波長下以ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附法）讀取儀（廠牌：BioTek）來讀取96孔培養盤中各孔的吸光值（OD405
）。
於量測後，將所測得的吸光值代入下列公式（1）計算出黑色素含量相對百分比（%）。換言之，於此，是將控制組的黑色素含量視為1（即控制組的黑色素含量相對百分比為100%）來計算各組別的相對黑色素含相對百分比（%）。並且，各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗（student t-test）來統計分析，如圖1所示。在圖1中，「*」代表在與控制組比較下其p值小於0.05，「**」代表在與控制組比較下其p值小於0.01，「###」代表在與實驗組A比較下其p值小於0.001。
公式（1）
黑色素含量相對百分比（%）＝(OD405 sample
/OD405 control
)×100% （1）
請參照圖1。相較於控制組，實驗組A的黑色素含量相對百分比為106.16%，實驗組B的黑色素含量相對百分比為82.79%，而對照組的黑色素含量相對百分比為90.58%。換言之，實驗組A的黑色素含量增加了6.16%，實驗組B降低17.71%的黑色素生成，而對照組降低9.42%的黑色素生成。於此，相較於控制組，實驗組A的黑色素含量反而上升，相較於控制組及對照組，以佛手柑發酵汁液作為實驗樣品的實驗組B的黑色素含量相對百分比均有顯著地降低。由此可知，相較於麴酸，佛手柑發酵汁液能更有效抑制自生黑色素生成。
基於此，佛手柑發酵汁液能用以抑制細胞自生黑色素生成，進而具有改善肌膚狀況、改善肌膚老化的作用。
實施例四：評估佛手柑發酵汁液對於UV所致的黑色素的累積調控
除了實施例三測試佛手柑發酵汁對於自生黑色素的調控外，此處更進一步測試佛手柑發酵汁對於UV光（紫外線）誘發黑色素的作用。
於此，所使用培養基為添加有10體積%胎牛血清蛋白（fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco）及1體積%盤尼西林-鏈黴素（penicillin/streptomycin，品牌：Gibco）的DMEM培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium；品牌：Gibco），以下稱基礎培養基。所使用的細胞株為小鼠黑色素瘤細胞株B16F10（購自美國典型培養物保存中心（ATCC），編號CRL-6475），以下稱B16F10細胞。
將B16F10細胞以每孔1.5×105
個細胞的細胞數接種於含有3mL基礎培養基的6孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養24小時。
在培養24小時後，將B16F10細胞分成4個組別：二個實驗組（實驗組A、實驗組B）、一個對照組以及一個控制組。移除各組別的基礎培養基，並更換成每孔3mL實驗培養基，然後將對照組及二個實驗組置於紫外線鏈結箱 (Cleaver Scientific；Cat. CL-508)以UVA照射（劑量8 J/cm2
）（控制組並未以UVA照射），接著將各組於37°C下接續培養48小時。其中，實驗組A的實驗培養基為含有0.25體積%實施例二所製備的佛手柑浸提液（未發酵處理）的基礎培養基。實驗組B的實驗培養基為含有0.25體積%實施例一所製備的佛手柑發酵汁液的基礎培養基。對照組及控制組的實驗培養基為單純的基礎培養基（即不含佛手柑浸提液，不含佛手柑發酵汁液）。
於培養24小時後，移除各孔中的實驗培養基並以1倍（1x）的磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS，品牌：Gibco）潤洗二次。於沖洗後，將胰蛋白酶（trypsin）加入至各孔中以處理細胞3分鐘。於3分鐘處理後，將各孔的懸浮的細胞個別收集於15mL離心管中，接而以400xg離心5分鐘以分離細胞沉澱物（cell pellet）與上清液。透過1xPBS再懸浮細胞沉澱物及離心反覆進行二次後，以200μL的1xPBS再懸浮細胞沉澱物，以得到細胞溶液。接著，將細胞溶液於液態氮中急凍30秒後，接而於室溫下靜置30分鐘進行解凍。在解凍完全之後，各離心管以14,000xg離心30分鐘。於30分鐘離心後，移除各離心管中上清液並添加入120μL 1N NaOH（配於ddH2
O）以與各離心管中的沉澱物進行混合。在混合均勻之後，將含有混合溶液的各離心管於60℃乾浴槽中靜置1小時。之後，從各離心管中取100μL混合溶液至96孔培養盤中並於405nm的波長下以ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附法）讀取儀（廠牌：BioTek）來讀取96孔培養盤中各孔的吸光值（OD405
）。
於量測後，將所測得的吸光值代入下列公式（2）計算出UVA造成的黑色素含量相對百分比（%），如圖2所示（圖2及公式（2）標示為「黑色素含量相對百分比」）。換言之，於此，是將控制組的黑色素含量視為1（即控制組的黑色素含量相對百分比為100%）來計算各組別的相對黑色素含相對百分比（%）。並且，各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗（student t-test）來統計分析。在圖2中，「###」代表在與控制組比較下其p值小於0.001，「**」代表在與對照組比較下其p值小於0.01，「***」代表在與對照組比較下其p值小於0.001，「※」代表在與實驗組A比較下其p值小於0.05。
公式（2）
黑色素含量相對百分比（%）＝(OD405 sample
/OD405 control
)×100% （2）
請參照圖2。相較於控制組，實驗組A的黑色素含量相對百分比為110.16%，實驗組B的黑色素含量相對百分比為100.00%，而對照組的黑色素含量相對百分比為120.85%。換言之，當以UVA處理後，對照組的黑色素含量相對百分比相較於控制組提高了20.85%，而實驗組A以UVA及佛手柑浸提液（未發酵處理）作共同處理後，實驗組A的黑色素含量相對百分比相較於控制組僅提高了10.16%，而實驗組以UVA及佛手柑發酵汁液共同處理後，實驗組B的黑色素含量相對百分比相較於控制組並無提高。由此可知，相較於對照組，實驗組A的UVA造成的黑色素生成有顯著地被抑制20.85%，代表佛手柑發酵汁液能有效抑制UVA造成的黑色素生成。
基此，佛手柑發酵汁液能用以抑制UVA造成的黑色素生成，進而具有改善肌膚狀況的作用及改善肌膚老化的作用。
實施例五：佛手柑發酵汁液抗醣化功效的測試
以200mM磷酸鈉緩衝液（Sodium phosphate buffer，pH7.4）、疊氮化鈉（Sodium azide，NaN3）與牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，品牌：Gibco）配置含有0.06%NaN3的60mg/mL BSA溶液。
以200mM磷酸鈉緩衝液與D果糖（D-（-）-Fructose，C6H12O6）配置1.5M D-fructose溶液。
以200mM磷酸鈉緩衝液與氨基胍鹽酸鹽（Aminoguanidine hydrochloride，AG，CH6N4•HCl）配置3mM AG溶液。
取0.25mL實施例二中所得到的佛手柑浸提液加入0.25mL BSA溶液與D-fructose溶液並均勻混合以得到實驗組A的待測溶液。
取0.25mL實施例一中所得到的佛手柑發酵汁液加入0.25mL BSA溶液與D-fructose溶液並均勻混合以得到實驗組B的待測溶液。
取0.25mL之3mM AG溶液加入0.25mL BSA溶液與D-fructose溶液並均勻混合以得到空白組的待測溶液。
取0.1mL各組別的待測溶液作為各組別的零點溶液。使用螢光分光光度計（Thermo Fisher Scientific）對0.1mL各組別的零點溶液以360nm之激發光以及460nm之放射光測定其螢光值，以得到反應前之零點之螢光值。
取0.45mL各組別的待測溶液於50℃下培養24小時，以得到各組別的終點溶液。取0.1mL各組別的終點溶液並使用螢光分光光度計對0.1mL各組別的終點溶液以360nm之激發光以及460nm之放射光測定其螢光值，以得到反應之終點之螢光值。
然後根據下列公式（3）計算各組別的相對醣化終產物（Advanced Glycation End products，AGEs）的形成量（%），以得知其抗醣化活性（Antiglycative activity）。換言之，於此，是將空白組的AGEs形成量視為1（即空白組的相對AGEs形成量為100%）來計算各組別的相對AGEs形成量（%）。
AGEs形成量（％）＝
（3）
其中，Fluorescence sample 24hr代表實驗組的終點之螢光值，Fluorescence sample 0hr代表實驗組的零點之螢光值，Fluorescence control 24hr代表空白組的終點之螢光值，Fluorescence control 0hr代表空白組的零點之螢光值。
參照圖3，相較於空白組，實驗組A（佛手柑浸提液（未發酵處理））明顯減少69%的醣化終產物的形成量，而實驗組B（佛手柑發酵汁液）明顯減少91%的醣化終產物的形成量。由此可知，佛手柑發酵汁液能有效抑制醣化終產物的形成，即具有抗醣化的作用。
實施例六：抗UVB所致基質金屬蛋白酵素9(MMP9)生成檢測
MMP-9基因屬於基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMPs)家族，其主要功能是降解和重塑細 胞外基質(extracellular matris)的動態平衡。目前已分離出廿八種MMPs，包括：膠原蛋白酶(collagenase)、膠質酶(gelatinase)、基質酶(stromelycin)、基酶(matrilysin)、與膜型MMP(transmembrane type-MMP)。MMP-9係屬於膠質酶，亦稱為明膠蛋白酶。細胞外基質(Extra cellular Matrix)主要由膠原蛋白、彈性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖4種組成分子組成，不同組織器官，各種組成成分比例不同。較為人知的是，若皮膚少了膠原蛋白的支撐，則皮膚外觀會變得鬆弛且缺乏彈性。UV照射或發炎反應都會促使MMPs過度表現，在這種情況下，MMPs幾乎可分解所有細胞外間質、降解結締組織中的蛋白質結構；其中，細胞外間質之中的膠原蛋白便係由MMP-9所分解、破壞。
因此本案之發明人係藉由實施例六來研究佛手柑發酵汁液對於MMP-9表現量之抑制效果。
於此，所使用培養基為含10%(v/v)的胎牛血清(fetal calf serum，FBS)、0.37%(w/v)的NaHCO3
、100units/ml的盤尼西林(penicillin)、100units/ml的鏈黴素(streptomycin)、0.1mM的NEAA(non-essential amino acid solution，非必需氨基酸溶液)、1Mm的丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、以及0.03%的L-谷氨酰胺(L-glutamine)的MEM(minimum essential medium)培養液，以下稱基礎培養基。所使用的細胞株為附著性人類纖維母細胞CCD-966sk (human normal skin fibroblasts)（購自BCRC，編號 60153），以下稱人類纖維母細胞。
將CCD-966sk細胞以每孔2.0×105
個細胞的細胞數接種於含有2mL基礎培養基的6孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養24小時。
在培養24小時後，將CCD-966sk細胞分成4個組別：二個實驗組（實驗組A、實驗組B）、一個對照組以及一個控制組。移除各組別的基礎培養基，並更換成每孔3mL實驗培養基，然後將對照組及二個實驗組置於紫外線鏈結箱 (Cleaver Scientific；Cat. CL-508)以UVB照射（劑量50 J/cm2
）（控制組並未以UVB照射），接著將各組於37°C下接續培養48小時。其中，實驗組A的實驗培養基為含有0.25體積%實施例二所製備的佛手柑浸提液（未發酵處理）的基礎培養基。實驗組B的實驗培養基為含有0.25體積%實施例一所製備的佛手柑發酵汁液的基礎培養基。對照組及控制組的實驗培養基為單純的基礎培養基（即不含佛手柑浸提液，不含佛手柑發酵汁液）。
於培養24小時後，移除各孔中的實驗培養基並以1倍（1x）的磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS，品牌：Gibco）潤洗二次。於沖洗後，將胰蛋白酶（trypsin）加入至各孔中以處理細胞3分鐘。於3分鐘處理後，將各孔的懸浮的細胞個別收集於1.5mL離心管中，接而以400xg離心5分鐘以分離細胞沉澱物（cell pellet）與上清液。透過1xPBS再懸浮細胞沉澱物及離心反覆進行二次後，以200μL的1xPBS再懸浮細胞沉澱物，以得到細胞溶液。接著，將50μL的RIPA裂解液添加進細胞溶液中，以14,000xg離心30分鐘。於30分鐘離心後，收集離心管中上清液，並以MMP9 ELISA套組(廠牌USCN，型號SEA553Hu)依照其使用手冊的標準程序進行檢測，檢測最終是以450nm的波長下以ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附法）讀取儀（廠牌：BioTek）來讀取96孔培養盤中各孔的吸光值（OD450
）。
於量測後，將所測得的吸光值代入下列公式（4）計算出UVB造成的MMP9生成相對百分比（%），如圖4所示（圖4及公式（4）標示為「MMP9生成相對百分比」）。換言之，於此，是將控制組的MMP9含量視為1（即控制組的MMP9含量相對百分比為100%）來計算各組別的相對MMP9含量相對百分比（%）。並且，各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗（student t-test）來統計分析。在圖4中，「**」代表在與控制組比較下其p值小於0.01、「#」代表在與對照組比較下其p值小於0.05、「###」代表在與對照組比較下其p值小於0.001、「※」代表在與實驗組A比較下其p值小於0.05。
公式（4）
MMP9含量相對百分比（%）＝(OD450 sample
/OD450 control
)×100% （4）
請參照圖4。相較於控制組，實驗組A的MMP9含量相對百分比為105.52%，實驗組B的MMP9含量相對百分比為93.45%，而對照組的黑色素含量相對百分比為122.07%。換言之，當以UVB處理後，對照組的MMP9含量相對百分比相較於控制組提高了22.07%，而實驗組A以UVB及佛手柑浸提液共同處理後，實驗組A的MMP9含量相對百分比相較於對照組下降16.55%，而實驗組B以UVB及佛手柑發酵汁液共同處理後，實驗組B的MMP9含量相對百分比相較於對照組下降28.62%。由此可知，相較於對照組，實驗組B的UVB造成的MMP9生成有顯著地被抑制28.62%，代表佛手柑浸提液能有效抑制UVB造成的MMP9生成。
由於UVB的刺激下會造成MMP9的生成，進而分解膠原蛋白，基此，佛手柑發酵汁液能用以抑制UVB造成的MMP9生成，進而減少膠原蛋白的分解，具有改善肌膚狀況，改善肌膚老化的作用。
綜上所述，根據本發明任一實施例的佛手柑發酵汁液，其可製備改善改善肌膚老化的組合物。換言之，前述之組合物具有下列一種或多種功能：抑制黑色素、抗醣化以及減少膠原蛋白分解。
無
圖1是繪示各組別的自生黑色素含量變化之長條圖。
圖2是繪示各組別的紫外線誘導黑色素生成變化之長條圖。
圖3是繪示各組別的相對醣化終產物形成量之長條圖。
圖4是繪示各組別的MMP9表現量之長條圖。
Claims (9)
- 一種佛手柑發酵汁液的用途，其是用於製備用以改善肌膚老化的組合物，其中該佛手柑發酵汁液是由一佛手柑浸提液經由啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）及乙酸醋酸菌（Acetobacter aceti）進行一發酵所得。
- 如請求項1所述的用途，其中該改善肌膚老化為抑制黑色素、抗醣化或減少膠原蛋白分解或其組合。
- 如請求項2所述的用途，其中該抑制黑色素為減少黑色素瘤細胞株的自生黑色素及/或減少紫外光誘導黑色素瘤細胞株生成的黑色素。
- 如請求項3所述的用途，其中該紫外光為UVA。
- 如請求項2所述的用途，其中該減少膠原蛋白分解為抑制基質金屬蛋白酵素9 (MMP9)之含量。
- 如請求項1所述的用途，其中該啤酒酵母相對於該佛手柑浸提液之添加量為0.01%-0.5%(v/v)，該乾酪乳桿菌相對於該佛手柑浸提液之添加量為0.01%-0.25%(v/v)，該乙酸醋酸菌相對於該佛手柑浸提液之添加量為1%-15%(v/v)。
- 如請求項1至6任一項所述的用途，其中該發酵的時間為4-8天。
- 如請求項1至6任一項所述的用途，其中該佛手柑發酵汁液的有效濃度為至少為0.25%(v/v)。
- 如請求項1至6任一項所述的用途，其中該佛手柑發酵汁液的糖度為40±2。
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